CN108795894A

CN108795894A - 烟草pod63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用

Info

Publication number: CN108795894A
Application number: CN201810662889.8A
Authority: CN
Inventors: 鲁黎明; 李立芹; 杨尚谕; 鲁逸飞; 蒋垚; 童铸
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明提供了烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用，属于烟草盐胁迫技术领域。所述烟草POD63蛋白具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。编码权利要求1所述的烟草POD63蛋白的基因具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。重组载体包含所述的基因。所述的烟草POD63蛋白、所述的基因或所述的重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。实验表明烟草的POD63基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。

Description

烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用

技术领域

本发明属于烟草盐胁迫技术领域，具体涉及烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用。

背景技术

植物过氧化物酶(peroxidase，POD)家族基因在逆境响应过程中具有重要功能。目前已经从许多植物(拟南芥，水稻，小桐子等)中克隆到这个家族基因(Tognolli，2002；Passardi，2004；王海波，2017)。例如，小桐子POD73受低温诱导表达显著，银杏POD1受植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、金属离子铜(Cu)和镉(Cd)以及甲基紫晶(MV)和伤害处理(WOU)的处理显著诱导(程华等，2010)。对于烟草来说，POD基因序列并未有过报道，同时烟草POD基因的生物学功能也不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用，揭示烟草POD63蛋白的生物学功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种重组载体，包含所述的基因。

本发明提供了一种重组菌，包含所述基因或所述的重组载体。

本发明提供了所述烟草POD63蛋白、所述基因或所述重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。

优选的，所述盐胁迫反应中盐包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。

优选的，所述盐的浓度优选为100～1000mmol/L。

本发明提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。实验结果表明，将所述烟草POD63蛋白在普通烟草品种K326中进行遗传转化，得到3个转基因的阳性株系；将这3个转基因的阳性株系与对照普通烟草K326进行氯化钠溶液的盐胁迫处理，与未转化有POD63蛋白的烟草(普通烟草K326)幼苗相比，3个转基因株系的相关生理指标(叶绿素含量、可溶性糖含量及钾含量)均明显高于对照，而丙二醛含量、钠含量则明显比对照低；在正常的生长条件，3个转基因株系与对照的上述生理指标(包括钾、钠含量)没有明显差异。这表明烟草的POD63基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。

本发明提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。所述基因是由GenBank收录的烟草过氧化物酶蛋白基因(登录号是XP_016440067.1)为模板设计引物扩增得到。基因核苷酸序列全长990bp。实验表明将所述基因在烟草中过量表达，具有明显的抗盐胁迫的作用。

附图说明

图1为编码烟草POD63蛋白的基因扩增电泳图；

图2为转基因烟草的耐盐性表型观察(盆栽大苗)；

图3为转基因烟草耐盐性表型观察(皿上幼苗)；

图4为转基因烟草表达量检测；

图5为叶绿素含量测定结果；

图6为丙二醛含量测定结果；

图7为可溶性糖含量测定结果；

图8为钾含量测定结果；

图9为钠含量测定。

具体实施方式

本发明提供了一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。所述烟草POD63蛋白的制备方法包括委托公司按照氨基酸序列进行合成或者通过构建外源重组蛋白的表达系统得到。

本发明提供了一种编码所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。在本发明中，所述基因的来源优选采用GenBank收录的烟草过氧化物酶蛋白基因(登录号是XP_016440067.1)为模板设计引物扩增得到。所述引物包括NtPOD63-F和NtPOD63-R。所述NtPOD63-F具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。所述NtPOD63-R具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成公司即可。所述扩增以烟草的总RNA反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，得到目标片段。所述扩增的反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环。所述扩增的反应体系如下：2×PCRMaster Mix5μL，NtPOD63-F 0.5μL，NtPOD63-R 0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 3μL。

本发明提供了一种重组载体，包括所述的基因。

在本发明中，所述重组载体的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)将上述方案中扩增的目标片段与pMD19-T载体16℃连接过夜，得到连接产物；所述连接的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：Solution I，5μL；pMD19-T 0.5μL；目的基因4.5μL；

(2)将所述连接产物转化感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上进行筛选，采用菌落PCR检测得到阳性克隆；

(3)将所述阳性克隆和表达载体PBI121分别进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，连接，得到重组载体。

在本发明中，所述酶切的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：10×TBuffer 1μL；BSA 1μL；XbaI 1μL；SmaI 1μL；载体4μL；ddH₂O 2μL。所述酶切的程序优选为37℃水浴反应5h。

所述连接的反应体系为10μL，具体包括以下含量的组分：Solution I，5μL；PBI121载体0.5μL；目的基因4.5μL。所述连接的反应程序为16℃连接8h。

本发明提供了一种重组菌，包含所述基因或所述的重组载体。所述重组菌中的宿主菌优选为农杆菌。本发明对所述农杆菌的菌株没有特殊限制，采用本领域所熟知的农杆菌菌株即可。本发明对所述重组菌的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组菌的制备方法即可。

在本发明中，所述烟草抗盐胁迫反应的方法，是将所述烟草POD63蛋白、所述基因或所述重组菌株利用农杆菌转化法导入烟草中，使烟草具有抗盐胁迫反应的作用。

在本发明中，所述盐胁迫反应中盐优选包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。所述盐的浓度优选为100～1000mmol/L，更优选为200～800mmol/L。

下面结合实施例对本发明提供的烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.基因克隆

取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA。然后，采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。根据利用Primer5.0软件设计的全长引物(NtPOD63-F，NtPOD63-R)，采用PCR技术，进行基因全长的扩增。目的基因扩增结果如图1，片段长度约为1000bp，目的片段纯化后，与pMD19-T载体16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取3个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序。测序结果表明，该基因长度为990bp。

实施例2

目的基因连接表达载体

酶切：将上述转化好的T-载体与表达载体PBI121分别进行双酶切(酶切位点为：XbaⅠ和SmaⅠ)。酶切体系10μL：10×T Buffer 1μL；BSA 1μL；XbaI 1μL；SmaI 1μL；载体4μL；ddH2O 2μL，37℃水浴反应5h。

随后在酶切后的反应液中加入1μL 10×Loading Buffer，进行凝胶电泳检测。回收目的基因和表达载体PBI121，然后用连接酶连接，连接体系10μL：SolutionI，5μL；PBI121载体0.5μL；目的基因4.5μL，16℃连接8h。

将连接后的表达载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增，结果表明烟草POD63基因的过表达载体构建成功。

实施例3

冻融法转化农杆菌和PCR检测

取200μL感受态细胞，室温融化后加入10μL构建好的重组质粒DNA，混匀后冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基，28℃慢速振荡培养4h，10000r/min离心1min集菌，弃上清，加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的平板上，28℃避光培养约48h。待平板上长出的单菌落，直接用灭菌的牙签蘸取单菌落，在PCR体系中晃动几下后进行PCR扩增反应。

反应程序为：

用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果空白对照没有条带，但PCR产物有明亮且大小正确的条带，证明转化成功。

实施例4

农杆菌转化烟草方法

4.1烟草无菌苗的培养和预培养

选取籽粒饱满无病虫害的烟草种子，装入1.5mL EP管中。先用70％的乙醇消毒30s，无菌水冲洗3～5次，然后用1mL30％次氯酸钠溶液消毒5min。吸出消毒液，再加入1mL30％次氯酸钠溶液消毒25min，消毒期间都要不断地振荡EP管。最后用无菌水反复清洗6～7次后，吸干种子表面水分，布于MS培养基上，并放置于光照培养箱(温度25℃、光照16h/d)中，培养30d左右备用。

选取苗龄约30d且长势良好的烟草无菌苗，用灭菌刀片将烟草叶片切下，放置在预培养基上培养2d(注意将叶的正面朝下放在培养基上)。

4.2侵染菌液的制备

(1)将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养2d。

(2)用灭菌牙签挑取菌落，接种于2mL液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜(12h左右)。

(3)活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，取100μL稀释到5mL LB培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.5(约3h检测一次)。

(4)取培养物1mL置于无菌离心管中，12000r/min离心1min，弃上清。加入100mL的MS0培养基，混匀备用。

4.3侵染叶片、共培养和分化培养

将在预培养基上培养2d的烟草叶片切成1cm²左右的叶盘，置于悬菌液中(MS0悬浮，可以稀释50～100倍)浸泡3～5min。然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。将侵染过的叶盘分别接种在覆有一层滤纸的共培养基上面，放到恒温培养箱20℃暗培养2d。用100mL含有200μL头孢霉素，100μL羧苄青霉素的无菌水清洗4min，重复一次后再用无菌水清洗8min，最后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养。培养前期3d继代一次。每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后，就每隔两周继代一次，直至抗性芽产生。

4.4生根培养和繁殖

待抗性芽长至1～2cm时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。待根长至2～3cm时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基，去掉下部叶，然后将无菌苗植入土壤。室内培养大约一周后，移到室外(最初的3d应在阴暗处生长且要盖上透明塑料)。经过PCR检测为阳性的植株进行繁殖到T3代。

实施例5

T3代转基因烟草表型观察和基因表达量的检测

烟草大苗的耐盐性表型观察：采用漂浮育苗的方法，对3个T3代转基因烟草株系和K326烟苗进行培养，30天后种植在培养盆中，2月苗龄时进行氯化钠胁迫实验，氯化钠溶液的浓度为800mM，处理使用氯化钠溶液的体积是1升，处理7天后进行照相(图2)。

烟草皿上幼苗的耐盐性表型观察：挑选饱满且大小一致的3个转基因烟草株系及普通烟草K326的种子，用75％的乙醇、10％的次氯酸钠溶液消毒后，用无菌水浸泡及清洗数次后，分别播种于MS培养基上，进行无菌苗的培养。在16h光/8h暗，25℃的光照培养箱中培养7d后，挑选长势一致的幼苗进行200mM的氯化钠处理，28d后照相。对照是挑选长势一致的幼苗在MS上正常生长28d后照相(图3)。

从图2、图3明显看到，盐胁迫后，3个转基因株系(T1，T2，T3)的烟苗长势明显优于对照K326。荧光定量PCR，扩增引物是NtPOD63Q-F(SEQ ID No.4)和NtPOD63Q-R(SEQ IDNo.6)，以18S为内参(引物序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)，检测结果表明，T1，T2，T3株系中目的基因(烟草POD63)的表达量明显高于对照(图4)。

实施例6

T3代转基因烟草盐处理后生理指标测定

将60天苗龄的3个转基因株系及对照K326幼苗，用300mM的氯化钠溶液处理21d(处理使用氯化钠溶液的体积是每次500ml)。然后，测定相关生理指标。

叶绿素含量：在盐处理后，3个转基因株系的叶绿素含量明显高于对照；在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照的叶绿素含量没有明显差异(图5)。

丙二醛含量：盐处理后，3个转基因株系的丙二醛含量明显低于对照；在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照的丙二醛含量没有明显差异(图6)。

可溶性糖含量：盐处理后，3个转基因株系的可溶性糖含量明显高于对照；在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照的可溶性糖含量没有明显差异(图7)。

钾和钠含量：盐处理后，3个转基因株系的钾含量明显高于对照，钠含量明显比对照低；在正常的生长条件下，3个转基因株系与对照的钾、钠含量没有明显差异(图8、图9)。

以上结果表明，烟草的POD63基因超量表达后能够提高烟草抵抗盐胁迫的能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 烟草POD63蛋白、编码基因及其在烟草盐胁迫反应中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 329

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

Met Ala Ile Lys Met Leu Leu Phe Leu Cys Ile Ser Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Thr Ser Ser Leu Ser Gln Arg His Ser Pro Leu Asn Thr Ala Phe Tyr

20 25 30

Arg Lys Ser Cys Pro Arg Phe Glu Gln Ile Met Glu Glu Thr Thr Thr

35 40 45

Asn Lys Gln Ile Thr Ser Pro Thr Thr Ala Ala Ala Thr Leu Arg Leu

50 55 60

Phe Phe His Asp Cys Phe Val Gly Gly Cys Asp Ala Ser Val Leu Val

65 70 75 80

Ser Ser Thr Pro Phe Asn Lys Ala Glu Arg Asp Ala Glu Ile Asn Leu

85 90 95

Ser Leu Pro Gly Asp Gly Phe Asp Val Val Val Arg Ala Lys Thr Ala

100 105 110

Leu Glu Leu Ser Cys Pro Gly Ile Val Ser Cys Ser Asp Ile Leu Ala

115 120 125

Val Ala Ala Arg Asn Leu Val Val Gln Thr Gly Gly Pro Phe Tyr Pro

130 135 140

Val Lys Leu Gly Arg Lys Asp Ser Phe Val Ser Lys Ala Ser Leu Val

145 150 155 160

Glu Gly Asn Leu Pro Arg Pro Thr Met Pro Met Asp Gln Ile Ile Lys

165 170 175

Ile Phe Glu Ser Arg Gly Phe Ser Ile Gln Glu Met Val Ala Leu Ser

180 185 190

Gly Ala His Thr Ile Gly Phe Ser His Cys Lys Glu Phe Asn Ser Asp

195 200 205

Leu Tyr Asn Tyr Asn Lys Thr Ser Gln Ala Asp Pro Ser Tyr Asn Pro

210 215 220

Arg Phe Ala Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Ser Asn Ser Gln Lys Asp

225 230 235 240

Pro Thr Leu Ser Val Phe Asn Asp Ile Met Thr Pro Asn Lys Phe Asp

245 250 255

Asn Met Tyr Tyr Gln Asn Leu Pro Lys Gly Leu Gly Leu Leu Ser Ser

260 265 270

Asp Arg Gly Leu Phe Ser Asp Pro Arg Thr Arg Ile His Val Glu Glu

275 280 285

Tyr Val Arg Asp Gln Asn Ala Phe Phe Lys Ala Phe Ala Ser Ala Met

290 295 300

Gln Lys Leu Ser Glu His Gly Val Lys Ile Gly Lys His Gly Glu Ile

305 310 315 320

Arg His Arg Cys Asp Ala Phe Asn Asn

325

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctataa aaatgcttct ttttctatgc atttccgcct tattaagtac ttcctcttta 60

tcccagcgcc attcgccgct aaatactgct ttttaccgca aatcatgccc aagatttgag 120

cagataatgg aagaaaccac tacaaacaaa cagatcactt ctcctactac cgccgccgcc 180

accctccgcc tcttcttcca cgactgcttc gtcggcggct gtgacgcctc cgtacttgtc 240

tcctccactc ccttcaacaa agccgagcgt gacgccgaaa tcaacctttc cctccccggc 300

gatggcttcg acgtggtcgt acgcgccaag accgcgcttg aactttcctg tccaggtata 360

gtctcttgct ccgacattct cgccgtcgct gcccgaaacc ttgtcgtcca aactggcggc 420

ccgttttatc cagttaaatt gggccgtaaa gattcttttg tatcgaaagc ctcattagta 480

gaaggaaatc tgccccggcc cacaatgccg atggatcaaa tcattaagat tttcgaatcc 540

agaggatttt cgattcaaga aatggtagca ttatctggag ctcacacaat tggattttcc 600

cactgtaaag agttcaactc ggatctttat aactacaaca aaacttcaca agctgatcct 660

tcgtataatc cgaggtttgc tcaagctttg aaagatgctt gtagtaattc ccagaaagat 720

ccaacattat cagtgttcaa cgatataatg actcctaaca aattcgataa tatgtattat 780

cagaacttgc ctaagggttt gggtttattg tcttcagacc gtggtctgtt ttcagatccg 840

aggacgagaa ttcacgttga ggaatatgtt agagatcaga atgcattttt taaggcgttt 900

gcttcagcaa tgcagaagct tagtgaacat ggtgttaaaa ttggtaaaca tggtgagatc 960

aggcacaggt gtgacgcttt caacaattga 990

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctataa aaatgcttct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaattgttg aaagcgtcac 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtttgggtt tattgtctt 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acctgtgcct gatctcac 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctacgctct gtatacatta gc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgttgagtc aaattaagcc gc 22

Claims

1.一种烟草POD63蛋白，具有如序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述的烟草POD63蛋白的基因，具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的烟草POD63蛋白、权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组载体在烟草抗盐胁迫反应中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述盐胁迫反应中盐的浓度优选为100～1000mmol/L。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述盐包括氯化钠溶液或氯化钾溶液。