CN101092634B - 一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法。该方法是使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA，得到抗黄瓜花叶病毒的植物。本发明利用含有内含子的反向重复序列(hpRNA)而不是简单的正向或反向序列，能产生最高效率的RNA沉默抗病毒效应。而且该抗病特点在于减弱病毒的初期侵染的同时利用病毒初期侵染提高抗病效力，充分利用病毒初期侵染产生的病毒RNA被3’UTR hpRNA来源的小RNA的剪切，来加速RNAi效率，实现诱导型RNAi效力叠加的新型抗病体系。

Description

一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法

技术领域

本发明涉及一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法。

背景技术

病毒病害造成农作物的减产及品质的严重下降。为了得到抗病农作物，过去20年里育种学家通常采用把天然抗性基因转入对病毒敏感作物的方法(Goldbach R，Bucher E，Prins M.Resistance mechanisms to plant viruses：an overview.VirusRes 2003.92：207-12)。同时，转入外源抗病蛋白(Lodge JK，Kaniewski WK，TumerNE.Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweedantiviral protein.Proc Natl Acad Sci USA 1993.90：7089-93；Watanabe Y，OgawaT，Takahashi H，Ishida I，Takeuchi Y，Yamamoto M，Okada Y.Resistance againstmultiple plant viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specificribonuclease.FEBS Lett 1995.372：165-8；Boonrod K，Galetzka D，Nagy PD，Conrad U，Krczal G.Single-chain antibodies against a plant viralRNA-dependent RNA polymerase confer virus resistance.Nat Biotechnol 2004.22：856-62)以及抑制寄主代谢酶途径也得到广泛应用(Masuta C，Tanaka H，UeharaK，Kuwata S，Koiwai A，Noma M.Broad resistance to plant viruses in transgenicplants conferred by antisense inhibition of a host gene essential inS-adenosylmethionine-dependent transmethylation reactions.Proc Natl AcadSci USA 1995.92：6117-21)。如今，除了天然的抗性特征，利用基因操作获得工程抗性已得到广泛应用。例如，利用病原来源的抗性(PDR)已在几个病毒株系中实现(Goldbach R，Bucher E，Prins M.Resistance mechanisms to plant viruses：an overview.Virus Res 2003.92：207-12；Abel PP，Nelson RS，De B，HoffmannN，Rogers SG，Fraley RT，Beachy RN.Delay of disease development in transgenicplants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene.Science 1986.232：738-43；Lindbo JA，Silva-Rosales L，Proebsting WM，Dougherty WG.Induction of a Highly Specific Antiviral State in Transgenic Plants：Implications for Regulation of Gene Expression and Virus Resistance.PlantCell 1993.5：1749-59)，该方法是在植物中引入病毒基因组的一部分序列或表达完整或修饰的病毒蛋白及RNA，以打乱病毒的复制周期。越来越多的证据表明其中一种PDR是病毒转基因RNA沉默的结果。RNA沉默是导致真核生物序列特异的基因表达受抑的一种非常保守的现象。双链RNA(dsRNA)作为沉默诱发因子被RNase III酶同源蛋白Dicer剪切成21-25nt的siRNA。这些siRNA指导RNA诱导的沉默复合物(RISC，一种多聚蛋白复合物)，造成靶标RNA的降解或在DNA水平上发挥作用造成染色质的修饰。

与动物一样，RNA沉默在植物中作为一种防御病毒入侵的免疫反应发挥作用(Baulcombe D.RNA silencing.Trends Biochem Sci 2005.30：290-3；Voinnet O.Induction and suppression of RNA silencing：insights from viral infections.Nat Rev Genet 2005.6：206-20)。当植物受到病毒入侵时，就会激活病毒诱导的基因沉默(VIGS)途径，该抗病途径能特异识别并降解病毒RNA(Baulcombe D.RNAsilencing in plants.Nature 2004.431：356-63；Scholthof HB.TheTombusvirus-encoded P19：from irrelevance to elegance.Nat Rev Microbiol 2006.4：405-11)。在病毒入侵的植物体内能检测到病毒来源的siRNA(vsiRNA)的积累(Chellappan P，Vanitharani R，Pita J，Fauquet CM.Short interfering RNAaccumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected hosts，andgene silencing targets specific viral sequences.J Virol 2004.78：7465-77；Molnar A，Csorba T，Lakatos L，Varallyay E，Lacomme C，BurgyanJ.Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly fromhighly structured single-stranded viral RNAs.J Virol 2005.79：7812-8)。研究表明，vsiRNA主要来源于病毒复制过程中的dsRNA双链中间体以及高度结构化的病毒RNA单链(Molnar A，Csorba T，Lakatos L，Varallyay E，Lacomme C，BurgyanJ.Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly fromhighly structured single-stranded viral RNAs.J Virol2005.79：7812-8；Pantaleo V，Szittya G，Burgyan J.Molecular bases of viralRNA targeting by viral siRNA programmed RISC.J Virol 2007.81：3797-806)。

病毒基因组序列的同源基因转入植物后诱发RNA沉默并赋予转基因植物对该病毒高度特异的抗性(Lindbo JA，Silva-Rosales L，Proebsting WM，Dougherty WG.Induction of a Highly Specific Antiviral State in Transgenic Plants：Implications for Regulation of Gene Expression and Virus Resistance.PlantCell 1993.5：1749-59；Lindbo JA，Dougherty WG.Pathogen-derived resistanceto a potyvirus：immune and resistant phenotypes in transgenic tobaccoexpressing altered forms of a potyvirus coat protein nucleotide sequence.Mol Plant Microbe Interact 1992.5：144-53；Guo HS，Garcia JA.DelayedResistance to Plum Pox Potyvirus Mediated by a Mutated RNA Replicase Gene：Involvement of a Gene-Silencing Mechanism.Mol Plant Microbe Interact1997.10：160-70)。对于转基因沉默介导的抗性来说，有时病毒的侵染甚至是必要的，而且植物常表现出“恢复”表型。另外，在病毒侵染的野生型植物中也能看到这种恢复现象。这种恢复现象非常类似于病毒诱导的转基因植物产生的恢复抗性，即在未侵染的系统叶中病毒浓度显著降低(Covey SN，Al-Kaff NS，Langara A，Turner DS.Plants combat infection by gene silencing.Nature 1997.385：781-2；Ratcliff F，Harrison BD，Baulcombe DC.A Similarity Between ViralDefense and Gene Silencing in Plants.Science 1997.276：1558-60)。

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麦花叶病毒科，黄瓜花叶病毒属的典型成员，寄主范围广泛，能侵染超过85科365种的1000多种植物，包括单子叶与双子叶植物、草本、灌木与木本植物等(Palukaitis P，Roossinck MJ，Dietzgen RG，Francki RI.Cucumber mosaic virus.Adv Virus Res 1992.41：281-348)。CMV是典型的三组分正义单链RNA病毒之一，其基因组RNA包裹在独立的病毒粒子中(Sugiyama M，Sato H，Karasawa A，Hase S，Takahashi H，EharaflY.2000.Characterization of symptom determinants in two mutants of cucumbermosaic virus Y strain，causing distinct mild green mosaic symptoms in tobacco.Physiol Mol Plant Pathol 56：85-90)。根据衣壳蛋白(CP)的系统发展史估计与5’非翻译区(5’UTR)的重组，CMV可被分为三个亚组，即亚组IA，IB和亚组II(Roossinck MJ，Zhang L，Hellwald KH.Rearrangements in the 5’nontranslatedregion and phylogenetic analyses of cucumber mosaic virus RNA 3 indicateradial evolution of three subgroups.J Virol 1999；73：6752-8)。RNA1和RNA2分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的亚单位1a和2a(Hayes RJ，Buck KW.Complete replication of a eukaryotic virus RNA in vitro by a purifiedRNA-dependent RNA polymerase.Cell 1990；63：363-8)。RNA3具有两个开放阅读框，编码运动蛋白(MP)和CP蛋白。其中CP蛋白是由亚基因组RNA-RNA4转译的，该RNA由负链转录而来(Schwinghamer MW，Symons RH.Translation of the fourmajor RNA species of cucumber mosaic virus in plant and animal cell-freesystems and in toad oocytes.Virology 1977；79：88-108)。而另一个亚基因组RNA-RNA4A编码的是2b蛋白。CMV的3’UTR序列在不同基因组RNA之间以及不同株系与亚组RNA中都非常保守，而且其3’端都能够形成非常稳定的类似于tRNA的二级结构(TLS)(Rietveld K，Pleij CW，Bosch L.Three-dimensional models of thetRNA-like 3’termini of some plant viral RNAs.EMBO J 1983.2：1079-85；KwonCS，Chung WI.Differential roles of the 5’untranslated regions of cucumbermosaic virus RNAs 1，2，3and 4 in translational competition.Virus Res 2000.66：175-85)。已知该TLS区域包含有负链合成的启动子，其首要功能包括在寄主因子参与下的与复制酶的互作(Fernandez-Cuartero B，Burgyan J，Aranda MA，Salanki K，Moriones E，Garcia-Arenal F.Increase in the relative fitness ofa plant virus RNA associated with its recombinant nature.Virology 1994；203：373-7)。

申请号为91104076.5，发明名称为“构建抗黄瓜花叶病毒的转基因植物”的中国专利申请公开了将CMV外壳蛋白(CP)基因和CMV卫星RNA基因同时引入植物表达来获得抗病的转化技术。利用CP基因获得的抗性主要机制是交叉保护机理。大量的实验已经证明，CP基因介导的抗性不适合应用于大田的抗CMV病毒，因为植物生长在稍高的温度下该抗性很容易被打破。CMV卫星RNA虽然可以减缓CMV的病症，但是也具有对CMV(辅助病毒)和寄主的特异性。利用卫星RNA来减缓CMV侵染的病症也不宜在大田应用。虽然利用CP和卫星RNA两者的结合，可以获得较高的专一抗性，但是，也不适合应用于大田上。因为CMV病毒病害最致命的危害就是它的传毒载体蚜虫无专化性要求，大量的野生寄主和带毒蚜虫常使植物出现多种亚组CMV病毒的复合侵染，所以，造成长期以来许多防治方法难以奏效。也因此使CMV有植物“流感性病毒”之称。

公开号为EP806481-A、发明名称为“Preparing transgenic plants resistantto RNA virus infection-using anti：sense gene constructs containing the viralcoat protein gene，e.g.from cucumber mosaic virus”的欧洲专利申请公开了在烟草中表达CMV的coat protein(CP)的反向序列来获得对单一CMV的抗性技术。用病原基因的反向序列来获得抗性的主要机理是利用寄主的RNA沉默抗性机制。大量的实验已经证明，用反向序列引起的RNA沉默(RNAi)效应远远不及用含有内含子的反向重复序列引起的RNAi效应显著；另外，用CP的序列不能同时将CMV的三个基因组和两个亚基因组作为RNAi的靶标基因，更谈不上能靶向其他亚组的CMV病毒。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法。

本发明所提供的培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，是使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA，得到抗黄瓜花叶病毒的植物。

所述方法中，使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA，也就是使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的发夹RNA(hpRNA)。

上述方法中，所述黄瓜花叶病毒3’UTR可为亚组IA，IB和亚组II的黄瓜花叶病毒中的任意一个株系的3’UTR。如亚组II中的Q株系、Ly株系或Trk7的3’UTR；亚组IB中的SD株系、Tfn株系或Nt9株系等的3’UTR；亚组IA中的Fny株系、Mf株系或O株系的3’UTR。其中，亚组II中的Q株系(Genbank Accession Number M21464)以及其他株系的3’UTR序列；亚组IB中的SD株系(GenBank Accession NumberAB008777)以及其他株系的3’UTR序列；亚组IA中的Fny株系(GenBank AccessionNumber NC001440(也可为D10538，都是一样的序列))以及其他株系的3’UTR序列。

上述方法中，黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA优选来自亚组IA黄瓜花叶病毒中的Fny株系，或亚组IB黄瓜花叶病毒中的SD株系，或亚组II黄瓜花叶病毒中的Q株系；尤其优选来自亚组II黄瓜花叶病毒的Q株系。

所述3’UTR可为RNA1、RNA2或RNA3的3’UTR，优选为RNA3的3’UTR。

现有的可使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA的方法均可选用，其中的一种选择是，将在多克隆位点插入有用黄瓜花叶病毒3’UTR的3′端序列或5′端序列构建成的发夹结构的重组真核表达载体导入目的植物中。

其中，所述黄瓜花叶病毒3’UTR的5′端序列或3′端序列，可来自亚组IA、IB和亚组II的黄瓜花叶病毒中的任意一个株系的RNA1、RNA2和RNA3中任一个基因组RNA的3’UTR，如亚组II黄瓜花叶病毒的Q株系的RNA3的3’UTR或SD株系的RNA3的3’UTR。所述亚组II黄瓜花叶病毒的Q株系的RNA3的3’UTR的5′端序列具体可选自GenBank Accession Number M21464的自5′端第1877至2076位中21-200nt核苷酸片段中的任意一个序列。所述SD株系的RNA3的3’UTR的5′端序列选自GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1919至2118位中21-200nt核苷酸片段中的任意一个序列。

上述方法中，在多克隆位点插入有用黄瓜花叶病毒3’UTR的3′端序列或5′端序列构建成的发夹结构的重组真核表达载体具体可为如图1B所示的35S-3TRi或35S-3UTi或35S-SD-3UTi。

本发明的培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，适合于黄瓜花叶病毒能侵染的各种植物，包括单子叶与双子叶植物、草本、灌木与木本植物等，如烟草。

本发明基于3’UTR对于CMV复制的重要性，以及核酸序列与三维结构的稳定性，探求CMV 3’UTR介导的RNA沉默抗病毒效应。实验结果表明，表达CMV 3’UTR来源的hpRNA的大部分转基因烟草表现出恢复表型，并伴随系统叶中病毒RNA积累的降低。在转基因植物中3’UTR来源的siRNA的积累水平与转基因组的抗性程度之间不存在明显的相关性。不同亚组CMV的抗性实验表明，转基因烟草同样具有对其他亚组CMV的诱导型广谱抗性作用。

黄瓜花叶病毒(CMV)是三分体病毒，包括三条基因组RNA和两条亚基因组RNA。CMV病毒不同基因组间的3’UTR核苷酸序列具有大于80％的同源性，不同亚组间的3’UTR核苷酸序列具有约60％的同源性。所以，把3’UTR序列作为靶向目标可以同时作用于病毒多基因组。实验证明，利用一种CMV的3’UTR序列构建的发夹RNA(hpRNA)产生的小RNA对不同亚组的CMV基因组RNA都有沉默效用，从而获得广谱的抗CMV抗性效果。这也是为大田抗CMV应用所必要的。

本发明利用含有内含子的反向重复序列(hpRNA)而不是简单的正向或反向序列，能产生最高效率的RNA沉默抗病毒效应。而且该抗病特点在于减弱病毒的初期侵染的同时利用病毒初期侵染提高抗病效力，充分利用病毒初期侵染产生的病毒RNA被3’UTR hpRNA来源的小RNA的剪切，来加速RNAi效率，实现诱导型RNAi效力叠加的新型抗病体系。

附图说明

图1A为CMV基因组RNA 3’UTR序列的高度相似性。

图1B为CMV基因组结构及35S-3UTi和35S-3TRi表达框架示意图。

图2为3’UTR来源的siRNAs瞬时表达检测及对CMV靶标RNA的下调。

(A)3’UTR发夹RNA来源的siRNAs瞬时表达检测。

(B)，(C)，(D)分别为35S-3UTi与三种靶标(35S-QR4，35S-QR1*，35S-SDR4)的共注射杂交结果。

图3为35S-3UTi转基因烟草中3UTi来源的siRNAs与CMV RNAs积累水平的检测。

(A)对47个转基因株系中的20个株系的T1代进行3UTi来源的siRNAs积累水平的Northern杂交检测。

(B)在CMV感染转基因T1代株系25天后，每个组选择两个转基因株系进行CMVRNA积累水平的分子检测。

图4为CMV攻毒35S-3UTi转基因植物后的表型观察

(A)左图显示的是SD-CMV感染空载体转基因植物后叶片出现严重失绿及卷曲的症状，右图显示的是35S-3UTi转基因植物能从SD-CMV感染中恢复过来。

(B)上图显示的Q-CMV感染空载体与35S-3UTi转基因植物后感染叶与系统叶的症状表型，下图显示的是SD-CMV感染空载体与35S-3UTi转基因植物后感染叶与系统叶的症状表型。未感染的野生型烟草叶片作为正对照。

图5为pSK-intron的物理图谱。

具体实施方式

本发明的方法适用于培育黄瓜花叶病毒能侵染的各种植物，包括单子叶与双子叶植物、草本、灌木与木本植物等。下面仅以培育抗黄瓜花叶病毒烟草为例，阐明本发明的方法。

培育抗黄瓜花叶病毒烟草的实验证明，表达Q株系或SD株系的黄瓜花叶病毒CMV3’UTR来源的发夹RNA(hpRNA)的转基因烟草(Xanthi.nc)能有效地降低CMV RNA的积累。少数转基因烟草出对Q-CMV侵染表现出完全抗性；大部分转基因烟草在Q-CMV侵染后诱导了对病毒的抗性，并恢复健康表型。与CMV接种叶相比，上层系统叶表现出无病或弱病症表型，而且病毒RNA的积累减少，表现出恢复型抗性。Northernblot杂交结果显示，抗性程度与转基因植物中3’UTR来源的siRNA的积累量不存在明显的相关性。对其他亚组的CMV株系，大多数转基因烟草同样表现出恢复型抗性。结合植物瞬时表达系统的实验，结果表明植物中表达3’UTR来源的siRNA具有降解病毒靶标的生物学活性，即能有效地靶向病毒基因组RNA，造成病毒多基因组分RNA的剪切，最终使植物表现应答病毒侵染的诱导型抗性。由于不同亚组CMV3’UTR的高度同源性，使转基因烟草同时具用对不同亚组CMV的广谱抗性。下面具体阐明培育抗黄瓜花叶病毒烟草的方法。

实施例1、培育抗黄瓜花叶病毒烟草

1、瞬时表达实验中CMV RNA33’UTR发夹RNA来源的siRNAs积累的检测

CMV可分为三个亚组：亚组IA、IB和亚组II。其中，每个株系内3’UTR之间的序列相似性高达约80％，不同株系间RNA33’UTR的相似性也有60％左右(图1A)。正是由于CMV三组分基因组RNA 3’UTR之间的这种高度相似性促使发明人研究靶向3’UTR的抗病毒策略。如图1B所示，CMV的三条基因组RNA和两条亚基因组RNA的3’UTR区域包含5’端和3’端tRNA-like结构。为了检测3’UTR发夹RNA来源的siRNA的产生效率，扩增了对应于Q-CMV(亚组II)RNA3(M21464)3’UTR区域18到213nt和117到321nt的两段序列，分别对应于3’UTR的5’端和3’端，构建到发夹结构表达框架中(图1B)，该发夹结构由花椰菜花叶病毒(CauliflowerMosaic Virus，CaMV)的强组成型启动子35S控制，得到35S-3UTi和35S-3TRi两种发夹RNA表达框架。为了检测siRNA的瞬时表达，携带有35S-3UTi或35S-3TRi重组质粒被转化到农杆菌中。携带有35S-3TRi的农杆菌生长缓慢，表明该结构对农杆菌生长可能有毒性，3TR序列中的tRNA-like高级结构可能是原因之一。由于得不到可用的农杆菌悬浮物，因此在下面的实验中仅选用35S-3UTi进行更深入的分析。携带有35S-3UTi农杆菌悬浮物被注射到本生烟叶片中，分别于注射后1、2、3天剪取注射叶片，提取RNA，进行小分子量Northern杂交。注有空载体的叶片作为阴性对照。由图2中A可以看出，相对于注有空载体的叶片，在注有35S-3UTi重组质粒的烟草叶片中能够检测到来源于3’UTR发夹RNA的siRNA的表达。

具体实验方法和结果如下：

(1)重组真核细胞表达载体的构建

DNA操作与克隆按《分子克隆》中的标准程序进行(Sambrook J，Russel DW.Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3d edn.Cold Spring Harbor，NY：ColdSpring Harbor Laboratory 2002)。

A、以由CMV Q株系(Q-CMV)(植物基因组学国家重点实验室)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到Q-CMV RNA3(M21464)(genebank登录号)3’UTR 18-213nt(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1894至2089位)(196bp)和117-321nt(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1993至2197位)(205bp)两段序列，分别命名为3UT和3TR。其中，扩增3UT的引物为：3UT5，5’-GTCCGAAGACGTTAAACTAC-3’，和3UT3，5’-CTAGGAGGTGATTTCAAGGGAAGCTT-3’；扩增3TR的引物为：3TR5，5’-GGGTTGTCCATCCAGCTTACG-3’，和3TR3，5’-GGTCTCCTTATGGAGAACCTGTGGAAGCTT-3’。其中下划线部分为外加的HindIII酶切位点。PCR产物直接连入pGEM-T载体(Promega，Madison，WI)，测序验证后得到含有3UT的克隆pT-3UT和含有3TR的克隆pT-3TR。分别用HindIII/SalI限制酶和EcoRI/SpeI限制酶从pT-3UT上切下两段3UT片段，将该片段分别连接到pSK-intron载体中的限制性内切酶HindIII/SalI和EcoRI/SpeI位点间，得到含有3UT-intron-3UT片段的重组质粒pSK-3UTi。

分别用HindIII/SalI限制酶和EcoRI/SpeI限制酶从pT-3TR上切下两段3TR片段，将该片段分别连接到pSK-intron载体中的限制性内切酶HindIII/SalI和EcoRI/SpeI位点间，得到含有3TR-intron-3TR片段的重组质粒pSK-3TRi。

其中pSK-intron的构建方法如下

通过PCR将拟南芥actin gene 11(ATU27981)的第三个内含子(GenBank AccessionNumber U27981的自5′端第1957-2111位)扩增出来，引物为：

Pint5’，TACGTAAGTAGATCTTCAACACC(下划线为snaBI酶切位点)；

Pint3’，GGAATTCTGCAAACACACAAGACAAT(下划线为EcoRI酶切位点)。扩增出来的155bp片段经snaBI(产生平末端)/EcoRI消化后连接到经EcoRV(产生平末端)/EcoRI消化的pBluscript II SK+(Stratagene公司产品)载体上，得到pSK-intron载体。pSK-intron的物理图谱如图5所示。

重组质粒pSK-3UTi和pSK-3TRi经HincII和SacI消化，各自切下3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段。pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)经XbaI酶切，Klenow酶补齐粘端，SacI酶切，分别与3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段连接，将3UT-intron-3UT片段和3TR-intron-3TR片段分别克隆到pCAMBIA1300双元载体的XbaI(经Klenow酶补齐末端)和SacI位点之间，上下游分别有35S启动子和NOS终止子。最终得到含有3UT-intron-3UT片段(称为3UTi)的重组质粒为35S-3UTi，含有3TR-intron-3TR片段的重组质粒35S-3TRi。

B、为了构建SD-CMV 3‘UTR来源的发夹RNA表达载体，以由CMV SD株系(SD-CMV)(植物基因组学国家重点实验室)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到SD-CMV RNA33’UTR 5’端1-200nt片段(即GenBank Accession NumberAB008777的自5′端第1919至2118位)(200bp)，命名为SD-3UT，引物分别为SD-3UT5，GTATACATCCGTGTTTCCCAGAACCCTC，SD-3UT3，AAGCTTTGGTCTCCTAAAGGAGGCTCCCAC。下划线部分分别为，为方便克隆而引入的HincII和HindIII位点，PCR产物连接到pGEM-Teasy载体上，经测序验证后分别得到其正反向插入的克隆，分别命名为pT-SD3UT(+)和pT-SD3UT(-)，其中pT-SD3UT(+)经HincII和HindIII消化后产生的片段连接到经同样酶消化的pSK-intron中间载体上，命名为pSK-SD3UT(+)，随后pT-SD3UT(-)经EcoRI和SpeI(pGEM-Teasy上有EcoRI和SpeI位点)的消化后产生的片段连接到经同样酶消化的pSK-SD3UT(+)上，这样就在intron的左右两侧反向连上了SD-3UT片段，得到的含有SD3UT(+)-intron-SD3UT(-)片段(即SD-3UTi片段)的载体命名为pSK-SD-3UTi，最后，pSK-SD-3UTi载体经HincII和SacI消化后产生的SD-3UTi片段连接到经SmaI和SacI消化的双元载体pCAMBIA1300(AF234296)上，得到重组质粒pCAMBIA1300-SD-3UTi(35S-SD-3UTi)。

(2)35S-3UTi注射本生烟(Nicotiana benthamiana)与siRNA表达检测

pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)或35S-3UTi或35S-3TRi经电击转化法转入根癌农杆菌EHA105(植物基因组学国家重点实验室)中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基上筛选阳性菌株。含有pCAMBIA 1300或35S-3UTi或35S-3TRi的农杆菌在LB液体培养基培养后用注射器注入本生烟草(Nicotiana benthamiana)(植物基因组学国家重点实验室)叶片组织中(English JJ，Mueller E，Baulcombe DC.Suppression of Virus Accumulationin Transgenic Plants Exhibiting Silencing of Nuclear Genes.Plant Cell 1996；8：179-88)，注射前将菌液的OD600吸光值调至1.0，注射剂量为注满整个叶片。每种质粒注射3株。注射后1，2，3天分别剪取每株注射叶，提取总RNA，进行siRNA的Northern杂交。

植物总RNA是选用Invrtrogen公司的TRIZOL提取试剂进行提取的，提取按照其操作说明进行。30μg总RNA经17％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行低分子量RNA的杂交，杂交方法参照参考文献(Reinhart BJ，Weinstein EG，Rhoades MW，BartelB，Bartel DP.MicroRNAs in plants.Genes Dev 2002；16：1616-26)。35S-3UTi和35S-3TRi来源的siRNA分别用α[³²P]-UTP标记的经体外转录产生的Q-CMV RNA33’UTR全长片段(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1877至2197位)探针进行杂交检测，体外转录试剂盒为Ambion的MAXIscript kit。溴化乙锭染色的5S rRNA用于低分子量RNA的上样量对照。同时以3株未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)作为对照。

结果表明，注射后1，2，3天，3株注有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)的叶片均未检测到来源于3’UTR发夹RNA的siRNA的表达，与3株未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)检测结果相同；相对于注有空载体的叶片，注射后1，2，3天，在3株注有35S-3UTi重组质粒的烟草叶片中均能够检测到来源于3’UTR发夹RNA 21-22bp的siRNA的表达；注射后1，2，3天，在3株注有35S-3TRi重组质粒的烟草叶片中均未检测到来源于3’UTR发夹RNA的21-22bp的siRNA的表达(图2中A)。图2中A，Marker是RNA分子梯度，Vector表示pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)，1、2、3分别表示注射后1，2，3天，WT为未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)。

2、共注射实验中3’UTR来源的siRNA可下调CMV靶标的表达

为了检测产生的siRNA是否能够成功下调CMV靶标的积累，构建了含有Q-CMV亚基因组RNA4全长的35S控制下的表达质粒35S-QR4(图2中B)，并与35S-3UTi共注射到烟草叶片中进行瞬时表达。结果正如预期一样，与空载体共注射相比，与发夹RNA的共表达导致瞬时表达RNA4的水平显著减少(图2中B)，RNA4的降解在第二天最明显，此时同样能检测到3UTi来源的siRNA(图2中B)。该结果表明3UTi来源的siRNAs具有在RISC复合物中降解靶标RNA的生物学活性。

Q-CMV的RNA13’UTR与RNA33’UTR之间的保守性高达83.2％，为了检测3UTi来源的siRNA对其他CMV靶标的降解效率，包含有3’UTR的Q-CMV RNA1部分序列(2428到3389，称为RNA1*)被克隆到35S下游，得到的重组质粒35S-QR1*。35S-QR1*与35S-3UTi共注射到烟草中，结果表明，注射后第三天RNA1*靶标的降解显著(图2中C)。但是，RNA1*靶标的降解要慢于RNA4靶标。考虑到这两组实验中siRNA的表达水平没有明显差异(见图2，B和2.C下部)，表明RNA33’UTR来源的siRNA-RISC对RNA1*靶标的剪切效率不如对RNA4高。这与前面的结论即RNA1和RNA33’UTR的5’端80％的相似性是一致的，而这种相似性的程度可能影响了对RNA1*靶标的降解效率。与这一现象一致，在35S-3UTi与另一含有SD-CMV(亚组IB)RNA4全长的靶标质粒35S-SDR4的共注射实验中，3UTi来源的siRNA对SD-CMV RNA4的剪切效率比对Q-CMV RNA1*的又有所降低(图2.D)，因为SD-CMV RNA4与Q-CMV RNA3的3’UTR5’端只有72.9％的相似性。

另外，在35S-SD-3UTi与35S-SDR4、35S-QR4和35S-QR1*三种靶标载体的共注射实验中，Northern杂交的结果也表明，SD-CMV 3UTi来源的siRNA同样能够下调CMV靶标RNA的表达水平，而且SD-CMV RNA4的减少最为显著，其次为Q-CMV RNA1*和Q-CMV RNA4，两者的降低水平差异不大，这与SD-CMV RNA4 3’UTR和Q-CMV RNA13’UTR与Q-CMV RNA4 3’UTR的相似度是一致的(分别为65.4％和63.7％)。无论如何，瞬时表达实验证明了3UTi来源的siRNA是具有依赖同源性的降解病毒RNA靶标的能力的。

具体实验方法和结果如下：

(1)重组质粒的构建

为了构建siRNA的CMV靶标表达载体，以由Q-CMV(植物基因组学国家重点实验室)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到包含Q-CMV RNA13’UTR的962bp的片段(称为QR1*)(即GenBank Accession Number X02733的自5′端第2428至3389位)，引物分别为QR1-5：TCTAGATCGAGTGCTTGTGGATGAAGTTG，QR1-3：TGGTCTCCTTATGGAGAACCTG，带下划线的部分为XbaI识别位点。PCR扩增产物连接到pGEM-Teasy载体上，测序验证后经XbaI和SacI消化后得到包含Q-CMV RNA13’UTR的962bp的片段，将该片段连接入用同样酶消化的pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)双元载体中，得到重组质粒35S-QR1*。另外两个靶标表达载体35S-QR4和35S-SDR4是首先分别以由Q-CMV(植物基因组学国家重点实验室)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，和由SD-CMV(植物基因组学国家重点实验室)的总RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增Q-CMV RNA3的3’UTR的1031bp的片段(称为QR4，即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1167至2197位)和SD-CMVRNA3的3’UTR的1009bp的片段(称为DR4，即GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1211至2219位)。得到的片段经测序验证后经XbaI和SacI消化连接到pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)上得到的。PCR扩增QR4的引物分别为：QR4-5，5’-TCTAGAGTTTAGTTGTTCACCTGAGTC-3’和QR4-3，5’-GAGCTCTGGTCTCCTTATGGAGAAC-3’；PCR扩增SDR4的引物分别为：SDR4-5，5’-TCTAGAGTCTGTGTGTTGTGTTTTTC-3’，和DR4-3，5’-GAGCTCTGGTCTCCTAAAGGAGGCT-3’。下划线部分为方便克隆引入的XbaI和SacI限制性酶切位点。

(2)农杆菌注射本生烟(Nicotiana benthamiana)

35S-3UTi、35S-QR1*、35S-QR4或35SSDR4经电击转化法转入根癌农杆菌EHA105中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基上筛选阳性菌株。将OD600为1.5的携带有35S-3UTi的菌液与OD600为0.5的携带有靶标重组质粒(35S-QR1*，35S-QR4和35S-SDR4中的任一种)的菌液等体积混合，用注射器注入本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶片组织中(English JJ，Mueller E，BaulcombeDC.Suppression of Virus Accumulation in Transgenic Plants ExhibitingSilencing of Nuclear Genes.Plant Cell 1996；8：179-88)，注射剂量为注满整个叶片。每种质粒注射3株。注射后1，2，3天分别剪取每株注射叶，提取总RNA，进行高分子量Northern杂交(检测siRNA的靶标的积累)和低分子量Northern杂交。

在高分量RNA杂交分析中，8μg总RNA在含有1％甲醛的琼脂糖胶(浓度为1.2％)中进行电泳分离，并转移到Hybond-N+膜上。然后将膜与用α[³²P]-dCTP标记的DNA探针进行杂交，选用Amersham公司的Random Primer labeling Kit进行探针标记。检测siRNA的靶标Q-CMV RNA1*的积累选用Q-CMV基因组RNA1(即GenBank AccessionNumber X02733的自5′端第2720至3019位)为特异探针进行杂交，检测siRNA的靶标Q-CMV RNA4的积累选用Q-CMV基因组RNA3(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1220至1876位)为特异探针进行杂交，检测siRNA的靶标SD-CMV RNA4的积累选用SD-CMV基因组RNA3(即GenBank Accession Number AB008777的自5′端第1263至1918位)为特异探针进行杂交。亚甲蓝染色的28S rRNA用于高分子量RNA的上样量对照。同时以3株未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)作为对照。

低分子量杂交方法同步骤1。

结果表明注射后1，2，3天，3株注有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)和35S-QR4的叶片均未检测到来源于3’UTR发夹RNA的siRNA的表达，与3株未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)检测结果相同。相对于注有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)和35S-QR4的叶片，注射后2和3天，在3株注有35S-3UTi和35S-QR4重组质粒的烟草叶片中均能够检测到来源于3’UTR发夹RNA的21-22bp的siRNA的表达；同时表明瞬时表达RNA4的水平显著减少，RNA4的降解在第二天最明显。该结果表明3UTi来源的siRNAs具有在RISC复合物中降解靶标RNA的生物学活性。(图2中B)。图2中B，Marker为RNA分子梯度，Vector表示pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)，1、2、3分别表示注射后1，2，3天，WT为未转化的本生烟(Nicotiana benthamiana)。

另外，在35S-SD-3UTi与35S-SDR4、35S-QR4和35S-QR1*三种靶标载体的共注射实验中，Northern杂交的结果也表明，SD-CMV 3UTi来源的siRNA同样能够下调CMV靶标RNA的表达水平，而且SD-CMV RNA4的减少最为显著，其次为Q-CMV RNA1*和Q-CMVRNA4，两者的降低水平差异不大，这与SD-CMV RNA43’UTR和Q-CMV RNA1 3’UTR与Q-CMV RNA4 3’UTR的相似度是一致的(分别为65.4％和63.7％)。

3、转基因植物中3UTi来源的siRNA的表达导致植物从CMV病毒侵染中恢复的现象

得到瞬时表达实验的证据后，将35S-3UTi重组质粒转入烟草，以转有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)的转基因烟草作为负对照。总共得到了47个独立的转基因株系中，将转基因植物T1代经抗性筛选后移入土中培养。转基因植物的T1代首先进行Northern杂交检测3UTi来源的siRNA的积累水平，结果表明，47个株系中有20个能够检测到siRNA的表达，这20个株系中siRNA的积累水平也很不一致(图3.A)，根据siRNA的积累水平可将这20个转基因株系分为三组。组I包括株系6，15，17，24，28，40和45，siRNA的积累水平最低；组II包括株系8，20，27，34，37，38和43，具有中等水平的siRNAs积累；组III包括株系7，13，18，21，33和42，积累的siRNA最多(图3.A)。

为了检测这三组转基因株系对CMV侵染的敏感性，T1代转基因植物进行Q-CMV攻毒实验。CMV侵染4-6天后通常后造成烟草系统侵染叶失绿等症状。攻毒实验观察表明，转有空载体的对照植株表现出与野生型烟草一样的感病症状，所有的转有35S-3UTi重组质粒的转基因烟草都表现出一定程度的对Q-CMV侵染的保护功能，具体表现在大多数攻毒植株的病症减少或者延迟。仅有很少的转基因植株表现出对Q-CMV侵染的完全抗性。有趣的是，虽然在组I中完全抗性的比例(3.7％)较之组II(9.09％)和组III(7.84％)有些许降低，但三组转基因植物中，感病植物都有在感病后表现出恢复健康表型的抗性植物的存在(表1)。这表明3UTi来源的siRNA的积累水平或许不是决定对CMV侵染敏感性的唯一因素。攻毒实验25天后，每组选择两棵植物，以Q-CMV CP序列为特异探针进行的Northern杂交的结果表明(图3.B，上半部分第2，4，6，8，10，12，14和16列)，在每组感染的转基因植物中，侵染症状的减少伴随着侵染叶中病毒RNA积累水平的下降。这一结果进一步证明了35S-UTi转基因植物的抗CMV程度与siRNA的积累水平并没有强相关性。观察发现，攻毒17天后新生叶感病症状就开始减轻，25天后新生叶中的病毒RNA水平显著减少(见图3.B，上面)。在三次独立攻毒实验中，所有三个组的转基因植物都发现了这种恢复现象，而且在恢复现象出现的比例上没有显著不同(表1)。

为了检测转有35S-3UTi的转基因植株对CMV病毒是否具有广谱抗性，又进行了亚组IB SD-CMV的攻毒实验。结果表明，感染后的野生型烟草出现更明显的失绿症状，而且系统新生叶出现卷曲现象(图4.A，左图)，与Q-CMV攻毒实验一致，所有的转基因植株都表现出对SD-CMV侵染某种程度的保护作用，大部分植物病状减轻或延迟，并且以SD-CMV CP序列为特异探针进行的Northern杂交结果表明，侵染叶中病毒RNA积累水平显著降低(图3.B中第2，4，6，8，10，12，14和16)。但是，系统新生叶中病毒RNA的减少不如Q-CMV攻毒实验中那么明显，这与瞬时表达实验中3UTi来源的siRNAs对SD-RNA4靶标的剪切效率不如Q-CMV RNA4靶标的结果是符合的(图2.D)。但是，大多数经SD-CMV攻毒实验的转基因植株中也发现了恢复现象。因为SD-CMV侵染野生型烟草的强烈的失绿和叶型卷曲症状，使转基因烟草的恢复抗性表型更为明显(图4.B)。结合CMV不同亚组病毒的攻毒实验，结果表明，3’UTR来源的发夹RNA产生的siRNAs在RISC介导的对病毒RNA 3’UTR的剪切中是具有生物学功能的，这种剪切导致了转基因植物对CMV病毒侵染表现出同源依赖性的恢复现象。证明了表达3’UTR来源的hpRNA烟草具有诱导型广谱抗CMV效应。

具体实验方法和结果如下：

35S-3UTi经电击转化法转入根癌农杆菌EHA105中，并在含有10μg/mL的利福平和含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基上筛选阳性菌株。利用与携带有重组质粒的农杆菌共培养方法进行烟草(Xanthi.nc)(植物基因组学国家重点实验室)转化。具体方法如下：

①无菌苗准备：将烟草种子在37℃浸泡过夜，再用30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水洗3-5次，转移到装有MS固体培养基的玻璃高瓶中，光照培养。

②预培养：将无菌苗叶片切除边缘和中脉后切成0.5cm×0.5cm的小块，置于MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基上预培养两天。

③农杆菌的准备：从平板上挑取新鲜单菌落或冻存的液体菌种，接种到2ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀＝0.6~0.8。

④侵染：将农杆菌菌液于室温条件下，4000rpm，离心10min，沉淀悬浮于10ml MS液体培养基中，将预培养的叶片放入菌液中浸泡15min，期间轻轻摇动。

⑤共培养：取出叶片，置于无菌滤纸上吸去附着的菌液；放回MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基上，暗处共培养两天。

⑥选择培养：将经过共培养的叶片转移到MS+BAP(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧苄霉素)(500mg/L)的分化培养基上，光照培养3-4周左右。

⑦继代培养：当叶盘分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织时，将这些抗性材料转移到新的分化培养基中上进行继代培养。

⑧生根培养：待不定芽长到1cm左右时，将其切下并转到MS+Kan(卡那霉素)(200mg/L)+Cef(羧苄霉素)(500mg/L)生根培养基上，2周左右长出不定根，当不定根长到2-3cm时，取出植株，彻底清除根部培养基，移入土壤中培养，成熟后收种。

总共得到了47个独立的转35S-3UTi株系。得到的35S-3UTi T1代转基因烟草种子在含有潮霉素(20mg/L)的MS培养基的平板上筛选抗性植株转移至土壤中，每个株系各10株。同时以转有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)的转基因烟草作为负对照。长至6片叶龄时，取第4片叶进行siRNAs积累水平的Northern杂交检测，方法同步骤1。结果表明，47个株系中有20个能够检测到siRNA的表达，这20个株系中siRNA的积累水平也很不一致(图3中A)；49株转有空载体pCAMBIA-1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)的转基因烟草均未检测到siRNA的表达。根据siRNA的积累水平可将这20个转基因株系分为三组。组I包括株系6，15，17，24，28，40和45，siRNA的积累水平最低；组II包括株系8，20，27，34，37，38和43，具有中等水平的siRNAs积累；组III包括株系7，13，18，21，33和42，积累的siRNA最多(图3中A)(图3中共检测了47个株系的转基因植物，图中显示的是有siRNA表达的20个株系的siRNA的积累情况，每个株系选择5棵植物，样品混在一起提取RNA进行杂交)。图3中A具有两位小数的数值表示结合到膜上的同位素探针的放射强度(代表膜上RNA的积累量)。

这20个株系长至8片叶龄时进行病毒侵染实验，毒源为CMV(Q株系或SD株系)(植物基因组学国家重点实验室)，实验设三次重复。侵染方法是首先在新鲜的转基因植株叶面喷布一层金刚砂，然后将感染有CMV的烟草新鲜叶片组织在磷酸缓冲液(pH 7.2)中匀浆，浓度为500mg/ml磷酸缓冲液，感染时用手蘸取匀浆液轻轻涂抹于转基因植株叶表，每株感染三个叶片，全部涂完10分钟后用清水冲洗掉叶面的金刚砂，保湿24小时，转入温室正常培养，25天后观察表型，同时每组选择两个株系，每个株系各3株，从感染叶(L)和系统未感染叶(感染叶上方第五片叶，S)中提取总RNA，8μg总RNA用于Nortern杂交，Q株系侵染的转基因株系探针选用Q-CMV RNA4特异探针(即GenBank Accession Number M21464的自5′端第1220至1876位)，SD株系侵染的转基因株系探针选用SD-CMV RNA4特异探针(即GenBankAccession Number AB008777的自5′端第1263至1918位)杂交方法同步骤2的高分子量杂交。

攻毒25天后，观察发病情况，以叶片光滑无明显皱缩，无花叶矮化症状，CMV RNA积累量低为抗性标准。49株转有空载体pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)的对照植株表现出与10株野生型烟草一样的感病症状：如叶片皱缩卷曲，花斑失绿，植株矮化等。上述20个株系的每个株系转有35S-3UTi重组质粒的转基因烟草都表现出一定程度的对Q-CMV侵染的保护功能，具体表现在大多数攻毒植株(72.22％-89.09％，见表1)的病症减少或者延迟(表型观察表明叶片无明显皱缩，无失绿花斑，植株未见矮化，Northern杂交数据显示病毒积累量降低)。图4中B上部显示的是一株未转基因未被病毒侵染的野生型烟草(图中以Mock表示)、一株转pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)烟草(图中以Vector表示)和一株转35S-3UTi烟草(图中以35S-3UTi表示)在Q-CMV攻毒后25天的表型。仅有很少的转35S-3UTi植株表现出对Q-CMV侵染的完全抗性(全株无病)。有趣的是，虽然在组I中完全抗性的比例(3.7％)较之组II(9.09％)和组III(7.84％)有些许降低，但三组转基因植物中，都有在感病后表现出恢复健康表型的抗性植株的存在(表1)。这表明3UTi来源的siRNA的积累水平或许不是决定对CMV侵染敏感性的唯一因素。表1是三次独立攻毒实验的结果。其中，组I中，株系6，15，17，24，28，40和45分别8、7、7、8、8、8、8株；组II中，株系8，20，27，34，37，38和43分别8、8、7、8、8、8、8株；组III中，株系7，13，18，21，33和42分别9、8、8、8、9、9株。

表1、Q-CMV攻毒后25天，各株系对Q-CMV的抗性

以Q-CMV CP序列为特异探针进行的Northern杂交的结果表明，在每组感染的转35S-3UTi烟草中，侵染症状的减少伴随着侵染叶中病毒RNA积累水平的下降(图3中B为每个株系出现10棵表现恢复抗性表型植株混合样品提取RNA进行Northern检测的结果，上半部分第2，4，6，8，10，12，14和16列)。观察发现，攻毒17天后新生叶感病症状就开始减轻，25天后新生叶中的病毒RNA水平显著减少(见图3中B，上面，见图中数据，图3中B的具有两位小数的数值表示结合到膜上的同位素探针的放射强度(代表膜上RNA的积累量))。在三次独立攻毒实验中，所有三个组的转基因植物都发现了这种恢复现象，而且在恢复现象出现的比例上没有显著不同(表1)。

亚组IB SD-CMV的攻毒实验结果表明，感染后的10株转pCAMBIA1300烟草出现更明显的失绿症状，而且系统新生叶出现卷曲现象，与Q-CMV攻毒实验一致，所有的转35S-3UTi植株都表现出对SD-CMV侵染某种程度的保护作用，70％-73.81％转基因植物病状减轻或延迟(见表2，表型观察表明叶片无明显皱缩，无失绿花斑，植株未见矮化，Northern杂交数据显示病毒积累量降低)。图4中A左图显示的是一株转pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)烟草(图中以Vector表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型；图4中A右图显示的是一株转35S-3UTi烟草(图中以35S-3UTi表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型。

并且以SD-CMV CP序列为特异探针进行的Northern杂交结果表明，转35S-3UTi烟草侵染叶中病毒RNA积累水平显著降低(图3.B下部中第2，4，6，8，10，12，14和16)。但是，系统新生叶中病毒RNA的减少不如Q-CMV攻毒实验中那么明显，这与瞬时表达实验中3UTi来源的siRNAs对SD-RNA4靶标的剪切效率不如Q-CMV RNA4靶标的结果是符合的(图2.D)。但是，经SD-CMV攻毒实验的转基因植株中70.83％也发现了恢复现象(120株转基因植株中有85株)。因为SD-CMV侵染野生型烟草的强烈的失绿和叶型卷曲症状，使转基因烟草的恢复抗性表型更为明显(图4中B)。图4中B下部显示的是一株野生型未被病毒侵染的野生型烟草(图中以Mock表示)、一株转pCAMBIA1300(AF234296，澳大利亚CAMBIA公司产品)烟草(图中以Vector表示)和一株转35S-3UTi烟草(图中以35S-3UTi表示)在SD-CMV攻毒后25天的表型。结合CMV不同亚组病毒的攻毒实验，结果表明，3’UTR来源的发夹RNA产生的siRNAs在RISC介导的对病毒RNA 3’UTR的剪切中是具有生物学功能的，这种剪切导致了转基因植物对CMV病毒侵染表现出同源依赖性的恢复现象。证明了表达3’UTR来源的hpRNA烟草具有诱导型广谱抗CMV效应。

表2、SD-CMV攻毒后25天，各株系对Q-CMV的抗性

Claims (2)

1.一种培育抗黄瓜花叶病毒植物的方法，是使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA，得到抗黄瓜花叶病毒的植物；

所述使目的植物表达黄瓜花叶病毒3’UTR来源的siRNA方法为，将在多克隆位点插入来自黄瓜花叶病毒Q株系的RNA3的3’UTR的5′端序列构建成的发夹结构的重组真核细胞表达载体导入目的植物中；

所述黄瓜花叶病毒Q株系的RNA3的3’UTR的5′端序列为GenBank AccessionNumber M21464的自5′端第1894至2089位的196bp的核苷酸序列；

所述植物为烟草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组真核细胞表达载体为35S-3UTi。

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