CN104694535A - 体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性rna及其鉴定和应用 - Google Patents

体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性rna及其鉴定和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性RNA及其鉴定和应用。本发明研究表明，体内病原体会释放非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，这些特定的ncRNA可作为体内病原体的生物标志物，可有效地用于体内病原体的检测和治疗，从而显著改善微生物感染性疾病的诊断和治疗。本发明还提供了鉴别体内病原体来源的ncRNA的方法。本发明为抑制微生物和/或微生物性疾病提供了一种新的治疗策略。

Description

体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性RNA及其鉴定和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性RNA及其鉴定和应用。 
背景技术
微生物(Microorganism)是广泛存在于自然界中的一群肉眼看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍甚至数万倍才能观察到的微小生物的总称。它们具有体形微小、结构简单、繁殖迅速、容易变异及适应环境能力强等特点。 
微生物种类繁多，在自然界中的分布极为广泛。在人类、动物和植物的体表及其与外界相通的腔道中也有多种微生物存在。 
微生物对人类最重要的影响之一是导致某些疾病，尤其是传染病。虽然在疾病的预防和治疗方面，人类已取得了长足进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，许多疾病一直缺乏有效的治疗药物。此外，大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致危害更大的耐药性菌株的产生。 
凡是生长在活的生物体外或体内的微生物，都称为寄生微生物，寄生生活的微生物靠剥夺其他生物的营养，甚至靠其他生物的身体的某部分作为营养。微生物可通过口腔、皮肤或呼吸道进入人或动物体内，利用人或动物体的营养生长繁殖。如果这些细菌产生毒素，就会使人生病，如霍乱、伤寒、肺炎等。艾滋病、感冒等疾病则是由病毒引起的。病毒是更专一的寄生微生物，因为它们离开活细胞就不能生活，所以叫做严格寄生微生物。 
微生物感染(Microbial infection)是临床常见的微生物导致的疾病。细菌性疾病的诊断,绝大多数均需进行细菌学诊断以明确病因。然而自标本中分离到细菌并不一定意味该菌为疾病的病原，因此应根据病人的临床情况、采集标本的部位、获得的细菌种类进行综合分析。有时尚需做毒力、细胞及动物等试验以确定该菌株的致病性。 
由于细菌及其代谢产物具有抗原性，细菌性感染还可通过检测抗体进行诊断。此外，近年来还发展起来通过检测细菌的遗传物质对细菌的遗传物质对细菌 进行诊断的新方法—基因诊断方法。但上述检测方法操作繁琐，对检测样本采集及保存要求严格，同时检测结果假阳性率高，检测周期长，易对患者病情造成延误。 
病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。现有病毒检测方法的缺陷是：病毒检测所需的样本取材，保存及运输要求更为严格，样本取材易受采集者主观因素影响，导致病毒检测的假阳性或假阴性率均较高，影响临床治疗效果。 
感染性疾病，特别是慢性持续性感染，是危害人类健康与生命的全球性顽疾之一。对人类有重要影响的胞内病原体，包括结核分枝杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌、嗜肺军团菌、李斯特菌和麻风杆菌等。结核、AIDS、肝炎等七大病构成全球性威胁的疾病，其治疗困难的原因与病原体的胞内寄生性密切相关。 
针对胞内微生物感染的治疗是一难题。主要原因包括：当这些病原体侵入并潜伏于细胞内，常规的抗生素很难运送到细菌所潜伏的细胞内，并且即使运送到，浓度也很难达到有效杀菌效果；抗体不能进入细胞内发挥作用；当胞内菌成功寄生细胞后，不仅能够逃逸免疫吞噬、杀伤和清除，而且可在细胞内长期存在，在适当时机(如机体免疫力下降)导致机体发病。 
因此，针对微生物感染疾病，本领域迫切需要开发新的操作简单、结果准确的诊断和治疗技术，以便改善此类疾病的实验室诊断及临床治疗，避免患者病情延误，减轻患者身体及经济负担。 
发明内容
本发明的目的就是提供一种针对微生物感染的操作简单、结果准确的诊断和治疗方法。 
在本发明的第一方面，提供了一种分离的非编码RNA(ncRNA)序列，所述的非编码RNA序列是动物体内的病原体所释放的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)序列。 
在另一优选例中，所述的非编码RNA序列是所述体内的病原体所特有的，并且在健康动物体内是不存在的。 
在另一优选例中，所述的健康动物指未被所述病原体所感染或寄生的动物。 
在另一优选例中，所述的病原体包括感染微生物、寄生微生物、和/或共生微生物。 
在另一优选例中，所述的病原体包括细菌、病毒、衣原体、支原体。 
在另一优选例中，所述的病原体包括沙门氏菌、流感病毒、副流感病毒、奈 瑟氏菌、禽流感病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒。 
在另一优选例中，所述的非编码RNA包括microRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA、mRNA-like的非编码RNA、mRNA中的非翻译区。 
在另一优选例中，所述的非编码RNA选自下组：SEQ ID No.:1、2、3、4、5、12、13、14、或15所示的RNA序列。 
在本发明的第二方面，提供了一种来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的用途，所述非编码RNA序列被(a)用于制备检测所述病原体的检测试剂、检测芯片或试剂盒；(b)用作检测所述病原体的检测标志物。 
在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、探针。 
在另一优选例中，所述的试剂盒包括特异性检测所述非编码RNA的试剂以及使用说明书。 
在本发明的第三方面，提供了一种制品，所述制品含有第一方面所述的分离的非编码RNA序列、或含有用于检测第一方面所述的分离的非编码RNA序列的检测试剂。 
在另一优选例中，所述制品包括试剂盒和芯片。 
在本发明的第四方面，提供了一种特异性抑制或阻断本发明第一方面所述的miRNA的抑制剂。 
在另一优选例中，所述的抑制剂是miRNA海绵(sponge)、与miRNA序列互补的反义核酸、小分子化合物。 
在另一优选例中，所述的抑制剂是与(i)或(ii)中所述miRNA的核苷酸序列互补的核酸(如RNA、DNA或类似物)。 
在本发明的第五方面，提供了一种抑制剂的用途，所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂，所述抑制剂被用于制备抑制所述病原体感染或寄生的药物；或用于制备治疗所述病原体感染疾病的药物。 
在另一优选例中，所述的抑制剂包括化合物。 
在另一优选例中，所述的抑制剂包括反义核酸序列。 
在本发明的第六方面，提供了一种体外非治疗性抑制病原体的方法，包括步骤：在抑制剂存在下，培养所述的病原体，其中所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂。 
在另一优选例中，所述的病原体属于动物体内病原体。 
在本发明的第七方面，提供了一种抑制病原体感染或寄生于动物的方法，给需要的对象施用抑制剂，其中所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂。 
在本发明的第八方面，提供了一种治疗病原体感染疾病或寄生疾病的方法，给需要的动物对象施用抑制剂，其中所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂。 
在本发明的第九方面，提供了一种分离的或人工构建的前体核酸序列，所述的前体核酸序列能在动物细胞内剪切并表达成如第一方面所述的非编码RNA序列（ncRNA）。 
在本发明的第十方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体核酸序列，所述的前体核酸序列（如miRNA）能在人细胞内被剪切且表达成如第一方面所述的ncRNA。 
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构： 
Seq正向-X-Seq反向
式I 
式I中， 
Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的ncRNA的核苷酸序列； 
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列； 
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq 反向不互补； 
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构： 
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述， 
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。 
在本发明的第十一方面，提供了一种载体，所述载体含有第一方面所述的ncRNA，或第十方面所述的多核苷酸。 
在本发明的第十二方面，提供了一种核酸芯片，所述的核酸芯片包括： 
固相载体；以及 
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获第一方面所述的ncRNA。 
在本发明的第十三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断第一方面所述的ncRNA的抑制剂。 
在另一优选例中，所述的抑制剂是miRNA海绵(sponge)、与miRNA序列互补的反义核酸、小分子化合物。 
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 
附图说明
图1显示了对于体内病原体沙门氏菌的ncRNA的鉴定结果。其中sal-1,2,3,4,5代表检测的是同种沙门氏菌中不同的milRNA，mock是指用PBS作处理模拟细菌感染，故在细胞内没检测到sal-1,2,3,4,5。 
图2显示了病原体沙门氏菌的ncRNA的电泳图。其中各泳道如下： 
第1道代表分子量标准； 
第2道代表sal-1标准品； 
第3道代表mock模拟感染(PBS处理)； 
第4道代表LB培养的沙门氏菌SE2472(未接触细胞)； 
第5道代表沙门氏菌SE2472感染HT-29细胞； 
图3显示了沙门氏菌sal-1与pre-sal-1的关系。 
图4显示了沙门氏菌sal-1可调控iNOS上的两个靶位点。 
图5显示了在RAW264.7细胞中转入iNOS全长的表达质粒，sal-1同样可成功调控iNOS的表达。 
图6显示了沙门氏菌milRNA(sal-1)对靶基因iNOS的调控作用。 
图7显示了Sal-1在沙门氏菌感染小鼠中的调控作用。 
图8显示了H5N1miRNA前体茎环结构的分析结果。 
图9显示了H5N1感染的细胞中候选miRNA的定量PCR检测和northern blot检测结果。 
图10显示了miR-HA-3p与人类和小鼠PCBP2 mRNA 3'端结合位点。 
图11显示了H5N1流感病毒分泌的miR-HA-3p直接作用于PCBP2 mRNA的3'端并下调蛋白表达。 
图12显示了针对miR-HA-3p的抑制剂可以使小鼠获得对禽流感H5N1的抵抗力。 
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，体内病原体(包括感染微生物、寄生微生物、共生微生物等)会释放非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，这些特定的ncRNA可作为体内病原体的生物标志物，可有效地用于体内病原体的检测和治疗，从而显著改善微生物感染性疾病的诊断和治疗。在此基础上完成了 本发明。 
具体地，本发明的研究表明，体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物均可通过ncRNA参与生理稳态以及疾病的发生发展。通过鉴定和检测不同病原体所特有的ncRNA(作为病原体的生物标志物)，可以准确、快速地检测出不同的病原体。此外，基于体内病原体利用宿主系统所加工产生的ncRNA，可针对性地进行抑制和消除(如通过反义RNA技术)，从而进行微生物感染疾病的治疗。基于ncRNA的治疗，为抑制微生物和/或微生物性疾病提供了一种新的治疗策略。 
术语 
如本文所用，术语“微生物”包括病毒、细菌、衣原体等各种微小生物。在本发明中，“体内微生物”指存在于宿主(人或其他动物)体内的各种微生物，包括感染微生物、寄生微生物、和共生微生物。一类典型的体内微生物是可导致疾病的病原体。 
在本发明中，根据病原体与宿主细胞的关系，病原体可分为胞外菌和胞内菌两类。胞外菌是指在宿主细胞外的细胞间隙、血液、淋巴液、组织液等体液中生长繁殖的细菌。胞内菌又被分为两种：兼性胞内菌是指在宿主体内主要寄居在细胞内生长繁殖，体外无活细胞的培养基中亦可生长。专性胞内菌则不论在体内体外，都必须在活细胞内生长繁殖。 
如本文所用，术语“milRNA”即microRNA like，指来源于细菌的类似于microRNA的RNA序列。 
如本文所用，术语“sRNA”即small non-coding RNA，指微小的非编码性的RNA序列。在本发明中，sRNA包括microRNA以及milRNA。 
如本文所用，术语“Agomir”指miRNA刺激剂。Agomir可根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的双链小RNA分子,是用于模拟内源性成熟体miRNA序列。通常，agomir包括一条与目标miRNA成熟体序列一致的序列，以及一条与miRNA成熟体序列互补的序列。特异的microRNA agomir能够被导入到表达对应microRNA的细胞内，模拟microRNA的作用，或者与构建有miRNA结合位点的双荧光素酶报告系统结合，验证miRNA与靶基因之间的调控关系。 
如本文所用，术语“Antagomir”指miRNA阻断剂。Antagomir可根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。 
Agomir和antagomir可根据所提供的短RNA的序列，用常规方法进行设计和合成。 
如本文所用，术语“Ago2”指argonaute RISC catalytic component 2。它 是构成RISCs复合物的主要成分，参与干涉性短RNA-介导的基因沉默(short-interfering-RNA-mediated gene silencing)。 
iNOS，指诱导型一氧化氮合成酶。 
非编码RNA 
非编码RNA(Noncoding RNA，ncRNA)，指的是不被翻译成蛋白质的RNA，其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等各种不同的RNA，这些RNA从基因组上转录而来，不翻译成蛋白，但是参与蛋白质翻译过程，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能。例如，snRNA、snoRNA参与RNA剪接和RNA修饰。 
非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等；大于500nt，包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带polyA尾巴的非编码RNA等。 
snRNA是small nuclear RNA的简称，也称作小核RNA。其功能是与蛋白因子结合形成小核核糖蛋白颗粒(small nuclear ribonucleo-protein partcle，简称snRNPs)，行使剪接mRNA的功能。 
snoRNA是最早在核仁发现的小RNA，称作小核仁RNA，最初发现它们的生物功能是用来修饰rRNA的。大多数小核仁RNA可以分为两类。一类是C Dbox snoRNA，这一类snoRNA是对RNA的碱基进行甲基化修饰的。另一类是H/ACA box，这一类snoRNA对RNA的碱基进行甲尿嘧啶化修饰。其特点是形成一个双stem，中间加一个loop区，中间的loop区中有一个boxH。而在尾部的tail有个boxACA。由于boxH和boxACA的一级序列特征的界定比较松。 
miRNA是小的RNA分子与转录基因互补，介导基因沉默。MicroRNA是一类21-23nt的小RNA，其前体大概是70-100nt左右，形成标准的茎(stem)结构，加工后成为21-23nt的单链RNA。microRNA的作用机制是与mRNA互补，让mRNA沉默或者降解。基于miRNA机制所开发的RNAi技术，就是利用类似microRNA的small RNA来沉默对应的mRNA。 
gRNA又称引导RNA，指真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA。 
eRNA，从内含子(introns)或非编码DNA转录的RNA分子，精细调控基因的转录和翻译效率。 
信号识别颗粒RNA，指细胞质中与含信号肽mRNA识别，决定分泌的RNA功能分子。 
pRNA，指噬菌体RNA。例如，研究表明，fi29噬菌体中用6个同样的小RNA 分子利用ATP参与DNA的包装。 
tmRNA，指具有tRNA样和mRNA样复合的RNA。tmRNA广泛存在细菌中，识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问题的核糖体的崩解。 
此外，mRNA中的非翻译区，包括内含子区域和核糖体识别元件如5'-UTR,3'-UTR等，也可看作非编码RNA。 
机理 
为了便于理解本发明，本发明人提供以下机理。然而，应理解，这些机理并不用于对本发明产生任何限定。 
本发明的研究揭示，微生物感染人体后，会分泌一些自身的ncRNA并进入循环系统，由于这些ncRNA是来自于微生物本身，因此，可以作为微生物感染疾病诊断标志物。 
典型地，存在于血清的、微生物来源的ncRNA可作为微生物感染疾病诊断标志物。这些血液或血清中的病原体特有的ncRNA，可极大地提高微生物感染性疾病的诊断效率，为疾病本身的治疗提供极大的帮助，具有重要的临床意义，同时，深入研究微生物来源ncRNA将为此类疾病的发病或感染机理提供新线索。 
鉴定方法 
本发明还提供了一种通用的鉴别病原体来源的ncRNA的方法， 
以血清或血液中存在的病原体ncRNA的鉴别为例，该鉴定方法通常包括以下步骤： 
a.收集各种微生物(包括细菌，病毒，支原体，衣原体等)感染患者的血液或血清样本； 
b.利用高通量测序技术及生物信息学分析比对相结合的手段，初筛患者血液或血清中微生物来源的一组sRNA(包括miRNA)； 
c.进一步运用灵敏的，准确的实时荧光定量PCR对初筛的sRNA进行验证，找出各种微生物感染患者血清中各自特异的，来源于微生物本身的血清sRNA并评价其对于疾病本身的诊断价值。 
在本发明中，对于鉴别出的病原体来源的ncRNA，可进一步评价所述ncRNA作为诊断标志物的可行性。 
在本发明中，对于鉴别出的病原体来源的ncRNA，可进一步评价所述ncRNA在病原体感染中所起的作用。 
一种典型的方法是通过体外细胞感染实验进行分析。该方法通常包括以下步 骤： 
a.用各种微生物(包括细菌，病毒，支原体，衣原体等)感染细胞，收集感染后细胞培液； 
b.利用高通量测序技术(Solexa测序技术)及生物信息学分析比对相结合的手段，初筛细胞培液中微生物来源的一组sRNA(包括miRNA)； 
c.进一步运用灵敏的，准确的实时荧光定量PCR对初筛的sRNA进行验证。 
通过本发明所提供的上述方法，可鉴别并评价微生物感染疾病患者体液、血液(或血清)中来源于微生物本身的一种或多种ncRNA(包括miRNA)对微生物感染疾病诊断的特异性，准确性，并与现有的临床诊断方法作比较。 
前体核酸序列 
ncRNA(如miRNA等)可从前体核酸序列如miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。 
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8个不匹配的核苷酸。 
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获 得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。 
反义寡核苷酸 
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。 
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。 
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。 
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到动物(如病原体感染患者)体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。 
多核苷酸构建物 
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。 
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构： 
Seq正向-X-Seq反向
式I 
式I中， 
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列； 
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补； 
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构： 
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述； 
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。 
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。 
所述的表达载体可优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。 
检测试剂、检测芯片和检测试剂盒 
本发明还提供了一种用于检测病原体病毒或病原体的试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的检测试剂、或检测芯片。所述的试剂盒可用于检测本发明的病原体特异性miRNA的表达谱；或用于检测病原体病毒或病原体，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。 
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。 
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。 
核酸芯片 
核酸芯片（如microRNA表达谱芯片）通常含有多上百、上千或更多个探针，涵盖多种microRNA，利用双链同源互补的原理检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中的microRNA的转录水平进行检测。 
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究 其表达谱以及miRNAs的调节方式。 
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于检测病原体病毒或病原体。 
本发明的所述的miRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括针对SEQ ID NO:1-4所示的序列的核酸序列。 
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。 
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。 
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。 
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。 
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。 
药物组合物 
本发明还提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的本发明miRNA(即miR-HA-3p)的抑制剂、阻断剂或拮抗剂。 
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。 
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物(如哺乳动物和禽类)而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。 
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。 
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。 
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。 
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备治疗病原体、缓解病原体症状、减少宿主动物中病原体病毒数量等。 
应用 
本发明的研究率先揭示了体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物调控宿主的新手段。通过分泌途径，不同的体内病原体(如体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物)将其产生的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)递呈给宿主细胞，“借助”宿主的蛋白，影响宿主的免疫系统，从而有助于体内病原体在宿主体内存活。因此，通过干扰或抑制病原体特异性的ncRNA，是抑制微生物感染和治疗微生物性疾病的新途径。 
基于本发明发现，可将病原体特异性的ncRNA用作检测(或诊断)标志物，并且作为治疗靶标。 
以沙门氏菌为例，沙门氏菌将细菌自身所编码的非编码RNA(ncRNA)呈递到宿主细胞内，借助细胞的microRNA剪切系统，产生出类似microRNA的milRNA，运用milRNA调控免疫系统(如iNOS)，进而被细菌利用，保护其免于被宿主清除。利用milRNA的inhibitor吸附milRNA可有效抑制细菌在细胞内的存活能力，导致细菌生存能力下降，故可运用于治疗细菌感染。 
以禽流感为例，寄生微生物禽流感病毒H5N1分泌miR-HA-3p，miR-HA-3p通过作用于PCBP2抑制RIG-I/MAVS通路的负调控，最终导致细胞因子产生的增多和身体炎症应答的加重。antagomir-HA-3p(miR-HA-3p的抑制剂)处理过的小鼠对H5N1有较强的抗性，并且感染后体重流失较少，存活时间较长。由于miR-HA-3p在H5N1分离出的病毒株中有较强的保守性，所以它可以作为一个重要治疗H5N1的因素。antagomir-HA-3p可作为一种有效的环节H5N1病毒的疗法。 
本发明的主要优点包括： 
(a)提供了一种检测病原体感染的简便、快速和准确的新方法。 
(b)提供了一种抑制微生物感染和治疗微生物性疾病的新途径。 
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 
实施例1 
沙门氏菌的ncRNA鉴别和应用 
在本实施例中，对体内病原体沙门氏菌进行研究，结果表明沙门氏菌可借助宿主产生milRNA(一种ncRNA)，针对该ncRNA可进行有效的检测和治疗沙门氏菌感染。 
(1)细菌感染细胞中milRNA的筛选 
将沙门氏菌菌种用接种环在LB平板上进行分离划线，挑取中等大小的菌落接种LB液体培养基，于37℃培养过夜，然后离心去除LB培养基，用RPMI-1640+10%FBS培养基重悬菌体。 
于感染细菌前一天，将用胰酶消化好的人的肠道上皮细胞HT-29细胞铺于细胞皿，置于5%CO2培养箱中37℃培养。 
按MOI(5-10:1)比例进行感染细胞，感染2小时后，用PBS洗去未感染进入细胞的细菌，然后用含庆大霉素的RPMI-1640+10%FBS进行培养，培养过夜后，再用PBS洗3遍，以0.1%PBST(PBS+Triton X-100)裂解细胞，再用0.22μm滤器过滤除去细菌。经上述处理后，彻底去除了未进细胞内的细菌及残余在细胞内的细菌。 
然后用Trizol LS提取裂解液中的总RNA，经Solexa深度测序后，对测得 的数据进行分析，找出沙门氏菌特异性的小RNA片段。 
1.1milRNA的鉴定 
对solexa测序所获得的片段进行分析，筛选出高拷贝的milRNA片段序列，针对这些序列，设计并合成定量PCR检测探针和northern blot的检测探针。 
1.2northern blot检测 
Trizol LS试剂分别提取用LB培养的沙门氏菌的总RNA，及沙门氏菌感染细胞后的胞浆总RNA，将总RNA用1x RNA loading buffer(Takara)重悬，然后在15%TBE-Urea polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)进行电泳，电泳后将RNA转印到尼龙膜上，经紫外线(UV)胶连后用地高辛(DIG)标记的探针进行杂交，分析milRNA的表达。 
1.3荧光定量PCR检测 
以Trizol LS试剂分别提取用LB培养的沙门氏菌的总RNA，及沙门氏菌感染细胞后的胞浆总RNA，然后用DEPC处理的超纯水溶解RNA，首先用探针的下游引物进行反转录成cDNA,再以合成的探针(ABI)进行定量PCR扩增，扩增后分析各样品中milRNA的含量。 
结果 
实验结果如图1、图2和3图所示。 
采用northern blot和qRT-PC检测，图1和2结果表明，仅在沙门氏菌感染细胞后才能出现19-30nt的小RNA(本发明中，称为milRNA)，本发明选取milRNA(sal-1)作了全面而且深入地研究。 
利用生物学软件分析milRNA(sal-1)在沙门氏菌的菌基因组上序列情况，具体结果见图3。图3显示，milRNA(sal-1)所在nc-RNA可被折叠成pre-sal-1。 
来源于沙门氏菌的部分ncRNA的序列如下： 
Sal-1:UGUGGGCACUCGAAGAUACGGAUU(SEQ ID No.:1) 
Sal-2:AUGCGAGAGUAGGGAACUGCCAGGCAU(SEQ ID No.:2) 
Sal-3:UCCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGC(SEQ ID No.:3) 
Sal-4:GAAGGUGGCGGAAUUGGUAGACG(SEQ ID No.:4) 
Sal-5:GCCCGGAUGGUGGAAUCGGUA(SEQ ID No.:5) 
Pre-sal-1的序列如下： 
5'-TGTGGGCACTCGAAGATACGGATTCTTAACGTCCTAGGACGAAAAATGAATACCAAGTCTCAAGAGTGAACACG-3'(SEQ ID No.:6) 
(2)针对milRNA的抑制剂(inhibitor)可抑制细菌感染宿主的能力 
2.1体外实验 
在本实验中，对于鉴别出的沙门氏菌特异性的sal-1,研究其与靶基因inducible nitric oxide synthase(iNOS)的相关性。 
以PCR扩增出可与milRNA结合的靶位点区域，通过Spe I+Hind III双酶切后，插入到pMIR-REPORT luciferase载体(购自上海英为信科技有限公司)，构建出重组质粒(iNOS)。另对前述构建好的重组质粒的milRNA binding sites进行突变，构建出重组突变质粒(iNOS mut)。 
同时将milRNA的前体装入至由CMV作为promoter的表达载体中构建出过表达milRNA的载体(pre-sal-1)。 
将milRNA对照质粒或pre-sal-1和iNOS或iNOS mut进行共转染至HEK-293T细胞中，进行报告基因检测，同时用β-gal质粒作参照。 
具体结果如图4所示。图4的Luciferase结果表明，sal-1均可以调控iNOS上的两个靶位点，从而下调iNOS。 
2.2Western blot 
将野生型的iNOS基因全长克隆入真核表达质粒，构建出重组表达iNOS质粒(iNOS WT)进行iNOS表达，同时对milRNA结合位点进行突变(同义突变，仅改变碱基序列不改变氨基酸序列)，构建出表达iNOS质粒(iNOS MUT)进行突变iNOS的表达。将pre-sal-1分别和iNOS WT和iNOS MUT共转染到小鼠RAW264.7细胞(该细胞不受刺激不表达iNOS)中进行表达,检测milRNA对iNOS的调控能力。 
具体结果如图5所示。图5结果表明，在RAW264.7细胞中转入iNOS全长的表达质粒，sal-1同样可成功调控iNOS的表达(下调)。 
2.3细胞感染实验 
将HT-29细胞于感染的沙门氏菌前一天铺好24孔板，次日在将anti-sal-1用lipofectin2000进行转录，anti-sal-1转染后24h，按MOI(5-10：1)感染沙门氏菌,对照组用随机序列，感染后24h检测胞内细菌的存活能力。 
各反义核酸的序列如下（5'至3') 
anti-sal-1:AAUCCGUAUCUUCGAGUGCCCACA(SEQ ID NO.:7) 
anti-sal-2:AUGCCUGGCAGUUCCCTACUCUCGCAU(SEQ ID NO.:8) 
anti-sal-3:GCCGUUCUACCGACUGAACUACAGAGGA(SEQ ID NO.:9) 
anti-sal-4:CGUCUACCAAUUCCGCCACCUUC(SEQ ID NO.:10) 
anti-sal-5:UACCGAUUCCACCAUCCGGGC(SEQ ID NO.:11) 
具体结果见图6。图6显示以人肠道上皮细胞(HT-29)为感染模型，在沙门氏 菌感染的HT-29细胞时，转染sal-1的抑制剂(anti-sal-1)，再分析iNOS的表达与活性检测，及分析沙门氏菌在细胞内的存活率。沙门氏菌感染针对sal-1的抑制剂后iNOS表达量进一步上升，约2.8倍(图6A)；iNOS活性也相应上升，约2.3倍(图6B)。而sal-1表达水平被下调，下调了约90%(图6C),沙门氏菌感染后在细胞内的数量也随之下降，降低至45%(图6D)。 
2.4体内实验 
将pre-sal-1序列经酶切后插入常规的lentivirus载体中以包装出可过量表达milRNA的慢病毒。 
将与milRNA互补结合的序列通过基因工程手段构建出可结合milRNA的海绵体(含有3次重复的互补片段)，然后将milRNA的海绵体也插入至lentivirus载体中以包装出可吸附milRNA的慢病毒。 
另外由于小鼠体内也能表达iNOS，为验证milRNA对iNOS的调控功能，本发明人构建出mouse iNOS上milRNA的结合位点都突变的表达质粒，然后将这种质粒也经酶切后插入lentivirus载体中以包装出可过量表达mouse iNOS的慢病毒。 
取6-8周龄的BALA/C小鼠为实验对象，分析milRNA的上调或下调表达对iNOS表达的影响，及对小鼠侵袭能力的比较。以6-8周的雌性BALB/C为感染模型，用重组慢病毒分别包装出过表达milRNA(sal-1)的慢病毒，过表达iNOS(小鼠iNOS的sal-1结合位点经氨基酸同义突变成sal-1不结合或低结合能力)的慢病毒，及特异性吸收milRNA(sal-1)海绵体的慢病毒。实验分为8组：mock；沙门氏菌(SE2472)；lenti-NTC+SE2472；lenti-sal-1+SE2472；lenti-sal-1sponge+SE2472；lenti-NTC+iNOS MUT SE2472；lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472；lenti-sal-1 sponge+iNOS MUT SE2472。 
具体结果见图7。图7显示小鼠模型中sal-1中的表达量。 
图7A结果显示，沙门氏菌SE2472感染小鼠后，sal-1表达量上升，在lenti-sal-1+SE2472组sal-1表达量进一步上升，lenti-sal-1 sponge+SE2472组的sal-1表达水平因被sal-1 sponge(针对的sal-1的抑制剂)吸附而下降。当将小鼠iNOS的sal-1的结合位点进行同义突变后包装成慢病毒再感染小鼠后，sal-1有所下降(因为突变的iNOS的表达影响了细菌在小鼠体内存活的能力，数量有所下降所致)，在lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472组的sal-1表达量能得到一定程度的回复表达，而在lenti-sal-1 sponge+iNOS MUT SE2472中sal-1表达量进一步下降。 
图7B表明，这8组小鼠在感染SE2472时临床症状的改变，这些变化符合前面sal-1变化所引起细菌感染症状的改变。 
图7C和7D显示，iNOS在这8组中的表达量的变化，沙门氏菌SE2472感染中iNOS的表达虽有上升，但差异不显著，只有当使用sal-1 sponge时iNOS的表达才能明显得到回复表达，这清楚地表明，sal-1调控了iNOS的表达，当iNOS经同义突变后，可见iNOS的表达得到进一步上升，且不受sal-1调控，结果显示sal-1的确可调控iNOS的表达。 
图7E检测了这8组中小鼠大肠组织中(肠腔中已经去除)细菌含量。sal-1上调表达可促进细菌在肠组织中的感染能力，sal-1被sponge吸附去除后，细菌感染能力会下调。在iNOS同义突变组中，sal-1不发挥调控作用，这些结果均表明了sal-1调控iNOS，并通过iNOS影响细菌在宿主体内的侵染与存活能力。 
本实施例的上述结果表明，沙门氏菌将细菌自身所编码的非编码RNA(ncRNA)呈递到宿主细胞内，借助细胞的microRNA剪切系统，产生出类似microRNA的milRNA，运用milRNA调控免疫系统(如iNOS)，进而被细菌利用，保护其免于被宿主清除。本发明利用milRNA的inhibitor吸附milRNA可有效抑制细菌在细胞内的存活能力，导致沙门氏菌生存能力下降，故可运用于治疗细菌感染。 
实施例2 
淋病奈瑟氏菌的ncRNA鉴别和应用 
在本实施例中，对体内病原体淋病奈瑟氏菌进行研究，结果表明淋病奈瑟氏菌分泌ncRNA，通过ncRNA参与生理稳态以及疾病的发生发展。ncRNA作为淋病奈瑟氏菌的生物标志物，可有效用于微生物感染性疾病的诊断。 
(1)淋病奈瑟氏菌分泌的ncRNA的鉴别 
首先将淋病奈瑟氏菌进行平板划线筛选，方法同实施例1。 
然后采用solexa深度测序，对测得的数据进行分析，找出淋病奈瑟氏菌特异性的ncRNA，序列为:GUAUCCCAUCCUCGUCGCCA(SEQ ID No.:12)。 
对solexa测序所获得的片段进行分析，筛选出高拷贝的ncRNA片段序列，针对这些序列，设计并合成定量PCR检测探针和northern blot检测探针。定量PCR检测方法与实施例1基本相同。不同的是，提取的总RNA为淋病奈瑟氏菌的总RNA。 
Northern blot检测方法与实施例1基本相同。 
结果 
采用Northern blot和qPCR检测结果表明，淋病奈瑟氏菌能够分泌ncRNA， 且ncRNA可折叠成茎环结构。 
(2)运用针对ncRNA的inhibitor进行抑制细菌感染宿主的能力 
运用生物学软件分析淋病奈瑟氏菌分泌的ncRNA的报告基因，具体操作如实施例1所述。Luciferase结果表明，淋病奈瑟氏菌分泌的ncRNA可调控代谢酶。 
以人肠道上皮细胞(HT-29)为感染模型，在淋病奈瑟氏菌感染的HT-29细胞时，转染报告基因的抑制剂(针对SEQ ID NO.:12的反义核酸)，再分析酶的表达与活性检测，及分析淋病奈瑟氏菌在细胞内的存活率，具体操作与实施例1基本相同。经针对SEQ ID NO.:12的反义核酸处理后，淋病奈瑟氏菌感染后在细胞内的数量也随之下降，下降了35%以上。 
取6-8周龄的BALA/C小鼠为实验对象，分析淋病奈瑟氏菌ncRNA的上调或下调表达对代谢酶表达的影响，及对小鼠侵袭能力的比较。以6-8周的雌性BALB/C为感染模型，用重组慢病毒分别包装出过表达淋病奈瑟氏菌ncRNA的慢病毒，过表达代谢酶的慢病毒，及特异性吸收淋病奈瑟氏菌ncRNA海绵体的慢病毒。具体操作如第二组实施例所述。结果表明，淋病奈瑟氏菌ncRNA调控代谢酶的表达，当代谢酶经同义突变后，表达得到进一步上升，且不受淋病奈瑟氏菌ncRNA调控，结果显示淋病奈瑟氏菌ncRNA的确可调控代谢酶的表达。淋病奈瑟氏菌ncRNA通过调控代谢酶影响细菌在宿主体内的侵染与存活能力。 
实施例3 
禽流感病毒的ncRNA鉴别和应用 
本实施例研究了禽流感的ncRNA，并证实了一种针对禽流感病毒H5N1的ncRNA(即miR-HA-3p)的抑制剂，可有效抑制H5N1病毒引起的死亡率。 
本实施例中主要试剂如下： 
Agomir是随机序列，作为对照。 
agomir-HA-3p是H5N1的ncRNA。 
antagomir代表表示针对禽流感ncRNA的抑制剂。其中，antagomir-HA-3p，是特异性针对miR-HA-3p的抑制剂，是序列与miR-HA-3p完全互补的反义序列。 
miR-HA-3p表示来源于禽流感H5N1的特异性ncRNA，其序列如下： 
其中，3种ncRNA的核心序列是GGACUAUUUGGAGCUAUAGC(SEQ ID NO.:16)。 
agomir-HA-3p(M)表示核心序列被改变的长度为22nt的RNA序列。 
(1)寄生微生物禽流感病毒H5N1分泌miR-HA-3p 
首先，运用生物学软件分析候选miRNA的茎环结构。 
具体结果见图8。图8显示预测的H5N1miRNA前体茎环结构次级结构。预测通过Mfold进行，预测出的成熟miRNA的5'端和3'端分别用红蓝色标注。结果表明，三个预测出的前体中，一条由HA片段编码，其他两条由PA片段编码。每个候选的miRNA都可以折叠成特异稳定的发夹结构。 
然后针对候选miRNA序列，设计并合成定量PCR检测探针和northern blot检测探针，检测H5N1感染细胞中候选miRNA的表达水平。定量PCR检测方法和northern blot检测方法具体操作同实施例1。 
具体结果如图9所示。 
图9显示H5N1感染的细胞中候选miRNA的定量PCR检测和northern blot检测结果。 
图9A显示miR-HA-3p和miR-PA1-3p在A549细胞中不同时间点的表达量。从图9A中可以看出，这两种miRNA的表达量在感染过程中逐渐增高。实时定量PCR结果显示miR-HA-3p的表达量在每个时间点都高于miR-PA1-3p的表达量。 
图9B显示miR-HA-3p在处于H5N1重感染期及恢复期的患者血清中的表达量。从图9B中可以看出，处于重感染期的患者血清中的miR-HA-3p表达量很高，但是在病毒感染减退之后，miR-HA-3p几乎检测不到。 
图9A和图9B的结果表明，H5N1在感染宿主细胞后，会分泌特殊的小分子miR-HA-3p进入宿主体内循环，并且miR-HA-3p的表达量与病毒的感染程度是成正相关的。 
图9C和图9D显示miR-HA-3p和miR-PA1-3p在H5N1感染细胞中northern blot的检测结果。 
图9C显示miR-HA-3p和miR-PA1-3p在H5N1感染的A549细胞中的northern blot的检测结果。从图9C可以看出，以U6作为对照，长度约80-nt的miR-HA-3p前体miRNA和22-nt成熟miR-HA-3p可以从H5N1感染的A549细胞中快速检测到。约100-nt前体miR-PA1-3p RNA可以检测到，但是成熟的miR-PA1-3p不能检测到。 
图9D显示miR-HA-3p在H5N1 IAV分离株中northern blot的检测结果。从图9D可以看出，从H5N1感染的A549细胞提取小RNA片段(＜200)，用这些片段与探针杂交，结果显示两种H5N1 IAV分离株中都可产生miR-HA-3p，结果表明miR-HA-3p不是只存在于特定的H5N1流感病毒中。 
(2)H5N1流感病毒分泌的miR-HA-3p直接作用于PCBP2mRNA的3'端并下调蛋白表达 
首先，运用生物学软件分析miR-HA-3p的靶位点。然后运用荧光素酶检测报告基因的方法，具体操作步骤如第二组实施例所述验证分析miR-HA-3p的靶位点。 
具体结果见图10。图10显示预测的miR-HA-3p与人类和小鼠PCBP2mRNA3'端结合位点。从图10的结果可以看出，PCBP2 mRNA是miR-HA-3p的一个潜在靶位点。在人体和小鼠体内获得了近似的结果。PCBP2属于核蛋白E族，与MAV介导的抗病毒作用相关。H5N1可以通过沉默PCBP2来增强MAV介导的抗病毒过程，从而在H5N1侵染过程中引起过渡的免疫应答或者细胞素风暴。 
接着，利用荧光素酶活性检测方法、western blotting检测方法和定量PCR检测方法分析人类和小鼠PCBP2基因野生型和变异型转染的HEK293T细胞分别经agomir,agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理后的荧光素酶活性、蛋白水平、蛋白mRNA水平的变化。 
具体结果如图11所述。图11A显示人类PCBP2基因野生型和变异型转染的HEK293T细胞分别经agomir,agomir-HA-3p(miR-HA-3p刺激剂)，agomir-HA-3p(M)(突变的miR-HA-3p刺激剂)处理后的荧光素酶活性的变化。图11B显示小鼠PCBP2基因野生型和变异型转染的HEK293T细胞分别经agomir,agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理后的荧光素酶活性的变化。 
从图11A和图11B的结果可以看出，agomir-HA-3p可以显著下调野生型PCBP2的3'端荧光素酶的表达量。但是agomir-HA-3p(M)没有上述作用。对比试验中，样本换成3'端载有荧光素酶基因的PCBP2转染的HEK293T细胞，上述两种刺激剂均不影响对比试验中荧光素酶活性。这些结果表明，miR-HA-3p可以直接作用于PCBP2 mRNA的3'端。 
图11C显示agomir,agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理的A549细胞PCBP2蛋白水平的Wertern blotting分析结果。从图11C可以看出，siPCBP2是沉默PCBP2基因的RNAi系统，作为对照，A549细胞转染了agomir-HA-3p后，通过蛋白质印记检测到PCBP2的表达明显被抑制，但是转染了agomir-HA-3p(M)的细胞PCBP2表达无明显变化。 
图11D显示agomir,agomir-HA-3p，agomir-HA-3p(M)处理A549细胞后PCBP2 mRNA表达水平。从图11D可以看出，miR-HA-3p与siPCBP2下调PCBP2的能力相当。agomir-HA-3p处理组与agomir组没有显著差异，结果表明miR-HA-3p在抑制PCBP2蛋白翻译方面起到了作用。 
综上所述，H5N1流感病毒分泌的miR-HA-3p直接作用于PCBP2 mRNA的3'端并下调蛋白表达。 
(3).miR-HA-3p抑制剂可以使小鼠获得对H5N1的抵抗力。 
取雌性BALB/c小鼠，分成2组，分别鼻内接种致死剂量的H5N1和H5N1突变株，之后检测其体重、致死率、病毒复制情况和细胞因子聚合物。 
病毒侵染8小时后，连续五天分别注射antagomir-HA-3p和antagomir。具体结果见图12。 
图12A和图12B显示接种H5N1或者突变株的小鼠在不同处理条件的死亡率。图12C和图12D显示接种H5N1或者突变株的小鼠在不同处理条件的体重流失程度。 
从图12可以看出，接种7天后，接种了H5N1的小鼠死亡率100%(图12A)，并且伴以20%以上的体重流失(见图12C)。antagomir处理对小鼠死亡和体重流失没有影响，然而antagomir-HA-3p处理组的小鼠7天后虽然有一定的体重流失但是死亡率仅在10%左右。这一现象说明用antagomir-HA-3p去除miR-HA-3p，可以降低H5N1感染小鼠的死亡率。这一结论在用H5N1突变株处理的实验组中也得到了证实。注射了H5N1突变株的小鼠和注射了H5N1的小鼠(图12A和C)相比存活时间较长(图12B)体重减少速度慢(图12D)。然而注射了突变株的小鼠在继续注射agomir-HA-3p后，存活率明显下降(图12B)并且体重下降速度加快(图12D)，跟预期相同的是，注射突变株并继续注射agomir的小鼠存活率和体重均无显著变化。 
本实施例的结果表明，寄生微生物高传染性病毒H5N1 IAV分泌一种特殊的小核糖核酸,即miR-HA-3p，这种ncRNA通过抑制PCBP2基因导致了H5N1感染过程中的细胞风暴。antagomir-HA-3p抑制剂有助于增强小鼠对H5N1的抗性，延长存活时间，为发展H5N1疗法提供基础。 
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种分离的非编码RNA(ncRNA)序列，其特征在于，所述的非编码RNA序列是动物体内的病原体所释放的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)序列。
2.如权利要求1所述的分离的非编码RNA序列，其特征在于，所述的非编码RNA序列是所述体内的病原体所特有的，并且在健康动物体内是不存在的。
3.如权利要求1所述的分离的非编码RNA序列，其特征在于，所述的病原体包括感染微生物、寄生微生物、和/或共生微生物；
较佳地，所述的病原体包括细菌、病毒、衣原体、支原体；
更佳地，所述的病原体包括沙门氏菌、流感病毒、副流感病毒、奈瑟氏菌、禽流感病毒、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒。
4.如权利要求1所述的分离的非编码RNA序列，其特征在于，所述的非编码RNA包括microRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA、mRNA-like的非编码RNA、mRNA中的非翻译区。
5.如权利要求1所述的分离的非编码RNA序列，其特征在于，所述的非编码RNA选自下组：SEQ ID No.:1、2、3、4、5、12、13、14、或15所示的RNA序列。
6.一种来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的用途，其特征在于，所述非编码RNA序列被(a)用于制备检测所述病原体的检测试剂、检测芯片或试剂盒；(b)用作检测所述病原体的检测标志物。
7.一种制品，其特征在于，所述制品含有权利要求1所述的分离的非编码RNA序列、或含有用于检测权利要求1所述的分离的非编码RNA序列的检测试剂。
8.一种抑制剂的用途，所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂被用于制备抑制所述病原体感染或寄生的药物；或用于制备治疗所述病原体感染疾病的药物。
9.一种体外非治疗性抑制病原体的方法，其特征在于，包括步骤：在抑制剂存在下，培养所述的病原体，其中所述抑制剂是抑制来源于动物体内病原体的非编码RNA序列的抑制剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断权利要求1所述的ncRNA的抑制剂。
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