CN105624160A - 布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(small？non-coding？RNA，sRNA)，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：1所示。Northern？blot实验证实了ncRNA1351在布鲁氏菌中的存在。通过构建ncRNA1351的布鲁氏菌缺失突变株和回复株，我们对ncRNA1351的功能进行了分析，实验结果表明：ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，说明ncRNA1351与布鲁氏菌的毒力相关。因此，可以ncRNA1351为靶点制备抗布鲁氏菌药物。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其应用
技术领域
本发明涉及细菌非编码小RNA(smallnon-codingRNA，sRNA)，特别是涉及一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其功能与应用。
背景技术
细菌非编码小RNA(smallnon-codingRNA，sRNA)是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50-400个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控。目前，非编码小RNA已成为生命科学研究的前沿和热点。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用。迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如：霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等。在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。布鲁氏菌是胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞(主要是巨噬细胞)内，胞内存活和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机理至关重要。由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，发明人推测出sRNA在布鲁氏菌的胞内生存和毒力调控中发挥一定的作用。因此，识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进行研究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理。已有研究人员对布鲁氏菌非编码小RNA进行了预测，包括BSR-2，BSR-16等，专利文献CN103710345A也公开了一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA。
发明内容
本发明的目的是寻找并提供一个更具利用价值的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子。
本发明所提供的来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(smallnon-codingRNA，sRNA)，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
ncRNA1351缺失突变载体和ncRNA1351回复载体也属于本发明。
所述ncRNA1351缺失突变载体具体可命名为ncRNA1351-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。
所述ncRNA1351回复载体具体可命名为ncRNA1351-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。
转化有ncRNA1351缺失突变载体的布鲁氏菌ncRNA1351缺失突变株和转化有ncRNA1351回复载体的布鲁氏菌ncRNA1351回复株也属于本发明。
以布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M为出发菌株，构建的ncRNA1351缺失突变株命名为16MΔncRNA1351，也属于本发明。
以布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M为出发菌株，构建的ncRNA1351回复株命名为16M-ncRNA1351，也属于本发明。
本发明用生物信息学的方法预测和分析出一个新的布鲁氏菌非编码小RNAncRNA1351。Northernblot实验证实了ncRNA1351在布鲁氏菌中的存在。通过构建ncRNA1351的布鲁氏菌缺失突变株和回复株对ncRNA1351的功能进行了分析，实验结果表明：ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，说明ncRNA1351与布鲁氏菌的毒力相关。因此，可以ncRNA1351为靶点制备抗布鲁氏菌药物，其长105nt，相较于已有研究的RNABSR0601的长度更短，更具有应用价值。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为ncRNA1351在布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M不同生长时期表达情况的Northernblot检测结果；
图2为ncRNA1351在酸、热、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况；
图3A为ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T的物理图谱；
图3B为ncRNA1351回复载体ncRNA1351-MCS的物理图谱；
图4为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的RT-PCR鉴定结果；
图5为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析结果；
图6为ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的小鼠毒力实验结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100mL)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis或B.melitensis)16M(野生株)由国家CDC提供。
所用引物和探针由大连宝生物公司合成，质粒由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、获得布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的序列
从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/)下载布鲁氏菌(Brucellamelitensis或B.melitensis)16M(野生株)的染色体序列(NC_003317.1和NC_003318.1两条染色体，命名为I和II)，从下载的序列中提取基因间区(指的是两个开放阅读框之间的序列)片段。在基因间区用pftools2.3(http://www.isrec.isb-sib.ch/ftp-server/pftools/)寻找启动子(cut-off(阈值)值取255)，用RNAMotif寻找终止子，其中的motifdescriptor(主题描述符)来自(http://www.tufts.edu/sackler/waldorlab/sRNAPredict/)，然后再在去冗余(指的是重复的序列)基础上预测出具有完整转录单元的基因间区，去除含有tRNA和rRNA的序列，最后，通过BLAST比对，找出保守的基因间区作为候选的(smallnon-codingRNA，sRNA)序列。
在候选的sRNA序列中，ncRNA1351是在布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16MI号染色体的反义链上预测的非编码小RNA，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，其5’端为1405195(指的是Genbank里面的序列号)，3’端为1405091(指的是Genbank里面的序列号)，长105nt，其编码基因位于(Brucellamelitensis)16M的BMEI1351(指的是Genbank里面的位点号码)和BMEI1350(指的是Genbank里面的位点号码)之间的基因间区。BLAST比对结果表明，ncRNA1351在布鲁氏菌菌种间的同源性达到100％，说明ncRNA1351具有高度的保守性，这一点也符合sRNA的特征。
实施例2、ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期表达情况的Northernblot验证
Northernblot是鉴定非编码小RNA的金标准。由于非编码小RNA的表达通常具有生长时期依赖性，因此，可用Northernblot检测ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期的表达情况。具体方法包括以下步骤：
1)根据ncRNA1351的编码序列设计引物，并在反向引物外侧添加T7启动子序列，引物序列为ncRNA1351-p-F：ACGGTCGAGAAATTGCGA和ncRNA1351-p-R：TAATACGACTCACTATAGGGAACCGATGGCTTTCCGGG(带下划线序列为T7启动子序列)。
2)首先以羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)的基因组DNA为模版，用引物ncRNA1351-p-F和ncRNA1351-p-RPCR扩增制备探针的DNA模板，25μlPCR反应体系为：10×buffer2.5μl，dNTPs(2.5mmol/L)2μl，引物ncRNA1351-p-F(10μmol/L)0.5μl，引物ncRNA1351-p-R(10μmol/L)0.5μl，EXTaq(5U/mL)0.2μl，模板DNA3μl，ddH2O17μl。PCR反应条件为：95℃7min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
3)以步骤2)获得的DNA为模板，用T7聚合酶体外转录制备ncRNA1351的地高辛标记探针，探针序列为：ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
转录体系为：模板DNA1μg，DIG-11-UTPMix2μl，5×Transcriptionbuffer4μl，RiboLockTMRNaseInhibitor(40U/μl)1μl，T7RNAPolymerase(20U/μl)1.5μl，DEPC水定容到20μl，混匀。转录条件为：在PCR仪中37℃体外转录反应2h；加入1μlDNaseI(2U/μl)37℃处理消化DNA30min；然后加入2μlEDTA(0.2M，pH8.0)终止反应；加入30μlDEPC处理过的水，使总体积达到50μl；加入1/10体积的5M乙酸铵(5μl)涡旋混匀和3倍体积预冷的无水乙醇(150μl)，-20℃放置过夜；12,000rpm、4℃离心15min，75％乙醇漂洗2次，弃上清，空气干燥。用50μlDEPC水溶解RNA探针。并向其中加入20URNaseInhibitor，5μl分装，-80℃保存。
4)将羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)分别培养至对数生长早期(EP，OD600＝0.5)和平台期(ST，OD600＝2.0)，采用Trizol法提取羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的总RNA，以羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的总RNA为模版，用步骤3)制备的探针进行Northernblot验证。
Northernblot验证结果如图1所示，ncRNA1351在羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的对数生长中期和平台期有转录，证明在布鲁氏菌16M中确实存在ncRNA1351。
实施例3、ncRNA1351在模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的表达分析
细菌sRNA的表达与应激条件有关，因此，可用RT-PCR的方法对ncRNA1351在酸、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况进行了检测。具体方法包括以下步骤：
1)将培养至对数生长中期(OD600＝1.2)的羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)菌液进行离心，收集菌体，将菌体分别在①TSB(TSB为大豆胰蛋白胨肉汤，购自生物梅里埃公司)7.0(pH为7.0，标准)、②GEM7.0(营养缺乏培养基，每升培养基中含MgSO4.7H2O0.2g，Citricacid.H2O2.0g，K2HPO410.0g，NaNH4HPO4.4H2O3.5g，葡萄糖20g，调pH为7.0)、③TSB7.0，42℃(热刺激)、④TSB4.0(酸)、⑤TSB7.0，1.5mMH2O2(高氧)条件下，培养30min。
2)采用Trizol法提取在不同条件培养的羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的RNA，RNA用DNAseI消化后作为模版，用引物ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA和ncRNA1351-RT-R：GGCGGCGTTTTCGTTTC检测ncRNA1351的表达水平，用引物16sRNA-RT-F：CACTGGACCATTACTGACGC和16sRNA-RT-R：ACTAAGGGCGAGGGTTGC检测16SrRNA的表达水平，16SrRNA为阳性内对照基因，25μlPCR反应体系为：2×onestepSYBRRT-PCRBuffer12.5μl，TakaraExTaq(5U/μl)0.5μl，RTEnzymeMixII0.5μl，Forwardprimer(10μM)1μl，Reverseprimer(10μM)1μl，RNasefreeH2O8.5μl，TotalRNA100ng；PCR反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s，56℃30s，72℃30s，45个循环。
3)相对定量的计算采用2-ΔΔCt方法分析，即ΔCt目标基因＝Ct(目标基因)-Ct(同一样本16SrRNA)；ΔΔCt目标基因＝ΔCt目标基因(实验组)-ΔCt目标基因(对照组)，相对倍数(实验组/对照组)＝2-ΔΔCt。实验进行3次，以TSB7.0条件为对照组(相对转录水平设为1)，其余条件为实验组。重复实验3次，计算平均值。
检测结果如图2所示，可以看出，ncRNA1351在酸(TSB4.0)、营养缺乏(GEM7.0)、氧化应激条件(H2O2)和热(42℃)等模拟巨噬细胞内环境的应激条件下的表达量明显增加，提示ncRNA1351可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关。
实施例4、ncRNA1351的功能分析
为了进一步分析ncRNA1351在布鲁氏菌胞内生存和毒力中发挥的作用，构建了ncRNA1351的突变株和回复株，并进行了相关表型实验。
1、ncRNA1351突变株和回复株的构建及验证
以羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)的基因组DNA为模板，用引物ncRNA1351-N-F和ncRNA1351-N-R扩增ncRNA1351的N端同源臂，用引物ncRNA1351-C-F和ncRNA1351-C-R扩增ncRNA1351的C端同源臂。以PUC19K(购自大连宝生物公司)为模板，用引物Kana-F和Kana-R扩增卡那霉素抗性基因(Kan基因)。PCR扩增产物用DNA胶纯化回收试剂盒(购自Promega公司)回收后，将N端同源臂、C端同源臂和Kan基因等摩尔比混合作为模板，进行融合PCR扩增。PCR扩增分两轮进行，分别命名为PCR-1和PCR-2。
(1)引物序列
ncRNA1351-N-F：GTACAAAAAAGCAGGCTTAGGTACCCCAGCATCAACATCAGCACG
ncRNA1351-N-R：GCTGACATTCATCCCAGGTGGCGCCGTAACGCAGTCAAGGAC；
ncRNA1351-C-F：ACTCTGGGGTTCGAAATGACCGTCTCGAAGGGCCGCATGTTT
ncRNA1351-C-R：TGTACAAGAAAGCTGGGTCCTGCAGCCTCCTTTATGTCAGGCGTTGC；
Kan-F：ATCAGGACATAGCGTTGGC
Kan-R：GGCAAGAAAGCCATCCAGT；
pBBR-F：GCGAAAGGGGGATGTGCTGC
pBBR-R：AGCGCGCAATTAACCCTCAC。
(2)融合PCR扩增
PCR-1反应体系：
PCR-1反应条件：94℃5min；94℃30s，66℃30s，72℃60s，10个循环。
将得到的PCR-1液稀释10倍作为第二步PCR(PCR-2)的模板，进行第二轮PCR扩增。
PCR-2反应体系：
PCR-2反应条件：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环；72℃10min。将PCR-2反应产物用DNA胶纯化回收试剂盒进行切胶回收，得到的回收片段即为ncRNA1351缺失突变盒，将其命名为ncRNA1351-NC。
(3)构建ncRNA1351缺失突变载体
将缺失突变盒ncRNA1351-NC和pMD18-TSimpleVector(购自大连宝生物公司)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化产物涂布氨苄(100μg/mL)抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物ncRNA1351-N-F和ncRNA1351-C-R进行菌落PCR鉴定。扩增出1997bpDNA片段(此DNA片段为N端同源臂、Kan基因和C端同源臂的融合片段)的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，对质粒用KpnⅠ酶进行酶切鉴定，经酶切获得4689bp大小DNA片段的阳性质粒，表明ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T构建成功，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，物理图谱如图3A所示。
(4)ncRNA1351缺失突变株的筛选与鉴定
将缺失突变载体ncRNA1351-NC-T质粒DNA与80μl羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M感受态细胞充分混匀，预冷15min，然后于18kV/cm、400Ω条件下进行电击，电击后立即加入1mLTSB培养基重悬细菌，转入1.5mL离心管中37℃复苏24h，复苏后的转化产物经系列稀释后涂布含有50μg/mL卡那霉素的TSA平板，37℃培养72h以上，筛选卡那霉素抗性克隆，即为ncRNA1351缺失突变株，将其命名为16MΔncRNA1351。
(5)构建ncRNA1351回复载体
以羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M的基因组DNA为模板，以ncRNA1351-N-F和ncRNA1351-C-R为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经DNA胶纯化回收试剂盒切胶回收后用KpnI和PstI双酶切，与经同样酶双酶切的质粒pRR1MCS-4(参见文献KovachM,ElzerP,StevenHillD,etal.Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBR1MCS,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.Gene,1995,166:175–176.)用T4DNALigase连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布氨苄霉素(100μg/mL)抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物pBBR1-F和pBBR1-R进行PCR鉴定。扩增出1204bpDNA片段的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，提取的质粒即为回复载体，将其命名为ncRNA1351-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示，物理图谱如图3B所示。
(6)ncRNA1351回复菌株的筛选
将回复载体ncRNA1351-MCS质粒DNA电转化至16M△ncRNA1351电感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄霉素的TSA双抗性平板，37℃培养72h以上，筛选双抗性克隆，双抗性克隆即为ncRNA1351回复菌株，命名为16M-ncRNA1351。
(7)16M△ncRNA1351和16M-ncRNA1351的RT-PCR验证
为了验证ncRNA1351缺失突变株和ncRNA1351回复株，可用RT-PCR的方法分析羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)、16M△ncRNA1351和16M-ncRNA1351这三株菌中ncRNA1351的转录情况，从转录水平对ncRNA1351缺失突变株和ncRNA1351回复株进行验证。将这三株菌在TSB培养基中培养至对数生长中期(OD600＝1.2)，然后采用TrizolRNA提取方法抽提总RNA。总RNA用DNAseI消化后，以随机引物为逆转录引物，用M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA，反应体系和反应条件为：2μg的总RNA加上1μg随机引物，将PCR管于PCR仪中70℃放置10min，解开模板中的二级结构；迅速将PCR管置于冰上停留5min以防止二级结构重新形成；短暂离心，将溶液收集到管底；按如下顺序将下列成分加入到引物和模板的混合物中：M-MLV5×reactionbuffer5μl，dNTP(2.5mMeach)5μl，RibonucleaseInhibitor(40U/μl)25U，M-MLV逆转录酶(200U/μl)1μl，水(无核酸酶)至25μl；轻弹管壁，混合反应液，37℃孵育60min。再以cDNA为模板，用针对ncRNA1351的引物ncRNA1351-RT-F和ncRNA1351-RT-R进行RT-PCR验证，PCR反应体系为：模板1μl，dNTPs(2.5mMeach)2μl，上游引物(20μM)0.5μl，下游引物(20μM)0.5μl，10×PCRBuffer2.5μl，rTaq(5U/μl)0.125μl，无菌去离子水至25μl；PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，30个循环；72℃7min。
结果如图4所示，可以看出，羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M、16M△ncRNA1351和16M-ncRNA1351中16srRNA的表达量是相同的，说明这三株菌的cDNA量是一致的。因此，可以进行这三株菌的ncRNA1351表达分析。16M△ncRNA1351中没有ncRNA1351的表达，而16M-ncRNA1351中ncRNA1351的表达得到了回复，实验结果证实ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351构建成功。
2、ncRNA1351缺失突变株和回复株在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析
布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，在巨噬细胞的内环境中包含多种杀(抑)菌机制，因此布鲁氏菌必须适应这些机制才能在胞内生存繁殖。为分析ncRNA1351在布鲁氏菌抵抗和适应这些条件中的作用，可在体外模拟多个胞内条件，包括氧化压力、热压力、酸压力、高渗透压等，分别将羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M、16MΔncRNA1351、16M-ncRNA1351在这些条件下进行处理，然后观察它们各自在这些条件作用下的存活率。
具体实验方法：将培养至对数生长中期(OD600＝1.2)的羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)、16MΔncRNA1351、16M-ncRNA1351菌液离心，PBS洗1次后将菌体重悬并振荡培养于①含440mMH2O2的TSB液体(40min)中；②50℃预热的TSB液体(60min)；③pH3.0的TSB液体(10min)；④1.5M的NaCl水溶液(30min)；⑤37℃的TSB液体(40min，对照)等不同的培养基中，倍比稀释后涂布TSA平板进行计数，观察羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M、16MΔncRNA1351、16M-ncRNA1351在高渗透压、氧化压力、热压力和酸压力环境中的存活力。结果以百分比表示，将对照组细菌的生存率设为100％。重复实验3次，计算平均值。
结果如图5所示，可以看出，与羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M相比，ncRNA1351缺失突变株16MΔncRNA1351在高渗透压、氧化、热和酸刺激条件下的生存能力明显减弱，结果提示，ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在体外刺激条件下的生存能力减弱；与ncRNA1351缺失突变株16MΔncRNA1351相比，ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在高渗透压、氧化、热和酸刺激条件下的生存能力又得到了回复。实验结果表明，ncRNA1351的正确表达对于布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存是必需的。
3、ncRNA1351缺失突变株和回复株的小鼠毒力实验
布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，布鲁氏菌在感染后，首先侵袭的是宿主的局部淋巴结，而后再迁移到其它的器官和组织。脾脏是一种免疫细胞丰富的器官，而布鲁氏菌主要寄生于吞噬细胞，因此脾脏是布鲁氏菌寄居的主要场所之一。布鲁氏菌致病性的重要指标之一是脾脏的载菌数。为了进一步确定ncRNA1351在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用，又进行了小鼠毒力实验。
选用6-8周龄Balb/c小鼠，随机分为4组，每组30只，分别为羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M(野生株)组、16MΔncRNA1351缺失突变株组、16M-ncRNA1351回复株组和生理盐水阴性对照组。具体步骤为：将羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M野生株、16MΔncRNA1351、16M-ncRNA1351培养至对数生长中期(OD600＝1.2)，然后对小鼠进行感染，感染部位为腹膜腔，感染次数为1次，每组细菌的感染浓度为5×105CFU/mL，每只小鼠注射200μl。在感染后不同时间点(7、14、28、45d)，每个时间点每组取5只小鼠，处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，加入1mL含有0.1％TritonX-100的磷酸盐缓冲液，用玻璃匀浆器研磨，制成匀浆，将组织匀浆液进行10倍系列稀释，从中选取适当稀释度的匀浆液各100μl涂布TSA平板，计算CFU。
结果如图6所示，可以看出，与羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M相比，在感染后不同时间点ncRNA1351缺失突变株16MΔncRNA1351在小鼠体内的生存能力明显减弱，在侵染后45天时，小鼠脾脏内几乎没有ncRNA1351缺失突变株的存在，而ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的生存能力与羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M类似，表明小鼠的毒力减弱的确是由ncRNA1351的缺失引起的。实验结果证实，ncRNA1351与布鲁氏菌的毒力相关。

Claims (6)

1.来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子(smallnon-codingRNA，sRNA)，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或与序列表中SEQIDNO：l所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与布鲁氏菌毒力和生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
2.ncRNA1351缺失突变载体，命名为ncRNA1351-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。
3.ncRNA1351回复载体，命名为ncRNA1351-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3所示。
4.以布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M为出发菌株，构建的转化有权利要求2所述ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T的布鲁氏菌ncRNA1351缺失突变株，命名为16MΔncRNA1351。
5.以布鲁氏菌(Brucellamelitensis)16M为出发菌株，构建的转化有权利要求3所述ncRNA1351回复载体ncRNA1351-MCS的布鲁氏菌ncRNA1351回复株，命名为16M-ncRNA1351。
6.权利要求1所述的非编码小RNA分子ncRNA1351在制备抗布鲁氏菌药物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593761A (zh) * 2018-12-21 2019-04-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103710345A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 中国人民解放军疾病预防控制所 布鲁氏菌的非编码小rna分子bsr0601及其应用
CN104383559A (zh) * 2014-10-27 2015-03-04 中南大学 长链非编码rnaloc401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用
CN104694533A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 江苏命码生物科技有限公司 沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用
CN104694535A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 江苏命码生物科技有限公司 体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性rna及其鉴定和应用
CN104922695A (zh) * 2014-12-25 2015-09-23 首都医科大学 一种长链非编码rna纳米微球的制备及其应用
CN105018498A (zh) * 2015-05-12 2015-11-04 中南大学 长链非编码rna afap1-as1的应用方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694533A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 江苏命码生物科技有限公司 沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用
CN104694535A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 江苏命码生物科技有限公司 体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性rna及其鉴定和应用
CN103710345A (zh) * 2013-12-27 2014-04-09 中国人民解放军疾病预防控制所 布鲁氏菌的非编码小rna分子bsr0601及其应用
CN104383559A (zh) * 2014-10-27 2015-03-04 中南大学 长链非编码rnaloc401317的表达载体、抑瘤试剂及其应用
CN104922695A (zh) * 2014-12-25 2015-09-23 首都医科大学 一种长链非编码rna纳米微球的制备及其应用
CN105018498A (zh) * 2015-05-12 2015-11-04 中南大学 长链非编码rna afap1-as1的应用方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐杰: "布鲁氏菌转录测序分析及sRNA功能研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
王同坤: "布鲁氏菌非编码小RNA的预测、鉴定及BSR-16的功能分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
王同坤等: "羊布鲁氏菌非编码小RNA分子BSR-2的预测与鉴定", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
王玉飞等: "基于RNA-Seq的羊种布鲁氏菌新转录本与非编码RNA鉴定", 《中国人兽共患病学报》 *
马卧龙: "布鲁氏菌RB51全基因组序列的初步分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593761A (zh) * 2018-12-21 2019-04-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用
CN109593761B (zh) * 2018-12-21 2022-04-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种与布鲁氏菌毒力相关的small RNA及其在制备弱毒布鲁氏菌中的应用

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