CN104694533A - 沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用 - Google Patents

沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了沙门氏菌的非编码性RNA及其鉴定和应用。具体地，本发明试验表明，沙门氏菌将自身编码的非编码RNA(ncRNA)呈递到宿主细胞内，借助细胞的microRNA剪切系统，产生出类似microRNA的milRNA，运用milRNA调控免疫系统，进而保护沙门氏菌免于被宿主清除。利用milRNA的抑制剂吸附milRNA可有效抑制细菌在细胞内的存活能力，导致细菌生存能力下降。本发明还提供了可有效检测、治疗和研究沙门氏菌或感染疾病的相关试剂和方法。

Description

沙门氏菌的非编码性RNA及其鉴定和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及沙门氏菌的非编码性RNA及其鉴定和应用。
背景技术
微生物(Microorganism)是广泛存在于自然界中的一群肉眼看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍甚至数万倍才能观察到的微小生物的总称。它们具有体形微小、结构简单、繁殖迅速、容易变异及适应环境能力强等特点。
微生物种类繁多，在自然界中的分布极为广泛。在人类、动物和植物的体表及其与外界相通的腔道中也有多种微生物存在。
微生物对人类最重要的影响之一是导致某些疾病，尤其是传染病。虽然在疾病的预防和治疗方面，人类已取得了长足进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，许多疾病一直缺乏有效的治疗药物。此外，大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致危害更大的耐药性菌株的产生。
凡是生长在活的生物体外或体内的微生物，都称为寄生微生物，寄生生活的微生物靠剥夺其他生物的营养，甚至靠其他生物的身体的某部分作为营养。微生物可通过口腔、皮肤或呼吸道进入人或动物体内，利用人或动物体的营养生长繁殖。如果这些细菌产生毒素，就会使人生病，如霍乱、伤寒、肺炎等。艾滋病、感冒等疾病则是由病毒引起的。病毒是更专一的寄生微生物，因为它们离开活细胞就不能生活，所以叫做严格寄生微生物。
微生物感染(Microbial infection)是临床常见的微生物导致的疾病。细菌性疾病的诊断,绝大多数均需进行细菌学诊断以明确病因。然而自标本中分离到细菌并不一定意味该菌为疾病的病原，因此应根据病人的临床情况、采集标本的部位、获得的细菌种类进行综合分析。有时尚需做毒力、细胞及动物等试验以确定该菌株的致病性。
由于细菌及其代谢产物具有抗原性，细菌性感染还可通过检测抗体进行诊断。此外，近年来还发展起来通过检测细菌的遗传物质对细菌的遗传物质对细菌进行诊断的新方法—基因诊断方法。但上述检测方法操作繁琐，对检测样本采集及保存要求严格，同时检测结果假阳性率高，检测周期长，易对患者病情造成延误。
感染性疾病，特别是慢性持续性感染，是危害人类健康与生命的全球性顽疾之一。对人类有重要影响的胞内病原体，包括结核分枝杆菌、沙门氏菌、布鲁氏菌、嗜肺军团菌、李斯特菌和麻风杆菌等。结核、AIDS、肝炎等七大病构成全球性威胁的疾病，其治疗困难的原因与病原体的胞内寄生性密切相关。
针对胞内微生物感染的治疗是一难题。主要原因包括：当这些病原体侵入并潜伏于细胞内，常规的抗生素很难运送到细菌所潜伏的细胞内，并且即使运送到，浓度也很难达到有效杀菌效果；抗体不能进入细胞内发挥作用；当胞内菌成功寄生细胞后，不仅能够逃逸免疫吞噬、杀伤和清除，而且可在细胞内长期存在，在适当时机(如机体免疫力下降)导致机体发病。
沙门氏菌属(Salmonella)是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病，这些统称为沙门氏菌。沙门氏菌目前已经发现1800种以上，按抗原成分可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌型。其中与人类疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒和肠炎杆菌。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌病、猪副伤寒、马流产沙门氏菌病等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。感染沙门氏菌或食用被带菌者粪便污染的食品，可使人发生食物中毒。
因此，为了防治微生物感染疾病，本领域迫切需要开发新的操作简单、结果准确的诊断和治疗技术，以便改善此类疾病的实验室诊断及临床治疗，避免患者病情延误，减轻患者身体及经济负担。
发明内容
本发明的目的就是提供一种针对微生物感染的操作简单、结果准确的诊断和治疗方法。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的微小样RNA(milRNA)，所述的milRNA选自：
(i)序列如SEQ ID NO:1-5任一所示的milRNA
(ii)与(i)中所述milRNA的核苷酸序列互补的milRNA。
在另一优选例中，所述的互补包括基本上互补(不互补的碱基≤3个，较佳地≤3个，更佳地≤1个)和完全互补。
在另一优选例中，所述的milRNA来自沙门氏菌。
在另一优选例中，所述的milRNA分离自人或非人哺乳动物的血液、体液、或组织样品。
在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。
在另一优选例中，所述的milRNA分离自人。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的或人工构建的前体milRNA，所述的前体milRNA能在动物细胞内剪切并表达成如本发明第一方面所述的milRNA。
在另一优选例中，所述的动物细胞包括人细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体milRNA，所述的前体milRNA能在人细胞内被剪切且表达成如本发明第一方面所述的milRNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为能在动物细胞中表达成所述的milRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入动物细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II，
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的milRNA，或本发明第三方面或5所述的多核苷酸。
在本发明第五方面，提供了如本发明第一方面所述milRNA的用途，用于(a)制备检测沙门氏菌感染的试剂、检测芯片或试剂盒；或(b)制备调控iNOS表达或活性的调节剂。
在另一优选例中，所述的调控iNOS表达或活性的调节剂是下调iNOS表达或活性的抑制剂。
在本发明第六方面，提供了一种核酸芯片，所述的核酸芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获本发明第一方面所述的milRNA。
在本发明第七方面，提供了如本发明第六方面所述核酸芯片的用途，用于制备检测沙门氏菌感染的试剂盒。
在本发明第八方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第六方面所述的核酸芯片或本发明第一方面所述的milRNA。
在本发明第九方面，提供了一种特异性抑制或阻断本发明第一方面所述的milRNA的抑制剂。
在另一优选例中，所述的抑制剂是milRNA海绵(sponge)、与milRNA序列互补的反义核酸、小分子化合物。
在另一优选例中，所述的抑制剂是与(i)或(ii)中所述milRNA的核苷酸序列互补的核酸(如RNA、DNA或类似物)。
在本发明的第十方面，提供了如本发明第九方面所述的milRNA的抑制剂的用途，用于制备(a)治疗沙门氏菌感染的药物，或(b)上调iNOS表达或活性的药物。
在本发明第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断本发明第一方面所述的milRNA的抑制剂。
在另一优选例中，所述的milRNA的抑制剂包括milRNA海绵(sponge)、与milRNA序列互补的反义核酸。
在另一优选例中，所述的milRNA的抑制剂如SEQ ID NO.:7所示。
在本发明第十二方面，提供了一种筛选用于治疗沙门氏菌感染的候选药物的方法，包括步骤：
(a)提供一测试组和一对照组，其中在所述测试组中将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中sal-1的表达水平，而所述的对照组采用与测试组相同的条件，但不将候选物质施用于对照组的细胞或动物；
(b)将测试组的sal-1与对照组的sal-1的表达水平进行比较；
其中，当测试组的sal-1的表达水平显著低于对照组的sal-1的表达水平时，则表明该候选物质是用于治疗沙门氏菌感染的候选药物。
在另一优选例中，所述的sal-1的序列如SEQ ID NO.:1中所述。
在另一优选例中，所述的动物包括小鼠，所述的细胞包括体外培养的细胞。
在本发明的第十三方面，提供了一种sal-1的用途，用于制备的下调iNOS表达或活性的调节剂或药物组合物。
在另一优选例中，所述的sal-1的序列如SEQ ID NO.:1中所述。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
附图说明
图1显示了对于体内病原体沙门氏菌的ncRNA的鉴定结果。其中sal-1,2,3,4,5代表检测的是同种沙门氏菌中不同的milRNA，mock是指用PBS作处理模拟细菌感染，故在细胞内没检测到sal-1,2,3,4,5。
图2显示了病原体沙门氏菌的ncRNA的电泳图。其中各泳道如下：
第1道代表分子量标准；
第2道代表sal-1标准品；
第3道代表mock模拟感染(PBS处理)；
第4道代表LB培养的沙门氏菌SE2472(未接触细胞)；
第5道代表沙门氏菌SE2472感染HT-29细胞；
图3显示了沙门氏菌sal-1与pre-sal-1的关系。
图4显示了沙门氏菌sal-1可调控iNOS上的两个靶位点。
图5显示了在RAW264.7细胞中转入iNOS全长的表达质粒，sal-1同样可成功调控iNOS的表达。
图6显示了沙门氏菌milRNA(sal-1)对靶基因iNOS的调控作用。
图7显示了Sal-1在沙门氏菌感染小鼠中的调控作用。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，体内病原体(包括感染微生物、寄生微生物、共生微生物等)会释放非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，这些特定的ncRNA可作为体内病原体的生物标志物，可有效地用于体内病原体的检测和治疗，从而显著改善微生物感染性疾病的诊断和治疗。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明的研究表明，体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物均可通过ncRNA参与生理稳态以及疾病的发生发展。通过鉴定和检测不同病原体所特有的ncRNA(作为病原体的生物标志物)，可以准确、快速地检测出不同的病原体。此外，基于体内病原体利用宿主系统所加工产生的ncRNA，可针对性地进行抑制和消除(如通过反义RNA技术)，从而进行微生物感染疾病的治疗。基于ncRNA的治疗，为抑制微生物和/或微生物性疾病提供了一种新的治疗策略。
术语
如本文所用，术语“本发明milRNA”、“沙门氏菌特异性milRNA”可互换使用，指sal-1，sal-2，sal-3，sal-4，sal-5中任何一种或其组合。
如本文所用，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”可互换使用，含义相同。
如本文所用，术语“sal-1阻断剂”指能够抑制或阻断sa-1功能的物质，如反义序列或核酸sponge等。这些抑制剂可抑制sal-1与靶基因iNOS的mRNA的结合，以及抑制sal-1对靶基因表达的下调。
术语
如本文所用，术语“微生物”包括病毒、细菌、衣原体等各种微小生物。在本发明中，“体内微生物”指存在于宿主(人或其他动物)体内的各种微生物，包括感染微生物、寄生微生物、和共生微生物。一类典型的体内微生物是可导致疾病的病原体。
在本发明中，根据病原体与宿主细胞的关系，病原体可分为胞外菌和胞内菌两类。胞外菌是指在宿主细胞外的细胞间隙、血液、淋巴液、组织液等体液中生长繁殖的细菌。胞内菌又被分为两种：兼性胞内菌是指在宿主体内主要寄居在细胞内生长繁殖，体外无活细胞的培养基中亦可生长。专性胞内菌则不论在体内体外，都必须在活细胞内生长繁殖。
如本文所用，术语“milRNA”即microRNA like，指来源于细菌的类似于microRNA的RNA序列。
如本文所用，术语“sRNA”即small non-coding RNA，指微小的非编码性的RNA序列。在本发明中，sRNA包括microRNA以及milRNA。
iNOS，指诱导型一氧化氮合成酶。
非编码RNA
非编码RNA(Noncoding RNA，ncRNA)，指的是不被翻译成蛋白质的RNA，其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA、microRNA等各种不同的RNA，这些RNA从基因组上转录而来，不翻译成蛋白，但是参与蛋白质翻译过程，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能。例如，snRNA、snoRNA参与RNA剪接和RNA修饰。
非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等；大于500nt，包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带polyA尾巴的非编码RNA等。
snRNA是small nuclear RNA的简称，也称作小核RNA。其功能是与蛋白因子结合形成小核核糖蛋白颗粒(small nuclear ribonucleo-proteinpartcle，简称snRNPs)，行使剪接mRNA的功能。
snoRNA是最早在核仁发现的小RNA，称作小核仁RNA，最初发现它们的生物功能是用来修饰rRNA的。大多数小核仁RNA可以分为两类。一类是C DboxsnoRNA，这一类snoRNA是对RNA的碱基进行甲基化修饰的。另一类是H/ACAbox，这一类snoRNA对RNA的碱基进行甲尿嘧啶化修饰。其特点是形成一个双stem，中间加一个loop区，中间的loop区中有一个boxH。而在尾部的tail有个boxACA。由于boxH和boxACA的一级序列特征的界定比较松。
miRNA是小的RNA分子与转录基因互补，介导基因沉默。MicroRNA是一类21-23nt的小RNA，其前体大概是70-100nt左右，形成标准的茎(stem)结构，加工后成为21-23nt的单链RNA。microRNA的作用机制是与mRNA互补，让mRNA沉默或者降解。基于miRNA机制所开发的RNAi技术，就是利用类似microRNA的small RNA来沉默对应的mRNA。
gRNA又称引导RNA，指真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA。
eRNA，从内含子(introns)或非编码DNA转录的RNA分子，精细调控基因的转录和翻译效率。
信号识别颗粒RNA，指细胞质中与含信号肽mRNA识别，决定分泌的RNA功能分子。
pRNA，指噬菌体RNA。例如，研究表明，fi29噬菌体中用6个同样的小RNA分子利用ATP参与DNA的包装。
tmRNA，指具有tRNA样和mRNA样复合的RNA。tmRNA广泛存在细菌中，识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问题的核糖体的崩解。
此外，mRNA中的非翻译区，包括内含子区域和核糖体识别元件如5'-UTR,3'-UTR等，也可看作非编码RNA。
milRNA及其前体
本发明提供了一类新的、来自于沙门氏菌的milRNA。这类milRNA与miRNA非常相似，它是一种RNA分子，从可形成milRNA前体的转录物加工而来。长度通常具有18-28个核苷酸(nt)(更特别的约20-26nt)。与miRNA类似，milRNA通常可被Northern印迹检测到。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
milRNA可从前体RNA(Precursor milRNA，Pre-milRNA)加工而来，所述的前体RNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体milRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体milRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体milRNA可被剪切生成milRNA，所述的milRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的milRNA具有如SEQ ID NO:1-5所示的序列。为了提高milRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的milRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的milRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的milRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-28nt(更特别的约20-26nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleic acid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长milRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到动物(如沙门氏菌感染患者)体内后，它们能够明显下调相关milRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的milRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的milRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的milRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体milRNA，所述的前体milRNA可被人细胞剪切且表达成所述的milRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的milRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正 向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的milRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的milRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
所述的表达载体可优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
机理
为了便于理解本发明，本发明人提供以下机理。然而，应理解，这些机理并不用于对本发明产生任何限定。
本发明的研究揭示，微生物感染人体后，会分泌一些自身的ncRNA并进入循环系统，由于这些ncRNA是来自于微生物本身，因此，可以作为微生物感染疾病诊断标志物。
典型地，存在于血清的、微生物来源的ncRNA可作为微生物感染疾病诊断标志物。这些血液或血清中的病原体特有的ncRNA，可极大地提高微生物感染性疾病的诊断效率，为疾病本身的治疗提供极大的帮助，具有重要的临床意义，同时，深入研究微生物来源ncRNA将为此类疾病的发病或感染机理提供新线索。
鉴定方法
本发明还提供了一种通用的鉴别病原体来源的ncRNA的方法，
以血清或血液中存在的病原体ncRNA的鉴别为例，该鉴定方法通常包括以下步骤：
a.收集各种微生物(包括细菌，病毒，支原体，衣原体等)感染患者的血液或血清样本；
b.利用高通量测序技术及生物信息学分析比对相结合的手段，初筛患者血液或血清中微生物来源的一组sRNA(包括miRNA)；
c.进一步运用灵敏的，准确的实时荧光定量PCR对初筛的sRNA进行验证，找出各种微生物感染患者血清中各自特异的，来源于微生物本身的血清sRNA并评价其对于疾病本身的诊断价值。
在本发明中，对于鉴别出的病原体来源的ncRNA，可进一步评价所述ncRNA作为诊断标志物的可行性。
在本发明中，对于鉴别出的病原体来源的ncRNA，可进一步评价所述ncRNA在病原体感染中所起的作用。
一种典型的方法是通过体外细胞感染实验进行分析。该方法通常包括以下步骤：
a.用各种微生物(包括细菌，病毒，支原体，衣原体等)感染细胞，收集感染后细胞培液；
b.利用高通量测序技术(Solexa测序技术)及生物信息学分析比对相结合的手段，初筛细胞培液中微生物来源的一组sRNA(包括miRNA)；
c.进一步运用灵敏的，准确的实时荧光定量PCR对初筛的sRNA进行验证。
通过本发明所提供的上述方法，可鉴别并评价微生物感染疾病患者体液、血液(或血清)中来源于微生物本身的一种或多种ncRNA(包括miRNA)对微生物感染疾病诊断的特异性，准确性，并与现有的临床诊断方法作比较。
应用
本发明的研究率先揭示了体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物调控宿主的新手段。通过分泌途径，不同的体内病原体(如体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物)将其产生的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)递呈给宿主细胞，“借助”宿主的蛋白，影响宿主的免疫系统，从而有助于体内病原体在宿主体内存活。因此，通过干扰或抑制病原体特异性的ncRNA，是抑制微生物感染和治疗微生物性疾病的新途径。
基于本发明发现，可将病原体特异性的ncRNA用作检测(或诊断)标志物，并且作为治疗靶标。
以沙门氏菌为例，沙门氏菌将细菌自身所编码的非编码RNA(ncRNA)呈递到宿主细胞内，借助细胞的microRNA剪切系统，产生出类似microRNA的milRNA，运用milRNA调控免疫系统(如iNOS)，进而被细菌利用，保护其免于被宿主清除。利用milRNA的inhibitor吸附milRNA可有效抑制细菌在细胞内的存活能力，导致细菌生存能力下降，故可运用于治疗细菌感染。
检测试剂、检测芯片和检测试剂盒
本发明还提供了一种用于检测沙门氏菌或沙门氏菌感染的试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的检测试剂、或检测芯片。所述的试剂盒可用于检测本发明的沙门氏菌感染特异性miRNA的表达谱；或用于检测沙门氏菌或沙门氏菌感染，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
芯片
microRNA表达谱芯片通常含有多上百、上千或更多个探针，涵盖多种microRNA，利用双链同源互补的原理检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中的microRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的milRNA序列，还可以制备相应的milRNA芯片，进而研究其表达谱以及milRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析milRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于检测沙门氏菌或沙门氏菌感染。
本发明的所述的milRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括针对SEQ ID NO:1-4所示的序列的核酸序列。
具体地，可根据本发明所述的milRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的milRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的milRNA芯片。
本发明所述的RNA与milRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在milRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的本发明milRNA(如sal-1)的抑制剂、阻断剂或拮抗剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备治疗沙门氏菌感染、缓解沙门氏菌感染症状、减少宿主动物中沙门氏菌数量、降低沙门氏菌感染死亡率的药物、降低过度免疫等。
本发明的主要优点包括：
(a)提供了一种检测病原体(如沙门氏菌)感染的简便、快速和准确的新方法。
(b)提供了一种抑制微生物感染和治疗微生物性疾病的新途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
在以下实施例中，对体内病原体沙门氏菌进行研究，结果表明沙门氏菌可借助宿主产生milRNA(一种ncRNA)，针对该ncRNA可进行有效的检测和治疗沙门氏菌感染。
实施例1细菌感染细胞中milRNA的筛选
将沙门氏菌菌种用接种环在LB平板上进行分离划线，挑取中等大小的菌落接种LB液体培养基，于37℃培养过夜，然后离心去除LB培养基，用RPMI-1640+10%FBS培养基重悬菌体。
于感染细菌前一天，将用胰酶消化好的人的肠道上皮细胞HT-29细胞铺于细胞皿，置于5%CO2培养箱中37℃培养。
按MOI(5-10:1)比例进行感染细胞，感染2小时后，用PBS洗去未感染进入细胞的细菌，然后用含庆大霉素的RPMI-1640+10%FBS进行培养，培养过夜后，再用PBS洗3遍，以0.1%PBST(PBS+Triton X-100)裂解细胞，再用0.22μm滤器过滤除去细菌。经上述处理后，彻底去除了未进细胞内的细菌及残余在细胞内的细菌。
然后用Trizol LS提取裂解液中的总RNA，经Solexa深度测序后，对测得的数据进行分析，找出沙门氏菌特异性的小RNA片段。
1.1milRNA的鉴定
对solexa测序所获得的片段进行分析，筛选出高拷贝的milRNA片段序列，针对这些序列，设计并合成定量PCR检测探针和northern blot的检测探针。
1.2northern blot检测
Trizol LS试剂分别提取用LB培养的沙门氏菌的总RNA，及沙门氏菌感染细胞后的胞浆总RNA，将总RNA用1x RNA loading buffer(Takara)重悬，然后在15%TBE-Urea polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)进行电泳，电泳后将RNA转印到尼龙膜上，经紫外线(UV)胶连后用地高辛(DIG)标记的探针进行杂交，分析milRNA的表达。
1.3荧光定量PCR检测
以Trizol LS试剂分别提取用LB培养的沙门氏菌的总RNA，及沙门氏菌感染细胞后的胞浆总RNA，然后用DEPC处理的超纯水溶解RNA，首先用探针的下游引物进行反转录成cDNA,再以合成的探针(ABI)进行定量PCR扩增，扩增后分析各样品中milRNA的含量。
结果
实验结果如图1、图2和3图所示。
采用northern blot和qRT-PC检测，图1和2结果表明，仅在沙门氏菌感染细胞后才能出现19-30nt的小RNA(本发明中，称为milRNA)，本发明选取milRNA(sal-1)作了全面而且深入地研究。
利用生物学软件分析milRNA(sal-1)在沙门氏菌的菌基因组上序列情况，具体结果见图3。图3显示，milRNA(sal-1)所在nc-RNA可被折叠成pre-sal-1。
来源于沙门氏菌(Salmonella)的部分ncRNA的序列如下：
Sal-1:UGUGGGCACUCGAAGAUACGGAUU(SEQ ID No.:1)
Sal-2:AUGCGAGAGUAGGGAACUGCCAGGCAU(SEQ ID No.:2)
Sal-3:UCCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGC(SEQ ID No.:3)
Sal-4:GAAGGUGGCGGAAUUGGUAGACG(SEQ ID No.:4)
Sal-5:GCCCGGAUGGUGGAAUCGGUA(SEQ ID No.:5)
Pre-sal-1的序列如下：
5'-TGTGGGCACTCGAAGATACGGATTCTTAACGTCCTAGGACGAAAAATGAATACCAAGTCTCAAGAGTGAACACG-3'(SEQ ID No.:6)
实施例2
针对milRNA的抑制剂(inhibitor)可抑制细菌感染宿主的能力
2.1体外实验
在本实验中，对于鉴别出的沙门氏菌特异性的sal-1,研究其与靶基因inducible nitric oxide synthase(iNOS)的相关性。
以PCR扩增出可与milRNA结合的靶位点区域，通过Spe I+Hind III双酶切后，插入到pMIR-REPORT luciferase载体(购自上海英为信科技有限公司)，构建出重组质粒(iNOS)。另对前述构建好的重组质粒的milRNA binding sites进行突变，构建出重组突变质粒(iNOS mut)。
同时将milRNA的前体装入至由CMV作为promoter的表达载体中构建出过表达milRNA的载体(pre-sal-1)。
将milRNA对照质粒或pre-sal-1和iNOS或iNOS mut进行共转染至HEK-293T细胞中，进行报告基因检测，同时用β-gal质粒作参照。
具体结果如图4所示。图4的Luciferase结果表明，sal-1均可以调控iNOS上的两个靶位点，从而下调iNOS。
2.2Western blot
将野生型的iNOS基因全长克隆入真核表达质粒，构建出重组表达iNOS质粒(iNOS WT)进行iNOS表达，同时对milRNA结合位点进行突变(同义突变，仅改变碱基序列不改变氨基酸序列)，构建出表达iNOS质粒(iNOS MUT)进行突变iNOS的表达。将pre-sal-1分别和iNOS WT和iNOS MUT共转染到小鼠RAW264.7细胞(该细胞不受刺激不表达iNOS)中进行表达,检测milRNA对iNOS的调控能力。
具体结果如图5所示。图5结果表明，在RAW264.7细胞中转入iNOS全长的表达质粒，sal-1同样可成功调控iNOS的表达(下调)。
2.3细胞感染实验
将HT-29细胞于感染的沙门氏菌前一天铺好24孔板，次日在将anti-sal-1用lipofectin2000进行转录，anti-sal-1转染后24h，按MOI(5-10：1)感染沙门氏菌,对照组用随机序列，感染后24h检测胞内细菌的存活能力。
各反义核酸的序列如下(5'至3')：
anti-sal-1:AAUCCGUAUCUUCGAGUGCCCACA(SEQ ID NO.:7)
anti-sal-2:AUGCCUGGCAGUUCCCUACUCUCGCAU(SEQ ID NO.:8)
anti-sal-3:GCCGUUCUACCGACUGAACUACAGAGGA(SEQ ID NO.:9)
anti-sal-4:CGUCUACCAAUUCCGCCACCUUC(SEQ ID NO.:10)
anti-sal-5:UACCGAUUCCACCAUCCGGGC(SEQ ID NO.:11)
具体结果见图6。图6显示以人肠道上皮细胞(HT-29)为感染模型，在沙门氏菌感染的HT-29细胞时，转染sal-1的抑制剂(anti-sal-1)，再分析iNOS的表达与活性检测，及分析沙门氏菌在细胞内的存活率。沙门氏菌感染针对sal-1的抑制剂后iNOS表达量进一步上升，约2.8倍(图6A)；iNOS活性也相应上升，约2.3倍(图6B)。而sal-1表达水平被下调，下调了约90%(图6C),沙门氏菌感染后在细胞内的数量也随之下降，降低至45%(图6D)。
2.4体内实验
将pre-sal-1序列经酶切后插入常规的lentivirus载体中以包装出可过量表达milRNA的慢病毒。
将与milRNA互补结合的序列通过基因工程手段构建出可结合milRNA的海绵体(含有3次重复的互补片段)，然后将milRNA的海绵体也插入至lentivirus载体中以包装出可吸附milRNA的慢病毒。
另外由于小鼠体内也能表达iNOS，为验证milRNA对iNOS的调控功能，本发明人构建出mouse iNOS上milRNA的结合位点都突变的表达质粒，然后将这种质粒也经酶切后插入lentivirus载体中以包装出可过量表达mouse iNOS的慢病毒。
取6-8周龄的BALA/C小鼠为实验对象，分析milRNA的上调或下调表达对iNOS表达的影响，及对小鼠侵袭能力的比较。以6-8周的雌性BALB/C为感染模型，用重组慢病毒分别包装出过表达milRNA(sal-1)的慢病毒，过表达iNOS(小鼠iNOS的sal-1结合位点经氨基酸同义突变成sal-1不结合或低结合能力)的慢病毒，及特异性吸收milRNA(sal-1)海绵体的慢病毒。实验分为8组：mock；沙门氏菌(SE2472)；lenti-NTC+SE2472；lenti-sal-1+SE2472；lenti-sal-1sponge+SE2472；lenti-NTC+iNOS MUT SE2472；lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472；lenti-sal-1sponge+iNOS MUT SE2472。
具体结果见图7。图7显示小鼠模型中sal-1中的表达量。
图7A结果显示，沙门氏菌SE2472感染小鼠后，sal-1表达量上升，在lenti-sal-1+SE2472组sal-1表达量进一步上升，lenti-sal-1sponge+SE2472组的sal-1表达水平因被sal-1sponge(针对的sal-1的抑制剂)吸附而下降。当将小鼠iNOS的sal-1的结合位点进行同义突变后包装成慢病毒再感染小鼠后，sal-1有所下降(因为突变的iNOS的表达影响了细菌在小鼠体内存活的能力，数量有所下降所致)，在lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472组的sal-1表达量能得到一定程度的回复表达，而在lenti-sal-1sponge+iNOS MUT SE2472中sal-1表达量进一步下降。
图7B表明，这8组小鼠在感染SE2472时临床症状的改变，这些变化符合前面sal-1变化所引起细菌感染症状的改变。
图7C和7D显示，iNOS在这8组中的表达量的变化，沙门氏菌SE2472感染中iNOS的表达虽有上升，但差异不显著，只有当使用sal-1sponge时iNOS的表达才能明显得到回复表达，这清楚地表明，sal-1调控了iNOS的表达，当iNOS经同义突变后，可见iNOS的表达得到进一步上升，且不受sal-1调控，结果显示sal-1的确可调控iNOS的表达。
图7E检测了这8组中小鼠大肠组织中(肠腔中已经去除)细菌含量。sal-1上调表达可促进细菌在肠组织中的感染能力，sal-1被sponge吸附去除后，细菌感染能力会下调。在iNOS同义突变组中，sal-1不发挥调控作用，这些结果均表明了sal-1调控iNOS，并通过iNOS影响细菌在宿主体内的侵染与存活能力。
本发明的实施例结果表明，沙门氏菌将细菌自身所编码的非编码RNA(ncRNA)呈递到宿主细胞内，借助细胞的microRNA剪切系统，产生出类似microRNA的milRNA，运用milRNA调控免疫系统(如iNOS)，进而被细菌利用，保护其免于被宿主清除。本发明利用milRNA的inhibitor吸附milRNA可有效抑制细菌在细胞内的存活能力，导致沙门氏菌生存能力下降，故可运用于治疗细菌感染。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种分离的微小样RNA(milRNA)，其特征在于，所述的milRNA选自：
(i)序列如SEQ ID NO:1-5任一所示的milRNA
(ii)与(i)中所述milRNA的核苷酸序列互补的milRNA。
2.如权利要求1所述的milRNA，其特征在于，所述的milRNA来自沙门氏菌。
3.一种分离的或人工构建的前体milRNA，所述的前体milRNA能在动物细胞内剪切并表达成如权利要求1所述的milRNA。
4.一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被动物细胞转录成前体milRNA，所述的前体milRNA能在人细胞内被剪切且表达成如权利要求1所述的milRNA。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的milRNA，或权利要求4所述的多核苷酸。
6.权利要求1所述milRNA的用途，其特征在于，用于(a)制备检测沙门氏菌感染的试剂、检测芯片或试剂盒；或(b)制备调控iNOS表达或活性的调节剂。
7.一种核酸芯片，所述的核酸芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性捕获权利要求1所述的milRNA。
8.一种试剂盒，所述的试剂盒中含有权利要求7所述的核酸芯片或权利要求1所述的milRNA。
9.一种特异性抑制或阻断权利要求1所述的milRNA的抑制剂。
10.如权利要求11所述的milRNA的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备(a)治疗沙门氏菌感染的药物，或(b)上调iNOS表达或活性的药物。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和特异性抑制或阻断权利要求1所述的milRNA的抑制剂。
12.一种筛选用于治疗沙门氏菌感染的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一测试组和一对照组，其中在所述测试组中将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中sal-1的表达水平，而所述的对照组采用与测试组相同的条件，但不将候选物质施用于对照组的细胞或动物；
(b)将测试组的sal-1与对照组的sal-1的表达水平进行比较；
其中，当测试组的sal-1的表达水平显著低于对照组的sal-1的表达水平时，则表明该候选物质是用于治疗沙门氏菌感染的候选药物。
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