KR20160097297A

KR20160097297A - 살모넬라균의 비코딩 rna 및 이의 식별과 응용

Info

Publication number: KR20160097297A
Application number: KR1020167018387A
Authority: KR
Inventors: 케 젱; 홍웨이 구; 첸위 장; 텐푸 장
Original assignee: 지앙수 마이크로메드마크 바이오테크 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2016-08-17
Also published as: EP3081646B1; EP3081646A1; JP2017501697A; CN106103715A; CN104694533A; CN106103715B; US20160319332A1; EP3081646A4; US9903002B2; JP6280222B2; WO2015085905A1; KR101927726B1

Abstract

본 발명은 살모넬라균의 비코딩 RNA 및 이의 식별과 응용을 제공한다. 구체적으로, 살모넬라균은 자체가 코딩한 비코딩 RNA(ncRNA)를 숙주세포 내에 전달하고, 세포의 마이크로 RNA(microRNA) 절단 시스템에 의하여 microRNA과 유사한 milRNA를 생성하며, milRNA 제어 면역 시스템을 응용함으로써, 살모넬라균을 보호하여 숙주에 의하여 제거되는 것으로부터 방지된다. milRNA의 억제제를 이용하여 milRNA를 흡착하면, 세균이 세포 내에서의 생존 능력을 효과적으로 억제하여, 세균의 생존 능력을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 살모넬라균 또는 감염 질환을 효과적으로 검측, 치료 및 연구할 수 있는 것에 관한 시약과 방법을 더 제공한다.

Description

살모넬라균의 비코딩 RNA 및 이의 식별과 응용{NON-CODING RNA OF SALMONELLA AND INDENTIFICATION AND USE THEREOF}

본 발명은 생물 기술 분야에 관한 것이고, 더 구체적으로 살모넬라균(Salmonella)의 비코딩(Noncoding) 리보핵산(RNA, Ribonucleic Acid) 및 이의 식별과 응용에 관한 것이다.

미생물(Microorganism)은, 자연계에 광범위하게 존재하는 육안으로 볼 수 없고 반드시 광학 현미경 또는 전자 현미경에 의하여 수백 배, 수천 배, 심지어 수만 배로 확대하여야만 관찰할 수 있는 미소생물의 총칭이다. 이들은 체형이 미소하고, 구조가 간단하며, 번식이 신속하고, 쉽게 변이되며, 및 환경 적응 능력이 강한 등 특징을 구비한다.

미생물의 종류가 다양하고, 자연계에서의 분포가 매우 광범위하다. 인류, 동물과 식물의 체표 및 이들이 외계와 서로 연통하는 복강경로에도 다양한 미생물이 존재한다.

미생물은 인류에 대한 제일 중요한 영향 중의 하나가 일부 질환을 초래하는 바, 특히 전염병을 초래한다. 비록 질환의 예방과 치료방면에서, 인류는 많은 발전을 가져왔지만, 새로 나타나거나 또는 다시 나타나는 미생물 감염은 여전히 끊임없이 발생하고, 많은 질환에는 줄곧 효과적인 치료약물이 부족하다. 이 밖에, 대량의 광범위항생제(broad spectrum antibiotics)의 남용으로 심한 선택압(Selective pressure)을 초래하고, 수많은 균주가 변이되어, 더 위험한 내약품성 균주가 나타났다.

무릇 살아 있는 생물의 체외 또는 체내에서 생장하는 미생물은 모두 기생 미생물로 불리우고, 기생 생활하는 미생물은 기타 생물의 영양을 박탈하거나, 심지어 기타 생물의 신체의 일부분을 영양으로 한다. 미생물은 구강, 피부 또는 호흡 기관을 통하여 사람 또는 동물 체내에 진입하고, 사람 또는 동물체의 영양을 이용하여 생장번식할 수 있다. 만일 이러한 세균이 독소를 생성하면, 사람은 콜레라, 장티푸스, 폐렴 등과 같은 병에 걸린다. 에이즈, 감기 등 질환은 바이러스에 의하여 초래된 것이다. 바이러스는 더 특정된 기생 미생물이고, 이들은 세포를 떠나면 생존할 수 없기 때문에, 엄격한 기생 미생물이라고 부른다.

미생물 감염(Microbial infection)은 임상에서 흔히 보는 미생물이 초래한 질환이다. 세균성 질환의 진단에서, 병인을 확인하기 위하여 절대 다수는 모두 세균학 진단을 해야 한다. 그러나, 시료로부터 분리하여 얻은 세균이 반드시 질환의 병원인 것을 의미하지 않으므로, 환자의 임상 상황, 시료를 채집한 부위, 획득한 세균 종류에 따라 종합적으로 분석해야 된다. 상기 균주의 병원성을 확정하기 위하여, 때로는 독력(virulence), 세포 및 동물 등 실험을 진행해야 된다.

세균 및 그 대사 산물은 항원성을 구비함으로써, 세균성 감염은 항체를 검출하여 진단을 진행할 수도 있다. 이 밖에, 최근에는 세균의 유전형질을 검출하여 세균에 대하여 진단하는 신규 방법인 유전자 진단 방법이 더 발전되고 있다. 하지만, 상기 검출 방법은 조작이 번거롭고, 검출 샘플의 채집 및 보관에 대한 요구가 엄격하면서, 검출 결과가 위양성(false positive)일 확율이 높고, 검출 주기가 길어, 환자 병세를 지연하기 쉽다.

감염성 질환, 특히 만성 지속성 감염은 인류 건강과 생명을 위협하는 전 세계적인 고질별 중의 하나이다. 인류에 대하여 중요한 영향을 주는 세포 내 병원체는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 살모넬라균, 브루셀라균(Brucella), 레지오넬라균(legionella), 리스테리아균(Listeria) 및 나균(Mycobacterium leprae) 등을 포함한다. 결핵, AIDS, 간염 등 칠대병은 전 세계적으로 위협하는 질환을 이루고, 상기 질환의 치료가 어려운 원인은 병원체의 세포 내 기생성과 밀접한 관계가 있다.

세포 내 미생물 감염에 대한 치료는 하나의 난관이다. 주요한 원인은, 이러한 병원체가 세포 내에 침입하여 잠복할 때, 일반적인 항생제는 세균이 잠복한 세포 내에 이송되기 어렵고, 가령 이송되어도, 이송된 상기 항생제의 농도는 효과적으로 살균하는 효과를 달성하기 어려운 것과; 항체는 세포 내에 진입하여 작용을 발휘할 수 없는 것과; 세포 내 균이 세포를 성공적으로 기생한 후, 면역 시스템의 탐식, 살상과 제거를 피면할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 내에서 장기간 생존할 수 있어, 적당한 시기(예를 들면, 생물체 면역력이 하강됨)에서 유기체 발병을 초래하기 때문이다.

살모넬라균속(Salmonella)은 인류와 동물 장 내에 기생되고, 생화학 반응과 항원 구조가 유사한 한 무리의 그람음성균(Gram negative bacillus)이고, 일부분은 전문 인류에 대하여 병을 일으키고, 일부분은 단지 동물에 대하여 병을 일으키며, 또 일부분은 사람과 동물에 대하여 모두 병을 일으키는데, 이러한 것들을 살모넬라균으로 총칭한다. 현재 이미 1800종 이상의 살모넬라균을 발견하였고, 항원 성분에 따라 A, B, C, D, E 등 기본적인 균형으로 구분할 수 있다. 그 중에서, 인류 질환에 관한 것에는 주로 A 그룹의 파라티푸스(paratyphoidfever) A균, B 그룹의 파라티푸스B균과 쥐티푸스균, C 그룹의 파라티푸스C균과 돼지콜레라균(swine fever), D 그룹의 장티푸스(typhoid fever)과 장염세균이 있다. 이러한 균들은 가금티푸스(fowl typhoid), 추백리(pullorum), 돼지콜레라, 쥐티푸스균, 돼지 파라티푸스, 말파라티푸스균(paratyphoid of horse) 등 질환을 초래할 수 있다. 병원성이 가장 강한 것은 살모넬라 콜레라(Salmonella cholerae)이고, 그 다음으로는 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)과 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis)이다. 살모넬라균에 감염되거나 또는 보균자의 대소변에 오염된 식품을 먹으면, 사람이 식중독에 걸릴 수 있다.

따라서, 미생물 감염 질환을 예방 치료하고, 이와 같은 질환의 실험실 진단 및 임상 치료를 개선하여, 환자 병세의 지연을 피면하며, 환자 신체 및 경제적의 부담을 감소시키도록, 본 기술분야에서는 조작이 간단하고 결과가 정확한 신규 진단과 치료기술을 개발하는 것이 절박하게 필요하다.

본 발명은, 미생물 감염에 대하여 조작이 간단하고 결과가 정확한 진단과 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 제1 양태에서, (i), 서열이 SEQ ID NO:1~5 중의 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 milRNA; 및 (ii), (i)중의 상기 milRNA의 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열과 상보적인 milRNA로부터 선택되는 분리된 mil RNA(microRNA-like)를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 상보적이라는 것은 기본적으로 상보적이인 것(비상보적인 염기≤3개, 바람직하게는 ≤3개, 더 바람직하게는 ≤1개)과 완전히 상보적인 것을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 milRNA는 살모넬라균에서 유래된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 milRNA는 사람 또는 사람이 아닌 포유동물의 혈액, 체액 또는 조직샘플로부터 분리된다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 혈액은 혈장 및/또는 혈청이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 사람이 아닌 포유동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소, 양 등이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 milRNA는 사람으로부터 분리된다.

본 발명의 제2 양태에서, 분리되거나 또는 인위적으로 구축되는 전구체 milRNA를 제공하는 바, 상기 전구체 milRNA는 동물 세포 내에서 절단되어 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA로 발현될 수 있다.

다른 바람직한 예에서, 상기 동물 세포는 인간 세포를 포함한다.

본 발명의 제3 양태에서, 동물 세포에 의하여, 인간 세포 내에서 절단되어 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA로 발현될 수 있는 전구체 milRNA로 전사될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 하기의 식 I로 표시되는 구조를 구비한다.

식 I: Seq_정방향-X-Seq_역방향

식 I에서, Seq_정방향은 동물 세포에서 상기 milRNA로 발현될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이고, Seq_역방향은 Seq_정방향와 기본적으로 상보적이거나 또는 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 서열이며, X는 Seq_정방향와 Seq_역방향 사이에 위치한 스페이서 서열(spacer sequences)이고, 상기 스페이서 서열과 Seq_정방향 및 Seq_역방향은 서로 비상보적이며, 식 I로 표시되는 구조는 동물 세포에 전이된 후, 하기의 식 II로 표시되는 이차구조(secondary structure)를 형성한다.

식 II:

식 II에서, Seq_정방향, Seq_역방향와 X의 정의는 상기와 같고, ||는 Seq_정방향와 Seq_역방향 사이에 형성되는 상보적 염기 페어링(Pairing) 관계를 표시한다.

본 발명의 제4 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 담체를 제공한다.

본 발명의 제5 양태에서, (a), 살모넬라균 감염을 검출하는 시약, 검출칩 또는 키트(kit)를 제조하거나, 또는 (b), 유도형NO생성효소(iNOS, inducible NO synthase)의 발현 또는 활성을 제어하는 조절제를 제조하기 위한 제1 양태에 따른 milRNA의 용도를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 iNOS의 발현 또는 활성을 제어하는 조절제는 iNOS의 발현 또는 활성을 감소하는 억제제이다.

본 발명의 제6 양태에서, 고상 담체; 및 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA를 특이적으로 포획하고, 상기 고상 담체에 순차적으로 고정되는 올리고뉴클레오타이드 프로브(oligonucleotide probe)를 포함하는 핵산칩（Nucleic Acid Chip）을 제공한다.

본 발명의 제7 양태에서, 살모넬라균 감염을 검출하는 키트를 제조하기 위한 본 발명의 제6 양태에 따른 핵산칩의 용도를 제공한다.

본 발명의 제8 양태에서, 본 발명의 제6 양태에 따른 핵산칩 또는 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA를 함유하는 키트를 제공한다.

본 발명의 제9 양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA를 특이적으로 제어 또는 차단하는 억제제를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 억제제는 milRNA 해면(sponge), milRNA 서열과 상보적인 안티센스 핵산(antisense nucleic acid), 소분자 화합물이다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 억제제는 (i) 또는 (ii)중의 상기 milRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 핵산(예를 들어, RNA, DNA 또는 유사체 등)이다.

본 발명의 제10 양태에서, (a), 살모넬라균 감염을 치료하는 약물을 제조하거나, 또는 (b), iNOS의 발현 또는 활성을 증가하는 약물을 제조하기 위한 본 발명의 제9 양태에 따른 milRNA의 억제제의 용도를 제공한다.

본 발명의 제11 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체와 본 발명의 제1 양태에 따른 milRNA를 특이적으로 제어 또는 차단하는 억제제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 milRNA의 억제제는 milRNA 해면(sponge), milRNA 서열과 상보적인 안티센스 핵산(antisense nucleic acid)을 포함한다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 milRNA의 억제제는 SEQ ID NO.: 7에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 제12 양태에서, 하나의 실험군과 하나의 대조군을 제공하고, 상기 실험군에서 후보물질을 실험군의 세포 또는 동물에 투여하여, 투여된 후의 상기 실험군 중의 sal-1의 발현 수준을 측정하며, 상기 대조군에 실험군과 동일한 조건을 사용하지만, 후보물질을 대조군의 세포 또는 동물에 사용하지 않는 단계(a); 및 실험군의 sal-1과 대조군의 sal-1의 발현 수준을 비교하는 단계(b)를 포함하고, 실험군의 sal-1의 발현 수준이 대조군의 sal-1의 발현 수준보다 현저히 낮을 경우, 상기 후보물질은 살모넬라균 감염을 치료하기 위한 후보약물임을 의미하는 살모넬라균 감염을 치료하는 후보약물의 선별방법을 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 sal-1의 서열은 SEQ ID NO.: 1에 설명한 바와 같다.

또 다른 바람직한 예에서, 상기 동물은 마우스를 포함하고, 상기 세포는 체외에서 배양되는 세포를 포함한다.

본 발명의 제13 양태에서, iNOS의 발현 또는 활성을 감소하는 조절제 또는 약물 조성물을 제조하기 위한 sal-1의 용도를 제공한다.

다른 바람직한 예에서, 상기 sal-1의 서열은 SEQ ID NO.: 1에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 후술되는(예를 들면, 실시예) 구체적인 설명의 각 기술특징은 모두 서로 조합되어, 새롭거나 또는 바람직한 과제의 해결수단을 구성하는 것으로 이해되어야 한다. 편폭의 제한으로 일일이 다시 설명하지 않는다.

도 1은 체내 병원체 살모넬라균의 비코딩 RNA(ncRNA)에 대한 식별 결과를 표시한 도이다. 여기서, sal-1, sal-2, sal-3, sal-4, sal-5는 동족 살모넬라균에서 상이한 milRNA를 검출한 것을 대표하고, mock는 인산 완충 식염수(PBS, phosphate buffer saline)로 세균 감염 시뮬레이션을 처리한 결과, 세포 내에서 sal-1, sal-2, sal-3, sal-4, sal-5를 검출하지 못한 것을 의미한다.
도 2는 병원체 살모넬라균의 ncRNA를 표시하는 전기 영동도(electropherogram)이다. 여기서, 제1 레인은 분자량 표준을 대표하고, 제2 레인은 sal-1 표준품을 대표하며, 제3 레인은 mock 감염 시뮬레이션(PBS 처리)을 대표하고, 제4 레인은 LB 배양한 살모넬라균 SE2472(세포를 첩촉하지 않음)를 대표하며, 제5 레인은 살모넬라균 SE2472 감염 HT-29 세포를 대표한다.
도 3은 살모넬라균 sal-1과 pre-sal-1의 관계를 표시하는 도이다.
도 4는 살모넬라균sal-1이 iNOS의 두 개의 타겟 부위(target site)를 조절할 수 있는 것을 표시하는 도이다.
도 5는 RAW264.7 세포에 iNOS 전체 길이(full-length)의 발현 플라스미드(plasmid)를 전이하면, sal-1도 역시 iNOS의 발현을 성공적으로 제어할 수 있는 것을 표시한 도이다.
도 6은 살모넬라균 milRNA(sal-1)이 타겟 유전자 iNOS에 대한 제어 작용을 표시한 도이다.
도 7은 Sal-1이 살모넬라균 감염 마우스에 있어서의 제어 작용을 표시한 도이다.

본 발명인은 광범위하고 철저한 실험을 거친 후, 체내 병원체(감염 미생물, 기생 미생물, 공생 미생물 등을 포함)는 비코딩 RNA을 방출하고, 이러한 특정된 ncRNA는 체내 병원체의 바이오마커(biomarkers)로 사용할 수 있으며, 체내 병원체의 검출과 치료에 효과적으로 사용되어, 미생물 감염성 질환의 진단과 치료를 효과적으로 개선할 수 있는 것을 최초로 예기치 않게 발견하였다. 이러한 기초 상에서 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명의 연구에 의하면, 체내 감염 미생물, 기생 미생물, 공생 미생물은 모두 ncRNA를 통하여 생리적 항상성 및 질환의 발생과 발전에 참여할 수 있다. 상이한 병원체의 특유한 ncRNA(병원체의 바이오마커로 사용함)를 식별 및 검출하여, 상이한 병원체를 정확하고 신속하게 검출해 낼 수 있다. 이 밖에, 체내 병원체를 기반으로 숙주 시스템이 가공 생성한 ncRNA를 이용하여, 표적적으로 억제와 제거(예를 들면, 안티센스 RNA 기술을 이용함)를 진행하여, 미생물 감염 질환에 대한 치료를 진행할 수 있다. ncRNA의 치료를 기반으로, 미생물 및/또는 미생물성 질환에 대하여 신규 치료 전략을 제공한다.

용어

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 본 발명의 용어 'milRNA', '살모넬라균 특이성 milRNA'은 서로 교체하여 사용할 수 있는 것으로, sal-1, sal-2, sal-3, sal-4, sal-5 중의 어느 하나 또는 이들의 조합을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 '억제제', '길항제'와 '차단제'는 서로 교체하여 사용할 수 있는 것으로, 이들의 함의는 동일하다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 'sal-1 차단제’는 안티센스 서열 또는 핵산 sponge 등과 같이 sal-1 기능을 억제 또는 차단할 수 있는 물질을 의미한다. 이러한 억제제는 sal-1과 타겟 유전자 iNOS의 mRNA의 결합을 억제하고, sal-1이 타겟 유전자의 발현에 대한 감소를 억제할 수 있다.

용어

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 '미생물'은 바이러스, 세균, 원시 세균, 클라미디아(chlamydia), 원생생물 등 각종 미소생물을 포함한다. 본 발명에서, '체내 미생물’은 숙주(사람 또는 기타 동물) 체내에 존재하는 각종 미생물을 의미하는 바, 감염 미생물, 기생 미생물과 공생 미생물을 포함한다. 이런 종류의 전형적인 체내 미생물은 질환을 초래할 수 있는 병원체이다.

본 발명에서, 병원체와 숙주세포의 관계에 따르면, 병원체는 세포외 세균과 세포내 세균인 두가지 종류로 구분될 수 있다. 세포외 세균은 숙주세포 외의 세포간극, 혈액, 림프액, 조직액 등 체액에서 생장번식하는 세균을 의미한다. 세포내 세균은 또 하기와 같은 두가지 종류로 구분된다. 통성 세포내 세균은 숙주 체내에서 주로 세포 내에 기숙하여 생장번식하고, 체외 생세포의 배지에서도 생장할 수 있는 세균을 의미한다. 편성 세포내 세균은 체내 또는 체외를 막론하고 모두 반드시 생세포 내에서만 생장번식하는 세균을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 'milRNA', 즉 microRNA like는 세균에서 유래되는, microRNA과 유사한 RNA 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 'sRNA', 즉 small non-coding RNA는 미소한 비코딩의 RNA 서열을 의미한다. 본 발명에서, sRNA는 microRNA 및 milRNA를 포함한다.

iNOS는 유도형 산화질소 합성 효소를 의미한다.

비코딩 RNA

비코딩 RNA는 단백질로 번역되지 않는 RNA를 의미하고, 이는 리보솜RNA( rRNA, ribosomal RNA), 운반RNA(tRNA, transfer RNA), 소형 핵 RNA (snRNA, small nuclear RNA), 핵소체내저분자 RNA(snoRNA, small nucleolar RNA), microRNA 등 각종 상이한 RNA를 포함하며, 이러한 RNA는 게놈(genome) 으로부터 전사되어 오고, 단백질로 번역되지 않지만, 단백질 번역 과정에 참여하며, RNA 수준에서 각자의 생물학적 기능을 수행할 수 있다. 예를 들면, snRNA, snoRNA는 RNA 절단과 RNA 수식에 참여한다.

비코딩 RNA는 길이 방면에서 구분하면, microRNA, 작은 간섭 RNA(siRNA, small interfering RNA), piRNA를 포함하는 50nt보다 작은 것; rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, SLRNA, SRPRNA 등을 포함하는 50 nt 내지 500 nt인 것; 길고 microRNA like의 비코딩 RNA, 길고 폴리 에이(polyA) 꼬리를 구비하지 않은 비코딩 RNA 등을 포함하는 500 nt보다 긴 것 세가지 종류로 구분할 수 있다.

snRNA는 small nuclear RNA의 약칭이고, 소핵 RNA로도 불리운다. 그 기능은 단백질 인자와 결합하여 소핵 리보핵산 단백질 입자(small nuclear ribonucleo-protein partcle, snRNPs으로 약칭)를 형성하는 것이고, mRNA를 이어맞추는(splicing) 기능을 수행한다.

snoRNA는 최초로 인(nucleolus)에서 발견된 작은 RNA인 것으로, 소인 RNA로 불리우며, 최초로 발견한 이들의 생물학적 기능은 rRNA를 수식하는 것이다. 대부분 소인 RNA는 두가지 종류로 구분될 수 있다. 한가지 종류는 C Dbox snoRNA이고, 이런 종류의 snoRNA는 RNA의 염기에 대하여 메틸화 수식하기 위한 것이다. 다른 종류는 H/ACA box이고, 이런 종류의 snoRNA는 RNA의 염기에 대하여 메틸우라실화 수식하기 위한 것이다. 이들의 특징은 중간에 하나의 루프(loop) 영역을 추가하는 한 쌍의 줄기(stem)를 형성하는 것이고, 중간의 loop 영역에는 하나의 boxH가 구비된다. 끝부분의 tail에는 하나의 boxACA가 존재하는데, 이는 boxH와 boxACA의 일차 서열 특징의 정의가 비교적 모호하기 때문이다.

miRNA는, 작은 RNA 분자와 전사 유전자가 상보되어 유전자의 침묵을 매개하는 것이다. MicroRNA는 한가지 종류의 21-23nt의 작은 RNA이고, 그 전구체는 대략 70~100nt 좌우이며, 표준적인 줄기(stem) 구조를 형성하고, 가공 후 21~23nt로 되는 단일 가닥 RNA이다. microRNA의 작용 메커니즘은 mRNA과 상보하여 mRNA를 침묵시키거나 또는 분해시키는 것이다. miRNA 메커니즘을 기반으로 개발한 RNAi 기술이 바로 microRNA과 유사한 small RNA를 이용하여 대응되는 mRNA를 침묵시키는 것이다.

gRNA는 안내 RNA로 불리우기도 하는데, 진핵생물에서 RNA 편집에 참여되는 mRNA과 상보적인 서열을 구비하는 RNA를 의미한다.

eRNA는 인트론(introns) 또는 비코딩 DNA로부터 전사된 RNA 분자로서, 유전자의 전사와 번역효율을 정밀하게 조절한다.

신호인식입자 RNA는 세포질에서 신호 펩타이드 함유 mRNA와, 분비하기로 한 RNA 기능 분자를 식별하는 것을 의미한다

pRNA는 박테리오파지(bacterio-phage) RNA를 의미한다. 예를 들면, 연구 결과에 의하면, fi29 박테리오파지에서 6 개의 동일한 작은 RNA 분자로 아데노신 3인산(ATP, adenosine triphosphate)을 이용하여 DNA의 패키징(packaging)에 참여한다.

tmRNA는, tRNA 유사와 mRNA 유사가 복합되는 RNA를 구비하는 것을 의미한다. tmRNA는 세균 중에 광범위하게 존재하고, 번역 또는 오독된 리보솜을 식별하며, 일부 스톨링(stalling)이 지연된 리보솜도 식별하고, 이러한 문제가 있는 리보솜의 붕괴를 매개한다.

이 밖에, mRNA 중의 비코딩 영역에는 인트론 영역과 5'-UTR, 3'-UTR 등과 같은 리보솜 식별 소자가 포함되는 바, 비코딩 RNA로도 볼 수 있다.

milRNA 및 이의 전구체

본 발명은 살모넬라균에서 유래되는 한 가지 신규 milRNA를 제공한다. 이러한가지 종류의 milRNA는 miRNA와 매우 유사하고, 이는 한가지 종류의 RNA 분자이며, milRNA 전구체를 형성할 수 있는 전사체를 가공하여 얻는다. 길이는 일반적으로 18~28개의 뉴클레오타이드(nt)(특히 약 20~26nt)를 구비한다. miRNA와 유사하고, milRNA는 일반적으로 노던법(Northern blot)에 의하여 검출된다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, '분리됨'은 물질이 이의 오리지널 환경으로부터 분리되는(만약 자연적인 물질이면, 오리지널 환경은 자연환경임) 것을 의미한다. 생체 세포 내의 자연적인 상태에서의 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩티드(polypeptide) 등은 분리 및 정제되지 않았지만, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 등은 자연적인 상태에서 동존하는 기타 물질로부터 이격되면, 분리 정제된 것이다.

milRNA는 전구체 RNA(Precursor milRNA, Pre-milRNA)로부터 가공되어 얻는 것이고, 상기 전구체 RNA는 안정한 줄기 루프(머리핀) 구조로 폴딩될 수 있으며, 상기 줄기 루프 구조의 길이는 일반적으로 50~100bp 사이에 있다. 상기 전구체 milRNA는 안정한 줄기 루프 구조로 폴딩될 수 있고, 줄기 루프 구조의 줄기부 양측에는 기본적으로 상보적인 두 개의 서열을 포함한다. 상기 전구체 milRNA는 자연적이거나 또는 인위적으로 합성될 수 있다.

전구체 milRNA는 절단되어, 암호화 유전자의 mRNA의 적어도 일부분의 서열과 상보적일 수 있는 milRNA를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, '기본적으로 상보적임' 은 뉴클레오타이드의 서열은 충분히 상보적이고, 예측 가능한 방식으로 상호작용을 발생할 수 있는 것을 의미하며, 예를 들어, 이차구조(줄기 루프 구조와 같음)를 형성하는 것이다. 일반적으로, 두 개의 '기본적으로 상보적'의 뉴클레오타이드 서열의 상호 사이에는 적어도 70%의 뉴클레오타이드가 상보적이고, 바람직하게는, 적어도 80%의 뉴클레오타이드가 상보적이며, 더 바람직하게는, 적어도 90%의 뉴클레오타이드가 상보적이고, 가장 바람직하게는, 98%, 99% 또는 100%와 같이 적어도 95%의 뉴클레오타이드가 상보적인 것이다. 일반적으로, 두 개의 충분히 상보적인 분자 사이에는 최대 40 개의 비매칭되는 뉴클레오타이드가 존재할 수 있고, 바람직하게는, 최대 30 개의 비매칭되는 뉴클레오타이드가 존재하며, 더 바람직하게는, 최대 20 개의 비매칭되는 뉴클레오타이드가 존재하고, 가장 바람직하게는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 8 개의 비매칭되는 뉴클레오타이드와 같이 최대 10 개의 비매칭되는 뉴클레오타이드가 존재한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이 '줄기 루프' 구조는 '머리핀' 구조로도 불리우는 것으로, 뉴클레오타이드 분자를 의미하며, 이는 이중 가닥 영역(줄기부)을 형성할 수 있는 바, 상기 이중 가닥 영역은 상기 뉴클레오타이드 분자의 두 개의 영역(동일한 분자에 위치함)으로 형성되고, 두 개의 영역은 이중 가닥 부분의 양측에 각각 배열되며; 상기 '줄기 루프' 구조는 비상보적인 뉴클레오타이드 분자, 즉, 단일 가닥 영역을 포함하는 적어도 하나의 '루프' 구조를 더 포함한다. 가령 상기 뉴클레오타이드 분자의 두 개의 영역이 완전히 상보적이 아니더라도 상기 뉴클레오타이드의 이중 가닥 부분은 이중 가닥 상태를 유지할 수 있다. 예를 들면, 삽입, 결실, 치환 등은 하나의 소영역의 비상보적 또는 상기 소영역 자체의 비상보적 또는 상기 소영역 자체가 줄기 루프 구조를 형성하거나 또는 기타 형식의 이차구조를 초래할 수 있다. 그러나, 상기 두 개의 영역은 여전히 기본적으로 상보적이며, 예측 가능한 방식에서 상호작용을 발생하고, 줄기 루프 구조의 이중 가닥 영역을 형성할 수 있다. 줄기 루프 구조는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 익숙한 것이고, 일반적으로 일차 구조를 구비하는 하나의 뉴클레오타이드 서열의 핵산을 획득한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 상기 핵산이 줄기 루프 구조를 형성할 수 있는지의 여부를 확정할 수 있다.

본 발명에서 설명한 milRNA는 SEQ ID NO: 1~5로 표시되는 서열을 갖는다. milRNA의 안정성 또는 기타 성질을 향상시키기 위하여, 상기 milRNA의 적어도 하나의 일단에 'TT' 등과 같은 적어도 하나의 보호성 염기를 추가할 수도 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드

본 발명에서 제시한 milRNA 서열에 따르면, 체내에서 상응한 milRNA의 발현을 감소할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계해 낼 수 있다. 본 명세서에서 사용한 바와 같이, '안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense-oligonucleotides, AS-Ons 또는 ASO)'는 '안티센스 뉴클레오타이드'로도 불리우고, 길이가 약 18~28nt(특히 약 20~26nt)의 DNA 분자 또는 RNA 분자 또는 그 유사체를 의미한다.

본 발명에서, 상기 '안티센스 올리고뉴클레오티드'는 잠금 핵산 또는 핵산 체인 백본(chain backbone) 수식기술 등을 기반으로 하는 수단을 사용하여 획득하는 수식을 거친 안티센스 뉴클레오타이드 등을 더 포함하고, 상기 수식은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 거의 개변시키지 않으며, 더 바람직하게는, 상기 수식은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 안정성, 활성 또는 치료효과를 향상시킬 수 있다. 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA)은 일반적으로 하나의 메틸렌 브릿지(methylene bridge)를 통하여 리보오스(ribose)의 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결시키는 수식기술을 의미한다. LNA는 milRNA의 혈청 반감기를 연장하고, 타겟에 대한 친화성을 향상시키며, 오프 타겟 작용의 범위와 수준을 감소시킬 수 있다. 핵산 체인 백본의 수식기술을 기반으로 제시되는 안티센스 약물은 가용성, 뉴클레아제 분해를 저항하는 등 방면에서 크게 개선되고, 대량 합성에 용이하다. 올리고뉴클레오티드의 백본 수식 방법에는 티오법을 포함하는 다양한 방법이 존재하는 바, 예를 들어, 디옥시뉴클레오티드 체인을 티오디옥시뉴클레오티드 체인으로 티오수식하는 것이다. 상기 방법은 DNA 백본의 인산결합의 산소 원자를 유황 원자로 교체하여, 안티뉴클레아제 분해를 저항할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드의 대부분 또는 전부 활성을 유지할 수 있는 어떠한 수식도 모두 본 발명에 포함된 것으로 이해해야 된다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 잠금 핵산 수식을 진행하고, 더 바람직하게는 티오 수식을 진행한다.

본 발명에서 설명한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물(예를 들면, 살모넬라균 감염 환자) 체내에 전이된 후, 이들은 관련되는 milRNA의 발현을 현저히 감소할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 구축물

본 발명에서 제시한 milRNA 서열에 따르면, 도입된 후 상응한 mRNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 milRNA로 가공되는 폴리뉴클레오타이드 구축물을 설계해 낼 수 있는 바, 다시 말하면, 상기 폴리뉴클레오타이드 구축물은 체내에서 상응한 milRNA의 량을 증가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 세포에 의하여 전구체 milRNA로 전사될 수 있는 분리된 폴리뉴클레오타이드(구축물)을 제공하고, 상기 전구체 milRNA는 인간 세포에 의하여 절단되고 상기 milRNA로 발현될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 구축물은 하기의 식 I로 표시되는 구조를 함유한다.

식 I: Seq_정방향-X-Seq_역방향

식 I에서, Seq_정방향은 동물 세포에서 상기 milRNA로 발현될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이고, Seq_역방향은 Seq_정방향와 기본적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 세포에서 상기 milRNA로 발현될 수 있는 뉴클레오타이드 서열이며, Seq_정방향은 Seq_정방향과 기본적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열이고, X는 Seq_정방향와 Seq_역방향 사이에 위치한 스페이서 서열이며, 또한 상기 스페이서 서열과 Seq_정방향 및 Seq_역방향은 서로 비상보적이며, 식 I로 표시되는 구조는 동물 세포에 전이된 후, 하기의 식 II로 표시되는 이차구조를 형성한다.

식 II:

식 II에서, Seq_정방향, Seq_역방향와 X의 정의는 상기와 같고, ||는 Seq_정방향와 Seq_역방향 사이에 형성되는 상보적 염기 페어링 관계를 표시한다.

일반적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 구축물은 발현 담체에 위치한다. 따라서, 본 발명은 담체를 더 포함하는 바, 이는 상기 milRNA 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 구축물을 함유한다. 상기 발현 담체는 일반적으로 프로모터(promoter), 복제기점(origin of replication) 및/또는 표지 유전자(marker gene) 등을 함유한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들이 숙지하는 방법은 본 발명에서 수요한 발현 담체를 구축할 수 있다. 이러한 방법은 체외 DNA 재조합 기술, DNA 합성 기술,체내 재조합 기술 등을 포함한다.

상기 발현 담체는 바람직하게 하나 또는 여러개의 선택적 표지 유전자를 포함하여, 전환된 숙주세포를 선택하는 표현형 형질을 제공하도록 할 수 있는 바, 예를 들어, 카나마이신(kalamycin), 젠타마이신(gentamycine), 히그로마이신(Hygromycin), 암피실린(Ampicillin) 내성이다.

메커니즘

본 발명을 쉽게 이해하기 위하여, 본 발명자는 하기와 같은 메커니즘을 제공한다. 그러나, 이러한 메커니즘은 본 발명을 한정하기 위함은 아닌 것으로 이해해야 된다.

본 발명의 연구에 따르면, 미생물이 인체를 감염한 후, 자체의 일부 ncRNA를 분비하여 순환 시스템에 진입하는데, 이러한 ncRNA는 미생물 자체에서 유래된 것이며, 따라서, 미생물 감염 질환의 진단 마커로 사용할 수 있다.

전형적으로, 혈청에 존재하고 미생물에서 유래되는 ncRNA는 미생물 감염 질환의 진단 마커로 사용할 수 있다. 이러한 혈액 또는 혈청 중의 병원체의 특유한 ncRNA는 미생물 감염성 질환의 진단 효율을 크게 향상시킬 수 있어, 질환 자체의 치료에 큰 도움을 주고, 중요한 임상 의의를 가지고 있으며, 동시에, 미생물에서 유래되는 ncRNA를 깊이 연구하여, 이러한가지 종류의 질환의 발병 또는 감염 메커니즘에 새로운 단서를 제공할 것이다.

식별 방법

본 발명은 하기와 같은 병원체에서 유래되는 ncRNA의 통용하는 식별 방법을 더 제공한다.

혈청 또는 혈액에 존재하는 병원체 ncRNA의 식별을 예를 들면, 일반적으로 상기 식별 방법은 하기와 같은 몇가지 단계를 포함한다. 각종 미생물(세균, 원시 세균, 바이러스, 마이코플라즈마(mycoplasma), 클라미디아, 원생생물 등을 포함)감염 환자의 혈액 또는 혈청 샘플을 수집하는 단계(a); 높은 처리율 시퀀싱(High-throughput sequencing) 기술 및 생물 정보학 분석을 이용하여 서로 결합하는 수단을 비교 대조하여, 환자의 혈액 또는 혈청 중의 미생물에서 유래되는 한 그룹의 sRNA(miRNA를 포함)를 초기 선별하는 단계(b); 및 민감하고 정확한 질적인 실시간 중합 효소 연쇄 반응법(Quantitative Real-time polymerase chain reaction)을 더 응용하여 초기 선별한 sRNA에 대하여 검증하고, 각종 미생물 감염 환자의 혈청 중의 각자 특이하며 미생물 자체에서 유래되는 혈청 sRNA를 찾아내어, 이가 질환 자체에 대한 진단 가치를 평가하는 단계(c).

본 발명에서, 식별해 낸 병원체에서 유래되는 ncRNA에 대하여, 상기 ncRNA를 진단 마커로 사용하는 실행 가능성을 더 평가할 수 있다.

본 발명에서, 식별해 낸 병원체에서 유래되는 ncRNA에 대하여, 상기 ncRNA가 병원체 감염에서 일으키는 작용을 더 평가할 수 있다.

전형적인 방법은 체외 세포 감염 실험을 통하여 분석하는 것이다. 일반적으로 상기 방법은 하기와 같은 몇가지 단계를 포함한다. 각종 미생물(세균, 원시 세균, 바이러스, 마이코플라즈마, 클라미디아, 원생생물 등을 포함) 감염 세포를 사용하여, 감염 후의 세포 배양액을 수집하는 단계(a); 높은 처리율 시퀀싱 기술(Solexa 시퀀싱 기술) 및 생물 정보학 분석을 이용하여 서로 결합하는 수단을 비교 대조하여, 세포 배양액에서 미생물에서 유래되는 한 그룹의 sRNA(miRNA를 포함)를 초기 선별하는 단계(b); 및 민감하고 정확한 질적인 실시간 중합 효소 연쇄 반응법을 더 응용하여 초기 선별한 sRNA를 검증하는 단계(c)를 포함한다.

본 발명에서 제시한 상기 방법에 따르면, 미생물 감염 질환 환자의 체액, 혈액(또는 혈청)에서 미생물 자체에서 유래되는 한 가지 또는 여러 가지의 ncRNA(miRNA를 포함)가 미생물 감염 질환 진단에 대한 특이성, 정확성을 식별 및 평가할 수 있고, 기존의 임상 진단 방법과 비교 대조할 수 있다.

응용

본 발명의 연구는 체내 감염 미생물, 기생 미생물, 공생 미생물이 숙주를 조절하는 신규 수단을 처음으로 제시한다. 분비 경로를 통하여, 상이한 체내 병원체(예를 들면, 체내 감염 미생물, 기생 미생물, 공생 미생물)는 이가 생성한 비코딩 RNA를 숙주세포에 전달하여, 숙주의 단백질의 '도움’을 빌려, 숙주의 면역 시스템에 영향을 줌으로써, 체내 병원체가 숙주 체내에서 생존하는데 이롭다. 따라서, 병원체 특이성의 ncRNA를 간섭 또는 억제하는 것은 미생물 감염을 억제하는 것과 미생물성 질환을 치료하는 새로운 경로이다.

본 발명의 발견에 기반하여, 병원체 특이성의 ncRNA를 검출(또는 진단) 마커로 사용하거나, 또는 치료타겟으로 사용할 수도 있다.

살모넬라균을 예를 들면, 살모넬라균은 세균 자체이 코딩한 비코딩 RNA(ncRNA)를 숙주세포 내에 전송하고, 세포의 microRNA 절단 시스템에 의하여, microRNA와 유사한 milRNA를 생성하며, milRNA를 이용하여 면역 시스템(예를 들면, iNOS)을 제어함으로써, 세균에 의해 이용되고, 이가 숙주에 의하여 제거되는 것을 피면하도록 보호한다. milRNA의 억제제(inhibitor) 를 이용하여 milRNA를 흡착하면, 세균이 세포 내의 생존 능력을 효과적으로 억제하여, 세균 생존 능력의 감소를 초래할 수 있어, 세균 감염의 치료에 적용될 수 있다.

검출시약, 검출칩와 검출키트

본 발명은 본 발명의 검출시약 또는 검출칩을 포함하는, 살모넬라균 또는 살모넬라균 감염을 검출하기 위한 키트를 더 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 살모넬라균 감염 특이성 miRNA의 발현 프로파일(expression profile)을 검출에 사용될 수 있거나, 또는 살모넬라균 또는 살모넬라균 감염의 검출에 사용될 수 있고, 바람직하게는, 상기 키트는, RNA 샘플을 마킹하기 위한 마커; 및 마커와 서로 대응되는 기질을 더 포함한다.

이 밖에, 상기 키트는 RNA의 추출, 중합효소 연쇄 반응 (PCR, polymerase chain reaction), 혼성화, 발색 등에 수요되는 각종 시약을 더 포함할 수 있고, 추출액, 증폭액, 혼성화액, 효소, 대조액, 발색액, 세액, 항체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

이 밖에, 상기 키트에는 사용 설명서 및/또는 칩 이미지 분석 소프트웨어를 더 포함할 수 있다.

칩

일반적으로, microRNA 발현 프로파일 칩은 몇 백개, 몇 천개 또는 더 많은 프로브를 포함하고, 다양한 microRNA를 포함하며, 동질 이중 가닥이 상보적인 원리를 이용하여 샘플에 함유된 각종 microRNA의 함량을 검출한다. 따라서, 동일한 시기에 테스트 샘플 중의 microRNA의 전사 수준을 검출할 수 있다.

본 발명에서 설명한 milRNA 서열을 이용하면, 상응한 milRNA칩을 더 제조할 수 있어, 이의 발현 프로파일 및 milRNAs의 조절 방식을 연구할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 살모넬라균 또는 살모넬라균 감염을 검출할 수 있는, milRNA 발현 프로파을 분석하기 위한 칩을 더 제공한다.

본 발명에서 설명한 milRNA칩은 고상 담체, 및 상기 고상 담체에 순차적으로 고정되는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브는 SEQ ID NO: 1~4로 표시되는 서열에 대한 핵산 서열을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에서 제시한 milRNA에 따르면, 고상 담체에 고정되고, '올리고뉴클레오티드 어레이(array)’를 형성하는 적합한 프로브를 설계할 수 있다. 상기 '올리고뉴클레오티드 어레이’는 어드레싱(addressing)(즉, 차별적이고 액세스 가능한 주소를 트징으로 하는 위치) 가능한 어레이를 구비하고, 매 하나의 어드레싱 가능한 위치에는 모두 이와 관련되는 하나의 특징적 올리고뉴클레오티드를 함유되는 것을 의미한다. 수요에 따라, 올리고뉴클레오티드 어레이를 여러 개의 서브 어레이로 나눌 수 있다.

상기 고상 담체로는 유전자칩 분야의 각종 흔히 사용하는 재료를 사용할 수 있고, 예를 들면, 나일론 필름, 활성기(예를 들면, 알데하이드기, 아미노기 등) 수식을 거친 유리칩 또는 실리콘칩, 수식을 거치지 않은 유리칩, 플라스틱칩 등 일 수 있지만 이에 한정되지 않는다.

본 기술분야의 공지된 바이오칩의 통상적인 제조 방법을 사용하여 상기 milRNA칩을 제조할 수 있다. 예를 들면, 만일 고상 담체로서 사용한 것이 수식 유리칩 또는 실리콘칩이고 프로브의 5'단에는 아미노기 수식의 축dT번들이 함유되면, 올리고뉴클레오타이드 프로브를 용액으로 조제할 수 있고, 그 다음 마이크로배열기(Microarrayer)를 사용하여 이를 수식 유리칩 또는 실리콘칩에 배열하고, 기설정한 서열 또는 어레이로 배열한 후, 하룻밤 방치하여 고정시키면 본 발명의 milRNA칩을 얻을 수 있다.

본 발명에서 설명한 RNA과 milRNA칩 사이의 고상 혼성화는 본 기술분야의 전형적인 방법에 의하여 진행되고, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 경험에 의하여 버퍼, 프로브와 샘플 농도, 전혼성화 온도, 혼성화 온도 및 시간 등과 관련되는 가장 적합한 조건을 쉽게 확정할 수 있다. 또는 <분자클론실험지침서>에서 제시한 내용을 참조할 수도 있다.

그 다음, 마킹 신호가 milRNA칩에 위치한 위치, 강도 등 정보에 의하여 데스트 정보를 획득한다. 증폭산물을 형광단(fluorophore)으로 마킹하면, 형광 검출기기(예를 들면, 레이저 공초점 스캐너Scanarray 3000 등)를 직접 사용하여 테스트 정보를 얻을 수도 있다.

약물 조성물

본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 유효량의 본 발명의 milRNA(예를 들면, sal-1)의 억제제, 차단제 또는 길항제를 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 '유효량' 또는 '유효 조제량'은 사람 및/또는 동물에 대하여 기능 또는 활성을 발생할 수 있고 사람 및/또는 동물에게 허용되는 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, '약학적으로 허용 가능한' 성분은 포유동물에 적용되고 과도한 부작용(예를 들면, 독성, 자극과 변태적 반응)이 없는 것인 바, 즉, 합리적인 효익/위험성을 구비하는 물질이다. 용어 '약학적으로 허용 가능한 담체'는, 각종 부형제와 희석제를 포함하고 치료제 투여에 사용되는 담체를 의미한다.

본 발명의 약물 조성물은 안전 유효량의 본 발명의 활성 성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다. 이러한가지 종류의 담체는 염수, 버퍼, 글루코오스(glucose), 물, 글리세린(glycerin), 에틸알코올(ethyl alcohol) 및 이들의 조합을 포함한다(이에 한정되지 않음). 일반적으로, 약물 제제는 응당 투여 방식과 서로 매칭되어야 하고, 본 발명의 약물 조성물의 제제는 주사제, 경구 제제(정제, 캡슐, 드링크제), 경피제, 지연제이다. 예를 들면, 생리염수 또는 글루코오스와 기타 보조제를 함유하는 수용액으로 통상적인 방법를 통하여 제조한다. 상기 약물 조성물은 무균 조건에서 제조해야 한다.

본 발명에서 제시한 활성 성분의 유효량은 투여의 방식과 치료될 질환의 엄중한 정도 등에 따라 변화될 수 있다. 바람직한 유효량의 선택은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들에 의하여 각종 요소에 따라 확정될 수 있다(예를 들면, 임상 실험을 통함). 상기 요소는, 생체 이용률, 대사, 반감기 등과 같은 상기 활성 성분의 약물동태학 파라미터, 또는 환자의 치료하고자 하는 질환의 엄중한 정도, 환자의 체중, 환자의 면역 상황, 투여 경로 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 활성 성분을 매일 약 0.00001mg~50mg/kg 동물체중(바람직하게는 0.0001mg~10mg/kg 동물 체중)의 조제량으로 투여하면, 만족스러운 효과를 얻을 수 있다. 예를 들면, 치료 상황의 절박한 요구에 의하여, 매일 여러 번으로 나눈 조제량을 투여하거나, 또는 조제량을 비례에 따라 감소할 수 있다.

본 발명에서 제시한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염수, 리포좀, 지질, 단백질, 단백질-항체 복합체, 펩티드 물질, 섬유소, 나노겔 또는 이들의 조합을 포함한다(이에 한정되지는 않음). 담체의 선택은 응당 투여 방식과 서로 매칭되어야 하고, 이러한 내용은 모두 본 발명이 속하는 기술분야의 통삭의 지식을 가진 자들이 숙지하는 것이다.

본 발명은, 살모넬라균 감염을 치료하고, 살모넬라균 감염 증상을 완화시키며, 숙주동물 중의 살모넬라균 수량을 감소하고, 살모넬라균 감염 사망율을 감소하며, 과도한 면역 등을 감소하기 위한 약물을 제조하는데 있어어의 상기 약물 조성물의 용도를 더 제공한다.

본 발명의 주요한 우점은 하기와 같다.

(a) 병원체(예를 들면, 살모넬라균) 감염을 검출하는 간편하고 신속하며 정확한 신규 방법을 제공한다.

(b) 미생물 감염을 억제하고 미생물성 질환을 치료하는 새로운 경로를 제공한다.

이하 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 더 설명한다. 이해해야 할 것은, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위함은 아니다. 하기의 실시예에서 구체적인 조건을 밝히지 않은 실험방법은 일반적으로 통상적인 조건에 따르는 바, 예를 들면, Sambrook 등, 분자클론: 실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 제시한 조건에 따르거나 제조사에서 건의한 조건에 따라 실행한 것이다. 달리 명시하지 않으면, 백분비와 분수는 중량백분비와 중량분수이다.

이하 실시예에서, 체내 병원체 살모넬라균을 연구한 결과에 의하면, 살모넬라균은 숙주에 의하여, 살모넬라균 감염을 효과적으로 검출하고 치료할 수 있는 milRNA(ncRNA)를 생성할 수 있다.

실시예1, 세균 감염세포에서 milRNA의 선별

LB 평판에서 접종 루프로 살모넬라균 균종을 획선 도말(Streak-plate)하고, 중등 크기의 콜로니(colony)를 선별하여 LB 용액 배지에 접종시키며, 37℃에서 하룻밤 배양시킨 다음, 원심 분리하여 LB 배지를 제거하고, RPMI-1640+10%FBS 배지로 균체를 재부유시킨다.

세균을 감염하기 전날에, 세포 용기에 췌장 효소로 소화 완성한 사람의 장 상피 세포인 HT-29 세포를 넣고, 5%의 CO₂ 항온기(incubator)에 놓아두어 37℃에서 배양한다.

MOI(5-10:1) 비율에 따라 세포를 감염시키고, 2시간 동안 감염시킨 후, PBS로 감염되지 않고 세포에 진입한 세균을 세척한 다음, 젠타마이신(gentamycine)을 함유하는 RPMI-1640+10%FBS로 배양하며, 하룻밤 배양한 후, 다시 PBS로 3번 세척하고, 0.1%의 PBST(PBS+Triton X-100)로 세포를 분해하며, 다시 0.22㎛의 필터로 세균을 제거한다. 상기 처리를 거친 후, 세포 내에 진입하지 않은 세균 및 세포 내에 잔존한 세균을 철저히 제거한다.

그 다음, Trizol LS로 용해물(lysate) 중의 전체 RNA를 추출하고, Solexa 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 거친 후, 측정하여 획득한 데어터를 분석하여, 살모넬라균 특이성의 작은 RNA 세그먼트(segment)를 찾아 낸다.

1.1 milRNA의 식별

solexa 시퀀싱에 의하여 획득한 세그먼트를 분석하여, 멀티 카피(multi copy)의 milRNA 세그먼트 서열을 선별해 내고, 이러한 서열에 대하여 정량 PCR 검출 프로브와 northern blot의 검출 프로브를 설계 및 합성한다.

1.2 northern blot 검출

Trizol LS 시약으로 LB를 사용하여 배양한 살모넬라균의 전체 RNA 및 살모넬라균이 세포를 감염한 후의 세포기질(cytosol)의 전체 RNA를 각각 추출하고, 전체 RNA를 1 x RNA loading buffer(Takara)로 재부유시킨 다음, 15%의 TBE-Urea polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)에서 전기영동하며, 전기영동 후, RNA를 나일론 필름에 전사하고, 자외선(UV) 가교를 거친 후, 디곡신(DIG)으로 마킹한 프로브로 혼성화시켜, milRNA의 발현을 분석한다.

1.3 질적인 실시간 PCR 검출

Trizol LS 시약으로 LB를 사용하여 배양한 살모넬라균의 전체 RNA 및 살모넬라균이 세포를 감염한 후의 세포기질의 전체 RNA를 각각 추출한 다음, DEPC 처리된 초순수로 RNA를 용해하고, 먼저 프로브의 다운스트림 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사하며, 다시 합성된 프로브(ABI)로 정량 PCR 증폭하고, 증폭 후 각 샘플 중의 milRNA의 함량을 분석한다.

결과

실험 결과는 도1, 도2와 도3에 도시된 바와 같다.

도1과 도2의 결과에 의하면, northern blot와 qRT-PC 검출을 사용하면, 단지 살모넬라균이 세포를 감염한 후에만 19~30nt의 작은 RNA(본 발명에서, milRNA로 불리움)가 나타나고, 본 발명은 milRNA(sal-1)를 선별하여 전면적이고 깊은 연구를 하였다.

생물학 소프트웨어를 이용하여 milRNA(sal-1)가 살모넬라균의 균 게놈에서의 서열 정황을 분석하였고, 구체적인 결과는 도3을 참조하면 된다. 도3은, milRNA(sal-1)가 위치한 nc-RNA는 pre-sal-1으로 중첩될 수 있는 것을 나타낸다.

살모넬라균(Salmonella)에서 유래되는 일부분의 ncRNA의 서열은 하기와 같다.

Sal-1: UGUGGGCACUCGAAGAUACGGAUU(SEQ ID No.: 1)

Sal-2: AUGCGAGAGUAGGGAACUGCCAGGCAU(SEQ ID No.: 2)

Sal-3: UCCUCUGUAGUUCAGUCGGUAGAACGGC(SEQ ID No.: 3)

Sal-4: GAAGGUGGCGGAAUUGGUAGACG(SEQ ID No.: 4)

Sal-5: GCCCGGAUGGUGGAAUCGGUA(SEQ ID No.: 5)

Pre-sal-1의 서열은 하기와 같다.

5'-TGTGGGCACTCGAAGATACGGATTCTTAACGTCCTAGGACGAAAAATGAATACCAAGTCTCAAGAGTGAACACG-3'(SEQ ID No.: 6)

실시예2

milRNA에 대한 억제제(inhibitor)는 세균이 숙주를 감염하는 능력을 제어할 수 있다.

2.1 체외 실험

본 실험에서, 식별해 낸 살모넬라균 특이성의 sal-1에 대하여, 이와 타겟 유전자 inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 관련성을 연구한다.

PCR로 milRNA과 결합할 수 있는 타겟 부위 영역을 증폭해 내고, Spe I+Hind III 더블 다이제스트 반응(Double Digests)를 거친 후, pMIR-REPORT luciferase담체(상하이 잉에이씬 과학기술유한회사로부터 구매)에 삽입하여, 재조합 플라스미드(iNOS)를 구축해 낸다. 또한 구축 완성한 상기 재조합 플라스미드의 milRNA 결합 부위(binding sites)를 돌연변이시켜, 재조합 돌연변이 플라스미드(iNOS mut)를 구축해 낸다.

동시에, CMV를 프로모터로 사용하는 발현 담체에 milRNA의 전구체를 넣어 과발현 milRNA의 담체(pre-sal-1)를 구축해 낸다.

milRNA 대조 플라스미드 또는 pre-sal-1과 iNOS 또는 iNOS mut를 HEK-293T 세포에 동시전이(cotransfection)시켜, 리보터 유전자 검출을 진행하고, 동시에 β-gal 플라스미드로 대조한다.

구체적인 결과는 도4에 도시된 바와 같다. 도4의 Luciferase 결과에 의하면, sal-1은 iNOS의 두 개의 타겟 부위를 모두 제어할 수 있어, iNOS를 감소한다.

2.2 Western blot

야생형의 iNOS 유전자 전체 길이를 진핵 발현 플라스미드에 클론해 넣어, 재조합 발현 iNOS 플라스미드(iNOS WT)를 구축하여 iNOS 발현을 진행하고, 동시에 milRNA 결합 부위를 돌연변이(단지 염기 서열을 개변시키고 아미노산 서열을 개변시키지 않는 세임센스 돌연변이(samesense mutation))시켜, 발현 iNOS 플라스미드(iNOS MUT)를 구축해 내서 돌연변이 iNOS의 발현을 진행한다. pre-sal-1를 각각 iNOS WT 및 iNOS MUT와 함께 마우스 RAW264.7세포(상기 세포는 자극을 받지 않고 iNOS를 발현하지 않음)에 각각 동시전이시킨 후 발현시켜 milRNA가 iNOS에 대한 제어 능력을 검출한다.

구체적인 결과는 도5에 도시된 바와 같다. 도5의 결과에 의하면, RAW264.7 세포에 iNOS 전체 길이를 전이한 발현 플라스미드인 sal-1도 마찬가지로 iNOS의 발현(감소)을 성공적으로 제어할 수 있다.

2. 3 세포감염 실험

살모넬라균에 감염되기 전날에, 24웰판에 HT-29 세포를 넣고, 다음날 anti-sal-1를 lipofectin 2000로 전사하고, anti-sal-1가 전이된 24h 후, MOI(5~10:1)로 살모넬라균을 감염시키며, 대조군은 임의의 서열을 사용하고, 감염된 24h 후 세포 내 세균의 생존 능력을 검출한다.

각 안티센스 핵산의 서열은 하기와 같다(5' 내지 3').

anti-sal-1: AAUCCGUAUCUUCGAGUGCCCACA(SEQ ID NO.:7)

anti-sal-2: AUGCCUGGCAGUUCCCUACUCUCGCAU(SEQ ID NO.: 8)

anti-sal-3: GCCGUUCUACCGACUGAACUACAGAGGA(SEQ ID NO.: 9)

anti-sal-4: CGUCUACCAAUUCCGCCACCUUC(SEQ ID NO.: 10)

anti-sal-5: UACCGAUUCCACCAUCCGGGC(SEQ ID NO.: 11)

구체적인 결과는 도6을 참조하면 된다. 도6은, 사람의 장 상피 세포(HT-29)를 감염 모형으로 할 경우, 살모넬라균 감염된 HT-29세포에 sal-1의 억제제(anti-sal-1)를 전이시키고, 다시 iNOS의 발현과 활성 검출을 분석하며, 살모넬라균이 세포 내에서의 생존율을 검출 및 분석한 것을 표시한다. 살모넬라균이 sal-1에 대한 억제제를 감염한 후, iNOS의 발현량은 약 2.8배(도6A)로 더 상승되고, iNOS의 활성도 약 2.3배(도6B)로 상응하게 상승된다. sal-1의 발현 수준은 약 90%(도6C)로 감소되고, 살모넬라균 감염후, 세포 내의 수량도 따라서 45%(도6D)로 감소된다.

2. 4 체내 실험

milRNA를 과발현시킬 수 있는 슬로바이러스를 패키징해 내도록, 다이제스트 반응을 거친 후의 pre-sal-1 서열을 통상적인 lentivirus 담체에 삽입한다.

milRNA와 상보적으로 결합되는 서열을 유전자 공학 수단으로 milRNA과 결합 가능한 해면체(3번 중복되는 상보적인 세그먼트를 포함)를 구축해 낸 다음, milRNA를 흡착할 수 있는 슬로바이러스를 패키징해 내도록, lentivirus 담체에 milRNA의 해면체도 삽입한다.

또한, 마우스 체내에서도 iNOS를 발현할 수 있으므로, milRNA가 iNOS에 대한 조절 기능을 검증하기 위하여, 본 발명자는 mouse iNOS의 milRNA의 결합 부위가 모두 돌연변이하는 발현 플라스미드를 구축해 낸 다음, 이러한 플라스미드도 다이제스트 반응을 거친 후 lentivirus담체에 삽입하여 mouse iNOS를 과발현시킬 수 있는 슬로바이러스를 패키징해 내도록 한다,.

6~8 주령의 BALA/C 마우스를 실험 대상으로 하여, milRNA의 증가 또는 감소 발현이 iNOS 발현에 대한 영향 및 마우스 침습 능력에 대한 비교를 분석한다. 6~8 주의 자성 BALB/C를 감염 모형로 하고, 재조합 슬로바이러스로 milRNA(sal-1)가 과발현된 슬로바이러스, iNOS가 과발현(마우스 iNOS의 sal-1 결합 부위는 아미노산을 거쳐 sal-1 비결합 또는 저결합 능력으로 세임센스 돌연변이됨)된 슬로바이러스 및 특이성 흡수 milRNA(sal-1) 해면체의 슬로바이러스를 각각 패키징해 낸다. 실험은 mock, 살모넬라균(SE2472), lenti-NTC+SE2472, lenti-sal-1+SE2472, lenti-sal-1 sponge+SE2472, lenti-NTC+ iNOS MUT SE2472, lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472, lenti- sal-1 sponge+iNOS MUT SE2472 등 8군으로 나우어진다.

구체적인 결과는 도 7을 참조하면 된다. 도 7은 마우스 모형에서 sal-1 중의 발현량을 나타낸다.

도 7A의 결과에 의하면, 살모넬라균 SE2472이 마우스를 감염한 후, sal-1의 발현량은 상승되고, lenti-sal-1+SE2472 군에서 sal-1의 발현량은 더 상승되며, lenti-sal-1 sponge+SE2472 군의 sal-1발현 수준은 sal-1 sponge(sal-1에 대한 억제제)의 흡착에 인하여 감소된다. 마우스 iNOS의 sal-1의 결합 부위를 세임센스 돌연변이시킨 후에 슬로바이러스로 패키징하고, 다시 마우스를 감염시킨 후, sal-1은 조금 감소되며(돌연변이된 iNOS의 발현은 세균이 마우스 체내에서 생존하는 능력에 영향을 주어, 수량이 조금 감소됨), lenti-sal-1+iNOS MUT SE2472 군의 sal-1의 발현량은 어느 정도의 회복 발현을 얻을 수 있고, lenti- sal-1 sponge+iNOS MUT SE2472에서 sal-1의 발현량은 더 감소된다.

도 7B는 상기 8군의 마우스가 SE2472에 감염될 때의 임상 증상의 개변을 표시하고, 이러한 변화는 앞서 설명한 sal-1의 변화에 인하여 세균 감염 증상의 개변에 부합된다.

도 7C과 도 7D는 iNOS가 이러한 8군 중의 발현량의 변화를 표시하고, 살모넬라균 SE2472 감염에서, iNOS의 발현은 비록 상승하였지만, 차이가 현저하지 않고, 단지 sal-1 sponge를 사용할 때에만 iNOS의 발현이 회복 발현을 현저하게 얻을 수 있으며, 이것은 sal-1이 iNOS의 발현을 제어하는 것을 명확히 표명하고, iNOS가 세임센스 돌연변이를 거친 후, iNOS의 발현이 더 상승되며 sal-1의 제어를 받지 않는 것을 알 수 있는 바, 결과에 의하면, sal-1은 iNOS의 발현을 확실히 제어할 수 있다.

도 7E는 이러한 8군에서 마우스 대장조직 중의(장 공동에서 이미 제거) 세균함량을 검출한 것을 표시한다. sal-1의 증가 발현은 세균이 장 조직에서의 감염 능력을 촉진할 수 있고, sal-1이 sponge에 의하여 흡착 제거된 후, 세균 감염 능력은 감소된다. iNOS 세임센스 돌연변이 군에서, sal-1은 제어 작용을 발휘하지 않는데, 이러한 결과들은, sal-1이 iNOS를 제어하고, iNOS를 통하여 세균이 숙주 체내에서의 감염과 생존 능력에 영향을 주는 것을 모두 표명한다.

본 발명의 실시예의 결과는, 살모넬라균은 자체가 코딩한 비코딩 RNA(ncRNA)를 숙주세포 내에 전달하고, 세포의 microRNA 절단 시스템에 의하여 microRNA과 유사한 milRNA를 생성하며, milRNA 제어 면역 시스템(예를 들면, iNOS)을 응용함으로써, 살모넬라균을 보호하여 숙주에 의하여 제거되는 것으로부터 방지되는 것을 표명한다. 본 발명은 milRNA의 inhibitor를 이용하여 milRNA를 흡착하면, 세균이 세포 내에서의 생존 능력을 효과적으로 억제하여, 세균의 생존 능력을 감소시킬 수 있으므로, 세균 감염의 치료에 적용될 수 있다.

실시예3

살모넬라균 milRNA의 응용

본 발명에서 설명한 milRNA의 용도는, (a), 살모넬라균 감염을 검출하는 시약, 검출칩 또는 키트를 제조하거나, 또는 (b), iNOS의 발현 또는 활성을 제어하는 조절제를 제조하는 것이다.

여기서, 살모넬라균 감염을 검출하는 핵산칩은, 고상 담체; 및 본 발명에서 설명한 milRNA를 특이적으로 포획하고, 상기 고상 담체에 순차적으로 고정되는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함한다.

본 발명의 살모넬라균 감염을 검출하는 상기 핵산칩은 혈청에서 안정하게 변화하는 milRNA 프로브를 높은 처리율적으로 선별할 수 있고, 동시에 혈청에서 milRNA의 전체 변화를 통하여 질환을 예측과 진단한다. 발명자는 우선 시퀀싱의 방법 또는 정량 PCR 방법을 통하여 혈청에서 한개 이상의 카피를 구비하는 milRNA를 확정한 다음, 이러한 milRNA의 역방향 상보적 프로브를 합성시키고, 다시 이러한 프로브를 칩마이크로배열기 SmartArrayTM로 75X5mm이며 화학적 수식을 거친 검경판(object plate)에 배열한다. 칩에 배열된 샘플은 내부표준인 U6, tRNA, 인공 제조되는 30개의 염기 길이의 외부 표준, 양성 대조 Hex 등을 더 포함한다. 전체 도트(dot) 어레이는 4 개의 서브 에레이로 구분되고, 매 하나의 서브 어레이에는 23개의 행, 21개의 열을 구비하고, 도트 간격은 185㎛이며, 도트의 직경은 약 130㎛이고, 매 하나의 프로브는 3번 반복된다.

칩 조작 프로세스는 하기와 같다. (1), 혈청/혈장 중의 전체 RNA를 추출하고, 포름알데히드 변성겔 전기 영동으로 전체 RNA의 질량을 검출한다. (2), milRNA의 분리: 50~100의 전체 RNA를 추출하여 Ambion's miRNA Isolation Kit(Cat #. 1560)으로 milRNA를 분리한다. (3), milRNA 샘플의 형광 마킹: T4 RNA 연결 효소(ligase) 마킹 방법을 이용하여 형광 마킹한 다음, 다시 무수 에틸에탄올로 침전시키고, 건조 후 칩 혼성화에 사용한다. (4), 혼성화와 세척: RNA를 16㎕의 혼성화액(15%의 포름아미드, 0.2%의 SDS, 3 X SSC, 50 X enhardt's solution)에 용해시키고, 42℃에서 하룻밤 혼성화시킨다. 혼성화가 완료된 후, 우선 42℃ 좌우에서 0.2%의 SDS, 2 X SSC의 액체에서 4분 동안 세척한 다음, 실온에서 0.2 X SSC 용체에서 4분 동안 세척하고, 유리칩을 건조시키면 스캔에 바로 사용할 수 있다. (5), 칩 스캔: LuxScan 10K/A 듀얼 레이저 스캐너로 칩을 스캔한다. (6), 데어터 추출 및 분석: LuxScan3. 0 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 칩 이미지를 분석하고, 이미지 신호를 디지털 신호로 전화시키며, 마지막으로 SAM로 선별한 차등 발현 유전자를 분석한다.

정량 PCR 기술과 바이오칩 기술로 이중 검증한, 살모넬라균 감염 및 정상적인 생리 상태에서 차등 발현 수준이 큰 한가지 종류의 혈청/혈장 milRNA 프로브를 바이오칩 제조에 적용하고, 방법은 상기와 같다. 상기 칩과 기존의 칩을 비교하면, 제조 공정과 조작 흐름에는 큰 개선이 없지만, 상기 칩은 프로브 라이브러리를 간소화하였고, 이로써, 칩의 제조 원가와 생산 시간을 크게 감소하여, 제조에 용이하다. 동시에 칩의 표적성과 실용성도 향상시켰다. 상기 칩을 실천에 투입하면, 단지 환자의 혈청/혈장만 필요하고, 기타 어떠한 조직 없이도 질환을 초기에 발견할 수 있어, 진단과 치료의 지도에 도움을 준다.

이 밖에, 본 발명에서 설명한 핵산칩의 용도는 살모넬라균 감염을 검출하는 키트를 제조하는데 사용된다. 살모넬라균 감염을 검출하는 키트는 본 발명에서 설명한 핵산칩 또는 본 발명에서 설명한 milRNA를 함유한다.

살모넬라균 감염의 진단, 치료 평가 및 약물활성 성분의 선별, 효능 평가에 사용되는 milRNA 키트의 제조 공정과 조작 프로세서는 정량과 반정량 PCR 기술과 바이오칩 기술에 기반한다.

우선, 시퀀싱하는 방법 또는 PCR 방법을 통하여 정상적인 혈청/혈장에 하나 이상의 카피를 함유하는 milRNA를 확정한다. 그 다음, 정량 PCR 기술과 바이오칩 기술을 통하여 질환 및 정상적인 생리 상태에서 발현량과 차등 수준이 큰 한가지 종류의 혈청/혈장 milRNA를 선별하여, 살모넬라균 감염의 발생 여부를 예측 및 병변 수준을 진단하는 지표로 사용한다. 마지막으로, 대응되는 혈청/혈장 milRNA의 수량을 선별해 냄으로써, 이것은, 칩 프로브 라이브러리의 기초상에서 만들어진 최적화된 간소화된 것이다. 상기 키트는 혈청/혈장 milRNA 프라이머, Taq 효소, dNTP 등 시약을 포함한다. 상기 키트의 가치는, 혈청/혈장만 필요하고 기타 조직 샘플이 필요하지 않고, 가장 간소화된 프로브 라이브러리를 통하여 milRNA의 변화 추세를 검출하며, 다시 상기 변화 추세를 통하여 살모넬라균 감염이 발생되는 가능성을 예측 또는 살모넬라균 감염의 병리적 단계를 진단하는 것이다. 따라서, 상기 키트를 실전에 추입하면, 초기에 살모넬라균 감염을 발견하는 가능성을 향상시킬 수 있어 진단과 치료의 지도에 도움을 준다.

본 발명에서 언급한 모든 문헌은 모두 본 출원에 참고로 인용되고, 매 한편의 문헌이 참고로 단독으로 인용되는 것과 같다. 이 밖에, 본 발명의 상기 설명 내용을 열독한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 대하여 여러가지 변경 또는 보정을 진행할 수 있고, 이러한 등가 형식은 모두 본 출원에 첨부된 특허청구범위에서 한정된 범위에 속하는 것으로 이해해야 된다.

<110> Jiangsu Micromedmark Biotech Co, Ltd. <120> Non-Coding RNA of Salmonella and Identification and Use Thereof <130> P2014-1567 <150> CN 201310665565.7 <151> 2013-12-09 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> RNA <213> Salmonella sp. <400> 1 ugugggcacu cgaagauacg gauu 24 <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Salmonella sp. <400> 2 augcgagagu agggaacugc caggcau 27 <210> 3 <211> 28 <212> RNA <213> Salmonella sp. <400> 3 uccucuguag uucagucggu agaacggc 28 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Salmonella sp. <400> 4 gaagguggcg gaauugguag acg 23 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Salmonella sp. <400> 5 gcccggaugg uggaaucggu a 21 <210> 6 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 tgtgggcact cgaagatacg gattcttaac gtcctaggac gaaaaatgaa taccaagtct 60 caagagtgaa cacg 74 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 aauccguauc uucgagugcc caca 24 <210> 8 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 augccuggca guucccuacu cucgcau 27 <210> 9 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 gccguucuac cgacugaacu acagagga 28 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 cgucuaccaa uuccgccacc uuc 23 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 uaccgauucc accauccggg c 21

Claims

(i) SEQ ID NO:1~5 중의 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 milRNA; 및
(ii) (i)중의 상기 milRNA의 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열과 상보적인 milRNA로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 milRNA(microRNA-like).
제1항에 있어서,
상기 milRNA는 살모넬라균(Salmonella)에서 유래되는 것을 특징으로 하는 분리된 milRNA.
동물 세포 내에서 절단되어 제1항에 따른 milRNA로 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 분리되거나 또는 인위적으로 구축되는 전구체 milRNA.
동물 세포에 의하여, 전구체 milRNA로 전사(Transcription)될 수 있되, 상기 전구체 milRNA가 인간 세포 내에서 절단되어 제1항에 따른 milRNA로 발현될 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide).
제1항에 따른 milRNA 또는 제4항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
(a), 살모넬라균 감염을 검출하는 시약, 검출칩 또는 키트(kit)를 제조하거나, 또는
(b), 유도형NO생성효소(iNOS, inducible NO synthase)의 발현 또는 활성을 제어하는 조절제를 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 milRNA의 용도.
고상 담체; 및
제1항에 따른 milRNA를 특이적으로 포획하고, 상기 고상 담체에 순차적으로 고정되는 올리고뉴클레오타이드 프로브(oligonucleotide probe)를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산칩（Nucleic Acid Chip).
제7항에 따른 핵산칩 또는 제1항에 따른 milRNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 따른 milRNA를 특이적으로 억제 또는 차단하는 것을 특징으로 하는 억제제.
(a), 살모넬라균 감염을 치료하는 약물을 제조하거나, 또는
(b), iNOS의 발현 또는 활성을 증가하는 약물을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 제11항에 따른 milRNA의 억제제의 용도.
약학적으로 허용 가능한 담체와 제1항에 따른 milRNA를 특이적으로 제어 또는 차단하는 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
실험군과 대조군을 제공하고, 상기 실험군에서 후보물질을 실험군의 세포 또는 동물에 투여하여, 투여된 후의 상기 실험군 중의 sal-1의 발현 수준을 측정하며, 상기 대조군에 실험군과 동일한 조건을 사용하지만, 후보물질을 대조군의 세포 또는 동물에 투여하지 않는 단계(a); 및
실험군의 sal-1과 대조군의 sal-1의 발현 수준을 비교하는 단계(b)를 포함하고,
실험군의 sal-1의 발현 수준이 대조군의 sal-1의 발현 수준보다 현저히 낮을 경우, 상기 후보물질이 살모넬라균 감염을 치료하기 위한 후보약물임을 의미하는 것을 특징으로 하는 살모넬라균 감염을 치료하는 후보약물의 선별방법.