JPH05503838A - リボザイム組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 リボザイム組成物および使用方法 発明の背景 本発明は、核酸配列、特にＲＮＡ配列の遺伝子工学、およびこれに使用するため の組成物および診断方法の一般的な領域に関する。

過去５年間にわたる分子生物学の基礎領域における発見により、ＲＮＡが、以前 には思いも寄らなかった一連の顕著な能力および生物学的活性を有していること が認識されるようになった。これらの新しいＲＮＡレベルの発見の中で最も重要 なことは、ＲＮＡが情報キャリアであると共に酵素であり得るという発見であっ た。

１９８２年以来、ＲＮＡベースの病原性因子に起因する予期しない病気がいくつ か現れた。これらには、致死性の後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）および、ウィロ イド様ＲＮＡ物質に起因するとりわけ悪性の敷底肝炎であるδ型肝炎が含まれる 。これらの血液媒介性の病気はＲＮＡレベルで蔓延して、患者の細胞内で発現し 、現在までに数百万の個体の血流内に存在するにいたっている。

従来の生物工学は、組換えＤＮＡ法およびＤＮＡレベルの介入スキームに依存し ているため、これらの病気と闘うための有効な取り組みはあまり進められていな い。

Ｔｈｏｍａｓ　Ｒ，ＣｅｃｈによりＪＡＭＡ　２６ｏ（２０＞、３０３０−３０ ３４　（１９８８年１１月）に示されるように、ＲＮＡ分子のあるものは、それ ら自身の開裂すなわちスプライシングを媒介し得、または酵素として働いて基質 ＲＮＡ分子の反応を促進させ得、従って細胞生物化学を導く上で積極的な役割を 果たし得る。これらの発見により示唆されることは、小核のリボ核タンパク質の 、リポソームの、および様々なリポ核タンパク質酵素のＲＮＡ成分を含む、他の 細胞ＲＮＡが触媒であるという可能性である。これらの活性はＲＮＡプロセッシ ングを理解する上で重要な貢献をなすものとして現れつつある。１９７７年に初 めて示されたｍＲＮＡのイントロンおよびエキソンのスプライシングは、ＲＮＡ プロセッシング分野の主要な部分である。ＲＮＡのスプライシングが最初に示さ れた後１０年の間に、イントロンの４つの主要なカテゴリーが、各々それ自身の ＲＮＡスプライシングのメカニズムと共に発見された。他の多くの生物学的反応 と同様、ＲＮＡのスプライシングには反応速度を速めてスプライス部位が正確に 選択されることを確実にする触媒が必要である。現時点で示されている少なくと も４つのシステムにおいては、ＲＮＡ触媒、つまりリボザイムがＲＮＡ開裂およ びスジ５４フフフ反応に関係しているように見える。リボザイムは、酵素活性を 有する、つまり他の分子に酵素として作用するか、または自己スプライシングま たは自己開裂などの反応において分子内触媒作用を行う、ＲＮＡ分子の特異的な ドメインとして定義される。

リボザイムはインビトロでの配列特異的ＲＮＡ開裂因子として使用され得、ＲＮ Ａの生物化学的研究にとって有用な道具を提供する。繊毛虫原生動物である好熱 性テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のｒＲＮ Ａ前駆体の研究において、Ｃｅｃｈは、スライ／ングはイントロン自体の折り畳 まれた構造により触媒されることを発見した。自己スプライシングの観察は、後 に関連するグループＩイントロンおよび構造の異なるグループ１１イントロンへ と進展した。場合によっては、ＦＩＮＡにより触媒される反応はまたタンパク質 にも関係する。グループＩイントロンのスプライシングは、ホスホジエステル結 合のすべてを変化させないリン酸エステルの交換である、トランスエステル反応 を２度行うことで実行される。最初のトランスエステル反応の段階では、グアノ シンがイントロンの５゛末端に付加されるとき、５°スプライス部位が開裂され る。第２段階では、エキソンが結合されるとき３゛スプライス位が開裂される。

これらの反応の触媒を助けるために、イントロンは外因性グアノシンの、および それ自体のスプライス部位近くのヌクレオチドの結合部位を提供する。さらに、 イントロンは、反応を促進する活性部位を提供する。

Ｍｉｃｈｅｌら、ＥＭＢＯＪ、　２．３３−３３−３８（１９にて示された、真 菌類のミトコンドリアに発見された構造的に異なるグループのイントロン、すな わちグループ１１イントロン、ちまた自己スライ／ングを行う。グループ１イン トロンと同様、スプライシングは、最初は５°スプライス部位に関し、第２は３ ゛スプライス位に関する２つのトランスエステル反応を通して行われる。

グループＩイントロンのメカニズムに対して、ｆｉｌ）ランスエステルのための 攻撃する基（求核分子）はイン）・ロン内に位置するアデノシンの２“ヒドロキ シル基である。トランスエステル反応の産物はラリアットと呼ばれる分枝ＲＮＡ である。研究されたすべての真核生物における核ｍＲＮＡイントロンは、グルー プ１１イントロンと同じ方法でスプライシングを行うように見える。

酵素とは、化学反応速度を大幅に加速させ、その基質に対するおよびその促進す る反応のタイプに対する特異性が極めて高い分子であり、各反応において消費さ れることがないため、１つの酵素分子は数多くの基質分子と相互作用し得る分子 として定義され得る。グループ１およびグループ１１イントロンに存在するタイ プの自己スプライシングＲＮＡは、反応により変化するため本当の酵素ではない 。しかし、ＣｅｃｈらによりＰＣＴ／ＵＳ８７１０３１６１にて開示されている ように、ヌクレオチドのいくつかの欠損あるいは置換を利用して、自己スプライ シングのグループ１イントロンを、４個のヌクレオチドの配列に対して特異性を 葡する酵素に転換し得る。テトラヒメナｒＲＮＡのイントロンの最初の１９個の ヌクレオチドを欠損すると、Ｌ−１９介在配列ＲＮＡと呼ばれる形態が生成され る。この分子はもはや分子内反応のための部位を含まず、プロセスにおいてツレ 自体最終的には変化せずに、他の基質のＲＮＡでの反応を媒介し得る。

このＲＮＡ酵素に対して示された最初の活性は、Ｚａｕｇら、鈷」狙ｃｅ　２３ １．４７０−４７５（１９８６）にて報告されたように、ＲＮＡの短鎖をより長 い鎖に組み立てること、すなわち、ＲＮＡポリマー化活性であった。

テトラヒメナの介在配列由来のＲＮＡ酵素の簗２の活性は、Ｚａｕｇら、Ｎａｔ ｕｒｅ　３２４．４２９−４３３（１，９８５）にて示された、配列特異的エン ドリボヌクレアーゼの活性である。このＲＮＡ酵素は、既知のいかなるタンパク 質リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）よりはるかに高い配列特異性を有する１本鎖 の他のＲＮＡ分子を開裂し得る。開裂部位の前のヌクレオチドの配列により識別 が行われ、開裂はグアノシンの付加により実行される。酵素活性部位（配列５− ＧＧＡＧＧＧ−３”）の部位特異的変異誘発は予測し得る方法で開裂特異性を変 えるため、切断により様々な配列が形成されるようなエンドリボヌクレアーゼを 合成することが可能であった。

ＲＮＡ触媒作用の他の２つの主要なカテゴリーが調査された。

第１は、ｔＲＮＡ前駆体において特異的な開裂を行うリボ核タンパク質酵素であ るＲ＋ＪアーゼＰの、いくつかの異なる生物からの例を含み、第２は、植物およ び動物に感染する様々の自己複製ＲＮＡ、すなわちウィロイド様病原体（すなわ ちＶＬＰ）を含む。

Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ、　Ｃｅ１ｌ　３５．８４９−８５７（１９８ ３）にて報告されたように、ＲＮＮアーゼに関連する反応は、グループＩおよび グループ１［イントロンにより触媒されるものと類似しており、攻撃するものが リボースのヒドロキシル基ではな（水である点で異なる。

Ｐｒｏｄｙら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１．１５７７−１５８０（１９８６）、 およびＨｕｔｃｈｉｎＳら、　Ｎｕｃ！ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４． ３６２７−３６４０＜１９８６）にて示されたように、（自らが感染性の小環状 ＲＮＡの）１つのウィロイド、および（ある種の植物ＲＮＡウィルスのコートタ ンパク質により被包される各々環状および直鎖状のＲＮＡである）いくつかのウ イルソイドおよびサテライトＲＮＡを含む、植物に感染するＶＬＰ１？ＮＡのい くつかは、インどトロで効率的に部位特異的自己開裂を行う。これらのＲＮＡは 「ハンマーヘッド」と呼ばれる、僅か約３０個のヌクレオチドよりなる、１つの 小さな構造ドメインからなる。感染の間、ローリングサークル複製により生成さ れる直鎖状のＲＮＡマルチマーがユニットサイズの子孫へ転換するのは自己開裂 によるものであると考えられている。上流側開裂産物の３′末端に環状のホスフ ェートを残す開裂の要件は、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２８．５ ９６−６００（１９ｇ？＞、およびＦｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅ１１５０．９−１６ （１９８７）に示されている。

小さな環状の、部分的に二本鎖ＤＮＡゲノムを有するＢ型肝炎ウィルスは、ヒト にウィルス性肝炎および肝細胞性感を引き起こす。小さな環状ＲＮＡを含むδ型 肝炎ウィルスは、Ｂ型肝炎ウィルスのサテライトウィルスである。Ｂ型肝炎つィ スルとδ型肝炎ウィルスのキャリアの重複感染は敷底肝炎を引き起こし、これは 多くは致死性である。δ型肝炎ウィルスＲＮＡは環状であり、Ｗａｎｇら、Ｎａ ｔｕｒｅ　３２３．５０８−５１４（１９８５ン、およびＣｈａｍら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　８３．８７７４−８７７８ （１９８６）にて示されるように、植物に感染するウィロイドおよびウィルソイ ドの構造に類似した、分子内塩基ベアリングを特徴とする構造を有する。Ｓｈａ ｒｍｅｅｎらはｊｖｌｒｏ１６２．２６７４−２５７９（１９８８）にて、δ型 肝炎ウィルスＲＮＡはインビトロにおいて一種の自己開裂を行い得ると述べた。

この開裂産物は２°、３−環状ホスフェートおよび５−ヒドロキシル末端を有す る。自己開裂の原因となる配列と構造は明確にされなかったが、ウィルソイドに 見いだされたハンマーへノドの形状とは異なるという予測が述べられた。

関連する発見として、Ｂｒａｎｃｈらは５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．６４９−６５ ２　（１９８９年２月３日）にて、）ＩＤＶ　ＲＩＪＡの高度に保存されたドメ イン内に存在し、以前植物ウィロイドゲノムの中央の保存領域にマ・ノブされた 局部３次構造に関連し得る、）ＩＤＶゲノムＲＮＡに新しい構造要素が存在する ことを示した。また、この構造要素がδＲＮＡの自己開裂部位に極めて近接して いることも示した。同時に、ＷＩＪおよびＬａｉは５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．　 ６５２−６５５　（１９８９年２月３日）にて、δ型肝炎つィルスＲ）ＪＡの１ ４８個のヌクレオチドのサブフラグメントは可逆的に開裂および結合を行うこと を報告した。

反応の方向は、ｙ　ｇ　２１オンの有無により決定され、開裂反応はＪ２°が存 在するとき有利となる。結合には、関連する［ＩＮＡ分子の特定の配座が必要で あり、水素結合により一体に保持される２つの開裂されたＲＮＡフラグメントの 間てのみ起こる。結合はＥＤＴＡにより！１１ｇ２９が除去されると起こる。１ ９８９年３月、ＷｕらはＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ　へｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６ ．　１８３１−１１１３５にて、開裂は、１３３＠のヌクレオチド程の短さの、 δ型肝炎ウィルス１．７ｋｂゲノムのサブフラグメントにより、５．０から９１ のｐＨで、ハンマーへノドによる開裂で要求されるものよりはるかに低い濃度で ある、少なくとも５００μＭのＭ　ｇ　２“またはＣａ２ゝの存在下で実行され 得、末端ウソジンの２°、３°−環状のモノホスフェート残基を有する５゛フラ グメント、および５−ヒドロキシル基を持つグアノシン残基を宵する３゛フラグ メントを生成すると報告した。

該文献には、リボザイムは試薬としてまたは治療剤として有用性を持ち得るとい う多くの示唆があったが、この目的達成のためにはまだほとんどのことがなされ ていない。テトラヒメナの配列は、後に酵母に発見された配列と同様に、プロセ スにおいて再生産されず、化学量論的な比率において作用するものであるため、 本当の酵素ではない。酵素的活性を有し、またｌ？ＮＡを開裂および結合し得る この配列のフラグメントを工学的に処理することは可能であるが、これらフラグ メントの欠点は、これらが非常に大きく　（もともとの４１５ヌクレオチド配列 の内２００以上の残基が必要）、また特異性が制限されるということである。ｔ ＲＮＡ前駆体の５゛末端から余分のＲＮＡ配列を開裂して成熟ｔＲＮＡ分子を創 成するＥ、　ｃｏＩｉ　ＲＮＮアーゼ（ＭＩＲＮＡ）のＲＮＡサブユニットは、 その基質認識領域が２０ヌクレオチド以下であるように工学的に処理され得ると いうことが示唆されている。

ウィロイド様病原体、すなわちＶＬＰは次の２つのクラスに分割され得る。すな わち、遊離の生きているウィロイドのクラス１１　およびウィルソイドとサテラ イトウィロイド（ヘルパーウィルスに復製を要求するＲＮＡ分子）を含むクラス ＩＩである。

δ型肝炎ウィルスはこの定義によればクラスＩＩ　ＶＬＰである。

ＶＬＰは２つのタイプのりボザイムを有する。最初のタイプ、「ハンマーへノド 」は、Ｃ５ＩＲＯ，Ｃａｎｂｅｒｒａ、Ａｕ５ｔｒａｌｉａのＨａｓｅｌ。

ｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈが商業用として現在開発中である。Ｕｈ　１ｅｎｂｅ ｃｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）は、アボカドの日照斑点（５ｕｎｂｌｏｔ ｃｈ）のウィロイド、およびたばこの輪紋病ウィルスおよびアルファルファの一 過性ストリークウィルス（ｓｔｒｅａｋ　ｖｉｒｕｓ）のサテライトＲＮＡなど の植物ウィロイドからの、これらの小さな（１８ヌクレオチドまで減少）比較的 特異的なりポザイム配列を最初に開発した。現在の形態においては、テトラヒメ ナリボザイムは４塩基の２２配列を有し、ハンマーへッドリボザイムは約１２塩 基の認識配列を有する。４塩基の配列は、典型的なａ＋ＲＮＡサイズのＲＮＡに 平均して数回現れ、これに対し、１２塩基配列では、ＲＩＩＡを開裂するために これらのりポザイムが相補的に使用され得る。

知られる限り、これらリポザイムのいずれも、現在のところ、幾分制限された特 異性でＩＩＮＡを開裂およびスプライシングするための実験室用試薬としてより 他には使用されていない。

サイズの制限に加えて、リボザイムの特異性が比較的広いために、ＲＮＡのみを 標的として開裂すること、特に宿主ＲＮＡに損傷を与えずに開裂することが困難 である。δ型肝炎ウィルス以外の非植物ウィロイドで明確に特徴付けされている ものはない。従って、δリボザイムを含む、リボザイムのすべてのクラスをまと めるキーとなる知識、すなわち、メカニズムの理解が可能となる詳細な１次、２ 次、および３次構造についての知識は未だ達成されていない。

従って、標的のＲＮＡ配列を特異的に開裂する方法および組成物を提供すること が、本発明の目的である。

ＡＩＤＳなどのＲＮＡ発現に関連する病状の治療のために、インビトロおよびイ ンビボにおいて、ＲＮＡを特異的に開裂する方法および組成物を提供することが 本発明の別の目的である。

また、δ型肝炎を引き起こすウィロイド様物質、およびクローン病の原因となる 物質を含む他のウィロイド様物質を検出し治療する方法および組成物を提供する ことも本発明の目的である。

δ型肝炎ウィロイドに基づ（組織特異的発現ベクターおよびワクチンを構築する 方法および組成物を提供することが本発明のさらに別の目的である。

発明の要旨 ＲＮＡを開裂するりボザイムはδ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）　ＲＮＡ１ｉ：存在 する特異なドメインに由来し、サイズを著しく増大させずに特異性を高めるよう に工学設計されている。δリボザイムドメインは１次、２次、および３次構造の 特異的要素よりなり、実験研究および抗ウイルス治療のためのＲＮＡ開裂試薬と して有用である。実施例において、δ型肝炎ＲＮＡの２つのドメインモデルによ り予測されるリボザイム近辺の１０から１５塩基の２次構造および３次構造要素 を使用して、これらの配列がＨ１’／を標的とすることが示される。これらの要 素を含むδＲＮＡの保存領域は、ＲＮＡ特異的ノ・イブリダイゼーンヨン法を利 用して、ＶＬＰの単離および特徴付けにおいてと同様に、血液銀行におけるよう な、組織および流体のサンプル中のδ型肝炎ウィルスを検出するための診断法と しても有用である配列よりなる。ハイブリダイモーション法により同定された新 しいＲＮＡは次に、紫外線架橋結合およびリボザイム（ＲＮＡ開裂）活性に感応 する３次構造を有する非宿主ＲＮＡ配列を複製することを含む場合は、ＶＬＰと して特性付けされ、同じウィロイドの異なる鎖に保存された配列が発見される。

図面の簡単な説明 図ＩＡはδ型肝炎ゲノムの略図である。残基番号はＷａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　 ３２３．５０ｇ−５１４（１９８６）に基づく。保存領域の太線は現在のところ 特徴付けされている鎖におけるの最も不変である配列を示す。ｒ　ＵＶＪと記さ れた領域はこの領域に存在する局所的３次構造を示す。本図面の左下の上向き矢 印はδリボザイムにより触媒される、残基６８５−６８６間のまさにその開裂点 を示す。δタンパク質、すなわち抗原は、抗原コード領域の残基９５７−１５９ ７によりコードされる。

図ＩＢは、δリボザイム活性を含む配列を示す。「δ＋」はδ残基６４５−７４ ５の配列を示し、これは開裂部位（残基６８５−６８６において「ネ」にて示す ）、および残基７０３−７３５の局所的３次構造の領域を含む。「δ−」はδゲ ノムのアンチ鎖の対応する領域を示し、残基９００にリボザイム部位を含む。

発明の詳細な説明 リボザイム活性および２次ならびに３次構造を有するδ型肝炎ＲＮＡおよび関連 ＶＬＰ由来の配列および構造は、ＲＮＡ開裂の因子として、予防ならびに治療剤 として、および発現系においてなどのいくつかの主要な応用例がある。

δはウィロイドに似た作用をするが、図ＩＡに示すように、関連しないタンパク 質をコードする配列を有する。ＲＮＡのローリングサークルの自己開裂、および ＲＮＡリガーゼ活性を含むウィロイド活性の集中発生により、タンパク質コード 配列を放棄して第２のタンパク質コード配列に置換することが可能である。ウィ ロイド様領域は約３５０から４００塩基の可変領域および保存領域を有する。タ ンパク質コード領域は約１２００塩基である。第１リボザイム活性は、図１Ｂに 示すように、はぼ塩基６４５から７４５のウィロイド様領域にあり、塩基６８５ と６８６間の結合を開裂する。δＲＮＡの相補的なゲノムのアンチ鎖もまた、残 基９００のまわりを中心とするりボザイム活性を有する。局所的３次構造を有す るウィロイド様領域のサブドメインは塩基７０３から７３５を含む。局所的３次 構造により、塩基７０３から７３５の間のサブドメインが塩基８５６から８７６ と会合し、これが、構造変化を引き起こすことにより、または開裂に必要な構造 を安定化させることにより、リポザイムを調整すると考えられる。塩基８５６か ら８７６ノ配列は、ＡＵＧ　ＣＣＣＡＧＧ　ＵＣＧ　ＧＡＣＣＧＣＧＡＧである 。

Ｂｒａｎｃｈら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）により発表された研究が完了 して以来、ＲＮＡベースの発現ベクターの創成と同様に、ウィルスの治療および 診断の領域において具体的な応用が可能となる方法で、δＲＮＡについての様々 な観察結果を一体化する上でさらに顕著な進歩が遂げられた。これをおこなった 洞察は、δＲＮＡのウィロイド様特徴が単一の小さなサブゲノムドメインに集中 発生し、特に、δリボザイムが１次、２次、および３次構造の特性領域に埋め込 まれるという実験結果である。いくつかのりポザイムクラスからのデータと直接 比較することにより、構造の３つのすべてのレベルがリボザイムの機能にとって 極めて重要であることを予測し、またこれを示す実験を実行することが可能であ った。従って、特定の病原性ウィルスＲＮＡに向けて標的される改変りボザイム 配列を計画し合成するためには、δＲＮＡの２つのドメインの構造についての知 識が直接必要とされる。さらに、δＲＮＡゲノムの保存領域がどこに位置するか 、および何故それらはδの他の鎖ならびに同様に他のＶＬＰに保存されようとす るのかを示すことにより、２つのドメインモデルは、成功する診断法の設計にと って極めて重要である。この結論は次の事実により導かれる。すなわち、配列、 塩基対構造、および局所的３次構造の知識すべてが効率性に影響を及ぼし、この 効率性でδの保存配列へのハイブリタイゼー７ｇンブローブがδＲＮＡと結合し 、これにより、δ１？ＮＡを高い効率で背景の細胞ＲＩＪＡから区別して正確に 同定する。

２つのドメインモデルがなければ、δＲＮＡおよびその池のＶＬＰを同定するた めの正しいプローブを設計し合成することは不可能である。δＲＮＡのドメイン が、複製の間にＲＮＡ開裂を行う領域により（すなわちリボザイムを含む部位に より）分離されるという事実は、複製に必要なすべてを依然として含むが、内部 ではδ抗原のためのタンパク質コード配列が異なるタンパク質をコードするＲＮ Ａに置換される、改変δ配列の使用を可能にすることにより、発現ベクター系へ の道を示している。

１、試薬 ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは分子生物学者にとって非Ｎに貴重な試薬である 。制限フラグメントサイズのパターンが、ＤＮＡ分子間の配列関係を確立するた めに使用され、大きなりＮＡは開裂され得、遺伝子工学、配列決定、およびタン パク質結合の研究に有用なサイズのフラグメントにされる。一方、リポザイムは 、非常に向上した配列特異性で、ＲＮＡを開裂する。

開裂のための標的配列に相補する、ヌクレオチド配列を両側に有する触媒配列を 使用して、小さな特異的リボザイムをＨＤＶから調製し得る。さらに、δ型肝炎 ＲＮＡの保存ウィロイド様ドメインは、ＲＮＡブロセノセフグ機能を有する高次 構造を含む。δリボザイムを使用するためには、１次配列、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒ ｉｃｋ塩基ベアリングにより定義される２次配列、および局所的３次構造要素の ３要素すべての知識が要求されることが示されている。（ＵＶ誘導ＲＮＡ：ＲＮ Ａ架橋結合により定義される）局所的３次構造の特性要素、およびＲＮＡ開裂反 応に必要な要素を含むこのドメインの１領域をつなく一連のＤＮＡ構築物からの 転写物を使用して、共宵結合のＵＶ誘導架橋結合に関係する塩基が同定された。

ごの６ＲＮＡ内に既に存在する構造は、このウィロイド様病原体のプロセフ／ン グ、複製およびその他の機能にとって重要であると考えられる特徴的な非Ｗａｔ ｓｏｎ：Ｃｒ１ｃｋ要素を定義するため、この構造要素を含む変異型および野生 型のＲＮＡドメインは、生物学的機能におけるその役割を確実にし、構造の最も 望ましい改変を決定するために比較され続は得る。δゲノムの残基６５０から７ ３０は、これらの反応に関与しキー領域の輪郭を描く。これらの残基は図ＩＢに 示される。

これらの配列は、制限酵素と同様の方式で実験室用試薬として、およびインビボ における特異的な細菌およびウィルス配列の開裂および不活性化のための治療剤 としての応用を有する。インビボにおける使用に対する現在の限界は、改変配列 を細胞に侵入させる能力である。もつとも、Ｂ型肝炎ウィルス（ｉ（Ｂ’／）が 存在しないときはＨＤＶが肝細胞に感染し得ることは示されている。

２、診断法 ＨＤＶ配列は、単独でまたはＨＤＶ抗原に対する抗体との組合せで使用され得、 現在の方法より正確で感度の高いＨＤＶのためのスクリーニング試験を提供する 。さらに、配列および／または抗原の検出のための同じ技術が、ＨＢＶ検出のた めに使用され得る。

δ型肝炎は一般にはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の存在下で発見されている。δ およびＨＢＶによる同時感染は、重症のおよび多くは致死ともなる敷底肝炎とな ることが多い。最近果められたデータによれば、静脈薬剤濫用者などのいくつか のグループでは４０−７０％がＨＢＶと同様にδに感染している。米国では、δ 因子感染と旧ｖ感染のレベルは平行して増加しているように見える。・現在は、 輸血用に保存されている血液の各ユニ・ノドは、ＨＩＶおよび）ＩＢＭの宵無を 試験される。δの試験が必要であるが、現在の研究実験室でのδ抗体試験は血液 銀行で使用されるほどには信頼性がない。このようなセンターは、δの存在を示 すのにＨＢＶ試験に依存するが、最近のデータによれば、δはＨＢＶの不存在で 複製され得るだけでなく、ＨＢＶ試験の組合せではδ自体の直接の検出の代わり となり得ないことが示唆されている。さらに、通常使用されるある種の）ＩＢＶ 試験では、間違って陽性反応する比率が高く、年間何方ユニ、ｌ−もの血液が無 駄にされている。予備報告によれば、［非Ａ型、非Ｂ型肝炎」とあいまいな用語 の下に識別されるケースの半分以下は、現在はＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と呼 ばれる新しい因子の証拠を示している。残りの多くは同様にδ型肝炎因子が宿っ ている可能性がある。

δ型肝炎因子はその主要な抗原タンパク質としてＨ８７表面抗原を有する。δ因 子感染はまた別の新しい抗原の生産を刺激する。この抗原に対する抗体はδ感染 のすべてではないがいくつかのケースにおいて検出され得る。δ検出のためにＨ Ｉ３Ｖ表面抗原に対する抗体を使用するδアッセイは、Ｂ型肝炎とδ型肝炎とを 信頼でき得る程度に識別し得ない。この従来になＬ’　ＲＩＪＡ病原体を突き止 める唯一の信頼できる方法は、ゲノムＲＮＡを直接検出することである。一連の ＲＮＡレベルの合成および標識方法を使用して、δ因子のＲＮＡの重要な領域へ の特異的プローブが、＋５１標識およびＲＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション 法を使用して構築され得る。

δＲＮＡ用のプローブは効率的で且つ、直接の核酸ハイブリダイゼーション法に 基づくべきである。この核酸ハイブリダイゼーション法では、完全な相補配列の Ｗａｔｓｏｎ：Ｃｒ１ｃｋ塩基のベアリングが特異性へのキーである。δ検出の ためには、従来の「ドツト−プロット」または「スロット−プロット」ハイブリ ダイゼーション法と組み合わせた標準放射免疫検定法において１２５１標識した 核酸プローブを使用することが好適である。ＳＦ３またはＩ７などの細菌ウィル スから得られるＲＮＡポリメラーゼは市販されており、特定のＤＮＡテンプレー トから全種類の特異的ＲＮＡを合成するのに使用されている。従って、従来の遺 伝子工学技術によりクローニングされた配列は、これら２つのＲＮＡポリメラー ゼの１つのためのプロモータ配列を含む別のＤＮＡへの挿入として移動され得、 組み合わされたＤＮＡは試験管にミリグラム単位の量の所望のＲＮＡを与えるた めに複製され得る。δＲＮＡクローンは入手可能で、この技術を使用して複製さ れ得る。さらに、δのゲノムＩＩＮＡの配列は、ｆａｎｇら、独±」ｇ　（１９ ８６）により公表された。所望のオリゴヌクレオチドが合成により作製され、Ｉ ７　ＲＮＡポリメラーゼにより複製され、ＲＮＡポリメラーゼのための予め合成 されたプロモータセグメントを、所望の配列の３０−４０塩基を含む合成りＮＡ の一本鎖に付加することにより、クローニングすることなく、大量の所望のＲＮ Ａ配列を生産し得る。

配列は−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｃｏｒｐ、、　Ｗａｌｔｈ ａＩＩｌ、　ＭＡより市販の１２５１標識ＣＴＰにより放射標識され得る。この Ｉ２５［−ＣＴＰはＶＬＰ特異的プローブおよび転写物に特異的に組み込まれる 。適切な極性のＲＮＡの複製は＋２Ｊ標識ＣＴＰおよびその池の標準成分の存在 下で行われる。得られるＲＮＡをフェノール抽巴し、セルロースＣＦ−１１でク ロマトして、組み込まれなかった標識を除去上次にフィンガープリントおよび池 の技術により試験してその配列を確認する。ハイブリダイゼーション試験は血清 サンプルまたはその抽出液を滴下したフィルターにて順次行う。

非放射検出法もまた使用され得る。

ルーチン試験を開発する際には次の２点を考慮することが重要である。すなわち （１）サンプル生産が容易であること、および（２）アッセイが信頼できるもの であることである。

δ因子の有無が試験される最初の生物学的成分である血清のための、簡単な手順 と複雑な手順が、最も容易なアプローチを決定するために試験される。１つのケ ースでは、試験は、ホルムアルデヒドなどの変性剤を希釈血清サンプル（例えば 、５０マイクロリツトルを全１ｔｏ、５ｍｌに希釈）と混合し、Ｉ’ｌＮＡおよ びその他の物質を濃縮して、直接フィルターにスポットする。

フェノール抽出までおよびこれを含むもっと複雑な手順が、効率性を決定するた めに平行して試験される。減圧オーブンで乾燥させた後、フィルターを１２５１ 標識した特異的なＲＮＡプローブ（およびδ因子以外のＲＮＡに相補するフント ロール）にハイブリッドして、光集中スクリーンを使用してオートラジオグラフ ィーを行う。１２５Ｉは、半減期か比較的長い（６０日）ことと２次ベータ崩壊 粒子が豊富であることにより、後者のアプローチにとって理想的なラジオアイソ トープである。

検出効率性を最大にするために、および、ＨＩＶに対して観察されたように、多 くの領域が急速に新しい配列に移動する、δゲノムにおける急速な変化に対して 防御するために、δ因子ゲノムの様々な領域に相補するい（つかのプローブを混 合し得る。比較配列分析により同定されたδゲノムの保存領域に対していくつか の異なるプローブを使用し得る。保存領域はこのＶＬＰのＲＮＡゲノムの約２０ ％を占める。

δ因子に加えて、ヒトおよび動物細胞の別のウィロイド様１’ｌＮＡを検出する 技術は、環状ＲＮＡおよびモノマー体のマルチマー複製の形跡に基づくものであ る。これら２つの特性は共に現在のところ、ウィロイドおよびウィロイド様物質 のための信頼性のある診断法であることが証明されている。環状ＲＮＡは、部分 的に変性した状響で２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出される。

このアッセイにおいては、環状ＲＮＡは池のすべての影響のＲＮＡから離れる方 間に移動し、従って検出されるだけでなく精製もされ得る。これらの同じサンプ ルにおいて、マルチマーＲＮＡセット（これらは環状である必要はない）の研究 は、検出されたＲＮＡサークルまたはこれから複製された選択された配列をプロ ーブとして使用して行われ得る。

最後に、δの保存領域のためのハイブリダイゼーションプローブが池の組織のＶ ＬＰのためのスクリーニングにおいて利用されている。

本明細書では、工学設計したδ型肝炎ＲＮＡ由来の診断法、発現系、および治療 法を特に参照して述べているが、同様に工学設計したＲＮＡ配列および構造は、 上述のような方法を使用して他の材料から単離したＶＬＰから引き出され得る。

スクリーニングされるべき種類の病気の例には、「スローウィルス」が関連する ものが含まれる。これらの病気に対しては、感染を説明する「ブリオン」仮説の 失敗が、多くの実験室でこれらの病気（例えば、スクレービーおよびクロイノフ エルトーヤーコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ−Ｊａｃｏｂ）　ｌ１ｌｆ候群）と関 連する小さなＲＮＡの研究を大幅に加速させた。）ＩＤＶ配列はまた、クローン 病、多発性硬化症、およびリウマチ様関節炎の原因となる因子であると仮定され るウィロイドなどの他のウィロイド様物質をスクリーニングするために使用され 得る。配列は標識され、保存領域、［ＩＶ架橋結合およびリポザイム活性を示す ＲＮＡ配列をスクリーニングする特異的なハイブリダイゼーションアッセイにて 使用される。これらのアッセイはまた、次にウィロイド様特性、すなわち配列比 較、Ｕｖ架橋結合、環状形状を決定するための２次元ポリアクリルアミドゲル電 気泳動、およびリボザイム活性、をスクリーニングし得る候補のＲＮＡ配列また は分子を選別するように発展させ得る。

クローン病は、ＶＬＰと関連しているように見える広域に蔓延したヒトの腸の病 気である。クローン病は、口から肛門までのいかなる部位にも現れ得るが、特徴 的に遠位の小腸および結腸に関連し、結果的にｔ肖化管が徐々に破壊される、病 因が知られていない、慢性で炎症性の、激痛を伴うヒトの病気である。これは、 十代の若者の発病率が最も高い、主に若い人の病気である。すべてのケースのほ ぼ６０％が、１０歳から２５歳までの年齢で始まる。この病気の世界的な発病率 は１００．　ＯＱＯ人口当り６０人であり、年間発病数は１００．０００人当り ６１人である。

比較として、ＡＩＤＳの現在の年間発病率は１００．０００人口当り１３゜７ケ ースである。医院、クリニックおよび病院で利用可能なりローン病の診断試験は 、米国では年間２千万の被験体の潜在市場を持つとみられている。クローン病の 唯一利用可能な診断法には、従来の腸および直腸組織の顕微鏡検査が含まれる。

現在の診断法はクローン病の発病を予測し得ず、ただ確立された病気の存在を予 測するだけである。この試験は時間と労力を必要とする。

クローン病には細菌またはウィルスとの明白な関連性は確立されていない。しか し、最近のデータによれば、長さが３００から８００ヌクレオチドのｉｉｌ！囲 の３つの固有の環状ＲＮＡ種が、クローン病と診断された焼入かの患者から取ら れた肉芽腫腸の組織からのＲＮＡゲノム物の中に存在していることが示されてい る。

これらのクローン病に特異的なＲＮ、Ａ種に向かう臨床的に有用なハイブリダイ ゼーンコンブローブは、その場所でのハイブリダイゼー７：Ｉンにより感染性因 子の場所を決定し、これにより感染した組織の正確な外科的摘出を可能とするた めに、手術に先立ち、外科医がクローン病患者の直腸に生検を実施することを可 能にする。この病気の患者の７５％が最終的には手術を必要とし、病気に冒され た組織の場所を正確に突き止める能力が必要とされる。現在のところ、外科医は 、顕微鏡検査に基づいてどの組織を手術するかの決定を行う。再発率が５年で３ １％以上および１０年で６０％以上であるため、この方法は明らかに不効率であ る。

現在のところウィルス病因因子を持つと考えられるが、証明された特徴付けられ た病原体を持たない他の病気は、先ずウィロイド様ＲＮＡをめてスクリーニング される。これには関節炎および多発性硬化症が含まれる。

（以下余日） ３、治療薬 ａ、リボザイムベースの治療薬 ｍ　ＲＮ　Ａにコードされたタンパク質および構造ＲＮＡ目体を含む、ＲＮ　Ａ として発現された全ての細胞性遺伝子産物は、配列および構造の適切な領域を含 むように設計されたりボザイム、特にＨＤＶリボザイムによる特異的開裂および 不活性化の標的とされ得る。細胞性遺伝子産物は、ｒａｓ遺伝子産物などの、癌 遺伝子の改変された産物であり得る。その場合は、この産物は通常の細胞成分で はない；即ち、ＨＩＶ復製のために必要不可欠な遺伝子によってフードされたタ ン、＜り質などのウィルスタンパク質；または細菌タンノくり質である。

細胞内への特異的送達は、レトロウィルス技術を使用することによって達成され 得るであろう。欠陥レトロウィルスベクターは、これら自体のＲＮＡ配列をＤＮ Ａの形で宿主染色体に組み込み、改変したりボザイム配列を宿主に組み込むよう に設計される。その宿主中で、コピーが作製され、そして細胞質内に放出され、 標的ヌクレオチド配列との相互作用を行う。

ｂ、非すボザイムベースのワクチン δＲＮ　Ａに関連する簗２の主要な治療方法は、１株のＨＤＶの先注感染が他の 株による二次感染を制限すると（１う事実に基づくものである。ＨＤＶは、ＨＤ 　Ｖによる二次感染１こ対する「ワクチン」として使用されるように弱毒化し得 る。δ株によるこの「交差防御」のメカニズムは知られて０な（八〇１つの形態 では、δＲＮＡの保存領域は、δ抗原以外のタンパク質をフードする配列に、ま たは、症例においてＨＤＶ感染の発病度に寄与するかあるいはその原因となるδ 抗原を改変したδ抗原をコードする配列に連結し、そして、患者を非病原性の改 変されたＨＤＶで感染させる。他の形態では、δの保存配列中の塩基を変化させ 、これによって、宿主成分への異なるアフィニティーが野生型δと改変δとで得 られるため、非病原性である。患者は改変δで感染させられ、これによって、毒 性のδ株による感染から保護される。

δ型肝炎ウィルスのＲＮＡゲノムはサイズの異なる二つのドメインに分けられる 。即ち、複製のためのほとんどの機能を含むウィロイド様ドメイン：およびδ抗 原をコードするタンパク質コードドメインである。ウィロイド様ドメインの最も 重要な機能の一つ、ＲＮＡブロセ／ングに関する機能は、本来は自己触媒的であ り、Ｒ，Ｎ　Ａ触媒による開裂およびライゲーションが起こる。共宵結合により 閉環された環状一本鎖Ｒ，Ｎ　Ａ分子の初期の複製能力は、このＲＮＡ分子の自 己触媒による開裂およびライゲーションステノブを行う能力に決定的に依存して いた可能性がある。さらに、δ因子のゲノムなどの、二つのドメインを持つこの ような環状一本鎖ＲＮＡ分子の発生は、ＲＮＡを開裂およびライゲーションする このような能力がその初期の進化において重要であることの別の証拠と考え得る 。自己触媒によるライゲーションを行い得るＲＮＡ分子が、δ抗原をコードする セグメントなどのコードセグメノトを捉え、かつ、このプロセスを続は得る場合 、新しい７ステムを構築するために用いることができる。このシステムでは、非 δタンパク質をコードする配列と組み合わせて、分子のりボザイムドメインを使 用することによって、感染した細胞の保護が可能となる。換言すれば、δ型肝炎 および他のＶＬＰ関連疾患に対するこの第２の方法即ち「ワクチン」方法は、こ の二つのドメインおよびδＲＮＡがその現在の形態に進化した方法に関する知識 がら、自然に生じるものである。さらに、δウィルスのりボザイムドメインは、 望ましいタンパク質と結合し得る。この結合は、感染した細胞中での非δタンパ ク質の発現に使用される。

δ型肝炎ウィルスの２つのドメイン構造の分析に基づいて、哺乳類の細胞中で非 δ型肝炎ウィルスタンパク質を発現させるための肝臓特異的ベクターを構築する ことができる。他のウィロイドを単離する方法を用いると、他の組織特異的ウィ ロイドを単離して類似の組織特異的ウィロイドベースの発現／ステムを構築する ことが可能となるであろう。これらのウィロイド由来の配列は、さらに毒性の高 いウィロイド株による同時感染を防止する「ワクチン」としても使用し得る。

４、発現システム ＨＤＶは、タンパク質コード配列を含み、ＨＢＶが無い場合でも細胞に感染し、 さらに１個の細胞内で何千回も複製され得る。このため、ＨＤＶは、細胞培養ま たはインビボ中で、真核細胞、特に肝細胞中で、タンパク質の発現のための改良 されたシステムの基となり、これによって、例えば、欠損酵素またはインシュリ ンなどの他のタンパク質に置換される。

好ましい形態では、発現されるタンパク質をフードする配列が、ＨＤＶ抗原をコ ードする配列の代わりにＨＤＶに挿入される。δＲＮＡの２つのドメインモデル から予測されることは、ウィロイド様ドメイン（これらの操作中、完全な状態で 保持された）によって継続的複製が可能となり、現在では改変されたδＲＮＡ中 にフードされた新しいタンパク質の発現を伴う、ということである。

ＨＤＶまたはＨＤＶから調製されたプローブの単離に使用される方法論が、クロ ーン病におけるウィロイド様物質の場合と同様に、腸管細胞などの他の細胞タイ プに特有のウィロイドの単離に有用であると仮定すると、肝細胞以外の細胞タイ プに特異的な発現システムを作製することが可能となり、また全ての細胞に適用 可能な、δおよびこれらの他のウィロイド様物質を取り込むためのシステムを探 求することが可能となるであろう。

実施例１：δ型肝炎ウィルスの２つのドメインの単離および特性付け、並びに単 離された保存領域からの改変されたりボザイム配列の製造 δ型肝炎ウィルス（）ＩＤＶ）は、以前はδ因子と呼ばれていたもので、ウィロ イドおよび植物の関連サテライトＲＮＡに非常に類似した哺乳類の病原体である 。ウィロイドゲノムと同様に、ＨＤＶゲノムは共有結合により閉環されたＲＮＡ 環であり、いかなる従来のウィルスのゲノムよりも小さい。

さらに、欠陥干渉粒子とは異なり、ＨＤＶ　ＲＮＡはそのヘルパーウィルスであ るＢ型肝炎ウィルスと顕著な配列の相同性は全く有していない。このため、多く の植物サテライトＲＮＡにさらに類似することとなる。さらに、ゲノム鎖および ゲノムのアノチ鎖の双方のマルチマー形態が、ＨＤＶを復製する組織中で報告さ れている。小さい感染性植物ＲＮＡのために最初に提案されたローリングサーク ル複製経路と同様に、これらのマルチマーＨＤＶ前駆体Ｒ＞＋　Ａは、開裂しラ イゲーションし子孫の環を生成すると考えられている。最後に、棒状二次構造が ＨＤＶ　Ｒ，ＮＡのために描かれた。これは、植物ウィロイド配列のおよび構造 の綿密な研究から得られたものに非常に類似している。ＨＤＶ　ＲＮＡの転写物 内に紫外線（Ｕ　Ｖ）感受性部位が存在することが現在証明されている。

これらの部位は、ＨＤＶ　ＲＮＡの、提案された二次構造に対する実験的な支持 を与え、三次構造エレメントもまた明らかにする。類似の紫外線感受性部位が、 ジャガイモ紡錘塊茎ウィロイドＲＮ　Ａ中で位置決めされた。これはウィロイド 中央の保存領域の構造を規定するために使用されている。ＨＤＶＲＮＡのＵＶ誘 起した架橋は、この病原性因子のゲノムＲＮ　Ａ中のウィロイド様ドメインの識 別を助ける幾つかの特徴のうちの一つを提供する。

構造分析のための材料をえるために、ゲノム側のＲＮ　Ａを、ＨＤＶ　ＲＮＡの 完全長のｃＤＮＡクローンおよび数個の部分クローンからインビトロで転写した 。−次スクリーニングのために、これらのｃ　ＤＮＡクローンの転写物に紫外線 を９０秒間照射した。この照射は、ウィロイド内のＵｖ感受性三次構造エレメン トと真核性５ＳリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）との架橋に以前使用された条件 下で行った。照射された６転写物およびコントロールのδ転写物の双方を、リボ ヌクレアーゼＴＩ　（ＲＮａｓｅ　Ｔｌ）を用いて３７°Ｃで消化した。

その産物をゲル電気泳動によって分画し、光誘起架橋を含有し得るＵＶ依存バン ドを探索した。このＵＶ依存バンドは、ＨＤＶ　ＲＮＡのゲノム鎖に新規の三次 構造が存在することを示すものである。顕著なバンドが、ゲノムの長さのＲＮＡ とこれより小さい部分転写物との双方のＵＶ照射試料中に存在していた。このＲ Ｎａｓｅ　Ｔｌ消化法では、大きいＲＮＡでさえも分析することができる。長さ が短いために、無傷の架橋された形態に対する精製ステップとして二次元ゲル電 気泳動を利用することができ、上記の２個の部分クローンの転写物を、さらに詳 しい研究に利用した。

標準技術によるオリゴヌクレオチドマツピングによって、転写物の僅か２つのセ グメントが、ＨＤＶゲノム配列の架橋に特異的なＲＮａｓｅ　Ｔｌに耐性の領域 のフィンガープリント中に存在するオリゴヌクレオチドを構成することが示され た。これらの放出されたオリゴヌクレオチドはδゲノムの２個の非近接セグメン トを規定する。一方のセグメントは、７０３から７３５までの残基を含有し、他 方は、８５６がら８７６までの塩基を含有する。二次構造マツプの、ＲＮａｓｅ 　ＴｌｆＦＩ性領域を含む部分から、ＲＮａｓｅ　Ｔ１部分消化産物が１６個の Ｇ残基を含む最小５４個の塩基を含有することが明かである。

このように規定された領域は、図１Ａ中から、残基６８５で始まるδの自己開裂 部位に非常に近接して位置することがわかる。７０３〜７３５の残基は、残基６ ８５に隣接しており、これまで研究されてきたりボザイム活性を呈する全てのサ ブゲノムフラグメント中に存在する。これらの同じ残基が局所的三次構造のＵＶ 感受性領域中に存在することは、それらのりボザイム活性の性質を説明する際に 考慮しなければならない。

ＵＶ誘起架橋によって結合した２個の塩基は、非ワトソンークリック結合を含有 する局所的三次構造のエレメント内に存在する傾向にある。ジャガイモ紡錘塊茎 ウィロイドおよび真核性５Ｓ　ｒＲＮＡ中のＵＶ感受性部位は類似の領域に存在 する。これらの領域には従来の結合が無く、その両側には螺旋状の領域が存在す る。これらの分子には、構造エレメント内の２個の塩基は、通常とは異なる空間 配向を有するために、ＵＶ処理で架橋する。ＵＶ架橋実験によって、他の幾つか のタイプのＲ，Ｎ　Ａの構造に関する本質的な情報が提供された；δＲＮＡはこ の強力な技術によって現在研究できるグループの一部である。転移ＲＮＡ中の三 次結合は、その三次元構造の確立を促進する。同様に、非ワトソンークリック結 合は池の種類のＲＮＡにおいて重要となり得る。特に、コードされた遺伝子情報 を越える機能を有するＲＮＡは、ワトソンークリック塩基対形成のみによっては 行うことができない相互作用を必要とし得る。

特に、δリボザイムの酵素機能は、開裂活性の近傍の、配列（−次構造）と塩基 対形成（二次構造）のみに依存しているのではなく、局所的三次構造エレメント にも依存している。

その構造の分析によって、７０３〜７３５の塩基の関与する折り畳み特性が明ら かになる。この折り畳み特性は、δリボザイムを本明細書に記載の治療目的に適 用する際に必要となる。さらに、これは全てのりボザイムベースのシステムに一 般的に必要となると考えられる。しがし、δリボザイムシステムは、現在のとこ ろ、ＵＶ架橋実験により、三次構造相互作用が規定されている唯一のものである 。

要約すれば、ＨＤＶの４つの報告された配列（２つの株を現す）は全体で約１０ ％の違いを呈するが、２９５個の塩基に渡って伸張し、かつ架橋部位を含有する ２つの伸張部は、僅か１個の塩基変化を有し、はぼ従来のウィロイドサイズ（約 ２５０個から４００個の塩基の範囲）のドメインを規定する。ジャガイモ紡錘塊 茎ウィロイドのＵＶ感受性部位は、この植物ウィロイドゲノムの最もよく保存さ れた領域、即ち複製に関係すると考えられる分子の部分に存在する。ＨＤＶＲＮ ＡのＵＶ感受性エレメントがゲノム鎖およびゲノムのアンチ鎖の自己開裂部位に 近接していること、並びにこれらの成分か保存δ配列の伸張部のみに位置するこ とによって、δ因子が２個の部分で構成されることが示唆される。このモデルで は、多くの復製機能に必要な構造が塊になってウィロイド様ドメインを形成する 。これがゲノムの左がら４分の１を構成する。残りの４分の３の内、はぼ半分は δ抗原をコードするために割り当てられ、他の半分のほとんどは、それ自体の何 れかの機能の特定に加えて、このコード領域を安定させるように作用し得る。

実施例２：肝炎δ診断薬の調製 保存された肝炎δ領域の配列を使用することによって、この疾密の種々の株を保 育する患者中のδ因子ＲＮＡの、信頼性があり、再現性のある検出が可能となる 。δＲＮＡの残りの部分では、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶウィルスと同様に、 配列の急速で不可逆的な変異が生じる。このために、δＲＮＡのこの第２のドメ イン中の配列の検出を目的としたテストの信頼性は急激に低下する。しがし、保 存されたライコイド様領域をプローブを介して検出すると、δ因子株はプローブ によってさらに特性付けられ得る。これらのプローブは、δのゲノムＲＮＡのこ の「可変」領域中の変化した配列を検出するように設計されている。

現在まで、配列分析によってこの領域では２０％までの変動が明らかにされてい る。これは、何件かのδ肝炎の集団発生において報告された疾患および他の比較 的穏やかな発病の発病度に関連し得る。さらに、植物ウィロイドとの類似にょっ て、δ因子ＲＮＡの保存ドメインの制限された部分が保持される傾向にある。こ れらの制限された部分は、クローン病の病因と考えられている類縁関係が離れた ＶＬＰにおいてさえ保持されている。この洞察により、ハイブリダイゼーション プローブを用いて潜在するＶＬ　Ｐ＠種々の組織でスクリーニングする方法の基 礎が形成される。これらのハイブリダイゼーションプローブは、保存されたδ領 域がら、および確認された他のＶＬＰの保存領域からのものでもある。

実施例３：リポザイムベースの治療薬；ＨＴＬＶ−１およびＨＩＶ用 標的治療の手段として、特異的に設計された核酸配列を、ＡＩＤＳなどの造血細 胞のウィルス誘起疾患を患っている患者の造血細胞中に導入することが可能であ ることは、非常に大きな可能性がある。特異的な遺伝子配列をヒトの細胞に導入 するために現在利用されている最も効果の高い方法論は、ＲＮＡ含有レトロウィ ルスを使用することを包含する。このＲＮＡ含有レトロウィルスは、ヒトの細胞 への遺伝子導入を高効率で行うための媒体またはベクターとして作用する。

ＶＬＰの２つのドメイン構造は、リボザイムの位置及び配列を規定しており、内 因性のＲＮＡに基づ＜　ＲＮＡ切断活性はこれらの感染性因子の遺伝子材料内に 包埋されている。ヒトｖＬＰからのりボザイムのヌクレオチド配列をレトロウィ ルスベクターに組み込むと、病原性ＲＮＡ配列の不活性化のための固有の治療因 子が創生される。

この因子の特異性は、相補的配列をリボザイムを囲むように隣接させて付加した 結果で、これによって、標的とされるＲＮＡ内の開裂のための特定の位置にリボ ザイムを導く。これらの相補的配列によって、リボザイムが標的ＲＮＡに非常に 近接して併置されることが可能となり、次いで、標的ＲＮＡを切断し、不活性化 することができる。さらに、局所的三次構造の適切な領域は、最大の開裂効率が 確実に得られるように設計され得る。標的の範囲は、標的配列に関する知識、お よびδリボザイムの作用する態様にのみ依存する。標的配列が一旦同定されると 、その両側に、約１５個のヌクレオチドの長さで選択され、これらの領域に対し て完全に相捕的な領域を、δリポザイムエリアに隣接して挿入し、標準的なワト ン７：クリンク塩基対形成法則および遺伝子工学を使用して、適切な配列が構築 される。さらに、δリボザイム領域の７０３〜７３５の塩基と、近接して配置し た８５６〜８７６の塩基との間に形成された三次構造の知識を利用して、構築さ れる合成δリボザイムの周囲構造が、標的配列の類似領域と適切な三次構造相互 作用を確実に行うように構成され得る。

このように、開裂部位に形成されたりボザイム：基質複合体の構造的統合性を最 大化し、開裂速度を最大レベルに調整する。

抗ウイルス治療に対するこのリポザイム方法は、他の全ての方法に比べて、その 効率および特異性において大きな利点を有する。特に、造血細胞のウィルス性疾 患の治療用の高効率遺伝子導入システムに関して、これらの利点が得られる。

リポザイムベースの治療法は、ＨｒＶ−１の拡散を防止する手段として、および ７７′または感染した個体に免疫機能を与え得るＴ細胞のＨＩＶ−１耐性集団を 提供する手段としても使用され得る。ＨＩＶ−１に対する抗体を保有していると 最近診断されたがＡＩＤＳの症候をまだ呈していない患者が、この治療法の最も 良い候補者となり得る。この方法は、患者の骨髄幹細胞をいくらか取り出し、次 いで部分的な細胞排除を行う必要がある。取り出された細胞を実験室でリボザイ ムベースの特異な治療薬で処理し、そして次に、同じ個体に戻す。処理された細 胞を患者の体内でＴ細胞を含む成熟造血細胞にまで発達させる。これらのＴ細胞 は通常の免疫機能を有し、特に重要なことには、細胞内で免疫化され、これによ って患者の体内にまだ存在するいかなるＨＩＶ−１による破壊も防止される。し たがって、この固有の治療法は、ＨＩＶ−１に感染した個体の死の原因となる、 患者の日和見感染を食い止める手段を提供する。

骨髄幹細胞および造血細胞は比較的容易に取り出され、置換されて、さらに、導 入された遺伝子の増殖のために細胞の自己再生集団を提供する。上記のように、 ＨｒＶ−１およびＨＴＬＶ−１はこれらの方法に従うべきものである。長期的に は、リポザイムベースの治療薬を使用することによって、細胞内の望ましくない 遺伝子の選択的不活性化が可能となると予想される。この望ましくない遺伝子に は、癌細胞の原因および維持に関連する活性化された癌遺伝子などがある。

感染した細胞の染色体に組み込まれたレトロウィルスによって引き起こされた感 染性疾患は、生物医学者の想像と才能に対する非常に大きな挑戦である。ＨＴＬ Ｖ−１感染による成人Ｔ細胞白血病およびＨＩ　Ｖ−１感染によるＡＩＤＳは、 このような疾患のヒトにおける最初の例である。しかし、ヒト以外の種における レトロウルス感染の例は多い。ＡＩＤＳに代表される特殊な脅威のために、この 疾患の蔓延を阻止してＨＩＶ−１に感染した個体を治療するために多大な努力が なされてきており、現在もなお続けられている。

ＡＺＴはＡＩＤＳ治療のための最初のＦＤＡ認可薬剤である。実験室では、ＡＺ ＴはＨＩＶ−１の逆転写酵素を阻害する作用を呈しており、これによって、培養 細胞中のウィルスの複製を防止する。残念なことに、ウィルス復製およびその後 の病原性効果を防止するＡＺＴの能力は患者中で限られている。他の固有のヌク レオシドアナログを作製する努力もされているが、その何れにおいてもＨＩＶ− １逆転写酵素に対する特異的効果は証明されていない。

ＨＩＶ−１の拡散を防止するワクチンを作製する試みが数社によりなされている 。ＡＩＤＳワクチンは効果的なものとなるためには：　（１）高レベルの抗体を 生成し、（２）Ｈ［Ｖ−１を中和することができ、（３）細胞媒介による免疫を 生成し、さらに（４）ＨＩＶ−１の異なる株との交差反応が可能でなければなら ない。ヒト以外の動物のレトロウィルスに対して積み重ねてきた多大な経験によ れば、ワクチンの開発は可能となりそうもない。このようなウィルスに感染した ほとんどの動物は、ウィルスに対して高い力価の抗体を保育しているが、それに もかかわらずウィルス感染状態のままである。Ａ、　Ｉ　Ｄ　Ｓの場合は、ＨＩ Ｖ−１に対するワクチンはＨＩＶ−１に接触したことのない個体にのみ有用とな り得る。

可溶性ＣＤ４タンパク質は、感染した患者の体内でのＨＩ　Ｖ−１の拡散を防止 するための実現可能な治療薬として開発中である。この治療は、可溶性ＣＤ４分 子が、膜上のＣＤ４レセプタ一分子よりも、より効果的にＨＩＶ−１粒子と結合 するために、患者の非感染細胞へのウィルスの拡散を防止するという概念に基づ くものである。この治療法は先行技術がなく、成功するかどうかは明らかではな い。

上記のまだ試みられていない方法と対照的に、ＨＩＶ感染の治療、および標的付 けされたりポザイムを保有するレトロウィルスベクターにより形質転換される白 血球の関連疾患の治療にリボザイムベースの技術の使用が可能であろう。標的付 けされたりボザイムを用いて治療され得る疾患の特定の例としては、ＨＴＬＶ− １だけではな（、種々のレトロウィルス誘起白血病も挙げられる。他のタイプの 治療可能な形質転換組織としては、既知の配列の同定された癌遺伝子を保有する 腸管細胞および乳房細胞がある。

δ型肝炎すボザイムベースの技術を用いた方法および組成物の変更および改変は 、上記の詳細な記述により当業者に明らかとなるであろう。このような変更およ び改変は、添付の請求の範囲内で行われるものとする。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）賢 平成４年３月２５日

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＮＡ配列を選択的に開裂する方法であって、δ型肝炎ウイルスまたは他の 哺乳類のウイロイド様病原体の保存領域からのＲＮＡドメインを、 変更される部位のＲＮＡ配列に対して相補的な標的配列、と組み合わせて、提供 することを包含し、該ドメインがリボザイム活性を有する、方法。
2. ２．前記ウイルスの複製に必要不可欠なＲＮＡからの該ウイルスの前記保存領域 を選択することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記リボザイム活性が、変更されるＲＮＡ配列を開裂することである、請求 項１に記載の方法。
4. ４．前記リボザイム活性が、変更されるＲＮＡ配列に結合することである、請求 項１に記載の方法。
5. ５．前記ウイルスのドメインを標識することをさらに包含する、請求項４に記載 の方法。
6. ６．前記標識されたドメインを用いて等方性の細胞をスクリーニングすること、 および、ＲＮＡに対する標準的条件下で塩基対形成させることによってこれにハ イブリダイズする配列を検出すること、をさらに包含する、請求項５に記載の方 法。
7. ７．前記変更されるＲＮＡ配列が、ＲＮＡウイルスである、請求項１に記載の方 法。
8. ８．前記ＲＮＡウイルスが、ＨＩＶまたはＨＴＬＶである、請求項７に記載の方 法。
9. ９．前記ウイルスのドメインと組み合わせて、該ウイルスに由来しない配列を、 開裂されるＲＮＡ配列中に挿入するために提供すること、をさらに包含する、請 求項１に記載の方法。
10. １０．前記ウイルスの保存領域が、リガーゼ活性を有する、請求項９に記載の方 法。
11. １１．前記ウイルスのドメインを、レトロウイルスベクターに挿入すること、を さらに包含する、請求項９に記載の方法。
12. １２．前記相補的配列の長さが、１０ヌクレオチドと２０ヌクレオチドとの間で ある、請求項１に記載の方法。
13. １３．前記保存領域が、δの肝炎配列６３４〜７４５、および、対応するゲノム のアンチ鎖、から選択される、請求項１に記載の方法。
14. １４．哺乳類細胞中のウイロイド様物質を検出する方法であって、 δ型肝炎ウイルスの保存領域からの標識化ＲＮＡ配列を提供する、ことを包含す る方法。
15. １５．前記ＲＮＡ配列が、リボザイム活性を有する６４５と７４５との間の残基 の配列、局所的３次構造を有する７０３と７３５との間の残基の配列、および、 ６４５と７４５との間の残基に相補的なゲノムのアンチ鎖、から選択される、請 求項１４に記載の方法。
16. １６．該細胞または該細胞からの溶解物を該標識化δ型肝炎ウイルス配列と、前 記δ型肝炎ウイルス配列が前記細胞中の相補的ＲＮＡ配列に結合する条件下で、 接触させること、をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
17. １７．前記細胞中のＲＮＡと前記δ型肝炎ウイルス配列との結合量を定量化する ことをさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記細胞が、δ型肝炎ウイルスを含有する、請求項１６に記載の方法。
19. １９．前記細胞が、Ｂ型肝炎ウイルスを含有する、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．前記細胞が、クローン病の症状を有する患者からのものである、請求項１ ４に記載の方法。
21. ２１．δ型肝炎ウイルスの可変配列の標識化ＲＮＡ配列を提供することをさらに 包含する、請求項１４に記載の方法。
22. ２２．ウイロイド感染を阻害するためのワクチンであって、抗原性の薬剤キャリ アと組み合わせた、阻害されるウイロイドの保存配列、を含有するワクチン。
23. ２３．前記保存配列が、δ型肝炎ウイルスのものである、請求項２２に記載のワ クチン。
24. ２４．ウイロイド感染に対して宿主に予防接種する方法であって、阻害されるウ イロイドの保存配列を、抗原性の薬剤キャリアと組み合わせて提供すること、を 包含する方法。
25. ２５．前記保存配列が、δ型肝炎ウイルスのものである、請求項２４に記載の方 法。
26. ２６．宿主細胞中での発現システムであって、ウイロイド様物質の保存配列、お よび、発現されるタンパク質をコードする核酸配列、を含有する発現システム。
27. ２７．前記ウイロイド配列が、δ型肝炎ウイルスの非タンパク質コード配列であ る、請求項２６に記載のシステム。
28. ２８．前記保存配列が、δのゲノム地図の６１１から９８０の残基の配列から選 択される、請求項２６に記載の発現システム。
29. ２９．前記ウイロイド配剤およびタンパク質コード配列が、他のウイロイド様物 質による宿主細胞の同時感染を防止する、請求項２６に記載のシステム。
30. ３０．遺伝子を宿主細胞に挿入するための組成物であって、ウイロイドの保存配 列と挿入される遺伝子との組み合わせを含有する組成物。
31. ３１．前記ウイロイド配列が、δ型肝炎ウイルスの非タンパク質コード配列であ る、請求項３０に記載の組成物。
32. ３２．前記保存配列が、デルタのゲノム地図の６１１から９８０の残基である、 請求項３１に記載の発現システム。
33. ３３．遺伝子を宿主細胞染色体に挿入する方法であって、ウイロイドの保存配列 、挿入される遺伝子、および、該遺伝子を該染色体の特定の部位へ挿入する標的 配列を提供することを包含する、方法。
34. ３４．前記配列のＤＮＡコピーを作製し、そして該ＤＮＡコピーを、前記宿主細 胞と同じタイプの細胞を感染させることが知られているレトロウイルスベクター 中に挿入すること、をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
35. ３５．欠陥ウイルスパッケージング細胞株中でレトロウイルスを成長させること 、および前記宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに包含する、請求項３ ４に記載の方法。
36. ３６．ウイロイドを検出する方法であって、同じ材料から単離されたＲＮＡの、 ３次構造、紫外光感受性、リボザイム活性および保存配列を有するＲＮＡ配列で 、同じ３次構造により特徴付けられるＲＮＡ配列を単離すること、を包含する方 法。
37. ３７．前記ＲＮＡ配列が、δ型肝炎ウイルスの異なる株からのものである、請求 項３６に記載の方法。
38. ３８．ウイロイドを検出するためのプローブであって、宿主細胞から単離され、 かつ同じ材料から単離されたＲＮＡの、３次構造、紫外光感受性、リボザイム活 性および保存配列を有するＲＮＡ配列で、同じ３次構造により特徴付けられる、 ＲＮＡ配列を含有する、プローブ。
39. ３９．検出のために標識された、請求項３８に記載のプローブ。
40. ４０．δ型肝炎ウイルス由来の、請求項３８に記載のプローブ。
41. ４１．リボザイム活性を有する、請求項３８に記載のプローブ。
42. ４２．デルタのゲノム地図の６１１から９８０の残基を含有する配列由来である 、あるいはその一部由来である、請求項４０に記載のプローブ。