JPH05503838A - リボザイム組成物および使用方法 - Google Patents
リボザイム組成物および使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
リボザイム組成物および使用方法
発明の背景
本発明は、核酸配列、特にRNA配列の遺伝子工学、およびこれに使用するため
の組成物および診断方法の一般的な領域に関する。
過去5年間にわたる分子生物学の基礎領域における発見により、RNAが、以前
には思いも寄らなかった一連の顕著な能力および生物学的活性を有していること
が認識されるようになった。これらの新しいRNAレベルの発見の中で最も重要
なことは、RNAが情報キャリアであると共に酵素であり得るという発見であっ
た。
1982年以来、RNAベースの病原性因子に起因する予期しない病気がいくつ
か現れた。これらには、致死性の後天性免疫不全症(AIDS)および、ウィロ
イド様RNA物質に起因するとりわけ悪性の敷底肝炎であるδ型肝炎が含まれる
。これらの血液媒介性の病気はRNAレベルで蔓延して、患者の細胞内で発現し
、現在までに数百万の個体の血流内に存在するにいたっている。
従来の生物工学は、組換えDNA法およびDNAレベルの介入スキームに依存し
ているため、これらの病気と闘うための有効な取り組みはあまり進められていな
い。
Thomas R,CechによりJAMA 26o(20>、3030−30
34 (1988年11月)に示されるように、RNA分子のあるものは、それ
ら自身の開裂すなわちスプライシングを媒介し得、または酵素として働いて基質
RNA分子の反応を促進させ得、従って細胞生物化学を導く上で積極的な役割を
果たし得る。これらの発見により示唆されることは、小核のリボ核タンパク質の
、リポソームの、および様々なリポ核タンパク質酵素のRNA成分を含む、他の
細胞RNAが触媒であるという可能性である。これらの活性はRNAプロセッシ
ングを理解する上で重要な貢献をなすものとして現れつつある。1977年に初
めて示されたmRNAのイントロンおよびエキソンのスプライシングは、RNA
プロセッシング分野の主要な部分である。RNAのスプライシングが最初に示さ
れた後10年の間に、イントロンの4つの主要なカテゴリーが、各々それ自身の
RNAスプライシングのメカニズムと共に発見された。他の多くの生物学的反応
と同様、RNAのスプライシングには反応速度を速めてスプライス部位が正確に
選択されることを確実にする触媒が必要である。現時点で示されている少なくと
も4つのシステムにおいては、RNA触媒、つまりリボザイムがRNA開裂およ
びスジ54フフフ反応に関係しているように見える。リボザイムは、酵素活性を
有する、つまり他の分子に酵素として作用するか、または自己スプライシングま
たは自己開裂などの反応において分子内触媒作用を行う、RNA分子の特異的な
ドメインとして定義される。
リボザイムはインビトロでの配列特異的RNA開裂因子として使用され得、RN
Aの生物化学的研究にとって有用な道具を提供する。繊毛虫原生動物である好熱
性テトラヒメナ(Tetrahymena thermophila)のrRN
A前駆体の研究において、Cechは、スライ/ングはイントロン自体の折り畳
まれた構造により触媒されることを発見した。自己スプライシングの観察は、後
に関連するグループIイントロンおよび構造の異なるグループ11イントロンへ
と進展した。場合によっては、FINAにより触媒される反応はまたタンパク質
にも関係する。グループIイントロンのスプライシングは、ホスホジエステル結
合のすべてを変化させないリン酸エステルの交換である、トランスエステル反応
を2度行うことで実行される。最初のトランスエステル反応の段階では、グアノ
シンがイントロンの5゛末端に付加されるとき、5°スプライス部位が開裂され
る。第2段階では、エキソンが結合されるとき3゛スプライス位が開裂される。
これらの反応の触媒を助けるために、イントロンは外因性グアノシンの、および
それ自体のスプライス部位近くのヌクレオチドの結合部位を提供する。さらに、
イントロンは、反応を促進する活性部位を提供する。
Michelら、EMBOJ、 2.33−33−38(19にて示された、真
菌類のミトコンドリアに発見された構造的に異なるグループのイントロン、すな
わちグループ11イントロン、ちまた自己スライ/ングを行う。グループ1イン
トロンと同様、スプライシングは、最初は5°スプライス部位に関し、第2は3
゛スプライス位に関する2つのトランスエステル反応を通して行われる。
グループIイントロンのメカニズムに対して、fil)ランスエステルのための
攻撃する基(求核分子)はイン)・ロン内に位置するアデノシンの2“ヒドロキ
シル基である。トランスエステル反応の産物はラリアットと呼ばれる分枝RNA
である。研究されたすべての真核生物における核mRNAイントロンは、グルー
プ11イントロンと同じ方法でスプライシングを行うように見える。
酵素とは、化学反応速度を大幅に加速させ、その基質に対するおよびその促進す
る反応のタイプに対する特異性が極めて高い分子であり、各反応において消費さ
れることがないため、1つの酵素分子は数多くの基質分子と相互作用し得る分子
として定義され得る。グループ1およびグループ11イントロンに存在するタイ
プの自己スプライシングRNAは、反応により変化するため本当の酵素ではない
。しかし、CechらによりPCT/US87103161にて開示されている
ように、ヌクレオチドのいくつかの欠損あるいは置換を利用して、自己スプライ
シングのグループ1イントロンを、4個のヌクレオチドの配列に対して特異性を
葡する酵素に転換し得る。テトラヒメナrRNAのイントロンの最初の19個の
ヌクレオチドを欠損すると、L−19介在配列RNAと呼ばれる形態が生成され
る。この分子はもはや分子内反応のための部位を含まず、プロセスにおいてツレ
自体最終的には変化せずに、他の基質のRNAでの反応を媒介し得る。
このRNA酵素に対して示された最初の活性は、Zaugら、鈷」狙ce 23
1.470−475(1986)にて報告されたように、RNAの短鎖をより長
い鎖に組み立てること、すなわち、RNAポリマー化活性であった。
テトラヒメナの介在配列由来のRNA酵素の簗2の活性は、Zaugら、Nat
ure 324.429−433(1,985)にて示された、配列特異的エン
ドリボヌクレアーゼの活性である。このRNA酵素は、既知のいかなるタンパク
質リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)よりはるかに高い配列特異性を有する1本鎖
の他のRNA分子を開裂し得る。開裂部位の前のヌクレオチドの配列により識別
が行われ、開裂はグアノシンの付加により実行される。酵素活性部位(配列5−
GGAGGG−3”)の部位特異的変異誘発は予測し得る方法で開裂特異性を変
えるため、切断により様々な配列が形成されるようなエンドリボヌクレアーゼを
合成することが可能であった。
RNA触媒作用の他の2つの主要なカテゴリーが調査された。
第1は、tRNA前駆体において特異的な開裂を行うリボ核タンパク質酵素であ
るR+JアーゼPの、いくつかの異なる生物からの例を含み、第2は、植物およ
び動物に感染する様々の自己複製RNA、すなわちウィロイド様病原体(すなわ
ちVLP)を含む。
Guerrier−Takada、 Ce1l 35.849−857(198
3)にて報告されたように、RNNアーゼに関連する反応は、グループIおよび
グループ1[イントロンにより触媒されるものと類似しており、攻撃するものが
リボースのヒドロキシル基ではな(水である点で異なる。
Prodyら、 5cience 231.1577−1580(1986)、
およびHutchinSら、 Nuc!eic Ac1ds Res、 14.
3627−3640<1986)にて示されたように、(自らが感染性の小環状
RNAの)1つのウィロイド、および(ある種の植物RNAウィルスのコートタ
ンパク質により被包される各々環状および直鎖状のRNAである)いくつかのウ
イルソイドおよびサテライトRNAを含む、植物に感染するVLP1?NAのい
くつかは、インどトロで効率的に部位特異的自己開裂を行う。これらのRNAは
「ハンマーヘッド」と呼ばれる、僅か約30個のヌクレオチドよりなる、1つの
小さな構造ドメインからなる。感染の間、ローリングサークル複製により生成さ
れる直鎖状のRNAマルチマーがユニットサイズの子孫へ転換するのは自己開裂
によるものであると考えられている。上流側開裂産物の3′末端に環状のホスフ
ェートを残す開裂の要件は、Uhlenbeck、 Nature 328.5
96−600(19g?>、およびForsterら、Ce1150.9−16
(1987)に示されている。
小さな環状の、部分的に二本鎖DNAゲノムを有するB型肝炎ウィルスは、ヒト
にウィルス性肝炎および肝細胞性感を引き起こす。小さな環状RNAを含むδ型
肝炎ウィルスは、B型肝炎ウィルスのサテライトウィルスである。B型肝炎つィ
スルとδ型肝炎ウィルスのキャリアの重複感染は敷底肝炎を引き起こし、これは
多くは致死性である。δ型肝炎ウィルスRNAは環状であり、Wangら、Na
ture 323.508−514(1985ン、およびChamら、Proc
、 Natl、 Acad、 Sci、 ll5A 83.8774−8778
(1986)にて示されるように、植物に感染するウィロイドおよびウィルソイ
ドの構造に類似した、分子内塩基ベアリングを特徴とする構造を有する。Sha
rmeenらはjvlro162.2674−2579(1988)にて、δ型
肝炎ウィルスRNAはインビトロにおいて一種の自己開裂を行い得ると述べた。
この開裂産物は2°、3−環状ホスフェートおよび5−ヒドロキシル末端を有す
る。自己開裂の原因となる配列と構造は明確にされなかったが、ウィルソイドに
見いだされたハンマーへノドの形状とは異なるという予測が述べられた。
関連する発見として、Branchらは5cience 243.649−65
2 (1989年2月3日)にて、)IDV RIJAの高度に保存されたドメ
イン内に存在し、以前植物ウィロイドゲノムの中央の保存領域にマ・ノブされた
局部3次構造に関連し得る、)IDVゲノムRNAに新しい構造要素が存在する
ことを示した。また、この構造要素がδRNAの自己開裂部位に極めて近接して
いることも示した。同時に、WIJおよびLaiは5cience 243.
652−655 (1989年2月3日)にて、δ型肝炎つィルスR)JAの1
48個のヌクレオチドのサブフラグメントは可逆的に開裂および結合を行うこと
を報告した。
反応の方向は、y g 21オンの有無により決定され、開裂反応はJ2°が存
在するとき有利となる。結合には、関連する[INA分子の特定の配座が必要で
あり、水素結合により一体に保持される2つの開裂されたRNAフラグメントの
間てのみ起こる。結合はEDTAにより!11g29が除去されると起こる。1
989年3月、WuらはProc、Natl へcad、Sci、USA 86
. 1831−11135にて、開裂は、133@のヌクレオチド程の短さの、
δ型肝炎ウィルス1.7kbゲノムのサブフラグメントにより、5.0から91
のpHで、ハンマーへノドによる開裂で要求されるものよりはるかに低い濃度で
ある、少なくとも500μMのM g 2“またはCa2ゝの存在下で実行され
得、末端ウソジンの2°、3°−環状のモノホスフェート残基を有する5゛フラ
グメント、および5−ヒドロキシル基を持つグアノシン残基を宵する3゛フラグ
メントを生成すると報告した。
該文献には、リボザイムは試薬としてまたは治療剤として有用性を持ち得るとい
う多くの示唆があったが、この目的達成のためにはまだほとんどのことがなされ
ていない。テトラヒメナの配列は、後に酵母に発見された配列と同様に、プロセ
スにおいて再生産されず、化学量論的な比率において作用するものであるため、
本当の酵素ではない。酵素的活性を有し、またl?NAを開裂および結合し得る
この配列のフラグメントを工学的に処理することは可能であるが、これらフラグ
メントの欠点は、これらが非常に大きく (もともとの415ヌクレオチド配列
の内200以上の残基が必要)、また特異性が制限されるということである。t
RNA前駆体の5゛末端から余分のRNA配列を開裂して成熟tRNA分子を創
成するE、 coIi RNNアーゼ(MIRNA)のRNAサブユニットは、
その基質認識領域が20ヌクレオチド以下であるように工学的に処理され得ると
いうことが示唆されている。
ウィロイド様病原体、すなわちVLPは次の2つのクラスに分割され得る。すな
わち、遊離の生きているウィロイドのクラス11 およびウィルソイドとサテラ
イトウィロイド(ヘルパーウィルスに復製を要求するRNA分子)を含むクラス
IIである。
δ型肝炎ウィルスはこの定義によればクラスII VLPである。
VLPは2つのタイプのりボザイムを有する。最初のタイプ、「ハンマーへノド
」は、C5IRO,Canberra、Au5traliaのHasel。
ffおよびGerlachが商業用として現在開発中である。Uh 1enbe
ck、 Nature (1987)は、アボカドの日照斑点(5unblot
ch)のウィロイド、およびたばこの輪紋病ウィルスおよびアルファルファの一
過性ストリークウィルス(streak virus)のサテライトRNAなど
の植物ウィロイドからの、これらの小さな(18ヌクレオチドまで減少)比較的
特異的なりポザイム配列を最初に開発した。現在の形態においては、テトラヒメ
ナリボザイムは4塩基の22配列を有し、ハンマーへッドリボザイムは約12塩
基の認識配列を有する。4塩基の配列は、典型的なa+RNAサイズのRNAに
平均して数回現れ、これに対し、12塩基配列では、RIIAを開裂するために
これらのりポザイムが相補的に使用され得る。
知られる限り、これらリポザイムのいずれも、現在のところ、幾分制限された特
異性でIINAを開裂およびスプライシングするための実験室用試薬としてより
他には使用されていない。
サイズの制限に加えて、リボザイムの特異性が比較的広いために、RNAのみを
標的として開裂すること、特に宿主RNAに損傷を与えずに開裂することが困難
である。δ型肝炎ウィルス以外の非植物ウィロイドで明確に特徴付けされている
ものはない。従って、δリボザイムを含む、リボザイムのすべてのクラスをまと
めるキーとなる知識、すなわち、メカニズムの理解が可能となる詳細な1次、2
次、および3次構造についての知識は未だ達成されていない。
従って、標的のRNA配列を特異的に開裂する方法および組成物を提供すること
が、本発明の目的である。
AIDSなどのRNA発現に関連する病状の治療のために、インビトロおよびイ
ンビボにおいて、RNAを特異的に開裂する方法および組成物を提供することが
本発明の別の目的である。
また、δ型肝炎を引き起こすウィロイド様物質、およびクローン病の原因となる
物質を含む他のウィロイド様物質を検出し治療する方法および組成物を提供する
ことも本発明の目的である。
δ型肝炎ウィロイドに基づ(組織特異的発現ベクターおよびワクチンを構築する
方法および組成物を提供することが本発明のさらに別の目的である。
発明の要旨
RNAを開裂するりボザイムはδ型肝炎ウィルス(HDV) RNA1i:存在
する特異なドメインに由来し、サイズを著しく増大させずに特異性を高めるよう
に工学設計されている。δリボザイムドメインは1次、2次、および3次構造の
特異的要素よりなり、実験研究および抗ウイルス治療のためのRNA開裂試薬と
して有用である。実施例において、δ型肝炎RNAの2つのドメインモデルによ
り予測されるリボザイム近辺の10から15塩基の2次構造および3次構造要素
を使用して、これらの配列がH1’/を標的とすることが示される。これらの要
素を含むδRNAの保存領域は、RNA特異的ノ・イブリダイゼーンヨン法を利
用して、VLPの単離および特徴付けにおいてと同様に、血液銀行におけるよう
な、組織および流体のサンプル中のδ型肝炎ウィルスを検出するための診断法と
しても有用である配列よりなる。ハイブリダイモーション法により同定された新
しいRNAは次に、紫外線架橋結合およびリボザイム(RNA開裂)活性に感応
する3次構造を有する非宿主RNA配列を複製することを含む場合は、VLPと
して特性付けされ、同じウィロイドの異なる鎖に保存された配列が発見される。
図面の簡単な説明
図IAはδ型肝炎ゲノムの略図である。残基番号はWangら、Nature
323.50g−514(1986)に基づく。保存領域の太線は現在のところ
特徴付けされている鎖におけるの最も不変である配列を示す。r UVJと記さ
れた領域はこの領域に存在する局所的3次構造を示す。本図面の左下の上向き矢
印はδリボザイムにより触媒される、残基685−686間のまさにその開裂点
を示す。δタンパク質、すなわち抗原は、抗原コード領域の残基957−159
7によりコードされる。
図IBは、δリボザイム活性を含む配列を示す。「δ+」はδ残基645−74
5の配列を示し、これは開裂部位(残基685−686において「ネ」にて示す
)、および残基703−735の局所的3次構造の領域を含む。「δ−」はδゲ
ノムのアンチ鎖の対応する領域を示し、残基900にリボザイム部位を含む。
発明の詳細な説明
リボザイム活性および2次ならびに3次構造を有するδ型肝炎RNAおよび関連
VLP由来の配列および構造は、RNA開裂の因子として、予防ならびに治療剤
として、および発現系においてなどのいくつかの主要な応用例がある。
δはウィロイドに似た作用をするが、図IAに示すように、関連しないタンパク
質をコードする配列を有する。RNAのローリングサークルの自己開裂、および
RNAリガーゼ活性を含むウィロイド活性の集中発生により、タンパク質コード
配列を放棄して第2のタンパク質コード配列に置換することが可能である。ウィ
ロイド様領域は約350から400塩基の可変領域および保存領域を有する。タ
ンパク質コード領域は約1200塩基である。第1リボザイム活性は、図1Bに
示すように、はぼ塩基645から745のウィロイド様領域にあり、塩基685
と686間の結合を開裂する。δRNAの相補的なゲノムのアンチ鎖もまた、残
基900のまわりを中心とするりボザイム活性を有する。局所的3次構造を有す
るウィロイド様領域のサブドメインは塩基703から735を含む。局所的3次
構造により、塩基703から735の間のサブドメインが塩基856から876
と会合し、これが、構造変化を引き起こすことにより、または開裂に必要な構造
を安定化させることにより、リポザイムを調整すると考えられる。塩基856か
ら876ノ配列は、AUG CCCAGG UCG GACCGCGAGである
。
Branchら、 5cience (1989)により発表された研究が完了
して以来、RNAベースの発現ベクターの創成と同様に、ウィルスの治療および
診断の領域において具体的な応用が可能となる方法で、δRNAについての様々
な観察結果を一体化する上でさらに顕著な進歩が遂げられた。これをおこなった
洞察は、δRNAのウィロイド様特徴が単一の小さなサブゲノムドメインに集中
発生し、特に、δリボザイムが1次、2次、および3次構造の特性領域に埋め込
まれるという実験結果である。いくつかのりポザイムクラスからのデータと直接
比較することにより、構造の3つのすべてのレベルがリボザイムの機能にとって
極めて重要であることを予測し、またこれを示す実験を実行することが可能であ
った。従って、特定の病原性ウィルスRNAに向けて標的される改変りボザイム
配列を計画し合成するためには、δRNAの2つのドメインの構造についての知
識が直接必要とされる。さらに、δRNAゲノムの保存領域がどこに位置するか
、および何故それらはδの他の鎖ならびに同様に他のVLPに保存されようとす
るのかを示すことにより、2つのドメインモデルは、成功する診断法の設計にと
って極めて重要である。この結論は次の事実により導かれる。すなわち、配列、
塩基対構造、および局所的3次構造の知識すべてが効率性に影響を及ぼし、この
効率性でδの保存配列へのハイブリタイゼー7gンブローブがδRNAと結合し
、これにより、δ1?NAを高い効率で背景の細胞RIJAから区別して正確に
同定する。
2つのドメインモデルがなければ、δRNAおよびその池のVLPを同定するた
めの正しいプローブを設計し合成することは不可能である。δRNAのドメイン
が、複製の間にRNA開裂を行う領域により(すなわちリボザイムを含む部位に
より)分離されるという事実は、複製に必要なすべてを依然として含むが、内部
ではδ抗原のためのタンパク質コード配列が異なるタンパク質をコードするRN
Aに置換される、改変δ配列の使用を可能にすることにより、発現ベクター系へ
の道を示している。
1、試薬
DNA制限エンドヌクレアーゼは分子生物学者にとって非Nに貴重な試薬である
。制限フラグメントサイズのパターンが、DNA分子間の配列関係を確立するた
めに使用され、大きなりNAは開裂され得、遺伝子工学、配列決定、およびタン
パク質結合の研究に有用なサイズのフラグメントにされる。一方、リポザイムは
、非常に向上した配列特異性で、RNAを開裂する。
開裂のための標的配列に相補する、ヌクレオチド配列を両側に有する触媒配列を
使用して、小さな特異的リボザイムをHDVから調製し得る。さらに、δ型肝炎
RNAの保存ウィロイド様ドメインは、RNAブロセノセフグ機能を有する高次
構造を含む。δリボザイムを使用するためには、1次配列、Watson−Cr
ick塩基ベアリングにより定義される2次配列、および局所的3次構造要素の
3要素すべての知識が要求されることが示されている。(UV誘導RNA:RN
A架橋結合により定義される)局所的3次構造の特性要素、およびRNA開裂反
応に必要な要素を含むこのドメインの1領域をつなく一連のDNA構築物からの
転写物を使用して、共宵結合のUV誘導架橋結合に関係する塩基が同定された。
ごの6RNA内に既に存在する構造は、このウィロイド様病原体のプロセフ/ン
グ、複製およびその他の機能にとって重要であると考えられる特徴的な非Wat
son:Cr1ck要素を定義するため、この構造要素を含む変異型および野生
型のRNAドメインは、生物学的機能におけるその役割を確実にし、構造の最も
望ましい改変を決定するために比較され続は得る。δゲノムの残基650から7
30は、これらの反応に関与しキー領域の輪郭を描く。これらの残基は図IBに
示される。
これらの配列は、制限酵素と同様の方式で実験室用試薬として、およびインビボ
における特異的な細菌およびウィルス配列の開裂および不活性化のための治療剤
としての応用を有する。インビボにおける使用に対する現在の限界は、改変配列
を細胞に侵入させる能力である。もつとも、B型肝炎ウィルス(i(B’/)が
存在しないときはHDVが肝細胞に感染し得ることは示されている。
2、診断法
HDV配列は、単独でまたはHDV抗原に対する抗体との組合せで使用され得、
現在の方法より正確で感度の高いHDVのためのスクリーニング試験を提供する
。さらに、配列および/または抗原の検出のための同じ技術が、HBV検出のた
めに使用され得る。
δ型肝炎は一般にはB型肝炎ウィルス(HBV)の存在下で発見されている。δ
およびHBVによる同時感染は、重症のおよび多くは致死ともなる敷底肝炎とな
ることが多い。最近果められたデータによれば、静脈薬剤濫用者などのいくつか
のグループでは40−70%がHBVと同様にδに感染している。米国では、δ
因子感染と旧v感染のレベルは平行して増加しているように見える。・現在は、
輸血用に保存されている血液の各ユニ・ノドは、HIVおよび)IBMの宵無を
試験される。δの試験が必要であるが、現在の研究実験室でのδ抗体試験は血液
銀行で使用されるほどには信頼性がない。このようなセンターは、δの存在を示
すのにHBV試験に依存するが、最近のデータによれば、δはHBVの不存在で
複製され得るだけでなく、HBV試験の組合せではδ自体の直接の検出の代わり
となり得ないことが示唆されている。さらに、通常使用されるある種の)IBV
試験では、間違って陽性反応する比率が高く、年間何方ユニ、l−もの血液が無
駄にされている。予備報告によれば、[非A型、非B型肝炎」とあいまいな用語
の下に識別されるケースの半分以下は、現在はC型肝炎ウィルス(HCV)と呼
ばれる新しい因子の証拠を示している。残りの多くは同様にδ型肝炎因子が宿っ
ている可能性がある。
δ型肝炎因子はその主要な抗原タンパク質としてH87表面抗原を有する。δ因
子感染はまた別の新しい抗原の生産を刺激する。この抗原に対する抗体はδ感染
のすべてではないがいくつかのケースにおいて検出され得る。δ検出のためにH
I3V表面抗原に対する抗体を使用するδアッセイは、B型肝炎とδ型肝炎とを
信頼でき得る程度に識別し得ない。この従来になL’ RIJA病原体を突き止
める唯一の信頼できる方法は、ゲノムRNAを直接検出することである。一連の
RNAレベルの合成および標識方法を使用して、δ因子のRNAの重要な領域へ
の特異的プローブが、+51標識およびRNA:RNAハイブリダイゼーション
法を使用して構築され得る。
δRNA用のプローブは効率的で且つ、直接の核酸ハイブリダイゼーション法に
基づくべきである。この核酸ハイブリダイゼーション法では、完全な相補配列の
Watson:Cr1ck塩基のベアリングが特異性へのキーである。δ検出の
ためには、従来の「ドツト−プロット」または「スロット−プロット」ハイブリ
ダイゼーション法と組み合わせた標準放射免疫検定法において1251標識した
核酸プローブを使用することが好適である。SF3またはI7などの細菌ウィル
スから得られるRNAポリメラーゼは市販されており、特定のDNAテンプレー
トから全種類の特異的RNAを合成するのに使用されている。従って、従来の遺
伝子工学技術によりクローニングされた配列は、これら2つのRNAポリメラー
ゼの1つのためのプロモータ配列を含む別のDNAへの挿入として移動され得、
組み合わされたDNAは試験管にミリグラム単位の量の所望のRNAを与えるた
めに複製され得る。δRNAクローンは入手可能で、この技術を使用して複製さ
れ得る。さらに、δのゲノムIINAの配列は、fangら、独±」g (19
86)により公表された。所望のオリゴヌクレオチドが合成により作製され、I
7 RNAポリメラーゼにより複製され、RNAポリメラーゼのための予め合成
されたプロモータセグメントを、所望の配列の30−40塩基を含む合成りNA
の一本鎖に付加することにより、クローニングすることなく、大量の所望のRN
A配列を生産し得る。
配列は−New England Nuclear、Corp、、 Walth
aIIl、 MAより市販の1251標識CTPにより放射標識され得る。この
I25[−CTPはVLP特異的プローブおよび転写物に特異的に組み込まれる
。適切な極性のRNAの複製は+2J標識CTPおよびその池の標準成分の存在
下で行われる。得られるRNAをフェノール抽巴し、セルロースCF−11でク
ロマトして、組み込まれなかった標識を除去上次にフィンガープリントおよび池
の技術により試験してその配列を確認する。ハイブリダイゼーション試験は血清
サンプルまたはその抽出液を滴下したフィルターにて順次行う。
非放射検出法もまた使用され得る。
ルーチン試験を開発する際には次の2点を考慮することが重要である。すなわち
(1)サンプル生産が容易であること、および(2)アッセイが信頼できるもの
であることである。
δ因子の有無が試験される最初の生物学的成分である血清のための、簡単な手順
と複雑な手順が、最も容易なアプローチを決定するために試験される。1つのケ
ースでは、試験は、ホルムアルデヒドなどの変性剤を希釈血清サンプル(例えば
、50マイクロリツトルを全1to、5mlに希釈)と混合し、I’lNAおよ
びその他の物質を濃縮して、直接フィルターにスポットする。
フェノール抽出までおよびこれを含むもっと複雑な手順が、効率性を決定するた
めに平行して試験される。減圧オーブンで乾燥させた後、フィルターを1251
標識した特異的なRNAプローブ(およびδ因子以外のRNAに相補するフント
ロール)にハイブリッドして、光集中スクリーンを使用してオートラジオグラフ
ィーを行う。125Iは、半減期か比較的長い(60日)ことと2次ベータ崩壊
粒子が豊富であることにより、後者のアプローチにとって理想的なラジオアイソ
トープである。
検出効率性を最大にするために、および、HIVに対して観察されたように、多
くの領域が急速に新しい配列に移動する、δゲノムにおける急速な変化に対して
防御するために、δ因子ゲノムの様々な領域に相補するい(つかのプローブを混
合し得る。比較配列分析により同定されたδゲノムの保存領域に対していくつか
の異なるプローブを使用し得る。保存領域はこのVLPのRNAゲノムの約20
%を占める。
δ因子に加えて、ヒトおよび動物細胞の別のウィロイド様1’lNAを検出する
技術は、環状RNAおよびモノマー体のマルチマー複製の形跡に基づくものであ
る。これら2つの特性は共に現在のところ、ウィロイドおよびウィロイド様物質
のための信頼性のある診断法であることが証明されている。環状RNAは、部分
的に変性した状響で2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出される。
このアッセイにおいては、環状RNAは池のすべての影響のRNAから離れる方
間に移動し、従って検出されるだけでなく精製もされ得る。これらの同じサンプ
ルにおいて、マルチマーRNAセット(これらは環状である必要はない)の研究
は、検出されたRNAサークルまたはこれから複製された選択された配列をプロ
ーブとして使用して行われ得る。
最後に、δの保存領域のためのハイブリダイゼーションプローブが池の組織のV
LPのためのスクリーニングにおいて利用されている。
本明細書では、工学設計したδ型肝炎RNA由来の診断法、発現系、および治療
法を特に参照して述べているが、同様に工学設計したRNA配列および構造は、
上述のような方法を使用して他の材料から単離したVLPから引き出され得る。
スクリーニングされるべき種類の病気の例には、「スローウィルス」が関連する
ものが含まれる。これらの病気に対しては、感染を説明する「ブリオン」仮説の
失敗が、多くの実験室でこれらの病気(例えば、スクレービーおよびクロイノフ
エルトーヤーコブ(Creutzfeld−Jacob) l1lf候群)と関
連する小さなRNAの研究を大幅に加速させた。)IDV配列はまた、クローン
病、多発性硬化症、およびリウマチ様関節炎の原因となる因子であると仮定され
るウィロイドなどの他のウィロイド様物質をスクリーニングするために使用され
得る。配列は標識され、保存領域、[IV架橋結合およびリポザイム活性を示す
RNA配列をスクリーニングする特異的なハイブリダイゼーションアッセイにて
使用される。これらのアッセイはまた、次にウィロイド様特性、すなわち配列比
較、Uv架橋結合、環状形状を決定するための2次元ポリアクリルアミドゲル電
気泳動、およびリボザイム活性、をスクリーニングし得る候補のRNA配列また
は分子を選別するように発展させ得る。
クローン病は、VLPと関連しているように見える広域に蔓延したヒトの腸の病
気である。クローン病は、口から肛門までのいかなる部位にも現れ得るが、特徴
的に遠位の小腸および結腸に関連し、結果的にt肖化管が徐々に破壊される、病
因が知られていない、慢性で炎症性の、激痛を伴うヒトの病気である。これは、
十代の若者の発病率が最も高い、主に若い人の病気である。すべてのケースのほ
ぼ60%が、10歳から25歳までの年齢で始まる。この病気の世界的な発病率
は100. OQO人口当り60人であり、年間発病数は100.000人当り
61人である。
比較として、AIDSの現在の年間発病率は100.000人口当り13゜7ケ
ースである。医院、クリニックおよび病院で利用可能なりローン病の診断試験は
、米国では年間2千万の被験体の潜在市場を持つとみられている。クローン病の
唯一利用可能な診断法には、従来の腸および直腸組織の顕微鏡検査が含まれる。
現在の診断法はクローン病の発病を予測し得ず、ただ確立された病気の存在を予
測するだけである。この試験は時間と労力を必要とする。
クローン病には細菌またはウィルスとの明白な関連性は確立されていない。しか
し、最近のデータによれば、長さが300から800ヌクレオチドのiil!囲
の3つの固有の環状RNA種が、クローン病と診断された焼入かの患者から取ら
れた肉芽腫腸の組織からのRNAゲノム物の中に存在していることが示されてい
る。
これらのクローン病に特異的なRN、A種に向かう臨床的に有用なハイブリダイ
ゼーンコンブローブは、その場所でのハイブリダイゼー7:Iンにより感染性因
子の場所を決定し、これにより感染した組織の正確な外科的摘出を可能とするた
めに、手術に先立ち、外科医がクローン病患者の直腸に生検を実施することを可
能にする。この病気の患者の75%が最終的には手術を必要とし、病気に冒され
た組織の場所を正確に突き止める能力が必要とされる。現在のところ、外科医は
、顕微鏡検査に基づいてどの組織を手術するかの決定を行う。再発率が5年で3
1%以上および10年で60%以上であるため、この方法は明らかに不効率であ
る。
現在のところウィルス病因因子を持つと考えられるが、証明された特徴付けられ
た病原体を持たない他の病気は、先ずウィロイド様RNAをめてスクリーニング
される。これには関節炎および多発性硬化症が含まれる。
(以下余日)
3、治療薬
a、リボザイムベースの治療薬
m RN Aにコードされたタンパク質および構造RNA目体を含む、RN A
として発現された全ての細胞性遺伝子産物は、配列および構造の適切な領域を含
むように設計されたりボザイム、特にHDVリボザイムによる特異的開裂および
不活性化の標的とされ得る。細胞性遺伝子産物は、ras遺伝子産物などの、癌
遺伝子の改変された産物であり得る。その場合は、この産物は通常の細胞成分で
はない;即ち、HIV復製のために必要不可欠な遺伝子によってフードされたタ
ン、<り質などのウィルスタンパク質;または細菌タンノくり質である。
細胞内への特異的送達は、レトロウィルス技術を使用することによって達成され
得るであろう。欠陥レトロウィルスベクターは、これら自体のRNA配列をDN
Aの形で宿主染色体に組み込み、改変したりボザイム配列を宿主に組み込むよう
に設計される。その宿主中で、コピーが作製され、そして細胞質内に放出され、
標的ヌクレオチド配列との相互作用を行う。
b、非すボザイムベースのワクチン
δRN Aに関連する簗2の主要な治療方法は、1株のHDVの先注感染が他の
株による二次感染を制限すると(1う事実に基づくものである。HDVは、HD
Vによる二次感染1こ対する「ワクチン」として使用されるように弱毒化し得
る。δ株によるこの「交差防御」のメカニズムは知られて0な(八〇1つの形態
では、δRNAの保存領域は、δ抗原以外のタンパク質をフードする配列に、ま
たは、症例においてHDV感染の発病度に寄与するかあるいはその原因となるδ
抗原を改変したδ抗原をコードする配列に連結し、そして、患者を非病原性の改
変されたHDVで感染させる。他の形態では、δの保存配列中の塩基を変化させ
、これによって、宿主成分への異なるアフィニティーが野生型δと改変δとで得
られるため、非病原性である。患者は改変δで感染させられ、これによって、毒
性のδ株による感染から保護される。
δ型肝炎ウィルスのRNAゲノムはサイズの異なる二つのドメインに分けられる
。即ち、複製のためのほとんどの機能を含むウィロイド様ドメイン:およびδ抗
原をコードするタンパク質コードドメインである。ウィロイド様ドメインの最も
重要な機能の一つ、RNAブロセ/ングに関する機能は、本来は自己触媒的であ
り、R,N A触媒による開裂およびライゲーションが起こる。共宵結合により
閉環された環状一本鎖R,N A分子の初期の複製能力は、このRNA分子の自
己触媒による開裂およびライゲーションステノブを行う能力に決定的に依存して
いた可能性がある。さらに、δ因子のゲノムなどの、二つのドメインを持つこの
ような環状一本鎖RNA分子の発生は、RNAを開裂およびライゲーションする
このような能力がその初期の進化において重要であることの別の証拠と考え得る
。自己触媒によるライゲーションを行い得るRNA分子が、δ抗原をコードする
セグメントなどのコードセグメノトを捉え、かつ、このプロセスを続は得る場合
、新しい7ステムを構築するために用いることができる。このシステムでは、非
δタンパク質をコードする配列と組み合わせて、分子のりボザイムドメインを使
用することによって、感染した細胞の保護が可能となる。換言すれば、δ型肝炎
および他のVLP関連疾患に対するこの第2の方法即ち「ワクチン」方法は、こ
の二つのドメインおよびδRNAがその現在の形態に進化した方法に関する知識
がら、自然に生じるものである。さらに、δウィルスのりボザイムドメインは、
望ましいタンパク質と結合し得る。この結合は、感染した細胞中での非δタンパ
ク質の発現に使用される。
δ型肝炎ウィルスの2つのドメイン構造の分析に基づいて、哺乳類の細胞中で非
δ型肝炎ウィルスタンパク質を発現させるための肝臓特異的ベクターを構築する
ことができる。他のウィロイドを単離する方法を用いると、他の組織特異的ウィ
ロイドを単離して類似の組織特異的ウィロイドベースの発現/ステムを構築する
ことが可能となるであろう。これらのウィロイド由来の配列は、さらに毒性の高
いウィロイド株による同時感染を防止する「ワクチン」としても使用し得る。
4、発現システム
HDVは、タンパク質コード配列を含み、HBVが無い場合でも細胞に感染し、
さらに1個の細胞内で何千回も複製され得る。このため、HDVは、細胞培養ま
たはインビボ中で、真核細胞、特に肝細胞中で、タンパク質の発現のための改良
されたシステムの基となり、これによって、例えば、欠損酵素またはインシュリ
ンなどの他のタンパク質に置換される。
好ましい形態では、発現されるタンパク質をフードする配列が、HDV抗原をコ
ードする配列の代わりにHDVに挿入される。δRNAの2つのドメインモデル
から予測されることは、ウィロイド様ドメイン(これらの操作中、完全な状態で
保持された)によって継続的複製が可能となり、現在では改変されたδRNA中
にフードされた新しいタンパク質の発現を伴う、ということである。
HDVまたはHDVから調製されたプローブの単離に使用される方法論が、クロ
ーン病におけるウィロイド様物質の場合と同様に、腸管細胞などの他の細胞タイ
プに特有のウィロイドの単離に有用であると仮定すると、肝細胞以外の細胞タイ
プに特異的な発現システムを作製することが可能となり、また全ての細胞に適用
可能な、δおよびこれらの他のウィロイド様物質を取り込むためのシステムを探
求することが可能となるであろう。
実施例1:δ型肝炎ウィルスの2つのドメインの単離および特性付け、並びに単
離された保存領域からの改変されたりボザイム配列の製造
δ型肝炎ウィルス()IDV)は、以前はδ因子と呼ばれていたもので、ウィロ
イドおよび植物の関連サテライトRNAに非常に類似した哺乳類の病原体である
。ウィロイドゲノムと同様に、HDVゲノムは共有結合により閉環されたRNA
環であり、いかなる従来のウィルスのゲノムよりも小さい。
さらに、欠陥干渉粒子とは異なり、HDV RNAはそのヘルパーウィルスであ
るB型肝炎ウィルスと顕著な配列の相同性は全く有していない。このため、多く
の植物サテライトRNAにさらに類似することとなる。さらに、ゲノム鎖および
ゲノムのアノチ鎖の双方のマルチマー形態が、HDVを復製する組織中で報告さ
れている。小さい感染性植物RNAのために最初に提案されたローリングサーク
ル複製経路と同様に、これらのマルチマーHDV前駆体R>+ Aは、開裂しラ
イゲーションし子孫の環を生成すると考えられている。最後に、棒状二次構造が
HDV R,NAのために描かれた。これは、植物ウィロイド配列のおよび構造
の綿密な研究から得られたものに非常に類似している。HDV RNAの転写物
内に紫外線(U V)感受性部位が存在することが現在証明されている。
これらの部位は、HDV RNAの、提案された二次構造に対する実験的な支持
を与え、三次構造エレメントもまた明らかにする。類似の紫外線感受性部位が、
ジャガイモ紡錘塊茎ウィロイドRN A中で位置決めされた。これはウィロイド
中央の保存領域の構造を規定するために使用されている。HDVRNAのUV誘
起した架橋は、この病原性因子のゲノムRN A中のウィロイド様ドメインの識
別を助ける幾つかの特徴のうちの一つを提供する。
構造分析のための材料をえるために、ゲノム側のRN Aを、HDV RNAの
完全長のcDNAクローンおよび数個の部分クローンからインビトロで転写した
。−次スクリーニングのために、これらのc DNAクローンの転写物に紫外線
を90秒間照射した。この照射は、ウィロイド内のUv感受性三次構造エレメン
トと真核性5SリポソームRNA (rRNA)との架橋に以前使用された条件
下で行った。照射された6転写物およびコントロールのδ転写物の双方を、リボ
ヌクレアーゼTI (RNase Tl)を用いて37°Cで消化した。
その産物をゲル電気泳動によって分画し、光誘起架橋を含有し得るUV依存バン
ドを探索した。このUV依存バンドは、HDV RNAのゲノム鎖に新規の三次
構造が存在することを示すものである。顕著なバンドが、ゲノムの長さのRNA
とこれより小さい部分転写物との双方のUV照射試料中に存在していた。このR
Nase Tl消化法では、大きいRNAでさえも分析することができる。長さ
が短いために、無傷の架橋された形態に対する精製ステップとして二次元ゲル電
気泳動を利用することができ、上記の2個の部分クローンの転写物を、さらに詳
しい研究に利用した。
標準技術によるオリゴヌクレオチドマツピングによって、転写物の僅か2つのセ
グメントが、HDVゲノム配列の架橋に特異的なRNase Tlに耐性の領域
のフィンガープリント中に存在するオリゴヌクレオチドを構成することが示され
た。これらの放出されたオリゴヌクレオチドはδゲノムの2個の非近接セグメン
トを規定する。一方のセグメントは、703から735までの残基を含有し、他
方は、856がら876までの塩基を含有する。二次構造マツプの、RNase
TlfFI性領域を含む部分から、RNase T1部分消化産物が16個の
G残基を含む最小54個の塩基を含有することが明かである。
このように規定された領域は、図1A中から、残基685で始まるδの自己開裂
部位に非常に近接して位置することがわかる。703〜735の残基は、残基6
85に隣接しており、これまで研究されてきたりボザイム活性を呈する全てのサ
ブゲノムフラグメント中に存在する。これらの同じ残基が局所的三次構造のUV
感受性領域中に存在することは、それらのりボザイム活性の性質を説明する際に
考慮しなければならない。
UV誘起架橋によって結合した2個の塩基は、非ワトソンークリック結合を含有
する局所的三次構造のエレメント内に存在する傾向にある。ジャガイモ紡錘塊茎
ウィロイドおよび真核性5S rRNA中のUV感受性部位は類似の領域に存在
する。これらの領域には従来の結合が無く、その両側には螺旋状の領域が存在す
る。これらの分子には、構造エレメント内の2個の塩基は、通常とは異なる空間
配向を有するために、UV処理で架橋する。UV架橋実験によって、他の幾つか
のタイプのR,N Aの構造に関する本質的な情報が提供された;δRNAはこ
の強力な技術によって現在研究できるグループの一部である。転移RNA中の三
次結合は、その三次元構造の確立を促進する。同様に、非ワトソンークリック結
合は池の種類のRNAにおいて重要となり得る。特に、コードされた遺伝子情報
を越える機能を有するRNAは、ワトソンークリック塩基対形成のみによっては
行うことができない相互作用を必要とし得る。
特に、δリボザイムの酵素機能は、開裂活性の近傍の、配列(−次構造)と塩基
対形成(二次構造)のみに依存しているのではなく、局所的三次構造エレメント
にも依存している。
その構造の分析によって、703〜735の塩基の関与する折り畳み特性が明ら
かになる。この折り畳み特性は、δリボザイムを本明細書に記載の治療目的に適
用する際に必要となる。さらに、これは全てのりボザイムベースのシステムに一
般的に必要となると考えられる。しがし、δリボザイムシステムは、現在のとこ
ろ、UV架橋実験により、三次構造相互作用が規定されている唯一のものである
。
要約すれば、HDVの4つの報告された配列(2つの株を現す)は全体で約10
%の違いを呈するが、295個の塩基に渡って伸張し、かつ架橋部位を含有する
2つの伸張部は、僅か1個の塩基変化を有し、はぼ従来のウィロイドサイズ(約
250個から400個の塩基の範囲)のドメインを規定する。ジャガイモ紡錘塊
茎ウィロイドのUV感受性部位は、この植物ウィロイドゲノムの最もよく保存さ
れた領域、即ち複製に関係すると考えられる分子の部分に存在する。HDVRN
AのUV感受性エレメントがゲノム鎖およびゲノムのアンチ鎖の自己開裂部位に
近接していること、並びにこれらの成分か保存δ配列の伸張部のみに位置するこ
とによって、δ因子が2個の部分で構成されることが示唆される。このモデルで
は、多くの復製機能に必要な構造が塊になってウィロイド様ドメインを形成する
。これがゲノムの左がら4分の1を構成する。残りの4分の3の内、はぼ半分は
δ抗原をコードするために割り当てられ、他の半分のほとんどは、それ自体の何
れかの機能の特定に加えて、このコード領域を安定させるように作用し得る。
実施例2:肝炎δ診断薬の調製
保存された肝炎δ領域の配列を使用することによって、この疾密の種々の株を保
育する患者中のδ因子RNAの、信頼性があり、再現性のある検出が可能となる
。δRNAの残りの部分では、AIDSを引き起こすHIVウィルスと同様に、
配列の急速で不可逆的な変異が生じる。このために、δRNAのこの第2のドメ
イン中の配列の検出を目的としたテストの信頼性は急激に低下する。しがし、保
存されたライコイド様領域をプローブを介して検出すると、δ因子株はプローブ
によってさらに特性付けられ得る。これらのプローブは、δのゲノムRNAのこ
の「可変」領域中の変化した配列を検出するように設計されている。
現在まで、配列分析によってこの領域では20%までの変動が明らかにされてい
る。これは、何件かのδ肝炎の集団発生において報告された疾患および他の比較
的穏やかな発病の発病度に関連し得る。さらに、植物ウィロイドとの類似にょっ
て、δ因子RNAの保存ドメインの制限された部分が保持される傾向にある。こ
れらの制限された部分は、クローン病の病因と考えられている類縁関係が離れた
VLPにおいてさえ保持されている。この洞察により、ハイブリダイゼーション
プローブを用いて潜在するVL P@種々の組織でスクリーニングする方法の基
礎が形成される。これらのハイブリダイゼーションプローブは、保存されたδ領
域がら、および確認された他のVLPの保存領域からのものでもある。
実施例3:リポザイムベースの治療薬;HTLV−1およびHIV用
標的治療の手段として、特異的に設計された核酸配列を、AIDSなどの造血細
胞のウィルス誘起疾患を患っている患者の造血細胞中に導入することが可能であ
ることは、非常に大きな可能性がある。特異的な遺伝子配列をヒトの細胞に導入
するために現在利用されている最も効果の高い方法論は、RNA含有レトロウィ
ルスを使用することを包含する。このRNA含有レトロウィルスは、ヒトの細胞
への遺伝子導入を高効率で行うための媒体またはベクターとして作用する。
VLPの2つのドメイン構造は、リボザイムの位置及び配列を規定しており、内
因性のRNAに基づ< RNA切断活性はこれらの感染性因子の遺伝子材料内に
包埋されている。ヒトvLPからのりボザイムのヌクレオチド配列をレトロウィ
ルスベクターに組み込むと、病原性RNA配列の不活性化のための固有の治療因
子が創生される。
この因子の特異性は、相補的配列をリボザイムを囲むように隣接させて付加した
結果で、これによって、標的とされるRNA内の開裂のための特定の位置にリボ
ザイムを導く。これらの相補的配列によって、リボザイムが標的RNAに非常に
近接して併置されることが可能となり、次いで、標的RNAを切断し、不活性化
することができる。さらに、局所的三次構造の適切な領域は、最大の開裂効率が
確実に得られるように設計され得る。標的の範囲は、標的配列に関する知識、お
よびδリボザイムの作用する態様にのみ依存する。標的配列が一旦同定されると
、その両側に、約15個のヌクレオチドの長さで選択され、これらの領域に対し
て完全に相捕的な領域を、δリポザイムエリアに隣接して挿入し、標準的なワト
ン7:クリンク塩基対形成法則および遺伝子工学を使用して、適切な配列が構築
される。さらに、δリボザイム領域の703〜735の塩基と、近接して配置し
た856〜876の塩基との間に形成された三次構造の知識を利用して、構築さ
れる合成δリボザイムの周囲構造が、標的配列の類似領域と適切な三次構造相互
作用を確実に行うように構成され得る。
このように、開裂部位に形成されたりボザイム:基質複合体の構造的統合性を最
大化し、開裂速度を最大レベルに調整する。
抗ウイルス治療に対するこのリポザイム方法は、他の全ての方法に比べて、その
効率および特異性において大きな利点を有する。特に、造血細胞のウィルス性疾
患の治療用の高効率遺伝子導入システムに関して、これらの利点が得られる。
リポザイムベースの治療法は、HrV−1の拡散を防止する手段として、および
77′または感染した個体に免疫機能を与え得るT細胞のHIV−1耐性集団を
提供する手段としても使用され得る。HIV−1に対する抗体を保有していると
最近診断されたがAIDSの症候をまだ呈していない患者が、この治療法の最も
良い候補者となり得る。この方法は、患者の骨髄幹細胞をいくらか取り出し、次
いで部分的な細胞排除を行う必要がある。取り出された細胞を実験室でリボザイ
ムベースの特異な治療薬で処理し、そして次に、同じ個体に戻す。処理された細
胞を患者の体内でT細胞を含む成熟造血細胞にまで発達させる。これらのT細胞
は通常の免疫機能を有し、特に重要なことには、細胞内で免疫化され、これによ
って患者の体内にまだ存在するいかなるHIV−1による破壊も防止される。し
たがって、この固有の治療法は、HIV−1に感染した個体の死の原因となる、
患者の日和見感染を食い止める手段を提供する。
骨髄幹細胞および造血細胞は比較的容易に取り出され、置換されて、さらに、導
入された遺伝子の増殖のために細胞の自己再生集団を提供する。上記のように、
HrV−1およびHTLV−1はこれらの方法に従うべきものである。長期的に
は、リポザイムベースの治療薬を使用することによって、細胞内の望ましくない
遺伝子の選択的不活性化が可能となると予想される。この望ましくない遺伝子に
は、癌細胞の原因および維持に関連する活性化された癌遺伝子などがある。
感染した細胞の染色体に組み込まれたレトロウィルスによって引き起こされた感
染性疾患は、生物医学者の想像と才能に対する非常に大きな挑戦である。HTL
V−1感染による成人T細胞白血病およびHI V−1感染によるAIDSは、
このような疾患のヒトにおける最初の例である。しかし、ヒト以外の種における
レトロウルス感染の例は多い。AIDSに代表される特殊な脅威のために、この
疾患の蔓延を阻止してHIV−1に感染した個体を治療するために多大な努力が
なされてきており、現在もなお続けられている。
AZTはAIDS治療のための最初のFDA認可薬剤である。実験室では、AZ
TはHIV−1の逆転写酵素を阻害する作用を呈しており、これによって、培養
細胞中のウィルスの複製を防止する。残念なことに、ウィルス復製およびその後
の病原性効果を防止するAZTの能力は患者中で限られている。他の固有のヌク
レオシドアナログを作製する努力もされているが、その何れにおいてもHIV−
1逆転写酵素に対する特異的効果は証明されていない。
HIV−1の拡散を防止するワクチンを作製する試みが数社によりなされている
。AIDSワクチンは効果的なものとなるためには: (1)高レベルの抗体を
生成し、(2)H[V−1を中和することができ、(3)細胞媒介による免疫を
生成し、さらに(4)HIV−1の異なる株との交差反応が可能でなければなら
ない。ヒト以外の動物のレトロウィルスに対して積み重ねてきた多大な経験によ
れば、ワクチンの開発は可能となりそうもない。このようなウィルスに感染した
ほとんどの動物は、ウィルスに対して高い力価の抗体を保育しているが、それに
もかかわらずウィルス感染状態のままである。A、 I D Sの場合は、HI
V−1に対するワクチンはHIV−1に接触したことのない個体にのみ有用とな
り得る。
可溶性CD4タンパク質は、感染した患者の体内でのHI V−1の拡散を防止
するための実現可能な治療薬として開発中である。この治療は、可溶性CD4分
子が、膜上のCD4レセプタ一分子よりも、より効果的にHIV−1粒子と結合
するために、患者の非感染細胞へのウィルスの拡散を防止するという概念に基づ
くものである。この治療法は先行技術がなく、成功するかどうかは明らかではな
い。
上記のまだ試みられていない方法と対照的に、HIV感染の治療、および標的付
けされたりポザイムを保有するレトロウィルスベクターにより形質転換される白
血球の関連疾患の治療にリボザイムベースの技術の使用が可能であろう。標的付
けされたりボザイムを用いて治療され得る疾患の特定の例としては、HTLV−
1だけではな(、種々のレトロウィルス誘起白血病も挙げられる。他のタイプの
治療可能な形質転換組織としては、既知の配列の同定された癌遺伝子を保有する
腸管細胞および乳房細胞がある。
δ型肝炎すボザイムベースの技術を用いた方法および組成物の変更および改変は
、上記の詳細な記述により当業者に明らかとなるであろう。このような変更およ
び改変は、添付の請求の範囲内で行われるものとする。
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)賢
平成4年3月25日
Claims (42)
- 1.RNA配列を選択的に開裂する方法であって、δ型肝炎ウイルスまたは他の 哺乳類のウイロイド様病原体の保存領域からのRNAドメインを、 変更される部位のRNA配列に対して相補的な標的配列、と組み合わせて、提供 することを包含し、該ドメインがリボザイム活性を有する、方法。
- 2.前記ウイルスの複製に必要不可欠なRNAからの該ウイルスの前記保存領域 を選択することをさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 3.前記リボザイム活性が、変更されるRNA配列を開裂することである、請求 項1に記載の方法。
- 4.前記リボザイム活性が、変更されるRNA配列に結合することである、請求 項1に記載の方法。
- 5.前記ウイルスのドメインを標識することをさらに包含する、請求項4に記載 の方法。
- 6.前記標識されたドメインを用いて等方性の細胞をスクリーニングすること、 および、RNAに対する標準的条件下で塩基対形成させることによってこれにハ イブリダイズする配列を検出すること、をさらに包含する、請求項5に記載の方 法。
- 7.前記変更されるRNA配列が、RNAウイルスである、請求項1に記載の方 法。
- 8.前記RNAウイルスが、HIVまたはHTLVである、請求項7に記載の方 法。
- 9.前記ウイルスのドメインと組み合わせて、該ウイルスに由来しない配列を、 開裂されるRNA配列中に挿入するために提供すること、をさらに包含する、請 求項1に記載の方法。
- 10.前記ウイルスの保存領域が、リガーゼ活性を有する、請求項9に記載の方 法。
- 11.前記ウイルスのドメインを、レトロウイルスベクターに挿入すること、を さらに包含する、請求項9に記載の方法。
- 12.前記相補的配列の長さが、10ヌクレオチドと20ヌクレオチドとの間で ある、請求項1に記載の方法。
- 13.前記保存領域が、δの肝炎配列634〜745、および、対応するゲノム のアンチ鎖、から選択される、請求項1に記載の方法。
- 14.哺乳類細胞中のウイロイド様物質を検出する方法であって、 δ型肝炎ウイルスの保存領域からの標識化RNA配列を提供する、ことを包含す る方法。
- 15.前記RNA配列が、リボザイム活性を有する645と745との間の残基 の配列、局所的3次構造を有する703と735との間の残基の配列、および、 645と745との間の残基に相補的なゲノムのアンチ鎖、から選択される、請 求項14に記載の方法。
- 16.該細胞または該細胞からの溶解物を該標識化δ型肝炎ウイルス配列と、前 記δ型肝炎ウイルス配列が前記細胞中の相補的RNA配列に結合する条件下で、 接触させること、をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 17.前記細胞中のRNAと前記δ型肝炎ウイルス配列との結合量を定量化する ことをさらに包含する、請求項15に記載の方法。
- 18.前記細胞が、δ型肝炎ウイルスを含有する、請求項16に記載の方法。
- 19.前記細胞が、B型肝炎ウイルスを含有する、請求項16に記載の方法。
- 20.前記細胞が、クローン病の症状を有する患者からのものである、請求項1 4に記載の方法。
- 21.δ型肝炎ウイルスの可変配列の標識化RNA配列を提供することをさらに 包含する、請求項14に記載の方法。
- 22.ウイロイド感染を阻害するためのワクチンであって、抗原性の薬剤キャリ アと組み合わせた、阻害されるウイロイドの保存配列、を含有するワクチン。
- 23.前記保存配列が、δ型肝炎ウイルスのものである、請求項22に記載のワ クチン。
- 24.ウイロイド感染に対して宿主に予防接種する方法であって、阻害されるウ イロイドの保存配列を、抗原性の薬剤キャリアと組み合わせて提供すること、を 包含する方法。
- 25.前記保存配列が、δ型肝炎ウイルスのものである、請求項24に記載の方 法。
- 26.宿主細胞中での発現システムであって、ウイロイド様物質の保存配列、お よび、発現されるタンパク質をコードする核酸配列、を含有する発現システム。
- 27.前記ウイロイド配列が、δ型肝炎ウイルスの非タンパク質コード配列であ る、請求項26に記載のシステム。
- 28.前記保存配列が、δのゲノム地図の611から980の残基の配列から選 択される、請求項26に記載の発現システム。
- 29.前記ウイロイド配剤およびタンパク質コード配列が、他のウイロイド様物 質による宿主細胞の同時感染を防止する、請求項26に記載のシステム。
- 30.遺伝子を宿主細胞に挿入するための組成物であって、ウイロイドの保存配 列と挿入される遺伝子との組み合わせを含有する組成物。
- 31.前記ウイロイド配列が、δ型肝炎ウイルスの非タンパク質コード配列であ る、請求項30に記載の組成物。
- 32.前記保存配列が、デルタのゲノム地図の611から980の残基である、 請求項31に記載の発現システム。
- 33.遺伝子を宿主細胞染色体に挿入する方法であって、ウイロイドの保存配列 、挿入される遺伝子、および、該遺伝子を該染色体の特定の部位へ挿入する標的 配列を提供することを包含する、方法。
- 34.前記配列のDNAコピーを作製し、そして該DNAコピーを、前記宿主細 胞と同じタイプの細胞を感染させることが知られているレトロウイルスベクター 中に挿入すること、をさらに包含する、請求項33に記載の方法。
- 35.欠陥ウイルスパッケージング細胞株中でレトロウイルスを成長させること 、および前記宿主細胞にトランスフェクトすることをさらに包含する、請求項3 4に記載の方法。
- 36.ウイロイドを検出する方法であって、同じ材料から単離されたRNAの、 3次構造、紫外光感受性、リボザイム活性および保存配列を有するRNA配列で 、同じ3次構造により特徴付けられるRNA配列を単離すること、を包含する方 法。
- 37.前記RNA配列が、δ型肝炎ウイルスの異なる株からのものである、請求 項36に記載の方法。
- 38.ウイロイドを検出するためのプローブであって、宿主細胞から単離され、 かつ同じ材料から単離されたRNAの、3次構造、紫外光感受性、リボザイム活 性および保存配列を有するRNA配列で、同じ3次構造により特徴付けられる、 RNA配列を含有する、プローブ。
- 39.検出のために標識された、請求項38に記載のプローブ。
- 40.δ型肝炎ウイルス由来の、請求項38に記載のプローブ。
- 41.リボザイム活性を有する、請求項38に記載のプローブ。
- 42.デルタのゲノム地図の611から980の残基を含有する配列由来である 、あるいはその一部由来である、請求項40に記載のプローブ。
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US5225347A (en) * | 1989-09-25 | 1993-07-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors |
US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
FR2680797A1 (fr) * | 1991-09-03 | 1993-03-05 | Genset Sa | Structure ribozymique derivee de l'arn genomique du virus de l'hepatite delta. |
AU683011B2 (en) * | 1992-01-13 | 1997-10-30 | Duke University | Enzymatic RNA molecules |
US6469158B1 (en) | 1992-05-14 | 2002-10-22 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
US5804683A (en) * | 1992-05-14 | 1998-09-08 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of RNA with alkylamine |
US5693535A (en) * | 1992-05-14 | 1997-12-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | HIV targeted ribozymes |
US5686599A (en) * | 1992-05-14 | 1997-11-11 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
WO1993023057A1 (en) * | 1992-05-14 | 1993-11-25 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting cancer development |
US5610052A (en) * | 1992-08-26 | 1997-03-11 | Ribozyme Pharmaceuticals Inc. | Enzymatic RNA with activity to ras |
US5977343A (en) | 1992-05-14 | 1999-11-02 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes |
US5989906A (en) * | 1992-05-14 | 1999-11-23 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for inhibiting P-glycoprotein (mdr-1-gene) |
US5599704A (en) * | 1992-08-26 | 1997-02-04 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | ErbB2/neu targeted ribozymes |
AU679525B2 (en) * | 1992-12-04 | 1997-07-03 | Innovir Laboratories, Inc. | Regulatable nucleic acid therapeutic and methods of use thereof |
US5837542A (en) | 1992-12-07 | 1998-11-17 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) ribozymes |
US5612215A (en) * | 1992-12-07 | 1997-03-18 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Stromelysin targeted ribozymes |
AU6409094A (en) * | 1993-03-15 | 1994-10-11 | Yale University | Diagnosis of human inflammatory bowel diseases and nucleic acid reagents therefor |
US6897016B1 (en) | 1993-11-12 | 2005-05-24 | The Regents Of The University Of Colorado | Alteration of sequence of a target molecule |
US5667969A (en) * | 1993-11-12 | 1997-09-16 | University Research Corporation | Alteration of sequence of a deleterious target molecule by ribozyme catalyzed trans-splicing |
NZ278432A (en) * | 1994-01-05 | 1998-06-26 | Gene Shears Pty Ltd | Oligonucleotides comprising a sequence defining a conserved catalytic region and a sequence capable of hybridizing with a predetermined target sequence in a rna virus packaging sequence |
AU1925295A (en) * | 1994-02-22 | 1995-09-04 | Immusol, Inc | Ribozyme therapy for hepatitis b infection |
US5869248A (en) * | 1994-03-07 | 1999-02-09 | Yale University | Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences |
US5891689A (en) * | 1994-04-12 | 1999-04-06 | Innovir Laboratories, Inc. | Heme-bearing microparticles for targeted delivery of drugs |
US5631148A (en) * | 1994-04-22 | 1997-05-20 | Chiron Corporation | Ribozymes with product ejection by strand displacement |
US5998193A (en) * | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
US20020058636A1 (en) * | 1994-09-21 | 2002-05-16 | Geoffrey P. Symonds | Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs |
US6057153A (en) * | 1995-01-13 | 2000-05-02 | Yale University | Stabilized external guide sequences |
US5683873A (en) * | 1995-01-13 | 1997-11-04 | Innovir Laboratories, Inc. | EGS-mediated inactivation of target RNA |
US5872241A (en) * | 1995-01-25 | 1999-02-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Multiple component RNA catalysts and uses thereof |
US5646031A (en) * | 1995-05-16 | 1997-07-08 | Northern Illinois University | SArMV and sCYMVI hairpin ribozymes |
WO1997020060A1 (en) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Conditionally replicating viral vectors and their use |
US5885806A (en) * | 1995-11-28 | 1999-03-23 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to prepare conditionally replicating viral vectors |
US5888767A (en) * | 1996-11-27 | 1999-03-30 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of using a conditionally replicating viral vector to express a gene |
US6620805B1 (en) | 1996-03-14 | 2003-09-16 | Yale University | Delivery of nucleic acids by porphyrins |
US5877162A (en) * | 1996-03-14 | 1999-03-02 | Innovir Laboratories, Inc. | Short external guide sequences |
WO1997038087A2 (en) | 1996-04-05 | 1997-10-16 | Chiron Corporation | Alphaviral vector with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
US6610478B1 (en) | 1996-08-16 | 2003-08-26 | Yale University | Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences |
WO1998006837A1 (en) * | 1996-08-16 | 1998-02-19 | Yale University | Phenotypic conversion of drug-resistant bacteria to drug-sensitivity |
US6013447A (en) * | 1997-11-21 | 2000-01-11 | Innovir Laboratories, Inc. | Random intracellular method for obtaining optimally active nucleic acid molecules |
US6248525B1 (en) | 1998-03-30 | 2001-06-19 | Yale University | Method for identifying essential or functional genes |
CA2230203A1 (en) | 1998-04-29 | 1999-10-29 | Universite De Sherbrooke | Delta ribozyme for rna cleavage |
DE60045931D1 (de) | 1999-07-07 | 2011-06-16 | Zymogenetics Inc | Menschliches Rezeptor für Zytokine |
EP2319939A3 (en) | 1999-10-21 | 2012-09-26 | Case Western Reserve University | Gene expression profiling of inflammatory bowel disease |
US20030026791A1 (en) * | 2001-03-27 | 2003-02-06 | Laurent Humeau | Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections |
US20040192889A1 (en) * | 2001-03-30 | 2004-09-30 | Dale Bredesen | Cytotoxic peptides and peptidomimetics based thereon, and methods for use thereof |
ES2358187T3 (es) | 2001-07-10 | 2011-05-06 | JOHNSON & JOHNSON RESEARCH PTY LIMITED | Procedimientos para la modificación genética de las células progenitoras hematopoyéticas y utilizaciones de las células modificadas. |
AU2002316640C1 (en) | 2001-07-10 | 2009-01-29 | Johnson & Johnson Research Pty Limited | Methods for genetic modification of hematopoietic progenitor cells and uses of the modified cells |
US20040005546A1 (en) | 2002-02-28 | 2004-01-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
CA2374388C (en) | 2002-02-28 | 2005-07-12 | Matthew C. Coffey | The use of ribozymes in the detection of adventitious agents |
WO2003077215A2 (en) | 2002-03-08 | 2003-09-18 | Glen Research Corporation | Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same |
US20040209353A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-10-21 | Chiron Corporation | Biological sample storage device and method for biological sample contamination testing |
US8426194B2 (en) | 2003-01-21 | 2013-04-23 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods and agents for screening for compounds capable of modulating VEGF expression |
US9068234B2 (en) | 2003-01-21 | 2015-06-30 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods and agents for screening for compounds capable of modulating gene expression |
US20040235019A1 (en) * | 2003-03-06 | 2004-11-25 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostics and therapeutics for the gene expression signature of PPAR-gamma receptor ligand |
EP1654383A1 (en) * | 2003-08-08 | 2006-05-10 | Licentia, Ltd. | Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis, and therapy |
US7544855B2 (en) * | 2004-04-23 | 2009-06-09 | Buck Institute | Transgenic mouse whose genome comprises an APP having a mutation at amino acid 664 |
US9012140B2 (en) | 2004-07-06 | 2015-04-21 | Societe de Commercialisation des Produits de la Recherche Appliquée Socpra Sciences et Génie S.E.C. | Target-dependent nucleic acid adapter |
DK1624076T3 (da) * | 2004-08-06 | 2007-06-25 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Kvantitativ påvisning af HDV ved hjælp af realtids-RT-PCR |
JP5265188B2 (ja) | 2004-08-26 | 2013-08-14 | ザ ユニバーシティー オブ ウェスタン オンタリオ | Staphylococcusaureusにおける鉄輸送阻害剤を同定する方法 |
JP2013509874A (ja) | 2009-11-04 | 2013-03-21 | エラスムス ユニバーシティ メディカル センター ロッテルダム | 新脈管形成を調節する為の新規化合物及びこれらの化合物を使用する処置方法 |
WO2014129895A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Stichting Vu-Vumc | Means and method for increasing the sensitivity of cancers for radiotherapy |
CN103493722A (zh) * | 2013-09-03 | 2014-01-08 | 苍南县水产研究所 | 紫菜全浮流人工养殖干露的装置及其使用方法 |
CA3020426A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof |
US11364310B2 (en) | 2016-10-17 | 2022-06-21 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant virus replicon systems and uses thereof |
US11845939B2 (en) | 2016-12-05 | 2023-12-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing gene expression |
EA202091513A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-09-09 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение |
US11020476B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV) |
US11389531B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-07-19 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines |
CA3089024A1 (en) | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems |
CA3216308A1 (en) | 2021-04-21 | 2022-10-27 | Zhejiang University | Negative-strand rna viral vector and plant genome editing method without transformation |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4795700A (en) * | 1985-01-25 | 1989-01-03 | California Institute Of Technology | Nucleic acid probes and methods of using same |
US4888278A (en) * | 1985-10-22 | 1989-12-19 | University Of Massachusetts Medical Center | In-situ hybridization to detect nucleic acid sequences in morphologically intact cells |
AU6523486A (en) * | 1985-11-07 | 1987-06-02 | Hans Dunberg | A lamp assembly |
AT394950B (de) * | 1986-07-11 | 1992-07-27 | Pickhard Ewald | Injektionsspritze mit nadelschutzkappe |
US4987071A (en) * | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US5116742A (en) * | 1986-12-03 | 1992-05-26 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods |
EP0640688A1 (en) * | 1987-12-15 | 1995-03-01 | Gene Shears Pty. Limited | Ribozymes |
JPH02295883A (ja) * | 1989-05-09 | 1990-12-06 | Mitsubishi Electric Corp | エレベータの扉安全装置 |
-
1989
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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ANAL BIOCHEM 147-2=1985 * |
ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN PHYTOPATHOLOGICAL SOCIETY AND THE PACIFIC DIVISION 78=1988 * |
PROC NATL ACAD SCI=1989US * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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US5225337A (en) | 1993-07-06 |
WO1991004324A1 (en) | 1991-04-04 |
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