CN106521036A - 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法 - Google Patents

一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，属于病毒检测领域。本发明方法可以同时检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四种病毒；操作简单，检测速度快且高通量；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。本发明的引物特异性好，除可以与所要检测的四种目标病毒核酸结合外，不与其他常见病毒，如猫瘟热、犬腺病毒1型、犬钩端螺旋体等核酸结合。

Description

一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒 2型的四重PCR检测方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法。
背景技术
犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感、犬腺病毒2型是犬常见传染病，发病率高、死亡率高，对养犬业造成严重损失。犬细小病毒病由犬细小病毒（Canine Parvovirus ,CPV）引起的犬的一种急性传染病，以急性出血性胃肠炎或非化脓性心肌炎为特征，各种年龄和不同性别的犬都有易感性，但幼犬的易感性更高，病死率达50%。犬瘟热由犬瘟热病毒（CanineDistempter Virus,CDV）引起，犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病，以早期双相热、急性鼻卡他和随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征，可引起犬全身性的免疫抑制，病死率极高。犬副流感是由副流感病毒5型（CanineParainfluenza Virus,CPIV）引起犬的一种传染病，以突然发热、卡他性鼻炎和支气管炎为特征，是犬呼吸系统重要疾病之一，可感染各种年龄犬，幼龄犬病情较重，潜伏期较短，突然发热，咳嗽和呼吸困难，有些犬还表现后躯麻痹和运动失调等神经症状。犬腺病毒2型为犬传染性喉气管炎病毒（Canine adenovirus，CAV），主要引起幼犬的传染性喉气管炎和肠炎。多可见于4月龄以下的幼犬，潜伏期为 5~6 天，以持续性高热（体温在39.5℃左右）、咳嗽、浆液性或黏液性鼻涕、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎为特征。
上述四种犬疾病临床症状相似，又易于混合感染，临床鉴别诊断非常困难，常用的单一PCR方法耗时又长，因此，建立一种可以同时检测这四种疾病的鉴别诊断方法具有很高的实用性和现实意义，以便尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，试剂盒和检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：
CPVP1：5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'（SEQ ID NO：1）；
CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'（SEQ ID NO：2）；
CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'（SEQ ID NO：3）；
CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'（SEQ ID NO：4）；
CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC3'（SEQ ID NO：5）；
CPIVP2：5' ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'（SEQ ID NO：6）；
CAVP1：5' TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'（SEQ ID NO：7）；
CAVP2：5' CTGCCAGCCACAGTCCAA3'（SEQ ID NO：8）。
一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述检测引物。
一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，包括下列步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用上述所述的引物对进行PCR扩增反应获得扩增产物；
3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
优选的，步骤2）中PCR扩增反应体系为：2×1 step buffer 12.5μL， 引物CPVP1、CPVP2、CDVP1、CDVP2、CPIVP1、CPIVP2、CAVP1、CAVP2各0.25μL，病毒核酸模板 2 μL，余量水，总体积为25µl。
优选的，步骤2）中PCR反应程序：50℃，30min；95 ℃预变性 2 min；然后95 ℃，30s，53 ℃，30s，72 ℃，30 s，共进行30个循环；最后 72 ℃延伸7min。
本发明的有益效果是：
本发明方法可以同时检测犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四种病毒；操作简单，检测速度快且高通量；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
本发明的引物特异性好，除可以与所要检测的四种目标病毒核酸结合外，不与其他常见病毒，如猫瘟热、犬腺病毒1型、犬钩端螺旋体等核酸结合。
附图说明
图1为特异性试验电泳结果图；
图2为敏感性试验电泳结果图；
图3为重复性试验电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1 引物设计
根据犬细小病毒基因、犬瘟热病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的保守序列，经过筛选各设计了一对特异性引物，用于犬细小病毒基因、犬瘟热病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的部分基因片段。预期扩增产物片段长度分别为1033bp、804bp、396bp和258bp。引物的序列如下：
犬细小病毒基因扩增引物：
CPVP1： 5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC 3'（SEQ ID NO：1）；
CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC 3'（SEQ ID NO：2）；
犬瘟热病毒基因扩增引物：
CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC 3'（SEQ ID NO：3）；
CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG 3'（SEQ ID NO：4）；
犬副流感病毒基因扩增引物：
CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC 3'（SEQ ID NO：5）；
CPIVP2：5' ATACCCCGCTTCCTGTTCCT 3'（SEQ ID NO：6）；
犬腺病毒2型基因扩增引物：
CAVP1：5' TGCCTCTTCCCAGCGTAA 3'（SEQ ID NO：7）；
CAVP2：5' CTGCCAGCCACAGTCCAA 3'（SEQ ID NO：8）。
以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
实施例2 四重PCR检测方法
1）DNA 的提取：按照Axygen公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书，提取病毒基因组，-20℃保存备用。
2）四重PCR扩增反应
在PCR反应管中分别加入灭菌水7.5μL，2×1 step buffer 12.5μL， CPV 上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CDV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CPIV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CAV-2上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，primescript 1 step enzyme mix1 μL，模板 2 μL，共25µl RT-PCR扩增体系。
PCR反应程序：50℃，30min；95 ℃预变性 2 min；然后95 ℃，30s，53 ℃，30s，72℃，30 s，共进行30个循环；最后 72 ℃延伸7min；4 ℃保存。
结果观察：PCR产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型引物扩增的PCR产物分别在1033bp、804bp、396bp和258bp左右各出现了一条片段，四重引物扩增的PCR产物出现了4条带，与预期大小相符。
实施例3 特异性试验
按照实施例2的方法，利用四重PCR检测方法，以犬四联活疫苗（犬细小病毒病、犬瘟热、犬副流感和犬腺病毒2型）提取的基因组为模板，并以灭菌水为阴性对照，验证该RT-PCR方法的特异性。
PCR产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。
图1结果显示，犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型引物扩增的PCR产物分别在1033bp、804bp、396bp和258bp左右各出现了一条片段，四重引物扩增的PCR产物出现了4条带，与预期大小相符，而灭菌水对照、猫瘟热、犬腺病毒1型、犬钩端螺旋体均没有出现条带(图1)。
实施例4 敏感性试验
将200μL犬四联活疫苗提取基因组，用核酸分析仪确定其浓度，然后将其按 10倍递减稀释至 10-8，用引物对其进行 PCR扩增，验证该RT-PCR方法的敏感性。
用核酸分析仪测定犬四联活疫苗基因组的浓度为7.06ng/μL，按 10倍递减稀释至10-8，RT-PCR扩增体系为 25 μL，模板为2μL。能检出的最小基因组浓度为7.06×10-4ng/μL（图2）。
实施例5 扩增重复性试验
将犬四联活疫苗在相同条件下，重复进行 8次基因组提取和RT-PCR扩增检测，以验证该RT-PCR方法的重复性。
PCR产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳显示，8次提取的犬四联活疫苗基因组的PCR扩增结果均出现了四条清晰明亮的目的条带（图3）。结果表明，建立的犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型四重RT-PCR检测方法具有良好的重复性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PC
R检测方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acggtggtca acctgctgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatggccctt gtgtagacgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggtcaggta ggagacaaag gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agacaccaag gtccgagcac ag 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcccatcatt ctcgctcacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ataccccgct tcctgttcct 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgcctcttcc cagcgtaa 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgccagcca cagtccaa 18

Claims (5)

1.一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：
CPVP1：5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'；
CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'；
CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'；
CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'；
CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC3'；
CPIVP2：5'ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'；
CAVP1：5'TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'；
CAVP2：5'CTGCCAGCCACAGTCCAA3'。
2.一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。
3.一种用于鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增反应获得扩增产物；
3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中PCR扩增反应体系为：2×1step buffer 12.5μL， 引物CPVP1、CPVP2、CDVP1、CDVP2、CPIVP1、CPIVP2、CAVP1、CAVP2各0.25μL，病毒核酸模板 2 μL，余量水，总体积为25µl。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中PCR反应程序：50℃，30min；95 ℃预变性 2 min；然后95 ℃，30s，53 ℃，30s，72 ℃，30 s，共进行30个循环；最后 72℃延伸7min。
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