CN107014995A - 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒 - Google Patents

一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107014995A
CN107014995A CN201710236570.4A CN201710236570A CN107014995A CN 107014995 A CN107014995 A CN 107014995A CN 201710236570 A CN201710236570 A CN 201710236570A CN 107014995 A CN107014995 A CN 107014995A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dog
elisa
tiny
canine distemper
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710236570.4A
Other languages
English (en)
Inventor
袁鹏飞
焦铁军
李河林
胡江锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangling Lyufang Bioengineering Co Ltd
Original Assignee
Yangling Lyufang Bioengineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangling Lyufang Bioengineering Co Ltd filed Critical Yangling Lyufang Bioengineering Co Ltd
Priority to CN201710236570.4A priority Critical patent/CN107014995A/zh
Publication of CN107014995A publication Critical patent/CN107014995A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G01N2333/13—Canine distemper virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒，包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照、阴性对照和由辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体。该方一种犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒便、高效，通过血清检测血清抗体来判断接种疫苗后的犬类免疫保护状况。

Description

一种犬瘟热、犬细小抗体的ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种犬瘟热、犬细小抗体的ELISA检测试剂盒。
背景技术
在我国，随着社会经济发展方式的转变，养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业，其规模在不断扩大；随着人们生活质量的不断提高，宠物犬的饲养量在也逐年增加，而对这些行业发展造成最大影响的就是犬类传染病的爆发，对于这些传染病的预防与控制形式也愈加严峻。在犬类疫病中，犬瘟热和犬细小是发病率及死亡率都较高的疫病。犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，传染性极强，死亡率可达80％以上。犬瘟热初期狗的体温高达39.5-41摄氏度，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻症状。在以后2-14天内再次出现胃肠道疾病，呕吐、拉稀，有脓性笔体、脓性眼屎，精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期会出现典型的神经症状，口吐白沫，抽搐，但以冬、春多发，犬是主要的自然宿主。而犬类感染细小病毒后发病急，死亡率高，常呈爆发性流行；不同年龄、性别、品种的犬均可感染，但八月龄以内的幼犬最易感染且死亡率高达70％。病犬和康复带毒犬经粪便、尿液、唾液和呕吐物向外界排毒后污染饲料、饮水、食具及周边环境。健康犬直接接触病犬或者进入被污染环境通过消化道感染。
我国的犬类疫病防控缺乏有效的综合防控体系，既不利于犬类疫病防控，也不利于人类的身体健康。犬类经过接种疫苗后往往存在一种情况，即不知道免疫效果如何，导致了有些犬接种疫苗以后仍然发病，而市面上流行的试剂盒往往只能检测犬瘟热或犬细小，这两种常见病通常需要购买2个试剂盒进行检测，无形中增大了工作量，工作繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种方便、高效、通过检测血清抗体来判断接种疫苗后的犬类免疫保护状况的犬瘟热、犬细小抗体的ELISA检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒，包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照和阴性对照；
上述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的H蛋白及VP2基因，规格为6孔×10条；
上述血清稀释液为即用型；
上述浓缩洗涤液为20倍浓缩；
上述底物显色液为即用型TMB显色液，10ml；
上述终止液为2mol/L的H2SO4溶液，10mL；
上述酶标单克隆抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
上述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后的犬血清稀释液；
上述阴性对照为：经高温灭活的未患病，且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
本发明还公开了上述的检测犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒在检测犬瘟热、犬细小IgG抗原中的应用。
本发明一种犬瘟热、犬细小抗体的ELISA检测试剂盒具有如下优点：两种检测方法整合至一个试剂盒，给使用者提供了方便且降低了使用成本。
附图说明
图1是本发明中犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒；
其中：1.犬瘟热病毒H蛋白；2.犬细小病毒VP2基因。
具体实施方式
本发明一种犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒，包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照和阴性对照；
上述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的H蛋白及VP2基因，规格为6孔×10条；
上述血清稀释液为即用型；
上述浓缩洗涤液为20倍浓缩；
上述底物显色液为即用型TMB显色液，10ml；
上述终止液为2mol/L的H2SO4溶液，10mL；
上述酶标单克隆抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
上述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后的犬血清稀释液；
上述阴性对照为：经高温灭活的未患病，且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
本发明还公开了上述的检测犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒在检测犬瘟热、犬细小IgG抗原中的应用。
一、抗原制备
1.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的表达：
根据GenBank中犬瘟热病毒H基因序列及犬细小病毒VP2基因序列，设计合成2对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出H基因片段及VP2基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-H及pET-VP2基因，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
2.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解，具体为：超声1.5s，间隔2s，共10min。然后10000rpm离心，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒H蛋白纯化后OD值为2.05，与标准品比较后，其浓度为1500μg/ml；犬细小病毒VP2纯化后OD值为1.85，与标准品比较后，其浓度为1200μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG的制备：
1.纯化犬IgG的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/L pH为5.0的醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清液经尼龙筛过滤，尼龙筛孔径为125um，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用lmol/L NaOH溶液调pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出后，12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
以上述制备的纯化犬IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬IgG多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；向其中再加入20μl、0.2M、pH为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，4℃放置2小时；所得产物在0.1M、pH为7.4的PBS中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH为7.4的PBS中。将溶液装入透析袋中，对0.1M pH为7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明试剂盒的检测原理：
采用间接ELISA法，将重组的犬瘟热蛋白H、犬细小病毒蛋白VP2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒H蛋白；2为犬细小病毒VP2基因。用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小IgG抗体与酶标板中包被的H、VP2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬IgG多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的H、VP2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小IgG抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法：
用pH9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组H、VP2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的H、VP2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
pH为7.4，浓度为0.15M的PBS洗涤液中各组分及含量如下：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤液至100ml；
底物缓冲液：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml，pH为5.0；
四甲基联苯胺TMB显色液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul：
终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml。
c)检测犬瘟热、犬细小IgG抗体的ELISA试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，包含以下组分：
H蛋白、VP2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
TMB底物；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小IgG抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬IgG多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析：
1)检测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
PC-NC≥0.4；
Cut OHH＝NC+0.05；
其中NC＝阴性对照血清OD值；
PC＝阳性对照血清OD值；
2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
当血清样本的OD值低于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阴性。
当血清样本的OD值高于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阳性。
实例2：
一、抗原制备：
1.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的表达：
根据GenBank中瘟热病毒H基因序列及犬细小病毒VP2基因序列，设计合成2对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出H基因片段以及VP2基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-H及pET-VP2基因，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
2.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解，具体过程为：超声1.0s，间隔1s，共10min；然后10000rpm离心，分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒H蛋白纯化后OD值为2.25，与标准品比较后，其浓度为1600μg/ml；犬细小病毒VP2纯化后OD值为1.75，与标准品比较后，其浓度为1100μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG的制备：
1.纯化犬IgG的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/L pH为5.0的醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(125um)，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用lmol/L NaOH调pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清液；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
上述制备的纯化犬IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬IgG多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl 0.2MpH为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.1M pH为7.4PBS中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH为7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.1M pH7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明重试剂盒的检测原理：
采用间接ELISA法，将重组的犬瘟热蛋白H、犬细小病毒蛋白VP2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒H蛋白；2为犬细小病毒VP2基因。用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小IgG抗体与酶标板中包被的H、VP2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬IgG多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的H蛋白及VP2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小IgG抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法
用pH为9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组H蛋白、VP2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的H蛋白、VP2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
浓度0.15M，pH为7.4的PBS洗涤液：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml；
底物缓冲液：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml；
四甲基联苯胺TMB底物显色液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul；
2M H2SO4终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml；
c)检测犬瘟热、犬细小IgG抗体的间接ELISA试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，包含以下组分：
H蛋白、VP2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
TMB显色液；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小IgG抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬IgG多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析
1)检测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
PC-NC≥0.4；
Cut OHH＝NC+0.05；
其中NC＝阴性对照血清OD值；
PC＝阳性对照血清OD值；
2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
当血清样本的OD值低于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阴性。
当血清样本的OD值高于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阳性。
实例3：
一、抗原制备：
1.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的表达：
根据GenBank中瘟热病毒H基因序列及犬细小病毒VP2基因序列，设计合成2对引物，采用PCR方法从DNA中扩增出H基因片段以及VP2基因片段，将其克隆到表达载体pET28b中，构建了重组质粒pET-H及pET-VP2基因，测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。
2.犬瘟热病毒H蛋白、犬细小病毒VP2基因的纯化：
诱导结束后，离心收集诱导后菌体，用PBS洗涤重悬菌体，超声裂解，具体过程如下：超声1.0s，间隔2s，共15min；然后12000rpm离心，分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE分析。蛋白纯化时使用镍离子亲和层析柱，纯化后，经SDS-PAGE、western blotting鉴定，获取到单一条带，并具备较好的抗原性。使用BCA法测定纯化后蛋白含量，犬瘟热病毒H蛋白纯化后OD值为2.15，与标准品比较后，其浓度为1500μg/ml；犬细小病毒VP2纯化后OD值为1.55，与标准品比较后，其浓度为900μg/ml。
二、辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG的制备：
1.纯化犬IgG的制备：
取经检验合格的犬作为采血用犬，采血前体况较好，体温、食欲、大小便正常，无其他疾病。消毒后，颈静脉采血，分离血清，纯化IgG方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。
取1份预处理过的血清加2份0.06mol/L pH为5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释血清加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出后12000r/min离心30min，弃沉淀；上清液经尼龙筛过滤，筛网孔径为125um，加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用lmol/L NaOH调节pH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1小时；12000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜；取出12000r/min离心30min，除去不溶性沉淀，分装，冻存备用。
2.兔抗犬IgG多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：
上述制备的纯化犬IgG作为免疫原，免疫成年健康家兔，心脏采血后，纯化获得兔抗犬IgG多克隆抗体。
纯化后的多克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：
称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中；向其中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温避光搅拌20分钟；对1mM pH为4.4的醋酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；向其中再加入20μl0.2M pH为9.5的碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0，然后立即加入溶于0.01M碳酸盐缓冲液的多克隆抗体纯品5mg，浓度为10mg/ml，室温避光轻柔搅拌2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4，混匀，4℃放置2小时；所得产物对0.1M pH为7.4PBS中4℃透析过夜。
透析完成后，在搅拌中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃下1小时。3000r/min离心30min，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH为7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.1M pH7.4的PBS缓冲液透析，取出铵离子，10000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冻存。
三、试剂盒的建立：
1.本发明试剂盒的检测原理：
采用间接ELISA法，将重组的犬瘟热蛋白H、犬细小病毒蛋白VP2基因包被于微孔板中，包被方式如附图1所示，其中：1为犬瘟热病毒H蛋白；2为犬细小病毒VP2基因。用1％BSA将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的犬瘟热、犬细小IgG抗体与酶标板中包被的H蛋白、VP2基因发生抗原反应，加入酶标兔抗犬IgG多克隆抗体后，酶标抗体与上一步反应结束的H蛋白、VP2基因抗原-抗体复合物结合。随后，加入辣根过氧化物酶底物TMB显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度值，OD值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中犬细小IgG抗体的含量成正比。
2.本发明试剂盒的组成：
a)酶标板的最佳制备方法：
用pH为9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组H蛋白、VP2基因稀释后，按100ul/孔加入微孔板中，保证每孔中的H、VP2基因含量为0.15ug。4℃包被过夜，次日，弃去包被液，按200ul/孔加入1％BSA的封闭液，37℃静置2小时，洗涤甩干。室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
b)工作试剂的配置：
浓度为0.15M，pH为的7.4PBS洗涤液：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-20(0.05％)0.5ml，加蒸馏水至1000ml。浓缩成25倍作为存储液。
血清稀释液：牛血清白蛋白0.1g，加洗涤缓冲液至100ml；
底物缓冲液(pH 5.0磷酸柠檬酸)：0.2M Na2HPO4 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，加蒸馏水50ml；
四甲基联苯胺TMB底物显色液：TMB(10mg/5ml无水乙醇)0.5ml，底物缓冲液10ml，0.75％H2O2 32ul；
2M H2SO4终止液：蒸馏水178.3ml，逐滴加入质量浓度为98％的浓硫酸21.7ml；
c)检测犬瘟热、犬细小IgG抗体的间接ELISA试剂盒的组建：
组建检测犬瘟热、犬细小病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，包含以下组分：
H蛋白、VP2基因包被的60孔酶标板；
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体；
阳性对照；
阴性对照；
浓缩洗涤液；
血清稀释液；
TMB底物；
终止液；
产品说明书。
四、样品中犬瘟热、犬细小IgG抗体的检测：
1.用上述制备的试剂盒进行检测：
1)将待测血清、阳性对照及阴性对照用抗体稀释液按比例稀释，每孔100μl加入酶标板，37℃孵育1小时。洗涤液清洗3-5次。
2)每孔加入稀释后酶标兔抗犬IgG多克隆抗体100μl，37℃孵育30min，洗涤液清洗3-5次。
3)每孔加入TMB底物液100μl，室温避光反应10-15分钟。
4)每孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm吸光度值。
2.检测结果分析：
1)检测中阳性对照血清(PC)的OD值与阴性对照血清(NC)的OD值之差必须大于0.4时，检测被认为有效。
PC-NC≥0.4；
Cut OHH＝NC+0.05；
其中NC＝阴性对照血清OD值；
PC＝阳性对照血清OD值；
2)检测时使用复孔，最终使用OD值为两个的平均值。
当血清样本的OD值低于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阴性。
当血清样本的OD值高于Cut OHH值时，该样本为犬细小病毒IgG抗体阳性。

Claims (2)

1.一种犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括ELISA板条、血清稀释液和浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、酶标单克隆抗体、阳性对照和阴性对照；
所述ELISA板条：每个试剂盒装有1块ELISA微孔板，每块ELISA板条为能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原为原核表达的H蛋白及VP2基因，规格为6孔×10条；
所述血清稀释液为即用型；
所述浓缩洗涤液为20倍浓缩；
所述底物显色液为即用型TMB显色液，10ml；
所述终止液为2mol/L的H2SO4溶液，10mL；
所述酶标单克隆抗体为：辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG多克隆抗体，使用前100倍稀释；
所述阳性对照为：经高温灭活的经疫苗免疫后的犬血清稀释液；
所述阴性对照为：经高温灭活的未患病，且未经疫苗免疫的犬血清稀释液。
2.如权利要求1所述的检测犬瘟热、犬细小抗原的ELISA检测试剂盒在检测犬瘟热、犬细小IgG抗原中的应用。
CN201710236570.4A 2017-04-12 2017-04-12 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒 Pending CN107014995A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710236570.4A CN107014995A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710236570.4A CN107014995A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107014995A true CN107014995A (zh) 2017-08-04

Family

ID=59446008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710236570.4A Pending CN107014995A (zh) 2017-04-12 2017-04-12 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107014995A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109342725A (zh) * 2018-11-29 2019-02-15 广州优迪生物科技股份有限公司 一种犬瘟热、犬细小病毒检测试剂盒
CN110568204A (zh) * 2019-06-10 2019-12-13 青岛海润检测股份有限公司 一种一步法定量检测犬瘟热病毒-犬细小病毒抗体的化学发光试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101236206A (zh) * 2008-01-17 2008-08-06 中国兽医药品监察所 一种猪肺炎支原体重组抗原elisa检测试剂盒
CN101413948A (zh) * 2008-11-13 2009-04-22 浙江大学 犬狂犬病病毒np-elisa抗体检测试剂盒
CN101533016A (zh) * 2009-04-15 2009-09-16 江苏省农业科学院 检测兔出血症病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN103757139A (zh) * 2014-02-17 2014-04-30 河南省动物疫病预防控制中心 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN106521036A (zh) * 2016-12-19 2017-03-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101236206A (zh) * 2008-01-17 2008-08-06 中国兽医药品监察所 一种猪肺炎支原体重组抗原elisa检测试剂盒
CN101413948A (zh) * 2008-11-13 2009-04-22 浙江大学 犬狂犬病病毒np-elisa抗体检测试剂盒
CN101533016A (zh) * 2009-04-15 2009-09-16 江苏省农业科学院 检测兔出血症病毒抗体的间接elisa试剂盒
CN103757139A (zh) * 2014-02-17 2014-04-30 河南省动物疫病预防控制中心 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN106521036A (zh) * 2016-12-19 2017-03-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重pcr检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.L. LITSTER ET AL: "Accuracy of a point-of-care ELISA test kit for predicting the presence of protective canine parvovirus and canine distemper virus antibody concentrations in dogs", 《THE VETERINARY JOURNAL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109342725A (zh) * 2018-11-29 2019-02-15 广州优迪生物科技股份有限公司 一种犬瘟热、犬细小病毒检测试剂盒
CN110568204A (zh) * 2019-06-10 2019-12-13 青岛海润检测股份有限公司 一种一步法定量检测犬瘟热病毒-犬细小病毒抗体的化学发光试剂盒
CN110568204B (zh) * 2019-06-10 2022-04-01 青岛海润检测股份有限公司 一种一步法定量检测犬瘟热病毒-犬细小病毒抗体的化学发光试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104862285B (zh) 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用
CN107102148A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其应用
CN104725490A (zh) 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒
CN102236017A (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接elisa试剂盒及其用途
CN106596966A (zh) 一种牛口蹄疫3abc抗体化学发光检测试剂盒
CN107219364A (zh) 检测a型副鸡嗜血杆菌抗体的间接elisa试剂盒及其检测方法及其应用
CN109232720A (zh) 一种口蹄疫O型病毒sIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
CN101016541A (zh) 一种生产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法
CN107014995A (zh) 一种犬瘟热、犬细小抗体的elisa检测试剂盒
CN105859883A (zh) 一种含OmpU抗体的免疫磁珠及其制备与捕获-多重PCR检测病原弧菌的方法
CN104280551A (zh) 鸭坦布苏病毒病e-elisa检测试剂盒及其制备方法
CN100526452C (zh) 一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用
CN104292311A (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用
CN106771237B (zh) 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的elisa试剂盒
CN108776221A (zh) 一种禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体同时检测的试剂盒
CN101303349B (zh) 一种猪囊尾蚴病间接elisa检测试剂盒及其制备方法
CN107356754A (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达及其ELISA试剂盒
CN102565392B (zh) 一种马链球菌兽疫亚种的酶联免疫检测试剂盒及检测方法
CN102286093A (zh) 一种嗜吞噬细胞无形体抗原及含有该抗原的试剂盒
CN107576791A (zh) 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒
CN104297493B (zh) 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备elisa试剂中的应用及其elisa试剂盒
CN107011417A (zh) 重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法
CN116840463A (zh) 大口黑鲈蛙虹彩病毒抗体胶体金试纸条及其制备方法和应用
CN104502588A (zh) 检测犬瘟热病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其制备方法
CN102841209A (zh) 一种以猪瘟病毒重组蛋白ns2建立的elisa试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170804

RJ01 Rejection of invention patent application after publication