CN104292311A - 用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用。所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明将PEDV主要表面抗原S蛋白在体外表达系统中分段表达，获得7个纯化的多肽抗原，从中筛选出1个多肽抗原，可用于检测PEDV中和抗体。所述的抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。所述抗原采用成熟表达系统生产，产量大易于后续中试及扩大生产，易于商品化。

Description

用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用。 
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea；PED)最早暴发于1971年英国架子猪及育肥猪群，其病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus；PEDV)。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus；TGEV)、猫冠状病毒、犬胃肠炎病毒和人冠状病毒229E同属冠状病毒科冠状病毒属1群。根据报道该病毒自然宿主仅为猪，也有报道显示PEDV可适应小鼠传代并具小鼠神经毒力。PEDV主要导致中大猪腹泻，1976年发现该病也可导致乳猪群发生急性腹泻。目前，PEDV导致仔猪发病的致病机理也已阐明，即仔猪接触病毒后在小肠内复制导致细胞变性，肠绒毛脱落，致使体内水分外排，猪只电解质紊乱，而PEDV针对较大猪的致病机理尚不十分清楚。 
欧洲对此病的报告主要集中于断奶猪或架子猪顽固性、重复发生的水样腹泻，其可造成生长迟滞，但死亡不常见。而在亚洲PEDV引起的腹泻致死率更为严重，且从临床上与典型的TGEV极为相似，暴发的特点是所有年龄的猪均发生水泻。新生仔猪因水泻和脱水而死亡，死亡率为50-100％。在韩国，该病呈全国性流行，几乎全年都可发生，但常发于寒冷季节。1992年1月至1993年12月之间，韩国兽医研究所诊断的71个病毒性肠炎病例中，56.3％确诊为PED，90％发病的仔猪日龄在10日龄以内；从1997年8月到1999年7月，韩国5个省份1258个肠道病例中，50.4％被诊断为猪流行性腹泻。日本在1993-1994年间以及在1996年报告了若干次发病，分别有14000和39000头新生仔猪死亡。在1996年冬天，日本9个县108个哺乳仔猪和育肥猪场发生PED，其中56256头仔猪中死亡39509头。 
我国于1980年首次分离到PEDV后，陆续有多地报道PED的流行。据王明等报道，近年来PED在我国流行面逐渐扩大，其对26个省、市、自治区的调查表明，PED的总死亡率占36种猪病总死亡率的1.74％。PEDV的发病呈现仔猪高死亡率、反复发病等新的特点，对国内养猪业造成重大经济损失。PEDV流行难以防控的主要原因在于其独特的局限性肠道上皮致病特点。 
胎儿上皮绒毛膜胎盘在母猪妊娠期形成，乳猪出生后其消化道在短短的几周内会经历一系列变化，采食初乳的24小时内，猪胃、胰腺、小肠会快速生长，乳猪要快速适应从胎盘营养到肠内营养的转变。而这一过程是复杂、快速突然的，在这一时期胎儿肠道具有特殊的生理特点，出生后48小时内的仔猪，其肠道能够直接摄取大量的大分子物质，肠道这种胞饮作用没有选择性，在出生后的48小时内逐渐停止(称作肠道关闭)。这一过程中一方面有利于大分子的免疫球蛋白的直接吸收，尽快通过被动免疫保护仔猪免受疫病侵扰；但同时也为抗原或致病性大分子的非特异吸收提供便利。此外，尽管仔猪出生时就存在免疫系统的分子成分，但在数量上和功能上都不成熟，同时胃肠道PH值等非特异屏障并没有完全建立使得病原分子更易乘虚而入。 
2010年到2012年PEDV暴发导致国内大量乳猪死亡，其死亡率与乳猪日龄呈反比，即1到4日龄乳猪感染后纠正病损的几率很小，仔猪越大死亡率会降低。根据上述初生乳猪生理特点可知，如果母猪带毒且病毒滴度较高，同时初乳中和抗体效价低，则PEDV在仔猪初生后48小时内可能经肠道非特异吸收、大量富集，导致肠道上皮细胞迅速脱落，最终导致仔猪脱水死亡。 
依据初生仔猪出生后特殊肠道生理特点，仔猪初生健康水平取决于母猪健康程度，根据已有文献可知母猪群体抗体水平的高低体现了猪群抵抗PEDV流行及发病能力的强弱，因此定期监测母猪抗体水平，特别是中和抗体水平是预防监测猪场PEDV流行趋势的重要手段。 
中和试验是检测PEDV中和抗体的金标准，但其操作繁琐，需要特殊的场地和仪器，不易应用于现地。有人将PEDV全病毒抗原作为包被抗原组装ELISA检测系统应用于现地检测，其结果与中和试验具有较高相关性。但以PEDV全病毒作为包被抗原，存在生物安全隐患。因此，研发安全、有效的用于检测PEDV中和抗体的抗原，是本领域的研究重点。 
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，本发明提供了用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用。 
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 
用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。 
上述抗原的制备方法，包括如下步骤： 
①将PEDV毒株主要抗原基因依据冠状病毒抗原区域及接头覆盖原则分段，其3’端为载体His标 签，重组基因片段均通过特异性引物从PEDV毒株基因组中扩增而来； 
②将扩增得到的基因及所带标签基因克隆至载体质粒内，获得相应的重组质粒；大量繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中表达目的蛋白； 
③利用Ni离子层析柱纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE及Western-blot确定目的蛋白的表达及纯化，获得纯化的多肽抗原。 
优选地，当步骤②中使用的表达系统为原核表达系统时，具体步骤为：将扩增得到的基因片段插入原核表达载体pET32a相应酶切位点处，经PCR筛选及测序，筛选出阳性重组子；用重组质粒转化BL21大肠杆菌感受态细胞，通过LA琼脂板及PCR鉴定含重组质粒的工程菌；将重组菌接种至LA培养基之后待菌液OD至0.6～0.8时，以异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂诱导重组蛋白表达。 
上述抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。 
本发明采用主要抗原蛋白部分重叠分段表达技术，应用不同表达系统生产安全、纯净的PEDV中和抗体检测抗原。本发明将PEDV主要表面抗原S蛋白在体外表达系统中分段表达，获得7个纯化的多肽抗原，从中筛选出1个多肽抗原，可用于检测PEDV中和抗体。应用该多肽抗原作为间接ELISA包被抗原，可大规模检测猪群PEDV中和抗体。 
本发明用于检测PEDV中和抗体的抗原及其制备方法和应用具有明显的优点和有益效果： 
(1) PEDV刺激机体产生抗体的主要结构蛋白为S蛋白，过去认为不同毒株S蛋白存在差异大、变异快的特点，因此常以全病毒及保守蛋白作为抗体检测包被抗原，全病毒存在制备及特异性问题，而保守蛋白由于并非病毒的主要抗原蛋白，因此不适用于检测群体抗病毒性抗体。SP4位于PEDV主要抗原基因S上，同时具备了稳定及特异两方面特点，可以用来评估群体免疫状态。 
(2) 利用现地背景未知血清进行中和试验可以较好的模拟不同片段应用于现地的情况，结果显示以SP4作为间接ELISA方法包被抗原可以很好地鉴别高抗体水平样品及低抗体水平样品。 
(3) 抗原蛋白采用成熟表达系统生产，产量大，易于后续中试及扩大生产，易于商品化。 
附图说明
图1为PEDV S蛋白分段表达示意图。 
图2为SP1-SP7核酸电泳图。 
图3为IPTG诱导SP1-SP7表达的SDS-PAGE电泳图。 
图4为纯化的SP1-SP7的SDS-PAGE电泳图。其中，M：Marker；泳道1-7分别代表SP1-SP7的SDS-PAGE电泳条带。 
图5为纯化的SP1-SP7的Western-blot鉴定图。其中，M：Marker；泳道1-7分别代表SP1-SP7的SDS-PAGE电泳条带。 
图6不同抗原ELISA检测结果与中和实验相关性分析。 
图7为不同抗原ELISA检测结果ROC曲线分析。 
图8为SP4真核表达抗原Western-blot鉴定结果。 
图9为SP4真核表达抗原ELISA检测结果ROC曲线分析。 
图10为不同毒株SP4蛋白变异情况示意图，其中星号所示为常用疫苗毒株。 
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例作进一步说明。如无特殊说明，本发明中的方法、试剂都是本领域的常规方法、试剂。 
本发明根据已鉴定的PEDV抗原表位，并参考其它冠状病毒抗原表位的分布，将PEDV的S1基因及部分S2基因分成7段，在体外表达系统中对7段基因片段进行表达，获得7个多肽抗原。分别以7个多肽抗原为包被抗原建立检测PEDV的间接ELISA方法。同时用这7个不同抗原的ELISA方法和病毒中和试验对156个猪血清样品进行检测。比较ELISA检测结果和病毒中和试验结果，根据ELISA结果与中和试验结果的相关性，筛选出适合的多肽抗原。 
首先，根据PEDV及冠状病毒抗原表位分布，确定主要抗原表位分段策略，考虑到多肽抗原接头部分存在未知抗原位点的可能性，不同抗原片段之间有部分重合。分段策略见图1，图1中列出了不同多肽抗原在S蛋白上的相对位置。 
然后，按照不同表达系统表达蛋白的方法，将各分段基因及所带标签基因，克隆至表达系统的载体质粒内，获得相应的重组质粒。大量繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中。通过宿主细胞表达目的蛋白，利用所带标签及其相关纯化技术纯化目的蛋白，应用PEDV高免阳性血清及阴性对照血清完成不同片段间接ELISA的系统构建。以中和试验结果为金标准依据相关系数(r)判断不同系统结果与其接近程度完成片段的筛选。 
实施例1 
1、PEDV S1及部分S2基因分段重组基因的扩增 
(1)PEDV部分S基因分段策略及其合成 
根据软件预测S蛋白信号肽，分段表达时需去掉信号肽。依据PEDV已鉴定抗原区域差别性分段原则，将PEDVS1及部分S2基因分为7段，分别命名为SP1-SP7，所述SP1-SP7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-7所示，所述SP1-SP7的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8-14所示(见表1)。同时SP5-SP7还兼具补全接口的作用。上述7个片段均在3’端加入His标签基因。 
表1 SP1-SP7核苷酸序列及氨基酸序列 
(2)PEDV RNA抽提和RT-PCR 
PEDV RNA的抽提按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书(方法)进行。分别取250μL猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)GDS01毒株感染细胞冻融液和750μL TRIzol LS，加入1.5mL微量离心管内，用吸管吹打充分混匀，室温放置10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5分钟后，4℃下12000rpm离心15min；取上清于一新的灭菌1.5mL离心管内，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温放置10min，在4℃下12000rpm离心10min；倾去上清，沉淀中加入70％的乙醇750μL，轻轻混匀，洗涤一次，4℃下12000rpm离心15min，弃去上清，风干；加入10μL用DEPC水处理的无RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA(沉淀)，直接用于RT-PCR或-80℃保存备用。 
参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行RT-PCR。在20μL反应体系中分别加入以下组分：RNA：3μL；5×RT buffer：4μL；dNTPs：4μL；RNA酶抑制剂：0.5μL；引物UP：1μL；引物DN:1μL；AMV：2μL；DEPC水：补至20μL。混匀后，室温放置10min，42℃保温1h，冰浴2min，RT产 物直接用于PCR扩增或-20℃保存。 
所述猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)GDS01毒株已进行了保藏，保藏编号为：CCTCC V201428，保藏日为2014年9月4日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称为CCTCC，保藏地址为武汉市武昌珞珈山。 
(3)SP1-SP7分段融合基因的PCR扩增 
采用SP1-SP7各自特异性引物(见表2)，将上述反转录的产物直接用作PCR扩增SP1-SP7基因的模板。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，最后延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭，EB)电泳检测，结果如图2所示，各抗原的PCR扩增条带大小如下： 
SP1：711bp；SP2：906bp；SP3：783bp；SP4：522bp；SP5：636bp；SP6：723bp；SP7：705bp。 
表2 SP1-SP7扩增引物序列 
所有的PCR产物样品经电泳凝胶抽提后，获得纯化的SP1-SP7基因DNA片段，经限制性内切酶Kpn  I/Xhol I 37℃分别消化后，再进一步纯化，以备下一步构建重组质粒用。具体操作如下：制备1％琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)，将所有PCR样品加入凝胶的样品槽内，设置电压100V，电泳时间40min在长波紫外灯下，切下含有样品带的凝胶条，装入小塑料离心管中。参照胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)说明书，抽提纯化SP1-SP7基因DNA片段。经限制性内切酶37℃过夜消化后，用胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)，按照说明指导，离心过柱，纯化回收酶切消化后的SP1-SP7片段。 
2、构建表达SP1-SP7基因的原核表达质粒及在大肠杆菌中合成重组蛋白 
(1)构建表达SP1-SP7基因的重组质粒 
原核表达质粒pET32a(Novagen公司产品)经限制性内切酶Kpn I/Xhol I在37℃酶切过夜后，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒pET32a。在T4DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的SP1-SP7DNA片段于16℃连接过夜。反应体系如下：10×T4连接缓冲液1ul，SP1-SP7酶切回收的DNA片段3mL，酶切pET32a质粒回收产物3ul，T4DNA连接酶1ul，ddH2O补至10ul。采用热休克方法将连接产物转导入DH5α感受态细胞中加入到一小塑料离心管中，轻轻混合后将小管置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上5分钟，向其中加入200ulLB培养液。37℃摇床培养1小时。取100ul菌液涂布于LB固体培养基(含有氨苄霉素抗生素)上，37℃培养16h，从平板上挑取阳性克隆菌落，进行菌液PCR，抽提质粒后经DNA序列测定后，获得重组质粒pET32a-SP1—pET32a-SP7。 
(2)表达SP1-SP7基因工程菌株的制备 
将纯化的重组pET32a-SP1、pET32a-SP2、pET32a-SP3、pET32a-SP4、pET32a-SP5、pET32a-SP6、pET32a-SP7质粒分别转导入E.coli感受态细胞株BL21细胞中(美国Novagen公司产品)。具体步骤为：采用热休克方法将连接产物转导入BL21感受态细胞中，将连接产物和BL21感受态细胞加入到一小塑料离心管中，轻轻混合后置于冰上30min，转入42℃水浴中热休克90s，迅速放回冰上5分钟，向其中加入200ulLB培养液。37℃摇床培养1小时。取100ul菌液涂布于LB固体培养基(含有氨苄霉素抗生素)上，37℃培养16h，从平板上挑取阳性克隆菌落，进行菌液PCR，获得含重组质粒pET32a-SP1—pET32a-SP7的表达工程菌株，之后甘油保菌冻存备用。 
(3)分段重组蛋白的表达及可溶性分析 
将上述重组表达菌液以1％的菌液量接种于LB/Amp液体培养基中，37℃振荡培养2h(菌液OD600达到0.4-0.6)时，取1mL未诱导的菌液另行培养，向其余菌液中加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，继续剧烈振荡培养4h，取IPTG诱导后菌液1mL，12000rpm离心1min，弃上清，加入100μL 1×PBS悬浮菌体， 加入25μL 5×Loading Buffer；沸水煮4-8min，以完全裂解细胞并使蛋白变性。取5-10μL上样，进行SDS-PAGE垂直电泳检测。分离胶配制好后，小心加入玻璃板中，注意不要产生汽泡。胶的高度以距梳孔下边缘1cm处为宜。缓慢加水密封，盖过胶面即可，注意使液面平整。室温聚合30-60min，胶凝固后，与水相之间有一条明显的分界线。将分离胶上的水倒去并用滤纸吸干，然后沿垫片边缘缓缓加入浓缩胶，插入1.0mm厚的梳子，室温聚合15-30min。待浓缩胶凝固后，将梳子和塑胶条取出，固定到电泳装置中，并加入足量的1×Tris-Gly电泳缓冲液。小心加入l0μL已处理好的蛋白样品和蛋白质Marker，空置的孔加等体积的空白1×SDS凝胶加样缓冲液，以防止相邻泳道样品的扩散。60V恒压电泳，当溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶时，将电压调至120V继续电泳，直至澳酚蓝到达凝胶的底部。取下凝胶，在左下角做好标记，浸泡于考马斯亮蓝R-250染色液中染色2h后，然后放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰(图3)。 
根据诱导条件在500mL LB液体培养基中诱导表达融合蛋白，250rpm，16℃振荡培养24h；4000rpm，4℃，10min离心收集菌体；在预称重的离心管中用50mL PBS洗涤沉淀，去除上清后称重，每克菌体湿重加入5mL PBS试剂；用超声波裂解菌体(功率为400W，5s/次，间歇5；共计30次)，确定蛋白的表达形式为包涵体，离心收集包涵体。 
3、分段重组蛋白的纯化、鉴定及复性 
(1)重组蛋白的纯化 
包涵体溶于8mol/L尿素，50mmo1/L Tris-HCl(pH 8.0)中后，上清液用0.45μm滤膜过滤，以备上镍螯和亲和层析柱用。具体步骤如下：用3-5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子以除去柱子中的酒精。用至少5倍柱体积的Binding Buffer 20mM Na3PO4、0.5M NaCl、咪唑(2040mM)，pH 7.4平衡柱子，流速1mL/min。用至少5倍柱体积的含8mol/L尿素的Binding Buffer(20mM Na3PO4、0.5M NaCl、2040mM咪唑)，pH7.4平衡柱子，流速1mL/min。用Φ0.45μm虑膜过滤的上清液，通过注射器上样。用至少10-15倍柱体积的含8mol/L尿素的Binding Buffer冲洗柱子，直到样品被柱子完全吸附。用含8mol/L尿素的Elution Buffer通过线形梯度，冲洗柱子，并收集纯化的蛋白产物。咪唑的浓度设定为：0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.3mM、0.5mM，洗脱条件20mM Na3PO4、0.5M NaCl、咪唑(0.05-0.5mM)，pH 7.4来检测洗脱目标蛋白的最佳咪唑浓度。用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。用5倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，来调整柱子的pH值。用20％的酒精冲洗柱子，并保存。洗脱样品用SDS-PAGE进行分析鉴定(图4)。 
(2)纯化后重组蛋白的Western-blot鉴定 
SDS-PAGE电泳实验操作如下：分别取10ul样品，再各自加入10ul的2×SDS上样缓冲液。100℃处 理5min后，将所有20ul的混合样品加入4％-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4℃，时间3小时，当蓝色指示剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。电泳结束后进行电转移至聚偏二氟乙烯膜PVDF(Millipore，Φ0.45μm)。Western印迹分析按试剂盒(Invitrogen)说明书操作。鼠抗6His单克隆抗体1:3000用1×封闭液稀释。样品经SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶及与之相同大小的1张3MM棉滤纸(Bio-Rad)浸泡于转移缓冲液中，并事先将与凝胶相同大小的PVDF膜(用前先用甲醇浸泡15s，然后清水中洗2min)置于转移缓冲液中浸泡30min以上，然后按由负极到正极的顺序将滤纸、凝胶、膜、滤纸一次叠放，用玻璃棒排空每层间的气泡，在两面均分别盖上海绵和具有气孔的有机玻璃板，夹紧，置于装满转移缓冲液的电泳槽中以15V或300mA电泳1h左右，使凝胶上的蛋白完全转移到膜上。从转移装置上取下吸附了蛋白的膜，用3％BSA/TBS室温封闭2h或4℃封闭过夜；弃去封闭液，用洗涤液漂洗3次，每次5min；加入3000稀释后的鼠抗6His单克隆抗体10mL，4℃过夜；弃去抗体，在室温条件下，用洗涤液漂洗3次，每次5min；加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温下轻轻摇动孵化1h；将显色液(Thermo)滴于膜上，上机曝光扫描实验结果(图5)。 
(3)重组蛋白的透析复性 
经层析纯化后的目的蛋白含有变性剂尿素，需透析复性，步骤如下：将蛋白装入透析袋中，分别用1mol/L尿素复性液(1mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，100μmol/L ZnCl2，pH 8.0)，0.5mol/L尿素复性液(0.5mol/L尿素，50mmo1/L Tris-HCl，100μmol/L ZnCl2，pH 8.0)，0.1mol/L尿素复性液(0.1mol/L尿素，50mmol/L Tris-HCl，100μmo1/L ZnCI2，pH 8.0)以及10mmol/L PBS(pH 8.0)溶液于4℃分4次经48h逐步透析复性。 
4、血清样品的分离及间接ELISA操作程序 
(1)血清样品的分离 
将血液分装在2mLEP管中室温静置2h或4℃过夜沉淀红细胞分离血清。分离的血清存于-20℃备用。 
(2)间接ELISA操作程序 
包被抗原：SP1-SP7抗原用包被缓冲液稀释至适当浓度，4.13μg/孔，4℃包被过夜； 
洗涤：1×PBST洗板3次，每次5min； 
封闭：用封闭液进行封闭，200μL/孔，37℃静置1h； 
洗涤：1×PBST洗板3次，每次5min； 
孵育一抗：待检血清用稀释缓冲液稀释至适当浓度，100μL/孔加入，37℃静置1h(同时设置阳性对照， 
阴性对照以及空白对照孔)； 
洗涤：1×PBST洗板3次，每次5min； 
孵育二抗：HRP-羊抗猪IgG二抗用稀释缓冲液稀释至1:5,000，100μL/孔加入，37℃孵育1h； 
洗涤：1×PBST洗板3次，每次5min； 
TMB显色：加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/孔，37℃作用10min； 
终止反应：加入终止液2mol/L硫酸，50μL/孔； 
酶标仪测定：OD450nm值。 
结果判定：P约等于1.0；P/N>2，证明系统成立。 
5、结果 
诱导前后SDS-PAGE电泳(图4)显示SP1-SP7蛋白成功表达，经Ni离子纯化后蛋白经Western-blot验证显示纯化蛋白为表达蛋白且纯化效果较好(图5)。为了验证抗原的检测效果，将相应血清样品进行中和试验。病毒中和试验操作参照Hoffman等方法进行，不同血清效价水平见表3。 
表3 156份血清样品中和实验结果 
*中和效价(SN)以血清测定对数表示。 
不同抗原片段的ELISA结果与中和试验数据相关性分析是在两项数据符合正态分布的基础上应用统计学箱法去除掉个别明显错误的数据之后按照直线相关性方法进行统计分析(图6)，其中SP1-SP7相关系数(r)分别为：SP1：0.3810；SP2：0.5151；SP3：0.4663；SP4：0.6113；SP5：0.3596；SP6：0.5384；SP7：0.2660。其后以1:8为中和抗体阴阳性阈值，采用受试者回归曲线(ROC)判断不同片段ELISA系统区分检测样品的可靠性，依据线下面积(AUC)来评估系统的成熟度。如图7所示，不同系统的线下面 积(AUC)分别为：SP1：0.6863；SP2:0.7249；SP3：0.7379；SP4：0.8538；SP5：0.5729；SP6：0.7262；SP7：0.6085。其中SP4作为包被抗原组装ELISA系统时，其AUC值接近0.9符合AUC对诊断方法的要求。 
如表4所示，SP4的ELISA检测结果可以很好区分高滴度中和抗体样品和低滴度中和抗体样品，当SP4蛋白片段具备作为群体初筛中和抗体检测抗原时可以较好将猪群按滴度进行分类，避免高抗体水平猪只重复免疫导致抗体中和猪只不能得到有效保护，与此同时及时筛选鉴别出低抗体水平猪只及时补免可有效控制PEDV在猪群的传播，因此本发明符合群体初筛用试剂要求。 
表4 不同中和效价样品与SP4ELISA检测结果符合率 
*中和效价(SN)以血清测定对数表示。 
实施例2 
1、SP4基因的扩增 
本部分内容与实施例1基本相同，仅SP4特异性引物不同。将实施例1中SP4上下游引物的酶切位点互换，得到本实施例中的SP4F’与SP4R’以适应真核表达质粒pFastBacDual p10启动子下游酶切位点要求。所述SP4F’的序列为：GCCTCGAGATGAGTATTAGGACAGAATATTTACAGCTT，所述SP4R’的序列为：GCGGTACCACTATACATATGAAGCTTCTCAGCGTC。 
2、构建表达SP4基因的真核表达质粒及在昆虫细胞sf9中合成重组蛋白 
(1)构建表达SP4基因的重组质粒 
真核表达质粒pFastBacDual(Invitrogen)酶切、连接及重组质粒大量制备过程见实施例1中原核表达载体构建过程，最后获得重组质粒pFastBacDual-SP4。 
(2)重组杆粒Bacmid的构建 
将重组质粒pFastBacDual-SP4转化DH10Bac感受态细胞，DH10Bac含有AcMNPV杆状病毒基因组及转座辅助质粒，通过三抗(Gen、Kan和Tet)、X-Gal、IPTG平板筛选获得携带SP4片段的重组杆粒rBacmid-SP4。 
(3)转染及感染 
首先将5μg纯化的rBacmid-SP4与6μL转染试剂CellfectinR II Reagent(Invitrogen)加至210μl无血清Grace培养基中混匀。将混合液加至六孔板单孔中，孔内细胞密度为8×105。在27℃条件下孵育4小时后弃掉上清换为含血清的Grace培养基后继续在27℃温箱中培养指导90％细胞出现细胞病变。收集细胞上清收获重组病毒rB-SP4并应用噬斑纯化技术三次纯化rB-SP4。 
(4)SP4重组蛋白的制备及纯化 
Sf9细胞感染rB-SP4重组病毒后继续培养72小时，收获感染细胞经超声破碎、及低速离心去除细胞碎片后得到澄清上清。上清用Ni离子层析柱纯化，除所用试剂均不添加变性剂尿素外，其他部分与实施例1相同。 
(5)纯化后重组蛋白的Western-blot鉴定 
真核表达蛋白量常低于原核表达，因此纯化后通过Western-blot实验方法鉴定表达蛋白，实验方法与实施例1相同，结果如图8所示。 
(6)重组蛋白的透析 
经层析纯化的目的蛋白含有高浓度咪唑，需透析去除，步骤如下：将蛋白装入透析袋中，用PBS溶液进行一次过夜透析。 
3、间接ELISA操作程序 
真核表达抗原间接ELISA操作程序与实施例1中间接ELISA相同，真核抗原包被ELISA同为4.13μg/孔。 
真核蛋白表达系统是在原核筛选的基础上考察表达、纯化SP4的可行性，真核表达鉴定结果如图8所示，结果表明SP4蛋白在Sf9细胞成功表达，应用已测中和抗体血清样品针对真核表达蛋白组装ELISA系 统进行ROC测试结果证明AUC值大于0.4符合AUC对诊断试剂的要求(图9)。 
PEDV刺激机体产生抗体的主要结构蛋白为S蛋白，过去认为不同毒株S蛋白存在差异大、变异快的特点，因此常以全病毒及保守蛋白作为抗体检测包被抗原，全病毒存在制备及特异性问题，而保守蛋白由于并非病毒的主要抗原蛋白，因此不适用于检测群体抗病毒性抗体。SP4位于PEDV主要抗原基因S上，同时具备了稳定及特异两方面特点，可以用来评估群体免疫状态。本发明筛选到的SP4重组多肽抗原，其序列在不同毒株之间变异小(图10)，将其作为包被抗原进行间接ELISA试验，所得结果与中和试验呈显著相关。采用成熟表达系统生产抗原蛋白，产量大，易于后续中试及扩大生产，易于商品化。 
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (4)

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.权利要求1所述的抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
①将PEDV毒株主要抗原基因依据冠状病毒抗原区域及接头覆盖原则分段，其3’端为载体His标签，重组基因片段均通过特异引物从PEDV毒株基因组中扩增而来；
②将扩增得到的基因及所带标签基因克隆至载体质粒内，获得相应的重组质粒；大量繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中表达目的蛋白；
③利用Ni离子层析柱纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE及Western-blot确定目的蛋白的表达及纯化，获得纯化的多肽抗原。
3.根据权利要求2所述的抗原的制备方法，其特征在于：当步骤②中使用的表达系统为原核表达系统时，具体步骤为：将扩增得到的基因片段插入原核表达载体pET32a相应酶切位点处，经PCR筛选及测序，筛选出阳性重组子；用重组质粒转化BL21大肠杆菌感受态细胞，通过LA琼脂板及PCR鉴定含重组质粒的工程菌；将重组菌接种至LA培养基之后待菌液OD至0.6～0.8时，以异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂诱导重组蛋白表达。
4.权利要求1所述的抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。
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