CN101955942A - 编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用。编码猪α-干扰素的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-501位。表达猪α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。本发明还公开了利用表达猪α-干扰素的重组菌生产猪α-干扰素蛋白的方法。本发明的编码猪α-干扰素的DNA分子适合在大肠杆菌中表达。本发明的猪α-干扰素，对猪是安全的；对仔猪日增重、生长猪料重比、受孕母猪生产繁殖性能无不良影响；对确诊的临床PED感染具有明显的治疗效果。接种猪α-干扰素的猪生活环境中没有抗性基因残留。

Description

编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码猪α-干扰素的DNA分子和重组大肠杆菌及其应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是多功能细胞因子家族中的一员，是由具有正常生理功能的细胞在适宜的诱生剂的作用下产生的、能抑制病毒增殖的一类糖蛋白，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖、调节功能性细胞活性及对细胞分化与免疫的进行调控等方面的多种生物学功能。根据干扰素的细胞来源、生化特性及其生物学活性的差异，可分为I型和II型两大类型：其中I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-τ4个亚型，主要是由白细胞或成纤维细胞在病毒诱导下分泌的；II型干扰素主要有IFN-γ，一般不是由病毒诱导产生，而是由被PHA、ConA等抗原物质激活的T细胞和NK细胞合成的。

近年来重组DNA技术迅速发展，已广泛应用于各种生物制品的生产，基因工程重组人α-干扰素就是应用重组DNA技术生产的最早的蛋白药品之一，也是当今我国能自主生产的少数基因工程药物之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种适合在大肠杆菌中表达的编码猪α-干扰素的DNA分子。

本发明所提供的编码猪α-干扰素的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-501位。

本发明的编码猪α-干扰素的DNA分子，按照大肠杆菌密码子偏嗜性进行改造，适合在大肠杆菌中表达。

本发明的目的是提供一种遗传稳定、重组蛋白表达稳定的表达猪α-干扰素的重组菌。

本发明所提供的表达猪α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

本发明的表达猪α-干扰素的重组菌在有选择压力下经过传代培养重组菌含质粒率均在96％以上，在无选择压力下连续传代5代时质粒丢失率小于5％，经诱导表达后，目的蛋白表达量稳定，复性后蛋白的抗病毒活性均在1.0×10⁹U/mg以上。表达猪α-干扰素的重组菌表达、制备的猪α-干扰素中不存在重组质粒。

本发明的另一个目的是提供一种生产猪α-干扰素蛋白的方法。

本发明的生产猪α-干扰素蛋白的方法，包括如下步骤：

将表达猪α-干扰素的重组菌进行发酵罐发酵培养，诱导表达猪α-干扰素，收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，洗涤包涵体，离心收集包涵体；

用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，离心收集上清；

采用His-蛋白质镍亲和层析树脂纯化上清，收集目的蛋白峰；

测定收集的蛋白浓度，在冰水浴或者2℃-8℃的条件下，将收集的蛋白加入到复性液中使蛋白质浓度在75-150μg/mL L，2℃-8℃静置复性20-24小时，获得猪α-干扰素蛋白；所述复性液中盐酸胍0.3-1.0mol/L、尿素0.5-2.0mol/L、精氨酸0.1-1.0mol/L、还原型半胱氨酸1.0-7.0mmol/L、氧化型胱氨酸0.1-2.0mmol/L、Tris-HCl 10-20mmol/L(pH8-11)、EDTA 1.0-5.0mmol/L(pH8.0)；所述表达猪α-干扰素的重组菌是是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

本发明的再一个目的是提供一种猪α-干扰素蛋白注射液。

本发明所提供的猪α-干扰素蛋白注射液，其活性成分为上述生产猪α-干扰素蛋白的方法制备的猪α-干扰素蛋白的PBS溶液或者生理盐水溶液。

其中，还可含有适宜浓度的佐剂、稳定剂。如浓度为1～10％的葡萄糖或蔗糖，0.1～2.5％的甘露醇或山梨醇及适量浓度的甘油、氯化钠等。

本发明的生产猪α-干扰素蛋白的方法获得的α-干扰素蛋白能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用，生物学活性均在1.17×10⁹U/mg以上。

本发明的猪α-干扰素，对猪是安全的；对仔猪日增重、生长猪料重比、受孕母猪生产繁殖性能无不良影响；对确诊的临床PED感染具有明显的治疗效果。接种猪α-干扰素的猪生活环境中没有抗性基因残留。

附图说明

图1为重组猪IFN-α的标准曲线。

具体实施方式

实施例

(一)猪α-干扰素基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达与复性

IFN-α成熟肽基因：根据大肠杆菌偏嗜密码子优化、改造后由大连宝生物公司合成。其核苷酸序列为序列表中的序列1，包括501个碱基，第1-498位编码166个氨基酸，含有4个半胱氨酸残基，分别位于表达蛋白的第13、41、111和151位，其中成熟肽序列理论分子量为19KDa。

通过BamH I+Hind III双酶切含有合成poIFN成熟肽序列的克隆质粒和pQE30载体，琼脂糖电泳回收约相应片段进行连接，构建pQPA23P重组表达质粒，取鉴定后的阳性pQPA23P重组质粒转化M15(pREP4)，获得重组大肠杆菌MPIA23。

重组大肠杆菌MPIA2337℃振荡培养。当OD₆₀₀在0.4～0.6时加入IPTG，37℃继续培养4.5-6h，进行诱导表达。培养结束后，取菌体离心，收集菌体沉淀用10mmol/L Tris-HCl-1mmol/L EDTA悬浮后，加样缓冲液煮沸裂解变性5min后直接用于15％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。染色结束后，用双波长非点扫描仪，对上述SDS-PAGE电泳蛋白带进行凝胶薄层扫描。

以pQE30载体转化菌为阴性对照，诱导菌株在分子量20kD处可见一特异蛋白带。蛋白可溶性试验表明，该菌株所表达的蛋白为不溶性包涵体，双波长非点凝胶薄层扫描对SDS-PAGE电泳蛋白带进行扫描结果表明，特异的蛋白可占菌体总蛋白的47.6％。

取发酵培养并诱导的重组大肠杆菌MPIA23培养物4℃5000g离心15min，收集菌体，重悬于TE[10-50mmol/L Tris HCl(pH8.0)，1-5mmol/L EDTA]中，置4℃备用，或离心后将沉淀-20℃保存，使用时再用TE1重悬。将上述菌液于60-100Mpa压力下破碎二次。先低速离心去杂质后再高速离心收集包涵体，并依次用含1-5％TritonX-100的TE溶液、2-4mol/L尿素的TE溶液和1-3mol/L盐酸胍缓冲溶液对获得的包涵体进行洗涤，6000-10000g离心后收集的沉淀即为初步纯化的表达干扰素包涵体。最后用含有5-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，6000-10000g离心后收集上清即为表达猪IFN-α的变性液。

采用His-蛋白质镍亲和层析树脂对表达猪IFN-α的变性液进行进一步纯化。采用胱氨酸-半胱氨酸再氧化法对纯化后的包涵体变性液利用分段稀释法进行复性。具体的操作如下：利用BCA Protein Assay Kit测定上述变性液的蛋白浓度，然后在冰水浴或者2℃-8℃的条件下，将上清加入到复性液中使蛋白质浓度在75-150μg/mL，2℃-8℃静置复性20-24小时，获得猪α-干扰素蛋白；所述复性液中盐酸胍0.3-2.0mol/L、尿素0.5-2.0mol/L、精氨酸0.1-1.0mol/L、还原型半胱氨酸1.0-7.0mmol/L、氧化型胱氨酸0.1-2.0mmol/L、Tris-HCl 10-50mmol/L(pH8-10)、EDTA 1.0-5.0mmol/L(pH8.0)；使蛋白质浓度在75-150μg/mL之间。将复性液2℃-8℃静置复性20-24小时，0.45μm滤膜过滤后测定复性蛋白的抗病毒活性。复性完成后，采用细胞病变抑制法(以MDBK-VSV为检测系统)测定复性液的抗病毒活性(效价测定)制备MDBK细胞悬液，细胞计数后滴加96孔板。待MDBK细胞在96孔板上生长成单层后，去除生长液，每孔加入10倍倍比稀释的干扰素100μL，每个稀释度接6孔，37℃孵育过夜培养后，弃去处理液，加入100μL 100TCID₅₀的水疱性口炎病毒(VSV)进行病毒接种，37℃培养1d～2d，待对照孔细胞全部发生明显的细胞病变(CPE)时在倒置显微镜下观察结果，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位(1U)。

多次活性检测结果表明，重组IFN在MDBK细胞上表现出较高的抗病毒活性，能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用。复性后的重组猪IFN-α生物学活性均在1.17×10⁹U/mg以上。

(二)重组猪IFN-α制备的稳定性试验

1)质粒在重组大肠杆菌MPIA23中的遗传稳定性

将37℃振荡培养过夜的重组大肠杆菌MPIA23，按1％接种于100mL含Kan(30μg/mL)和Amp(50μg/mL)的LB培养基中，37℃继续培养12h。将上述培养物稀释10⁶倍，在含Kan(30μg/mL)和Amp(50μg/mL)的LB培养基中37℃培养12h，适当稀释后，取100μL菌液涂种于LB琼脂平板上。37℃过夜培养后，随机挑取100个单菌落，转种在含Kan+Amp的LB琼脂平板上，37℃过夜培养并进行菌落计数，同时取相应指定代次的菌落进行PCR鉴定。

在200μl的Ep管中加入5μl 10×PCR反应缓冲液，4μl 40mM dNTP，上、下游引物各1μl(20pmol/L)，菌落模板适量，0.5μl Taq(5units/μl)，补ddH2O至50μl。反应条件如下：95℃预变性2min；循环反应：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。同时设置为相应的阴性、阳性对照，扩增产物在1.2％琼脂搪凝胶上电泳检测。

按照该法测定的重组大肠杆菌菌株MPIA23P的含质粒率均在98％以上。生长菌落PCR扩增均能获得约500bp的特异性片段。

2)无选择压力下连续传代的质粒遗传稳定性

将含Kan(30μg/mL)和Amp(50μg/mL)的LB培养基中37℃振荡培养过夜的菌体，按5％接种于100mL不含Kan和Amp的LB培养基，振荡培养18-20h，连续培养5代后，适当稀释，取100μL菌液涂种于普通LB琼脂平板上过夜培养，然后随机挑取100个单菌落，转种在含Kan和Amp的LB琼脂平板上，37℃过夜培养并进行菌落计数。

试验结果表明，重组大肠杆菌菌株MPIA23P在无选择压力下连续传代5代时质粒丢失率小于5％。

3)重组菌株MPIA23P发酵培养及猪α-干扰素表达的稳定性试验

将重组菌株MPIA23P的种子批、第10和20代时的菌种接种含Kan(30μg/mL)和Amp 50μg/mL)的LB培养基200mL或者500mL，37℃过夜培养后接种100mL摇瓶、7L GBJL-AUTOBIO2000型自动机械搅拌玻璃发酵罐发酵或者30L全自动机械搅拌发酵罐发酵培养。当OD₆₀₀约为1.0时加入终浓度为1-10mmol/L的IPTG，37℃继续培养4-9h，进行诱导表达。培养结束后，取表达菌体离心，称重，计算每升发酵液的湿菌体收获量。取部分收集菌体沉淀用10mmol/L Tris-HCl悬浮后，加样缓冲液煮沸5min后直接于15％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，观察表达情况。染色结束后，用双波长非点扫描仪，对上述SDS-PAGE电泳蛋白带进行凝胶薄层扫描。

收获培养物制备样品进行SDS-PAGE和薄层扫描分析，目的蛋白表达量应符合原始菌种的表达量，稳定在15％-20％，且与原始菌株表达图谱一致。

将重组菌株MPIA23P的第10、20和30代时的菌种经IPTG进行诱导培养5h后，收获培养物制备样品进行SDS-PAGE和薄层扫描分析，目的蛋白表达量稳定，特异的表达蛋白可占菌体总蛋白的20％以上，符合原始菌种的表达量，且与原始菌株表达图谱一致。

4)重组大肠杆菌表达猪α-干扰素的复性与活性检测

将上述收集菌体重悬后用超高压匀质对菌体进行破碎，按已经建立的方法进行包涵体分离、纯化后，最后用含有7mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，8000g离心后收集上清即为表达的重组基因干扰素变性液，BCA法测定变性液中的蛋白质浓度。测定蛋白质浓度后变性液采用胱氨酸-半胱氨酸再氧化法对纯化后的包涵体变性液通过分段稀释法进行复性。复性后采用细胞病变抑制法(以MDBK-VSV为基本检测系统)测定复性液的抗水疱性口炎病毒(VSV)的抗病毒活性检测(效价测定)。

多次活性检测结果如表4表明，采用该复性方法复性后的重组IFN在MDBK细胞上表现出相应较高且稳定的抗病毒活性，能够有效地抑制VSV病毒对细胞的破坏作用，复性后的重组猪IFN-α生物学活性均在1.0×10⁹U/mg以上。

5)重组大肠杆菌表达猪α-干扰素中重组质粒pQPA23P的检测

将上述复性液所留样品取样利用poIFN-α两端的引物

A1P1：5’-CGGATCCTGTGACCTGCCGCAGACCCACA-3’

A1P2：5’-CGAAGCTTTTACTCCTTCTTGCGCAGACG-3’；

对目的基因或者包含目的基因的片段进行PCR扩增。

在200μl的Ep管中加入5μl 10×PCR反应缓冲液，4μl 40mM dNTP，上、下游引物各1μl(20pmol/L)，待检复性液1μl，0.5μl Taq(5units/μl)，补ddH₂O至50μl。反应条件如下：95℃预变性2min；循环反应：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；最后在72℃下再延伸10min。同时设置为相应的阴性、阳性对照，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，与核酸Marker DL2000做对照，观察扩增结果。

除阳性对照外，样品中均未见特异性扩增，说明重组大肠杆菌表达猪α-干扰素中不存在重组质粒pQPA23P。

(三)重组猪IFN-α对猪的临床反应和病理学观察试验

28日龄健康“杜长大”三元杂交断奶仔猪16头，待受孕胎次较一致的经产母猪4头，由山东得利斯集团第一种猪场提供。

选择体重相近的28日龄健康‘杜长大’三元杂交断奶仔猪16头(平均体重约8-9kg)，随机分为4组。第1组为对照组，肌肉注射4ml生理盐水；第2组肌肉注射重组IFN-α10万单位、第3组肌肉注射猪重组IFN-α100万单位、第4组肌肉注射IFN-α1000万单位。每天一次，连用三天。每组为一栏。每日饲喂3次仔猪全价饲料，自由饮水。总试验期28天。

1)重组猪IFN-α对试验猪的临床表现、不良反应观察。

各断奶仔猪注射接种后，均无异常反应，接种部位未见红肿、溃烂等反应，各试验组仔猪和对照组猪体温均正常，采食量和增重均无明显差异，猪的精神状态良好，表现活跃，鼻镜湿润，皮肤红润光滑，被毛柔顺有光泽，与对照组没有差别。

妊娠母猪注射接种后，也无体温反应，全部顺利受孕妇，食欲正常，分娩时也未见异常。对部分试验猪扑杀、剖检，注射部位未见坏死，心包膜内胞液量正常，无纤维渗出和粘连，心脏表面无出血；肺脏正常；检查肝脏表面和各个切面，无病灶，不肿胀；脾脏的表面和切面均无肿胀和出血点，表现正常；肾脏正常；其它部位也未见异常：各实质脏器均无有明确意义的病理学变化。

2)重组猪IFN-α对仔猪日增重的影响

分别于试验的第1和28天早晨空腹逐头称重，计算日增重。

从表1中可以看出注射不同剂量IFN-α的各实验组平均日增重均高于对照组，但差异不显著。各实验组平均日增重以100万单位组和500万单位组最高，20万单位组和试验组次之。各实验组间差异不显著。

3)重组猪IFN-α对生长猪料重比的影响

分别与试验的第1和28天早晨称量各组饲料消耗量，计算饲料增重比。

从表1中可以看出各实验组中的料重比差异不显著，20万单位组和100万单位组较低，500万单位组料重比略低于对照组。

4)对受孕母猪生产繁殖性能的影响

待受孕胎次较一致(一胎)的经产母猪4头，受孕前三天肌肉注射重组IFN-α按200万单位/头，观察至生产。

结果如表2试验组和对照组的受胎率均为100％；试验组11.75头的窝产仔数和对照组的10.25头相比，差异显著(P＜0.05)。

5)猪流行性腹泻(PED)的自然发病病例的治疗实验与临床观察

在山东得利斯集团第一种猪场发生病毒性腹泻的临床病例(约70日龄左右，体重18-22kg)，临诊症状表现发病初期精神萎顿沉郁、行走摇摆无力、食欲减退、体温38.5～40.5℃，有的表现排灰色或灰黄色水样稀便，部分猪呕吐和厌食。死亡猪剖检，病变主要表现在小肠：肠管臌胀，内有少量食糜和大量黄色液体，肠壁变薄；剪开肠管可见小肠绒毛缩短紧贴肠壁，肠系膜淋巴结显著水肿。根据临床诊断认为可能是猪流行性腹泻或者传染性胃肠炎，故按病毒性腹泻进行干扰素和常规治疗，同时取病猪的粪便利用PED/TGE Ag Rapid Test Kit(猪流行性腹泻/传染性胃肠炎抗原快速检测试纸条：免疫层析法定性检测粪便样品中的猪流行性腹泻/传染性胃肠炎)进行初步诊断，然后在试验室进行PCR鉴定及病毒的分离培养。结果表明，对采集的20份粪便样品中有15份PEDAg Rapid Test Kit检测阳性，RT-PCR有12份阳性。分离获得的6株病毒进行PEDV/TGEV RT-PCR结果表明，只有PEDV呈现阳性，而TGEV未见阳性片段。

选取上述自然发病的仔猪15头随机分为3组，5头/组，测量体重、体温，观察发病状态并记录。

组1：干扰素治疗组5头：肌肉注射干扰素100万U/头(1mL)，同时注射安乃近+地塞米松，每天一次，连用三天。

组2：常规药物治疗组5头：采用常规治疗法安乃近+地塞米松，治疗发病仔猪。

组3：不治疗的对照组5头：不做任何治疗，其它饲养条件相同。

对确诊的临床PED感染治疗对比结果表明，实验组1的5头猪，注射两天后开始好转，采食量就有所增加，4天时已基本恢复食欲，6天时基本恢复正常，10天时未见反复，除一头略表现生长受阻外，其余4头全部康复，同正常未感染组。

常规药物对照组2中的5头猪，在注射4天后一直反复，5天时有一头死亡，7天时又有一头死亡；另一头10天时被毛粗乱，生长严重受阻，成为僵猪，10天时有2只饮食和精神状态恢复正常。

不做任何治疗的组3的5头猪对照组，不治疗，2、5和6天时各有一头死亡，其余2头七天时饮食欲开始恢复，10天时饮食和精神状态基本恢复正常，但生长受阻。

在试验的结束后，对比治疗期间采食量的发现，试验组1比对照组2的日采食量有明显的增高，试验组增加0.59公斤，而对照组2增加0.38公斤，对照组3增加0.23公斤，差距明显。从表3也可看到无论其全治愈率还是毛治愈率也有明显差异。

注：全康复猪为吃食，饮水都正常的，生长正常。

僵猪为：能吃食了，还需治疗，病情稳定不会死亡但生长速度缓慢。

全治愈率为：＝全康复猪/全组的所有猪

毛治愈率为：＝(全康复猪+僵猪)/全组的所有猪

(四)重组猪IFN-α纯化制品在猪体内的消长规律

30日龄健康“杜长大”三元杂交断奶仔猪4头。

对各试验猪肌肉注射1个剂量重组猪IFN-α，试验期为7天。

分别在肌肉注射重组猪IFN-α在注射液前、注射后0.5h、1h、2h、3h、4h、8h、12h、24h、48h、96h、168h时前腔静脉采血分离血清。

将重组猪IFN-α做不同浓度的稀释，测定不同干扰素浓度下对应的OD值，以OD值为横坐标(x)，以干扰素浓度(y)为纵坐标回归，建立回归方程为y＝384.284x²-133.362x+7.1972，R2＝0.98672，如图1所示。

重组猪IFN-α含量的测定

试验步骤：

①取出酶标板，将被测血清和对照样品用pH10.6的碳酸盐缓冲液依次倍比稀释后依照次序分别加入相应的孔中，200μl/孔，4℃包被过夜；

②PBS(pH7.2)洗4次，每孔200μl，每次10-60秒；

③在每样品孔中加入250μl Blocking buffer；

④室温(20-25℃)置摇床2h；

⑤PBS(pH7.2)洗4次，每孔200μl，每次10-60秒；

⑥每孔加入PBS/BSA稀释的Penta-His HRP各200μl；

⑦室温(20-25℃)孵育2h；

⑧PBS(pH7.2)洗4次，每孔200μl，每次10-60秒；

⑨每孔加入200μl底物溶液，在室温(20-25℃)下避光孵育反应15分钟；

⑩测定OD值：反应结束后在每孔加入50μl终止液，终止反应后在492nm波长测定各反应孔的OD值，记录结果。

根据上述回归方程y＝384.284x²-133.362x+7.1972，按照测得的OD值(表4)计算得到的理论数值为负值，而且与空白对照数值交叉，无法根据重组猪IFN-α中国药理学会推荐的3p97等软件进行药动学、药时曲线等的处理。这可能是由于给猪注射的干扰素样品中的重组猪IFN-α含量太太低，每毫升中(100万单位)含有的重组猪IFN-α含量理论值约在20-100ng之间，给10KG左右的猪注射吸收后分布较为广泛导致血清中的含量极低，加之检测方法的局限性而测不出其中重组猪IFN-α含量。但从OD值上可略见在注射2h后升高，在8h时OD值最高，之后下降，在24小时后恢复到注射前水平。

(五)重组猪IFN-α免疫猪自身抗体的消长规律

体重相近的28日龄健康“杜长大”三元杂交断奶仔猪16头。

包被液：pH9.5-9.6，0.05M(NaHCO₃2.93g，Na₂CO₃1.95g，加水至1000mL，4℃保存)；

洗涤液(PBST)：含有0.05％Tween-20，0.01M pH7.4的PBS(NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄-12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween-200.5mL，加蒸馏水至1000mL)。

保温液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g、0.05％PBS-Tween20100mL，4℃保存；

封闭液：1％牛血清白蛋白(pH7.4PBS，内含0.05％-吐温20)。

底物溶液(OPD-H₂O₂)：磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)-0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7mL、0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3mL、蒸馏水50mL.

底物溶液：磷酸盐柠檬酸缓冲液100mL、邻苯二胺(OPD)40mg、30％H₂O₂15mL，现配现用。

终止液：2M H₂SO₄(浓硫酸22.2mL+H₂O 177.8mL)。

选择体重相近的28日龄健康“杜长大”三元杂交断奶仔猪16头(平均体重约8-9kg)，随机分为4组。第1组为对照组，肌肉注射4ml生理盐水；第2组肌肉注射重组猪IFN-α10万单位、第3组肌肉注射猪重组猪IFN-α100万单位、第4组肌肉注射重组猪IFN-α1000万单位。每天一次，连用三天。每组为一栏。每日饲喂3次仔猪全价饲料，自由饮水。总试验期28天。分别在用药前、用药后1周、2周、3周和4周时前腔静脉采血分离血清，-20℃保存备用。

1)ELISA方法检测血清中干扰素抗体效价：

抗原包被：用包被液将纯化重组干扰素作1∶5稀释后包被酶标板，每孔100μL，同时设阴性对照孔，置4℃过夜。

     1    2    3      4      5      6      7      8      9      10      11     12

A    +    0N1    0M1    1N1    1M1    2N1    2M1    3N1    3M1    4N1    4M1    /

B    +    0N2    0M2    1N2    1M2    2N2    2M2    3N2    3M2    4N2    4M2    /

C    -    0N3    0M3    1N3    1M3    2N3    2M3    3N3    3M3    4N3    4M3    /

D    -    0N4    0M4    1N4    1M4    2N4    2M4    3N4    3M4    4N4    4M4    /

E    /    0L1    0H1    1L1    1H1    2L1    2H1    3L1    3H1    4L1    4H1    /

F    /    0L2    0H2    1L2    1H2    2L2    2H2    3L2    3H2    4L2    4H2    /

G    /    0L3    0H3    1L3    1H3    2L3    2H3    3L3    3H3    4L3    4H3    /

H    /    0L4    0H4    1L4    1H4    2L4    2H4    3L4    3H4    4L4    4H4    /

取出4℃保存的包被好的酶标板，PBST洗涤4次，每次2min，沥干。

封闭：用1％BSA封闭液每孔200μl，37℃封闭2h。

洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次2～3min，沥干。

加入被检血清：将对照血清和采集的样品血清用保温液作1∶10稀释，加入反应板相邻的两个孔中，每孔每孔100μl，37℃作用2h。

洗涤：用洗涤液洗涤3次，每次2～3min，沥干。

用保温液将酶结合物(辣根过氧化物酶-HRP标记的兔抗猪二抗)作1∶500稀释，加入反应孔中，每孔100μL，置37℃孵育1h。

洗涤：倒掉板中液体后，用洗涤液洗涤3次，每次2～3min，沥干。

加入底物：每孔100μL，置室温暗盒内显色20～30min，或37℃孵育10min。

加入终止液：每孔50μL，静置5min。

测定OD值：用检测仪，于492nm波长测定各反应孔的OD值，记录结果。

ELISA检测显示，试验仔猪在注射不同剂量重组猪IFN-α用药后1周、2周、3周和4周时，其OD₄₉₂值与用药前没有显著差异，其值均在0.264-.0.409之间，而空白对照值为0.261，阳性对照为0.817。结果表明连续三次注射重组猪IFN-α的猪体内在检测时限内没有利用该ELISA方法可以检测到的抗重组猪IFN-α的抗体产生。

2)细胞病变抑制法测定血清中干扰素抗体效价

按常规方法消化MBDK细胞，加入适量的8％小牛血清的MEM，细胞计数，按5×10⁵个/ml稀释后滴加96孔板。待MBDK在96孔板上生长成单层，去除生长液，每孔加入用维持液10倍倍比稀释的干扰素100μl，每个稀释度接8孔，37℃孵育过夜培养后，弃去处理液，每孔加入100μl 100TCID₅₀的水疱性口炎病毒(VSV)，同时设接毒对照和空白对照，37℃培养24-48h，待对照孔细胞全部发生明显细胞病变(75％CPE)时在显微镜下观察结果，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度的倒数即为干扰素效价(1U)。然后用2％血清的MEM将干扰素稀释成5U/ml。

先将血清适当稀释，置56℃水浴中处理30分钟，以破坏补体和其他不耐热的非特异性杀病毒因子。随后再做2倍连续稀释。

取稀释好的干扰素和等体积不同稀释度的血清，充分混匀后置37℃水浴中感作1小时。

血清毒性对照，被检血清的最低稀释倍数；正常细胞对照；阳性和阴性血清对照，将兔抗IFN多克隆抗体做为阳性对照样品。

待感作完毕后，迅速将干扰素-血清混合物或对照等接种已经长成MDBK细胞。

将接种24小时的细胞板取出，吸去营养液，换为100TCID₅₀的水疱性口炎病毒，设立正常细胞对照和攻毒细胞对照，37℃5％CO₂温箱培养。

待病毒对照细胞完全病变时判定结果，以保护50％细胞免受病毒侵犯为终点。无中和抗体：细胞无明显病变；有中和抗体：细胞病变在50％以上。

细胞病变抑制法测定结果显示，所有样品检测孔中细胞均无明显病变，用药后1周、2周、3周和4周时血清处理样品与用药前的细胞形态也没有差异，与未处理细胞形态一致，而病毒对照组细胞细胞完全病变，结果表明连续三次注射重组猪IFN-α的猪体内在检测时限内没有达到检测水平的中和抗体产生。

综上所述，连续三次注射重组猪IFN-α的猪体内在检测时限内没有利用该ELISA方法可以检测到的抗重组猪IFN-α的抗体产生，连续三次注射重组猪IFN-α的猪体内在检测时限内没有达到检测水平的中和抗体产生。

(六)接种猪生活环境中抗性基因残留情况的检测

硫酸卡那霉素(Kan，Amresco 0408，USP)、氨苄青霉素(Amp，Amresco，USP)、Tryptone、Yeast Extract(Oxiod)，EDTA、IPTG、SDS(Promega)，Agrose(Merck)，麦康凯培养基；按分子克隆各种溶液的配制，其中硫酸卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)用生理盐水溶解成50mg/mL的贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤后分装-20℃贮存备用。

麦康凯培养基：10g麦康凯培养基，加蒸馏水至1L，溶解后调节pH至7.0，121℃灭菌15min，冷却后备用。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L Nacl，加蒸馏水至1L，溶解后调节pH至7.0，121℃灭菌15min，冷却后备用。

LB-琼脂培养基：在上述1L LB培养基中加入15g琼脂，121℃灭菌15min，冷却后备用。

Amp-LB-琼脂培养基和Kan-LB-琼脂培养基：在将上述灭菌后的LB-琼脂培养基冷却到45-50℃时分别加入相应终浓度的Amp和/或Kan贮存液(其中Amp最终使用浓度为50μg/mL，kan为30μg/mL)混匀后倒平皿，约15-20mL/板。

1)猪粪便中抗性菌的培养与PCR鉴定

收集接种猪的粪便，用无菌生理盐水适量稀释，取100μl涂布麦康凯培养基，共接种4个平板。次日随机挑取100个麦康凯平板上的红色菌落，转种Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板，37℃培养16h，观察细菌生长情况。对在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板生长的菌落随机取部分菌落利用干扰素基因引物进行PCR鉴定，以确定该菌中是否含有相应的重组质粒。

接种猪粪便中抗性细菌培养结果表明，在山东得利斯集团第一种猪场的分离培养中，其麦康凯培养基上的红色菌落数高于济南军区总医院动物实验中心的培养。随机挑取各个分离培养中的100个转种到Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板上后均不生长；由于在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板没有菌落生长，故再随机从各平板上取部分菌落进行PCR扩增，除阳性对照外，样品中均未见特异性犷增。

2)饲养坏境水中抗性菌的培养与PCR鉴定

收集饲养坏境中的水，取100μl直接涂布麦康凯培养基，共接种4个平板。次日随机挑取麦康凯平板上适当数量的红色菌落，转种Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板，37℃培养16h，观察细菌生长情况。对在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板生长的菌落随机取部分菌落利用干扰素基因引物进行PCR鉴定，以确定该菌中是否含有相应的重组质粒。

接种猪所在环境水中抗性细菌培养结果表明，在山东得利斯集团第一种猪场和济南军区总医院动物实验中心的分离培养中只有少量的红色菌落生长，随机挑取各个分离培养中的50个转种到Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板上后均不生长；由于在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板没有菌落生长，故随机从各平板上取部分菌落进行PCR扩增，除阳性对照外，样品中均未见特异性扩增。

3)饲养环境土中抗性菌的培养与PCR鉴定

收集饲养环境中的土，用适量无菌生理盐水稀释，取100μl直接涂布麦康凯培养基，共接种4个平板。次日随机挑取麦康凯平板上适当数量的红色菌落，转种Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板，37℃培养16h，观察细菌生长情况。对在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板生长的菌落随机取部分菌落利用干扰素基因引物进行PCR鉴定，以确定该菌中是否含有相应的重组质粒。

由于济南军区总医院动物实验中心为水泥处理地面，故没有采集土样进行细菌的分离培养，只在山东得利斯集团第一种猪场进行了接种猪所在环境土壤中抗性细菌培养，结果表明的分离培养中有少量的红色菌落生长，随机挑取分离培养中的100个转种到Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板上后均不生长；由于在Amp+Kan-LB-琼脂培养基平板没有菌落生长，故随机从平板上取部分菌落进行PCR扩增，除阳性对照外，样品中均未见特异性扩增。

综上所述，对接种猪所在环境(粪、水、土)中同时具有氨苄青霉素和硫酸卡那霉素抗性的监测结果表明没有重组大肠杆菌菌株MPIA23P或者同时具有氨苄青霉素和硫酸卡那霉素抗性基因存在。

Claims (6)

1.一种编码猪α-干扰素的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-501位。

2.一种表达猪α-干扰素的重组菌，是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

根据权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

3.一种生产猪α-干扰素蛋白的方法，包括如下步骤：

将表达猪α-干扰素的重组菌进行培养，诱导表达猪α-干扰素，收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，洗涤包涵体，离心收集包涵体；

用含有6-8mol/L盐酸胍的缓冲溶液溶解包涵体，离心收集上清；采用His-蛋白质镍亲和层析树脂纯化上清；

测定上清的蛋白浓度，在冰水浴或者2℃-8℃的条件下，将上清加入到复性液中使蛋白质浓度在75-150μg/mL L，2℃-8℃静置复性20-24小时，获得猪α-干扰素蛋白；所述复性液中盐酸胍0.3-1.0mol/L、尿素0.5-2.0mol/L、精氨酸0.1-1.0mol/L、还原型半胱氨酸1.0-7.0mmol/L、氧化型胱氨酸0.1-2.0mmol/L、Tris-HCl 10-20mmol/L(pH8-11)、EDTA 1.0-5.0mmol/L(pH8.0)；

所述表达猪α-干扰素的重组菌是是稳定表达序列表中序列1自5’末端第1-498位所示的DNA分子编码的蛋白的重组大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的生产猪α-干扰素蛋白的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株M15[pREP4]。

5.鸡α-干扰素蛋白注射液，其活性成分为权利要求3所述生产猪α-干扰素蛋白的方法制备的猪α-干扰素蛋白。

6.根据权利要求5所述的鸡α-干扰素蛋白注射液，其特征在于：含有佐剂和/或稳定剂。