CN101392256A

CN101392256A - 野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法

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Publication number: CN101392256A
Application number: CNA2007101443454A
Authority: CN
Inventors: 刘娣; 王君伟; 李文辉
Original assignee: HEILONGJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES FARMING RESEARCH CENTER; Northeast Agricultural University
Current assignee: HEILONGJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES FARMING RESEARCH CENTER; Northeast Agricultural University
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: CN101392256B

Abstract

野猪α－干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，国内重组菌株或者是表达量不高，或者是产物是以融合状态表达，或者是产物带有纯化标签，或者是没有高密度发酵工艺，存在诸多问题。本发明组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α－干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法。本发明属于生物制药中的基因工程生产多肽药物技术领域。

Description

野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法

技术领域：

本发明涉及一种野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法。

背景技术：

干扰素作为生物体内的第一病毒防御系统，一直是各种生物体内重要的细胞因子之一。利用干扰素来防治家畜的病毒性疾病，也是一种非常有效的手段。野猪α-干扰素是一种诱生蛋白，正常情况下动物机体是不产生的。目前，国内主要是体外培养猪白细胞并诱导生产干扰素，然后从培养上清中提取干扰素。这种方法生产的干扰素生物活性低，成本高，且猪血有各种病毒污染，也会给产品的安全带来问题。通过基因工程技术，可以在体外大规模生产重组干扰素蛋白。干扰素的非糖基化形式也具有生物活性，因而可以使用原核表达系统表达该种蛋白。目前国内虽已开展了相关的研究，但是，还是没有一条完整的可供生产的下游工艺，国内重组菌株的或者是表达量不高，或者是产物是以融合状态表达，或者是产物带有纯化标签，或者是没有高密度发酵工艺，存在诸多问题。

发明内容：

本发明的目的是提供一种野猪α-干扰素基因的合成序列、表达载体构建及产物的制法，为在工业化大规模生产野猪α-干扰素提供一条高效、安全、经济、稳定的生产工艺。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，所述的人工合成的编码野猪α-干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CATAGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGCCCG TTT AGC TGCCTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GAA GCG CTGGGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTGGTG CATGAG ATG CTGCAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAGAGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GAAGCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GATAGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTG CAA GAAAAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCG GAA GTG ATG CGC GCGTTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGTAAA AAA GAA TAA，将含有所述的核苷酸序列的野猪α-干扰素的基因插入到带有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪α-干扰素的基因的表达质粒pWL-poIFN-α，转化大肠杆菌DH-5α后，野猪α-干扰素获得高效表达。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，对所述的工程菌进行30℃培养过夜，以10％接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为OD₆₀₀达到4～10时，42℃诱导发酵培养2.5～5.5小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0.1～0.4％TritonX-100，包涵体精提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.5～2摩尔脲，蛋白变性液为8～10摩尔脲、50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇，蛋白复性液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用Sephacry S-200和DEAE-Sepharose FF层析柱纯化。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的核苷酸序列的5′端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3′端CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TAA为经过自由能和mRNA二级结构优化的序列。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的高效表达载体是含有核苷酸序列的野猪α-干扰素的表达载体使用了质粒载体pWL，它含有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起始密码子ATG之间的序列为GAATTCAAA，以及野猪α-干扰素基因构建的载体，所述的核苷酸序列的5′端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，所述的野猪α-干扰素的表达载体转化为大肠杆菌DH-5α，表达蛋白占菌体总蛋白的25％～33％。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，生产的重组野猪α-干扰素分子量为19kD，且在体外有效保护Wish细胞和胎猪体细胞免受水泡性口炎病毒的攻击。

这个技术方案有以下有益效果：

1.本发明利用生物学软件改变了野猪α-干扰素基因中稀有密码子，使之变成大肠杆菌的偏爱密码子，并且优化了5′端起始密码子区域和3′端终止密码子区域30个碱基的自由能和摩尔RNA二级结构。5′端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA，含有EcoR I酶切位点；3′端的终止密码子后加上了Sal I酶切位点。该基因虽然改变了稀有密码子，但是氨基酸序列并无改变，表达水平有很大提高。

2.本发明所生产的重组野猪α-干扰素，其分子量为19kD，且在体外有效保护Wish细胞和胎猪体细胞免受水泡性口炎病毒的攻击。

3.本发明利用生物信息学，对野猪α-干扰素进行了全基因组扫描。优化设计并合成了野猪α-干扰素基因，带有该基因的表达载体转化宿主大肠杆菌DH-5α，获得高效表达，表达蛋白占菌体总蛋白的25％～33％。本发明也提供了一套完整的下游生产工艺，包括高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法。是一条可大规模工业化生产重组野猪α-干扰素的方法。

4.本发明提供了一整套工程菌高密度发酵、包涵体分离和纯化、蛋白复性和纯化工艺。野猪α-干扰素具有高效抗病毒和功能，可用于猪病毒性传染病的预防和治疗。并且由于存在交叉活性，该干扰素可用于牛、羊等动物的病毒性疾病的治疗。

5.本发明能够生产高活性、低成本的野猪α-干扰素，可以工业化大量生产重组野猪α-干扰素。

附图说明：

附图1是本发明实施例野猪α-干扰素的成熟肽的核苷酸序列与其氨基酸序列比对图。

附图2是本发明实施例天然野猪α-干扰素的成熟肽的核苷酸序列及其氨基酸序列比对图。

附图3是本发明实施例野猪α-干扰素的序列的测定图谱。测定结果可见5′端ATG之前引入了EcoR I酶切位点，3′TAA之后引入了Sal I酶切位点。

附图4是本发明实施例野猪α-干扰素的酶切鉴定图谱。

附图5是本发明实施例优化工程菌高密度发酵表达条件鉴定图谱。1为标准分子量蛋白、2为未诱导的菌体、3为高密度发酵诱导条件表达的菌体。

附图6是本发明实施例工程菌表达野猪α-干扰素在大肠杆菌中存在形式的鉴定图谱。

附图7是本发明实施例分离纯化的重组野猪α-干扰素SDS-PAGE电泳检定图谱。

附图8是本发明实施例分离纯化的重组野猪α-干扰素HPLC的检测结果。

本发明的具体实施方式：

实施例1：

野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，所述的人工合成的编码野猪α-干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CATAGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAG ATG CGT CGC ATC AGCCCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTC CCG CAG GAA GCG CTGGGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTG GTG CAT GAG ATG CTGCAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCG GCG GCC TGG GAT GAGAGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAG CTG CGC GAT CTG GAAGCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCG CTG CTG GAG GAG GATAGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACG CTG TAT CTGCAA GAAAAA AGCTAC AGC CCGTGT GCGTGG GAA ATTGTG CGTGCG GAA GTG ATG CGC GCGTTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TAA，将含有所述的核苷酸序列的野猪α-干扰素的基因插入到带有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪α-干扰素的基因的表达质粒pWL-poIFN-α，转化大肠杆菌DH-5α后，野猪α-干扰素获得高效表达。

所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，对所述的工程菌进行30℃培养过夜，以10％接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为OD₆₀₀达到4～10时，42℃诱导发酵培养2.5～5.5小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0.1～0.4％TritonX-100，包涵体精提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.5～2摩尔脲，蛋白变性液为8～10摩尔脲、50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇，蛋白复性液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用Sephacry S-200和DEAE-FF层析柱纯化。

本发明中，利用生物学软件改变了野猪α-干扰素基因中稀有密码子，使之变成大肠杆菌的偏爱密码子，并且优化了5′端起始密码子区域和3′端终止密码子区域内30个碱基的自由能和mRNA二级结构，使之适合转录的起始。该序列的5′端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA，含有EcoR I酶切位点；3′端的终止密码子后加上了Sal I酶切位点。克隆至载体pWL之中，得到表达质粒pWL-poIFN-α。图1和图2分别显示了野猪α-干扰素的成熟肽的核苷酸序列与氨基酸序列比对图和天然野猪α-干扰素的成熟肽的核苷酸序列及其氨基酸序列比对图。

参考附图3，本发明实施例野猪α-干扰素的序列的测定图谱。测定结果可见5′端ATG之前引入了EcoR I酶切位点，3'TAA之后引入了Sal I酶切位点。

参考附图4，本发明实施例将表达质粒pWL-poIFN-α转化大肠杆菌。采用氯化钙转化法，宿主菌为大肠杆菌DH-5α。重组菌种的筛选：随机挑取8-10个单菌落分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素钠的5m LB液体培养基之中，30℃220r/min过夜培养。次日，收集菌体，微量碱变性方法提取质粒，质粒经过酶切鉴定片断大小与设计结果一致。其中1为单酶切，2为EcoR I和Sal I双酶切，3为标准分子量

参考附图5，本发明实施例将野猪α-干扰素工程菌接种于含100μg/ml氨苄青霉素钠的液体LB培养基之中，30℃220r/min培养15h，至0D₆₀₀约1.5，次日按10％的接种量接种发酵罐中，发酵罐内含有4L已灭菌的分批培养的基础培养基〔蛋白胨10g，丙三醇20ml，酵母粉5g，Na₂HPO₄·12H₂O8g，KH₂PO₄4g，MgSO₄7H₂O0.25g，CaCl₂0.1g，微量元素(微量元素储备液：FeSO₄.7H₂O1g，MnSO₄H₂O1g，ZnSO₄7H₂O2.78g，CoCl₂6H₂O2g，Na₂MoO₄2H₂O2g，CuSO₄5H₂O1.85g，H₃BO₃0.5g，定容至1L)4ml〕、2ml消泡剂和4g氨苄青霉素。初始发酵参数设置：温度30℃，pH值7.2，DO值(溶氧浓度)100％；起始搅拌速度230r/min。当DO值在3min之内下降至60％以下，则开始进行补料发酵，流加补料培养基(蛋白胨8g，丙三醇3ml，酵母粉8g，MgSO₄·7H₂O0.25g，定容至1L)。当OD₆₀₀达到4～5时，在5min内将发酵罐升温至42℃，进行诱导表达。诱导表达5小时的时候终止发酵。图5中，1：标准分子量蛋白2：未诱导的菌体3：本实施例高密度发酵诱导条件表达的菌体。

参考附图6，本发明实施例用离心法收集发酵的菌体，经生理盐水洗涤后超声波破碎菌体，离心后上清和沉淀作SDS-PAGE电泳鉴定。未诱导的菌作为空白对照。结果表明表达野猪α-干扰素以包涵体的形式存在。

本发明实施例重组野猪α-干扰素的提取和变性：离心收集发酵菌体，将细菌溶于以下溶液TE(50mM tris、1mM EDTA)、0.1mg/ml溶菌酶、0.1～0.4％TritonX-100，室温搅拌过夜。次日，在冰浴中进行超声破碎。离心弃上清。沉淀用TE+0.5M的尿素搅拌清洗。离心弃上清。沉淀TE清洗，离心弃上清。最后沉淀用Tris清洗，离心。得到初步纯化的包涵体，加入蛋白变性液(8～10M脲、50mM tris、1mM EDTA、10mM DTT)，搅拌过夜后，12000r/min，离心，20min，取上清，弃沉淀。图6中，1：标准分子量蛋白，2：包涵体。

参考附图7，本发明实施例重组野猪α-干扰素的复性和纯化：以含6M尿素和10mM DT T的TE溶液作为流动相经过Sephacryl S-200凝胶层析，收集第二个出样峰。将Sephacryl S-200凝胶层析收集的第二个样品峰，缓缓稀释到4℃预冷的复性液之中。复性液中含有1mM GSS G，10mM DTT以及TE(pH8.5)缓冲液，并补充尿素使其终浓度为0.5M。4℃，过夜。复性的样品上样至DEAE-FF柱上，用150mM NaCl₂的50mM tris缓冲液洗下样品峰。SDS—PAGE电泳鉴定纯化的重组野猪α-干扰素(参考附图7)其纯度大于95％。图7中，1为标准分子量蛋白，2为纯化蛋白还原电泳，3为纯化蛋白的非还原电泳。

本发明实施例重组野猪α-干扰素的活性检定：用微量细胞病变抑制法，以Wish细胞/VSV为基本检测系统。将抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最高稀释度定义为1个干扰素单位(U)。活性检测结果表明，野猪α干扰素的生物学活性为4.45×10⁶UI/mg。

参考附图8，HPLC检测重组野猪α-干扰素纯化蛋白的结果，纯度在98％以上。

Claims

1.一种野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，其特征是：所述的人工合成的编码野猪α-干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GATCTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAGATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTCCCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTGGTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCGGCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCGCTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACGCTG TAT CTG CAA GAA AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCGGAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAAAAA GAA TAA，将含有所述的核苷酸序列的野猪α-干扰素的基因插入到带有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪α-干扰素的基因的表达质粒pWL-poIFN-α，转化大肠杆菌DH-5α后，野猪α-干扰素获得高效表达。

2.根据权利要求1所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其特征是：对所述的工程菌进行30℃培养过夜，以10％接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为OD₆₀₀达到4～10时，42℃诱导发酵培养2.5～5.5小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0.1～0.4％TritonX-100，包涵体精提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.5～2摩尔脲，蛋白变性液为8～10摩尔脲、50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇，蛋白复性液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用Sephacry S-200和DEAE-Sepharose FF层析柱纯化。

3.根据权利要求1或2所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其特征是：所述的核苷酸序列的5′端ATG TGT GAT CTG CCG CAAACC CAT AGC CTG GCG以及3′端CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAA AAA GAA TAA为经过自由能和mRNA二级结构优化的序列。

4.根据权利要求1或2所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其特征是：所述的高效表达载体是含有核苷酸序列的野猪α-干扰素的表达载体使用了质粒载体pWL，它含有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因，以及特定的SD序列和起始密码子ATG之间的序列为GAATTCAAA，以及野猪α-干扰素基因构建的载体，所述的核苷酸序列的5′端起始密码子前面的核苷酸序列为GAATTCAAA。

5.根据权利要求1或2所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其特征是：所述的野猪α-干扰素的表达载体转化为大肠杆菌DH-5α，表达蛋白占菌体总蛋白的25％～33％。

6.根据权利要求1或2所述的野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其特征是：生产的重组野猪α-干扰素分子量为19kD，且在体外有效保护Wish细胞和胎猪体细胞免受水泡性口炎病毒的攻击。