CN101434965A - 一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172－α2b的构建方法，构建方法为：(1)根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物EcolC1958，双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体pBPE172；(2)将重组人干扰素α2b的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接，得到一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172－α2b。本发明构建的载体转化大肠杆菌E.Coli BL21，诱导表达时，表达出的干扰素α2b主要在上清中存在，说明干扰素α2b是以可溶性的形式存在，利用本载体制备的干扰素的溶解性得到了很大的提高。

Description

一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，涉及一种表达载体的构建方法。

背景技术

重组人干扰素是分子生物学发展的产物，人们可以按其意向设计出不同于自然人干扰素的新型干扰素。通过遗传点突变技术，研制出具有独特功能的干扰素和干扰素融合体。这些干扰素类似物和杂合体有希望成为活性更强、更适于临床应用的新型干扰素。目前市场上应用最多的干扰素是基因工程重组干扰素α2b，它是采用基因工程技术，特别是DNA重组技术制备，利用基因工程技术获得干扰素基因，将其连接质粒上然后重组到表达细胞中进行转录、翻译、表达，最后纯化得到高浓度的干扰素产品，但是存在的问题是干扰素在溶解性不够理想，于是越来越多的研究者将研究方向的重点放在如何在分子水平上改造干扰素基因使其溶解性得到提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法，通过构建出的表达载体可使表达出的重组人干扰素α2b成为可溶性。

本发明的技术方案概述如下：

一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法，由如下步骤组成：

(1)根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物EcolC1958，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体pBPE172，所述载体pBPE172中包含一段rbs序列：AAAGGAGGAGAATATACATT；

(2)将序列表SEQ ID NO.3所述的重组人干扰素α2b的核苷酸序列与所述载体pBPE172酶切后连接，得到一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b。

本发明的优点是：

本发明构建的重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b转化大肠杆菌E.Coli BL21，诱导表达时，表达出的干扰素α2b主要在上清中存在，说明干扰素α2b是以可溶性的形式存在，利用本载体制备的干扰素的溶解性得到了很大的提高。

附图说明

图1为PCR后的EcolC1958片段的琼脂糖电泳图。

图2为pBPE172质粒双酶切凝胶电泳图。

图3为重组人干扰素α2b片段的琼脂糖电泳图。

图4为pBPE172-α2b质粒双酶切的凝胶电泳图。

图5为表达质粒pBPE172-α2b诱导表达SDS-PAGE电泳图。

图6为pBPE172载体的构建示意图。

图7为pBPE172-α2b构建示意图。

具体实施方式

pfu DNA聚合酶，dNTP mixture，Tris饱和酚、蛋白胨、酵母粉、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、卡那霉素、氯霉素购于北京鼎国生物技术有限责任公司。

标准核酸分子量Marker DL 2000，Hind III酶，EcoR I酶，Xba1酶，HindIII酶DNALigation Kit Ver 2.0连接酶等购于宝生物工程(大连)有限公司。

PCR产物纯化试剂盒，EZ-10Spin Column PCR Product Purification Kit Cat.No.BS363与凝胶纯化试剂盒，EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit Cat.No.BS353购于天津厚普生物技术有限公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

可溶性表达载体pBPE172的构建

1)通过National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库检索铁氧还蛋白EcolC1958的DAN原始序列(约2000bp)，利用primer premier 5.00设计引物1和引物2。引物1和引物2构成一对引物，包含与EcolC1958连接片段互补的DNA序列。其中，引物1包含酶切位点Xba1和一段特殊的rbs序列(此序列能够更加有利于核糖体与mRNA的结合)，引物2包含酶切位点EcoRI。

引物1的序列(波浪线为酶切位点，直线为rbs序列)：CCCTC

AGGAGGAGAATATACATTATGGCTAACGGTTGG(序列表SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)

引物2的序列(波浪线为酶切位点)：

CTCCACAGGCAGTAGATT(序列表SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列)

2)铁氧还蛋白EcolC1958DNA片段的扩增。

PCR反应体系(100μL体系)如下：

10×PCR Buffer(含Mg2+15mM)                     10μL

dNTP(各2.5mM)                                  10μL

DMSO                                           10μL

引物1(20ng/μL)                                 2μL

引物2(20ng/μL)                                 2μL

模板DNA(大肠杆菌DNA)(10ng/μL)                  2μL

超纯水                                         63μL

pfu酶(5U/μL)                                   1μL

PCR反应条件：95℃，5min，1个循环；95℃，40s，50℃，30s，72℃，3min30s，共30个循环；72℃，10min，1个循环；4℃保存。

得到铁氧还蛋白EcolC1958 DNA片段。电泳验证，(见图1，泳道1为2000bp左右)，纯化，4℃保存。

3)用内切酶Xba1和内切酶EcoRI，双酶切铁氧还蛋白EcolC1958 DNA片段和质粒pET28a，形成单链带有突出端的待连接片段。

酶切体系(10μL体系)：

10×M Buffer                  1μL

EcolC1958或pET28a             5μL

超纯水                        3μL

Xba1                          0.5μL

EcoRI                         0.5μL

于37℃恒温箱中，2h。得到单链带有突出端的待连接片段EcolC1958和pET28a线性片段。

4)DNA片段的连接。

连接体系：

2×Ligation Buffer            5μL

EcolC1958                     2.5μL

pET28a                        2.5μL

T4连接酶                      0.5μL

于24℃恒温水浴中，2h。得到连接产物。

5)将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入400μl LB液体培养基(不含Amp)，37℃摇床静置50min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200μl，均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，第二天挑单菌落，用碱法提取质粒进行双酶切验证，最后经测序正确即为载体pBPE172。

见图2，pBPE172质粒双酶切凝胶电泳图，泳道3和泳道5中，可以看到目的片段2000bp左右，载体大小约为5200bp左右。泳道3和泳道5均为正确的载体。

实施例2

重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建

1)通过总结和分析大量关于干扰素活性位点的数据后，利用PCR的方法，合成重组人干扰素α2b优化序列(序列表SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列)，起始端加入酶切位点EcoRI，结束端加入酶切位点HindIII。

重组人干扰素α2b中含有166个氨基酸，其基因序列的长度在498bp。

引物的设计与合成：

根据序列表SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列设计合成8对引物(A1～A8)，长度为60～80bp，相邻引物的重叠区域为12bp，Tm值在50～60℃范围。设计上游引物ES和下游引物HX，上游引物ES引入酶切位点EcoRI，下游引物HX引入酶切位点HindIII。

各引物序列如下：

ES(直线为酶切位点)：CGCGAATTCATGTGCGATCTGCCG(SEQ ID NO.4)

HX(直线为酶切位点)：GTCAAGCTTTTCTTTGCTACGCAGTCTTTC(SEO ID NO.5)

A1：

ATGTGCGATCTGCCGCAGACCCATAGCCTGGGCAGCCGTCGTACCCTGATGCTGC

TGGCCCAG(SEQ ID NO.6)

A2：

CTTCCTGCGGAAAGCCAAAATCATGACGATCTTTCAGGCAGCTAAACAGGCTAA

TACGACGCATCTGGGCCAGCAG(SEQ ID NO.7)

A3：

TTCCGCAGGAAGAATTTGGCAACCAGTTTCAGAAAGCGGAAACCATTCCGGTGC

TGCATGAAATGATTCAGCAGAT(SEQ ID NO.8)

A4：

GAATTTATCCAGCAGGGTTTCATCCCACGCCGCGCTGCTATCTTTGGTGCTAAAC

AGGTTGAAGATCTGCTGAATC(SEQ ID NO.9)

A5：

CTGGATAAATTCTATACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGC

GTGATTCAGGGCGTGGGCGTGA(SEQ ID NO.10)

A6：

GTGATGCGCTGAAAATATTTACGCACGGCCAGAATGCTATCTTCTTTCATCAGCG

GGGTTTCGGTCACGCCCACGC(SEQ ID NO.11)

A7：

TCAGCGCATCACCCTGTATCTGAAAGAAAAAAAATATAGCCCGTGCGCGTGGGA

AGTGGTGCGTGCGGAAATTATG(SEQ ID NO.12)

A8：

TTCTTTGCTACGCAGGCTTTCCTGCAGGTTGGTGCTCAGGCTAAAGCTACGCATA

ATTTCCGC(SEQ ID NO.13)

重组人干扰素α2b基因片段的PCR扩增：

PCR反应体系：

10×pfu Buffer(含Mg2+15mM)              5μL

dNTP(各2.5mM)                           5μL

上游引物ES(20ng/μL)                     2μL

下游引物HX(20ng/μL)                     2μL

引物A1～A8(20ng/μL)                     各0.2μL

超纯水                                  33.9μL

pfu酶(5U/μL)                            0.5μL

反应条件：95℃，5min；95℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min，4℃保存。电泳验证PCR结果，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号α2b(序列表SEQID NO.3所述的核苷酸序列)，4℃保存。

见图3，重组人干扰素α2b片段的琼脂糖电泳图，泳道3为500bp左右。

2)用内切酶EcoRI和内切酶HindIII，双酶切质粒pBPE172和α2b纯化产物，形成形成单链带有突出端的待连接片段。

酶切体系(10μL体系)：

10×M Buffer                                   1μL

pBPE172或α2b                                   5μL

超纯水                                         3μL

EcoRI                                          0.5μL

HindIII                                        0.5μL

于37℃恒温箱中，2h。分别得到单链带有突出端的待连接片段pBPE172和单链带有突出端的待连接片段α2b。

3)DNA片段的连接。

连接体系：

2×Ligation Buffer                             5μL

α2b                                            2.5μL

pBPE172                                        2.5μL

T4连接酶                                       0.5μL

于24℃恒温水浴中，2h。得到连接产物，载体pBPE172-α2b。

4)将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入400LB液体培养基，37℃摇床，150rpm，50min，5000rpm/min离心1分钟，弃200μl上清，剩余菌液均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，第二天挑单菌落，用碱法提取质粒进行双酶切验证，最后经测序正确，最后将正确连接的菌种和质粒保存，并将质粒编号为表达载体pBPE172-α2b。

见图4，pBPE172-α2b载体双酶切的凝胶电泳图，泳道1和泳道2中，可以看到目的片段500bp左右，载体大小约为7200bp左右。泳道1和泳道2均为正确的载体。

实施例3

重组人干扰素的可溶性表达

1)种子菌制备：将构建的正确的pBPE172-α2b质粒转化表达菌株E.Coli BL21的感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，37℃摇床，150rpm，45min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200μl，均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，做为种子菌。

2)将种子菌接入5ml LB液体培养基中(含卡那霉素)，37℃过夜复苏。然后将复苏的菌液按1：100接种于50ml LB液体培养基中(含卡那霉素)，37℃培养OD600为0.5—0.6，加入1mM IPTG诱导培养，30℃诱导表达5h。用冷冻离心机8000rpm、4℃下离心10min，收集菌体。

3)超声破菌

将收集的菌体用1/10体积的PBS(pH8.0)悬浮，置冰上，用超声裂解，采用功率水平为6～7，超10s，停10s，共30次。当裂解液粘度变小，基本澄清时，说明菌体已经基本破碎。基本破碎后，将破碎液在12000rpm，4℃离心10min，收集上清和沉淀，沉淀用等体积PBS悬浮，冷冻保存，SDS-PAGE电泳分析。

4)SDS-PAGE电泳检测

按照以下步骤进行电泳：

样品处理

取适量体积的各部分样品，包括诱导前和诱导后的菌体、超声后上清和沉淀，加入1/5体积的5×SDS电泳缓冲液。100℃水浴加热10min使蛋白充分变性。

凝胶配制

12％分离胶的配制：4ml A液、3.5ml B液、2.5ml超纯水，50μL10％过硫酸胺，5μLTEMED。

4×浓缩胶配制：0.67ml A液、1ml C液、2.3ml超纯水、30μL10％过硫酸铵、5μL TEMED。

加入TEMED后，立即混匀，灌胶。

上样

当PAGE胶凝固后，电泳槽内加入电泳缓冲液，上样。

电泳

电泳时先用较低电压，先150V，待样品进入分离胶后，电压提高到180V，直至溴酚蓝至胶的底部为止。

染色

电泳完毕后，剥离分离胶，立即泡入考马斯亮蓝染色液中，摇床上缓慢摇30min，然后更换脱色液冲洗两次，每次约45min，染色后扫描，以标准Marker做参照，电泳显示蛋白准确表达。

见图5是，表达质粒pBPE172-α2b诱导表达SDS-PAGE电泳图，泳道4为菌种的5h上清，泳道5为菌种的5h沉淀。可见，泳道4中94KD的目标条带比泳道5亮许多，说明诱导表达产物主要以可溶性方式存在。

实施例4

诱导表达的优化。

1)诱导表达

将构建的正确的pBPE172-α2b质粒转化表达菌株E.Coli BL21的感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热击90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，37℃摇床，150rpm，45min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200μl，均匀涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，做为种子菌。

2)诱导菌株的选择

挑单菌落37℃培养过夜，第二天按1：50比例接种，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度1mM的IPTG诱导，继续培养5h，取样分析。

3)诱导温度的优化

在3个250ml摇瓶中(含50ml LB液体培养基)分别接种表达菌，37℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度1mM的IPTG诱导，分别在25℃、30℃、37℃诱导，继续培养5小时，取出摇瓶，用冷冻离心机在8000rpm、4℃离心10min，收集菌体，取样分析。

4)诱导时间的优化

按上述方法接种表达菌，37℃摇瓶培养至OD600为0.6左右时，加入1mM的IPTG，在30℃下诱导，分别在1h、2h、3h、4h和5h取样电泳，分析不同诱导时间对蛋白表达量的影响。

5)诱导剂浓度的确定

按上述方法接种表达菌，37℃摇瓶培养至OD600为0.6左右时，加入0.1mM、0.5mM、1mM的IPTG，在30℃下诱导，取样电泳，分析不同诱导剂浓度对蛋白表达量的影响。

从诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间进行优化，初步确定表达条件为30℃，IPTG浓度为1mM，诱导5h。

<110>天津大学

<120>一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法

<160>13

<210>1

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(44)

<400>1

ccctctagaa aaggaggaga atatacatta tggctaacgg ttgg    44

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(24)

<400>2

ctcgaattcc acaggcagta gatt   24

<210>3

<211>498

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>gene

<222>(1)…(498)

<400>3

atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc   60

cagatgcgtc gtattagcct gtttagctgc ctgaaagatc gtcatgattt tggctttccg   120

caggaagaat ttggcaacca gtttcagaaa gcggaaacca ttccggtgct gcatgaaatg   180

attcagcaga tcttcaacct gtttagcacc aaagatagca gcgcggcgtg ggatgaaacc   240

ctgctggata aattctatac cgaactgtat cagcagctga acgatctgga agcgtgcgtg   300

attcagggcg tgggcgtgac cgaaaccccg ctgatgaaag aagatagcat tctggccgtg   360

cgtaaatatt ttcagcgcat caccctgtat ctgaaagaaa aaaaatatag cccgtgcgcg   420

tgggaagtgg tgcgtgcgga aattatgcgt agctttagcc tgagcaccaa cctgcaggaa   480

agcctgcgta gcaaagaa   498

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(24)

<400>4

cgcgaattca tgtgcgatct gccg   24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(30)

<400>5

gtcaagcttt tctttgctac gcagtctttc   30

<210>6

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(63)

<400>6

atgtgcgatc tgccgcagac ccatagcctg ggcagccgtc gtaccctgat gctgctggcc   60

cag   63

<210>7

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(76)

<400>7

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gcatctgggc cagcag   76

<210>8

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(76)

<400>8

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<210>9

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)…(76)

<400>9

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<210>10

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)…(76)

<400>10

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<210>11

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(76)

<400>11

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<210>12

<211>76bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(76)

<400>12

tcagcgcatc accctgtatc tgaaagaaaa aaaatatagc ccgtgcgcgt gggaagtggt   60

gcgtgcggaa attatg   76

<210>13

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)…(63)

<400>13

ttctttgcta cgcaggcttt cctgcaggtt ggtgctcagg ctaaagctac gcataatttc   60

cgc   63

Claims (1)

1.一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b的构建方法，其特征由如下步骤组成：

(1)根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物EcolC1958，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体pBPE172，所述载体pBPE172中包含一段rbs序列：AAAGGAGGAG AATATACATT；

(2)将序列表SEQ ID NO.3所述的重组人干扰素α2b的核苷酸序列与所述载体pBPE172酶切后连接，得到一种重组人干扰素α2b基因的可溶性表达载体pBPE172-α2b。

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