CN105087629A

CN105087629A - 利用小球藻表达人干扰素基因的方法

Info

Publication number: CN105087629A
Application number: CN201510597160.3A
Authority: CN
Inventors: 卢其能; 周琨; 徐长豪; 李润根
Original assignee: Yichun University
Current assignee: Yichun University
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转入根癌农杆菌AGL-1；3）？利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中并表达。用小球藻的偏好密码子对人干扰素（HuIFN-α2b）基因序列进行优化改造并人工合成该基因，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。

Description

利用小球藻表达人干扰素基因的方法

技术领域：

本发明涉及生物工程技术领域，特别是一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法。

技术背景：

干扰素具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节的功能，临床应用非常广泛，市场需求量巨大。目前，临床上应用的干扰素主要是原核表达系统生产的重组蛋白，但原核表达系统存在下游提取纯化工艺复杂、成本高等缺陷，寻找新的表达系统成为药用蛋白研究和生产的热点。小球藻特别是蛋白核小球藻作为一种营养丰富且繁殖快的真核单细胞藻类，是安全的新资源食品，作为药用蛋白表达系统有着天然的优势。

利用农杆菌转化小球藻的研究是近年才出现的，2012年，Cha等^[1]利用根癌农杆菌介导转化的方法将pCAMBIA1304质粒上的T-DNA区转入普通小球藻(C.vulgaris)，并且研究了预培养时间，共培养的时间、PH值、温度，以及乙酰丁香酮浓度和农杆菌OD值对转化的影响。2013年，马瑞娟等^[2]利用根癌农杆菌介导转化的方法将pCAMBIA2301-idi的T-DNA区转入普通小球藻(C.vulgaris)，并成功获得转化子，且转化子叶黄素产量较野生型有明显提高。

用于转基因植物筛选的选择基因通常是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因。常用到的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ基因)，潮霉素磷酸转移酶基因(HptⅡ基因)和氯霉素乙酰转移酶(CAT基因)等。陈颖、王逸云、cha等^[3,4,1]人的试验说明不同的小球藻对抗生素的敏感性也不同，故如何来选择一个小球藻较敏感的抗生素以及对应的选择基因是也是当前的一个重要课题。

用于转基因植物基因表达检测的报告基因主要包括β-葡萄糖苷酶基因(GUS基因)、荧光素酶基因(Luc基因)、绿色荧光蛋白基因(GFP基因)以及冠瘿碱合成酶基因等。Cha等在转基因小球藻检测到了绿色荧光蛋白的表达。

利用小球藻获得干扰素就必须得到转干扰素基因的小球藻，小球藻的遗传转化是获得转基因小球藻的途径。在众多遗传转化方法中，通过根癌农杆菌Ti质粒构建的外源基因转化体系是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化方法，但是如何建立起一种稳定而高效的根癌农杆菌介导的小球藻遗传转化体系的关键所在。

蛋白核小球藻的培养基为BG-11+10g/L葡萄糖，用100mg/L的潮霉素筛选转化体。为了提高外源基因在小球藻中的表达效率，优化并人工合成干扰素(HuIFN-α2b)基因，构建人工合成干扰素基因与绿色荧光蛋白融合表达的植物表达载体pCAMBIA1304-IFN，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，并获得稳定遗传的小球藻转化体。通过PCR和RT-PCR的验证，检测HuIFN-α2b基因转入蛋白核小球藻并在转录水平得到了表达；WesternBlot和荧光显微镜观察鉴定融合蛋白在蛋白核小球藻转化细胞内成功表达。

发明内容：

本发明就是要提供一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，用小球藻的偏好密码子对人干扰素(HuIFN-α2b)基因序列进行优化改造并人工合成该基因，构建人工合成干扰素基因与绿色荧光蛋白基因融合表达的植物表达载体pCAMBIA1304-IFN，利用根癌农杆菌AGL-1介导的方法成功转化蛋白核小球藻，获得稳定遗传的小球藻转化体，并检测到人工合成干扰素与绿色荧光蛋白融合基因在蛋白核小球藻转化细胞中成功表达。

本发明一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其所述方法包括：1)利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2)用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1；3)利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-α2b基因整合到小球藻基因组中并表达。

本发明所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其所述1)步合成相应的小球藻表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，方法如下：(1)用小球藻Rubisc蛋白对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；(2)在优化的人干扰素HuIFN-α2b基因5′端加A，使其形成AflⅢ限制性酶切位点，在其3′去掉终止密码子，添加SpeⅠ的限制性酶切位点；(3)将pCAMBIA1304通过NcoⅠ(C|CATGG)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，人工合成人干扰素HuIFN-α2b基因用AflⅢ(A|CATGT)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，回收酶切片段，T4DNA连接酶将粘性末端连接，制成重组质粒pCAMBIA1304-IFN表达载体。

本发明所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，所述HuIFN-α2b基因序列的设计引物为：

IFN-1FP：5′ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3′

IFN-1RP：5′CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3′

其扩增产物长度为498bp；

IFN-2FP：5′ACAGGCACGACTTCGGCTTC3′

IFN-2RP：5′CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3′

其扩增产物长度为321bp。

本发明所述的方法，所述人干扰素HuIFN-α2b基因的合成按照优化后人干扰素HuIFN-α2b基因人工合成该序列，两端加AflⅢ和SpeⅠ酶切位点，将pCAMBIA1304通过NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，人工合成序列构建AflⅢ和SpeⅠ双酶切，连接两个片段构建pCAMBIA1304-IFN表达载体。

本发明所述小球藻优选为蛋白核小球藻。

本发明是根据蛋白核小球藻对密码子的偏好性，设计并合成适合蛋白核小球藻表达的HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304，构建的重组质粒命名为pCAMBIA1304-IFN，将其转化大肠杆菌，挑取若干大肠杆菌转化子提取重组质粒，经过PCR和酶切鉴定，确认重组质粒pCAMBIA1304-IFN构建成功。将pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1，挑取若干农杆菌转化子进行PCR鉴定，确定其均为阳性转化子，可作为工程菌转化小球藻。

利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组中，其中包括潮霉素抗性基因和HuIFN-α2b基因，潮霉素抗性基因的表达使得转基因小球藻可以含潮霉素的选择培养基上生长，挑取3个选择培养基上的藻落除菌，在无选择压的培养基中生长后，继续划线于含潮霉素的选择培养基上让其生长，结果只有一个藻株拥有较稳定的潮霉素抗性。提取其基因组DNA和总RNA分别进行PCR和RT-PCR鉴定，确定HuIFN-α2b基因已经成功整合入小球藻基因组DNA并且转录成功。

通过WesternBlot检测融合蛋白的表达，由于融合蛋白的分子量大约为115KDa左右，只要检测100-130KDa之间是否有特异条带即可确定融合蛋白的表达与否，最终显示结果表明转基因小球藻显出特异条带而野生小球藻没有，通过荧光显微镜观察到部分转基因小球藻发出绿色荧光而，确定优化改造并人工合成的HuIFN-α2b基因已经在小球藻细胞中成功翻译表达。

附图说明：

图1、人干扰素HuIFN-α2b基因密码子优化前后对比图，位于附图左边的是人干扰素HuIFN-α2b基因优化前的密码子，右边的则是人干扰素HuIFN-α2b基因优化后的密码子；

图2、人干扰素HuIFN-α2b基因人工合成该序列，连接两个片段pCAMBIA1304-IFN表达载体构建过程图；

图3、人干扰素HuIFN-α2b基因已经成功连入质粒pCAMBIA1304图，即重组质粒IFN-2FP/IFN-2RPPCR扩增图；

图4、根癌农杆菌提取质粒IFN-2FP/IFN-2RP扩增图；

图5、转基因小球藻的RT-PCR鉴定图；

图6、转基因小球藻干扰素融合蛋白的表达图。

本发明的图3中的1-6表示泳道，图中的泳道1表示去离子水扩增结果，泳道2-5：重组质粒扩增结果，泳道6：Maker；

本发明的图4中的1-8表示泳道，图中的泳道1表示去离子水扩增结果，泳道2-7：提取质粒扩增结果，泳道8：Maker；

图5中的1-7表示泳道，图中的泳道1表示Maker，泳道2、4、6分别表示：转基因的小球藻的cDNA、野生型小球藻的cDNA、pCAMBIA1304-IFN以及IFN-2FP/IFN-2RP引物RT-PCR扩增的结果；泳道3、5、7分别表示：转基因的小球藻的cDNA、野生型小球藻的cDNA、pCAMBIA1304-IFN以及IFN-1FP/IFN-1RP引物RT-PCR扩增的结果；

图6中1-6表示泳道，图中的泳道1-3表示转基因小球藻，泳道4-6表示野生型小球藻。

具体实施方式：

通过下述实施例对本发明作进一步的详细说明，其将有助于进一步理解本发明技术方案，但不限制本发明的内容。

实施例：

本发明所用材料与方法：

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidsa，FACHB-9)购自中科院的某生物研究所；以下实施例中所示小球藻如无殊说明均是指蛋白核小球藻；

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，AGL-1)为本单位实验室保存；

pCAMBIA1304购自长沙某生物技术有限公司；

主要仪器设备：

高速冷冻离心机、基因扩增仪、紫外可见光分光光度计、超低温冰箱、电泳仪、凝胶成像系统、灭菌锅、分析天平、酸度计、光照培养箱、恒温振荡器、酶标仪、蛋白成像系统、电转仪、荧光显微镜等；

药品与试剂:

NaCl、NaOH、K₂HPO₄·3H2O、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO₄、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、MgCl₂、NaAc、KAc、EDTA、CTAB、Tris、SDS、MES、HindⅢ、SpeⅠ、2×TaqPCRMasterMix、DNAmaker、DNaseⅠ、乙酰丁香酮、琼脂糖、琼脂粉、葡萄糖、尿素、乙醇、蛋白胨、酵母提取物、RNAout试剂盒。聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)、磺基水杨酸、NaN₃、Na₂S₂O₃、甲醛、异丙醇、冰醋酸、三氯乙酸、甘油、丙烯酰胺、N,N’-亚甲双丙烯酰胺、甘氨酸/过硫酸铵、丽春红S、考马斯亮蓝、溴酚蓝、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白预染Maker、脱脂奶粉、Tween-20、ECL发光液和NC膜、Anti-6×His-Tagantibody、羊抗兔HRP标记；

实验方法：

试剂配制，

LB(LuriaBroth)培养基：10g蛋白胨(typtone)，5g酵母提取物(yeastextract)，10gNaCl溶解于950mL去离子水中，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，1000mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，4℃保存；

LB固体培养基另加琼脂粉1.5％，IM培养基即诱导培养基：将下述2种溶液混匀配成工作液，4℃保存，

IM培养基Ⅰ(900mL)：NaCl0.15g，K₂HPO₄·3H₂O2.7g，KH₂PO₄1.45g，MgSO₄·7H₂O0.5g，(NH₄)₂SO₄0.5g，加去离子水800mL溶解，调PH至5.3，加水至900mL，121℃，25min高压除菌；

IM培养基Ⅱ(100mL)：CaCl₂·2H₂O0.067g，FeSO₄·7H₂O0.0025g，C₆H₁₂O₆2g，MES8.54g，甘油0.5g，调pH至5.3，0.22μm针头式过滤器过滤除菌；

选择固体培养基：量取90mLBG-11培养基，加入1g琼脂粉，121℃，25min高压除菌，待其温度降到60℃左右，加入10mL10×Glu+Urea、200μL100mg/mL的Amp200μL100mg/mL的Cef和200μL50mg/mL的Hyg，混匀，倒入培养皿，待其冷却凝固，封口膜密封，4℃保存；

0.1mol/LCaCl₂溶液：称取CaCl₂·2H2O1.47g，溶于足量的去离子水，100mL容量瓶定容，0.22μm针头式过滤器过滤除菌；

CaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/LMgCl₂、20mmol/LCaCl₂)：称取1.63g，溶于足量的去离子水中，加入0.1mol/LCaCl₂溶液20mL，100mL容量瓶定容，0.22μm针头式过滤器过滤除菌；

0.1mol/LCaCl₂溶液：称取CaCl₂·2H₂O1.47g，溶于足量的去离子水，100mL容量瓶定容，0.22μm针头式过滤器过滤除菌；

50％甘油：量取50mL甘油，加入50mL去离子水，混匀，121℃，25min高压除菌，4℃保存；

5mol/LNaCl溶液：称取29.22gNaCl，加热溶解于足量的去离子水，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

3mol/LNaAc(pH5.2)：称取NaAc24.6g，溶于80mL去离子水中，加冰醋酸调PH至5.2，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

1mol/LTirs-Hcl(pH8.0)：称取Tirs12.114g，溶于80mL去离子水中，加浓盐酸调节pH至8.0，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

5mol/LKAc(pH6.0)：称取KAc49.07g，溶于80mL去离子水中，加冰醋酸调PH至6.0，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

10mol/LNaOH：称取40gNaOH，溶于80mL去离子水中，100mL容量瓶定容，室温保存；

0.5mol/LEDTA(pH8.0)：称取EDTA-Na₂18.16g，加80mL去离子水，磁力搅拌器上搅拌，慢慢加入10mol/LNaOH，调节PH至8.0，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

10％SDS：称取SDS10g，加热溶解于足量去离子水中，100mL容量瓶定容，室温保存；

质粒提取溶液Ⅰ：C₆H₁₂O₆·H2O1g，1mol/LTirs-Hcl(pH8.0)2.5mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，4℃保存；

质粒提取溶液Ⅱ：10％SDS100μL，10mol/LNaOH20μL，灭菌去离子水880μL制成1mL质粒提取溶液Ⅱ，现用现配；

质粒提取溶液Ⅲ：5mol/LKAc(PH6.0)60mL，冰乙酸11.5mL，灭菌去离子水28.5mL，配好后装入一个灭菌的瓶子中，4℃保存；

0.15mol/LNaCl溶液：称取0.877gNaCl，溶于足量的去离子水，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，4℃保存；

0.02mol/LCaCl₂溶液：取灭菌的15mL离心管，加入0.1mol/LCaCl₂溶液2mL，再加入8mL灭菌去离子水，混匀，4℃保存；

100mmol/LAS(乙酰丁香酮)：称取196.2mg乙酰丁香酮，溶于5mLDMSO，加去离子水定溶于10mL，超净台中操作，所有器具都需灭菌，-20℃保存；CTAB提取液：称取CTAB2g，加入约40mL去离子水中，加入1mol/LTirs-Hcl(PH8.0)10mL，0.5mol/LEDTA(PH8.0)4mL，5mol/LNaCl溶液28mL，加热使CTAB溶解，100mL容量瓶定容，121℃，25min高压除菌，室温保存；

蛋白提取缓冲液1：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)加入0.020g/LNaN₃以及0.001g/LPMSF，

蛋白提取缓冲液2：300mL去离子水中加入45mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液、75mL甘油和，6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)以及0.001g/LPMSF

30％(W/V)丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺(Acrylamide)和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于80mL去离子水中，充分搅拌溶解，定容至100mL，0.45μm膜过滤后置于棕色瓶中4℃保存待用；

10％(W/V)过硫酸铵(AP)：0.1g过硫酸铵溶于1mL去离子水中，4℃保存待用，有效期为两周；

10％(W/V)SDS：10gSDS溶于80mL去离子水，加热溶解，定容至100mL，室温保存；

1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)：18.17gTris溶于80mL去离子水中，加入浓盐酸调节PH至8.8,定容至100mL，4℃保存待用；

1mol/LTris-HCl(pH6.8)：12.1gTris溶于80mL去离子水中，加入浓盐酸调节PH至6.8,定容至100mL，4℃保存待用；

5×Tris-Glycinebuffer：15.1gTris，94g甘氨酸，5gSDS，溶于800mL去离子水中，加热并充分搅拌使其溶解，定容至1000mL，室温保存；

5×SDS-PAGELoadingbuffer：取1.25mL1mol/LTris-HCl(pH6.8)，0.5gSDS，25mg溴酚蓝，2.5mL甘油，加去离子水溶解并定容至5mL，0.5mL/份分装，室温保存，使用前每份加入25μLβ-巯基乙醇；

考马斯亮蓝R-250染液：称取1g考马斯亮蓝R-250，加入250mL异丙醇，搅拌溶解，加入100mL冰醋酸和650mL去离子水，充分搅拌，室温保存；

考染脱色液：冰醋酸100mL，乙醇50mL，去离子水850mL，充分搅拌后，室温保存；

甲醛固定液：40％甲醇、0.5mL37％甲醛，

硫代硫酸盐显影液：3％Na₂CO₃、0.0004％Na₂S₂O₃、0.5mL/L37％福尔马林，

半干式电转缓冲液：48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸(Glycine)，0.04％SDS，20％甲醇；

10×丽春红染液：丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，去离子水定容至100mL，室温保存；

TBST：1mol/LTris-HCl(pH7.5)10mL，加入800mL去离子水，加入8.8gNaCl，加热搅拌溶解，定容至1000ml，最后加入使用前加入20％Tween20，Tween20的终浓度为0.05％。

本发明的基因序列的优化设计和表达载体的构建步骤为：

1)先确定HuIFN-α2b基因序列；

2)通过对HuIFN-α2b基因在普通小球藻中的密码子使用频率做一个分析，找出小球藻使用频率低的密码子；

3)根据小球藻Rubisc蛋白，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；

4)在优化的人干扰素HuIFN-α2b基因5′端加A，使其形成AflⅢ限制性酶切位点，在其3′去掉终止密码子，添加SpeⅠ的限制性酶切位点；

5)将pCAMBIA1304通过NcoⅠ(C|CATGG)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，人工合成HuIFN-α2b基因AflⅢ(A|CATGT)和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，回收酶切片段，T4DNA连接酶将粘性末端连接，构建pCAMBIA1304-IFN表达载体。

利用大肠杆菌DH5α感受态的制备和热激法转化：

1)将保存于-70℃超低温冰箱中的大肠杆菌DH5α菌种取出，在LB固体培养基上划线，置于37℃倒置培养过夜；

2)在长出菌落的LB固体平板上挑取单菌落至2mLLB液体培养基中，置于摇床，温度设置37℃，转速设置220rpm，摇动培养过夜；

3)将500μL菌液接种至50mLLB液体培养基中，按1﹕100比例，37℃、220rpm摇床摇动培养至OD600≈0.5，控制时间约3h，培养两瓶；

4)将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，立即冰浴10～15min，直至菌液完全冷却；

5)将离心管置于冷冻离心机中，温度设置4℃，转速设置5000rpm，离心10min，收集菌体，倒出LB液体培养基，将离心管置于灭菌滤纸上倒置1min，使残留的培养基流尽；

6)用30mL预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液重悬菌体，置于冰上；

7)将离心管置于冷冻离心机中，4℃，5000rpm，离心10min，倒出上清液，收集菌体，将离心管置于灭菌滤纸上倒置1min，使残留的溶液流尽；

8)每个离心管加2mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬菌体，然后加入860μL50％甘油，混匀，使甘油的最终浓度为15％(V/V)，置于冰上；

9)将上述菌液每50μL分装于预冷的1.5mL灭菌离心管中，液氮速冻，置于-70℃超低温冰箱中保存。

对大肠杆菌DH5α的热激法转化：

1)保存于-70℃超低温冰箱中的大肠杆菌DH5α感受态细胞取出，置于冰上融化；

2)加入1μL重组质粒混匀，置于冰上30min；

3)将混有质粒的菌液置于42℃水浴中热激90s，然后迅速置于冰上冷却2min；

4)加入700μLLB液体培养基，37℃、200rpm摇床摇动培养1h；

5)将离心管置于离心机中，5000rpm，离心10min，去除650μLLB液体培养基，然后将菌体沉淀用枪轻轻吹打，使之重悬混匀；

6)将上述菌液均匀涂布于含50mg/LKan的LB固体培养基上，置于37℃生化培养箱中倒置培养过夜。

大肠杆菌质粒的提取和鉴定：

1)挑取大肠杆菌转化子于3mL含50mg/LKan的LB液体培养基中，37℃，220rpm，摇床摇动培养过夜，然后进行如下操作；

2)在提取质粒之前，吸出500μL菌液到灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL50％甘油混匀，编号，液氮速冻，超低温冰箱保存，然后将剩余2.5mL菌液分次加入1.5mL离心管中，1200rpm离心1min，尽量吸去上清；

3)向离心管中加入100μL预冷的质粒提取溶液Ⅰ，在旋涡振荡器上振荡，将沉淀的菌体重悬，冰上放置5min；

4)配制质粒提取溶液Ⅱ，向离心管中加入200μL，盖紧管盖，轻轻地上下颠倒混匀4～6次，冰上放置5min；

5)向离心管中加入150μL质粒提取溶液Ⅲ，轻轻地上下颠倒混匀4～6次，此时菌液变得粘稠且清亮，冰上放置5min；

6)4℃，12000rpm，离心10min，将上清液吸出至一新的灭菌的1.5mL离心管中(约400μL，不可将沉淀吸出)；

7)加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，充分振荡混匀，12000rpm，离心10min；

8)取上清液至一新的灭菌的1.5mL离心管中，加入1/10体积的3mol/LNaAc(PH5.2)，加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀；

9)放入-20℃冰箱静置至少30min，然后4℃，12000rpm，离心10min；

10)弃去上清液，用75％的乙醇洗涤两次，沉淀自然干燥，加入灭菌去离子水(200μL中加1μL10mg/L的RNaseA)；

11)根据人干扰素HuIFN-α2b基因序列设计引物：

IFN-1FP：5′ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3′

IFN-1RP：5′CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3′

其扩增产物长度为498bp，

IFN-2FP：5′ACAGGCACGACTTCGGCTTC3′

IFN-2RP：5′CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3′

其扩增产物长度为321bp。

质粒的PCR鉴定，PCR扩增体系(20μL)表1：

PCR反应条件为：

PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶检测；

12)质粒的酶切鉴定：由于NcoⅠ与AflⅢ同尾酶连接后，不能被限制性内切酶识别，故利用HuIFN-α2b基因之前多克隆位点中HindⅢ限制性酶切位点与HuIFN-α2b基因最后SpeⅠ限制性酶切位点进行双酶切，切出的片段长度是1262bp。

双酶切反应体系(10μL)表2：

37℃酶切过夜，酶切产物于1.2％琼脂糖凝胶检测。

根癌农杆菌感受态细胞制备，冻融法：

1)将保存于-70℃超低温冰箱中的农杆菌菌株取出，在LB固体培养基上划线，置于28℃倒置培养1-2天，直至有菌落长出；

2)挑取农杆菌单菌落于5mLLB液体培养基中，28℃，220rpm，摇床摇动培养36h；

3)将500μL农杆菌菌液接种至50mLLB液体培养基中(按1﹕100比例)，28℃，220rpm，摇床摇动培养至OD600≈0.5(约6h)，培养两瓶；

5)将离心管置于冷冻离心机中，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌体，倒出LB液体培养基，将离心管置于灭菌滤纸上倒置1min，使残留的培养基流尽；

6)将农杆菌重悬于10mL0.15mol/LNaCl溶液中，冰上放置10min；

7)4℃，5000rpm，离心10min，倒出上清液，收集菌体，将离心管置于灭菌滤纸上倒置1min，使残留的溶液流尽；

8)将农杆菌用1mL0.02mol/LCaCl₂溶液重悬，置于冰上，

9)将上述菌液每100μL分装于预冷的1.5mL灭菌离心管中，液氮速冻，置于-70℃超低温冰箱中保存；

根癌农杆菌冻融法转化：

1)将保存于-70℃超低温冰箱中的农杆菌冻融法感受态细胞取出，置于冰上融化；

2)加入1μL重组质粒混匀，冰浴5min；

3)放入液氮速冻5min，然后37℃水浴5min；

4)加入1mLLB液体培养基，28℃，200rpm，摇床摇动培养2h；

5)将离心管置于离心机中，5000rpm，离心10min，去除1mLLB液体培养基，然后将菌体沉淀用枪轻轻吹打，使之重悬混匀；

6)将上述菌液均匀涂布于含50mg/LKan、50mg/LRif的LB固体培养基上，置于28℃生化培养箱中倒置培养2天以上，至板上长出单菌落；

根癌农杆菌质粒的提取和鉴定：

1)挑取农杆菌转化子于5mL含50mg/LKan和50mg/LRif的LB液体培养基中，28℃，220rpm，摇床摇动培养2天，然后利用康为世纪质粒小提试剂盒进行如下操作；

2)在提取质粒之前，吸出500μL菌液到灭菌的1.5mL离心管中，加入500μL50％甘油混匀，编号，液氮速冻，超低温冰箱保存，然后将剩余4.5mL菌液分次加入1.5mL离心管中，1200rpm离心1min，尽量吸去上清；

3)向有农杆菌沉淀的离心管中加入250μLBufferP1(在使用前预先加好RNaseA)，用漩涡混合器将细菌沉淀彻底重悬起来；

4)向离心管中再加250μLBufferP2，轻轻地上下颠倒混匀4～6次，使菌体充分裂解，此时菌液变得粘稠且清亮。此步操作时间不应超过5min，以防质粒受到破坏；

5)向离心管中再加250μLBufferN3，立即轻轻地上下颠倒混匀4～6次，此时离心管内会出现白色絮状沉淀，1200rpm离心10min，将沉淀离心至离心管底部；

6)将已装入收集管的吸附柱中加入200μLBufferPS，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装回收集管中；

7)将步骤5所得的上清液加入已经装入收集管的吸附柱中，不可将沉淀吸出，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱装回收集管中；

8)向收集管中加入600μLBufferPW，使用之前预先加入无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

9)重复步骤8；

10)将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温下数分钟，将残留的乙醇挥发掉；

11)将吸附柱置于一个新的灭菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μLBufferEB(预先在65℃-70℃加热)，室温放置数分钟，12000rpm离心1min；

12)将离心管中的质粒溶液重新加到吸附膜的中间部位，重复步骤11，然后收集质粒溶液做鉴定，剩余的-20℃保存；

13)农杆菌提取质粒的PCR鉴定与大肠杆菌相同；

用根癌农杆菌AGL-1介导的方法转化蛋白核小球藻：

1)挑取农杆菌转化子于10mLLB液体培养基中(含50mg/LKan和50mg/LRif)中，两管，28℃，220rpm，摇床摇动培养2天；

2)将上述培养的菌液转移至两只50mL的灭菌离心管中，4000rpm，离心10min收集菌体，倒掉上清液；

3)向每只离心管中加入5mLIM培养基，将菌体重悬，4000rpm，离心10min收集菌体，倒掉上清液；

4)向每只离心管中加入适量IM培养基，使得菌液的初始OD₆₀₀在0.2至0.3之间,加入卡那霉素，使其终浓度为50mg/L，加入乙酰丁香酮，使其终浓度为150μmol/L，28℃，150rpm，培养6-8h，直至OD₆₀₀达到0.8-1.0；

5)将培养至对数期的蛋白核小球藻转移至两只1.5mL的离心管中，4000rpm离心10min，将上清液吸去；

6)向每只离心管中加入1mLIM培养基，使蛋白核小球藻重悬，4000rpm离心10min，将上清液吸去；

7)将两只离心管中的蛋白核小球藻浓缩重悬至1mLIM培养基中；

8)将100μL诱导培养后的农杆菌菌液与100μL上述蛋白核小球藻液混匀，装入旋盖的1.5mL的离心管中，管盖拧松，25℃，生化培养箱黑暗共培养2天；

9)2天后将共培养藻液均匀涂布于选择培养基上，28℃，生化培养箱黑暗培养3天，然后光照培养；

转化蛋白核小球藻除菌和遗传稳定性检测：

1)挑取蛋白核小球藻转化子于BG-11+10g/LGlu液体培养基(含200mg/LAmp、200mg/LCef)中培养至对数期；

2)用接种针蘸取上述藻液划线于选择培养基，培养观察其生长状况；

转基因小球藻基因组DNA的提取和PCR验证：

1)取10mL处于对数生长期的小球藻，12000rpm，离心5min，弃上清收集藻体，滤纸上倒置1min，尽量倾去残留的痕量培养基；

2)加入1.5mLCTAB提取液重悬藻体，将藻液吸出至预冷的研钵，快速研磨，吸取700μL研磨好的藻液至1.5mL离心管中，65℃水浴50min，每十分钟颠倒摇晃一次；

3)水浴完成后加入700μL苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混匀，12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中；

4)向离心管中加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中；

5)向离心管中加入加入1/10体积的3mol/LNaAc(PH5.2)，加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20℃静置30min以上；

6)12000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，加入300μLTE缓冲液溶解，加入3μL10mg/L的RNaseA，37℃水浴30min；

7)重复步骤4，5；

8)12000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，加入20μL灭菌去离子水，-20℃保存备用；

9)小球藻基因组DNAPCR鉴定反应体系及条件同前质粒PCR鉴定，产物于1.2％琼脂糖凝胶检测。

转基因小球藻总RNA的提取和RT-PCR验证：

1)取30mL处于对数生长期的小球藻，12000rpm，离心5min，弃上清收集藻体，滤纸上倒置1min，尽量倾去残留的痕量培养基；

2)将装有藻体沉淀的离心管放入超低温冰箱，待藻体冻结后取出，称取200mg左右的藻体，利用天恩泽柱式植物RNAout试剂盒进行如下操作；

3)将藻体放入预冷的研钵，加入溶液A研磨(溶液A预先65℃水浴)；

4)取1mL研磨物至一灭菌的1.5mL离心管中，加入0.3mL的溶液B和0.2mL的氯仿，在振荡器上振荡30s将其混匀；

5)12000rpm离心5min，取上清液(约600μL)至新的灭菌离心管中，加入0.5mL的溶液C和0.2mL的氯仿，

6)12000rpm离心3min，取上清液(约1mL)至一新的灭菌离心管中，加入0.5倍体积的溶液D，上下颠倒使之混匀；

7)将一半的溶液转移至装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心30s，弃收集管中的废液，然后将另一半加入同一吸附柱中进行同样的步骤；

8)向吸附柱中加入0.7mL通用洗柱液，12000rpm离心30s，弃废液；

9)向吸附柱继续加0.3mL通用洗柱液，12000rpm离心30s，弃废液，再12000rpm离心30s，去掉残留的乙醇；

10)将吸附柱转移至DEPC水处理的RNase-free离心管，加入50μLRNA洗脱液，室温放置1-2min；

11)12000rpm离心30s，收集小球藻总RNA，将10μLRNA溶于2mLTE缓冲液中测其OD₂₆₀，得出RNA的浓度；

12)用DNaseⅠ(RNase-free)除去RNA中的痕量DNA，剩余的RNA超低温冰箱保存。

反应体系(10μL)表3：

37℃反应30min，向反应液中加入1μL50mMEDTA，络合反应液中的Mg²⁺，65℃反应10min，使DNaseⅠ失活，利用TIANGENQuantcDNA第一链合成试剂盒进行以下操作；

13)将Oligo(dT)₁₅、superpuredNTP、RNase-freeddH₂O、10×RTMix在室温条件下解冻，振荡混匀，快速离心，然后立即置于冰上；

14)按照下述体系将Oligo(dT)₁₅、superpuredNTP、RNase-freeddH₂O和10×RTMix混合，振荡混匀，快速离心，置于冰上；

15)将RNA模板加入反应体系中，振荡混匀，快速离心。

反应体系(10μL)表4：

37℃反应60min，然后进行PCR反应，反应进行40个循环，产物于1.2％琼脂糖凝胶检测。

总蛋白提取：

取10mL野生小球藻藻液,12000rpm离心10min，取沉淀至预冷的研钵中，加入200μL提取缓冲液1或提取缓冲液2，充分研磨，直至将藻体研磨碎，释放出蛋白；6000rpm，4℃离心10min，取上清，煮沸10min后12000rpm，4℃离心10min，取上清，4℃保存准备上样，其余-20℃保存。

SDS-PAGE电泳：

1.配置10％的分离胶(去离子水4mL、30％丙烯酰胺溶液2.5mL、1.5mol/LTris-HCl0.9mL、10％SDS75μL、10％AP60μL、TEMED5μL)；

2.将配好的分离胶沿着玻璃板边缘加入制胶槽，在分离胶溶液上盖一层异丙醇压胶，待分离胶凝固之后，吸去异丙醇；

3.配置5％的浓缩胶(去离子水2.1mL、30％丙烯酰胺溶液0.5mL、1mol/LTris-HCl0.37mL、10％SDS25μL、10％AP25μL、TEMED5μL)；

4.将配好的浓缩胶沿玻璃板边缘加入制胶槽，插入梳子；

5.待凝胶凝固后将胶板放入电泳槽中，加入1×Tris-Glycinebuffer，使凝胶的上下均浸泡在缓冲液中，拔出梳子；

6.做提取缓冲液对蛋白提取影响时，上样量选择相同的体积，做WesternBlot时，上样量既要相同的质量也要相同体积，每孔上样量约20μg蛋白，根据蛋白定量结果取相应体积的蛋白样品，加入5×SDS-PAGELoadingbuffer，煮沸10min后离心取上清上样；

7.浓缩胶选择80V电压，电泳20min，然后切换120V电压，电泳60min，当染料到达凝胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步考染、银染或转膜进行WB检测。

WesternBlot：

1.转膜：转膜前将NC膜和滤纸在电转液中浸泡10min，胶也在电转液中平衡1min，然后将膜、胶和滤纸排列成三明治式(滤纸三层/凝胶/NC膜/滤纸三层)，用电转液浸湿后，置于电转仪的正负极之间，凝胶在负极一端，NC膜在正极一端，9V，转膜1h。

2.丽春红检测膜上蛋白：将转好的膜放入TBST中洗一次，置于丽春红工作液中，室温下摇床摇动染色5min，，去离子水洗膜，直至水不再变色，蛋白条带显示出红色条带

3.封闭；将100-130KDa之间的膜切下来，用5％脱脂奶粉室温封闭1h

4.孵育一抗：按照说明书将Anti-6×His-Tagantibody用5％BSA1:1000稀释，将抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，室温孵育2h或者4℃孵育过夜

5.孵育二抗：孵育一抗的NC膜用TBST洗3次，每次5min，然后将二抗用5％脱脂奶粉1:1000稀释，37℃孵育1h，TBST洗3次，每次5min。

6.显色：将ECL发光液A和B等量混匀配置ECL发光液，加在NC膜的正面，暗室避光5min，倒掉显色液，用纸将显色液吸掉，在膜上面盖一层平整的透明纸。将膜放入凝胶成像系统扫描，根据条带强弱调整感光时间以达到理想效果；

表达产物的观察与验证：

取生长后期的转基因小球藻与未转基因的小球藻制成临时玻片，在荧光显微镜下观察小球藻细胞是否有绿色荧光，以验证干扰素与绿色荧光蛋白的融合蛋白是否表达。

结果与分析：

人干扰素HuIFN-α2b基因的优化设计：

人干扰素HuIFN-α2b基因序列为人类基因序列，有些密码子在小球藻中使用频率极低或不常使用，为了最大限度地提高在宿主小球藻中的基因表达效率，用小球藻的偏好密码进行替换。找到小球藻使用频率低的密码子CTA、CAA、AGA、ATA、AAA、TTA；Rubisc是地球上最丰富的蛋白，是植物和小球藻中含量最多，表达量最高的蛋白之一；因此，用小球藻Rubisc蛋白(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉，对比优化前后序列差异性如图1所示。

人干扰素HuIFN-α2b基因的合成和表达载体的构建：

按照优化后HuIFN-α2b基因人工合成该序列，两端加AflⅢ和SpeⅠ酶切位点，将pCAMBIA1304通过NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，人工合成序列构建AflⅢ和SpeⅠ双酶切，连接两个片段构建pCAMBIA1304-IFN表达载体，如图2所示，测序确定该载体构建正确。

大肠杆菌的遗传转化、转化体的筛选和鉴定：

挑取四个大肠杆菌转化子提取重组质粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物扩增，结果可以看到重组质粒可以扩增出498bp和321pb长的片段，可知这四个大肠杆菌均为阳性转化子，而且HuIFN-α2b基因已经成功连入质粒pCAMBIA1304，如图3所示；

将大肠杆菌中提取的重组质粒进行HindⅢ和SpeⅠ双酶切，可以看到经过酶切后，出现一条介于1000bp和2000bp之间的条带，靠近1000bp，与重组质粒两个酶切位点之间1262bp的距离一致，可知HuIFN-α2b基因已经连入质粒pCAMBIA1304对应的位点，重组质粒连接正确；

根癌农杆菌的遗传转化、转化体的筛选和鉴定：

挑取六个农杆菌转化子提取质粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物扩增，结果可以看到扩增出498bp和321pb长的片段，可知这六个农杆菌均为阳性转化子，可以作为转化小球藻的工程菌，如如图4所示；

小球藻的遗传转化和转化体的筛选：

将诱导培养后的农杆菌，含有pCAMBIA1304-IFN表达载体菌液与经过处理的对数期小球藻藻液混匀，装入离心管中，25℃，黑暗共培养2天；2天后将共培养藻液均匀涂布于选择培养基上，28℃，生化培养箱黑暗培养3天，然后光照培养，约2周后，选择培养基上长出少量藻落，获得小球藻转化体，而对照组则没有藻落长出。

小球藻转化体的PCR鉴定，所述小球藻为蛋白核小球藻：

为了验证小球藻转化体的真实性，提取小球藻转化体和野生型小球藻的基因组DNA，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物扩增，结果转基因小球藻DNA可以扩增出498bp和321pb长的片段，且与pCAMBIA1304-IFN质粒扩增出的片段长度相同，而野生型的小球藻的DNA没有相应的条带扩增出来，可知HuIFN-α2b基因已经成功转入小球藻。

小球藻转化体的RT-PCR鉴定：

为了考察小球藻转化体中人干扰素基因在转录水平上的表达情况，提取转基因小球藻和野生型小球藻的总RNA，逆转录合成cDNA，然后以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物扩增，结果转基因小球藻的cDNA可以扩增出498bp和321pb长的片段，与pCAMBIA1304-IFN质粒扩增出的片段长度相同，而野生型小球藻的cDNA没有相应的条带扩增出来，可知HuIFN-α2b基因已经在小球藻细胞内成功转录。

WesternBlot检测转基因小球藻干扰素融合蛋白的表达：

确定HuIFN-α2b基因已经转入小球藻并可以成功转录后，要进一步验证融合蛋白的表达必须通过Westernblot，在融合蛋白的C端带有6个组氨酸组成的His-tag，利用该标签可以提取以及鉴定融合蛋白；

用提取缓冲液1提取转基因小球藻和野生型小球藻的总蛋白，WesternBlot检测C端带有His-tag的融合蛋白，将100-130KDa之间的膜切下来，封闭，孵育一、二抗，然后显色，转基因小球藻的膜上出现条带而野生型小球藻对应的位置没有相应的条带显现出来，可知融合蛋白在转基因小球藻中表达，如图6所示；转基因小球藻融合蛋白观察：

将转基因小球藻与未转基因的小球藻临时玻片在荧光显微镜下观察可看到转基因小球藻细胞有一部分呈现绿色荧光，而野生型小球藻则基本全部呈现由叶绿体发出的红色荧光，可见干扰素与绿色荧光蛋白的融合蛋白已经在小球藻细胞内成功表达，可能由于遗传的不稳定、外源蛋白表达量的差异或者表达的时空差异，转基因小球藻也不是全部都呈现绿色荧光；

根据蛋白核小球藻对密码子的偏好性，设计并合成适合蛋白核小球藻表达的HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304，挑取4个大肠杆菌转化子提取重组质粒，经过PCR和酶切鉴定，确认重组质粒pCAMBIA1304-IFN构建成功。将pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1，挑取6个农杆菌转化子进行PCR鉴定，确定其均为阳性转化子，可作为工程菌转化小球藻。利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，其中包括潮霉素抗性基因和HuIFN-α2b基因，潮霉素抗性基因的表达使得转基因小球藻可以含潮霉素的选择培养基上生长，挑取3个选择培养基上的藻落除菌，在无选择压的培养基中生长后，继续划线于含潮霉素的选择培养基上让其生长，结果只有一个藻株拥有较稳定的潮霉素抗性。提取其基因组DNA和总RNA分别进行PCR和RT-PCR鉴定，确定HuIFN-α2b基因已经成功整合入小球藻基因组DNA并且转录成功；

通过WesternBlot检测融合蛋白的表达，由于融合蛋白的分子量大约为115KDa左右，只要检测100-130KDa之间是否有特异条带即可确定融合蛋白的表达与否，最终显示结果表明转基因小球藻显出特异条带而野生小球藻没有，通过荧光显微镜观察到部分转基因小球藻发出绿色荧光而，确定人干扰素HuIFN-α2b基因已经在小球藻细胞内成功翻译表达。

Claims

1.一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，以小球藻为生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密码子对人干扰素HuIFN-α2b基因序列进优化改造，其特征是所述方法包括：1）利用小球藻的使用频率高的偏好密码子取代小球藻的使用频率低的密码子，人工合成在小球藻中表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，并连入pCAMBIA1304中，构建重组质粒pCAMBIA1304-IFN，并转化大肠杆菌；2）用大肠杆菌转化子提取重组质粒pCAMBIA1304-IFN，将所述重组质粒pCAMBIA1304-IFN转入根癌农杆菌AGL-1；3）利用根癌农杆菌介导的小球藻转化方法，将重组质粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA区整合入小球藻的基因组DNA中，使优化改造的人干扰素HuIFN-α2b基因整合到小球藻基因组中并表达。

2.依据权利要求1所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征是所述1）步合成相应的小球藻表达的人干扰素HuIFN-α2b基因序列，方法如下：（1）用小球藻Rubisc蛋白对应氨基酸的密码子将小球藻使用频率低的密码子替换掉；（2）在优化的人干扰素HuIFN-α2b基因5′端加A，使其形成AflⅢ限制性酶切位点，在其3′去掉终止密码子，添加SpeⅠ的限制性酶切位点；（3）将pCAMBIA1304通过NcoⅠ（C|CATGG）和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，人工合成人干扰素HuIFN-α2b基因用AflⅢ（A|CATGT）和SpeⅠ(A|CTAGT)双酶切，回收酶切片段，T4DNA连接酶将粘性末端连接，制成重组质粒pCAMBIA1304-IFN表达载体。

3.依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征是所述人干扰素HuIFN-α2b基因序列的设计引物为：

IFN-1FP：5′ATGTGCGACCTTCCCCAGAC3′

IFN-1RP：5′CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC3′

其扩增产物长度为498bp；

IFN-2FP：5′ACAGGCACGACTTCGGCTTC3′

IFN-2RP：5′CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC3′

其扩增产物长度为321bp。

4.依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征所述人干扰素HuIFN-α2b基因的合成按照优化后人干扰素HuIFN-α2b基因人工合成该序列，两端加AflⅢ和SpeⅠ酶切位点，将pCAMBIA1304通过NcoⅠ和SpeⅠ双酶切，人工合成序列构建AflⅢ和SpeⅠ双酶切，连接两个片段构建pCAMBIA1304-IFN表达载体。

5.依据权利要求1或2所述的一种利用小球藻表达人干扰素基因的方法，其特征所述小球藻为蛋白核小球藻。