CN105585621A

CN105585621A - 大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用

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Publication number: CN105585621A
Application number: CN201610127507.2A
Authority: CN
Inventors: 王全伟; 朱美娇
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2016-03-07
Filing date: 2016-03-07
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2036-03-07
Also published as: CN105585621B

Abstract

本发明公开了大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明克隆了一个新基因GmAIRP1，将其转入烟草中，得到转GmAIRP1烟草，用高盐胁迫条件处理转GmAIRP1烟草和野生型烟草，转GmAIRP1烟草长势优于野生型烟草；对两组植株的POD、CAT、MDA、脯氨酸含量测定结果显示，转基因植株清除自由基和调节渗透压的能力总体高于野生植株，揭示GmAIRP1可能参与了植物的抗盐调控过程，为培育抗盐性植物奠定基础。

Description

大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因与应用。

背景技术

盐碱、干旱等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境因子导致植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。植物在长期的进化中，逐渐形成了一系列应答逆境胁迫的防御机制，其中泛素/26S蛋白酶体途径是应答胁迫的一个重要途径。泛素连接酶E3决定靶蛋白的特异性识别，在泛素化过程中具有至关重要的作用。

大豆是我国重要的经济作物和粮食作物，干旱、盐碱等非生物胁迫导致其产量和品质均大大下降，既不能满足国内人民生活的需求，也极大限制了大豆的出口。探究泛素/26S蛋白酶体途径在大豆抵御非生物胁迫中的功能与作用机制、挖掘相关调节基因，将有助于推动大豆抗逆遗传育种。

发明内容

本发明的一个目的是提供大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因。

本发明提供的蛋白，命名为GmAIRP1，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的蛋白质；

2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将序列表中序列1所示的GmAIRP1基因替换表达载体PBI121的BamHI和SacI酶切位点间DNA片段得到的载体，命名为pBI121-GmAIRP1。

扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗盐性；上述调控为提高。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为烟草。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述抗逆性为抗盐性。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为烟草。

上述转基因植物的抗盐性高于所述目的植物体现在高盐胁迫下，转GmAIRP1烟草的POD或CAT含量高于野生型烟草；或转GmAIRP1烟草的MDA含量低于野生型烟草；或转GmAIRP1烟草长势优于野生型烟草。

本发明的实验证明，本发明克隆了一个新基因GmAIRP1，将其转入烟草中，得到转GmAIRP1烟草，用高盐胁迫条件处理转GmAIRP1烟草和野生型烟草，转GmAIRP1烟草长势优于野生型烟草；对两组植株的POD、CAT、MDA、脯氨酸含量测定结果显示，转基因植株清除自由基和调节渗透压的能力总体高于野生植株，揭示GmAIRP1可能参与了植物的抗盐调控过程，为培育抗盐性植物奠定基础。

附图说明

图1为GmAIRP1基因的RT-PCR扩增结果。

图2为100μmol/LABA诱导下GmAIRP1基因的表达模式。

图3为200mmol/LNaCl诱导下GmAIRP1基因的表达模式。

图4为农杆菌中重组质粒的PCR鉴定。

图5为转GmAIRP1烟草的PCR产物电泳检测结果。

图6为转GmAIRP1烟草的RT-PCR检测。

图7为转GmAIRP1烟草的发育进程。

图8为野生型烟草种子与转GmAIRP1烟草种子对比。

图9为转GmAIRP1烟草盐胁迫下的表型分析。

图10为200mmol/LNaCl处理下转GmAIRP1烟草和野生烟草中的POD、CAT和MDA含量。

图11为200mmol/LNaCl处理下转GmAIRP1烟草和野生烟草中的脯氨酸含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

合丰45大豆(不同株型大豆群体分布对产量形成的影响.大豆科学，2005，29(4)：634-637.)；

龙江981烟草(烤烟新品种龙江981的选育及其特征特性.中国烟草科学，2015，36(4)：18-23.)

农杆菌菌株为EHA105(影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报，2012,3(1)：22-27.)

植物表达载体质粒PBI121全长14Kb，含有卡那霉素抗性，记载在如下文献中：致病疫霉NLP家族基因PITG_10839的克隆和功能分析.中国农业科学，2014,47(5):895-902。

MS培养基，1/2MS培养基，卡那霉素(Kan)，头孢霉素(Cef)，利福平(Rif)、6BA，NAA等。

RNA提取试剂盒RNApreppurePlantKit、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒均购自天根生物有限公司；RNA反转录试剂盒FirstStrandcDNASynthesisKit购自东洋纺生物有限公司；限制性内切酶BamHI和SacI均购自NEB公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、氨苄青霉素(Amp)购自宝生物(大连)有限公司。

实施例1、GmAIRP1基因的克隆及表达模式

一、GmAIRP1基因的克隆

利用primerpremier5.0设计引物，并分别在引物5′端加上BamHI和SacI两个限制内切酶识别位点，引物序列如下：

GmAIRP1-P1：5′CGGGATCCATGGGCGGTTGCTGTTGT3′

BamHI

GmAIRP1-P2：5′GGAGCTCTTATTCAATGGGAGGGTCG3′

SacI

提取合丰45大豆的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，用GmAIRP1-P1和GmAIRP1-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR扩增产物电泳结果如图1所示，M:DL2000分子量标准；1～8:PCR扩增产物，得到约640bp大小的目的条带。

将上述PCR扩增产物与pMD-19Tsimple载体连接，转化E.coliDH5α，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定初步筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行测序，结果该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，序列表中序列1所示的基因命名为GmAIRP1，该基因的开放阅读框为序列1第1-642位核苷酸，其编码的蛋白命名为GmAIRP1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2所示，该蛋白由213个氨基酸残基组成。

二、GmAIRP1基因在逆境胁迫和激素诱导下的表达模式分析

1、逆境胁迫

将合丰45大豆种子播种于蛭石中，在温度为28℃的温室中培养，当幼苗长至第三片三出复叶时，进行各种处理。

(1)盐胁迫处理：在干燥的蛭石中浇入含200mmol/LNaCl的Hoagland溶液，处理0～24h；

(2)ABA处理：在干燥的蛭石中浇入含100μmol/LABAHoagland溶液，处理0～24h。

分别于0.5h、1h、1.5h、3h、6h、12h和24h取不同处理组的大豆叶片，用去离子水冲洗，液氮速冻后于-80℃保存，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行RT-PCR。

上述内参及目的基因引物如表1所示，

表1为内参及目的基因引物

ABA胁迫GmAIRP1基因表达结果如图2(上图为电泳图，下图为柱状图)所示，在ABA处理之后，GmAIRP1基因的表达量大致呈现一个先降后升的趋势，通过柱状图可以观察到，在处理后1h和6h时表达量最高，1h时达到峰值，在12h后该基因表达量趋于平稳，这表明短时间的ABA处理能够诱导该基因上调表达。

高盐胁迫GmAIRP1基因表达结果如图3(上图为电泳图，下图为柱状图)所示，用200mmol/LNaCl处理初期，GmAIRP1基因的表达量表现一定程度的下降，在处理1h达到峰值，3h时表达量稍有下降，但也维持在一个比较高的表达水平，在6h时该基因表达量回落，12h又再次升高，直到24h后又再次回落，总体呈现一个先下降后升高最后下降的趋势。实验表明，短时间内的盐胁迫可以诱导该基因表达量的升高，并在1h和3h时维持一个比较高的表达水平。

实施例2、GmAIRP1基因的功能鉴定

一、重组载体的构建

将实施例1的一获得的642bp的PCR产物经过BamHI和SacI酶切，与经过相同酶切的表达载体PBI121连接，得到重组载体。

经过测序，重组载体为将序列表中序列1所示的GmAIRP1基因替换表达载体PBI121的BamHI和SacI酶切位点间DNA片段得到的载体，命名为pBI121-GmAIRP1。

二、重组菌的制备

三亲杂交法将目的质粒pBI121-GmAIRP1导入农杆菌EHA105，具体如下：

(1)将受体农杆菌EHA105接种于含有100mg/L利福平的YEP固体培养基上，28℃培养，待长出单菌落，挑取一个单菌落接种于液体培养基中，28℃振荡培养。

(2)将含有prk2013(上海北诺生物科技有限公司，货号addgene0697，Kan抗性)的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，37℃培养，待长出单菌落，挑取一个单菌落接种于液体培养基中，37℃振荡培养(1天)。

(3)挑选带有pBI121-GmAIRP1质粒的大肠杆菌单菌落在含50mg/L的Kan液体LB培养基中37℃震荡培养(1天)。

(4)待三种菌长到OD为0.5左右时，等体积(共150～200μl)混匀，涂布于不含任何抗生素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。

(5)将长出的菌落转接到含有100mg/L利福平和50mg/LKan的YEP固体培养基上，28℃培养2-4天，长出单菌落。

(6)将单菌落再次转接到含有100mg/L利福平和50mg/LKan的YEP固体培养基上，28℃培养2天，长出单菌落。

将上述单菌落培养于50mg/L利福平和50mg/LKan的YEP液体培养基中，提取质粒，用引物GmAIRP1-P1、GmAIRP1-P2进行扩增。

结果如图4所示，M：DL2000分子量标准；1-2：单克隆菌落PCR产物；3：空白对照，得到642bp的为阳性克隆，将上述阳性克隆命名为EHA105/pBI121-GmAIRP1。

三、转GmAIRP1烟草的获得

1、农杆菌介导的烟草遗传转化制备转GmAIRP1烟草

(1)无菌苗的获得

取龙江981烟草(以下也称为野生型烟草)种子在95％的乙醇中浸泡1min，用无菌水冲洗4次，然后用10％的次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗6次，将种子接种到MS培养基上或铺有3-4层潮湿的滤纸上，待植株长到4-5片真叶时即可用于感染。

(2)预培养：取烟草叶片，无菌条件下用解剖器将烟草叶片切成约5mm直径的叶盘，放入MS1(MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA)培养基中预培养48小时。

(3)农杆菌活化：挑取一个转化后的农杆菌单菌落，接种于10mlYEP液体培养基(含50mg/LRif和50mg/LKan)中，28℃，250r/min振荡培养过夜，次日，以1：100比例转接至20ml上述YEP培养基中活化(为避免生长过度，可多接种几瓶)，28℃，250r/min振荡培养至对数生长期(OD600＝0.5～0.6)。

(4)侵染与共培养：将烟草叶圆片浸入活化的农杆菌菌液中5～8min。用灭菌的滤纸吸净多余的菌液，置于MS1培养基上，于黑暗处28℃共培养30～48h。

(5)芽诱导：将叶片转置于诱导出芽的MS2选择培养基(MS1+100mg/LKan+500mg/LCef)上，室温25℃，16h，3000Lux光照条件下培养。三天转一次，连续转三次后，以后每两周转一次。

(6)生根和移栽：待不定芽长到1厘米左右时，将芽转移至MS3培养基(1/2MS+0.2mg/LNAA+l00mg/LKan+250mg/LCef)上诱导生根，等根长到6-7厘米时，移至蛭石中，一个星期后将植株移入土壤中，得到T₀代转GmAIRP1烟草。

上述发展流程如图7所示，A:愈伤组织的诱导和分化；B：再生植株；C：阳性植株开花与结实。

2、转GmAIRP1烟草的分子生物学鉴定

1)PCR鉴定

提取T₀代转GmAIRP1烟草叶片的基因组DNA，用引物GmAIRP1-P1、GmAIRP1-P2进行PCR扩增，得到PCR产物。以野生型烟草为对照。

PCR产物电泳结果如图5所示，M：DL2000分子量标准；1-7：T₀代转GmAIRP1烟草；8：阳性对照pBI121-GmAIRP1；9：野生型烟草对照；10：空白对照，得到642bp为PCR鉴定阳性T₀代转GmAIRP1烟草。

(2)RT-PCR鉴定

提取上述PCR鉴定阳性T₀代转GmAIRP1烟草的RNA，反转录为cDNA，用GmAIRP1基因引物P1、P2进行RT-PCR检测，得到PCR产物。

PCR产物电泳结果如图6所示，M：DL2000分子量标准；1-3：阳性T₀代转GmAIRP1烟草；4：野生型烟草对照；5：空白对照6：阳性对照pBI121-GmAIRP1，得到642bp为阳性T₀代转GmAIRP1烟草。

采用同样的方法将pBI121载体转入野生型烟草中，得到T₀代转pBI121烟草，采用同样的方法进行PCR鉴定和RT-PCR鉴定，结果与野生型烟草无显著差异。

T₀代收种得到T₁代。

四、转GmAIRP1烟草的表型及抗逆性检测

1、表型检测

观察阳性T₀代转GmAIRP1烟草和野生型烟草的种子，结果如图8所示，A：野生型烟草种子；B：阳性T₀代转GmAIRP1烟草种子，可以看出，阳性T₀代转GmAIRP1烟草种子相比野生型烟草种子颜色更深，接近黑色，籽粒也没有野生型种子饱满，推测可能是因为外源基因的转入影响了烟草的结实，具体作用机制还需进一步研究。

2、转基因烟草的抗逆性鉴定

10mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液；POD反应液；CAT反应液；3％磺基水杨酸水溶液；2.5％酸性茚三酮显色液；甲苯；85％磷酸；冰乙酸；10％TCA；0.6％TBA；Hoagland溶液；NaCl；PEG6000；6-BA；NAA等。

1)将阳性T₀代转GmAIRP1烟草进行无性繁殖

选用阳性T₀代转GmAIRP1烟草的幼叶叶片，经去离子水洗后用70％乙醇擦洗叶片表面，后立即置于10％次氯酸钠溶液中进行表面灭菌6分钟，接着在无菌条件下，用无菌去离子水洗涤4-5次，用无菌吸水纸吸去叶片表面的水分，并除去主脉。切成约5x5(毫米)的小块，接种于装有MS(2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+100mg/LKan)培养基，每瓶5块。材料接种后,将培养瓶置于25士l℃的恒温培养间进行培养,每天用日光灯光照10小时，将所得芽转入1/2MS(0.2mg/LNAA+100mg/LKan)培养基中进行生根处理，待幼苗长出2-3片幼叶，作为无性繁殖转GmAIRP1烟草。

2)高盐胁迫处理

将上述无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T₀代转pBI121烟草分别移到含有200mmol/LNaCl的1/2MS培养基中，置于25士l℃的恒温培养室进行培养，每天用日光灯光照10小时，21天后观察幼苗生长形态，并拍照。

结果如图9所示，上：野生型植株(A1-A2)；下：无性繁殖转GmAIRP1烟草(B1-B2)，可以看出，在高盐处理下，转GmAIRP1烟草生长情况好于野生型烟草，因此转GmAIRP1烟草(B1-B2)的抗盐性高于野生型烟草。

3)检测胁迫处理后相关生理指标

选取无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T₀代转pBI121烟草栽种于蛭石中，用Hoagland溶液培养一个月，选择长势一致的植株分别进行胁迫处理。盐胁迫处理：在干燥的蛭石中浇入含200mmol/LNaCl的Hoagland溶液，处理3d；分别在第1d、2d、3d进行取材，将所取材料用液氮冷冻后存于-80℃冰箱待用。实验设三次重复。

A、抗氧化酶活性测定

(1)酶液的提取

分别称取0.1g各组经高盐胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T₀代转pBI121烟草叶片加入2ml预冷的50mmol/L磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维为止，分装在小离心管中，再用1mlpH7.0的磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入50ml心管中，10000rpm离心20min，吸取上清液2ml即为POD和CAT粗酶提取液。

称取0.15g各组经高盐胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T₀代转pBI121烟草叶片，加1ml的10％TCA于研钵中研磨，然后再加0.5mlTCA继续研磨，匀浆在4000r/min离心10min,上清液即为MDA粗酶提取液。

(2)酶活性测定

a、POD活性的测定

取上清液50μl加入比色杯中(对照加磷酸缓)，加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读1次OD470值(读0，1，2min)。

计算公式：POD总活性(Ug/min)＝△A470*V_T/V_S*W*0.01*t；

注：△A：反应时间内吸光值的变化，V_T：总粗酶液体积(ml)，V_S：测定时所用粗酶液体积(ml)，W：样品鲜重(g)，t：时间(min)。

b、CAT活性的测定

分别吸取上清酶液和用沸水煮过的上清酶液200μl加入比色杯中(对照加磷酸)，加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔30S再读一次(读第0，1，2，3min的OD值)。

计算公式：CAT总活性(Ug/min)＝[A₁-(A₂+A₃)/2]*V_T/0.1*V_S*W*t；

注：A₁:加入煮死酶液的对照管吸光值，A₂、A₃：样品吸光值，V_T：总粗酶液体积(ml)，V_S：测定时所用粗酶液体积(ml)，W：样品鲜重(g)，t：时间(min)。

c、MDA活性的测定

取离心的上清液2ml(对照用2ml蒸馏水代替)，加入2ml0.6％TBA，混合后于沸水中反应15min,取上清夜测定450、532及600nm处的OD值。

计算公式：

MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56×D₄₅₀

MDA含量(μmol/g)＝MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(ml)/鲜重(g)

结果如图10所示，可以看出，在200mmol/LNaCl处理下处理下两组植物的POD含量大致呈现出先升后降的趋势。胁迫第1天，转GmAIRP1烟草的POD活性达到最大峰值，显著高于野生型烟草POD的活性。随着胁迫时间增加两组植株POD活性均下降，可能是随着胁迫时间的增长，两组植株氧化物酶系统遭到破坏所致。由此推测，短时间内转GmAIRP1烟草可先启动抗氧化酶系统抵御外界胁迫。

200mmol/LNaCl处理时转GmAIRP1烟草和野生型烟草的CAT活性都呈现逐渐上升的趋势，且转GmAIRP1烟草的CAT的活性均高于野生型烟草。

200mmol/LNaCl处理下，转GmAIRP1烟草与野生型烟草的MDA含量都不断累积，但转GmAIRP1烟草MDA含量均低于野生植株，表明膜质过氧化程度低于野生型植株，可能的原因是GmAIRP1基因的表达能更有效的启动转基因植株的抗氧化酶系统，以降低盐害对膜的损伤程度。

野生型烟草和T₀代转pBI121烟草结果无显著差异。

由此推测，高盐胁迫下，转基因植株的抗盐性高于野生植株。

B、游离脯氨酸含量的测定

在正常的生长环境下，植物中游离脯氨酸的含量较低，但植物遇到干旱、低温、盐碱等逆境胁迫时，游离的脯氨酸会大量累积，且累积指数与植物的抗逆性呈正相关，因此，脯氨酸可以作为植物抵抗逆境胁迫的一项生理生化指标。

(1)标准曲线的制作

取6支具塞试管分别按下表加入下列试剂：

表2

加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。用移液器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定OD值。以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。求出线性回归方程(y＝0.018x-0.0205R2＝0.9741)。根据线性回归方程和计算公式求出游离脯氨酸的含量。

(2)样品的测定

1)脯氨酸的提取

称取各组经高盐胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草(转基因)、野生型烟草和T₀代转pBI121烟草叶片各0.2g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。实验设三次重复。

2)脯氨酸含量的测定

吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定OD值。

3)计算公式：

从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：

脯氨酸含量(μg·g^－1Fw)＝X×提取液总量(ml)/样品鲜重(g)×测定时提取液用量(ml)。

注：X为从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)

结果如图11所示，200mmol/LNaCl处理下，转GmAIRP1烟草的游离脯氨酸的含量随着胁迫天数的增加呈迅猛上升趋势，虽然野生型烟草的游离脯氨酸含量也有所上升，但是上升幅度小，显著低于转GmAIRP1烟草的游离脯氨酸含量。

野生型烟草和T₀代转pBI121烟草结果无显著差异。

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。

6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物抗逆性中的应用；

或权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育抗逆性提高转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述抗逆性为抗盐性；

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为烟草。

8.一种培育抗逆性提高转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，

所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述抗逆性为抗盐性。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

所述双子叶植物具体为烟草。