CN102277379A - 表达凝血因子viii的表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用硝酸还原酶启动子(Nitrate Reducase promoter，NRpro)为启动元件，构建B区缺失重组人凝血因子VIII(BDD-rhFVIII)的植物表达载体，并以小球藻作为受体，表达B区缺失重组人凝血因子VIII(BDD-rhFVIII)。在小球藻中表达的重组人凝血因子VIII具有很强的凝血作用。本发明的结果可应用于制备凝血因子VIII制剂。
Description
技术领域
本发明涉及B区缺失重组人凝血因子VIII(B Domain deleterecombinant human coagulation factor VIII，BDD-rhFVIII)的植物表达载体及其在植物中表达生产BDD-rhFVIII的应用。具体地，涉及BDD-rhFVIII的植物表达载体及利用小球藻生产BDD-rhFVIII的方法。
背景技术
血友病
血友病(Hemophilia)是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。包括血友病A(甲)、血友病B(乙)，因子XI缺乏症(曾称血友病丙)和vWF因子(vonwillibrand factor)缺乏的血管性假血友病，他们构成血友病的四种类型。前两者为性染色体——X染色体连锁的隐性遗传病，仅男性发病；因子XI缺乏症为常染色体不完全隐性遗传。血友病在先天性出血性疾病中最为常见。血友病A是由于血液中缺乏功能性的凝血因子VIII，而造成的出血不止的出血性疾病。
血友病A在男性人群中的患病率约为1/5000，占血友病总数的80％以上；血友病B在男性人群中的患病率约为1/30000，占血友病总数的10％～20％。中国是世界上人口最多的国家之一，估计血友病患者65,000-130,000例，国内调查显示，绝大多数血友病患者未得到及时的诊断和治疗(Zhang et al.，2003)。
血友病是遗传性、伴随终身的出血性疾病。身体各个部位都有可能发生出血，以关节最为常见，肌肉出血次之，内脏出血少见但病情较重。重型血友病儿童多于2岁左右发生关节出血，此后反复的关节出血导致慢性血友病性关节炎，进而因为关节畸形而导致残疾，几乎是血友病患者的共同结局。因此在欧美国家实施了血友病综合关怀的治疗模式，尤其是对重型血友病儿童实行预防治疗，使重型血友病由威胁生命的、严重影响生存质量的疾病转变成终生携带但可以正常生活的疾病。加拿大2006年统计，2663个血友病患者(占全国血友病患者的98％)中，进行预防治疗的儿童占84％(Biss et al，2008)。但我国血友病工作起步晚，血友病儿童的状况不容乐观。目前，本病在发展中国家(如我国)的致残率和病死率远高于发达国家。
FVIII的结构特点
FVIII是血浆中大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FVIII是治疗血友病A的唯一有效的制剂。FVIII基因定位在X染色体的长臂顶端(Gitschier et al.，1984)，长超过180kb。包含有26个外显子，最初翻译产物为2351个氨基酸(Vehar et al.，1984)的单链蛋白质，该蛋白质包含19个氨基酸的信号肽和2332个氨基酸的成熟蛋白质。FVIII是多结构域的大分子糖蛋白，一个成熟的蛋白质由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成。轻链分子量约为80kDa，结构包括A3，C1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至约200kDa，结构包括域A1，A2和B，连接方式为A1-A2-B(Vehar et al.，1984；Lenting et al.，1998)。重链中，B结构域上的氨基酸残基Asp，Ser和Thr被广泛的糖基化。重链和轻链的连接是金属离子依赖性的，依赖于在A1和A3区的氨基酸残基与金属离子的结合，A1和A3区包含有相互作用位点。
天然凝血因子VIII(FVIII)蛋白质前体共含有26个可能的糖基化位点，其中在B结构域上有19个；而本发明中的rhFVIII结构中，B结构域已被除去，只编码两个分子量分别约为90kD和80kD的重链和轻链，含6-7个糖基化位点，仍具有天然人凝血因子VIII的功能。
当FVIII在血液中循环时，它通常与载体蛋白——血管性因子结合。当被凝血酶和/或活化的FXa因子水解时，FVIII被激活，这过程也包括诱导血管性因子与FVIII的解离。FVIII一旦被激活，活化的FVIIIa反过来可以与其它因子一起激活凝血因子FX，产生活化的FXa。
血友病A的治疗方法通常包括输入血浆或全血，注射从血浆中浓缩的FVIII，注射从转基因哺乳动物或通过转基因动物细胞培养系统中分离得到的重组人凝血因子。从血浆或哺乳动物细胞培养系统生产第八因子可能是困难和成本过高。此外，血浆源性因子VIII可能含有污染物，例如，A型肝炎，B和C病原体以及细小病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的病原体等有害杂质。
凝血因子VIII的生产
目前，凝血因子VIII的来源主要有三种：①直接从血液中提取纯化的凝血因子VIII。②采用人或动物培养细胞表达体系生产的FVIII。③用转基因动物代替动物细胞来生产FVIII。但这三种来源的FVIII都有一些不足或缺陷。
从血液中提取和纯化凝血因子VIII
从血液中直接提取和纯化的凝血因子VIII制剂最大的问题是病毒感染和产生FVIII抑制物。国外统计从1979--1984年约有一半血友病患者感染HIV病毒。在1978-1985年间，使用凝血因子浓缩制剂的患者感染艾滋病毒的情况：60-70％的患者感染了HIV；他们中有数千人死于艾滋病；感染了丙型肝炎之后感染HIV使肝衰竭的风险增加了21倍。我国80年代使用进口FVIII制剂的血友病患者已发现有HIV感染者。Wang等(2004)报道的肝炎与HIV患病率为49.1％和3.5％。钟小红等(2010)调查结果表明，HIV、HCV、HBV感染率分别是3.4％、10.1％、2.5％，总感染率为16.0％，由于89例患者未进行相关检测，真实感染率不得而知。尽管目前浓缩凝血因子的安全性日益提高，但是有相当部分的患者仍然使用冷沉淀及血浆进行治疗，因此，开展输血相关性病毒感染筛查，提高用血安全管理仍然值得重视。
采用人或动物培养细胞表达体系生产的FVIII
近年推出的基因重组凝血因子，采用人或动物培养细胞的表达体系来进行表达，通过培养产生大量凝血蛋白，再将凝血因子VIII蛋白提取纯化和浓缩，即成为基因重组凝血新药。这些动物细胞系包括：幼仓鼠肾细胞培养系，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株和猴COS-7细胞系。然而，使用哺乳动物细胞因子生产凝血因子VIII不能消除病原体传染给人类的可能性。因此，从动物细胞系生产的凝血因子VIII需要额外的质量保证测试和生物安全试验，以防止病原的传播。
人或动物培养细胞表达体系所用的培养基主要有两类：有血清培养基和无血清培养基(人工血清培养基)。有血清培养基可能携带病毒造成感染转移的危险，而人工血清培养基则成本高昂，限制了血友病预防性治疗的广泛应用，尤其是在发展中国家的推广。
用转基因动物代替动物细胞来生产FVIII
科学家也尝试着用转基因动物来代替动物细胞来生产FVIII。在所有的转基因的方法中，生产一种蛋白总是在一个特殊的组织中如乳汁，血液和尿液中。1997年Paleyanda等首次成功在转基因猪的乳汁中表达凝血因子(Paleyanda et al.，1997)。最近又有报道将重组凝血因子FVIII转入兔子中(Chrenek et al.，2007)，利用兔子的乳汁来生产凝血因子FVIII。但利用动物来生产凝血因子也存在问题，比如说存在动物的病原体和一些动物源的疾病会感染人类等问题(Soukharev et al.，2002)。
综上所述，血友病在我国的治疗存在很大的障碍：无足够的凝血因子制剂(供需比约为1∶10)；凝血因子制剂费用太高，存在着病原微生物污染的可能。因此，开发一种安全、高效、低成本的重组人凝血因子VIII生产系统迫在眉睫。
利用小球藻生物反应器可生产凝血因子VIII
目前重组药用蛋白制备主要通过动物和人类细胞及微生物作为生物反应器来生产的。常用的外源基因的表达体系如E.Coli，在表达过程中容易形成包涵体或不能进行正确的后加工而受到限制，为此常采用哺乳动物或人体培养细胞来解决这些问题，但这些体系由于所用的培养基组成、培养条件及纯化和病源微生物的污染等问题而使得成本相对较高，安全性也令人担忧。
小球藻是一种真核单细胞藻类，具有原核表达系统所不具备的蛋白后加工过程，且本身营养价值高，可直接食用，繁殖速度快，可自养培养也可异养培养，适宜于规模化生产，这些优点是其它表达系统所不具备的。
作为低等植物，转基因真核单细胞绿藻的培养则不仅具有转基因植物的这些优点，而且繁殖速度快，分离、纯化表达产物相对简单，产业化的培养技术已经成熟，适宜于规模化生产。作为新一代的生物反应器，有巨大的研发潜力(Chen et al.，2001)。在小球藻中表达和生产人凝血因子VIII的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供了B区缺失重组人凝血因子VIII的植物表达载体，其通过将硝酸还原酶启动子NRpro(SEQ ID NO：1)，BDD-rhFVIII(SEQ IDNO：2)和终止子Nos(SEQ ID NO：3)首尾连接到植物表达载体中而获得。
在本发明的一个方面，包括编码有凝血活性的BDD-rhFVIII基因，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在本发明的另一个方面，包括重组DNA序列，该序列包括一个启动子，该启动子在小球藻中是有功能的，还包括编码有凝血因子VIII活性的核苷酸序列，该核苷酸序列能够连接到启动子上。
在本发明的一个优选实施方案中，所述载体质粒选自由pBin19，pGreen，pCABIA1300，pBin121，pbin221和pBADW组成的组。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述载体质粒是如图1所示的pBI221质粒或如图2所示的pGreen0029。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外源基因是BDD-rhFVIII基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述小球藻藻种为椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
在本发明的另一个方面，提供了上述表达载体在利用小球藻表达外源基因中的应用。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。
本发明的另一个方面，提供了上述构建B区缺失重组人凝血因子VIII的植物表达载体的方法，其通过将硝酸还原酶启动子NRpro(SEQ ID NO：1)，BDD-rhFVIII(SEQ ID NO：2)和终止子Nos(SEQ ID NO：3)首尾连接到植物表达载体中的步骤，其中所述载体质粒适于在小球藻中表达外源基因。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。
具体地，本发明涉及表达凝血因子VIII的植物表达载体，其包含首尾连接的序列为SEQ ID NO：1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO：3的终止子Nos。优选地，所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ IDNO：2所示的序列。更优选地所述植物表达载体选自由pBin19，pGreen，pCABIA1300，pBin121，pbin221和pBADW组成的组。最优选地，所述植物表达载体选自pGreen0029。
本发明还涉及包含上述的植物表达载体的小球藻。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
本发明还涉及上述植物表达载体在小球藻中表达凝血因子VIII中的应用。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。优选地，所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ IDNO：2所示的序列。
本发明还涉及构建在小球藻中表达凝血因子VIII的表达载体的方法，其特征在于将首尾连接的序列为SEQ ID NO：1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO：3的终止子Nos克隆入植物表达载体中。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。更优选地，所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ ID NO：2所示的序列。
由本发明的内容可知，本发明的表达载体安全、高效的生产凝血因子VIII。
附图说明
图1.PBI221质粒结构图。
图2.pGreen0029质粒结构图。
图3.pGreen0029-nos质粒结构图。
图4.pGreen0029-NRpro质粒的结构图。
图5.pGreen0029-FVIII-nos质粒结构图。
图6.pGreen-NRpro-FVIII-nos质粒结构图。
图7.电击方法转化椭圆小球藻得到的抗G418的藻落。
图8.FVIII基因PCR检测结果。1泳道为阴性对照未转基因藻株；2泳道为阳性质粒；3-16泳道为转基因藻株。
图9.人凝血因子VIII相关抗原的免疫酶联检测(Human FVIII-AgELISAAssay)结果。
图10.阳离子交换柱层析SP-Sepharose chromatography的紫外吸收峰图。
图11.阴离子交换柱层析DEAE-650M chromatography的紫外吸收峰图。
图12.免疫亲和柱层析Immune-affinity chromatography的紫外吸收峰图。
图13.纯化的小球藻表达的rhFVIII的MALDI-TOF-MS检测结果图谱。
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6×Loading Buffer)购自TaKaRa公司；普通Taq酶，plus 2000Maker，DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限公司；鲑鱼精DNA购自Invitrogen公司；Human FVIII-Ag ELISA Assay kit试剂盒购自北京冬歌生物科技有限公司；Coamatic FVIII kit试剂盒购自北京友谊中联生物科技有限公司；阳离子交换柱层析的填料Cation exchange SP-Sepharosechromatography，阴离子交换柱层析的填料Anion exchange DEAE-650Mchromatography及免疫亲和柱层析Immune-affinity chromatography均购自北京拜耳迪生物技术有限公司。
实施例1.椭圆小球藻表达载体的构建方法
根据文献Wang等(wang et al.，2004)报道的椭圆小球藻高效的硝酸还原酶基因的启动子NRpro序列设计引物，上游引物NRpro-f：5’TGAAGCTTGTACCAGTGGTGCTGAGGTAGA-3’(SEQ ID NO：4)；下游引物NRpro-r：5’ACTCTAGACTTGTCGTCCTACTGCCGCAACAC-3’(SEQ ID NO：5)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加入Xho I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从椭圆小球藻基因组中得到NRpro启动子，测序结果显示为NRpro启动子序列(SEQ ID NO：1)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物1244bp大小的片段，用HindIII和Xho I内切酶双酶切，质粒pGreen 0029(来自BBSRC)(图2)也经Hind III和XhoI内切酶双酶切，然后将双酶切产物与同样是双酶切的载体pGreen 0029在16℃循环水浴锅中连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行HindIII和BamHI内切酶双酶切鉴定，能够得到约1240bp大小片段(即NRpro启动子)的质粒即命名为pGreen0029-NRpro(图4)。
实施例2.利用pGreen0029框架构建的表达载体。
根据Nos终止子序列(SEQ ID NO：3)设计引物，上游引物：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC-3’(SEQ ID NO：6)下游引物：5’-CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATAGATGA-3’(SEQ ID NO：7)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Sac I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从pBI221(来自Clontech公司的载体，载体图见图1)中获得了Nos终止子(即图1中的Nos-Ter)，PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。将PCR产物268bp大小的片段，用Not I和Sac I内切酶双酶切，质粒pGreen0029(图3，来自BBSRC)也经Not I和Sac I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Sac I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029-nos(图3)。
实施例3.合成BDD-rhFVIII基因
利用基因合成的方法合成BDD-rhFVIII基因(SEQ ID NO：2)，并通过酶切位点XhoI和Not I进行双酶切，回收约4.3kb的酶切片段(SEQ IDNO：2)，然后与同样是经过XhoI和Not I进行双酶切载体pGreen0029-nos(图3)连接，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37℃倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行XhoI和Not I内切酶双酶切鉴定，能够得到4.3kb左右大小片段(即rhFVIII基因)的质粒即命名为pGreen0029-FVIII-nos(图5)。
实施例4.BDD-rhFVIII表达载体pGreen-NRpro-FVIII-nos的构建.
按照常规技术，将NRpro启动子(SEQ ID NO：1)从载体pGreen0029-NRpro(图4)中通过HindIII和XhoI双酶切，回收酶切产物中约1.2kb的片段，将rhFVIII基因(SEQ ID NO：2)从载体pGreen0029-FVIII-nos(图5)中通过XhoI和Not I双酶切，回收酶切产物中约4.3kb的片段，将载体pGreen0029-nos(图3，来自于BBSRC)通过HindIII和NotI双酶切，调整好两个片段——启动子和基因的质量比为1∶1后，两个片段同时与用Hind III和Not I双酶切的pGreen0029-nos载体连接，转化得到抗性菌落，PCR检测、酶切验证和测序检测得到正确连接的质粒，即构建成BBD-rhFVIII的植物表达载体pGreen0029-NRpro-FVIII-nos(图6)。
实施例5.椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)的电击转化
椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)SE液体培养基见表1。
椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)固体培养基：液体培养基+7％琼脂pH 5.5-8.0。
椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)筛选培养基：小球藻固体培养基中添加抗生素G418至终浓度为30mg/L。
取100ml对数生长期的椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea，藻种来自中国科学院水生生物研究所)，50×g，离心10min离心收集藻细胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2，HIACHI)；用高渗液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M)冰上处理1-3h；50×g离心10min，去上清，沉淀用6ml电击缓冲液(山梨醇0.2M，甘露醇0.2M，KCL 0.08M，CaCL20.005M，HEPES 0.01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到1×106个/mL；加入终浓度为10μg/mL的质粒pGreen0029-NRpro-FVIII-nos和25μg/mL的鲑精DNA，混匀，冰上放置5-10min，然后每次吸取400μL混匀的小球藻细胞液进行电击。电击的参数如下：脉冲电压为6-10.5KV，脉冲持续时间分别为0.001-0.2s，脉冲次数为210，脉冲距离为2mm，循环周期为100。电击后将小球藻转入固体筛选培养基中进行筛选培养(图7)。
实施例6.转基因椭圆小球藻的分子检测
a.转基因椭圆小球藻总DNA的提取
挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25℃，光照25001ux，120rpm)。1周后(浓度达到约为1×108个/mL)，1600×g离心10min收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al.，(2001)的方法提取转基因椭圆小球藻总DNA，提取的DNA存于-20℃备用。
b.转基因小球藻的PCR检测
以转基因椭圆小球藻基因组DNA为模板，进行rhFVIII基因检测。检测rhFVIII基因所用的PCR引物分别为：正向引物F8-1133：5’AGGAGGACTGGGACTATGCT 3’(SEQ ID NO：9)；反向引物F8-24805′TTGAACTGAGGGACACTGCC3’(SEQ ID NO：10)。PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min 30s，30个循环结束后，72℃延伸10min。可以扩增出约1347bp的DNA片段，即rhFVIII基因片段。
共对14个转基因藻藻株进行了检测，检测结果见图8。转化藻株即电泳图8中的3-16，均能够扩增出外源rhFVIII基因，说明这些藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步检测转基因藻株的rhFVIII的凝血活性。
实施例7.转基因小球藻可溶性蛋白的提取
用SE培养基(培养基成分见表1)培养转基因椭圆小球藻，离心收集对数生长期(浓度约为1×108个/mL)的细胞，约3g湿重，然后按湿重∶PBS＝1∶1进行混合。超声破碎9s，间隔4s，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，1300rpm离心10min去沉淀，取上清，上清即为转基因小球藻的可溶性蛋白液。PBS的浓度为：50mM的磷酸钠缓冲液，pH值为7.2。
表1培养基组成
| 组成成份 | SE液体培养基 |
| 葡萄糖(g) | 5 |
| KNO3(g) | 0.4 |
| KH2PO4(g) | 0.075 |
| MgSO4·7H2O(g) | 0.175 |
| CaCl2(mg) | 25 |
| FeCl3·6H2O(mg) | 5 |
| NaCl(mg) | 25 |
| FeCl3·6H2O(mg) | 0.81 |
| EDTA(mg) | 20 |
| 微量元素(mL) | 1 |
| 水(mL) | 1000 |
其中的微量元素溶液配方为：H3BO3 1.43g，ZnSO4·7H2O 0.11g，MnCl2·4H2O 0.905g，Na2MoO4·2H2O 0.0185g，CuSO4·5H2O 0.0395g，水1000mL。
实施例8.rhFVIII表达量及凝血活性的检测
检测实施例7中提取获得的转基因椭圆小球藻藻蛋白样品中rhFVIII的含量和凝血活性。通过人凝血因子VIII相关抗原的免疫酶联检测试剂盒(Human FVIII-Ag ELISA Assay kit)筛选和检测转基因rhFVIII小球藻的表达量(结果见图9)，通过Coamatic FVIII kit检测所表达的rhFVIII：C。图9中A：1-12为标准品，每个浓度做复孔，即A1和A2为同一浓度的标准品，浓度为120ng/mL，A3和A4标准品的浓度为80ng/mL，A5和A6标准品的浓度为40ng/mL，A7和A8标准品的浓度为20ng/mL，A9和A10标准品的浓度为10ng/mL，A11和A12标准品的浓度为5ng/mL，其它为转基因藻株样品，每株转基因藻的提取液稀释20倍后，每个浓度均做复孔，如B1和B2是同一转基因藻株的同一浓度的样品，B3和B4是另一转基因藻株的同一浓度的样品，其它的样品依此类推。
检测结果表明转基因rhFVIII小球藻的表达量可达2mg/L，凝血活性为400IU，即比活性高达200IU FVIII：C/mg蛋白质。
实施例9.小球藻表达的rhFVIII的纯化
小球藻表达的重组人凝血因子VIII将通过3步法柱纯化进行纯化。
通过硫酸铵沉淀法将小球藻表达的重组人凝血因子VIII粗蛋白沉淀浓缩，以便进一步纯化。
1)通过阳离子交换(cation exchange SP-Sepharosechromatography，CEC)柱层析方法将沉淀浓缩的小球藻表达的重组人凝血因子VIII粗蛋白进行纯化见图10。用3倍柱体积的平衡液平衡(见表2)层析柱，然后上200ml体积的样品，上样结束后，再用3倍柱体积的平衡液洗涤柱子，最后用洗脱液洗脱(见表2)结合在层析柱上的重组人凝血因子VIII，并收集。用Coamatic FVIII kit试剂盒分别检测收集的各组分的活性。
表2阳离子交换柱层析的各种溶液成分
其中如图10中箭头所示，该组分具有凝血活性。
2)通过阴离子交换(Anion exchange DEAE-650M chromatography，AEC)柱层析方法将通过阳离子交换柱层析方法所获得的有凝血活性的部分进一步纯化见图11。先用5倍柱体积的洗液1(见表3)洗柱子，然后用3倍柱体积的平衡液(见表3)平衡柱子，然后上200mL的样品，接着用3倍柱体积的洗液2(见表3)洗柱子，最后用洗脱液(见表3)洗脱柱子直到没有吸收峰出现为止，并收集各洗脱组分。用Coamatic FVIIIkit试剂盒分别检测收集的各组分的活性。
表3阴离子交换柱层析的各溶液成分
其中如图11中箭头所示，该组分具有凝血活性。
3)通过免疫亲和层析方法(Immune-affinity chromatography，IAC)将通过了阴离子交换柱层析方法所获得的有凝血活性的部分进一步纯化见图12。用3倍柱体积的平衡液平衡(见表2)层析柱，然后上200ml体积的样品，上样结束后，再用3倍柱体积的洗液洗涤柱子，最后用洗脱液洗脱(见表4)结合在层析柱上的重组人凝血因子VIII，并收集。用Coamatic FVIII kit试剂盒，分别检测收集的各组分的活性。
表4免疫亲和层析各种溶液成分
其中如图12中箭头所示，该组分具有凝血活性。
实施例10.纯化的小球藻表达的rhFVIII的MALDI-TOF-MS检测
取1μL经上述3步纯化获得的rhFVIII样品(即最后通过免疫亲和层析方法获得的有凝血活性的组分)与基质HCCA即乙腈：0.1％三氟乙酸TFA(1∶2v/v)混合，然后手动点样进行MALDI-TOF-MS(型号autoflex，德国bluker doltonik公司生产)检测，检测图谱见图13。说明已获得一定纯度的rhFVIII样品。
参考文献：
Zhang L，Li H，Zhao H，et al.Retrospective analysis of 1312 patients withhemophilia and related disorders in a single Chinese institute.Haemophilia，2003，(6)：696-702.
Gitschier，J.，Wood，W.I.，Goralka，T.M.，Wion，K.L.，Chen，E.Y.，Eaton，D.H.，Vehar，G.A.，Capon，D.J.and Lawn，R.M.Characterization of the humanfactor VIII gene.Nature，1984，312：326-330.
Vehar G，Keyt B，Eaton D，et al.Structure of human factor VIII.Nature，1984，313：337-342
Lenting，P.J.，J.A.van Mourik，and K.Mertens.The life cycle of coagulationfactor VIII in view of its structure and function.Blood，1998，92(11)：3983-3996.
Wang T，Zhang L，Li H，et al.Assessing heahh-related qualith-of-life inindividuals with haemophilia in China.Haemophilia，2004，10(4)：370-375
钟小红，周春兰，周宏珍，等.血友病患者诊疗及健康状况调查分析.护理学杂志，201011(25)：23-26
Paleyanda，R.K.，et al.Transgenic pigs produce functional human factor VIIIin milk.Nat Biotech，1997，15(10)：971-975.
Chrenek，P.，et al.Expression of recombinant human factor VIII in milk ofseveral generations of transgenic rabbits.Transgenic Research，2007，16(3)：353-361.
Soukharev，S.，et al.Expression of factor VIII in recombinant and transgenicsystems.Blood Cells，Molecules，and Diseases，2002，28(2)：234-248.
Chen，Y.，et al.Highly efficient expression of rabbit neutrophil peptide-1genein Chlorella ellipsoidea cells.Current Genetics，2001，39(5)：365-370.
Claims (10)
1.表达凝血因子VIII的植物表达载体，其包含首尾连接的序列为SEQ ID NO：1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO：3的终止子Nos。
2.权利要求1的植物表达载体，其中所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ IDNO：2所示的序列。
3.权利要求1或2的植物表达载体，其选自由pBin19，pGreen，pCABIA1300，pBin121，pbin221和pBADW组成的组。
4.权利要求1或2的植物表达载体，其选自pGreen0029。
5.包含权利要求2-4任一项所述的植物表达载体的小球藻。
6.权利要求5的小球藻，其是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
7.权利要求2-4任一项的植物表达载体在小球藻中表达凝血因子VIII中的应用。
8.权利要求7的用于，其中所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)或者普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
9.构建在小球藻中表达凝血因子VIII的表达载体的方法，其特征在于将首尾连接的序列为SEQ ID NO：1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO：3的终止子Nos克隆入植物表达载体中。
10.权利要求9的方法，其中所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087629A (zh) * | 2015-09-18 | 2015-11-25 | 宜春学院 | 利用小球藻表达人干扰素基因的方法 |
| WO2019028993A1 (zh) * | 2017-08-07 | 2019-02-14 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1416348A (zh) * | 2000-03-10 | 2003-05-07 | 埃默里大学 | 修饰的凝血因子ⅷ |
| CN1676597A (zh) * | 2004-03-31 | 2005-10-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 小球藻营养缺失突变体的高效表达体系 |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| WO2008061995A2 (en) * | 2006-11-20 | 2008-05-29 | Octagene Gmbh | Genetic ablation of the prp gene cells using a targeted promoter trap strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals |
| CN101457233A (zh) * | 2007-12-12 | 2009-06-17 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 构建小球藻表达载体、转化小球藻和破壁小球藻的方法 |
-
2011
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1416348A (zh) * | 2000-03-10 | 2003-05-07 | 埃默里大学 | 修饰的凝血因子ⅷ |
| CN1676597A (zh) * | 2004-03-31 | 2005-10-05 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 小球藻营养缺失突变体的高效表达体系 |
| EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| WO2008061995A2 (en) * | 2006-11-20 | 2008-05-29 | Octagene Gmbh | Genetic ablation of the prp gene cells using a targeted promoter trap strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals |
| CN101457233A (zh) * | 2007-12-12 | 2009-06-17 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 构建小球藻表达载体、转化小球藻和破壁小球藻的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《Blood cells,Molecules, and Diseases》 20020430 Serguei Soukharev et Expression of factor VIII in tecombinant and transgenic systems 234-248 1-10 第28卷, 第2期 * |
| 《BlOOD》 19930601 D.D.Pittman et al Biochemical, immunological, and in vivo functional characterization of b-domain-deleted factor VIII 2925-2935 1-10 第81卷, 第11期 * |
| 《Journal of Applied Phycology》 20041231 Peng Wang et al Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrate reductase gene from chlorella ellipsoidea 11-16 1-10 第16卷, 第1期 * |
| 《Semin Hematol》 20010430 Courter S G et al Clinical evaluation of b-domain deleted recombinant factor VIII in previously treated patients 44-51 1-10 第38卷, 第2期 * |
| 《生命科学》 20061231 无 国家自然科学基金委员会生命科学部2006年度资助自由申请科学基金项目一览表 521-587 1-10 第18卷, 第6期 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087629A (zh) * | 2015-09-18 | 2015-11-25 | 宜春学院 | 利用小球藻表达人干扰素基因的方法 |
| WO2019028993A1 (zh) * | 2017-08-07 | 2019-02-14 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用 |
| CN109385443A (zh) * | 2017-08-07 | 2019-02-26 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用 |
| CN109385443B (zh) * | 2017-08-07 | 2022-08-02 | 北京睿诚海汇健康科技有限公司 | 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用 |
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