CN109385443A

CN109385443A - 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用

Info

Publication number: CN109385443A
Application number: CN201710667754.6A
Authority: CN
Inventors: 王跃驹; 马洁
Original assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Ruicheng Haiway Health Technology Co Ltd
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: CN109385443B; WO2019028993A1

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人凝血八因子(anti‑hemophilic factor(AHF),FVIII)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组FVIII成功表达。凝血实验证明生菜生产的FVIII具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人FVIII的方法。

Description

生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。

背景技术

人凝血八因子(FVIII)因子VIII是非正常血液凝固所必需的非酶血浆蛋白。人类因子VIII活性的不足与先天性出血性疾病(称为血友病A)有关。患者是因为缺乏凝血因子(大多数患者缺乏“八因子”，少数患者是缺乏“九因子”或“十一因子”)而流血不止，如得不到及时治疗，发病症状为出血部位疼痛难忍、留下残疾甚至死亡但只需要注射凝血八因子，血友病人就可以像正常人一样生活。也就是说，八因子是治疗血友病A的特效药，也是必须用药，不管有多少风险，都应该使用，否则就会有生命危险，而如果没有八因子治疗，则患者本身的生存就会有危险。血友病A患者用八因子治疗，可维持正常止血。但令人遗憾的是，预防性治疗在全世界并不普遍。

目前，我国市场上凝血八因子均为从血液中获得，通过两步灭活生产工艺提取凝血八因子。由于血源供应不足，导致凝血八因子产量远远达不到临床的需求量，致使凝血八因子价格快速上涨。好多血友病人由于缺乏凝血八因子而导致苦苦挣扎，甚至死亡。而且，血浆中潜在的病原体如肝炎和艾滋病毒导致从目前从血浆中来源的凝血八因子存在各种风险。为了消除血浆病原体以及病毒污染的潜在风险，利用基因工程技术生产重组八因子(rFIII)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的FIII从而取代血浆来源的八因子。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物， ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人凝血八因子具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了凝血八因子(FVIII)，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人凝血八因子。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述凝血因子为人凝血八因子(FVIII)。

本发明还提供了一种表达载体，包括凝血因子的核苷酸序列和双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述凝血因子为人凝血八因子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：在凝血因子的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；所述凝血因子优选为FVIII；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC57-FVIII；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段FVIII，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-FVIII。

具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人FVIII(GenBank Accession号：AX746360)密码子优化为植物偏好的密码子，由 GeneArt^TMGeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的FVIII序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人凝血八因子基因片段FVIII通过Xbal/Sacl从pUC57-FVIII中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-FVIII。将植物表达构建体分别通过用Multiporator (Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤， 5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2) 并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器 (220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。所述克隆FVIII基因片段(图1)，并且构建两种基于双元植物表达载体p35S-FVIII (图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。

在本发明中，FVIII cDNA序列(GenBank:AX746360)如SEQ ID No.1 所示；FVIII氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；密码子优化后的FVIII cDNA 序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了所述表达载体在表达凝血因子中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述凝血因子包括人凝血八因子(FVIII)。

本发明还提供了一种生菜作为宿主表达凝血因子的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得人凝血八因子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述凝血因子为人凝血八因子(FVIII)。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。

具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles， IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3 次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。

在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g 离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性 (95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组FVIII 的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及人FVIII标准品 (Biovision)分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗FVIII的抗体(Abcam) 分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组FVIII经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为280kDa的条带(图3(A)，泳道1)，与阳性FVIII条带一致(图3(A)，泳道2)。在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3(A)，泳道3)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量0.18mg/kg。另外，Western印迹分析也检测到大约280kDa的条带(图3(B)，泳道1)，观察到的蛋白分子量(280kDa)与阳性对照组(图3(B)，泳道2)一致。

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞在补充有6％胎牛血清和6％马血清的DMEM培养基中24小时。以指定浓度加入β-凝血八因子(人)。培养基每2-3天更换一次。通过亚甲蓝染色观察5天内神经突的发育。检查细胞生长结果表明，没有任何处理的PC12神经树突细胞生长较差。相比之下，使用纯化的重组FVIII或相等的阳性对照FVIII标准处理的PC2细胞树突生长良，。表面拉伸蔓延(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源FVIII 具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了FVIII，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产人凝血八因子。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1(A)示FVIII克隆载体(金斯瑞公司构建合成)；

图1(B)示FVIII基因片段酶切(XbaI/SacI)鉴定；

图2示植物瞬时表达载体p35S-FVIII构建流程；利用限制性内切酶 (XbaI/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下FVIII片段，连接入pCam35S的 XbaI/SacI位点，生成植物瞬时表达载体p35S-FVIII；

其中，35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPT II，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；

图3(A)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的重组人经生长因子(FVIII)；泳道1:纯化重组FVIII(5μg)；泳道2：阳性对照FVIII (5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图3(B)示Western印记杂交检测纯化的重组人凝血八因子；泳道1:纯化重组FVIII(5μg)；泳道2：阳性对照FVIII(5μg)；泳道3：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图4示凝血八因子显著促进凝血实验；使用纯化的FVIII处理血浆，观察血浆凝固反应；5分钟后，重组人凝血八因子明显促进血浆凝血。

具体实施方式

本发明公开了生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产FVIII重组蛋白质。

本发明提供了生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人FVIII(GenBank Accession号：AX746360)密码子优化为植物偏好的密码子，由 GeneArt^TMGeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的FVIII以及FGF-2序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入 Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人凝血八因子基因片段FVIII 通过Xbal/Sacl从pUC57-FVIII中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-FVIII。将植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌 GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mMMgSO₄)中至O.D.600 为0.5。

所述克隆FVIII基因片段(图1)，并且构建基于植物的双元表达载体 p35S-FVIII(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

本发明优化了农杆菌真空渗透的方法(图2)。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上) 并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum， Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m M β-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以 10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

实施例4SDS-PAGE凝胶电泳以及Western Blot蛋白印迹杂交

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性 (95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％Bis-Tris Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组FVIII 的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hFVIII和标准品 (Biovision)分别在10～20％Bis-Tris Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗hFVIII的抗体(Abcam) 分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组FVIII经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为280kDa的条带(图3(A))，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为 0.18mg/kg。另外，Western印迹分析也检测到大约300kDa的条带(图3(B))，观察到的蛋白分子量(300kDa)与阳性对照组一致。

实施例5凝血八因子增强神经营养活动实验

在新鲜血浆中加入人凝血八因子5ug。5分钟后检查血浆凝固情况。检查血浆结果表明，没有任何处理的血浆没有任何凝血反应。相比之下，使用纯化的重组FVIII或相等的阳性对照FVIII标准处理的凝血良好(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源FVIII具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

实施例6

对照组：利用烟叶生产人凝血八因子；

实验组：本发明提供的生菜生产人凝血八因子；

表1人凝血八因子

^*示与对照组相比P≤0.05；^#示与对照组相比P≤0.01；

由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人凝血八因子 (FVIII)显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，显著(P≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P ≤0.01)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人凝血八因子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京惠升生物工程科技有限公司

<120> 生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用

<130> MP1715703

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7056

<212> DNA

<213> FVIII

<400> 1

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

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ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

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ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

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agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

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gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060

aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120

attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180

gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240

aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300

gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360

ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420

caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480

aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540

ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600

ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660

gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720

aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgag 3780

ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840

aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900

aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960

agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020

ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080

aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140

aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200

caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260

atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320

agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380

aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440

ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500

aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560

cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620

gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680

ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740

ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800

tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860

aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920

atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980

gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040

attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100

gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160

gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220

gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280

tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340

tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400

ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460

cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520

catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580

gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640

acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700

atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760

ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820

aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880

tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940

gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000

gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060

attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120

cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180

caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240

tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300

cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360

atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420

accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480

cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540

cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600

agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660

acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720

caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780

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atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900

gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960

ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020

gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tactga 7056

<210> 2

<211> 2351

<212> PRT

<213> βFVIII

<400> 2

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

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Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

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Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

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Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

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610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

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Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

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Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

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Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

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Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp

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Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser

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Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu

865 870 875 880

Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys

885 890 895

Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn

900 905 910

Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met

915 920 925

Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys

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Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu

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Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu

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Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe

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Asn Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser

1025 1030 1035

Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu

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Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg

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1070 1075 1080

Ser Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln

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Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile

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Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro

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Ser Pro Lys Gln Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu

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Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys

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Glu Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu

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Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser

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Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe

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Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys

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Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly

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Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser

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Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp

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Lys Leu Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln

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Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile

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Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

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Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

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Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu

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His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp

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Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly

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Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu

1835 1840 1845

Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu

1850 1855 1860

Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His

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Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln

1880 1885 1890

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Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn

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1925 1930 1935

Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

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Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser

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Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr

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Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr

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2000 2005 2010

Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly

2015 2020 2025

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Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala

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Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His

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Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser

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Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile

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Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn

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Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg

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Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

2180 2185 2190

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln

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<210> 3

<211> 7005

<212> DNA

<213> 密码子优化后的FVIII cDNA序列

<400> 3

tactctgcta ctagaaggta ctacctcggc gccgttgaac tctcttggga ttacatgcag 60

tctgacctcg gagagcttcc agttgatgct agatttccac caagggtgcc aaagagcttc 120

cccttcaata cttccgtggt gtacaagaaa accctcttcg tcgagttcac cgaccacctc 180

ttcaacattg ctaagccaag accaccatgg atgggacttc tcggaccaac tattcaggct 240

gaggtgtacg ataccgtggt catcactctc aagaacatgg cttctcaccc agtgtctctt 300

cacgctgttg gagtgtctta ctggaaggct tctgagggtg ctgagtacga tgatcagact 360

tcccagcgtg agaaagagga cgataaggtt ttccctggtg gctcccatac ttacgtgtgg 420

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aggttcgatg acgacaacag ccccagcttc attcagattc gttccgtggc taagaagcac 1140

cccaagactt gggttcacta cattgctgct gaggaagagg attgggacta cgctccactt 1200

gttctcgctc cagatgacag gtcttacaag tcccagtacc tcaacaatgg cccacaaagg 1260

atcggccgta agtataagaa agtgcgtttc atggcctaca ccgacgagac tttcaagact 1320

cgtgaggcta ttcagcacga gtccggaatt cttggaccac ttctttacgg tgaggtgggc 1380

gatactctgc tcattatctt caagaaccag gccagcaggc cctacaatat ctacccacac 1440

ggaatcactg atgtgaggcc actttactcc agaaggcttc ccaagggcgt taagcacctt 1500

aaggacttcc caattctccc cggcgagatc ttcaagtaca agtggactgt gactgttgag 1560

gacggcccaa ctaagtcaga tccaagatgc cttaccaggt actactcctc cttcgtgaac 1620

atggaaaggg atctcgcttc cggtcttatc ggaccactcc tcatttgcta caaagagtcc 1680

gttgaccaga ggggcaacca gatcatgagc gataagagga acgtgatcct gttctccgtg 1740

ttcgatgaga acaggtcctg gtacttgacc gagaacatcc agcgattcct tccaaatcca 1800

gctggtgtgc aacttgagga tccagagttc caggcctcca acatcatgca ctccatcaac 1860

ggctacgtgt tcgactctct tcagctttct gtgtgccttc atgaggtggc ctactggtac 1920

attctctcta tcggtgctca gaccgacttc ctctctgtgt tcttctccgg ctacaccttc 1980

aagcacaaga tggtgtacga ggacaccctc acactcttcc cattttctgg tgagactgtg 2040

ttcatgtcca tggaaaaccc aggcctctgg attcttggat gccacaactc cgattttagg 2100

aacaggggaa tgaccgctct cctcaaggtt agctcttgcg ataagaacac cggcgactac 2160

tacgaggatt cctatgagga tatctccgcc tacctgctct ccaagaacaa cgctattgag 2220

ccccgtagct tctcccagaa ttctaggcat ccatccacca ggcaaaagca gttcaacgct 2280

actactatcc ccgagaacga catcgaaaag actgacccat ggttcgctca caggactcca 2340

atgccaaaga tccagaacgt gtcctcctcc gatcttctta tgcttctcag gcagtctcca 2400

actccacacg gcctttcttt gtctgatctc caagaggcca agtacgagac attctccgat 2460

gatccatctc caggcgctat cgactctaac aactccctgt ctgagatgac ccatttcagg 2520

ccacagcttc accactctgg tgacatggtt ttcactccag agtctggact tcagctcagg 2580

cttaacgaga agctcggaac tactgctgct accgagctta agaagctcga cttcaaggtt 2640

tcctccacct ccaacaacct catcagcact atcccaagcg ataacctcgc tgctggaact 2700

gacaacactt cttctcttgg cccaccatct atgccagtgc actacgattc tcagctcgac 2760

actactctct tcggcaagaa gtcctctcca ctcactgaat ctggtggccc actctcactt 2820

tccgaagaga acaacgactc taagctcctt gagtccggcc tcatgaactc ccaagaatct 2880

tcctggggca agaacgtgag cagtactgag tctggtaggc tgttcaaggg aaagcgtgct 2940

catggaccag ctctgcttac taaggataac gccctcttca aggtgtccat cagccttctc 3000

aagaccaaca agaccagcaa caactccgct accaaccgta agactcatat cgatggaccc 3060

agcctcctca tcgagaactc tccatctgtt tggcagaaca tcctcgagtc cgacaccgag 3120

ttcaagaagg tgacaccact catccacgac aggatgctta tggacaagaa cgctactgct 3180

ctcaggctca accacatgag caacaagact acctccagca agaatatgga aatggtgcag 3240

cagaagaaag agggcccaat tccaccagat gctcagaacc cagacatgtc attcttcaag 3300

atgctgttcc tgcctgagtc cgctagatgg attcaaagga ctcacggcaa gaactcactc 3360

aactcaggac aaggaccatc tccaaagcag cttgtgtctc ttggacctga gaagtctgtt 3420

gagggccaga acttcctgag cgaaaagaac aaggtggtgg ttggaaaggg cgagttcact 3480

aaggatgtgg gcctcaaaga gatggttttc cccagttcta ggaacctgtt cctcaccaac 3540

cttgacaacc tccacgagaa caacacccac aatcaagaaa agaagattca agaagagatc 3600

gagaaaaaag agactctcat ccaagagaac gtggtgctcc cacagatcca cactgttacc 3660

ggaacaaaga actttatgaa gaacttgttc ctgctcagca ccaggcagaa cgttgaggga 3720

tcttatgatg gtgcttacgc tccagtgctc caggacttca gatctctcaa cgactccact 3780

aacaggacca agaagcacac cgctcacttc tctaagaagg gcgaagaaga gaacctcgaa 3840

ggactcggaa atcagaccaa gcagatcgtc gagaagtacg cttgcactac caggatcagc 3900

ccaaacactt ctcagcagaa cttcgtgacc cagaggtcta agagagcact caagcaattc 3960

aggctcccac tcgaagaaac cgaactcgag aagcgtatca tcgtggacga cacttctact 4020

cagtggtcta agaacatgaa gcacctcact ccatccacac tcacccagat cgactacaac 4080

gaaaaagaga agggcgctat cacccagtct ccactttctg attgcctcac caggtcacac 4140

tctattccac aggctaacag gtccccactg ccaattgcta aggtgagcag cttcccatct 4200

atcaggccaa tctaccttac tagggtcctc ttccaggaca actcctctca tcttccagct 4260

gcctcttacc gtaagaagga ctctggcgtt caagagtcct cacactttct tcagggcgcc 4320

aagaagaaca acctctctct cgctattctc accctcgaga tgactggtga tcaaagagag 4380

gtgggatccc tcggtacttc cgctactaac tctgtgacct acaagaaggt cgagaacacc 4440

gtcttgccaa agccagatct cccaaagact tccggcaagg ttgagttgct tccaaaggtg 4500

cacatctacc agaaggatct gttccccacc gagacttcta atggatctcc aggacacctc 4560

gatctcgttg agggttcact tctccaaggt acagagggtg ctatcaagtg gaacgaggct 4620

aataggccag gtaaggtgcc attccttcgt gtggctactg agtcctctgc taagactcca 4680

agcaagctct tggatcctct tgcttgggac aaccactacg gaactcagat cccaaaagaa 4740

gagtggaagt ctcaagagaa gtctcccgaa aagaccgcct ttaagaagaa ggacaccatc 4800

ctgtcactca acgcctgcga gtctaatcac gctatcgctg ctattaacga ggggcagaac 4860

aagccagaga ttgaggttac atgggctaag caaggtagga ctgagaggct ttgctctcaa 4920

aacccaccag tgcttaagag gcaccagaga gagatcacta ggactactct ccaatccgac 4980

caagaggaaa tcgattacga cgacaccatc tccgtcgaga tgaagaaaga agatttcgac 5040

atctacgacg aggacgagaa ccagtctcct cgttccttcc agaagaaaac caggcactac 5100

ttcattgccg ctgttgagag gctctgggat tacggcatgt catcttctcc acacgtgctc 5160

agaaataggg ctcagtctgg ttctgtgccc caattcaaga aagtggtgtt ccaagagttc 5220

actgacggca gctttactca gccactttat cgtggtgagc tgaacgagca ccttggactt 5280

ttgggacctt acattcgtgc tgaggtcgag gataacatca tggtgacttt ccgtaaccag 5340

gcttctaggc cctactcctt ctacagctcc ctcatctctt acgaagagga tcagagacaa 5400

ggtgccgagc ctcgtaagaa tttcgtgaag ccaaacgaga caaagaccta cttttggaag 5460

gtgcagcacc acatggctcc aactaaggac gagtttgatt gcaaggcttg ggcctacttc 5520

tcagacgttg acctcgaaaa ggatgtgcac tctggactta tcggcccatt gcttgtttgc 5580

cacaccaaca ctcttaaccc agctcacgga aggcaagtga ctgtgcaaga gttcgctctg 5640

ttcttcacca tctttgacga gactaagtct tggtacttca ctgaaaacat ggaacgaaac 5700

tgcagggccc catgcaacat ccaaatggaa gatccaacct ttaaagaaaa ctacaggttc 5760

cacgctatca acggttacat catggatact ctccctggcc ttgtgatggc tcaagatcaa 5820

aggatcaggt ggtatctcct ctccatgggg tccaacgaga acattcacag catccacttc 5880

tccggacacg tgttcactgt gaggaaaaaa gaagagtaca agatggccct ctacaacttg 5940

taccctggcg ttttcgagac agtcgagatg cttccatcca aggctggaat ttggcgtgtt 6000

gagtgcttga ttggtgagca ccttcatgct ggaatgtcca ctttgttcct cgtgtactcc 6060

aacaagtgcc agactcctct tggaatggct tccggacaca ttagggactt ccagatcact 6120

gcttctggac agtatggaca gtgggctcct aagcttgcta ggttgcatta ctccggctcc 6180

attaacgcct ggtctaccaa agaacccttc agctggatca aggtggacct ccttgctcca 6240

atgatcatcc acggcattaa gactcaaggc gcccgtcaga agttctccag cctttacatt 6300

tcccagttca tcatcatgta cagcctcgac ggtaagaagt ggcagactta caggggaaac 6360

tccactggta ctctcatggt gttcttcggt aacgtggact cctccgggat taagcacaac 6420

atcttcaacc caccaattat cgcccgttac atcaggcttc accccactca ctactccatc 6480

aggtctactc ttaggatgga actcatgggc tgcgacctca actcttgctc tatgccactt 6540

ggtatggaat ccaaggccat ctctgacgct cagattaccg cctcctctta cttcaccaac 6600

atgttcgcta cctggtcacc atctaaggct aggcttcatc ttcaaggcag gtctaatgct 6660

tggcgtccac aggtgaacaa cccaaaagag tggcttcagg tcgactttca aaagactatg 6720

aaggtgaccg gcgtgaccac tcagggtgtt aagtctctcc tcacctccat gtacgtgaaa 6780

gagttcctca tctcctcatc acaggatggc caccagtgga ctttgttctt ccagaacgga 6840

aaggtgaagg tgttccaggg aaaccaggat tctttcaccc cagtggtgaa ttccctcgat 6900

ccaccacttc tcactcgtta ccttaggatt caccctcagt catgggtgca ccagattgca 6960

ttgaggatgg aagttcttgg ttgcgaggct caggatctct actga 7005

Claims

1.生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述凝血因子为人凝血八因子。

3.一种表达载体，其特征在于，包括凝血因子的核苷酸序列和双元植物载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述凝血因子为人凝血八因子。

5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

步骤1：在凝血因子的核苷酸序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入Sacl限制性酶切位点；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC57-FVIII；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体pUC57-FVIII中获得基因片段FVIII，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-FVIII。

6.根据权利要求3至5任一项所述的表达载体在表达凝血因子中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述凝血因子包括人凝血八因子。

8.一种生菜作为宿主表达凝血因子的方法，其特征在于，将如权利要求3至5任一项所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得凝血因子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述凝血因子为人凝血八因子。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空-95kPa压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。