CN1602354A

CN1602354A - 人凝血因子ⅶ多肽

Info

Publication number: CN1602354A
Application number: CNA028206096A
Authority: CN
Inventors: E·泊森; O·H·奥森
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG; Novo Nordisk AS
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2005-03-30
Also published as: MXPA04002833A; EP1432794A2; EP1432794B1; ATE532858T1; RU2325401C2; UA82177C2; JP2005509413A; RU2004112768A; HUP0500060A2; WO2003027147A3; WO2003027147A2; NO20041700L; BR0212818A; CZ2004427A3; IL160897A0; ZA200402262B; HUP0500060A3; ES2376694T3; CA2461003A1; PL368619A1

Abstract

本发明涉及具有凝血活性的新型人凝血因子VIIa变体，编码该变体的多核苷酸构建体，包含和表达该多核苷酸的载体和宿主细胞，药物组合物，用途和治疗方法。

Description

人凝血因子VII多肽

发明领域

本发明涉及新的具有促凝活性的人凝血因子VIIa多肽，以及编码该多肽的多核苷酸构建物，包括并表达该多核苷酸的载体和宿主细胞，药物组合物，治疗的用途和方法。

发明背景

血液凝固是一种由各种血液成分(或因子)复杂的相互作用组成的过程，它最终引起血纤维蛋白凝块。通常，参与被称为凝固“级联”的血液成分是无酶促活性的蛋白(前酶或酶原)，该蛋白通过激活物(本身是活化的凝血因子)的作用转化为蛋白水解酶。经受这种转化的凝血因子通常被称为“活性因子”，并通过在凝血因子的名称之后附加字母“a”来标明(如，凝血因子VIIa)。

止血过程的起动是通过因血管壁损伤而暴露的组织因子与凝血因子VIIa之间形成复合物来介导的。该复合物然后将凝血因子IX和X转化为它们的活性形式。在携有组织因子的细胞上，凝血因子Xa将有限量的凝血酶原转化为凝血酶。凝血酶激活血小板，将凝血因子V和VIII转化为Va和VIIIa，这两种辅因子在进一步的过程中引起完全的凝血酶释放。这一过程包括通过凝血因子IXa产生凝血因子Xa(与凝血因子VIIIa复合)，并出现于活化血小板表面上。凝血酶最终将血纤蛋白原转化为血纤蛋白，导致形成血纤蛋白凝块。近年来，已发现凝血因子VII和组织因子成为血液凝固的主要起动因子。

凝血因子VII是一种以单链酶原循环于血液中的痕量血浆糖蛋白。该酶原被催化失活。单链凝血因子VII可以通过凝血因子Xa，凝血因子XIIa，凝血因子IXa，凝血因子VIIa或凝血酶在体外转化为双链凝血因子VIIa。凝血因子Xa被认为是凝血因子VII的主要生理激活物。正如一些其它涉及止血的血浆蛋白，凝血因子VII依赖维生素K来发挥其活性，该维生素K是集簇于因子VII蛋白质氨基末端附近的多个谷氨酸残基发生γ-羧化作用所必需的。这些γ-羧化谷氨酸是金属离子诱导的凝血因子VII与磷脂相互作用所需要的。通过裂解内部Arg152-IIe153肽键，可将酶原凝血因子VII转化为活性的双链分子。在组织因子、磷脂和钙离子的存在下，双链凝血因子VIIa通过有限的蛋白水解作用迅速激活凝血因子X或凝血因子IX。

常常需要刺激或改善个体的凝血级联。凝血因子VIIa一直被用于控制一些原因的出血紊乱，如凝血因子缺乏(例如血友病A和B或凝血因子XI或VII缺乏)或凝血因子抑制剂。凝血因子VIIa一直也被用于控制血液凝固级联功能正常(没有凝血因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制物)的个体中的过度出血。举例来说，这种出血可以由缺乏血小板功能、血小板减少症或Von Willebrand疾病导致。出血也是与外科手术和其它形式的组织损伤有关的主要问题。

欧洲专利No.200,421(ZymoGenetics)涉及编码人类凝血因子VII的核苷酸序列以及在哺乳动物细胞中重组表达凝血因子VII。

Dickinson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，14379-14384)涉及一种凝血因子VII变体，其中Leu 305被Ala取代(FVII(Ala305))。

Iwanaga等(Thromb.Haemost.(supplement August 1999)，466，abstract 1474)涉及凝血因子VIIa的变体，其中残基316-320被删除或残基311-322被来自胰蛋白酶的相应残基取代。

需要具有凝血活性的凝血因子VIIa的变体，具有高活性、可以以相对小的剂量施用的变体，以及不会产生与常规疗法有关的不希望的副作用(如凝血体系的系统激活和出血)的变体。

发明详述

目前已经发现，具有Leu305和独立地选自由SEQ ID NO：1的Lys157，Lys337，Asp334，Ser336，Val158，Glu296和Met298构成的组中的至少一个氨基酸被不同氨基酸所取代的人凝血因子VIIa多肽变体，与野生型人凝血因子VIIa相比具有增加的凝血活性。

术语“不同氨基酸”用于此处意指与天然存在于该位置的氨基酸不同的氨基酸。它包括但不限于可以由多核苷酸编码的氨基酸。优选的，不同氨基酸是天然的L型，并能被多核苷酸编码。特殊的实例是L-半胱氨酸(Cys)。

术语“活性”用于此处意指凝血因子VII多肽转化其底物凝血因子X成为活性凝血因子Xa的能力。凝血因子VII多肽的活性可用“体外蛋白水解分析”(参见实施例6)检测。

术语“内在活性”也包括缺少组织因子时在活化血小板表面上产生凝血酶的能力。

在凝血因子VIIa的组织因子复合形式中，Leu305位于其中一个α-螺旋的末端，该位置被认为对活性很重要。在游离的凝血因子VIIa中(未与组织因子结合的凝血因子VIIa)，该螺旋被扭曲，因此可能会不稳定。根据本发明的多肽变体获得了活性构象，该构象通常必须由组织因子来诱导。与野生型凝血因子VIIa相比多肽变体的活性提高可能是由于α-螺旋的稳定化，该螺旋的重新定向或构象上的其它改变。Leu305的替换将诱导该螺旋的重新定向和/或稳定化。

包括Lys157、Lys337、Asp334、Ser336、Val158、Glu296和Met298的氨基酸位于被认为能影响蛋白酶结构域的氨基末端插入、从而影响凝血因子VIIa的催化活性构象形成的区域内，该活性构象形成依赖于IIe153末端氨基和Asp343侧链之间的盐桥。通过取代可消除静电排斥，增加氢键或促进插入氨基末端。

由于与天然凝血因子VIIa相比，这里描述的凝血因子VIIa多肽变体的固有活性更高，较低的剂量即可在作用部位充分获得功能适当的浓度，从而有可能以较低的剂量对出血发作或需要增强正常止血体系的个体给药。

本发明的发明者已经发现，通过但合取代氨基酸Leu305以及在位置157的Lys、在位置337的Lys、在位置158的Val、在位置296的Glu、在位置298的Met、在位置334的Asp和在位置336的Ser中的一个或多个残基，凝血因子VIIa将自然地获得通常必须由组织因子诱导的更有活性的构象。这种凝血因子VIIa多肽变体显示的固有活性可能在促凝血活性不依赖于组织因子(血小板表面上的凝血因子Xa产生)的情况下具有治疗效果，例如，当高剂量的NovoSeven^被用药时可能如此。

在进一步的实施方式中，在蛋白酶结构域内的额外氨基酸取代进一步促进形成分子的活性构象。然而认为，当上述突变在所述后七个氨基酸附近(顺序的或三维的)进行时，将看到最显著的效果。

本发明进一步包括在凝血因子VIIa的N端Gla区域(对应于SEQID NO：1中1-37位的氨基酸)取代几个氨基酸，这样可以使蛋白质对膜磷脂(如携有组织因子的细胞或血小板上的膜磷脂)具有实质性更高的亲和力，从而产生改善了促凝血效应的凝血因子VII多肽变体。

这样，上述凝血因子VIIa多肽变体除了已经在位置305进行的氨基酸取代与在位置157，158，296，298，334或337处的取代组合，以及在蛋白酶结构域其它部位的非必要氨基酸取代之外，它们也可在N-末端Gla结构域有至少一个氨基酸取代，从而获得与天然凝血因子VII相比具有增强的活性以及对膜磷脂具有增加的亲和力的蛋白质。优选在凝血因子VII的位置10和32的氨基酸(指SEQ ID NO：1)可以用不同的氨基酸取代。待掺入上述位置的优选氨基酸的实例有：位置10的Pro氨基酸被Gln，Arg，His，Gln，Asn或Lys所取代；和/或位置32的Lys被Glu，Gln或Asn所取代。

根据维生素K-依赖性血浆蛋白的不同磷脂亲和力和序列，在Gla结构域的其它氨基酸也可考虑被取代。

术语“N端GLA结构域”意指凝血因子VII的氨基酸序列1-37。

三个字母表示的“GLA”意指4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)。

术语“蛋白酶结构域”意指凝血因子VII的氨基酸序列153-406(凝血因子VIIa的重链)

此处使用的术语“凝血因子VII多肽”意指包括天然人凝血因子VII(SEQ ID NO：1)氨基酸序列1-406的任何蛋白质或其变体。它包括但不限于人凝血因子VII，人凝血因子VIIa和它们的变体。

此处使用的术语“凝血因子VII”意指包括无活性的单链酶原凝血因子VII分子以及激活的双链凝血因子VII分子(凝血因子VIIa)。它包括具有天然人凝血因子VII或凝血因子VIIa的氨基酸序列1-406的蛋白质。它也包括氨基酸序列略微修饰、例如N末端被修饰(包括N端氨基酸缺失或增加)的蛋白质，只要这些蛋白质实质上保留凝血因子VIIa的活性即可。此处使用的术语“凝血因子VIIa”或“FVIIa”意指由活化形式(凝血因子VIIa)组成的产物。上述定义的“凝血因子VII”或“凝血因子VIIa”也包括不同个体中可能存在和出现的天然等位基因变异。并且，糖基化作用或其它翻译后修饰的程度和位置可以依据选择的宿主细胞和宿主细胞环境的性质而改变。

此处使用的术语“变体”意指具有SEQ ID NO：1给出序列的凝血因子VII，其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已经被其它氨基酸取代和/或其中亲本蛋白的一个或多个氨基酸已经被删除和/或其中一个或多个氨基酸已经被插入到蛋白中和/或其中一个或多个氨基酸已经被添加到亲本蛋白中。这种添加既可发生在亲本蛋白的N端，也可发生在C端，或二者都有。此处定义的“变体”在其活化形式下仍具有FVII活性。在一个实施方式中，变体与SEQ ID NO：1所示序列有70％相同。在一个实施方式中，变体与SEQ ID NO：1所示序列有80％相同。在另一个实施方式中，变体与SEQ ID NO：1所示序列有90％相同。在进一步的实施方式中，变体与SEQ ID NO：1所示序列有95％相同。

在第一方面，本发明涉及一种凝血因子VII多肽，其中相对于SEQID NO：1氨基酸序列包括至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，以及(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

在第二方面，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有两处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298构成的组中的一个氨基酸。

在第三方面，本发明涉及相对SEQ ID NO：1的氨基酸序列有三处取代的凝血因子VII多肽；其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的两个氨基酸。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有四处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298构成的组中的三个氨基酸。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有五处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的四个氨基酸。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有六处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298构成的组中的五个氨基酸。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有七处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298构成的组中的六个氨基酸。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列有八处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代氨基酸K157、K337、D334、S336、V158、E296和M298。

更进一步，本发明涉及编码凝血因子VII多肽的多核苷酸构建物，所述多肽相对于SEQ ID NO：1氨基酸序列有至少两处取代，其中所述取代为(i)用其它任何氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

术语“构建物”意指可基于编码感兴趣多肽的完全或部分天然核苷酸序列的多核苷酸区段。该构建物可任选地包含其它多核苷酸区段。类似的，术语“能被多核苷酸构建物编码的氨基酸”包括了能由上述定义的多核苷酸构建物编码的氨基酸，也即氨基酸如Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，Glu，Lys，Arg，His，Asp和Gln。

更进一步，本发明提供了包含编码凝血因子VII多肽的多核苷酸构建物的重组载体。

此处使用的术语“载体”意指任何能在宿主细胞中扩增的核酸实体。因而，载体可以是自主复制型载体，也即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。或者，载体也可以是在引入宿主细胞中时被整合到宿主细胞基因组上并与它已经被整合入的染色体一起复制的类型。载体的选择通常取决于它将被引入的宿主细胞。载体包括但不限于质粒载体，噬菌体载体，病毒或粘粒载体。载体通常包含复制起点和至少一个可选择基因，也即编码产物易于检测或编码产物的存在是细胞生长所必需的基因。

更进一步，本发明提供了包含多核苷酸构建物或载体的重组宿主细胞。在一个实施方式中，重组宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方式中，重组宿主细胞是哺乳动物来源细胞。在更进一步的实施方式中，重组宿主细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和BHK细胞构成的组。

此处使用的术语“宿主细胞”是指任何细胞，包括杂交细胞，其中异源的DNA可以被表达。典型的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞，酵母细胞，哺乳动物细胞，包括人类细胞，如BHK，CHO，HEK和COS细胞。在实施本发明时，被培养的宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为已建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO(如ATCC CCL61)，COS-1(如ATCC CRL 1650)，幼仓鼠肾细胞系(BHK)和HEK293(如ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1106-1110，1982)，下文称为BHK570细胞。BHK570细胞系获自美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Dr.，Rockville，MD 20852，ATCC保藏号为CRL 103 14。tk-ts13 BHK细胞系也可以保藏号CRL1632获自ATCC。其它合适的细胞系包括但不限于Rat Hep I(大鼠肝癌细胞；ATCC CRL 1600)，Rat HepII(大鼠肝癌细胞；ATCC CRL 1548)，TCMK(ATCC CCL139)，人肺细胞(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。同样有用的是3T3细胞，Namalwa细胞，骨髓瘤细胞和骨髓瘤与其它细胞的融合细胞。

更进一步，本发明提供了一种含有并表达所述多核苷酸构建物的转基因动物。

更进一步，本发明提供了一种含有并表达所述多核苷酸构建物的转基因植物。

更进一步，本发明涉及一种生产本发明的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括在适当的生长培养基中，在允许多核苷酸构建物表达的条件下，培养包含所述多核苷酸构建物的细胞，并从培养基中回收得到的多肽。

此处使用的术语“适当的生长培养基”意指含有营养物和细胞生长、表达编码本发明凝血因子VII多肽的核苷酸序列所需的其它成分的培养基。

更进一步，本发明涉及一种生产凝血因子VII多肽的方法，该方法包括从转基因动物产生的乳汁中回收多肽。

更进一步，本发明涉及一种生产凝血因子VII多肽的方法，该方法包括培养包含多核苷酸构建物的转基因植物细胞，并从得到的植物中回收多肽。

更进一步，本发明涉及一种药物组合物，其中含有凝血因子VII多肽，该凝血因子VII多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列含有至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸；并任选地含有药物可接受的载体。

更进一步，本发明涉及相对于SEQ ID NO：1氨基酸序列含有至少两处取代的凝血因子VII多肽用来制备药物的用途，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。在一个实施方式中，该药物用于治疗出血紊乱或出血发作，或者用于增强正常的止血体系。在一个实施方式中，该用途是治疗血友病A或B。

在本发明范围内，术语“治疗”的意思既包括防止预期的出血，如在外科手术中，也包括调节已经发生的出血，如在创伤中，目的是抑制出血或使出血最小化。因而根据本发明，预防性施用凝血因子VIIa多肽包括在术语“治疗”中。

术语“出血发作”的意思包括未受控制的和过度的出血。出血发作可能是与外科手术和组织损伤的其它形式相关的主要问题。未受控制的和过度的出血可以发生在具有正常凝血体系的个体中，以及凝固或出血紊乱的个体中。此处所用的术语“出血紊乱”表现为显示出血的细胞或分子来源的、任何先天的、后天获得的或诱导的缺陷。实例为凝血因子缺陷(如血友病A和B，或凝血因子XI或VII缺乏症)，凝血因子抑制因子，血小板功能缺乏，血小板减少或Von Willebrand疾病。

出血过多也可发生于血液凝固级联功能正常(没有凝固因子缺乏或针对任何凝固因子的抑制因子)的个体中，并可由血小板功能缺乏，血小板减少或Von Willebrand疾病引起。在这种情况下，出血可能类似于由血友病导致的出血，因为如同在血友病中，其止血体系缺乏必需凝固“化合物”(如血小板或Von Willebrand因子蛋白)或这样的必需化合物不正常，导致主要的出血。在经历了过多的与外科手术或巨大创伤相关的组织损伤的个体中，正常的止血机制可能不足以承受紧急止血的需要，因此尽管他们有正常的止血机制，但还可产生出血。当出血发生在如脑、内耳区域和眼睛等外科手术止血可能性不大的器官中时，获得令人满意的止血也是一个问题。同样的问题也可以发生于从各种器官(肝，肺，肿瘤组织，胃肠道)中进行活组织检查取样以及在腹腔镜外科手术中。所有这些情况下，通常很难通过外科技术提供止血(缝合，夹等)，在出血是弥散性的(出血性胃炎和大量子宫出血)的情况下就是如此。急性的和过多的出血也可发生在接受抗凝血治疗的个体中，他们已经被给出的治疗诱导使得止血有缺陷。在抗凝血效应必须被迅速消除的情况下，这些个体可能需要介入外科手术干预。对患有局部前列腺癌的个体，基本的耻骨后前列腺切除术是是一种通常实施的方法。该手术常常并发显著的且有时是大量的失血。前列腺切除术中相当多的失血主要与其复杂的解剖位置相关，其中有各种密集的血管化位置，外科手术止血不容易接近，并可能导致较大区域的弥散性出血。可能导致不令人满意的止血的另一种情况是在具有正常止血机制的个体被实施抗凝血疗法以防止血栓栓塞性疾病的情况下。这种疗法可包括肝素，其它形式的蛋白多糖，华法林或其它形式的维生素K拮抗剂以及阿司匹林和其它血小板聚集抑制剂。

在本发明的一个实施方式中，出血与血友病相关。在另一个实施方式中，出血与具有获得性抑制因子的血友病相关。在另一个实施方式中，出血与血小板缺少有关。在另一个实施方式中，出血与VonWillebrand疾病相关。在另一个实施方式中，出血与严重组织损伤相关。在另一个实施方式中，出血与严重的创伤相关。在另一个实施方式中，出血与外科手术相关。在另一个实施方式中，出血与腹腔镜外科手术相关。在另一个实施方式中，出血与出血性胃炎相关。在另一个实施方式中，出血与大量子宫出血有关。在另一个实施方式中，出血发生在机械止血可能性较小的器官上。在另一个实施方式中，出血发生在脑、内耳区域或眼睛上。在另一个实施方式中，出血与进行活组织检查取样相关。在另一个实施方式中，出血与抗凝血疗法相关。

此处使用的术语“个体”意指任何动物，尤其是哺乳动物，如人，并可以在适当的地方与术语“患者”交换使用。

术语“正常止血体系增强”意指产生凝血酶的能力增强。

更进一步，本发明涉及治疗个体的出血紊乱或出血发作的方法或增强正常止血体系的方法，该方法包括对有此需要的个体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽，所述多肽相对于SEQ ID NO：1氨基酸序列包含有至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

更进一步，本发明涉及本发明的凝血因子VII多肽用作药物。

在本发明的一个实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且K157被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且K337被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且D334被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且S336被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且V158被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且E296被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，并且M298被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中在蛋白酶结构域的剩余位置内有至少一个氨基酸被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中在蛋白酶结构域的剩余位置内有至多20个额外氨基酸被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中与选自SEQ ID NO：1中159-170位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已经被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中与选自SEQ ID NO：1中290-304位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已经被任何其它氨基酸所取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中R304已经被选自由Tyr，Phe，Leu和Met构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中与选自SEQ ID NO：1中306-312位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已经被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中M306已经被选自由Asp和Asn构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中D309已经被选自由Ser和Thr构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中与选自SEQ ID NO：1的330-339位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已经被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中A274已经被任何其它氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中A274已经被选自由Met，Leu，Lys和Arg构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中K157已经被选自由Gly，Val，Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述K337已经被选自由Ala，Gly，Val，Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述D334已经被选自由Gly和Glu构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述S336已经被选自由Gly和Glu构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述V158已经被选自由Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述E296已经被选自由Arg，Lys和Val构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述M298已经被选自由Lys，Arg，Gln和Asn构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述L305已经被选自由Val，Tyr和Ile构成的组中的氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述L305已经被Val取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述氨基酸已经被能由多核苷酸构建物编码的不同氨基酸取代。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约1.25。在一个实施方式中，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约2.0。在更进一步的实施方式中，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约4.0。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中当通过凝血因子VIIa多肽活性检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约1.25。在一个实施方式中，当通过凝血因子VIIa多肽活性检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ IDNO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约2.0。在进一步的实施方式中，当通过凝血因子VIIa多肽活性检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约4.0。该凝血因子VIIa活性可以由描述于实施例5或6的检测法测定。

在本发明进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中当通过“体外水解分析测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约1.25。在一个实施方式中，当通过“体外水解分析测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ IDNO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽活性之间的比率至少为大约2.0。在进一步的实施方式中，当通过“体外水解分析测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约4.0。

在本发明的进一步实施方式中，凝血因子VII多肽是一种多肽，其中当通过“体外蛋白分解测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约1.25。在一个实施方式中，当通过“体外蛋白水解分析测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约2.0。在进一步的实施方式中，当通过“体外蛋白水解测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约4.0。在进一步的实施方式中，当通过“体外蛋白水解测定法”检测时，所述凝血因子VII多肽的活性和具有SEQ ID NO：1所示序列的天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比率至少为大约8.0。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少有两处取代的人FVII，其中所述取代为(i)L305V和(ii)选自由K157X¹，K337A，D334X²，S336X³，V158X⁴，E296V和M298Q构成的组中的一个或多个氨基酸，其中X¹为Gly，Val，Ser，Thr，Asn，Gln，Asp或Glu；X²为Gly或Glu；X³为Gly或Glu；X⁴为Thr或Asp。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/K337A-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/E296-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/K337A/V158T-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/K337A/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/K337A/E296V-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/K337A/V158D-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/E296V-FII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/E296V-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/E296V/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII.

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/E296V/K337A-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/E296V/K337A-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII。

在本发明更进一步的实施方式中，凝血因子VII多肽是L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII。

更进一步，本发明提供了一种人凝血因子VIIa多肽，它与天然人凝血因子VIIa多肽相比具有增加的组织因子非依赖性活性。在另一方面，活性增加并没有伴随着底物特异性的改变。在本发明的另一方面，该多肽变体与组织因子的结合不应受损，并且当该多肽变体结合到组织因子上时，它应至少具有野生型凝血因子VIIa的活性。

说明书中使用的氨基酸取代命名如下所述。第一个字母代表了天然存在于SEQ ID NO：1中某位置的氨基酸。其后的数字代表了它在SEQ ID NO：1中的位置。第二个字母代表了取代天然氨基酸的不同氨基酸。一个实例为L305V/K337A-FVII，其中位于SEQ ID NO：1的305位置的亮氨酸被缬氨酸取代，并且位于SEQ ID NO：1的337位置的赖氨酸被丙氨酸取代，两种变异发生于同一凝血因子VII多肽变体中。

在本发明的范围内，如表1所述的氨基酸的三字母或单字母被用于它们常规的含义中。如果没有明确指出，这里所指的氨基酸是L-氨基酸。更进一步，如果没有另外指出，肽的氨基酸序列的左和右端分别是N和C末端。

表1：氨基酸缩写

氨基酸	三字母代码	单字母代码
氨基酸	三字母代码	单字母代码	甘氨酸	Gly	G
脯氨酸	Pro	P	甘氨酸	Gly	G
脯氨酸	Pro	P	丙氨酸	Ala	A
缬氨酸	Val	V	丙氨酸	Ala	A
缬氨酸	Val	V	亮氨酸	Leu	L
异亮氨酸	Ile	I	亮氨酸	Leu	L
异亮氨酸	Ile	I	甲硫氨酸	Met	M
半胱氨酸	Cys	C	甲硫氨酸	Met	M
半胱氨酸	Cys	C	苯丙氨酸	Phe	F
酪氨酸	Tyr	Y	苯丙氨酸	Phe	F

色氨酸	Trp	W
色氨酸	Trp	W	组氨酸	His	H
赖氨酸	Lys	K	组氨酸	His	H
赖氨酸	Lys	K	精氨酸	Arg	R
谷氨酰胺	Gln	Q	精氨酸	Arg	R
谷氨酰胺	Gln	Q	天冬酰胺	Asn	N
谷氨酸	Glu	E	天冬酰胺	Asn	N
谷氨酸	Glu	E	天冬氨酸	Asp	D
丝氨酸	Ser	S	天冬氨酸	Asp	D
丝氨酸	Ser	S	苏氨酸	Thr	T

凝血因子VII多肽变体的制备

本发明也涉及制备如上述人凝血因子VII多肽变体的方法。这里描述的凝血因子VII多肽变体可通过重组核酸技术生产。通常，为编码需要的蛋白质，可对克隆的野生型凝血因子VII核酸序列进行修饰。然后可将该经修饰的序列插入到表达载体中，继而又将该表达载体转化或转染到宿主细胞中。优选采用高等真核细胞作为宿主细胞，尤其是培养的哺乳动物细胞。完整的人凝血因子VII核酸和氨基酸序列是已知的(参见US4784950，其中描述了克隆并表达重组人凝血因子VII)。牛的凝血因子VII序列描述于Takeya等，J.Biol.Chem.263：14868-14872(1988)。

氨基酸序列改变可以通过各种技术完成。可以通过定点诱变进行氨基酸序列修饰。定点诱变技术是本领域公知的，并且描述于例如Zoller和Smith(DNA 3：479-488，1984)或“通过重叠延伸进行剪接”Horton等，Gene 77，1989，pp.61-68。因此，利用凝血因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可以导入所选的改变。同样地，利用特定的引物采用聚合酶链反应制备DNA构建物的方法是本领域技术人员公知的(参见PCR Protocols，1990，Academic Press，San Diego，California，USA)。

编码本发明凝血因子VII多肽变体的核酸构建物可以是基因组或cDNA的来源，如通过制备基因组或cDNA文库、杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列来获得，杂交根据标准技术使用合成的寡核苷酸探针进行(参阅Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd.Ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1989)。

编码凝血因子VII多肽变体的核酸构建物也可通过已建立的标准方法合成制备，如，Beaucage和Caruthers描述的亚磷酰胺法Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869，或由Matthes等，EMBOJournal3(1984)，801-805描述的方法。根据亚磷酰胺法，合成寡核苷酸，如在自动DNA合成仪中合成，纯化，退火，连接并在合适的载体中克隆。编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列也可通过聚合酶链反应用特定的引物制备，例如在US4683202，Saiki等，Science239(1988)，487-491，或Sambrook等，supra中所描述的。

此外，通过按照标准技术将对应于完整核酸构建体不同部分的合成的、基因组的或cDNA来源(适当时)的片段连接起来，可以制成合成的和基因组来源相混合、合成的和cDNA来源相混合或基因组和cDNA来源相混合的核酸构建体。

核酸构建物优选为DNA构建物。根据本发明用于产生凝血因子VII多肽变体的DNA序列通常在凝血因子VII多肽的氨基末端编码前原多肽，以获得适当的翻译后加工(如谷氨酸残基的γ-羧化)并从宿主细胞中分泌。前原多肽可以是凝血因子VII或另一维生素K-依赖性血浆蛋白质(如凝血因子IX，凝血因子X，凝血酶原，蛋白C或蛋白S)的前原多肽。正如本领域技术人员所理解的，可以在凝血因子VII多肽变体的氨基酸序列中进行额外修饰，其中所述修饰并不会显著损害该蛋白质作为凝结剂的能力。例如，凝血因子VII多肽变体也可在活化裂解位点处被修饰，以抑制酶原凝血因子VII转化为它的活化双链形式，如在US5288629中一般性描述的(此处引入作为参考)。

编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列通常被插入到重组DNA载体中，这样的载体可以是任何载体，并可方便地进行重组DNA操作，载体的选择通常依它被引入的宿主细胞而定。因而，载体可以是自主复制型载体，也即以染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，如质粒。或者，载体可以是在引入宿主细胞时被整合到宿主细胞基因组内并与它已经整合的染色体一起复制的类型。

载体优选为表达载体，在其中编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列被可操作地连接到该DNA转录所需的额外区段上。通常，表达载体源于质粒或病毒DNA，或二者都可有。术语“可操作性连接”意指这些片段排列的方式能够使它们发挥预期的功能，如转录起始于启动子，并通过编码该多肽的DNA序列继续下去。

用于表达凝血因子VIIa多肽变体的表达载体包含能指导克隆基因或cDNA转录的启动子。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并可源于宿主细胞同源或异源蛋白质编码基因的任何DNA序列。

指导编码人凝血因子VII多肽变体的DNA转录的适当启动子的实例为SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)，MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222(1983)，809-814)，CMV启动子(Boshart等，Cell 41：521-530，1985)或腺病毒2主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，Mol.Cell.Biol，2：1304-1319，1982)。

用于昆虫细胞的适当启动子的实例为多角体蛋白启动子(US 4,745,051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311，(1992)7-11)，P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69，1988，pp.765-776)，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动子(EP 397485)，杆状病毒39K迟早期基因启动子(US5,155,037；US5,162,222)。

用于酵母宿主细胞的适当的启动子包括来自酵母糖酵解基因的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，在Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals中(Hollaender et al，eds.)Plenum Press，New York，1982)，或TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature 304(1983)，652-654)启动子。

用于丝状真菌宿主细胞的适当启动子的实例为ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用启动子的实例为那些源于编码下述酶的基因的启动子，所述酶是例如米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉(A.niger)耐酸性α-淀粉酶，黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)，Rhizomucor miehei脂肪酶，米曲霉(A.oryzae)碱性蛋白酶，米曲霉(A.oryzae)丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。优选TAKA-淀粉酶和gluA启动子。适当的启动子在如EP238023和EP 383779中提到。

如果必要，编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列也可被可操作性的连接到适当的终止子上，如人生长激素终止子(Palmiter等，Science 222，1983，pp.809-814)或TPI 1(Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1，1982，pp.419-434)或ADH3(McKnight等，TheEMBO J.4，1985，pp.2093-2099)终止子。表达载体也可以包含一组位于启动子下游、凝血因子VII序列本身的插入位点上游的RNA剪接位点。优选的RNA剪接位点可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中获得。在表达载体中也包含位于插入位点下游的多腺苷酸化信号。特别优选的多腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，ibid.)，来自腺病毒5Elb区域的多腺苷酸化信号，人生长激素基因终止子(DeNoto等Nucl.Acids Res.9：3719-3730，1981)或来自人凝血因子VII基因或牛凝血因子VII基因的多腺苷酸化信号。表达载体也可包括非编码病毒前导序列，如腺病毒2三联前导序列，位于启动子和RNA剪接位点之间；还可包含增强子序列，如SV40增强子。

为了指导本发明的人凝血因子VII多肽变体进入宿主细胞的分泌途径，可在重组载体中提供分泌信号序列(也即通常所说的前导序列，前原序列或前序列)。分泌信号序列以正确的阅读框架连接到编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是与该蛋白质天然相关的类型，或可来自编码另一分泌蛋白的基因。

为了从酵母细胞中分泌，分泌信号序列可编码任何信号肽，该信号肽能确保有效地指导所表达的人凝血因子VII多肽变体进入细胞的分泌途径。信号肽可以是天然出现的信号肽，或是它们的功能性部分，或者是合成肽。适当的信号肽可以是α-因子信号肽(参见US4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶信号肽(参见O.Hagenbuchle等，Nature 289，1981，pp.643-646)，经修饰的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等，Cell 48，1987，pp.887-897)，酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)，或酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，Yeast 6，1990，pp.127-137)。

为了在酵母中有效分泌，可将编码前导肽的序列插入到信号序列的下游和编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列的上游。前导肽的功能是使所表达的肽从内质网指导到高尔基体并进一步到分泌小泡，以便分泌到培养基中(也即，穿过细胞壁或至少通过细胞膜进入到酵母细胞的细胞周质间隙，从而输出人凝血因子VII多肽变体)。前导肽可以是酵母α-因子前导区(它的使用公开于如US 4,546,082，US4,870,008，EP 16 201，EP 123 294，EP 123 544和EP 163 529中)。或者，前导肽可以是合成的前导肽，也就是天然不存在的前导肽。合成的前导肽可以如WO 89/02463或WO 92/11378中所述进行构建。

为用于丝状真菌，信号肽可方便地衍生自编码曲霉菌属(Aspergillus sp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码Rhizomucormiehei脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因中方便地获得。信号肽优选从编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉(A.niger)耐酸淀粉酶或黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶的基因衍生而来。适当的信号肽被公开于例如 EP 238 023和EP 215 594中。

为用于昆虫细胞，信号肽可方便地衍生自昆虫基因(参见WO90/05783)、如鳞翅目Manduca sexta脂动激素前导信号肽(参见US5,023,328)被方便地获得。

用于连接编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列、启动子和非必要地终止子和/或分泌信号序列的操作，以及将它们插入到含有复制必需信息的适当载体中的操作，是本领域技术人员公知的技术(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)。

转染哺乳动物细胞和表达引入到细胞中的DNA序列的方法描述于如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell 14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Graham和van der Eb，Virology 52(1973)，456；和Neumann等，EMBO J.1(1982)，841-845。

可通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725-732，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603-616，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52d：456-467，1973)或电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)将克隆的DNA序列导入到培养的哺乳动物细胞中。为了鉴别并选择表达外源DNA的细胞，可将具有可选择性表型(选择标记物)的基因与需要的基因或cDNA一起引入到细胞中。优选的选择标记包括赋予抗药性如抗新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤的基因。选择标记可以是一种可扩增的选择标记。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。关于选择标记物的综述参见Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，MA，此处引入作为参考)。本领域技术人员能够容易选择适当的选择标记物。

可以在另一质粒上将选择标记物与需要的基因同时引入到细胞中，或者它们可以在同一质粒上被导入。如果在同一质粒上，选择标记物和需要的基因可以在不同启动子或同一启动子的控制下，后一种排列产生双顺反子信使。这种类型的构建物是本领域公知的(例如，Levinson和Simonsen，U.S.4,713,339)。向引入细胞的混合物中添加被称为“载体DNA”的附加DNA也是有利的。

细胞吸收了DNA后，将它们在适当的生长培养基中生长，通常是1-2天，开始表达所需的基因。用于此处的术语“适当的生长培养基”意指含有细胞生长和表达感兴趣的人凝血因子VII多肽变体所需的营养物和其它成分的培养基。培养基通常包含碳源，氮源，必需氨基酸，必需糖类，维生素，盐，磷脂，蛋白质和生长因子。为了生产γ-羧化蛋白，该培养基应含有维生素K，优选浓度为约0.1μg/ml至约5μg/ml。然后应用药物选择来筛选以稳定方式表达选择标记物的细胞生长。对于已经用可扩增选择标记物转染的细胞，可以提高药物浓度以选择克隆序列的拷贝数增加，从而提高表达水平。然后筛选稳定转染细胞克隆中表达所需的人凝血因子VII多肽变体的情况。

导入编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列的宿主细胞可以是能产生翻译后修饰型人凝血因子VII多肽变体的任何细胞，包括酵母、真菌和高等真核细胞。

用于本发明的哺乳动物细胞系的实例为COS-1(ATCC CRL1650)，幼仓鼠肾细胞(BHK)和293(ATCC CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系为tk-ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：1106-1110，1982，此处引入作为参考)，下文中称为BHK570细胞。BHK570细胞系已被保藏于美国典型培养物保藏中心，Parklawn Dr.，Rockville，Md.20852，ATCC保藏编号为CRL10314。也可以保藏号CRL 1632从ATCC获得tk-ts13 BHK细胞系。此外，许多其它细胞系也可用于本发明，包括Rat Hep I(大鼠肝癌细胞；ATCC CRL 1600)，Rat Hep II(大鼠肝癌细胞；ATCC CRL 1548)，TCMK(ATCC CCL139)，人肺细胞(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)，CHO(ATCC CCL 61)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。

适当的酵母细胞的实例包括酵母属(Saccharomyces spp.)或裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces spp)细胞，尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)菌株。用异源DNA转化酵母细胞和从其中生产异源多肽的方法公开于如US 4,599,311，US 4,931,373，US 4,870,008，5,037,743和US 4,845,075，它们全部引入此处作为参考。转化细胞由选择标记物决定的表型选择，通常为药物抗性或在缺少特殊营养物(如亮氨酸)时的生长能力。用于酵母的优选载体是公开于US4,931,373中的POT1载体。该编码人凝血因子VII多肽变体的DNA序列之前可以有信号序列和非必要地前导序列，如上所述。适当酵母细胞的进一步实例为克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)菌株，如乳克鲁维氏酵母(K lactis)，汉逊氏酵母属(Hansenula)菌株，如多形汉逊氏酵母(H.Polymorpha)，或毕赤氏酵母属(Pichia)，如巴斯德毕赤氏酵母(P.Pastoris) (参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；US 4,882,279)。

其它真菌细胞的实例是丝状真菌细胞，如曲霉属(Aspergillusspp.)，脉孢菌属(Neurospora spp.)，镰孢属(Fusarium spp.)，或木霉属(Trichoderma spp.)，尤其是米曲霉(A.oryzae)，构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)菌株。使用曲霉属(Aspergillus spp.)表达蛋白质的内容已经公开于如EP 272 277，EP 238 023，EP 184 438中。例如，可以按照Malardier等，1989，Gene 78：147-156的描述实施转化尖镰孢(F.Oxysporum)的方法。例如可以按照如EP244234所述的方法完成木霉属(Trichoderma spp.)的转化。

当丝状真菌被用作宿主细胞时，它可用本发明的DNA构建物转化，通过方便地整合DNA构建物进入到宿主染色体中可获得重组宿主细胞。这种整合通常被认为是有利的，因为DNA序列更可能稳定地保持在细胞中。将DNA构建物整合进入宿主染色体可根据常规方法进行，如通过同源或异源重组。

转化昆虫细胞并在其中产生异源多肽可如同US 4,745,051；US4,879,236；US 5,155,037；5,162,222；EP 397,485的描述实施，它们全部引入此处作为参考。用作宿主的昆虫细胞系可以是合适的鳞翅目(Lepidoptera)细胞系，如Spodoptera frugiperda细胞是或Trichoplusia ni细胞(参见US5,077,214)。培养条件可以是例如WO89/01029或WO 89/01028或任何上述参考文献中描述的条件。

然后将上述转化或转染宿主细胞在适当的营养培养基中，在允许表达人凝血因子VII多肽变体的条件下进行培养，之后，可从培养物中回收所得到的所有或部分肽。用于培养细胞的培养基可以是任何适于宿主细胞生长的常规培养基，如基本培养基或含有适当补充物质的复合培养基。适当的培养基可由供应商获得，或可以根据公开的配方(如，按照美国典型培养物保藏中心的目录)制备。然后可通过常规程序从培养基中回收由细胞产生的人凝血因子VII多肽变体，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质性成分，通过各种层析法纯化，如离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等，依所述多肽的类型而定。

可利用转基因动物来产生本发明的凝血因子VII多肽变体。优选在雌性哺乳动物宿主乳腺中产生蛋白质。在乳腺中表达及随后分泌所需蛋白到乳汁中的方式克服了从其它来源中分离蛋白时遇到的许多困难。乳汁易采集，可大量的获得，并已在生物化学上得到充分表征。而且，主要的乳汁蛋白以高浓度存在于乳汁中(通常是约1至15g/l)。

从商业的观点来看，明显地优选使用乳汁产量多的宿主种类。虽然小型动物如小鼠和大鼠可以使用(优选在原理的证明阶段)，但优选使用家畜哺乳动物，包括但不限于，猪，山羊，绵羊和牛。由于以下因素，如绵羊的已有转基因历史，乳汁产量，成本和采集绵羊乳汁的设备易于获得，特别优选使用绵羊(参见，如WO88/00239中比较了影响宿主物种选择的因素)。通常比较理想的是选择已经过育种用于乳业的宿主动物品种，如East Friesland绵羊，或通过在后期与转基因品系杂交来导入种畜。无论如何，应使用已知的、处于健康状态的动物。

为在乳腺中获得表达，可使用来自乳蛋白基因的转录启动子。乳蛋白基因包括那些编码酪蛋白(参见US5,304,489)，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的基因。优选β-乳球蛋白(BLG)启动子。就绵羊β-乳球蛋白基因来说，通常可使用该基因5’侧翼序列的至少近406pb的区域，但优选使用大部分的5’侧翼序列，可多达约5kbp，如涵盖β-乳球蛋白基因5’侧翼启动子和非编码区部分的4.25kbp DNA片段(参见Whitelaw等，Biochem.J.286：31-39(1992))。来自其它物种的类似启动子DNA片段也是合适的。

也可将其它区域的β-乳球蛋白基因引入构建物，待表达基因的基因组区域同样也可以。本领域通常认为，缺少内含子的构建物与那些含有这些DNA序列的构建物相比表达较差(参见Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：836-840(1988)；Palmiter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：478-482(1991)；Whitelaw等，Transgenic Res.1：3-13(1991)；WO 89/01343；和WO 91/02318，此处均引入作为参考)。在这点上，如果可能，优选使用含有编码所需蛋白质或多肽的基因的全部或一些天然内含子的基因组序列，因此优选进一步包括至少一些来自如β-乳球蛋白基因的内含子。一种这样的区域是从绵羊β-乳球蛋白基因的3’非编码区域提供内含子剪接和RNA多聚腺苷酸化的DNA区段。当用于取代基因的天然3’非编码序列时，该绵羊β-乳球蛋白区段可增强并稳定所需蛋白质或多肽的表达水平。在其它实施方式中，凝血因子VII序列变体起始ATG周围的区域被来自乳汁特异蛋白基因的相应序列所取代。这种取代提供了一种假定的组织特异性启动环境，用以增强表达。可很方便地用那些如BLG基因的相应区域取代整个凝血因子VII前原序列和5’非编码序列，当然也可取代更小的区域。

为了在转基因动物中表达凝血因子VII多肽变体，将编码变体凝血因子VII的DNA区段操作性地连接到其表达所需的额外DNA区段上，产生表达单元。这种额外区段包括上述启动子，也包括提供转录终止和mRNA多聚腺苷酸化的序列。该表达单元进一步包括编码分泌信号序列的DNA区段，该分泌信号序列可操作性地连接到编码经修饰的凝血因子VII的区段上。该分泌信号序列可以是天然凝血因子VII分泌信号序列或可以是另一种蛋白如乳蛋白的信号序列(参见，如vonHeijne，Nucl.Acids Res.14：4683-4690(1986)；和Meade等，U.S.4,873,316，此处引入作为参考)。

用于转基因动物的表达单元可方便地通过将变体凝血因子VII序列插入到含有额外DNA片段的质粒或噬菌体载体上来实现，当然表达单元也可通过基本上任何顺序的连接来构建。特别方便的是提供含有编码乳蛋白的DNA片段的载体，并用凝血因子VII变体的编码序列取代乳蛋白的编码序列；从而产生了包括乳蛋白基因的表达控制序列的基因融合体。无论如何，在质粒或其它载体上克隆表达单元将有益于变体凝血因子VII序列的扩增。扩增可方便地在细菌(如E.coli)宿主细胞上进行，因而该载体通常包括复制起点和在细菌宿主细胞中有功能的选择标记物。然后将该表达单元引入到选定的宿主种类中的受精卵(包括早期胚胎)中。异源DNA的引入可通过一些途径中的任一种完成，包括显微注射(如美国专利号4,873,191，)，逆转录病毒感染(Jaenisch，Science 240：1468-1474(1988))或用胚胎干(ES)细胞定位整合(有关综述参见Bradley等，Bio/Technology 10：534-539(1992))。然后将这些卵植入到假妊娠雌性动物的输卵管或子宫内，使之发育到妊娠期。在它们的种系中载有所导入的DNA的后代可以以正常的孟德尔方式将这些DNA传递到它们的后代中，从而发展成转基因畜群。生产转基因动物的一般规程是本领域公知的(参见，如Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986；Simons等，Bio/Technology 6：179-183(1988)；Wall等，Biol.Reprod.32：645-651(1985)；Buhler等，Bio/Technology 8：140-143(1990)；Ebert等，Bio/Technology 9：835-838(1991)；Krimpenfort等，Bio/Technology 9：844-847(1991)；Wall等，J.Cell.Biochem.49：113-120(1992)；U.S.4,873,191；U.S.4,873,316；WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；和GB87/00458)。最初在小鼠中开发了将外源DNA序列引入到哺乳动物和它们的生殖细胞的技术(参见如Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380-7384(1980)；Gordon和Ruddle，Science 214：1244-1246(1981)；Palmiter和Brinster，Cell 41：343-345(1985)；Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442(1985)；和Hogan等(ibid.))。随后调整这些技术以用于较大的动物，包括家畜(参见，如，WO＜RTI 88/00239，WO 90/05188，和WO 92/11757；和Simons等，Bio/Technology 6：179-183(1988))。总结的说，以迄今为止最有效的转基因小鼠或家畜产生途径，将数百个所需DNA的线性分子根据已建立的技术注入到受精卵的原核之一中。也可将DNA注入到受精卵的细胞质中。

也可在转基因植物中生产。表达也可在全身进行或指导到特定的器官中，如块茎(参见Hiatt，Nature 344：469-479(1990)；Edelbaum等，J.Interferon Res.12：449-453(1992)；Sijmons等，Bio/Technology 8：217-221(1990)；和EP 0 255 378)。

本发明的凝血因子VII多肽变体可从细胞培养基或乳汁中回收。本发明的凝血因子VII多肽变体可以通过各种本领域公知的方法纯化，包括但不限于色谱层析法(如离子交换，亲和，疏水，层析聚焦和大小排阻法)，电泳方法(如制备性等电聚焦(IEF)，溶解度差异(如硫酸铵沉淀)或萃取法(参见，如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。优选地，它们可在抗凝血因子VII抗体柱上通过亲和层析法纯化。特别优选使用钙依赖性单克隆抗体，如Wakabayashi等，J.Biol.Chem.261：11097-11108，(1986)和Thim等，Biochemistry 27：7785-7793，(1988)所描述的。进一步的纯化可以通过常规的化学纯化方法获得，如高效液相色谱法。其它纯化方法是本领域公知的，包括柠檬酸钡沉淀法，可用来纯化本文公开的新型凝血因子VII多肽变体(参见，如Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。

对于治疗的目的，优选本发明的凝血因子VII多肽变体是实质上纯的。因此，在本发明的优选实施方式中，本发明的凝血因子VII多肽变体被纯化为至少约90-95％均一，优选为约98％均一。纯度可以由如电泳和氨基末端氨基酸侧序评价。

凝血因子VII变体在其活化位点被裂解，以便转变为它的双链形式。活化可以根据本领域公知的方法进行，如公开于Osterud，等，Biochemistry 11：2853-2857(1972)；Thomas，美国专利号4,456,591；Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841(1983)；或Kisiel和Fujikawa，Behring Inst.Mitt.73：29-42(1983)中的方法。或者，正如Bjoern等(Research Disclosure，269 September 1986，pp.564-565)所描述的，可以使其通过离子交换色谱柱如MonoQE(Pharmacia fine Chemicals)等来活化凝血因子VII。然后可配制所得到的活化凝血因子VII变体，并如下述方法用药。

分析测定

本发明也提供了选择本发明的首选凝血因子VIIa变体的适当分析测定方法。这些分析测定可以作为一种简单的体外预试验进行。

因而，此处的实施例5公开了一种简单的试验(标题为“体外水解分析测定”)，可用于测定本发明的凝血因子VIIa变体的活性。基于此，尤其感兴趣的凝血因子VIIa变体是这样的变体，其中当用“体外水解分析测定”检测时，变体的活性与显示于图1的天然凝血因子VII的活性之间的比率为1.0以上，如至少约1.25，优选为至少约2.0，如至少约3.0，或更优选至少约4.0。

变体的活性也可用生理性底物如凝血因子X测定(“体外蛋白酶解分析测定”)(参见实施例6)，适宜地在100-1000nM的浓度进行，其中在添加适当的发色底物(如S-2765)后测定所产生的凝血因子Xa。此外，活性分析测定可在生理温度下进行。

凝血因子VIIa变体产生凝血酶的能力也可以在含在生理性浓度的所有相关凝血因子和抑制因子(在模仿血友病A的情况下无凝血因子VIII)以及活化血小板的分析测定中测量(如在Monroe等(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547中的第543页所述，此处将其引入作为参考)。

给药和药物组合物

根据本发明的凝血因子VII多肽变体可以用于控制一些原因的出血紊乱，如凝血因子缺乏(如血友病A和B，或者凝血因子XI或VII缺乏症)或凝血因子抑制物，或者它们可用于控制发生在血液凝固级联功能正常的个体中的大量出血(无凝固因子缺乏或针对任何凝血因子的抑制物)。这种出血可由血小板功能缺陷，血小板减少或VonWillebrand疾病导致。它们也可以在其中由各种刺激诱导了纤维蛋白溶解活性提高的个体中观察到。

对于经受与外科手术或巨大创伤相关联的大范围组织损伤的个体，止血基质可能不足以满足立即止血的需要，尽管止血机制正常，出血仍然可能发生。当出血发生在器官如脑、内耳区域和眼睛时，达到满意的止血也是一个问题，在很难鉴别其来源时，这也是弥散性出血情况的一个问题(出血性胃炎和子宫过度出血)。同样的问题在对各种器官(肝，肺，肿瘤组织，胃肠道)进行活组织检查取样中以及在腹腔镜外科手术中也可出现。这些情况均存在经外科技术进行止血比较困难的问题。急性的和过多的出血也可发生于接受抗凝剂疗法的个体中，他们体内已经接受的治疗法诱导了止血缺陷。在抗凝效应必须被迅速抵消的情况下，这种个体可能需要外科手术干预。导致止血令人不满意的另一种情况是，具有正常止血机制的个体接受抗凝剂疗法以防止血栓栓塞疾病。这种疗法可包括肝素，其它形式的蛋白聚糖，华法林或其它形式的维生素K-拮抗剂，以及阿司匹林和其它血小板凝集抑制剂。

凝固级联的系统活化可导致弥散性血管内凝血(disseminatedintravascular coagulation，DIC)。然而，这种并发症并没有在接受高剂量重组凝血因子VIIa治疗的个体体内发现，这是由于凝血因子VIIa和暴露于血管壁损伤位点的TF之间的复合物形成诱导了这种局部止血过程。根据本发明的凝血因子VII多肽变体也可以它们的活化形式用于控制这种与正常止血机制有关的过度出血。

对于与有目的的干预有关的治疗，本发明的凝血因子VII多肽变体通常在进行干预之前的约24小时内给药，且在此之后持续7天或更多时间。作为凝结剂给药可以以此处描述的各种途径进行。

对于70kg的个体，作为给药和维持剂量，凝血因子VII多肽变体的剂量范围为约0.05mg至500mg/天，优选约1mg至200mg/天，更优选地从约10mg至约175mg/天，这取决于个体的体重和病情的严重性。

对于预防和/或治疗处理，该药物组合物主要用于非肠道给药。优选地，该药物组合物经非肠道给药，也即静脉内，皮下或肌内给药，或它可以通过连续或搏动式输注给药。用于非肠道给药的组合物包括本发明的凝血因子VII变体，与之组合(优选用于溶解)的药学可接受载体，优选是含水载体。有多种含水载体可以使用，如水，缓冲液，0.4％盐溶液，0.3％甘氨酸溶液等。本发明的凝血因子VII多肽变体也可配制成脂质体制剂，用以传输或投递或靶向到受伤位点。脂质体制剂一般性描述于如US4,837,028，US4,501,728和US4,975,282中。该组合物可通过常规的、公知的灭菌技术灭菌。获得的水溶液可包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，该冻干制剂在给药前与无菌水溶液混合。该组合物可含有药学可接受的、接近生理状态所需的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，张力调节剂等等，例如，乙酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙等。

这些配方中的凝血因子VII变体的浓度可以大范围改变，也即，从小于约0.5重量％，通常等于或至少为1重量％，至大约15重量％或20重量％，并根据选择的特殊给药方式、主要通过流体体积、粘度等选择。

因而，用于静脉注入的典型药物组合物含有250ml的无菌Ringer溶液和10mg的凝血因子VII变体。制备非肠胃给药组合物的现行方法是本领域技术人员公知和显然的，并更详细地公开于如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA(1990)。

可以施用有本发明凝血因子VII多肽变体的组合物，用于预防和/或治疗处理。在治疗应用中，以足够治疗、缓解或部分抑制疾病及其并发症的量将组合物施用于已经患有疾病的个体，如上文所述。适于实现该目的的量被定义为“治疗有效量”。正如本领域技术人员所理解的，对该目的有效的量取决于病情或损伤的严重程度以及个体的体重和总体状态。然而，通常对70kg的个体，有效量的范围为从每天约0.05mg至约500mg的凝血因子VII变体，更常用每天约1.0mg至约200mg的凝血因子VII变体剂量。

本发明的FVIIa多肽通常可在严重的疾病或受伤状态、也即危急生命的或可能危急生命的情况下使用。在这种情况下，由于外来物质已最小化，且人凝血因子VII多肽变体在人体内一般缺乏免疫原性，治疗医生施用实质上过量的这些变体凝血因子VII组合物可能会合乎需要。

在预防应用中，将含有本发明凝血因子VII变体的组合物施用于易受或处于疾病状态或损伤危险中的个体，以增强个体自身的凝血能力。这一剂量被定义为“预防有效量”。在预防应用中，精确的剂量同样取决于个体的健康和体重状况，但是对于70公斤的个体，剂量通常为每天约0.05mg至约500mg，70公斤个体更普遍的剂量为每天约1.0mg至约200mg。

组合物可单次或多次给药，剂量水平和模式由治疗医生选择。对于需要每天维持水平的不卧床个体，凝血因子VII多肽变体可以经连续输注给药，如用便携式泵系统给药。

本发明的凝血因子VII变体的局部投递、例如局部施用可通过例如喷雾，灌注，双球囊导管，支架，引入血管移植物或支架内，用于包被球囊导管的水凝胶，或其它已经建立好的方法来进行。在任何情况下，药物组合物应该提供足够有效治疗个体的量的凝血因子VII变体。

本发明进一步由以下实施例描述，但这些实施例不应解释为对保护范围的限制。以上描述和以下实施例公开的特征单独地、或以任何组合构成实现本发明多种形式的实质内容。

附图简述

图1表示天然(野生型)人凝血因子VII的完整的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)。

实施例

以下实施例中使用的氨基酸取代命名法如下所述。第一个字母代表天然存在于SEQ ID NO：1中某个位置的氨基酸。其后的数字代表它在SEQ ID NO：1中的位置。第二个字母代表取代该天然氨基酸的不同氨基酸。一个实例为L305V/K337A-FVII，位于SEQ ID NO：1中第305位置的亮氨酸被缬氨酸所取代，以及位于SEQ ID NO：1中第337位置的赖氨酸被丙氨酸所取代，两种突变均发生在同一凝血因子VII变体上。

实施例1

编码L305V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII的DNA。

通过定点诱变，使用超螺旋双链DNA载体(带有感兴趣的插入片段)和两条含有所需要突变的合成引物制备编码L305V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII和L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII的DNA构建物。使用了以下引物：

对于L305V-FVII：

5’-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3’(SEQ ID NO：2)

5’-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3’(SEQ ID NO：3)

对于K337A-FVII：

5’-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3’(SEQ ID NO：4)

5’-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3’(SEQ ID NO：5)

对于V158D-FVII：

5’-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3’(SEQ ID NO：6)

5’-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3’(SEQ ID NO：7)

对于E296V/M298Q-FVII：

5’-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3’(SEQ ID NO：8)

5’-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3’(SEQ ID NO：9)

在温度循环期间通过Pfu DNA聚合酶延伸分别与载体的相对链互补的寡核苷酸引物。掺入引物后，即产生了含有交错切口的突变质粒。温度循环之后，该产物用对甲基化和半甲基化DNA特异的Dpnl处理，以消化亲代DNA模板并选择含有突变的合成DNA。

利用特异引物通过聚合酶链反应制备DNA构建物的方法是本领域技术人员公知的(参见PCR Protocols，1990，Academic Press，SanDiego，California，USA)。

实施例2

L305V/K337A-FVII的制备

基本上按照以前描述的方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson和Nielsen(1996)FEBSLett.385，241-243)，以获得变体L305V/K337A-FVII的表达。该凝血因子VII变体的纯化如下：

在加入5mM EDTA，0.1％TritonX-100和10mMTris、调节pH至8.0、并加入水调节电导率到10-11mS/cm之后，将条件培养基上样到25ml的QSepharose Fast Flow柱中(Pharmacia Biotech)。

蛋白质洗脱通过用从10mM Tris，50mM NaCl，0.1％TritonX-100，pH8.0至10mM Tris，50mM NaCI，25mM Cacl₂，0.1％TritonX-100，pH8.0的梯度来完成。将含有L305V/K337A-FVII的部分汇合在一起，并将其施加到含有单克隆抗体F1A2(NovoNordisk，Bagsvaerd，Denmark)，偶联到经CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)的25ml柱上。

该柱用含有10mM CaCl₂，100mM NaCl和0.02％TritonX-100的50mM Hepes，pH7.5溶液平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液冲洗后，结合物质用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱。在使用或贮存之前，加入与EDTA相比属过量的CaCl₂，或将L305V/K337A-FVII转移到含有Ca²⁺的缓冲液中。每一步的产率通过凝血因子VII ELISA检测法测定，并且通过SDS-PAGE分析测定纯化蛋白质。

实施例3

L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII的制备。

基本上按照以前描述的方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson和Nielsen(1996)FEBSLett.385，241-243)，以获得变体L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII的表达。该凝血因子VII变体的纯化如下：

在加入5mM EDTA、0.1％TritonX-100和10mM Tris、调节pH至8.0、并加入水调节电导率到10-11mS/cm之后，将条件培养基上样到25ml的Q Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia Biotech)上。

蛋白质洗脱通过用从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％TritonX-100(pH8.0)至10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％TritonX-100(pH8.0)的梯度来完成。将含有L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII的部分汇合在一起，并将其施加到含有单克隆抗体F1A2(NoVo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)偶联到经CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)的25ml柱中。

该柱用含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％TritonX-100的50mM Hepes，pH7.5溶液平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液冲洗后，结合物质用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱。在使用或贮存之前，加入与EDTA相比属过量的CaCl₂，或将L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII转移到含有Ca²⁺的缓冲液中。每一步的产率通过凝血因子VII ELISA检测法测定，并且通过SDS-PAGE分析测定纯化蛋白质。

实施例4

L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII的制备。

基本上按照以前描述的方法转染BHK细胞(Thim等(1988)Biochemistry 27，7785-7793；Persson和Nielsen(1996)FEBSLett.385，241-243)，以获得变体L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII的表达。该凝血因子VII变体的纯化如下：

蛋白质洗脱通过用从10mM Tris、50mM NaCl、0.1％TritonX-100(pH8.0)至10mM Tris、50mM NaCl、25mM CaCl₂、0.1％ TritonX-100(pH8.0)的梯度来完成。将含有L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII的部分汇合在一起，并将其施加到含有单克隆抗体F1A2(Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)偶联到经CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia Biotech)的25ml柱中。

该柱用含有10mM CaCl₂、100mM NaCl和0.02％TritonX-100的50mM Hepes，pH7.5溶液平衡。用平衡缓冲液和含有2M NaCl的平衡缓冲液冲洗后，结合物质用含有10mM EDTA代替CaCl₂的平衡缓冲液洗脱。在使用或贮存之前，加入与EDTA相比属过量的CaCl₂，或将L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII转移到含有Ca²⁺的缓冲液中。每一步的产率通过凝血因子VII ELISA检测法测定，并且通过SDS-PAGE分析测定纯化蛋白质。

实施例5

体外水解分析测定

平行测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VIIa变体(二者此后都称为“凝血因子VIIa”)，以直接比较它们的比活性。该分析测定在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将终浓度为1mM的产色底物D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入到处于含有0.1M NaCl、5mMCaCl₂和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes(pH7.4)内的凝血因子VIIa(终浓度为100nM)中。在SpectraMax^TM 340的平板计数器(Molecular Devices，USA)上连续测量405nm处的吸光度。利用20分钟温育期间的吸光度减去无酶空白孔中的吸光度后的值来计算变体和野生型凝血因子的活性之间的比值：

比值＝(A_405nm凝血因子VIIa变体)/(A_405nm凝血因子VIIa野生型)

实施例6

体外蛋白水解分析测定

平行测定天然(野生型)凝血因子VIIa和凝血因子VIIa变体(二者此后都称为“凝血因子VIIa”)，以直接比较它们的比活性。该分析测定在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)上进行。将处于含有0.1M NaCl、5Mm CaCl₂和1mg/ml牛血清白蛋白的100μL 50mMHepes(pH7.4)中的凝血因子VIIa(10nM)和凝血因子X(0.8μM)孵育15分钟。通过添加含有0.1M NaCl，20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50μL 50mM Hepes(pH7.4)来终止凝血因子X的裂解。凝血因子Xa的产生量通过加入产色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide(S-2765，Chromogenix，Sweden)至终浓度为0.5mM来检测。在SpectraMax^TM 340平板计数器(MolecularDevices，USA)中测量405nm下的吸光度。利用孵育10分钟期间的吸光度减去无FVIIa空白孔中的吸光度后的值来计算变体和野生型凝血因子VIIa的蛋白水解活性之间的比值：

比值＝(A_405nm凝血因子VIIa变体)/(A_405nm凝血因子VIIa野生型)

实施例7

在实施例5和6描述的分析测定中测定的FVIIa变体的相对活性。

变体实施例5的比值实施例6的比值

L305V/K337A-FVII 7.2 6.2

L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII 6.7 45

L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII 11.5 72

wt-FVIIa 1.0 1.0

序列表

SEQ ID NO.1(天然人凝血因子VII的氨基酸序列)：

Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-

5 10 15

GLA-GLA-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-

20 25 30 35

Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro-

40 45 50

Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys-

55 60 65 70

Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile-

75 80 85 90

Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-

95 100 105

Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-

110 115 120 125

Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile-Leu-Glu-Lys-Arg-

130 135 140

Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly-

145 150 155 160

Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly-

165 170 175 180

Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-

185 190 195

Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-

200 205 210 215

Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr-

220 225 230

Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln-Pro-Val-

235 240 245 250

Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu-

255 260 265 270

Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-Leu-Leu-

275 280 285

Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-

290 295 300 305 306

Thr-Gln-Asp-Cys-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr-

310 315 320

Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys-Lys-Gly-

325 330 335 340

Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly-

345 350 355 360

Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-

365 370 375

Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-

380 385 390 395

Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro

400 405 406

SEQ ID NO：2(用于制备L305V-FVII的DNA引物)：

5’-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3’

SEQ ID NO：3(用于制备L305V-FVII的DNA引物)：

5’-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3’

SEQ ID NO：4(用于制备K337A-FVII的DNA引物)：

5’-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3’

SEQ ID NO：5(用于制备K337A-FVII的DNA引物)：

5’-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3’

SEQ ID NO：6(用于制备V158D-FVII的DNA引物)：

5’-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3’

SEQ ID NO：7(用于制备V158D-FVII的DNA引物)：

5’-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3’

SEQ ID NO：8(用于制备E296V/M298Q的DNA引物)：

5’-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3’

SEQ ID NO：9(用于制备E296V/M298Q的DNA引物)：

5’-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3’

序列表

<110>Novo Nordisk A/S

<120>人凝血因子VII多肽

<130>6357-WO

<150>DK PA 2001 01413

<151>2001-09-27

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>406

<212>PRT

<213>人凝血因子VII

<220>

<221>MISC FEATURE

<222>(1)..(406)

<223>Xaa指4-羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)

<400>1

Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa

1 5 10 15

Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys

20 25 30

Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp

35 40 45

Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln

50 55 60

Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly

85 90 95

Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

100 105 110

Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg

130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

145 150 155 160

Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln

165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala

180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu

195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg

210 215 220

Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn

225 230 235 240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu

275 280 285

Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg

290 295 300

Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser

305 310 315 320

Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

340 345 350

Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys

355 360 365

Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile

370 375 380

Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu

385 390 395 400

Leu Arg Ala Pro Phe Pro

405

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备L305V-FVII的DNA引物

<400>2

cgtgccccgg gtgatgaccc aggac 25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备L305V-FVII的DNA引物

<400>3

gtcctgggtc atcacccggg gcacg 25

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备K337A-FVII的DNA引物

<400>4

cggatggcag cgcggactcc tgcaaggg 28

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备K337A-FVII的DNA引物

<400>5

cccttgcagg agtccgcgct gccatccg 28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备V158D-FVII的DNA引物

<400>6

gtggggggca aggactgccc caaagggg 28

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备V158D-FVII的DNA引物

<400>7

cccctttggg gcagtccttg ccccccac 28

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备E296V/M298Q-FVII的DNA引物

<400>8

gccacggccc tggtgctcca ggtcctcaac gtgccc 36

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于制备E296V/M298Q-FVII的DNA引物

<400>9

gggcacgttg aggacctgga gcaccagggc cgtggc 36

Claims

1、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含至少两处取代的凝血因子VII多肽，其中所述的取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

2、根据权利要求1所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且K157被任何其它氨基酸取代。

3、根据权利要求1或2所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且K337被任何其它氨基酸取代。

4、根据权利要求1-3中任一所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且D334被任何其它氨基酸取代。

5、根据权利要求1-4中任一所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且S336被任何其它氨基酸取代。

6、根据权利要求1-5中任一所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且V158被任何其它氨基酸取代。

7、根据权利要求1-6中任一所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且E296被任何其它氨基酸取代。

8、根据权利要求1-7中任一所述的凝血因子VII多肽，其中L305被任何其它氨基酸取代，且M298被任何其它氨基酸取代。

9、根据权利要求1-8中任一所述的凝血因子VII多肽，其中在蛋白酶结构域的剩余位置中有至少一个氨基酸已被任何其它氨基酸所取代。

10、根据权利要求9所述的凝血因子VII多肽，其中在蛋白酶结构域的剩余位置中有至多20个额外氨基酸已被任何其它氨基酸所取代。

11、根据权利要求9-10中任一所述的凝血因子VII多肽，其中与选自SEQ ID NO：1的159-170中的位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已被任何其它氨基酸取代。

12、根据权利要求9-11中任一所述的凝血因子VII多肽，其中与选自SEQ ID NO：1的290-304中的位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已被任何其它氨基酸取代。

13、根据权利要求12所述的凝血因子VII多肽，其中R304已被选自由Tyr，Phe，Leu和Met构成的组中的氨基酸取代。

14、根据权利要求9-13中任一所述的凝血因子VII多肽，其中与选自SEQ ID NO：1的306-312中的位置处的氨基酸相应的至少一个氨基酸已被任何其它氨基酸取代。

15、根据权利要求14所述的凝血因子VII多肽，其中M306已被选自由Asp和Asn构成的组中的氨基酸取代。

16、根据权利要求14所述的凝血因子VII多肽，其中D309已被选自由Ser和Thr构成的组中的氨基酸取代。

17、根据权利要求9-16中任一所述的凝血因子VII多肽，其中与选自SEQ ID NO：1的330-339中的位置的氨基酸相应的至少一个氨基酸已被任何其它氨基酸取代。

18、根据权利要求9-17任一所述的凝血因子VII多肽，其中A274已被任何其它氨基酸取代。

19、根据权利要求18所述的凝血因子VII多肽，其中所述A274已被选自由Met，Leu，Lys和Arg构成的组中的氨基酸取代。

20、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含两处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个氨基酸。

21、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含三处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的两个氨基酸。

22、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含四处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的三个氨基酸。

23、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含五处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的四个氨基酸。

24、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含六处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的五个氨基酸。

25、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含七处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的六个氨基酸。

26、一种相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含八处取代的凝血因子VII多肽，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298氨基酸。

27、根据权利要求1，2，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述K157已被选自由Gly，Val，Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸所取代。

28、根据权利要求1，3，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述K337已被选自由Ala，Gly，Val，Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸所取代。

29、根据权利要求1，4，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述D334已被选自由Gly和Glu构成的组中的氨基酸所取代。

30、根据权利要求1，5，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述S336已被任何选自由Gly和Glu构成的组中的氨基酸所取代。

31、根据权利要求1，6，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述V158已被选自由Ser，Thr，Asn，Gln，Asp和Glu构成的组中的氨基酸所取代。

32、根据权利要求1，7，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述E296已被选自由Arg，Lys和Val构成的组中的氨基酸所取代。

33、根据权利要求1，8，20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述M298已被选自由Lys，Arg，Gln和Asn构成的组中的氨基酸所取代。

34、根据权利要求1-8和20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述L305已被选自由Val，Tyr和Ile构成的组中的氨基酸所取代。

35、根据权利要求34所述的凝血因子VII多肽，其中所述L305已被Val取代。

36、根据权利要求1-12，14，17-18和20-26中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述氨基酸已被能由多核苷酸构建物编码的任何其它氨基酸所取代。

37、根据权利要求1-36中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VII。

38、根据权利要求1-36中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述凝血因子VII多肽是人凝血因子VIIa。

39、根据权利要求1-38中任一所述的凝血因子VII多肽，其中所述凝血因子VII多肽的活性和SEQ ID NO：1所示天然凝血因子VIIa多肽的活性之间的比值至少为约1.25。

40、根据权利要求39所述的凝血因子VII多肽，其中所述比值至少为约2.0，优选至少约4.0。

41、根据权利要求20所述的凝血因子VII多肽，它是L305V/K337A-FVII。

42、根据权利要求22所述的凝血因子VII多肽，它是L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII。

43、根据权利要求23所述的凝血因子VII多肽，它是L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII。

44、一种编码权利要求1-43中任一所述的凝血因子VII多肽的多核苷酸构建物。

45、根据权利要求44所述的多核苷酸构建物，其中该多核苷酸构建物是载体。

46、一种包括权利要求44-45中任一所述多核苷酸构建物的宿主细胞。

47、根据权利要求46所述的宿主细胞，该细胞是真核细胞。

48、根据权利要求47所述的宿主细胞，该细胞是哺乳动物来源的。

49、根据权利要求48所述的宿主细胞，其中该细胞选自由CHO细胞、HEK细胞和BHK细胞构成的组。

50、一种含有并表达权利要求44所限定的多核苷酸构建物的转基因动物。

51、一种含有并表达权利要求44所限定的多核苷酸构建物的转基因植物。

52、一种生产权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括在允许表达多核苷酸构建物的条件下，在合适的生长培养基中培养权利要求46-49中任一所限定的细胞，以及从培养基中回收所得多肽。

53、一种生产权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括从权利要求50所限定的转基因动物的乳汁中回收凝血因子VII多肽。

54、一种生产权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽的方法，该方法包括培养权利要求51所限定的转基因植物的细胞，并从该植物中回收凝血因子VII多肽。

55、一种含有凝血因子VII多肽和非必要的药学可接受载体的药物组合物，该凝血因子VII多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言包含至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

56、一种含有权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽、并非必要地含有药学可接受载体的药物组合物。

57、凝血因子VII多肽用于制备药物的用途，该凝血因子多肽相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列而言含有至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

58、根据权利要求57所述的凝血因子VII多肽的用途，其中所述药物是用于治疗出血紊乱或出血发作，或者用于增强正常的止血体系。

59、权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽在制备可用于治疗出血紊乱或出血发作或者可用于增强正常止血体系的药物中的用途。

60、根据权利要求57-59中任一所述的用途，其中所述药物用于治疗血友病A或B。

61、一种用于治疗个体中出血紊乱或出血发作或者增强正常止血体系的方法，该方法包括对有此需要的个体施用治疗或预防有效量的凝血因子VII多肽，该多肽相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列而言包含至少两处取代，其中所述取代为(i)用任何其它氨基酸取代L305，和(ii)用任何其它氨基酸取代选自由K157，K337，D334，S336，V158，E296和M298构成的组中的一个或多个氨基酸。

62、一种治疗个体的出血紊乱或出血发作或者增强正常止血体系的方法，该方法包括对有此需要的个体施用治疗或预防有效量的权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽。

63、权利要求1-43中任一所限定的凝血因子VII多肽用作药物。