CN1400910A - 凝血因子VⅡ或VⅡa样分子 - Google Patents

凝血因子VⅡ或VⅡa样分子 Download PDF

Info

Publication number
CN1400910A
CN1400910A CN01804864A CN01804864A CN1400910A CN 1400910 A CN1400910 A CN 1400910A CN 01804864 A CN01804864 A CN 01804864A CN 01804864 A CN01804864 A CN 01804864A CN 1400910 A CN1400910 A CN 1400910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conjugate
polypeptide
amino acid
residue
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN01804864A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100488562C (zh
Inventor
金·V·安德森
安德斯·H·佩德森
克劳斯·博尼斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maxygen Holdings Ltd
Original Assignee
Maxygen Holdings Ltd
Maxygen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maxygen Holdings Ltd, Maxygen Inc filed Critical Maxygen Holdings Ltd
Publication of CN1400910A publication Critical patent/CN1400910A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100488562C publication Critical patent/CN100488562C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)的多肽偶联物，其制备及在其治疗方面的用途，特别是对多种凝血相关疾病治疗的用途。这些新的多肽偶联物包含至少一个共价偶联于多肽上的非多肽组分，其中该多肽的氨基酸序列与野生型FVII或FVIIa不同在于其引入或去除了至少一个包含所述非多肽组分连接基团的氨基酸残基。本发明的偶联物与商品化的rFVIIa相比有一种或多种改进的特性，包括功能性体内半寿期延长和/或血浆半寿期延长，和/或生物利用率增加和/或对蛋白酶解的敏感性降低。

Description

凝血因子VII或VIIa样分子
                       发明领域
本发明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽偶联物，其制备及在治疗中的用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
                       发明背景
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程。通常参与被称为凝血“级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，激活剂的作用可使其转变为活性形式。FVII就是这些凝血因子中的一种。
FVII是一种维生素K依赖性血浆蛋白，在肝中合成，并以分子量为53kDa的单链糖蛋白形式分泌到血液中(Broze & Majerus，J.Biol.Chem 1980；255：1242-1247)。FVII酶原在单一位点R152-I153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为活性形式(FVIIa)。FVIIa与组织因子的复合体(FVIIa复合体)可将凝血因子IX和凝血因子X均转变为其活性形式，接下来的反应导致快速的凝血酶产生以及纤维蛋白形成(Osterud & Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；74：5260-5264)。
FVII经历翻译后修饰，包括依赖维生素K的羧基化，导致在该分子N末端区产生10个γ羧基谷氨酸残基。因此，SEQ ID NO：1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位残基是Gla结构域中对于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括在第145和322位的两个天然产生的N-糖基化位点，以及在第52和60位的两个天然产生的O-糖基化位点处分别连接糖组分。
编码人FVII(hFVII)的基因被定位于13号染色体的q34-qter9(de Grouchy等，Hum Genet 1984；66：230-233)。其包含9个外显子，长度为12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；84：5158-5162)。FVII的基因组构和蛋白结构与其它维生素K依赖性原凝血蛋白的结构相似，外显子1a和1b编码信号序列；外显子2编码多肽和Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码表皮生长因子样结构域；以及外显子6到8编码丝氨酸蛋白酶的催化结构域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；24：3736-3750)。
利用X射线晶体成像的方法(Banner等，Nature，1996；380：41和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；285：2089)，已报道了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；96：8925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa与可溶性组织因子的复合体，以及hFVII的小片段的实验三维结构(Muranyi等，Biochemistry，1998；37：10605和Kao等，Biochemistry，1999；38：7097)。
关于FVII蛋白工程化突变体的报道相对较少(Dickinson & Ruf，J BioChem，1997；272：19875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；273：8516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；271：30685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；38：1957-1966)。
已报道了FVII在BHK或其他哺乳动物细胞中的表达(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2内切蛋白酶在真核细胞中的共表达(WO00/28065)。
人重组FVIIa的商品化制剂以NovoSeven的名称出售。NovoSeven指明用于治疗血友病A或B患者的出血发作。NovoSeven是市售的可治疗出血发作的唯一有效并且可靠的rFVIIa。
WO91/1154中报道了FVII的一种无活性形式，其中152的精氨酸和/或153的异亮氨酸被修饰。这些氨基酸位于活化位点。WO96/12800描述了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂导致的FVIIa的失活；Petersen等说明了FVIIa在I153的α氨基酸基团氨甲酰化导致的失活(Eur J Biochem，1999；261：124-129)。这种失活形式可以与野生型FVII或FVIIa竞争对组织因子的结合以及抑制凝血活性。这提示这种FVIIa的失活形式可用于治疗极易产生凝血的患者，如患脓毒病的患者，其易于发作心肌梗塞或血栓性中风。
在“Summary Basis for Approval for NovoSeven”(FDA参考号96-0597)中报道了rFVIIa的循环半寿期为2.3小时。相对高的剂量和频繁地给药对于达到并维持期望的疗效和预防效果是必需的。因此，难以获得足够的剂量调控，而频繁地静脉给药对于患者的生活方式造成了限制。
目前rFVIIa治疗的另一个问题是该分子对于蛋白酶解的相对不稳定。与冻干粉产品相反，蛋白酶解是获得溶液型制剂的一个主要障碍。获得稳定的溶液型制剂的好处在于方便患者操作，并且，在紧急情况下，便于更快地起作用，而这有可能是一种救生。在WO88/10295中公布了试图通过对主要蛋白酶解位点进行定点诱变预防蛋白酶的水解。
具有更长循环半寿期的分子将降低必需的给药次数。鉴于现有FVIIa需要经常注射，而且很有可能在获得更好的治疗性FVIIa水平的同时增强疗效，很明显需要改进FVIIa或FVIIa样分子。
延长蛋白的循环半寿期的一种方法是确保该蛋白的肾清除率降低。这可以通过将该蛋白与一种化学组分偶联来实现，该化学组分可赋予该蛋白降低的肾清除率。
此外，化学组分与该蛋白的连接，或对暴露于蛋白酶解作用的氨基酸的取代，可有效阻止蛋白酶接触从而避免对该蛋白的降解。聚乙二醇(PEG)就是一种这样的化学组分，可用于制备治疗性蛋白产品。
WO98/32466提示，FVII和其他许多蛋白一样，可以被PEG化，但对此该文献没有提供更进一步的信息。
                       发明简述
本申请公开了改进的FVII和FVIIa分子，特别是重组的hFVII和hFVIIa分子，其提供一个或多个上述所期望的益处。所以，本发明偶联物与现有商品化rFVIIa比较提供了一种或多种改进的特性，包括延长了功能性体内半寿期和/或延长了血浆半寿期，和/或增加了生物利用率和/或降低了对蛋白酶解的敏感性。因此，使用本发明偶联物进行治疗可以获得优于现有rFVIIa复合物的多种优点，如注射间隔更长。
相应的，一方面本发明涉及包含至少一个共价连接到多肽上的非多肽组分的偶联物，其中该多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa的序列在于，其至少引入或去除一个包含所述多肽连接基团的氨基酸残基。
本发明的另一方面涉及一种多肽，其中该多肽的氨基酸序列不同于SEQID NO：1中野生型FVII或hFVIIa的氨基酸序列在于，其至少引入或去除一个包含所述多肽连接基团的氨基酸残基。这种新的FVII多肽被认为可用于治疗、诊断以及其他目的，但特别感兴趣的是作为制备本发明偶联物的中间产物。
另一方面，本发明涉及：编码本发明多肽或本发明偶联物多肽部分的核苷酸序列；包含本发明核苷酸序列的表达载体；包含本发明核苷酸序列或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明进一步涉及包含本发明偶联物的药物组合物以及制备和使用这种偶联物的方法。
                       发明详述定义
在本申请和本发明的全文中，使用下列定义：
术语“偶联物”(或可互换为“偶联的多肽”)表示由一个或多个多肽与一个或多个非多肽组分(如聚合物分子、亲脂化合物、糖组分及有机衍生剂)共价连接而形成的杂合(复合或嵌合的意思)分子。优选地，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，即在生理液体如血液中可溶。本发明偶联多肽的实施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
术语“共价连接”表示该多肽和非多肽组分或者彼此直接共价连接，或者通过一个或多个间插组分，如桥、间隔子或连接部分，间接地共价连接。
术语“非偶联多肽”是偶联物的多肽部分。
本文所用术语“非多肽组分”表示能够与本发明多肽的连接基团偶联的分子。此类分子的优选实例包括聚合物分子、糖组分、亲脂性化合物或有机衍生剂。在本文中用于本发明的偶联物时，应理解为非多肽组分通过多肽连接基团连接到偶联物的多肽部分。如上说明，非多肽组分可能直接共价地连接到连接基团，或通过一个或多个间插组分，如桥、间隔子或连接部分，间接地共价连接到连接基团。
术语“聚合物分子”被定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中所述单体无一是氨基酸残基，除非聚合物是人白蛋白或另一种丰富血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换。该术语涵盖经体外糖基化连接的碳水化合物分子，所述体外糖基化即体外进行的合成性糖基化，其通常涉及碳水化合物分子与多肽连接基团共价连接，任选使用交联剂。
体内糖基化如N-或O-糖基化(下文作进一步描述)连接的碳水化合物分子在本文中称作“糖组分”。除指明偶联物中非多肽组分如聚合物分子或糖组分的数目外，偶联物中所含或本发明其它部分所指的“非多肽组分”表示偶联物中的一个或多个非肽部分，如聚合物分子或糖组分。
术语“连接基团”表示多肽的能够与非多肽组分如聚合物分子、糖组分、亲脂性化合物或有机衍生剂偶联的功能基团，特别是其氨基酸残基或碳水化合物组分。有用的连接基团及其相配的非多肽组分表示在下图中。
连接基团     氨基酸 非多肽组分实例  偶联方法/活化的PEG         参考
-NH2 N-末端，赖氨酸 聚合物，如PEG，具有酰胺或亚胺基团 mPEG-SPATresylatedmPEG Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews inTherapeutic Drug CarrierSystems9(3，4)：249-304(1992)
-COOH C-末端，天冬氨酸，谷氨酸 聚合物，如PEG，具有酯或酰胺基团碳水化合物组分 mPEG-Hz体外偶联 Shearwater Inc.
-SH 半胱氨酸 聚合物，如PEG，具有二硫键，马来酰亚胺或乙烯砜基团碳水化合物组分 PEG-乙烯砜PEG-马来酰亚胺体外偶联 Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews inTherapeutic Drug CarrierSystems9(3，4)：249-304(1992)
-OH 丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、OH- 糖组分具有酯、醚、氨基甲酸酯、碳酸酯基团的PEG 体内O-连接的糖基化
-CONH2 天冬酰胺作为部分N-糖基化位点 糖组分聚合物，如PEG 体内N-糖基化
芳香族残基 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 碳水化合物组分 体外偶联
-CONH2 谷氨酰胺 碳水化合物组分 体外偶联 Yan & Wold，Biochemistry，1984，Jul 31：23(16)：3759-65
醛酮 氧化的寡糖 聚合物，如PEG，PEG-酰肼 PEG化 Andresz等，1978，Makromol.Chem.179：301，WO92/16555，WO00/23114
胍 精氨酸 碳水化合物组分 体外偶联 Lundblad & Noyes，Chemical Reagents forProtein Modification，CRCPress Inc.，Florida USA
咪唑环 组氨酸 碳水化合物组分 体外偶联 同胍
对于体内N-糖基化来说，术语“连接基团”以非常规方式用于表示构成N-糖基化位点的氨基酸残基(序列为N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺并且S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝氨酸或苏氨酸并且最优选苏氨酸)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是在糖基化期间与糖组分连接的残基，但这种连接不能完成，除非该N-糖基化位点存在其它氨基酸残基。
因此，当非多肽组分是糖组分，并且偶联是通过N-糖基化实现时，与目的多肽氨基酸序列改变联用的术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”应理解为构成N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基被改变，改变方式是功能性的N-糖基化位点被引入氨基酸序列或从所述序列除去。
在本申请中，氨基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定义的来使用，此定义基于IUPAC命名法(IUPAC命名法以及氨基酸和肽的符号(残基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘误Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
术语“氨基酸残基”表示包含在下组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
用于鉴定氨基酸位置的术语举例说明如下：G124表示SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第124位被甘氨酸残基占据，G124R表示第124位甘氨酸残基被精氨酸残基取代。备选取代可以“/”表示，如K32D/E表示第32位的赖氨酸被天冬氨酸或谷氨酸所取代。多取代以“+”表示，如K143N+X145S/T表示第143位赖氨酸残基被天冬酰胺残基所取代，并且第145位的天冬酰胺残基被丝氨酸残基或苏氨酸残基所取代。额外氨基酸的插入，如在G124之后插入一个丙氨酸残基，表示为G124GA。氨基酸残基的缺失以星号表示。例如，第124位甘氨酸的缺失表示为G124*。除非另有说明，此处氨基酸残基的序号对应于SEQ ID NO：1所示野生型FVII/FVIIa的氨基酸序列。
此处所用与特定突变相关的术语“不同于”是指除特定的氨基酸差异外许可存在另外的差异。例如，除了去除和/或引入包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基外，FVII或FVIIa多肽可能还包含与这些氨基酸残基的引入和/或去除无关的其他取代。因此，除了此处公布的氨基酸改变(这些氨基酸改变目的在于，去除和/或引入非多肽组分的连接基团)外，可理解本发明多肽的氨基酸序列，如果需要可包含其他改变，这些改变不一定必须与连接位点的引入或去除有关，即其他的取代、插入或缺失。例如，这些改变可能包括去除N-和/或C末端的一个或多个氨基酸残基，或在N-和/或C末端引入一个或多个额外的氨基酸残基，如在N末端加入一个甲硫氨酸残基，以及“保守性氨基酸取代”，即，取代是在具有相同特性的氨基酸，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，碱性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸之间进行取代。
本发明中优选的取代特别选自下表所列出的保守取代组。
    1 丙氨酸(A)    甘氨酸(G)  丝氨酸(S)    苏氨酸(T)
    2 天冬氨酸(D)  谷氨酸(E)
    3 天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)
    4 精氨酸(R)    组氨酸(H)  赖氨酸(K)
    5 异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)  甲硫氨酸(M)  颉氨酸(V)
    6 苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)  色氨酸(W)
术语“突变”和“取代”在此可互换使用。
术语“核苷酸序列”表示两个或多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任意组合。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常指一种用于体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，按美国专利4683195描述的方法。一般来说，PCR方法涉及使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物来使引物延伸合成反应反复循环
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“培养细胞”在本文中可互换使用并且这些术语都应当理解为包括细胞生长或培养所产生的后代。“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA引入细胞的过程。
“可操作连接的”指两个或多个核苷酸序列通过酶促连接等方式共价连接在彼此相关的构象中，使序列行使正常功能。例如，编码前序列或分泌前导序列的核苷酸序列如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则被可操作性连接到该多肽的核苷酸序列上；启动子或增强子如果能影响该序列的转录，则与编码序列可操作性连接；核糖体的结合位点如果处在促进翻译的位置则与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接的”意指被连接的核苷酸序列是邻接的，并且在分泌引导区的情况下，是邻接的而且在阅读状态下。连接在方便的限制性位点来完成。如果不存在此类位点，那么使用合成的寡核苷酸衔接子或接头和标准的重组DNA方法。
术语“引入”主要指包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基的引入，特别是通过取代现存氨基酸残基，或者通过插入另外的氨基酸残基。
术语“去除”主要指包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基的去除，特别是通过将该氨基酸残基用另外的氨基酸残基取代的方式去除，或者使预去除的氨基酸残基缺失(没有取代)。
术语“FVIIa”或“FVII”多肽指单链形式的FVII分子。
术语“FVIIa”或“FVIIa多肽”指活化的双链形式的FVIIa分子，其中所述单链形式R152和I153之间的肽键被剪切。当本文中SEQ ID NO：1的氨基酸序列用于说明FVIIa的氨基酸序列时，应理解其中一条链包含1-152位的氨基酸残基，另一条链包含153-406位的氨基酸残基。
术语“rFVII”和“rFVIIa”分别指重组技术产生的FVII和FVIIa分子。
术语“hFVII”和“hFVIIa”分别指野生型人FVII和FVIIa。
术语“催化位点”用于指由FVII多肽的S344，D242和H193组成的催化三联体。
术语“活性FVIIa”，“活性FVIIa多肽”，“活性FVIIa偶联物”或“活性偶联物”用于指具有至少10％的野生型hFVIIa催化活性的FVIIa多肽或偶联物。文中所用催化活性可适当地通过在检测催化活性的方法章节或检测低水平催化活性的方法章节中所说明的方法来确定(参见文中材料和方法一节)。用以上所述分析时，所述活性偶联物优选具有野生型hFVIIa催化活性的至少15％，例如至少20％，如至少25％，更优选至少30％，如至少40％，最优选至少50％，如至少60％。
优选，活性偶联物可以结合组织因子，并进一步活化血浆凝血因子X和/或IX。因此，在一个优选的实施方案中，活性FVIIa多肽或其偶联物与野生型FVIIa相比，具有至少25％的凝血活性，如与野生型FVIIa相比具有至少50％的凝血活性，如与野生型FVII相比具有至少75％的凝血活性。因此，活性FVIIa多肽或其偶联物的凝血活性与野生型FVIIa相比，优选在25-200％的范围内。具体地，优选FVIIa多肽或其偶联物的凝血活性与野生型FVIIa相比在30-150％的范围内，如凝血活性与野生型FVIIa相比在30-100％的范围内。凝血活性可通过本领域已知的任何方法检测，如在材料和方法一节中进一步讨论的。然而，特别优选根据“检测凝血活性的方法”章节(参见材料和方法部分)中说明的方法确定凝血活性。
与给定的物质联用的术语“免疫原性”旨在表示该物质可诱导免疫系统反应的能力。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(对免疫原性更进一步的定义参见，如，Roitt：Essential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般来说，抗体反应性下降提示免疫原性下降。免疫原性可通过本领域任何已知的方法来测定，如体内方法或体外方法。
术语“无活性FVIIa”，“无活性FVIIa多肽”，“无活性的FVIIa偶联物”或“无活性偶联物”用于指活性低于野生型hFVIIa催化活性的10％的FVIIa多肽或偶联物。文中所用催化活性可适当地通过检测催化活性的方法章节或检测低水平催化活性的方法章节中所说明的方法来确定(参见文中材料和方法章节)。采用以上所述分析时，无活性偶联物的催化活性优选低于野生型hFVIIa催化活性的8％，如6％，例如低于5％，更优选低于4％，如低于3％，最优选低于2％，例如低于1％。
通常，无活性偶联物与野生型hFVIIa相比，体外或体内凝血活性显著降低。这种无活性的FVII或FVIIa多肽或偶联物可能与野生型FVII或FVIIa竞争结合组织因子，从而抑制凝血活性。优选这种无活性FVII或FVIIa多肽或偶联物与野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的1％。更优选这种无活性FVII或FVIIa多肽或偶联物与野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的0.05％。最优选这种无活性FVII或FVIIa多肽或偶联物与野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的0.01％。凝血活性可以与上述相同的方式，通过本领域已知的任何方法来检测，如在材料和方法中进一步讨论的。然而，特别优选根据“检测凝血活性的方法”章节(参见材料和方法部分)中说明的方法确定凝血活性。
术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽或偶联物在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽或偶联物的活性为最初活性的50％的时间。作为测定功能性体内半寿期的另一种方法，可测定“血清半寿期”，即，50％多肽或偶联物分子在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的测定常常比测定功能性体内半寿期简单并且血清半寿期的大小通常可以很好地说明功能性体内半寿期大小。血清半寿期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除率”、“血浆清除率”和“清除半寿期”。该多肽或偶联物通过网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝中一个或多个的作用，通过组织因子、SEC受体或其他受体介导的清除作用，或通过特异或非特异的蛋白水解作用而清除。通常清除依赖于大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)、电荷、连接的碳水化合物链，以及是否存在该蛋白的细胞受体。保留的功能通常选自前凝血剂、蛋白酶解或受体结合活性。功能性体内半寿期和血清半寿期可通过本领域中已知的任何合适的方法来测定，测定方法在下文材料和方法节作进一步讨论。
涉及功能性体内半寿期或血浆半寿期的术语“增加”用于表示偶联物或多肽的相应半寿期经可比条件下的测定，相对于参照分子如未偶联的rFVIIa(如NovoSeven)的半寿期在统计学上是显著增加的。例如，相应的半寿期可能增加至少约25％，如至少约50％，例如增加至少约100％，150％，200％，250％，300％，500％或100％。
术语“肾清除”使用其通常的含义，即发生在肾的清除，例如，通过肾小球过滤、肾小管排泄或在肾小管细胞中的降解来完成。肾清除取决于偶联物的物理特性，包括大小(直径)流体体积、对称性、形状/刚性和电荷。通常来说，大约为67kDa的分子量被认为是肾清除的截留值。肾清除可通过任何合适的测定方法来建立，如已建立的体内测定方法。通常，肾清除通过将标记的(如，放射标记的或荧光标记的)多肽偶联物给予患者并测定收集的患者尿液中的标记物活性来测定。肾清除的下降经过可比条件下与相应参照多肽，如相应的非偶联多肽，非偶联的相应野生型多肽，或其他偶联多肽(如与本发明无关的偶联多肽)进行比较而确定。优选，偶联物的肾清除率比相应的参照多肽降低至少50％，优选降低至少75％，最优选降低至少90％。
本发明偶联物表现对蛋白酶解敏感性降低的性质是非常重要的；包含水解产物的组合物与那些偶联物没有被水解或仅有小部分被水解的组合物相比，通常具有更小的特异性。此外，给药组合物中非生理降解产物可能会激发患者的免疫系统。
术语“对蛋白酶解降低的敏感性”主要指经可比条件下的检测，该偶联物与非偶联的野生型FVIIa相比，对蛋白酶解的敏感性降低。优选，蛋白酶解降低了至少10％，如至少25％(例如降低了10％-25％)，更优选降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了10％-50％，如25％-50％，更优选降低了60％，如至少降低了75％，或甚至降低了至少90％。更优选，蛋白酶解降低了100％。因此，优选本发明的偶联物与野生型FVIIa相比蛋白酶解程度小，即与非偶联的野生型FVIIa相比，本发明偶联物的蛋白酶解优选降低了10％-100％，如降低了25％-100％，更优选降低了50％-100％，最优选降低了75％-100％。
本发明人建立了一种合适的初步体外检测方法，其可用于评估这种偶联物对蛋白酶解的敏感性是否降低(自身蛋白酶解减少)。因此，在本发明优选的实施方案中，经“对蛋白酶解敏感性降低的检测”节中说明的方法、“检测催化活性”节中的方法或“检测低水平催化活性方法”节(参见本文材料和方法节)中说明的方法检测，本发明偶联物与野生型FVIIa相比对蛋白酶解的敏感性降低。
术语“亲代FVII”或“亲代多肽”是指本发明中将被修饰的分子。典型的亲代FVII是hFVII或hFVIIa(包括rFVIIa(NovoSeven))，其具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列。
“变体”是一种多肽，其与亲代多肽有一个或多个氨基酸残基的差异，通常有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基的差异。本发明的偶联物
本发明偶联物是开发FVII或FVIIa改进分子的总体新策略产生的。更具体的，通过去除和/或引入含有所述非多肽组分的连接基团的氨基酸残基，特异地改变多肽使该分子更易于与选定的非多肽组分偶联，使偶联模式最佳化(如，确保非多肽组分以最适量最佳分布在FVII或FVIIa分子表面并确保分子中只存在将偶联的连接基团)，从而获得新的偶联分子，其与现有的FVII和FVIIa分子相比，具有或不具有FVII的活性，此外具有一种或多种改进的特性。例如，当含有所选非多肽组分的连接基团的氨基酸残基总数增加到或降低到一个最佳水平时，该偶联物的肾清除率通常因偶联导致的分子形状、大小和/或电荷的改变而显著降低。
本发明优选的实施方案中，FVII或FVIIa多肽的一个以上的氨基酸残基被改变，例如所述改变包括去除和引入包含所选非多肽的连接基团的氨基酸残基。除了去除和/或引入氨基酸残基外，该多肽可能包含其他与非多肽组分连接基团的氨基酸残基的去除和引入无关的取代或糖基化。该多肽还可能与丝氨酸蛋白酶抑制剂连接，以抑制该多肽的催化位点。
包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，无论是被去除或引入，其选择基于所选非多肽组分的性质，并且，多数情况下，基于将多肽和非多肽组分之间偶联所用的方法。例如，当非多肽组分是聚合物分子，如聚乙二醇或聚环氧烷衍生的分子时，包含连接基团的氨基酸残基可选自：赖氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，或酪氨酸，优选半胱氨酸和赖氨酸，特别优选赖氨酸。
非多肽组分连接基团被引入本发明FVII或FVIIa多肽中或从所述多肽中被去除时，进行修饰的多肽部位优选位于该多肽的表面，更优选是由有25％以上侧链暴露于溶剂中的那些氨基酸残基占据的位置，优选所述氨基酸超过50％的侧链暴露于溶剂中。经过对人FVII或FVIIa分子三维结构的分析已鉴定出这些位置，所述方法见本文材料与方法一节。此外，该位置优选是FVII分子中位于组织因子结合位点区外和/或活性位点区外的部分。这些区域在下文材料和方法中得以识别。然而，值得强调的是，某些情况下(如期望获得无活性的偶联物)在这些区域内或其附近进行突变是有利的。例如，认为非多肽组分的一个或多个连接基团，如体内N-糖基化位点的连接基团，插入到FVII分子的活性位置区或活性位置结合槽的脊上是有利的。在下文材料与方法中定义了这种活性位点区及活性位点结合槽的脊，其由以下残基构成：
I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，(3346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405(活性位置区)；和N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370(活性位置结合槽的脊)
为了确定连接基团的最佳分布，基于FVII或FVIIa分子的三维结构计算该多肽表面的氨基酸残基间的距离。更具体的，对包含这种连接基团的氨基酸残基的CB间的距离，或一种氨基酸的功能基团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)与包含连接基团的另一种氨基酸残基的CB间的距离进行了确定。对于甘氨酸，使用CA而非CB。在本发明偶联物的FVII或FVIIa多肽部分中，任何所述距离优选大于8，特别优选大于10，以避免或降低异源偶联。
去除连接基团时，包含这种基团并占据以上所述位置的相应氨基酸残基优选用一种不同的氨基酸残基取代，该氨基酸残基不包含所述非多肽组分的连接基团。通常，将要去除的氨基酸残基是可产生不利偶联的氨基酸残基，如位于多肽功能位点或其附近的氨基酸残基(因为这些位点的偶联可能因破坏受体识别而导致所产生的偶联物失活或FVII或FVIIa的活性降低)。本文中术语“功能位点”是指对于FVII或FVIIa的功能或作用必不可少的或有关的氨基酸残基。这种氨基酸残基是所述功能位点的一部分。该功能位点可通过本领域已知方法确定，优选通过对FVIIa-组织因子复合物的结构分析进行识别(参见Banner等，Nature 1996；380：41-46)。
引入连接基团时，包含这种基团的氨基酸残基被引入该位置，优选通过取代占据该位置的氨基酸残基实现。
FVII或FVIIa多肽中存在并可用于偶联的连接基团的确切数量依赖于期望通过偶联达到的效果。获得的效果取决于，例如偶联的性质和程度(例如非多肽组分的确定，期望或可能与多肽偶联的非多肽的数目，偶联应该发生的部位或应该避免偶联发生的部位等)。
功能性体内半寿期取决于偶联物的分子量，而延长半寿期所需连接基团的数目因此依赖于所述非多肽组分的分子量。在一个实施方案中，当通过Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970).P680-85中的SDS-PAGE测定时，本发明偶联物具有至少67kDa，特别是至少70kDa的分子量。FVII具有大约53kDa的分子量，因此，为获得所期望的作用，需要另外添加大约10-20kDa。这可通过例如，偶联2到4个10kDa的PEG分子或本文描述的其它方法实现。
为了避免对亲代分子的结构和功能造成太多破坏，通常偶联物的多肽部分具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列90％以上的同一性，优选95％以上，如96％以上。具体的，偶联物多肽部分通常具有与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列97％以上的同一性，如98％以上，99％以上，99.25％以上，99.25％以上或99.5％以上。
氨基酸序列同源性/同一性可以便利地用如ClustalW程序(版本1.8，1999年6月)，使用缺省参数经序列比对确定(Thompson等，1994，ClustalW：Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Research，22：4673-4680)，或通过使用GENEDOC版本2.5(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，and Deerfield，D.W.II.1997 GeneDoc：Analysis and Visualization of Genetic Variation，EMBNEW.NEWS 4：14；Nicholas，K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997 GeneDoc：Analysis and Visualizationof Genetic Variation)从PEAM家族信息库版本4.0(http：//pfam.wustl.edu/)(NucleicAcids Res.1999 Jan 1；27(1)：260-2)中确定。
换一种说法，根据本发明将改变的氨基酸残基的总数(与SEQ ID NO：1氨基酸序列相比)通常不超过15个。优选，本发明偶联物的FVII或FVIIa多肽部分或本发明的多肽包含一个氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列有1-15个氨基酸残基，通常是1-10个或2-10个氨基酸残基的差异，例如1-8个或2-8个氨基酸残基，如3-7个或4-6个氨基酸残基的差异。因此，通常偶联物的多肽部分或本发明的多肽包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，其区别至多为15个氨基酸残基(如15个氨基酸残基)，至多14个氨基酸残基(如14个氨基酸残基)，至多13个氨基酸残基(如13个氨基酸残基)，至多12个氨基酸残基(如12个氨基酸残基)，至多11个氨基酸残基(如11个氨基酸残基)，至多10个氨基酸残基(如10个氨基酸残基)，至多9个氨基酸残基(如9个氨基酸残基)，至多8个氨基酸残基(如8个氨基酸残基)，至多7个氨基酸残基(如7个氨基酸残基)，至多6个氨基酸残基(如6个氨基酸残基)，至多5个氨基酸残基(如5个氨基酸残基)，至多4个氨基酸残基(如4个氨基酸残基)，至多3个氨基酸残基(如3个氨基酸残基)，至多2个氨基酸残基(如2个氨基酸残基)。
类似地，本发明的偶联物通常包含，如1-15个非多肽组分，通常1-10个非多肽组分或2-10个非多肽组分，如1-8或2-8个非多肽组分，如1-6，1-4，3-7或4-6个非多肽组分。
优选，本发明偶联物与rFVIIa(如NovoSeven)相比，具有一项或多项以下改进的特性：功能性体内半寿期延长；血浆半寿期延长，肾清除率降低以及对蛋白酶解的敏感性降低。
从WO88/10295中获知FVII/FVIIa的蛋白酶解发生在该分子中的多个蛋白酶解位点，即在K32，K38，I42，Y44，K143，R290，R315，K341，R392，R396以及R402(或位于K32-D33，K38-L39，I42-S43，Y44-S45，K143-R144，R290-G291，R315-K316，K341-G342，R392-S393，R396-P397以及R402-A403之间)。因此，增加例如功能性体内半寿期、增加血浆半寿期或降低对蛋白酶解敏感性的一个优选策略是在这些蛋白酶解位点的一个或多个位点和/或其附近改变亲代多肽，所用方法是在这些位点上或其附近引入非多肽组分。因此，本发明一个优选实施方案中，在上述鉴定出的一个或多个位置上，或相对于直接参与蛋白酶解的位置-4，-3，-2，-1，1，2，3，4，优选位置-2，-1，1，2，如位置-1，1上，引入了连接基团。
更具体的，优选将非天然产生的体内糖基化位点，特别是非天然产生的体内N-糖基化位点(参见以下)，引入选自以下的位置：28-48，139-147，286-294，311-319，338-345和388-406。具体的，优选将体内糖基化位点，如体内N-糖基化位点(参见以下)，引入选自以下的位置：30-34，36-46，141-144，288-292，313-317，341-343，390-398和400-404。更优选，将体内糖基化位点，如体内N-糖基化位点(参见以下)，引入选自以下的位置：31-33(如31，32或33位)，37-39(如37，38或39位)，41-46(如41，42，43，45或46位)，142-144(如142，143或144位)，289-291(如289，290或291位)，314-316(如314，315或316位)，341-342(如341，342或343位)，391-393(如391，392或393位)，395-397(如395，396或397位)和401-403(如401，402或403位)。本发明的偶联物，其中是非多肽组分是具有赖氨酸作为连接基团的分子
本发明一个实施方案中，非多肽组分包含赖氨酸作为连接基团，即，本发明偶联物包含至少一个与多肽共价偶联的非多肽组分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa的氨基酸序列在于，其引入或去除了至少一个氨基酸残基。
FVII/FVIIa包含17个赖氨酸残基。三个赖氨酸残基(K18，K62和K85)位于组织因子结合结构域，两个赖氨酸残基(K197和K341)位于活性位点区。
由于赖氨酸残基在亲代多肽中的相对高含量，认为至少一个赖氨酸残基应该优选被去除，特别是通过用非赖氨酸残基取代赖氨酸残基去除，以避免对非多肽组分的过度偶联。
因此，一个实施方案中，偶联物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示不同，差异在于，优选通过取代去除了至少一个赖氨酸残基，如1-15赖氨酸残基，特别是1-10，1-6或2-4赖氨酸残基。例如，优选通过取代去除的赖氨酸残基选自：K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其组合。具体的，优选去除赖氨酸残基，该残基是组织因子结合位点和/或活性位点区的组成部分，即，残基K18，K62，K85，K197，K341或其组合物。这种赖氨酸残基可以用任何其他氨基酸残基取代，但优选被R，Q，N或H，更优选被R取代。
另一实施方案中，偶联物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQID NO：1所示的序列不同，区别在于引入了至少一个赖氨酸残基，如1-15赖氨酸残基，特别是1-10，1-6或2-4赖氨酸残基，优选通过替代引入。可理解，在亲代分子预定位点引入至少一个赖氨酸残基，与上述至少一个赖氨酸残基的去除组合是优选的。因此，本发明一个优选的实施方案中，偶联物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列不同，区别在于去除了至少一个赖氨酸残基并且引入了至少一个赖氨酸残基。
赖氨酸残基可被引入的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位点或其附近。因此，一个优选实施方案中，用赖氨酸残基取代非赖氨酸残基可选自：I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F405K以或其组合，特别选自：R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其组合。
根据本发明这一方面，偶联物的非多肽组分可以是任何分子，当使用给定的偶联方法以赖氨酸为连接基团时，优选非多肽组分是聚合物分子。所述聚合物分子可以是“与聚合物分子偶联”一节中提及的任何分子，但优选选自线性或分支PEG或另一聚环氧烷。优选的聚合物分子的实例是来自Shearwater Polymers，Inc.的SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC；来自Enzon，Inc.的SC-PEG；US5880255所述的tresylated mPEG；或氧羰基-氧-N-二羧基酰亚胺-PEG(US5122614)。
一般来说，与赖氨酸残基偶联时，非多肽组分的分子量约为5到约20kDa，例如从大约5到大约10kDa，如约5kDa或约10kDa。
应该理解本部分所述的任何氨基酸改变，尤其是取代，可与任何氨基酸改变组合，优选与本文中其他部分所述的特定取代的特定氨基酸改变，包括糖基化位点的引入和/或去除组合。本发明的偶联物，其中非多肽组分是具有半胱氨酸作为连接基团的分子
本发明的另一个实施方案中，非多肽组分以半胱氨酸作为连接基团，即本发明偶联物包含至少一个与多肽共价偶联的非多肽组分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1中野生型人FVII或FVIIa之处在于，至少引入或去除了一个半胱氨酸残基。
FVII/FVIIa包含24个半胱氨酸残基，二硫键在以下半胱氨酸残基之间建立：C17和C22，C50和C61，C55和C70，C72和C81，C91和C102，C98和C112，C114和C127，C135和C262，C159和C164，C178和C194，C310和C329，以及C340和C368之间。
另一个实施方案中，FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ IDNO：1中的不同，差异在于引入至少一个赖氨酸残基，如1-15个赖氨酸残基，特别是1-10，1-6或2-4个赖氨酸残基，优选通过取代引入。
可引入赖氨酸残基的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位点或其附近。
因此本发明一个实施方案中，优选通过取代引入的赖氨酸残基选自：I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其组合，特别选自：K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其组合。
本发明进一步的实施方案中，半胱氨酸残基被引入野生型hFVII中由具有至少25％的侧链暴露于表面的那些苏氨酸或丝氨酸残基所占据的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一个位点上，优选通过取代引入半胱氨酸残基，所述位点选自：S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，T307，S320，T324，S333，S336，T370和S393。更优选hFVII中至少一个含S残基的位点上引入半胱氨酸残基，所述位点选自：S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S320，S333，S336和S393。
本发明进一步的实施方案中，半胱氨酸残基被引入野生型hFVII中由具有至少50％侧链暴露于表面的那些苏氨酸或丝氨酸残基所占据的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一个位置上优选通过取代引入一个半胱氨酸残基，所述位置选自：S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T293，更优选所述位置选自：S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214。
进一步的实施方案中，半胱氨酸残基被引入至少一个选自上述任一位置且并非活性位点区的位置。优选该位置由T或S残基占据。例如，FVII多肽包含引入到至少一个选自下组的位置上的半胱氨酸残基：S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，T307，S320，S333，S336，T370和S393(其超过25％的侧链暴露于表面)，所述位置特别选自：S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S残基占据)，更优选选自：S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超过50％的侧链暴露于表面)，特别选自：S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214(由S残基占据)。
另外的实施方案中，半胱氨酸残基被引入至少一个选自上述任一位置且并非组织因子结合位点区的位置。优选该位置由T或S残基占据。例如，FVII多肽包含引入至少一个位置上的半胱氨酸残基，所述的位置选自：S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，S320，T324，S333，S336，T370和S393(其超过25％的侧链暴露于表面)，特别选自：S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S233，S320，S333，S336和S393(由S残基占据)，更优选选自：S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T297(其超过50％的侧链暴露于表面)，特别选自：S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S残基占据)。
另外的实施方案中，半胱氨酸残基被引入至少一个选自上述任一位置且并非组织因子结合位点区或活性位点区的位置。优选该位置由T或S残基占据。例如，FVII多肽包含引入至少一个位置上的半胱氨酸残基，所述位置选自：S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，S320，S333，S336，T370和S393(其超过25％的侧链暴露于表面)，特别选自：S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S残基占据)，更优选选自：S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超过50％的侧链暴露于表面)，特别选自：S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S残基占据)。
尽管根据本发明这方面，偶联物的非多肽组分可以是任何分子，但当使用给定的偶联方法，以半胱氨酸作为连接基团时，优选非多肽组分是聚合物分子。聚合物分子可以是以“与聚合物分子的偶联”为标题的章节中描述的任何分子，但优选选自线性或分支的聚乙二醇或另一聚环氧烷。一个实施方案中聚合物分子是PEG，如VS-PEG。多肽和聚合物之间的偶联可以任何合适的方式来完成，如以“与聚合物分子的偶联”为标题的章节中描述的，例如使用一步法或在所述章节中所涉及的多步法。当FVII或FVIIa多肽仅包含一个可偶联的半胱氨酸残基时，优选与具有约5kDa到约20kDa分子量(如从约10kDa到约20kDa，如分子量约为5kDa，约为10kDa，约为12kDa，约为15kDa，或约为20kDa)的非多肽组分偶联，或者直接偶联或者通过低分子量聚合物间接偶联(按WO99/55377所公开的方法)。当偶联物包含两个或多个可偶联的半胱氨酸残基时，这些非多肽组分各自的分子量通常为约5到约10kDa，如约5kDa或约10kDa。
应该理解本部分所述的任何氨基酸的改变，尤其是取代，可与任何其他部分所述的氨基酸改变组合，优选本文中公开特定氨基酸改变的其他部分所述的特定取代，包括糖基化位点的引入和/或去除。
本发明的偶联物，其中非多肽组分是具有天冬氨酸或谷氨酸作为连接基团的分子
本发明的另一个实施方案中，非多肽组分以天冬氨酸或谷氨酸作为连接基团，即本发明偶联物包含至少一个与多肽共价偶联的非多肽，所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa序列之处在于，引入或去除至少一个天冬氨酸残基和/或至少一个谷氨酸残基。
另一个实施方案中，FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ IDNO：1所示不同，差异在于引入至少一个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基，如1-15个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基，特别是1-10，1-6或2-4个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基，优选通过取代引入。
可引入天冬氨酸残基或谷氨酸残基的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位点处，或其附近。
因此，本发明一个实施方案中，优选通过取代引入的天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基选自：I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其组合，特别选自以下组或其组合：K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E。
除了上述取代，根据以上实施方案偶联物的多肽可包含至少一个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基的去除，优选是通过取代。
由于赖氨酸残基在亲代多肽中的相对高含量，认为优选至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基应该被去除，特别是通过取代，以避免非多肽组分的过度偶联。
因此，一个实施方案中，偶联物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示不同，差异在于去除至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基，如1-15个天冬氨酸或谷氨酸残基，特别是1-10，1-6或2-4个天冬氨酸或谷氨酸残基，优选通过取代去除。例如，优选通过取代去除的天冬氨酸或谷氨酸残基选自：D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其组合。
应理解，向亲代分子预定位点引入的至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基，与至少一个上述天冬氨酸或谷氨酸残基的去除组合是尤其优选的。因此，本发明一个优选的实施方案中，偶联物FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示不同，区别在于至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基被去除(优选通过替代)并且至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基被引入(优选通过替代)。
根据本发明这一方面，具有天冬氨酸基团或谷氨酸基团作为其连接基团的偶联物非多肽组分，可以是具有这种特性的任何非多肽组分，优选非多肽组分是聚合物分子或有机衍生试剂，特别是聚合物分子，并且偶联物的制备如Sakane和Pardridge Pharmaceutical Research，Vol.14，No.8，1997，pp1085-1091。
应该理解所述本部分所述的任何氨基酸改变，尤其是取代，可与任何其他部分所述的氨基酸改变组合，尤其本文中公开氨基酸改变的其他部分的特定取代，包括糖基化位点的引入和/或去除。
本发明的偶联物，其中非多肽组分是糖组分
本发明又一个实施方案中，插入和/或去除了糖组分的连接基团，如糖基化位点，特别是体内的糖基化位点。
优选，本发明的偶联物包含至少一个与多肽共价连接的糖组分，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa序列区别在于，其中至少一个非天然产生的糖基化位点被引入和/或至少一个天然产生的糖基化位点被去除。尤其，天然产生的糖基化位点的去除与非天然糖基化位点的引入，或非天然糖基化位点的去除组合。引入的糖基化位点可以是O-糖基化位点或N-糖基化位点。优选糖基化位点是体内O-糖基化位点或体内N-糖基化位点，特别优选体内N-糖基化位点。
用于本文的术语“天然产生的糖基化位点”包括在N145，N322，S52和S60位置的糖基化位点。同样的，术语“天然产生的体内O-糖基化位点”包括S52和S60位置的糖基化位点，而术语“天然产生的体内N-糖基化位点”包括N145和N322位置的糖基化位点。
通常，FVII或FVIIa多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1中所示的序列区别在于，引入至少一个非天然产生的糖基化位点(如至少一个非天然产生的体内N-糖基化位点)，如1-15个非天然产生的糖基化位点(如1-15个非天然产生的体内N-糖基化位点)，特别是1-10，1-6，或2-4个非天然产生的糖基化位点(如1-10，1-6或2-4个非天然产生的体内N-糖基化位点)，优选通过取代引入。
应理解为了制备偶联物(其中所述偶联物多肽包含一个或多个糖基化位点)，所述多肽必须在能使糖(寡糖)组分连接至糖基化位点的宿主细胞中表达，或者在体外进行糖基化。可糖基化的宿主细胞在以下“与糖组分的偶联”一节中进一步有实例。
这方面的实施方案中，体内糖基化位点被引入亲代FVII或FVIIa分子中由暴露于该分子表面的氨基酸残基占据的位置，优选是超过25％的侧链暴露于溶剂中的那些氨基酸残基，特别是超过50％的侧链暴露于溶剂中的那些(这些位置在文中方法章节内确定)。然后引入N-糖基化位点，所用方式使得所述位点的N-残基位于所述位置中。类似的，引入O-糖基化位点以便组成该位点的S或T残基位于所述位置。所述位置包括K32S/T，I42S/T，Y44S/T，K143S/T，R290S/T，R315S/T，K341S/T，R392S/T，R396S/T，R402S/T或其组合。
N-糖基化时，可将体内糖基化位点引入仅需要一个突变就可创造出所述位点的位置处(即，创建功能性糖基化位点所需的任何其它氨基酸残基已存在于该分子内)。
换句话说，本发明的偶联物优选是这样一个偶联物，其中多肽氨基酸序列与SEQ ID NO：1的区别在于，至少一个天然产生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除丝氨酸(S)和苏氨酸(T)外的任何氨基酸。
类似的，本发明的偶联物优选是这样一个偶联物，其中多肽氨基酸序列与SEQ ID NO：1的区别在于，至少一个SEQ ID NO：1中天然产生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除N外的任何氨基酸。
创建体内N-糖基化位点的这类取代的特定实例包括选自以下组或其组合的取代：F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，i230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N。优选所述取代选自以下组：F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其组合。
替代的，体内糖基化位点引入由赖氨酸残基或精氨酸残基所占据的位置，优选由赖氨酸占据，特别是N-糖基化位点的N-残基或O-糖基化位点的S或T残基取代所述赖氨酸残基。
换句话说，本发明的偶联物优选是这样一个偶联物，其中多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的区别在于，至少一个SEQ ID NO：1中天然产生的K-X′-X序列或R-X′-X序列，优选K-X′-X序列，被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除丝氨酸(S)和苏氨酸(T)外的任何氨基酸。
创造体内N-糖基化位点的取代的实例包括选自以下组的取代：K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其组合。
上述糖基化方面的一个实施方案中，糖基化位点，尤其是N-糖基化位点，可被引入上述蛋白酶解位点处，或其附近(参见“本发明的偶联物”章节)。
因此，创造体内N-糖基化位点的取代的特定实例包括选自以下组的取代：                                   K32N+A34S/T，F31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T
或其组合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。优选，所述取代选自以下组：K32N+A34S/T，K8N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T或其组合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更优选，所述取代选自：
                                    K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T
或其组合，特别是K143N+N145T+R315N+V317T。
本发明的另一个实施方案中，优选体内糖基化位点被引入这样一个位置，其既不形成组织因子结合部分，也不形成活性位点区部分和此处定义的活性位点结合槽的脊。可想象这种糖基化变体主要属于之前本文定义的活性偶联物。
因此，创造体内N-糖基化位点的取代的特定实例包括选自以下组的取代：
                                         K32N+A34S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，W41N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T或其组合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。优选，所述取代选自以下组：
                                   K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R315N+V317S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T
及其组合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更优选，所述取代选自：
                                                   K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R315N+V317T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T
或其组合，特别是K143N+N145T+R315N+V317T。
本发明的另一个实施方案中，优选体内糖基化位点被引入这样一个位置，其不形成组织因子结合部分，但其形成活性位点区的一部分和此处定义的活性位点结合槽的脊。可想象这种糖基化变体主要属于之前本文定义的无活性偶联物。
所以，创建这种体内N-糖基化位点的取代的特定实例包括选自以下的取代：
                                          I153N+G155S/T，Q167N+L169S/T，V168N+L170S/T，L169N+L171S/T，L170N+V172S/T，L171N+N173S/T，A175S/T，A175N+L177S/T，L177N+G179S/T，G179N，G180N+L182S/T，T181N+I183S/T，V188N，V189N+A191S/T，S190N+A192S/T，A191N+H193S/T，H193N+F195S/T，F195N+K197S/T，D196N+I198S/T，K197N+K199S/T，I198N+N200S/T，K199N+W201S/T，W201N+N203S/T，R202S/T，I205S/T，V228N+I230S/T，I229N+P231S/T，I230N，P231N，S232N+Y234S/T，T233N+V235S/T，Y234N+P236S/T，V235N+G237S/T，P236N，G237N，T238N+N240S/T，T239N+H241S/T，H241N+I43S/T，D242S/T，I243N+L245S/T，A244N+L246S/T，L245N+R247S/T，L246N+L246S/T，V281N+G283S/T，S282N+W284S/T，G283N+G285S/T，W284N+Q286S/T，G285N+L287S/T，Q286N+L288S/T，D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，P321N+I323S/T，T324N+Y326S/T，E325N+M327S/T，Y326N+F327S/T，F328N+A330S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，S344N+G346S/T，G345N+P347S/T，P347N+A349S/T，H348N，L358N+G360S/T，T359N+I361S/T，G360N+V362S/T，I361N，V362N+W364S/T，S363N+G365S/T，W364N+Q366S/T，G365N+G367S/T，T370N+G372S/T，V376N，Y377N+R379S/T，T378N+V380S/T，R379N，V380N+Q382S/T，Q382N+I384S/T，Y383N+E385S/T，W386N+Q388S/T，L387N+K389S/T，L400N+R402S/T及其组合。优选选自以下的取代：                             D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，
及其组合，更优选选自以下的取代：                   D289N+G291T，
R290N+A292T，G291N，A292N+A294T，T293N+L295T，S339N+K341T，K341N+D343T，
G342N+S344T，D343N+G345T，
及其组合。
除了糖组分外，根据本发明这方面在本章节中说明的偶联物可含有另外的非多肽组分，特别是聚合物分子，如本发明所述，其偶联到偶联物多肽部分的一个或多个连接基团上。
应理解本章节中特定的任何氨基酸改变，尤其是取代，可与本文其他部分中说明的特定氨基酸改变(尤其是取代)组合。
例如，本章节中公开的任何糖基化变体(所述变体具有至少一个被引入和/或去除的糖基化位点，如包含R315N+V317T和/或K143N+N145T的取代)，可进一步与一个聚合物分子，如PEG，或任何其他的非多肽组分偶联。为此，可通过使用FVII或FVIIa中现有的连接基团，或被引入和/或去除连接基团，尤其使得可用于偶联的连接基团总数为1-6，特别是3-4或1，2，3，4，5，或6个而获得偶联物。
优选，在本发明偶联物中(其中FVII或FVIIa多肽包含两个糖基化位点)，非多肽组分的数量和分子量是经过选择的以使添加非多肽组分后的总分子量在5-25kDa的范围内，如在10-25kDa范围内，特别是约5kDa，12kDa，15kDa或20kDa。
无活性偶联物
本发明偶联物可通过去除至少一个氨基酸残基造成失活，所述氨基酸占据的位置选自SEQ ID NO：1的R152，I153，S344，D242和H193。这种去除可通过取代或缺失一个或多个上述氨基酸残基实现。优选，这种去除是通过取代实现，尤其通过保守取代实现。相应的，本文中所用无活性FVII或FVIIa多肽可包含一个或多个下述取代：R152X，I153X，S344X，D242X或H193X，其中X是任何氨基酸残基，优选是导致保守性取代的氨基酸残基。例如，无活性的FVII或FVIIa多肽包含R152X突变，其中X是除了赖氨酸以外的任何氨基酸残基(由于赖氨酸形成部分蛋白酶解位点的一部分)。特异性取代的其他实例包括I153A/V/L；S344T/A/G/Y；D242E/A和/或H193R/A。
替代的，活性FVII或FVIIa可能因I153α氨基酸基团的氨甲酰化，或通过将所述多肽与丝氨酸蛋白酶抑制剂复合而使其失活。合适的丝氨酸抑制蛋白，例如选自有机磷化合物，sulfanylfluoride，卤甲基酮肽，优选丹磺酸-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-谷氨酸-谷氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或azapeptide。
偶联物也可通过在选定的位置引入至少一个糖基化位点导致失活，以使后续的糖基化使偶联物失活。
如上“本发明的偶联物，其中非多肽组分是糖组分”章节的最后部分中所述，优选糖基化位点被引入这样一个位点，其不形成组织因子的一部分但形成活性位点区的一部分和本文定义的活性位点结合槽的脊。优选取代的特定例子在“本发明的偶联物，其中非多肽组分是糖组分”章节中给出。
本发明偶联物的非多肽组分
如上所述，本发明偶联物的非多肽组分优选选自聚合物分子、亲脂性化合物、糖组分(通过体内糖基化的方式)和有机衍化剂。所有这些物质都可为偶联物的多肽部分提供所需性质，特别是增加功能性体内半寿期和/或增加血浆半寿期。偶联物的多肽部分可以仅与一种类型的非多肽组分偶联，但也可以与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联，例如，与聚合物分子和糖组分偶联，与亲脂性基团和糖组分偶联，与有机衍化剂和糖组分偶联，与亲脂性基团和聚合物分子偶联等。与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联可同时或按顺序进行。
制备本发明偶联物的方法
在下列章节“与亲脂性化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与糖组分的偶联”和“与有机衍化剂的偶联”中描述与各指定类型非多肽的偶联。一般，本发明的多肽偶联物通过在有利于所述多肽表达条件下培养合适的宿主细胞，获取所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一个N-或O-糖基化位点，所述宿主细胞是可进行体内糖基化的真核细胞，和/或b)所述多肽可体外偶联非多肽组分。
应理解，对偶联的设计应使所得分子在所连接的非多肽组分的数量，这类分子的大小和形式(如线性或分支)，以及在所述多肽上的连接位点各方面最佳。使用的非多肽组分的分子量可，如基于希望达到的效果进行选择。例如，如果偶联的主要目的是获得具有高分子量的偶联物(如降低肾清除率)，通常要偶联尽量少的高分子量非多肽组分，以获得期望的分子量。如果希望获得高度的掩盖，可使用足量的低分子量非多肽组分(如分子量从约300Da到约5kDa，如分子量从300Da到2kDa)，以有效掩盖所有或大多数的蛋白酶解位点，或所述多肽中其他易被破坏的位点。
与亲脂性化合物的偶联
多肽和亲脂性化合物可以直接或通过使用接头彼此偶联。亲脂性化合物可以是天然的化合物如饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、维生素、类胡萝卜素或甾体激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺和具有一个或多个烷基-、芳基-、链烯基-的磺酸或其它多元不饱和化合物。可按本领域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505所述的方法来进行多肽和亲脂性化合物之间的偶联(任选通过接头来连接)。
与聚合物分子偶联，包括聚合物分子与多肽N末端的偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或杂聚物，通常所述分子的分子量范围约为300-100000Da，如约500-20000Da，更优选约为500-15000Da，甚至更优选的范围约为2-15kDa，如范围约为3-10kDa。当此处所用术语“约”涉及某一分子量时，“约”就表示大约的平均分子量，且反映这样一个事实，即在一定的聚合物制品中通常有一定的分子量分布。
均聚物的实例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。杂聚物是包含不同的偶联基团，如羟基基团和氨基基团的聚合物。
合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖或任何其它适于减小免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的生物聚合物。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一丰富的血浆蛋白。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、无毒的、无抗原性的、无免疫原性的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中分泌。
PEG是优选的聚合物分子，因为其与，例如多糖如葡聚糖相比仅仅具有极少量的能够交联的反应基团。特别感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为其偶联的化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多糖上的连接基团偶联)。因此，交联的危险被消除，所得多肽偶联物更均一并且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了使聚合物分子与多肽共价结合，聚合物分子的羟基末端基团必须为活化形式，即具有反应性功能基团(其实例包括伯胺基团、酰肼(HZ)、巯基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当激活的聚合物分子有商品例如可得自ShearwaterPolymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法，例如，如WO90/13540中所述激活。本发明中所使用的激活的线性或分支的聚合物分子的特定实例描述于Shearwater Po1ymers，Inc.1997和2000 Catalogs(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，引入本文供参考)。
激活的PEG聚合物的特定实例包括下列线性PEGs：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG和支链PEG如PEG2-NHS和US5,932,462和US5,643,575中所公开的那些，将两参考引入本文供参考。此外，引入本文供参考的下列出版物中公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化学过程：                       US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP229,108，EP402,378，US4,902,502，US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924，WO95/13090，WO95/33490，WO96/00080，WO97/18832，WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134，WO99/32139，WO99/32140，WO96/40791，WO98/32466，WO95/06058，EP439 508，WO97/03106，WO96/21469，WO95/13312，EP921 131，US5,736,625，WO98/05363，EP809 996，US5,629,384，WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605 963，US5,382,657，EP510 356，EP400 472，EP183 503和EP154 316。
多肽和激活的聚合物分子的偶联可通过使用任何常规方法，例如，按下列参考文献所述(所述参考文献中也描述了激活聚合物分子的适宜方法)进行：R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugationand Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.)。技术人员会知道根据所述多肽的连接基团(以上已给出实例)以及聚合物的功能基(例如，是氨基、羟基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亚胺，马来酰亚胺，vinysulfone或卤代醋酸盐)来使用激活方法和/或偶联化学。PEG化可以与多肽上的所有可利用的基团(即，暴露于多肽表面的连接基团)直接进行偶联或可以与一个或多个特定的连接基团如，N-末端氨基直接偶联(如US5985265描述的)。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)来完成。
应理解PEG化作用需设计为使所得分子在结合的PEG分子数目、这些分子的大小和形式(如，是线性的还是分支的)，以及在多肽分子中结合这些分子的位置各方面最佳。例如，可以根据需要达到的效果来选择所使用的聚合物的分子量。例如，如果偶联的主要目的是产生具有高分子量的偶联物(如，减小肾的清除)，通常理想的是偶联尽可能少的高分子量聚合物分子以获得所需分子量。当需要高度掩盖时，可通过使用足够数量的低分子量聚合物(如，分子量约为300Da-5kDa)来获得，这样可有效地掩盖多肽中所有的或大部分的蛋白酶解位点或所述多肽的易受破坏的位点。例如，可使用2-8，如3-6个这样的聚合物。
仅与蛋白质上一个连接基团偶联(如N-末端氨基基团)时，有利的是线性或分支的聚合物具有高分子量，优选约10-25kDa，如约15-25kDa，例如约20kDa。
一般来说，聚合物的偶联条件是使所有可利用的聚合物连接基团与聚合物分子反应。这可以通过使所述聚合物相对于所述多肽适当摩尔过量来实现。通常，激活的聚合物分子与多肽的摩尔比为1000-1，如约200-1，或约100-1。为获得最佳反应有些情况下所述摩尔比也可能略低，如约50-1，10-1或5-1。
本发明也打算通过接头来将聚合物分子与多肽偶联。合适的接头是技术人员公知的。优选的实例是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶联后，按本领域已知的方法如通过将伯胺加入到反应混合物中来封闭残留的活化聚合物分子，并通过合适的方法除去所产生的失活的聚合物分子。
应理解基于各种条件(如多肽的氨基酸序列，使用的活性PEG化合物的性质以及特定的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比)，可能获得不同程度的PEG化，较高程度的PEG化通常来自PEG与多肽的较高摩尔比。然而，来源于任何给定PEG化过程的PEG化多肽，通常包含PEG化程度略有不同的多肽偶联物的随机分布。
本发明一个实施方案，本发明多肽偶联物包含一个与SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIaN末端A1共价连接的聚合物分子，其中所述聚合物分子是与所述多肽连接的唯一聚合物分子。优选这种多肽偶联物包含与该多肽N末端连接的单一PEG分子，并且没有其他PEG分子。特别优选分子量至少约5kDa，尤其约10-25kDa，如约15-25kDa，例如约20kDa的线性或分支的PEG分子。根据这一实施方案的多肽偶联物可进一步包含一个或多个糖组分，所述糖组分连接于所述多肽N-连接的或O-连接的糖基化位点，或通过体外糖基化连接。
本发明另一个实施方案中，本发明多肽偶联物包含聚合物分子，所述聚合物分子与SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa N末端A1和N末端I153共价连接，所述聚合物分子是与所述多肽连接的唯一聚合物分子。优选这种多肽偶联物包含与该多肽N末端连接的单一PEG分子，并且没有其他PEG分子。特别优选分子量至少约5kDa，尤其约10-25kDa，如15-25kDa，例如约20kDa是优选的。根据这一实施方案的多肽偶联物可进一步包含一个或多个糖组分，所述糖组分连接于所述多肽N-连接的或O-连接的糖基化位点，或通过体外糖基化连接。
将聚合物(如PEG分子)选择性地偶联到多肽N-末端的方法中，US5985265中公开的方法是优选的。所述方法包括还原性烷基化(多肽N-末端氨基基团与含醛基的多肽，如醛基化-PEG，在存在还原剂，如NaCNBH3，的条件下反应，)。所述方法利用多肽中可用于衍生的不同伯氨基团(赖氨酸和N-末端相对比)的不同反应性，获得所述多肽的多种可选的衍生物，其N-末端羧基基团包含聚合物分子，如醛化PEG。所述反应在一个pH值下进行，所述pH值准许利用赖氨酸残基的ε-氨基基团与多肽N-末端残基α氨基基团的pKa差异。为了获得这种不同反应性，所述反应通常在弱酸条件下进行。合适的pH值范围包括pH4.5-7，如pH4.5-6，如pH5-6，特别是约pH5。
其他特定实施方案中，本发明的多肽偶联物包含一个PEG分子，所述PEG分子连接在多肽中可进行PEG化的每个赖氨酸残基上，尤其是线性的或分支的PEG分子，如分子量约1-15kDa，典型的约2-12kDa，如约3-10kDa，如约5kDa或6kDa。
其他实施方案中，本发明的多肽偶联物包含PEG分子，所述PEG分子连接在多肽中可进行PEG化的每个赖氨酸残基上，同时还连接在多肽N-末端的氨基酸残基上。
碳水化合物组分(如葡聚糖)与所述多肽氨基酸残基在体外的共价偶联也可使用WO87/05330和Aplin等人的CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中描述的方法。碳水化合物组分或PEG与蛋白质结合型和肽结合型Gln-残基的体外偶联也可以通过谷氨酰胺转移酶(TGases)来进行。谷氨酰胺转移酶以一种所谓的交联反应的方式催化供体氨基基团转移到蛋白-和肽-结合的Gln残基上。供体氨基基团可以是蛋白-或肽-结合的，如赖氨酸残基中的ε氨基基团，或也可以是小或大的有机分子的一部分。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中作为氨基供体的小的有机分子如腐胺(1，4二氨基丁烷)。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中作为氨基供体的大的有机分子如含氨基-PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35，13072-13080)。
通常谷氨酰胺转移酶是高度特异的酶，并非所有暴露于蛋白表面的Gln残基都可用于谷氨酰胺转移酶催化的含氨基物质的交联。相反只有少数Gln残基是谷氨酰胺转移酶的天然底物，但对于控制Gln残基作为适合的谷氨酰胺转移酶底物的确切参数仍不可知。因此，为了使蛋白对谷氨酰胺转移酶催化的交联反应敏感，经常的前提是在方便的位置增加一段氨基酸序列，所述氨基酸序列已知可很好地用做谷氨酰胺转移酶的底物。已知几种氨基酸序列可为谷氨酰胺转移酶的底物，或包含谷氨酰胺转移酶的底物，如P物质，elafin，纤维蛋白原，纤连蛋白，α2-纤溶酶抑制剂，α-酪蛋白，和β-酪蛋白。
与糖组分的偶联
为了完成FVII分子(包含一个或多个糖基化位点)的体内糖基化，编码多肽的核苷酸序列必须被插入到糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、或动物细胞，或选自转基因植物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞，如HEK293细胞，或昆虫细胞，如SF9细胞，或者酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或任何下文进一步描述的宿主细胞。
与有机衍生剂的偶联
所述多肽的共价修饰可通过多肽的一个或多个连接基团与有机衍生剂反应来进行。合适的衍生剂和方法在本领域中是公知的。例如，半胱氨酰基残基常常与(-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可与溴三氟丙酮、(-溴-(-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对氯汞基苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2- -1，3-二唑反应进行衍生。组氨酰基残基通过与二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0下反应进行衍生，因为该试剂较特异于组氨酰基侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物可用于衍生；该反应优选在0.1M卡可酸钠中于pH6.0下进行反应。赖氨酰基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍生具有使赖氨酰基残基的电荷逆转的作用。衍生含(-氨基的残基的其它合适的试剂包括亚氨基酯如methyl picolinimidate、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氢硼化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。精氨酰基残基通过与一种或多种常规试剂的反应来修饰，所述试剂包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生要求反应在碱性条件下进行，因为胍功能基具有高的pKa。
此外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应来进行选择性地修饰，其中R和R′是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰基和谷氨酰基通过与铵离子反应转化为天冬酰酰胺基和谷氨酰酰胺基。
功能性位点的封闭
已经报道聚合物的过度偶联可导致与聚合物偶联的多肽活性丧失。该问题可通过如去除位于功能性位点的连接基团，或在偶联前可逆性封闭功能性位点使功能位点在偶联时被覆盖而消除。后一种策略构成本发明进一步的技术方案(前一种策略在上文中进行了举例说明，如通过去除邻近功能性位点的赖氨酸残基)。更具体来说，按照第二种策略，多肽和非多肽组分之间的偶联是在多肽功能性位点用能够结合多肽功能性位点的辅助分子(如可结合所述多肽功能位点的组织因子或丝氨酸蛋白酶抑制剂)封闭的条件下进行的。
优选地，辅助分子能特异性识别多肽功能性位点，如受体，特别是组织因子，或者是全长的，或者是适当截短形式的组织因子，或是两个分子，其中一个是组织因子，另一个是一种肽或肽的抑制剂，其可结合到催化三联体上(优选定义为催化三联体附近10区域的氨基酸残基)，从而保护该区域。
另外，辅助分子可以是抗体，特别是识别FVII多肽的单克隆抗体。特别是，辅助分子可以是中和性单克隆抗体。
可使多肽在偶联之前与辅助分子相互作用。这确保多肽的功能性位点被掩盖或保护并因此而不能被非多肽组分如聚合物衍生。从辅助分子洗脱后，非多肽组分和多肽之间的偶联物可用至少部分保留的功能性位点来恢复。
具有被封闭的功能性位点的多肽与聚合物、亲脂性化合物、糖组分、有机衍生剂或任何其它化合物的随后偶联以常规方式进行，如按上文“与……偶联”的章节中所述的方法进行。
不考虑用于掩盖偶联物中多肽功能性位点的辅助分子的性质，理想的是辅助分子不含或仅仅含有少量的与分子中指定非多肽组分结合的基团，其中与这些基团的偶联将阻止偶联的多肽从辅助分子上解吸。因此，可与多肽非掩盖部分中存在的连接基团选择性偶联并且辅助分子可反复用于重复偶联。例如，如果非多肽组分是聚合物分子如PEG这种具有赖氨酸(氨基或N-末端氨基酸残基作为连接基团的分子时，理想的是辅助分子基本上不含可偶联的(氨基，优选不含任何(氨基。因此，在优选的实施方案中，辅助分子是能够与多肽功能性位点结合的蛋白质或肽，该蛋白质或肽不含任何与指定非多肽组分可偶联的连接基团。
在进一步的实施方案中，辅助分子首先与固相如柱填充材料，如Sephadex或琼脂糖珠，或表面，如反应容器共价连接。然后，将多肽装于载有辅助分子的柱材料上并按本领域已知的方法进行偶联，如按上文“与……偶联”的章节中所述的方法进行。该方法允许多肽偶联物通过洗脱从辅助分子上分离。多肽偶联物在不导致多肽偶联物实质性降解的理化条件下通过常规技术进行洗脱。含有多肽偶联物的流动相从固相上分离而辅助分子仍然共价连接。分离可以其它方式来完成：例如，辅助分子可用第二种可通过特异性结合剂(如，链霉抗生物素)来识别的分子(如生物素)来衍生。特异性结合剂可以与固相连接并因此允许通过流经第二辅助分子-固相柱，并随后洗脱辅助分子-第二分子复合体，而非多肽偶联物，可使多肽偶联物与辅助分子-第二分子复合体分离。多肽偶联物以任何合适的方式从辅助分子上释放。可通过提供的条件完成脱保护，其中辅助分子从其结合的FVII的功能性位点上分离。例如，与聚合物偶联的抗体和抗独特型抗体之间的复合物可通过将pH调节到酸性或碱性pH来分离。更优选使用识别FVII的Ca2+特异构象的构象特异性抗体，最后在温和条件下用EDTA洗脱。
丝氨酸蛋白酶抑制剂的连接
丝氨酸蛋白酶抑制剂的连接可根据WO96/12800中所述方法进行。
标记多肽的偶联
在另外的实施方案中，多肽作为融合蛋白(与标记物的，即通常由1-30，如1-20个氨基酸残基构成的氨基酸序列或肽段)来表达。除了允许快速和容易地进行纯化，标记物是完成标记多肽和非多肽组分之间偶联的便利工具。特别是，标记物可用于在微滴定板或其它载体如顺磁珠上完成偶联，这样标记的多肽可通过标记物来固定。在微滴定板上与标记的多肽偶联的优点是，标记的多肽可从培养肉汤直接固定到微滴定板上(原则上不经任何纯化)并进行偶联。因此，可减少操作步骤的总数(从表达到偶联)。而且，标记物可起间隔臂分子的作用以确保使固定的多肽更易于偶联。使用标记多肽进行的偶联可以是与本文中公开的任何非多肽组分的偶联，如与聚合物分子如PEG的偶联。
对使用的特定标记物的识别不是关键，只要该标记物能够与多肽一起表达并且能够固定在适宜的表面或载体物质上即可。许多适宜的标记物可通过商业渠道获得，例如，可购于Unizyme Laboratories，Denmark。例如，所述标记物可以是任一下列序列：
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
或任一下列序列：
EQKLI SEEDL(描述于Mol.Cell.Biol.5：3610-16，1985的C-端标记物)
DYKDDDDK(C-或N-端标记物)
YPYDVPDYA
抗上述标记物的抗体通常可通过商业渠道获得，例如购于ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
随后从多肽上切割标记物可通过市售酶进行。
制备本发明多肽或本发明偶联物多肽的方法
本发明的多肽或本发明偶联物的多肽部分(任选为糖基化形式)可通过本领域已知的任何合适的方法来制备。这些方法包括构建编码该多肽的核苷酸序列并在合适的转化或转染宿主中表达该序列。优选宿主细胞是γ-羧基化的宿主细胞，如哺乳动物细胞。然而，可通过化学合成方法或化学合成方法的组合或者化学合成方法和重组DNA技术的组合来产生本发明的多肽，但效率很低。
编码本发明多肽或偶联物多肽部分的核苷酸序列可通过分离或合成编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的亲代FVII，如hFVII的核苷酸序列来构建，然后改变所述核苷酸序列以引入(即插入或取代)或消除(即去除或取代)相关氨基酸残基。
核苷酸序列可通过公知方法经定点诱变方便地进行修饰。或者，核苷酸序列可通过化学合成来制备，例如通过使用寡核苷酸合成仪，其中基于所需多肽的氨基酸序列来设计寡核苷酸，并且优选选择有利于在生产重组多肽的宿主细胞中表达的那些密码子。例如，可以合成多个编码所需多肽各部分的小分子寡核苷酸，然后通过PCR、连接反应或连接酶链反应(LCR)(Barany，PNAS 88：189-193，1991)将所述寡核苷酸装配起来。各个寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用于互补装配。
另外的核苷酸序列修饰方法可用于产生多肽变体以便高流量筛选的，例如US5093257中公开的有关同源交换的方法，以及有关基因改组的方法，即两个或多个同源核苷酸序列间的重组，导致产生与起始核苷酸序列相比有许多核苷酸改变的新的核苷酸序列。基因改组(也被称为DNA改组)涉及一次或多次核苷酸序列的随机片段化和重新装配的循环，随之通过筛选选择编码具有所期望特性的多肽的核苷酸序列。为了使基于同源性的核酸改组能够发生，所述核苷酸序列的相关部分优选至少有50％的同一性，如至少60％的同一性，更优选至少70％的同一性，如至少80％的同一性。重组可在体外或体内进行。
以下文献中显示了适当的体外基因改组方法：Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，Naturem vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat.Biotechnol.1998.Mar；16(3)：258-61；Zhao H.和Amold，FB，Nucleic AcidsResearch，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research1998，Jan 15；26(2)：pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公开了一种合适的体内改组方法。其他通过体外或体内重组进行核酸诱变的技术在，如WO97/20078和US5837458中公开。特别的改组技术包括“基因族改组(Family shuffling)”，“合成改组”“计算机化(insliico)改组”。
基因族改组是使来自不同种属的一族同源基因进行一次或多次的改组和后续筛选或选择的循环。基因族改组技术在一些文献中有说明，如：Crameri等，(1998)，Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，NatureBiotechnology，vol.17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797；以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896。
合成改组涉及提供重叠的合成寡核苷酸文库，该文库基于，如目的同源基因之间的序列比对。对这种合成的寡核苷酸进行重组，筛选得到的重组核酸序列，如需要可进行进一步的改组循环。WO00/42561中有关于合成改组的说明。
计算机化(In silico)改组指一种DNA改组过程，由计算机系统进行或模拟，因此部分或完全无须对核酸进行物理操作。WO00/42560中有关于计算机化(in silico)改组的说明。
一旦装配(通过合成、定点诱变或另一方法)后，编码多肽的核苷酸序列立即被插入重组载体中，并与FVII在目标转化宿主细胞中表达必需的调控序列可操作地连接。
当然，应理解不是所有载体和表达调控序列都能同样良好地表达本文所述多肽变体的核苷酸序列。不是所有宿主都能使相同的表达系统发挥同样优良的功能。然而，本领域技术人员不用进行实验就可以对这些载体、表达调控序列和宿主作出选择。例如，在选择载体时必须考虑宿主，因为载体必须在其中复制或能够整合到染色体中。也应考虑载体拷贝数、控制拷贝数的能力以及载体编码的任何其它蛋白质如抗生素标记物的表达。在选择表达调控序列时，也应考虑各种因素。这些因素包括如序列的相对长度、其可控制性以及与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别要考虑潜在的二级结构。选择宿主时应考虑其与所选载体的相容性、核苷酸序列编码的产物的毒性、宿主的分泌特性和宿主正确折叠多肽的能力、宿主的发酵和培养要求和核苷酸序列编码产物纯化的难易。
重组载体可以是自主复制的载体，即载体作为染色体外实体存在，其复制独立于染色体复制，例如质粒。另外，引入宿主细胞时，载体可整合到宿主细胞基因组中并且与其整合的染色体一起复制。
载体优选是表达载体，其中编码本发明多肽的核苷酸序列可与核苷酸序列转录所需的另外的片断可操作地连接。载体通常由质粒或病毒DNA衍生。用于在本文所述宿主细胞中表达的各种合适的表达载体是可商购的或有文献描述的。可用于真核宿主的表达载体包括如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。具体的载体如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，LaJola，CA，USA)。可用于酵母细胞的表达载体包括2(质粒及其衍生物，POT1载体(US4,931,373)，pJSO37载体(描述于Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达载体包括pVL941，pBG311(Cate等，″Isolation of Bovine and Human Genes forMullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells″，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都来自Invitrogen)。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒包括pBR322，pET3a和pET12a(都来自Novagen Inc.，WI，USA)，较宽宿主范围的质粒，如RP4，噬菌体DNA，例如λ噬菌体的各种衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
本发明中使用的其它载体包括允许编码多肽的核苷酸序列扩增多个拷贝的那些载体。这种可扩增的载体是本领域公知的。例如，它们包括能够通过DHFR扩增的载体(例如参见Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufmanand Sharp，″Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene：Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通过谷氨酰胺合成酶(″GS″)扩增的载体(例如参见US5,122,464和EP338,841)。
重组载体可进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。此序列的一个例子(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起始点。当宿主细胞是酵母细胞时，能够使载体复制的合适序列是酵母质粒2(复制基因REP1-3和复制起始点。
载体也可含有可选择的标记，如基因，其产物补充宿主细胞的缺陷，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene40，1985，pp.125-130)，或者赋予对药物如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。对于酿酒酵母来说，可选择的标志包括ura3和Leu2。对于丝状真菌来说，可选择的标记包括 amdS、pyrG、arcB、 niaD和 sC。
术语“调控序列”在本文中包括对本发明多肽表达必需的或有利的所有成分。每个调控序列对编码多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导区、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。调控序列至少包括启动子。
本发明可以使用各种各样的表达调控序列。这些可使用的表达调控序列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达调控序列以及已知调控原核或真核细胞或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。
哺乳动物细胞中与转录相关的合适调控序列的实例包括SV40和腺病毒的早期或晚期启动子，如腺病毒2的主要晚期启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子、人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、人延伸因子1((EF-1()启动子、果蝇最小热休克蛋白70启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人遍在蛋白C(UbC)启动子、人生长激素终止子、SV40或腺病毒Elb区聚腺苷酸化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)：947-50)。
为了改进在哺乳动物细胞中的表达，可以将合成的内含子插入编码所述多肽的核苷酸序列的5′非翻译区。合成内含子的实例是来自质粒pCI-Neo的合成内含子(购自Promega Corporation，WI，USA)。
昆虫细胞中指导转录的合适调控序列的实例包括多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)多角体病毒碱性蛋白启动子、杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟早期基因启动子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括酵母(交配系统的启动子、酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子、来自酵母糖酵解基因或乙醇脱氢酶基因的启动子、ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。在丝状真菌宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括ADH3启动子和终止子、由编码米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶、黑曲霉(淀粉酶、黑曲霉或构巢曲霉(A.Nidulans)葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的启动子、TPI1终止子和ADH3终止子。在细菌宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括lac系统、trp系统、TAC或TRC系统的启动子和(噬菌体的主要启动子区域。
信号肽的存在或不存在如取决于用于多肽生产的表达宿主细胞、被表达的蛋白质(是细胞内的还是细胞外的蛋白质)和是不是需要分泌。为了在丝状真菌中使用，信号肽可以由编码曲霉属菌株的淀粉酶或葡萄糖淀粉酶的基因、编码米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信号肽优选由编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性(-淀粉酶、黑曲霉酸稳定淀粉酶或黑曲霉葡萄糖淀粉酶的基因衍生。为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以由昆虫基因方便地衍生(参见WO90/05783)，如鳞翅目Manduca sexta脂动激素前体(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蜕皮甾类UDP葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等，ProteinExpression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods inEnzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳动物细胞中使用的优选信号肽是hFVII的或鼠Ig(轻链信号肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 152：89-104)。为了在酵母细胞中使用，发现合适的信号肽是酿酒酵母(-因子信号肽(参见US4870008)、改性的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)、酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前导序列TA57(WO98/32867)。大肠杆菌的合适信号肽是信号肽ompA(EP581821)。
本发明编码FVII多肽的核苷酸序列，无论通过定点诱变、合成、PCR或其他何种方法制备，可选择地包括编码信号肽的核苷酸序列。如多肽需要从表达的细胞中分泌则需要信号肽。这种信号肽，如果存在，应该是能被表达所述多肽的细胞识别的。信号肽可与所述多肽同源(如，通常与hFVII相连)或异源(如其起源异于hFVII)，或者可以与宿主细胞同源或异源，即通常所述信号肽是该宿主细胞表达的信号肽或者通常其不是该宿主细胞表达的信号肽。相应的，所述信号肽可以是原核的，如来源于细菌如大肠杆菌，或者是真核的，如来源于哺乳动物或昆虫或酵母细胞。
可以使用任何合适的宿主产生本发明偶联物的多肽，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、假单孢菌属或链霉菌属或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。载体可引入细菌宿主细胞，例如可通过原生质体转化(参见如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques6：742-751)或偶联(参见如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5771-5278)来进行。合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属或木霉菌属。真菌细胞可以转化，转化过程涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。在Malardier等人1989，Gene 78：147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀菌属的合适方法。合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株，如酿酒酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属，如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica、汉逊酵母属，如多形汉逊酵母或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母转化系统试剂盒的产品手册)中所述的方法来转化。合适昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法转化昆虫细胞并在其中产生异源多肽。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(如，NS/O)、仓鼠幼鼠肾脏(BHK)细胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养中的植物细胞。另外合适的细胞系在本领域中是已知的并可购自公共的保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳动物细胞(如CHO细胞)可按US5047335所述方法进行改性来表达唾液酸转移酶，如，1，6-唾液酸转移酶，以便改进FVII或FVIIa多肽的糖基化。
为了增加分泌，使本发明多肽与内切蛋白酶，尤其是PACE(配对的碱性氨基酸转化酶)(如US5986079中所述)，如Kex2内切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起合成是有利的。
将外源性DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的转染方法。这些方法在本领域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA中所述的。按建立的方法进行哺乳动物细胞的培养，例如在Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins编，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997中公开的。
在本发明生产方法中，用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养培养基中培养细胞。例如，细胞可以在实验室中通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、成批、补料分批或固体状态发酵)或在合适培养基和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行工业发酵。培养在含有碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基可商购或可以按公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中所述的)。如果多肽分泌在营养培养基中，多肽可从培养基中直接回收。如果多肽不被分泌，可从细胞裂解物中回收。
可通过本领域已知的方法来回收所得多肽。例如，可通过常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀从营养培养基中回收多肽。
可通过本领域已知的各种方法包括但不限于层析(如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如，制备性等电聚焦)、溶解度差异(如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，如Protein Purification，J.-C.Jansonand Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)来纯化多肽。
在文献中公开了纯化单链FVII并且将其活化为双链FVIIa的多种方法(Broze和Majerus，1980，J.Biol.Chem.255：1242-47，Hedner和Kisiel，1983，J.Clin.Invest.71：1836-41等)。一种可用于纯化单链FVII的方法是如US5700914所述在纯化过程中引入锌离子。
一个优选实施方案中，所述多肽作为单链FVII被纯化，并进一步被PEG化。PEG化的FVII单链多肽活化是通过使用固定化酶(如因子IIa，IXa，Xa和XIIa)，或通过使用阳离子交换基质或其类似物自活化。
首先纯化单链形式的FVII，然后进行PEG化(如果需要)，最后通过上述方法之一或如Pedersen等(1989，Biochemistry 28：9331-36)所述的自活化进行活化是有利的。在活化前进行PEG化的优点在于避免了对R152-I153的剪切所形成的新的氨基末端的PEG化。新的氨基末端的PEG化可使所述分子失活，因为D242和I153氨基末端之间形成的氢键是活性所必需的。
本发明的药物组合物及其用途
另一个方面，本发明涉及组合物，特别涉及一种药物组合物，其包含本发明多肽或偶联物(包括上述无活性的偶联物)和可药用载体或赋形剂。
本发明的偶联物、多肽或药物组合物可用做药物。
优选，所述多肽或所述(活性)偶联物可用于生产治疗或预防哺乳动物中FVIIa/TF相关疾病或紊乱的药物。例如所述多肽或所述(活性)偶联物可用于生产治疗或预防疾病的药物，其中加快凝血对于所述疾病是有利的，如治疗患有血管损伤时凝血不足疾病的患者。尤其，所述多肽或所述(活性)偶联物可用做生产治疗以下疾病的药物，血友病、具有FVIII和FIX抑制剂的血友病，血小板减少的患者，血小板病的患者，如格兰兹曼氏血小板机能不全血小板释放缺陷和贮存库缺陷，患von Willebrand疾病的患者，患有肝脏疾病的患者，或有严重出血问题的健康者，如因外伤或大手术产生了针对FVIIa的抑制剂，出血紊乱，如血友病及其他通常与严重组织损伤有关的疾病。
类似的，本发明的无活性偶联物，可用做生产治疗或预防哺乳动物FVIIa/TF相关疾病或紊乱的药物。例如，本发明的无活性偶联物可用做生产治疗或预防疾病的药物，其中降低凝血对于所述疾病是有利的，如预防或治疗处于高度凝血状态的患者，如脓毒症、深度静脉血栓的患者，易患心肌梗塞或血栓性中风、肺梗塞的患者，急性冠状动脉综合症(acute coronarysyndromes)(心肌梗塞和不稳定的心绞痛)的患者，冠状动脉性心脏病(coronarycardiac)患者，预防接受血管成型手术患者的心脏疾病和restonosis，以及患外周血管疾病的患者。本发明的无活性偶联物也可用于生产治疗呼吸疾病、肿瘤生长及转移的药物。
另一方面，所述多肽，所述(活性)偶联物或包含本发明活性偶联物的所述药物组合物可用于治疗患FVIIa/TF相关疾病或紊乱(如一种或多种以上所述疾病或紊乱)的哺乳动物的方法中，包括给予需要治疗的哺乳动物以有效剂量的这种多肽，偶联物或组合物。
类似的，所述无活性偶联物或包含本发明无活性偶联物的所述药物组合物可用于治疗患有FVIIa/TF相关疾病或紊乱(如一种或多种以上所述疾病或紊乱)的哺乳动物的方法中，包括给予需要治疗的哺乳动物以有效剂量的这种无活性偶联物或组合物。
以治疗有效剂量给予本发明的多肽或偶联物，所述剂量大约与用rFVII如NovoSeven治疗所采用的剂量相同或更高。本文中“治疗有效剂量”是指对所治疾病状态足以产生预期效果的剂量。给药的准确剂量取决于具体情况，可通过本领域技术人员通过公知的方法加以确定。一般来说，所述剂量应当能够防止或减小被治疗疾病或症状的严重性或扩散。对本领域技术人员显而易见的是本发明多肽、偶联物或组合物的有效量取决于疾病、剂量、给药时间表、多肽或偶联物或组合物是单独给药还是与其它治疗剂联合给药、组合物的血清半寿期和患者的总体健康状况。优选，本发明的多肽、偶联物或组合物以有效剂量给予，尤其以足以使凝血紊乱正常化的剂量给予。
本发明的多肽或偶联物优选以组合物形式给药，其中包括可药用载体或赋形剂。“可药用”意指在给药的患者中不引起任何不利作用的载体或赋形剂。这些可药用载体和赋形剂在本领域中是公知的(参见，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
本发明的多肽或偶联物可通过公知方法配制成药物组合物。在E.W.Martin(Mark Publ公司，16版，1980)Remington′s Pharmaceutical Sciences描述了合适的制剂。
本发明的多肽或偶联物可以原形使用和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括但不限于与碱金属或碱土金属如钠、钾、钙和镁形成的盐，以及如锌盐。这些盐或复合物可作为晶体和/或无定形结构存在。
本发明的药物组合物可单独给予也可以与其他治疗制剂联合给予。这些制剂可以作为同一药物组合物中的一个组成部分给予，或者与本发明多肽或偶联物同时或依照一定的治疗时间表分别给予。此外，本发明的多肽、偶联物或药物组合物可用做其他治疗的佐剂。
本发明中“患者”包括人和其他哺乳动物。因此所述方法医用兽用均可。本发明多肽或偶联物的药物组合物可以多种形式配置，如以液体，凝胶，冻干粉或压制的固体形式。优选的形式根据治疗的特别需要而异，这对于本领域技术人员是显而易见的。
尤其，本发明多肽或偶联物的药物组合物以冻干粉或稳定溶液形式配制。所述多肽或偶联物可通过多种公知方法冻干粉化。多肽或偶联物可通过将蛋白酶解位点去除或掩盖，制备成稳定的溶液形式。获得稳定溶液的优点在于更便于患者使用，而且在紧急情况时，作用更快，这可能可以救生。优选的形式根据治疗的特定需要而异，这对于本领域技术人员是明显的。
本发明制剂可以多种方式给药，包括但不限于，口服、皮下、静脉内、小脑内、鼻内、真皮内、腹膜内、肌肉内、肺内、经阴道、经直肠、眼内或以任何其它适宜的方式。制剂可连续灌注给予，尽管大药丸注射(bolusinjection)是可接受的，但需利用本领域公知技术，如泵或植入。一些情况下所述制剂可以溶液或喷雾直接给予。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的优选实例是设计成非肠道给药的溶液。尽管在很多情况下，药物溶液制剂可以以适用于立即使用的液体形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，如通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合来制备，赋形剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂或去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围中。它们通常以大约2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐(gluconate)缓冲剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有助于防止变性或与容器壁粘合的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、(-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％(w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸(paraben)甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯亚甲基  卤化物(如苯亚甲基  氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇，优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以其它组分的相对量计算。
可以存在非离子表面活性剂或清洁剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗性多肽以避免搅拌诱导的聚集，其也允许配方剂暴露于剪切表面压力而不导致多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic(多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E)和共溶剂。
活性组分也可以被包裹在制备的微囊中，例如通过coascervation技术或通过界面聚合制备，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在胶体状药物释放体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在大乳剂中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公开了这些技术。
体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是灭菌的。该过程容易完成，例如，通过无菌滤膜来过滤。
持续释放制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物半渗透材料、具有合适形式如膜或微囊的材料。持续释放材料的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease(技术或Lupron Depot((由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能够长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝胶在较短时间内释放蛋白质。包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致生物活性丧失并且可能改变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰巯基、冻干酸性溶液、控制湿度、使周适宜的引入剂和开发特异性聚合物型组合物来达到稳定。
在下列实施例中进一步描述本发明，这些实施例并无限定。
序列
SEQ ID NO：1显示hFVII蛋白(包括γ-羧基化残基)
SEQ ID NO：2显示编码hFVII蛋白的cDNA序列
SEQ ID NO：3显示hFVII蛋白(无γ-羧基化残基)
SEQ ID NO：4显示FVII蛋白在哺乳动物中表达的表达盒
SEQ ID NO：5显示CBProFpr174引物
SEQ ID NO：6显示CBProFpr175引物
SEQ ID NO：7显示CBProFpr216引物
SEQ ID NO：8显示CBProFpr229引物
SEQ ID NO：9显示CBProFpr221引物
SEQ ID NO：10显示CBProFpr228引物
SEQ ID NO：11显示CBProFpr226引物
材料和方法
用于确定所要改变的氨基酸的方法
可接近的表面区域(ASA)
使用计算机程序组(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)计算结构中各个原子的可接近的表面区域(ASA)。该方法通常使用1.4大小的探针并将可接近的表面区域(ASA)定义为探针中心形成的面积。于该计算前，从坐标中去除所有水分子和所有氢原子，以及其它不与该蛋白质直接相连的原子。
侧链的分级(fractional)ASA
侧链原子的分级ASA通过侧链中原子的ASA总和除以延长的ALA-x-ALA三肽中残余类型侧链原子的ASA代表值来计算。参见Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在该例中，CA原子被看作甘氨酸残基侧链的一部分但不被看作其它残基的一部分。下表表示侧链的100％ASA标准：
Ala  69.232 Leu  140.762
Arg  200.352 Lys  162.502
Asn  106.252 Met  156.082
Asp  102.062 Phe  163.902
Cys  96.692 Pro  119.652
Gln  140.582 Ser  78.162
Glu  134.612 Thr 101.672
Gly  32.282 Trp  210.892
His  147.002 Tyr  176.612
Ile  137.912 Val  114.142
在该结构上未发现的残基鉴定为具有100％的暴露，因其被认为位于弹性区域。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35处的γ-羧基谷氨酸均被确定为100％暴露。
确定原子之间的距离
利用分子绘图软件，如Insight II(v.98.0 MSI INC，可方便地确定原子之间的距离。
催化位点区
催化位点区定义为任何这样的残基，所述残基具有至少一个原子在催化三联体(残基H193，D242，S344)内任何原子的10距离内。
确定组织因子结合位点
受体结合位点被定义为包含所有这类残基，所述残基在受体结合时，其可接近的表面区域改变。这通过至少两个ASA计算来确定；一个基于配基/受体复合物中分离的配基，另一个基于完整的配基/受体复合物。
检测FVII和FVIIa性质的方法
检测功能性体内半寿期的方法
体内生物半寿期的检测可通过上述文献中说明的多种方法进行。FDA参考号96-0597中说明了检测rFVIIa或其变体的体内半寿期的方法。简要地，在给予所述偶联物，多肽或组合物之前和之后24小时内抽取血浆，检测该血浆内FVII凝血活性。检测出稳定状态下分布体积的中值，并确定中值清除率。
对蛋白酶解敏感性降低的检测
制备组合物，所述组合物包含偶联物(100-750μg/ml，优选600μg/ml)，1.5mg Ca2+/ml(以氯化钙形式)，甘露醇(30mg/ml)，polysorbate 80(0.1mg/ml)，氯化钠(3mg/ml)，和甘氨酰-甘氨酸缓冲液(1.3mg/ml，pH5.5)。
制备含有野生型rFVIIa的类似组合物。
以“检测凝血活性的方法”或“检测低水平催化活性的方法”或“检测催化活性的方法”章节中所述方法，确定起始凝血活性，或起始酰胺分解活性。
然后将组合物在37℃温育直到含有野生型rFVIIa的组合物丧失其起始凝血或酰胺化活性的至少25％，优选至少50％。
然后检测包含本发明偶联物的组合物的凝血或酰胺分解活性。
以百分比表示本发明偶联物与野生型rFVIIa相比，对蛋白酶解的敏感性的降低。
对蛋白酶解降低的敏感性的其他检测方法
蛋白酶解可通过US5580560的实施例5中说明的方法检测，其中所述蛋白水解是自我蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性标记样品在体内模型中进行检测，通过取血样，并对这些血样进行SDS-PAGE和放射自显影来对比野生型和偶联物的蛋白酶解作用。
无论使用何种分析确定蛋白酶解，“降低的蛋白酶解”是指与非偶联的野生型FVIIa相比在裂解程度上的明显降低，这是通过对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的凝胶扫描、HPLC测定，或利用下述显色试验通过相对于野生型的保守的催化活性确定。
对rFVII及其偶联物的分子量的确定
偶联的或非偶联的rFVII或其偶联物的分子量是通过SDS-PAGE、凝胶过滤、Western印迹、基质辅助的激光解吸(matrix assisted laser deserption)、质谱分析或平衡离心，如根据Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)的SDS-PAGE，进行确定。
检测低水平催化活性的方法
用COASETFVII(Chromogenix，Art.No 82 19 00)确定FVII/FVIIa稀释样品和发酵液/经过培养的培养液中的酰胺分解活性。根据生产商的使用说明测定酰胺分解活性。简要的，FX以过量存在，并在37℃被FVIIa转变为FXa。所获得的FXa水解显色底物S2765(N-α-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)，释放显色分子对-硝基-苯胺(para-nitro-anillin)(pNA)，吸收波长为405nm的光。加入乙酸终止反应。通过与FVIIa(试验缓冲液中125 pg/ml-1ng/ml)的标准曲线的比较，确定样品中FVII/FVIIa的量。
检测催化活性的方法
偶联物裂解小肽底物的能力可通过使用显色底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-对-硝基苯胺)检测。重组FVIIa稀释于含0.1％BSA的0.1M Tris，0.1M NaCl，5mM CaCl2，pH8.3中。加入S-2288至1mM起动反应，37℃温育30分钟后检测405nm的吸光度。
检测凝血活性的方法
使用WO92/15686所述的标准一步(one-stage)凝血分析检测FVIIa的活性。简言之，待测样品在50mM Tris(pH7.5)，0.1％BSA中稀释，取该溶液100μl与100μl FVII缺陷型血浆和200μl含10mM Ca++的促凝血酶原激酶C温育。检测凝血时间并与标准曲线比较，所述标准曲线使用柠檬酸化的正常人血浆的系列稀释液制备。
检测抗凝血活性的方法
无活性FVII或FVIIa偶联物的抗凝血活性可通过上述一步凝血分析(检测凝血活性的方法)检测，其中无活性偶联物与野生型FVII竞争有限数量的relipidated组织因子。分析基本按照WO92/15686，实施例III中所述方法进行，该文本在此引用作为参考。记录无活性偶联物延长野生型FVII凝血时间的能力，将其作为抗凝血活性的一个指标。
                         实施例
实施例1
本实施例使用Banner等(J Mol Biol，1996；285：2089)确定的与可溶性组织因子形成复合体的hFVIIa的X射线结构。注意，参照文献中的残基序号并不与该序列一致。此处所用序号与SEQ ID NO：1一致。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35处的γ-羧基谷氨酸在此均命名为GLU(三字母的简写)或E(单字母简写)。所述结构中不存在143-152位的残基。
表面暴露
对FVII片段单独进行的分级ASA计算，结合上述方法中对非标准和/或丢失残基的可接近性的定义，确定以下残基有超过25％的侧链暴露于其表面：A1，N2，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F24，E25，E26，R28，E29，F31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，S103，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R％224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F275，V276，R277，F278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406。
以下的残基有超过50％的侧链暴露于表面：A1，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35，R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119，L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F275，R277，F278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406。
组织因子结合位点
通过ASA计算，人FVII中的以下残基在复合物中改变其ASA。这些残基被定义为组成受体结合位点的残基：                                             L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位点区
活性位点区是具有至少一个与催化三联体(残基H193，D242，S344)中任何原子的间距在10范围内的原子的任何残基：                             I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344， G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位点结合槽的脊
活性位点结合槽的脊通过对FVIIa结构1FAK.pdb的目测观察定义为：N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
实施例2
设计用于在哺乳动物细胞中表达人凝血因子VII的表达盒
合成SEQ ID NO：2所示DNA序列(包含编码具有天然短信号肽的人凝血因子VII全长cDNA的短型(Hagen等，1986.PNAS 83：2412))，以促进其在哺乳动物细胞中的高表达。首先根据Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol1987 Aug 20；196(4)：947-50)修饰ATG起始密码子的周围序列，以使ATG起始密码子上游共有序列完全匹配。然后，对天然人凝血因子cDNA的开放式阅读框进行修饰，使所使用的密码子为高表达的人基因中常用的密码子。随后，在开放阅读框末端插入两个翻译终止密码子，以便翻译有效终止。用70聚体DNA寡核苷酸装配完全合成且优化表达的FVII基因，最后用分别插入5′和3′末端BamHI和HindIII位点的末端引物，进行标准的PCR扩增，得到以下序列(SEQ ID NO：4)：ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggctgccgtcttcgtcacccaggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagagctccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagaggaacagtgcagctttgaggaagcccgggagattttcaaagacgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcgcctccagcccttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggggcgcaattgcgaaacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactgcagcgatcacacgggcacgaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcctgcacgcccacggtggaatacccttgcgggaagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggcgggaaggtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtcaacggggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagattaagaattggcggaacctcatcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtcccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacctatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgctccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggacctttagcgaacgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggggccagctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcccgcaaagtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatggctccaaggatagctgcaagggggactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccgggatcgtcagctggggccagggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctcatgcggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaagctt
通过从pCINeo(Promega)克隆内含子来制备用于对所得PCR产物的进行克隆载体，该PCR产物包含天然人凝血因子VII的表达盒。pCI-Neo的合成内含子用上述标准PCR条件扩增，引物如下：
CBProFpr174：5′-AGCTGGCTAGCCACIGGGCAGGTAAGTATCA-3′
CBProFpr175：5′-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3′
产生一个322bp PCR片段。该片段用NheI和BamHI剪切，之后克隆到pCDNA3.1/HygR(来自Invitrogen)，产生PF#34。
克隆PF#34上BamHI和HindIII位点之间的天然人凝血因子VII的表达盒，得到质粒PF#226。
实施例3
构建编码人凝血因子VII的变体形式的表达盒，该变体具有一个另外的体内糖基化位点
用序列突出端延伸(SOE)PCR产生具有已取代的密码子的人凝血因子变体开放阅读框的构建体。在SOE-PCR中，FVII开放阅读框的N-末端部分和C-末端部分都在各自初级PCR中首先得到扩增。
例如，为了将R315和V317密码子改变为N315和T317密码子，在初级PCR中使用以下配对引物：
CBProFpr216：5′-CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3′
CBProFpr229：5′-GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3′，以及
CBProFpr221：5′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′
CBProFpr228：5′-GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3′
然后组合初级PCR产物，加入末端引物(CBProFpr216和CBProFpr221)，产生编码期望的R315N+V317T FVII变体的二级全长产物。该二级PCR产物用BamHI和HindIII剪切，再克隆到载体PF#34的BamHI和HindIII位点之间，产生PF#249。
此外，当引入的突变与表达质粒内的唯一限制性内切酶位点足够靠近时，可以构建变体基因，所述构建方法包含一个单一PCR步骤和后续的克隆。例如，在一个单一PCR反应中使用以下PCR引物引入取代K143N+N145T：
CBProFpr226：5′-CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3′
CBProFpr221：5′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′
然后通过使用限制性内切酶位点XbaI和HindIII克隆克隆所得PCR产物。
使用以上策略，可制备下述糖基化偶联物，其酰胺分解活性的检测如检测低水平催化活性章节中所述。此外，对一些偶联物进行检测凝血活性章节所述的一步凝血分析。所得结果编辑于下表中。
糖基化偶联物   酰胺分解活性   凝血活性
T106NK143N+N145TV253NR290N+A292TG291NR315N+V317TK143N+N145T+R315N+V317T     +++--++     +ndndndnd+nd
+：可检测的活性；-：不可检测的活性；nd：未测定
实施例4
引入另外的近侧(位于N-末端)糖基化位点以改进糖基化位点的用途
为了预防野生型人FVII的自身裂解，通过如上所述产生R315N和V317T取代，在位置315处引入一个糖基化位点，得到PF#249。
用Lipofactamine 2000转染CHO K1细胞，获得低水平的瞬时表达。利用酰胺分解试验，COASETFVII，分析24小时的瞬时上清，表明该变体是有活性的。在用400μg/ml潮霉素B选择后，获得稳定克隆群。这些克隆以约0.2μg/ml的浓度表达R315N+V317T变体，在该浓度下可进行蛋白印记分析，以确定引入的糖基化位点的利用程度。用蛋白印迹分析从稳定克隆群的24小时上清，结果显示在位置315处引入的糖基化位点被部分利用，约一半的完全加工后的分泌蛋白被糖基化。然而，如果145处的天然糖基化位点通过产生K143N+N145T取代转移到143处，则蛋白印记显示315位引入的糖基化位点被完全糖基化。
实施例5
在HEK293细胞中表达FVII
在T-25培养瓶中培养接种20％的汇合细胞系HEK293(ATCC#CRL-1573)，所用培养基为DMEM，高葡萄糖10％热灭活的FCS(Gibco/BRL Cat#10091)，5μg/ml植醌，使细胞生长直到汇合。汇合的单层细胞用1，2，5，10和20μg上述质粒p226，以Lipofectamine 2000为转染试剂(Life technologies)按照生产商的方法进行转染。转染后24小时对培养液取样。24小时瞬时表达实验中FVII的浓度平均为0.15μg/ml。
随后，给予细胞包含100μg/ml潮霉素B的选择培养基。每3或4天更新一次培养基，经3周选择后，在用1μg质粒DNA和2μg质粒DNA转染的培养瓶中，潮霉素抗性细胞已生长至汇合。收集五个培养瓶中每个瓶的细胞并汇总。获得表达天然人凝血因子VII的稳定转染子群，将其按照标准方法在液氮中冷冻。
实施例6
制备稳定表达FVII的HEK293细胞
将一小瓶HEK293 PF#226转染子解冻，并将细胞接种于含15ml DMEM高葡萄糖，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100 U/l青霉素，100μg/l链霉素(其用于之后的所有实验)的75cm2组织培养瓶中，生长24小时。收集细胞，将其稀释并以1/2细胞/孔的密度铺96孔微滴定平板。12天后，约20-100个细胞的集落出现于孔中，将仅包含一个集落的那些孔进行标记。再生长2天后，在所有孔中添加100μl培养基。两天后，改换所有仅含一个集落的孔中的培养基。第一批集落3天后转移到25cm2组织培养瓶中培养，根据汇合程度，在接下来的11天将集落转移到到25cm2组织培养瓶中培养。当在T-25组织培养瓶中生长到汇合时，更换培养基，使克隆持续24小时将FVII分泌到生长培养基中，然后收集上清，用COASET FVII酰胺分解试验来检测因子VII的存在。发现有一个克隆，C18，表达29μg/ml的FVII。
实施例7
FVII糖基化变体的表达，所述变体无酰胺分解活性，可抑制FVIIa的功能
用于表达活性位点脊突变体R290N+A292T和G291N的表达质粒，可基本按实施例3中所述方法构建。
用酰胺分解试验COASETFVII(参见上述)，评估两种FVII糖基化变体(R290N+A292T和G291N)抑制rFVIIa活性的能力。用Lipofectamin 2000将编码R290N+A292T的质粒PF#250和编码G291N的质粒PF#294转染至接近汇合的经血清培养的HEK293细胞中。转染后，将转染细胞在37℃ 5％的CO2下温育3小时，然后将培养基更换为无血清培养基(DMEM，ITS-A，Ex-Cyte，植醌，P/S)。转染的40小时后，收集培养液并离心使其澄清，以备分析。
用rFVIIa：0.0125ng，0.025ng，0.05ng，0.075ng和0.1ng，制作标准曲线。将两种无活性糖基化变体R290N+A292T和G291N中的任一种的50μl未稀释、2倍稀释、5倍稀释、10倍稀释和50倍稀释的培养液或模拟转染的培养液中加入0.025ng rFVIIa。在COASET FVII试验中，0.025ng的FVIIa相当于OD405＝0.35(第一轮)及OD405＝0.26(第二轮)的信号。
将得到的结果编辑在下表中：糖基化偶联物                稀释倍数                   OD405标准                                                0.35   0.26摹拟物                         50                   0.38   0.19
                           25                   0.31   0.16
                           10                   0.21   0.15
                           5                    0.22   0.14
                           1                    0.08   0.07R290N+A292T                    50                   0.23     -
                           25                   0.12     -
                           10                   0.07     -
                           5                    0.04     -
                           1                    0.04     -G291N                          50                   -      0.16
                           25                   -      0.08
                           10                   -      0.06
                           5                    -      0.05
                           1                    -      0.04
上述数据显示糖基化偶联物G291N和R290N+A292T抑制rFVIIa的功能。
实施例8
FVII的纯化和之后的活化
野生型因子VII和其偶联物的纯化在4℃进行。从表达所述偶联物(或野生型FVII)的细胞中获得的上清经无菌过滤(0.22μm)，在冷的超纯(milli Q)水中稀释两倍。加入EDTA至5mM，将pH调整到8.6，导电率低于10mS/cm。将样品装载至已于4℃用10mM pH8.6的Tris平衡的Q-Sepharose快速流动树脂(Pharmacia)。在上样后，用10mM Tris(pH8.6)，150mM NaCl洗涤层析柱，直到280nm的光吸收达到基线值。然后在10mM Tris(pH8.6)，100mMNaCl中平衡该层析柱。结合型偶联物(或野生型FVII)用10mM Tris(pH8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2洗脱。汇集富含偶联物(或野生型FVII)的级分，透析或使用Vivaspin浓缩装置(Vivascience)进行浓缩。
偶联物(或野生型FVII)的自我活化通过在10mM Tris(pH7.8-8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2中浓缩并温育所洗脱的蛋白获得。
另外，在37℃下，10mM Tris(pH7.4-8.0)，100mM NaCl，5mM CaCl2中，与CNBr-活化的Sepharose偶联的因子Xa可活化所述偶联物(或野生型FVII)。
将偶联物(或野生型FVIIa)通过缓冲液交换转移到含10mM CaCl2，50mM NaCl，3％甘露醇，0.05％Tween80，pH5.6缓冲的溶液中，过滤除菌并-80℃储存。
实施例9
FVII的N-末端PEG化
在pH5.5的含10mM柠檬酸钠，20mM氯化钙，100mM氯化钠的pH5.5缓冲液中，用M-PEG-CHO(M-ALD-5000，来自Shearwater)将因子FVII与分子量约5kDa的甲氧基聚乙二醇(mPEG)偶联。M-PEG-CHO以过量50-100倍的摩尔浓度存在，所述蛋白浓度为0.2-0.5mg/ml。反应以300-1500μl量分批进行，每次在室温下搅动1小时，添加过量500-1000倍的NaBH3CN，继续过夜温育，室温搅动。
PEG化的FVII经缓冲液交换转移到缓冲液A(10mM Tris，pH7.6)，并在4℃将其上样至已在缓冲液A中平衡过的mono Q柱(Pharmacia)上。用从0-100％B的梯度(10mM Tris，(pH7.6)，500mM NaCl)以40倍柱体积洗脱结合型蛋白。
实施例10
大鼠中药物动力学研究
野生型FVII和本发明偶联物均在1.3mg/ml甘氨酰-甘氨酸缓冲液(pH5.5，含1.5mg/ml CaCl2，30mg/ml甘露醇，0.1mg/ml polysorbat 80和3mg/ml NaCl)中配制。为了确定体内半寿期，各制剂以一次性静脉内快速(bolus)注射给予S-D(Sprague-Dawley)大鼠。注射在约10秒钟内缓慢给予，以降低因高Ca++浓度造成的潜在的心衰危险。从9只麻醉处死的大鼠中以适当的间隔，如注射后1分钟，15分钟，30分钟，45分钟和1小时，采集血样。将所述血样收集在含腺嘌呤(Sigma#C4431)及50μl柠檬酸-磷酸-葡萄糖溶液的lml试管中以避免凝血。采样后立即将样品储存于约0℃直到离心，然后收集柠檬酸化血浆上清用于分析。样品通过检测凝血活性的方法章节中所述一步凝血试验进行分析，然后计算半寿期。
            序列表<110>马克西根公司(Maxygen ApS)<120>凝血因子VII或VIIa样分子<130>0212WO100<140><141><160>11<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>406<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><221>M0D_RES<222>(6)..(35)<223>Xaa＝γ-羧基谷氨酸或谷氨酸<400>1Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa1               5                  10                  15Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys
         20                  25                  30Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp
    35                   40                  45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln
 50                  55                  60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65                  70                  75                  80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly
             85                  90                  95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys
        100                 105                 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr
    115                 120                 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg
130                 135                 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145                 150                 155                 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln
            165                 170                 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala
        180                 185                 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu
    195                 200                 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg
210                 215                 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225                 230                 235                 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp
            245                 250                 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr
        260                 265                 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu
    275                 280                 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg
290                 295                 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305                 310                 315                 320Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser
            325                 330                  335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr
        340                 345                 350Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys
    355                 360                 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile
370                 375                 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385                 390                 395                 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro
            405<210>2<211>1338<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(115)..(1335)<400>2atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct  60gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gcc    117
                                                        Ala
                                                          1aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc    165Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys
          5                  10                  15aaa gag gaa cag tgc agc ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac    213Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp
     20                  25                  30gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att agc tat agc gat ggc gat cag    261Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln
 35                  40                  45tgc gcc tcc agc cct tgc cag aac ggg ggc tcc tgc aaa gac cag ctg    309Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu50                  55                  60                  65cag agc tat atc tgc ttc tgc ctg cct gcc ttt gag ggg cgc aat tgc    357Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys
             70                  75                  80gaa acc cat aag gat gac cag ctg att tgc gtc aac gaa aac ggg ggc   405Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly
         85                  90                  95tgc gag cag tac tgc agc gat cac acg ggc acg aag cgg agc tgc cgc   453Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg
    100                 105                 110tgc cac gaa ggc tat agc ctc ctg gct gac ggg gtg tcc tgc acg ccc   501Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro
115                 120                 125acg gtg gaa tac cct tgc ggg aag att ccc att cta gaa aag cgg aac   549Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn130                 135                 140                 145gct agc aaa ccc cag ggc cgg atc gtc ggc ggg aag gtc tgc cct aag   597Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys
            150                 155                 160ggg gag tgc ccc tgg cag gtc ctg ctc ctg gtc aac ggg gcc cag ctg   645Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu
        165                 170                 175tgc ggc ggg acc ctc atc aat acc att tgg gtc gtg tcc gcc gct cac   693Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His
    180                 185                 190tgc ttc gat aag att aag aat tgg cgg aac ctc atc gct gtg ctc ggc   741Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly
195                 200                 205gaa cac gat ctg tcc gag cat gac ggg gac gaa cag tcc cgc cgg gtg   789Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val210                 215                 220                 225gct cag gtc atc att ccc tcc acc tat gtg cct ggc acg acc aat cac   837Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His
            230                 235                 240gat atc gct ctg ctc cgc ctc cac cag ccc gtc gtg ctc acc gat cac   885Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His
        245                 250                 255gtc gtg cct ctg tgc ctg cct gag cgg acc ttt agc gaa cgc acg ctg   933Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu
    260                 265                 270gct ttc gtc cgc ttt agc ctc gtg tcc ggc tgg ggc cag ctg ctc gac   981Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp
275                 280                 285cgg ggc gct acc gct ctc gag ctg atg gtg ctc aac gtc ccc cgg ctg   1029Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu290                 295                 300                 305atg acc cag gac tgc ctg cag cag tcc cgc aaa gtg ggg gac tcc ccc   1077Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro
            310                 315                 320aat atc acg gag tat atg ttt tgc gct ggc tat agc gat ggc tcc aag   1125Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys
        325                 330                 335gat agc tgc aag ggg gac tcc ggc ggg ccc cat gcc acg cac tat cgc   1173Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg
    340                 345                 350ggg acc tgg tac ctc acc ggg atc gtc agc tgg ggc cag ggc tgc gcc   1221Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala
355                 360                 365acg gtg ggg cac ttt ggc gtc tac acg cgc gtc agc cag tac att gag   1269Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu370                 375                 380                 385tgg ctg cag aag ctc atg cgg agc gaa ccc cgg ccc ggg gtg ctc ctg   1317Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu
            390                 395                 400cgg gcc cct ttc cct tga taa                                       1338Arg Ala Pro Phe Pro
        405<210>3<211>406<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu1               5                  10                  15Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys
         20                  25                  30Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp
     35                  40                  45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln
 50                  55                  60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65                  70                  75                  80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly
             85                  90                  95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys
        100                 105                 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr
    115                 120                 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg
130                 135                 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145                 150                 155                 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln
            165                 170                 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala
        180                 185                 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu
    195                 200                 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg
210                 215                 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225                 230                 235                 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp
            245                 250                 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr
        260                 265                 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu
    275                 280                 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg
290                 295                 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305                 310                 315                 320Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser
            325                 330                 335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr
        340                 345                 350Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys
    355                 360                 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile
370                 375                 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385                 390                 395                 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro
            405<210>4<211>1357<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：用于在哺乳动物细胞中表达FVII的表达盒<400>4ggatcccgcc accatggtca gccaggccct ccgcctcctg tgcctgctcc tggggctgca  60gggctgcctg gctgccgtct tcgtcaccca ggaggaagcc catggcgtcc tgcatcgccg  120gcgccgggcc aatgcctttc tggaagagct ccgccctggc tccctggaac gcgaatgcaa  180agaggaacag tgcagctttg aggaagcccg ggagattttc aaagacgctg agcggaccaa  240actgttttgg attagctata gcgatggcga tcagtgcgcc tccagccctt gccagaacgg  300gggctcctgc aaagaccagc tgcagagcta tatctgcttc tgcctgcctg cctttgaggg  360gcgcaattgc gaaacccata aggatgacca gctgatttgc gtcaacgaaa acgggggctg  420cgagcagtac tgcagcgatc acacgggcac gaagcggagc tgccgctgcc acgaaggcta  480tagcctcctg gctgacgggg tgtcctgcac gcccacggtg gaataccctt gcgggaagat  540tcccattcta gaaaagcgga acgctagcaa accccagggc cggatcgtcg gcgggaaggt  600ctgccctaag ggggagtgcc cctggcaggt cctgctcctg gtcaacgggg cccagctgtg  660cggcgggacc ctcatcaata ccatttgggt cgtgtccgcc gctcactgct tcgataagat  720taagaattgg cggaacctca tcgctgtgct cggcgaacac gatctgtccg agcatgacgg  780ggacgaacag tcccgccggg tggctcaggt catcattccc tccacctatg tgcctggcac  840gaccaatcac gatatcgctc tgctccgcct ccaccagccc gtcgtgctca ccgatcacgt  900cgtgcctctg tgcctgcctg agcggacctt tagcgaacgc acgctggctt tcgtccgctt  960tagcctcgtg tccggctggg gccagctgct cgaccggggc gctaccgctc tcgagctgat  1020ggtgctcaac gtcccccggc tgatgaccca ggactgcctg cagcagtccc gcaaagtggg  1080ggactccccc aatatcacgg agtatatgtt ttgcgctggc tatagcgatg gctccaagga  1140tagctgcaag ggggactccg gcgggcccca tgccacgcac tatcgcggga cctggtacct  1200caccgggatc gtcagctggg gccagggctg cgccacggtg gggcactttg gcgtctacac  1260gcgcgtcagc cagtacattg agtggctgca gaagctcatg cggagcgaac cccggcccgg  1320ggtgctcctg cgggcccctt tcccttgata aaagctt                           1357<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr174<400>5agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a                                31<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr175<400>6tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t                                31<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr216<400>7cttaaggatc ccgccaccat ggtcagccag                                  30<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr229<400>8ggagtccccg gttttgttgg actgctgc                                    28<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr221<400>9acttaagcttt tatcaaggg a                                           21<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr228<400>10gcagcagtcc aacaaaaccg gggactcc                                    28<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物CBProFpr226<400>11cattctagaa aaccggaccg ctagcaaacc                                  30

Claims (73)

1.一种偶联物，该偶联物包含至少一个与多肽共价连接的非多肽组分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1所示野生型FVII或FVIIa的氨基酸序列在于，其引入或去除了至少一个包含所述非多肽组分的连接基团的氨基酸残基。
2.权利要求1的偶联物，其中所述连接基团选自赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
3.权利要求2的偶联物，其中所述连接基团是赖氨酸。
4.权利要求3的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，其去除了至少一个赖氨酸残基。
5.权利要求4的偶联物，其中所述赖氨酸残基通过取代被去除。
6.权利要求4或5的偶联物，其中所述被去除的赖氨酸残基选自：K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其组合。
7.权利要求6的偶联物，其中所述赖氨酸残基选自：K18，K62，K85，K197，K341或其组合。
8.权利要求5-7中任一项的偶联物，其中所述赖氨酸残基被选自下组的氨基酸残基所取代：R，Q，N或H。
9.权利要求8的偶联物，其中所述赖氨酸残基被R所取代。
10.权利要求3-9中任一项的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：1在于，其引入了至少一个赖氨酸残基。
11.权利要求10的偶联物，其中所述赖氨酸残基通过取代被引入。
12.权利要求11的偶联物，其中所述取代选自：I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F405K或其组合。
13.权利要求12的偶联物，其中所述取代选自：R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其组合。
14.权利要求3-13中任一项的偶联物，其中去除了至少一个赖氨酸残基，并且引入了至少一个赖氨酸残基。
15.权利要求2的偶联物，其中所述连接基团是半胱氨酸。
16.权利要求15的偶联物，其中所述半胱氨酸残基通过取代被引入。
17.权利要求16的偶联物，其中所述取代选自：I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其组合。
18.权利要求17的偶联物，其中所述取代选自：K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其组合。
19.权利要求2的偶联物，其中所述连接基团是天冬氨酸和/或谷氨酸。
20.权利要求19的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，其引入了至少一个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基。
21.权利要求20的偶联物，其中所述天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基通过取代被引入。
22.权利要求21的偶联物，其中所述取代选自：I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其组合。
23.权利要求22的偶联物，其中所述取代选自K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E或其组合。
24.权利要求19的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，其去除了至少一个天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基。
25.权利要求24的偶联物，其中所述天冬氨酸残基和/或谷氨酸残基通过取代被去除。
26.权利要求25的偶联物，其中所述取代选自：D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其组合。
27.权利要求19-26中任一项的偶联物，其中引入了至少一个天冬氨酸和/或谷氨酸残基，并且去除了至少一个天冬氨酸和/或谷氨酸残基。
28.上述权利要求中任一项的偶联物，其中所述非多肽组分是聚合物分子。
29.权利要求28的偶联物，其中所述聚合物分子选自天然的或合成的均聚物或杂聚物。
30.权利要求29的偶联物，其中所述聚合物分子是合成的均聚物或杂聚物，其选自：线性的和分支的聚乙二醇，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚(乙烯吡咯烷酮)。
31.权利要求30的偶联物，所述聚合物是线性的或分支的聚乙二醇。
32.权利要求31的偶联物，其中所述聚乙二醇的分子量约为300-100000Da。
33.上述权利要求中任一项的偶联物，其中所述多肽与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列有1-15个氨基酸残基的差异。
34.权利要求1的偶联物，其中所述非多肽组分是糖组分，并且其中所述连接基团是糖组分的连接基团。
35.权利要求34的偶联物，其中所述连接基团是糖基化位点。
36.权利要求35的偶联物，其中引入了至少一个非天然产生的糖基化位点。
37.权利要求35的偶联物，其中去除了至少一个天然产生的糖基化位点。
38.权利要求36-37中任一项的偶联物，其中引入了至少一个非天然产生的糖基化位点，并且去除了至少一个天然产生的糖基化位点。
39.权利要求36的偶联物，其中所述引入的糖基化位点是体内糖基化位点。
40.权利要求39的偶联物，其中所述糖基化位点是体内的O-糖基化位点。
41.权利要求39的偶联物，其中所述糖基化位点是体内的N-糖基化位点。
42.权利要求41的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，至少一个天然产生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除丝氨酸和苏氨酸外的任何氨基酸。
43.权利要求41的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，SEQ ID NO：1中存在的至少一个天然产生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除天冬酰胺外的任何氨基酸。
44.权利要求42或43的偶联物，其中所述取代选自：F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，I230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N或其组合。
45.权利要求44的偶联物，其中所述取代选自：F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其组合。
46.权利要求41的偶联物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO：1在于，SEQ ID NO：1中存在的至少一个天然产生的K-X′-X或R-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除丝氨酸和苏氨酸外的任何氨基酸。
47.权利要求46的偶联物，其中所述取代选自：K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其组合。
48.权利要求41的偶联物，其中所述非天然产生的体内N-糖基化位点是通过取代引入的，取代的位置选自：28-48，139-147，286-294，311-319，338-345，388-406。
49.权利要求48的偶联物，其中所述取代选自：
K32N+A34ST，F31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T
或其组合。
50.权利要求49的偶联物，其中所述取代选自：K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T或其组合。
51.权利要求50的偶联物，其中所述取代选自：K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，K341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T，K143N+N145T+R315N+V317T或其组合。
52.权利要求34-51中任一项的偶联物，其中所述多肽与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列有1-15个氨基酸残基的差异。
53.权利要求39-52中任一项的偶联物，其中引入了两个或多个体内糖基化位点。
54.权利要求34-53中任一项的偶联物，该偶联物进一步包含至少一个与所述多肽的氨基酸残基共价连接的非多肽组分，其中所述非多肽组分与糖组分不同。
55.权利要求54的偶联物，其中所述非多肽组分是权利要求29-32中任一项定义的聚合物分子。
56.上述权利要求中任一项的偶联物，其中所述偶联物的分子量至少为67kDa。
57.上述权利要求中任一项的偶联物，其中所述偶联物已失活。
58.一种多肽，其具有权利要求1-56中任一项定义的氨基酸序列。
59.一种核苷酸序列，其编码权利要求58的多肽。
60.一种表达载体，其包含权利要求59的核苷酸序列。
61.一种宿主细胞，其包含权利要求59的核苷酸序列或权利要求60的表达载体。
62.权利要求61的宿主细胞，其中所述宿主细胞是可进行体内糖基化的γ-羧基化细胞。
63.一种制备权利要求1-57中任一项定义的偶联物的方法，该方法包括在有益于所述多肽表达的条件下培养权利要求61或62所定义的宿主细胞，并回收所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一个N-或O-糖基化位点，并且所述宿主细胞是可进行体内糖基化的真核宿主细胞，和/或b)使所述多肽在体外与一个非多肽组分偶联。
64.一种组合物，其包含权利要求1-57中任一项所定义的偶联物和一种可药用的载体或赋形剂。
65.权利要求1-57中任一项所定义的偶联物，所述偶联物用做药物。
66.权利要求1-56中任一项所定义的偶联物在制备用于治疗哺乳动物FVIIa/TF相关疾病的药物中的用途。
67.权利要求66的用途，其中FVIIa/TF相关疾病选自需要加强凝血的疾病。
68.权利要求57所定义的失活的偶联物在制备用于治疗哺乳动物FVIIa/TF相关疾病的药物中的用途。
69.权利要求68的用途，其中FVIIa/TF相关疾病选自需要减弱凝血的疾病。
70.一种治疗具有FVIIa/TF相关疾病的哺乳动物的方法，包括以有效剂量给予有需求的哺乳动物以权利要求1-56中任一项所定义的偶联物。
71.权利要求70的方法，其中所述疾病选自需要加强凝血的疾病。
72.一种治疗具有FVIIa/TF相关疾病的哺乳动物的方法，包括以有效剂量给予有需求的哺乳动物以权利要求57所定义的偶联物。
73.权利要求72的方法，其中所述疾病选自需要减弱凝血的疾病。
CNB018048641A 2000-02-11 2001-02-12 凝血因子VⅡ或VⅡa样分子 Expired - Fee Related CN100488562C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000218 2000-02-11
DKPA200000218 2000-02-11
DKPA200001558 2000-10-18
DKPA200001558 2000-10-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2009101282432A Division CN101503726A (zh) 2000-02-11 2001-02-12 凝血因子Ⅶ或Ⅶa样分子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1400910A true CN1400910A (zh) 2003-03-05
CN100488562C CN100488562C (zh) 2009-05-20

Family

ID=26068765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018048641A Expired - Fee Related CN100488562C (zh) 2000-02-11 2001-02-12 凝血因子VⅡ或VⅡa样分子

Country Status (18)

Country Link
US (13) US6806063B2 (zh)
EP (3) EP2319541A1 (zh)
JP (2) JP2003521930A (zh)
CN (1) CN100488562C (zh)
AT (1) ATE428445T1 (zh)
AU (3) AU783512B2 (zh)
CA (2) CA2739933A1 (zh)
CY (1) CY1109614T1 (zh)
DE (1) DE60138364D1 (zh)
DK (1) DK1257295T3 (zh)
ES (1) ES2325877T3 (zh)
IL (2) IL150692A0 (zh)
NO (1) NO20023804L (zh)
NZ (1) NZ521257A (zh)
PL (2) PL204285B1 (zh)
PT (1) PT1257295E (zh)
RU (1) RU2278123C2 (zh)
WO (1) WO2001058935A2 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1863908B (zh) * 2003-09-09 2010-08-04 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
CN102083459A (zh) * 2008-05-23 2011-06-01 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 包括含有peg化的gla-结构域的蛋白质的低粘度组合物
CN101014626B (zh) * 2004-05-31 2012-12-05 魅德秀专有限公社 糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素
CN103068854A (zh) * 2010-06-04 2013-04-24 Sk化学公司 具有因子vii活性的融合蛋白质
CN102083971B (zh) * 2008-04-11 2015-08-05 催化剂生物科学公司 修饰的因子ⅶ多肽及其应用
US9186323B2 (en) 2007-05-02 2015-11-17 Novo Nordisk Healthcare Ag High concentration factor VII polypeptide formulations comprising an aromatic preservative and an antioxidant
CN105148287A (zh) * 2004-11-12 2015-12-16 拜尔健康护理有限责任公司 Fviii的位点定向修饰
CN108265038A (zh) * 2010-12-03 2018-07-10 基因流股份有限公司 改善的光-发射分子

Families Citing this family (158)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6747003B1 (en) 1997-10-23 2004-06-08 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
EP1198565A1 (en) * 1999-07-07 2002-04-24 Maxygen Aps A method for preparing modified polypeptides
ATE428445T1 (de) * 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US7220837B1 (en) 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7812132B2 (en) * 2000-04-28 2010-10-12 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
BR0113854A (pt) 2000-09-13 2004-07-06 Novo Nordisk As Polipeptìdeo do fator vii, construção de ácido nucleìco, célula hospedeira recombinante animal transgênico, planta transgênica, método para produzir o polipeptìdeo do fator vii, composição farmacêutica, uso de um polipeptìdeo do fator vii, e, métodos para o tratamento de episódios de sangramento e para tratamento ou profilaxia de distúrbios de sangramento em um indivìduo ou para a intensificação do sistema hemostático normal
PL204888B1 (pl) * 2000-09-13 2010-02-26 Novo Nordisk Healthcare Ag Wariant polipeptydu czynnika VII, konstrukcja kwasu nukleinowego, rekombinowana komórka gospodarza, zwierzę transgeniczne, sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII
WO2002038162A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 The Scripps Research Institute MODIFIED FACTOR VIIa
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
EP1373493B1 (en) * 2001-03-22 2013-07-31 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii derivative
ATE532858T1 (de) * 2001-09-27 2011-11-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Menschliche gerinnungsfaktor-vii-polypeptide
US7052868B2 (en) 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
EP2322229B1 (en) * 2001-10-10 2016-12-21 Novo Nordisk A/S Remodeling and glycoconjugation of Factor IX
AU2002336919A1 (en) 2001-11-02 2003-05-12 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
US6960657B2 (en) * 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
US7125846B2 (en) 2001-11-09 2006-10-24 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and factor V polypeptides
AU2002351756A1 (en) 2001-12-21 2003-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
KR20040065278A (ko) * 2001-12-21 2004-07-21 노보 노르디스크 에이/에스 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물
WO2003075847A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Emory University NOVEL CURCUMINOID-FACTOR VIIa CONSTRUCTS AS SUPPRESSORS OF TUMOR GROWTH AND ANGIOGENESIS
US20050069551A1 (en) * 2002-03-08 2005-03-31 Emory University Cytotoxic compound-protein conjugates as suppressors of tumor growth and angiogenesis
CA2483478A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Maxygen Holdings Ltd. Factor vii or viia polypeptide variants
US20040009918A1 (en) * 2002-05-03 2004-01-15 Hanne Nedergaard Stabilised solid compositions of modified factor VII
EP1517710B1 (en) * 2002-06-21 2011-03-30 Novo Nordisk Health Care AG Pegylated factor vii glycoforms
EP2283856B1 (en) 2002-06-21 2017-09-20 Novo Nordisk Health Care AG Stabilised solid compositions of factor VIIa polypeptides
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
DE60315847T2 (de) * 2002-09-25 2008-05-15 Novo Nordisk Health Care Ag Varianten des menschliche koagulationsfaktors vii
US6911323B2 (en) * 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
AU2003266931B2 (en) * 2002-09-30 2010-01-21 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants having increased clotting activity
NZ542094A (en) 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
WO2004083421A1 (en) * 2003-03-18 2004-09-30 Novo Nordisk Health Care Ag Method for the production of gla-residue containing serine proteases
WO2004082708A2 (en) * 2003-03-18 2004-09-30 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid, aqueous, pharmaceutical compositions of factor vii polypeptides
US7771996B2 (en) * 2003-03-20 2010-08-10 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants
US7897734B2 (en) 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI1624891T2 (sl) 2003-05-06 2013-09-30 Biogen Idec Hemophilia Inc. Strjevalni faktor-FC himerni proteini za zdravljenje hemofilije
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
AU2004240553A1 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
MXPA05012476A (es) * 2003-05-23 2006-02-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Estabilizacion de proteina en solucion.
DK1644504T3 (da) * 2003-06-19 2010-05-25 Bayer Healthcare Llc Faktor VII- eller -VIIA-Gla-domænevarianter
WO2004112828A1 (en) 2003-06-25 2004-12-29 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
DE602004023848D1 (de) * 2003-07-01 2009-12-10 Novo Nordisk Healthcare Ag Von factor vii polypeptiden
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
WO2005025623A2 (en) * 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
WO2005014035A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
BRPI0413518A (pt) 2003-08-14 2006-10-10 Novo Nordisk Healthcare Ag composição farmacêutica lìquida aquosa, método para preparar e uso da mesma, método para tratar uma sìndrome responsiva ao fator vii, e, recipiente hermético
EP1664291B1 (en) * 2003-09-09 2012-02-29 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii polypeptides
JP2007509843A (ja) * 2003-10-07 2007-04-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子活性を有するハイブリッド分子
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
WO2005054275A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Novo Nordisk Health Care Ag Nanofiltration of factor vii solutions to remove virus
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
TR201809670T4 (tr) 2003-12-19 2018-07-23 Novo Nordisk Healthcare Ag Faktör VII polipeptitlerinin stabilize edilmiş kompozisyonları.
CN101072789B (zh) 2004-01-08 2013-05-15 生物种属学股份公司 肽的o-连接的糖基化
DK2842576T3 (en) * 2004-01-21 2017-10-16 Novo Nordisk Healthcare Ag Transglutaminase-mediated peptide conjugation
EP1761630A2 (en) * 2004-06-21 2007-03-14 Novo Nordisk Health Care AG Glycosylation-disrupted factor vii variants
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
US20090176967A1 (en) * 2004-08-02 2009-07-09 Novo Nordisk Healthcare A/G Conjugation of FVII
KR20070043051A (ko) * 2004-08-17 2007-04-24 쳇엘베 베링 게엠베하 변형된 비타민 ｋ 의존적 폴리펩타이드
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
JP2008525381A (ja) 2004-12-23 2008-07-17 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 関心のあるビタミンｋ依存性タンパク質を含んでなる組成物中におけるタンパク質混入物の量の減少
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US9187546B2 (en) * 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20080188400A1 (en) * 2005-04-26 2008-08-07 Maxygen Holdings Ltd. Methods For Treating Bleeding
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
AU2006273696B2 (en) * 2005-06-24 2012-08-30 Drugrecure Aps Airway administration of activated protein C in inflammatory conditions affecting the respiratory tract
EP1904528B1 (en) 2005-07-13 2012-10-31 Novo Nordisk Health Care AG Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007022784A2 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Maxygen Holdings Ltd. Liquid factor vii composition
ES2515915T3 (es) 2005-09-01 2014-10-30 Novo Nordisk Health Care Ag Purificación de los polipéptidos del Factor VII mediante cromatografía de interacción hidrofóbica
JP5690047B2 (ja) * 2005-09-14 2015-03-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド
US20090011992A1 (en) * 2005-09-21 2009-01-08 Novo Nordisk Healthcare A/G Human Coagulation Factor VII Polypeptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2004214B1 (en) * 2006-03-16 2012-11-07 STELLARIS PHARMACEUTICALS Aps Local treatment with factor vii
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
CN101466400B (zh) * 2006-04-07 2014-06-25 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 共价凝血因子ⅶ-组织因子复合物
KR101492422B1 (ko) * 2006-04-11 2015-02-12 체에스엘 베링 게엠베하 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법
CN104593348A (zh) * 2006-05-24 2015-05-06 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内半寿期的因子ix类似物
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
CN101495155A (zh) 2006-07-07 2009-07-29 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 新的蛋白结合物及其制备方法
WO2008009635A2 (en) * 2006-07-17 2008-01-24 Novo Nordisk Health Care Ag Factor viia analogues with increased activity for treating thrombocytopenia
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
FR2904558B1 (fr) * 2006-08-01 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees"
EP2059527B1 (en) 2006-09-01 2014-12-03 Novo Nordisk Health Care AG Modified glycoproteins
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
US8777971B2 (en) * 2006-10-17 2014-07-15 Amj Bv Device and method for joining vessels in anastomosis
CN103804489A (zh) 2006-12-15 2014-05-21 巴克斯特国际公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
KR101542752B1 (ko) 2006-12-22 2015-08-10 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자
US20100143326A1 (en) * 2007-01-03 2010-06-10 Novo Nordisk Healthcare A/G SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF COAGULATION FACTOR VIIa-RELATED POLYPEPTIDES
EP1972687A1 (en) * 2007-03-23 2008-09-24 GenOdyssee Polynucleotides and polypeptides of human factor VII gene, SNPs
KR20150064246A (ko) 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
EP2147096B1 (en) * 2007-04-13 2015-03-25 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor VII polypeptides and uses thereof
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
US20100268055A1 (en) * 2007-07-19 2010-10-21 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self-Anchoring MEMS Intrafascicular Neural Electrode
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
JP5613876B2 (ja) * 2007-10-15 2014-10-29 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 延長された半減期を備えるヒト第ｉｘ因子変異体
SI2235197T1 (sl) 2007-12-27 2017-10-30 Baxalta GmbH Procesi celične kulture
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
US20110137011A1 (en) * 2008-04-21 2011-06-09 Novo Nordisk A/S Hyperglycosylated human coagulation factor ix
EP2280734B1 (en) * 2008-04-24 2014-02-26 Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited Factor ix conjugates with extended half-lives
JP2011520999A (ja) * 2008-05-23 2011-07-21 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 高濃度の芳香族保存料を有するペグ官能化セリンプロテアーゼの製剤
AU2009279090A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
JP5816097B2 (ja) 2009-01-22 2015-11-18 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 安定な成長ホルモン化合物
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
EP2440239B1 (en) 2009-06-09 2017-09-13 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
WO2010149172A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Rigshospitalet SYSTEMIC PRO-HEMOSTATIC EFFECT OF CLOTTING FACTORS IN COMBINATION WITH SYMPATHICOMIMETICS WITH AGONISTIC EFFECTS ON α-ADRENERGIC AND/OR β-ADRENERGIC RECEPTORS OF THE SYMPATHETIC NERVOUS SYSTEM, RELATED TO IMPROVED CLOT STRENGTH.
RU2744370C2 (ru) * 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
TWI537006B (zh) * 2009-07-27 2016-06-11 巴克斯歐塔公司 凝血蛋白接合物
US8841249B2 (en) 2009-08-06 2014-09-23 Novo Nordisk A/S Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
WO2011018515A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
US20110150843A1 (en) * 2009-10-30 2011-06-23 National Institute Of Immunology Method for the therapeutic correction of hemophilia a by transplanting bone marrow cells
AU2011208625C1 (en) 2010-01-22 2022-08-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
AU2011208620B2 (en) 2010-01-22 2015-04-16 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
EP2717898B1 (en) 2011-06-10 2018-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
TWI565715B (zh) * 2011-10-06 2017-01-11 韓美科學股份有限公司 凝血因子VII及VIIa之衍生物、接合物及含該接合物之複合物與其用途
AU2013204636B2 (en) 2012-02-15 2016-04-14 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant Factor VIII proteins
PL3564260T3 (pl) 2012-02-15 2023-03-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Kompozycje czynnika viii oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania
MD20140123A2 (ro) * 2012-04-16 2015-04-30 Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited Agenţi terapeutici optimizaţi pentru administrare subcutanată
JP2015533152A (ja) 2012-10-15 2015-11-19 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 第ｖｉｉ因子コンジュゲート
EP2906693A1 (en) * 2012-10-15 2015-08-19 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii polypeptides
EP3572090B1 (en) 2012-12-24 2022-12-14 Coagulant Therapeutics Corporation Short-acting factor vii polypeptides
CN105120887A (zh) 2013-04-05 2015-12-02 诺和诺德保健股份有限公司 生长激素化合物制剂
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
BR112016008039A2 (pt) * 2013-10-15 2017-10-17 Novo Nordisk Healthcare Ag polipeptídeos do fator vii da coagulação
CN108472337B (zh) 2015-08-03 2022-11-25 比奥贝拉蒂治疗公司 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法
RU2633588C2 (ru) * 2015-11-03 2017-10-13 Евгений Федорович Чередников Способ эндоскопического лечения язвенного гастродуоденального кровотечения
US20210069306A1 (en) 2019-08-15 2021-03-11 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment
EP4058466A1 (en) 2019-11-13 2022-09-21 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same
AU2022376537A1 (en) * 2021-10-29 2024-05-16 Sigilon Therapeutics, Inc. Compositions for cell-based therapies and related methods

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
ATE93541T1 (de) 1985-07-03 1993-09-15 Genencor Int Hybride polypeptide und verfahren zu deren herstellung.
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
WO1987002670A1 (en) 1985-10-25 1987-05-07 Mackay Vivian L Method of using bar1 for secreting foreign proteins
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5258288A (en) * 1986-07-25 1993-11-02 Genzyme Corporation Vector containing DNA encoding mature human protein S
DK323587D0 (da) 1987-06-25 1987-06-25 Novo Industri As Protein
JP2799316B2 (ja) 1987-06-12 1998-09-17 ヘキスト・マリオン・ルセル株式会社 雑種ヒトプロテインｃおよびその遺伝子工学的製法
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5648254A (en) 1988-01-15 1997-07-15 Zymogenetics, Inc. Co-expression in eukaryotic cells
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
JPH0246296A (ja) 1988-08-09 1990-02-15 Hoechst Japan Ltd 雑種プロテインｃ及びその製造方法
JP2928287B2 (ja) * 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
WO1990005783A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 Cetus Corporation Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins
US5041376A (en) 1988-12-09 1991-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method for identifying or shielding functional sites or epitopes of proteins that enter the exocytotic pathway of eukaryotic cells, the mutant proteins so produced and genes encoding said mutant proteins
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
HUT64022A (en) 1989-04-19 1993-11-29 Enzon Inc Process for producing active polyalkileneoxide carbonates for the modification of polypeptides
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5093317A (en) * 1989-06-05 1992-03-03 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factor
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US4973317A (en) 1989-07-14 1990-11-27 Bobrove Arthur M Automatic sheath protection of hypodermic needle
US5023328A (en) 1989-08-04 1991-06-11 The Texas A&M University System Lepidopteran AKH signal sequence
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5225537A (en) 1989-12-29 1993-07-06 Zymogenetics, Inc. Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins
JP2549224B2 (ja) 1990-01-26 1996-10-30 イムノ・アクチェンゲゼルシャフト 組換えにより産生される血液因子及びその血液因子の発現方法並びにその方法に使用されるワクシニアウイルス組換え体
EP0521873B1 (en) * 1990-01-29 1999-06-02 Zymogenetics, Inc. Anticoagulant proteins
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5583107A (en) 1990-09-04 1996-12-10 Cor Therapeutics, Inc. Agents affecting thrombosis and hemostasis
US5531916A (en) 1990-10-03 1996-07-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hydrofluorocarbon cleaning compositions
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
EP0785273A1 (en) 1990-11-26 1997-07-23 Genetics Institute, Inc. Paired basic amino acid converting enzyme and DNA sequence encoding it
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5833982A (en) * 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5817788A (en) * 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
DE69233398D1 (de) 1991-02-28 2004-09-16 Novo Nordisk As Modifizierter faktor-vii
CA2101918A1 (en) 1991-03-18 1992-09-19 Samuel Zalipsky Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5504064A (en) * 1991-04-10 1996-04-02 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with an activator of FVII
DE4113487C1 (zh) 1991-04-25 1992-11-05 Fleischgrosshandel Hans-Werner & Bernd Meixner Gmbh, 6301 Wettenberg, De
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
DK38293D0 (da) 1993-03-31 1993-03-31 Novo Nordisk As Fremstilling af proteiner
US5871384A (en) * 1993-04-20 1999-02-16 Kichijo; Hiroshi Block assembly and devices formed thereby
JPH0720127A (ja) * 1993-05-07 1995-01-24 Eisai Co Ltd 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬
EP0699075B1 (en) 1993-05-21 2001-12-12 Zymogenetics, Inc. MODIFIED FACTOR VII for inhibiting vascular restenosis and platelet deposition
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
WO1995000162A1 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
PT730470E (pt) 1993-11-10 2002-08-30 Enzon Inc Conjugados melhorados de interferao-polimero
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
WO1995033490A1 (en) 1994-06-02 1995-12-14 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
EP1559776A3 (en) 1994-06-30 2006-01-11 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic Fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE4437604A1 (de) 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
CA2204726A1 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Robin E. Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
AU6655496A (en) 1995-08-11 1997-03-12 Novo Nordisk A/S Method for preparing polypeptide variants
DE19531637A1 (de) 1995-08-28 1997-03-06 Immuno Ag Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Blutgerinnungsstörugnen, Verfahren zur Herstellung derselben und deren Verwendung
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0964702B1 (en) 1996-08-02 2006-10-04 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
ES2265159T3 (es) * 1996-11-08 2007-02-01 Oklahoma Medical Research Foundation Uso de una proteina c modificada.
US5837843A (en) * 1996-11-08 1998-11-17 Oklahoma Medical Research Foundation Modified protein C
WO1998032867A1 (en) 1997-01-24 1998-07-30 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
AU5773798A (en) 1997-01-29 1998-08-18 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
CN1246891A (zh) * 1997-02-06 2000-03-08 诺沃挪第克公司 添加和/或除去了连接基团的多肽－聚合物偶联物
US6323322B1 (en) 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
NZ334068A (en) 1997-06-06 2000-07-28 Kyowa Hakko Kogyo Kk Polypeptides chemically modified with polyalkylene glycol derivatives
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
WO1999003887A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
JP2001510168A (ja) 1997-07-18 2001-07-31 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ＦＶＩＩａ媒介性細胞内シグナル伝達経路に関連する反対条件の処理のためのＦＶＩＩａ又はＦＶＩＩａｉの使用
US6693075B1 (en) * 1997-10-23 2004-02-17 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6017882A (en) 1997-10-23 2000-01-25 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6747003B1 (en) * 1997-10-23 2004-06-08 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
JP4574007B2 (ja) 1998-04-28 2010-11-04 メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
AT408613B (de) 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
CA2348938A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 Novozymes A/S Low allergenic protein variants
ES2289824T3 (es) 1998-10-30 2008-02-01 Novozymes A/S Proteinas glicosiladas con alergenicidad reducida.
WO2000028065A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Novo Nordisk A/S Method for the production of fvii
WO2000042560A2 (en) 1999-01-19 2000-07-20 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides
WO2000054787A1 (en) 1999-03-16 2000-09-21 The Children's Hospital Of Philadelphia Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors
US6432826B1 (en) * 1999-11-29 2002-08-13 Applied Materials, Inc. Planarized Cu cleaning for reduced defects
ATE428445T1 (de) 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US7220837B1 (en) 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
EP1282693B1 (en) 2000-05-03 2010-10-20 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii variants
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) * 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
PL204888B1 (pl) 2000-09-13 2010-02-26 Novo Nordisk Healthcare Ag Wariant polipeptydu czynnika VII, konstrukcja kwasu nukleinowego, rekombinowana komórka gospodarza, zwierzę transgeniczne, sposób wytwarzania wariantu polipeptydu czynnika VII, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie wariantu polipeptydu czynnika VII
BR0113854A (pt) * 2000-09-13 2004-07-06 Novo Nordisk As Polipeptìdeo do fator vii, construção de ácido nucleìco, célula hospedeira recombinante animal transgênico, planta transgênica, método para produzir o polipeptìdeo do fator vii, composição farmacêutica, uso de um polipeptìdeo do fator vii, e, métodos para o tratamento de episódios de sangramento e para tratamento ou profilaxia de distúrbios de sangramento em um indivìduo ou para a intensificação do sistema hemostático normal
WO2002029045A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Novo Nordisk A/S Method for the production of vitamin k-dependent proteins
WO2002038162A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 The Scripps Research Institute MODIFIED FACTOR VIIa
CA2483478A1 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Maxygen Holdings Ltd. Factor vii or viia polypeptide variants
AU2003266931B2 (en) 2002-09-30 2010-01-21 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants having increased clotting activity
US7771996B2 (en) 2003-03-20 2010-08-10 Bayer Healthcare Llc FVII or FVIIa variants
DK1644504T3 (da) 2003-06-19 2010-05-25 Bayer Healthcare Llc Faktor VII- eller -VIIA-Gla-domænevarianter

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1863908B (zh) * 2003-09-09 2010-08-04 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
CN101014626B (zh) * 2004-05-31 2012-12-05 魅德秀专有限公社 糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素
CN105148287B (zh) * 2004-11-12 2019-07-09 拜尔健康护理有限责任公司 Fviii的位点定向修饰
CN105148287A (zh) * 2004-11-12 2015-12-16 拜尔健康护理有限责任公司 Fviii的位点定向修饰
CN105753968A (zh) * 2004-11-12 2016-07-13 拜尔健康护理有限责任公司 Fviii的位点定向修饰
US9186323B2 (en) 2007-05-02 2015-11-17 Novo Nordisk Healthcare Ag High concentration factor VII polypeptide formulations comprising an aromatic preservative and an antioxidant
CN102083971B (zh) * 2008-04-11 2015-08-05 催化剂生物科学公司 修饰的因子ⅶ多肽及其应用
CN102083459A (zh) * 2008-05-23 2011-06-01 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 包括含有peg化的gla-结构域的蛋白质的低粘度组合物
CN103068854A (zh) * 2010-06-04 2013-04-24 Sk化学公司 具有因子vii活性的融合蛋白质
US9644197B2 (en) 2010-06-04 2017-05-09 Sk Chemicals Co., Ltd. Fusion protein having factor VII activity
US10696960B2 (en) 2010-06-04 2020-06-30 Tiumbio Co., Ltd. Fusion protein having factor VII activity
CN108265038A (zh) * 2010-12-03 2018-07-10 基因流股份有限公司 改善的光-发射分子
US11661587B2 (en) 2010-12-03 2023-05-30 Promega Corporation Light-emitting molecules

Also Published As

Publication number Publication date
US20090023635A1 (en) 2009-01-22
EP1257295A2 (en) 2002-11-20
US7442524B2 (en) 2008-10-28
CA2397347A1 (en) 2001-08-16
NO20023804D0 (no) 2002-08-09
US20060252690A1 (en) 2006-11-09
AU2006200448B2 (en) 2009-11-12
US20060252689A1 (en) 2006-11-09
EP2319541A1 (en) 2011-05-11
AU2010200296A1 (en) 2010-02-18
US7598056B2 (en) 2009-10-06
ES2325877T3 (es) 2009-09-23
IL150692A0 (en) 2003-02-12
US8084591B2 (en) 2011-12-27
US6806063B2 (en) 2004-10-19
CA2739933A1 (en) 2001-08-16
PL206148B1 (pl) 2010-07-30
US7517974B2 (en) 2009-04-14
US20030096338A1 (en) 2003-05-22
US20070243588A1 (en) 2007-10-18
US7414022B2 (en) 2008-08-19
AU2006200448A1 (en) 2006-03-02
NO20023804L (no) 2002-09-25
EP1982732A3 (en) 2011-06-08
JP2005270110A (ja) 2005-10-06
US7754682B2 (en) 2010-07-13
US20060252127A1 (en) 2006-11-09
PL362856A1 (en) 2004-11-02
US20060240525A1 (en) 2006-10-26
EP1257295B1 (en) 2009-04-15
US20060228782A1 (en) 2006-10-12
WO2001058935A3 (en) 2001-11-29
AU3153501A (en) 2001-08-20
RU2002124129A (ru) 2004-03-20
IL199497A0 (en) 2011-07-31
DE60138364D1 (de) 2009-05-28
ATE428445T1 (de) 2009-05-15
CY1109614T1 (el) 2014-08-13
IL199497A (en) 2013-08-29
DK1257295T3 (da) 2009-08-10
CA2397347C (en) 2011-07-12
AU783512B2 (en) 2005-11-03
US20060019336A1 (en) 2006-01-26
EP1982732A2 (en) 2008-10-22
NZ521257A (en) 2004-10-29
JP4509846B2 (ja) 2010-07-21
US20070142280A1 (en) 2007-06-21
PT1257295E (pt) 2009-07-16
US7427592B2 (en) 2008-09-23
CN100488562C (zh) 2009-05-20
PL204285B1 (pl) 2009-12-31
US20120171765A1 (en) 2012-07-05
RU2278123C2 (ru) 2006-06-20
JP2003521930A (ja) 2003-07-22
US7511024B2 (en) 2009-03-31
US20060240524A1 (en) 2006-10-26
US7371543B2 (en) 2008-05-13
WO2001058935A2 (en) 2001-08-16
US20060258585A1 (en) 2006-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1400910A (zh) 凝血因子VⅡ或VⅡa样分子
CN1665925A (zh) 凝血因子Ⅶ或Ⅶa多肽变体
EP1549677B1 (en) FVII OR FVIIa VARIANTS HAVING INCREASED CLOTTING ACTIVITY
CN1839203A (zh) 因子VII或VIIa的GLA结构域变体
CN101503726A (zh) 凝血因子Ⅶ或Ⅶa样分子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Free format text: FORMER OWNER: MAXIGEN HOLDINGS CO., LTD.

Effective date: 20050408

Owner name: MAXIGEN HOLDINGS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: MARKCHIGAN CO.,LTD.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20050408

Address after: Cayman Islands

Applicant after: Maxygen Holdings Ltd.

Address before: Holm Hess, Denmark

Applicant before: Maxygen Inc.

Co-applicant before: Maxygen Holdings Ltd.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090520

Termination date: 20160212