PL204285B1 - Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego - Google Patents

Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego

Info

Publication number
PL204285B1
PL204285B1 PL362856A PL36285601A PL204285B1 PL 204285 B1 PL204285 B1 PL 204285B1 PL 362856 A PL362856 A PL 362856A PL 36285601 A PL36285601 A PL 36285601A PL 204285 B1 PL204285 B1 PL 204285B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
conjugate
fvii
fviia
Prior art date
Application number
PL362856A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362856A1 (pl
Inventor
Kim Vilbour Andersen
Anders Hjelholt Pedersen
Claus Bornaes
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare Llc filed Critical Bayer Healthcare Llc
Publication of PL362856A1 publication Critical patent/PL362856A1/pl
Publication of PL204285B1 publication Critical patent/PL204285B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są koniugat polipeptydowy o zdolności tworzenia skrzepu, polipeptyd zawierający jedno wprowadzone miejsce N-glikozylacji, sekwencja nukleotydowa kodująca taki polipeptyd, wektor ekspresyjny zawierający taką sekwencję nukleotydową, komórka gospodarz zawierająca taką sekwencję nukleotydową lub taki wektor ekspresyjny, sposób wytwarzania takiego koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny zawierający taki koniugat polipeptydowy i zastosowanie takiego koniugatu polipeptydowego.
Krzepnięcie krwi jest procesem stanowiącym złożone oddziaływanie różnych składników (lub czynników) krwi, który ostatecznie powoduje wytworzenie skrzepu fibrynowego. Ogólnie składniki krwi uczestniczące w tym, co nazwano „kaskadą” krzepnięcia są proenzymami i zymogenami, czyli enzymatycznie nieczynnymi białkami, które są przekształcane do formy aktywnej przez działanie aktywatora. Jednym z tych czynników krzepnięcia jest FVII.
FVII jest zależnym od witaminy K osoczowym białkiem syntetyzowanym w wątrobie i wydzielanym do krwi w postaci jednołańcuchowej glikoproteiny o masie cząsteczkowej 53 kDa (Broze i Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255:1242-1247). Zymogen FVII jest przekształcany do formy aktywnej (FVIIa) przez proteolityczne przecięcie w jednym miejscu, R152-I153, co powoduje powstanie dwóch łańcuchów połączonych przez jeden mostek dwusiarczkowy. FVIIa w kompleksie z czynnikiem tkankowym (kompleks FVIIa) potrafi przekształcać zarówno czynnik IX, jak i czynnik X do ich form aktywnych, a nastę pnie poprzez reakcje prowadzi do gwał townego wytwarzania trombiny i tworzenia fibryny (0sterud i Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74 : 5260-5264).
FVII ulega modyfikacjom potranslacyjnym, obejmującym zależną od witaminy K karboksylację w wyniku, której w regionie N-końcowym powstaje 10 reszt kwasu γ-karboksyglutaminowego. Zatem, reszty numer 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 i 35 przedstawione na SEQ ID NO: 1 są resztami kwasu γ-karboksyglutaminowego w domenie Gla ważnej dla aktywności FVII. Inne modyfikacje potranslacyjne obejmują przyłączenie reszt cukrowych w dwóch naturalnie występujących miejscach N-glikozylacji odpowiednio w pozycjach 145 i 322 oraz w dwóch naturalnie występujących miejscach O-glikozylacji odpowiednio w pozycjach 52 i 60.
Gen kodujący ludzki FVII (hFVII) zmapowano na chromosomie 13 w q34-qter 9 (de Grouchy i inni, Hum Genet 1984; 66:230-233). Zawiera on dziewięć eksonów i obejmuje 12,8 Kb (O'Hara i inni, Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:5158-5162). Organizacja genu i struktura białkowa FVII są podobne jak w przypadku innych zależnych od witaminy K białek prokoagulacyjnych, z eksonami 1a i 1b kodującymi sekwencję sygnałową, eksonem 2 kodującym propeptyd i domenę Gla, eksonem 3 kodującym krótki region hydrofobowy, eksonami 4 i 5 kodującymi domeny typu naskórkowego czynnika wzrostu oraz eksonami 6 do 8 kodującymi domenę katalityczną proteazy serynowej (Yoshitake i inni, Biochemistry 1985; 24:3736-3750).
Opisano eksperymentalną trójwymiarową strukturę hFVIIa (Pike i inni, PNAS. U.S.A., 1999; 96:8925-30, oraz Kemball-Cook i inni, J. Struct. Biol, 1999; 127:213-223), hFVIIa w kompleksie z rozpuszczalnym czynnikiem tkankowym z zastosowaniem metod krystalografii rentgenowskiej (Banner i inni, Nature, 1996; 380:41 oraz Zhang i inni, J.Mol.Biol, 1999; 285:2089) oraz mniejszych fragmentów hFVII (Muranyi i inni, Biochemistry, 1998; 37:10605 oraz Kao i inni, Biochemistry, 1999; 38:7097).
Opisano stosunkowo niewiele wariantów FVII wytworzonych metodami inżynierii genetycznej (Dickinson i Ruf, J Biol Chem, 1997; 272:19875-19879, Kemball-Cook i inni, J Biol Chem, 1998; 273:8516-8521, Bharadwaj i inni, J Biol Chem, 1996; 271:30685-30691, Ruf i inni, Biochemistry, 1999; 38:1957-1966).
Opisano ekspresję FVII w BHK lub innych komórkach ssaczych (WO92/15686, WO91/11514 oraz WO88/10295) oraz koekspresję FVII i endoproteazy kex2 w komórkach eukariotycznych (WO00/28065).
Handlowe preparaty ludzkiego zrekombinowanego FVIIa są sprzedawane jako NovoSeven®. NovoSeven® jest wskazany w leczeniu krwawienia u pacjentów z hemofilią A lub B. NovoSeven® jest jedynym dostępnym na rynku rFVIIa do skutecznego i niezawodnego leczenia krwawienia.
Nieaktywną formę FVII, w której arginina 152 i/lub izoleucyna 153 jest/są zmodyfikowane opisano w WO91/1154. Aminokwasy są umieszczone w miejscu aktywacji. WO 96/12800 opisuje inaktywację FVIIa przez inhibitor proteinazy serynowej; inaktywację przez karbamylowanie FVIIa w grupie α-aminowej I153 opisano w Petersen i inni, Eur J Biochem, 1999; 261:124-129. Zinaktywowana postać potrafi współzawodniczyć z FVII lub FVIIa typu dzikiego o wiązanie czynnika tkankowego i hamować aktywność krzepnięcia.
PL 204 285 B1
Sugeruje się, że inaktywowaną FVIIa można stosować u pacjentów w stanach nadkrzepliwości, tak jak u pacjentów z posocznicą , ryzykiem zawału mięśnia sercowego lub udarem zakrzepowym.
Okres półtrwania krążącego rFVIIa wynoszący 2,3 godzin opisano w „Summary Basis for Approval for NovoSeven®”, FDA nr odnośnika 96-0597. Aby osiągnąć i utrzymać wymagane działanie terapeutyczne lub profilaktyczne potrzebne są stosunkowo wysokie dawki i częste podawanie. W konsekwencji odpowiednie wyregulowanie dawek jest trudne do osiągnięcia i potrzeba częstego podawania dożylnego narzuca ograniczenia w trybie życia pacjenta.
Innym problemem w obecnym leczeniu rFVIIa jest stosunkowa niestabilność cząsteczki w związku z rozkładem proteolitycznym. Rozkład proteolityczny jest główną przeszkodą w uzyskaniu preparatu w roztworze w przeciwieństwie do liofilizowanego produktu. Zaletę otrzymania trwałego rozpuszczalnego preparatu stanowi łatwiejsze posługiwanie się nim przez pacjenta oraz, w przypadku nagłych wypadków, szybszym działaniu, co potencjalnie może uratować życie. Próbę przeciwdziałania rozkładowi proteolitycznemu przez ukierunkowaną mutagenezę w głównych miejscach proteolitycznych opisano w WO88/10295.
Cząsteczka o dłuższym okresie półtrwania w krążeniu zmniejszyłaby liczbę niezbędnych przypadków podawania. Biorąc pod uwagę, że obecny produkt FVIIa jest związany z częstymi zastrzykami, oraz potencjalną możliwość uzyskania bardziej optymalnych terapeutycznych poziomów FVIIa z równoczesnym zwiększonym działaniem terapeutycznym, istnieje wyraźna potrzeba znalezienia ulepszonych cząsteczek FVII lub FVIIa-podobnych.
Jedną z metod wydłużenia okresu półtrwania białka jest sprawienie, aby klirens tego białka w nerkach był obniżony. Moż na to osią gnąć przez sprzęgnięcie białka z ugrupowaniem chemicznym, które jest zdolne do spowodowania zmniejszonego klirensu tego białka w nerkach.
Ponadto przyłączenie ugrupowania chemicznego do białka lub podstawienie aminokwasów wystawionych na proteolizę może skutecznie zablokować kontakt z enzymem proteolitycznym prowadzący do proteolitycznego rozkładu białka. Glikol propylenowy (PEG) jest jednym z ugrupowań chemicznych, które stosowano do wytwarzania terapeutycznych produktów białkowych.
WO98/32466 sugeruje, że FVII, tak jak inne białka, może być PEG-ilowany, ale nie zawiera jakiejkolwiek informacji na ten temat.
Zgłoszenie ujawnia ulepszone cząsteczki FVII i FVIIa, w szczególności zrekombinowane cząsteczki hFVII i hFVIIa, dostarczające jedną lub większą liczbę z powyżej wymienionych wymaganych korzyści. Zatem koniugat według wynalazku wykazuje jedną lub większą liczbę ulepszonych właściwości w porównaniu z dostępnym w handlu rFVIIa, włącznie z wydłużonym funkcjonalnym okresem półtrwania in vivo i/lub wydłużonym okresem półtrwania w osoczu i/lub zmniejszonym rozkładem proteolitycznym. W konsekwencji leczenie medyczne koniugatem według wynalazku posiada wiele zalet w porównaniu z obecnie dostępnym związkiem rFVIIa, takich jak dłuższe przerwy pomiędzy zastrzykami.
Wynalazek dotyczy koniugatu polipeptydowego o zdolności tworzenia skrzepu, charakteryzującego się tym, że zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która różni się od sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VII (hFVII) lub ludzkiego czynnika VIla (hFVIIa) przedstawionej w SEQ ID NO: 1 o nie więcej niż 15 reszt aminokwasowych oraz zawiera miejsce N-glikozylacji in vivo wprowadzone przez podstawienie T106N lub V253N, oraz ugrupowanie cukrowe kowalencyjnie przyłączone do tego miejsca N-glikozylacji in vivo.
Wynalazek dotyczy także polipeptydu zawierającego jedno wprowadzone miejsce N-glikozylacji, który to polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową, która różni się od sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VII (hFVII) lub ludzkiego czynnika VIla (hFVIIa) przedstawionej w SEQ ID NO: 1 o nie więcej niż 15 reszt aminokwasowych oraz zawiera miejsce N-glikozylacji in vivo wprowadzone przez podstawienie T106N lub V253N.
Takie nowe polipeptydy FVII uważa się za użyteczne jako takie do terapii, diagnostyki lub do innych celów, ale znajdują szczególne zainteresowanie jako produkty pośrednie do wytwarzania koniugatów według wynalazku.
Wynalazek dotyczy także sekwencji nukleotydowej kodującej określony powyżej polipeptyd.
Wynalazek dotyczy także wektora ekspresyjnego zawierającego określoną powyżej sekwencję nukleotydową.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza zawierającej określoną powyżej sekwencję nukleotydową lub określony powyżej wektor ekspresyjny, która to komórka gospodarz jest komórką γ-karboksylującą zdolną do glikozylacji in vivo.
PL 204 285 B1
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania określonego powyżej koniugatu polipeptydowego, charakteryzującego się tym, że hoduje się określoną powyżej komórkę gospodarza w warunkach prowadzenia ekspresji polipeptydu, oraz odzyskuje się polipeptyd, przy czym komórka gospodarz jest komórką eukariotyczną zdolną do glikozylacji in vivo.
Korzystnie w odniesieniu do powyższego sposobu według wynalazku jako komórkę gospodarza hoduje się komórkę ssaczą, a korzystniej komórkę CHO, komórkę BHK lub komórkę HEK.
Wynalazek dotyczy także środka farmaceutycznego charakteryzującego się tym, że zawiera określony powyżej koniugat polipeptydowy oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.
Wynalazek dotyczy ponadto określonego powyżej koniugatu polipeptydowego do stosowania jako lek.
Wynalazek dotyczy także zastosowania określonego powyżej koniugatu polipeptydowego do wytwarzania leku do leczenia u ssaka choroby lub zaburzenia, w którym pożądane jest zwiększone tworzenie się skrzeplin.
Korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania według wynalazku chorobę lub zaburzenie stanowi hemofilia.
Ponadto korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania według wynalazku chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane urazem.
Ponadto korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania według wynalazku chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane operacją chirurgiczną.
Ponadto korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania według wynalazku chorobę lub zaburzenie stanowi małopłytkowość.
Ponadto korzystnie w odniesieniu do powyższego zastosowania według wynalazku chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane uszkodzeniem tkanki.
W kontekś cie zgł oszenia i wynalazku stosowne są poniż sze definicje.
Określenie „koniugat” (lub zamiennie „sprzężony polipeptyd”) oznacza heterogeniczną, (czyli złożoną lub chimeryczną) cząsteczkę utworzoną przez kowalencyjne przyłączenie jednego lub większej liczby polipeptydów do jednego lub większej liczby ugrupowań niepolipeptydowych, takich jak cząsteczki polimerów, związki lipofilowe, ugrupowania cukrowe lub organiczne środki derywatyzujące. Korzystnie koniugat jest rozpuszczalny w odpowiednich stężeniach lub warunkach, czyli rozpuszczalny w płynach fizjologicznych, takich jak krew. Do przykładów sprzężonych polipeptydów według wynalazku należą glikozylowane i/lub PEG-ilowane polipeptydy.
Określenie „kowalencyjne przyłączenie” oznacza, że polipeptyd i ugrupowanie niepolipeptydowe są albo bezpośrednio kowalencyjnie połączone ze sobą lub inaczej, niebezpośrednio kowalencyjnie połączone ze sobą przez pośredniczące ugrupowanie lub ugrupowania, takie jak mostek, łącznik lub łącznikowe ugrupowanie lub ugrupowania.
Określenie „niesprzężony polipeptyd” można stosować do polipeptydowej części koniugatu.
Stosowane tu określenie „ugrupowanie niepolipeptydowe” oznacza cząsteczkę zdolną do sprzęgnięcia z grupą przyłączającą polipeptydu według wynalazku. Korzystne przykłady takich cząsteczek obejmują cząsteczki polimerów, ugrupowania cukrowe, związki lipofilowe lub organiczne środki derywatyzujące. Gdy określenie stosuje się w kontekście koniugatu według wynalazku należy rozumieć, że ugrupowanie niepolipeptydowe jest przyłączone do polipeptydowej części koniugatu przez grupę przyłączającą polipeptydu. Jak wyjaśniono powyżej, ugrupowanie niepolipeptydowe może być bezpośrednio kowalencyjnie przyłączone do grupy przyłączającej lub niebezpośrednio kowalencyjnie przyłączone do grupy przyłączającej przez pośredniczące ugrupowanie lub ugrupowania, takie jak mostek, łącznik lub ugrupowanie lub ugrupowania łącznikowe.
„Cząsteczka polimeru” jest cząsteczką utworzoną przez kowalencyjne połączenie dwóch lub większej liczby monomerów, w której żaden z monomerów nie jest resztą aminokwasową, z wyjątkiem przypadku, gdy polimerem jest ludzka albumina lub inne białko występujące w osoczu w dużej ilości. Określenie ,,polimer” można stosować zamiennie z określeniem „cząsteczka polimeru”. Określenie obejmuje cząsteczki węglowodanów przyłączone przez glikozylację in vitro, czyli sztuczną glikozylację przeprowadzoną in vitro, normalnie obejmującą kowalencyjne przyłączenie cząsteczki węglowodanu do grupy przyłączającej polipeptydu, ewentualnie z użyciem środka sieciującego.
Cząsteczki węglowodanów przyłączone drogą glikozylacji in vivo, np. N- lub O-glikozylacji (jak to dokładniej opisano poniżej) określa się tutaj jako „ugrupowania cukrowe”. Z wyjątkiem przypadku, gdy liczba ugrupowań niepolipeptydowych, takich jak cząsteczka (cząsteczki) polimeru lub ugrupowania cukrowe w koniugacie, jest wyraźnie wskazana, każde odniesienie do „ugrupowania niepolipeptydowego” zawartego
PL 204 285 B1 w koniugacie lub inaczej stosowanego w opisie jest odniesieniem do jednego lub większej liczby ugrupowań niepolipeptydowych, takich jak cząsteczka(ki) polimeru lub ugrupowania cukrowe.
Określenie „grupa przyłączająca” oznacza grupę funkcyjną polipeptydu, w szczególności jego resztę aminokwasową lub ugrupowanie węglowodanowe, zdolną do przyłączenia ugrupowania niepolipeptydowego, takiego jak cząsteczka polimeru, cząsteczka lipofilowa, ugrupowanie cukrowe lub organiczny środek derwatyzujący. Użyteczne grupy przyłączające i pasujące do nich ugrupowania niepolipeptydowe podano w poniższej tabeli.
Grupa przyłączająca Aminokwas Przykłady ugrupowań niepolipeptydowych Metoda sprzęgania/Aktywowany PEG Literatura
-NH2 N-końcowy, Lys Polimer, np. PEG, z grupą amidową lub iminową mPEG-SPA Tresylowany mPEG Shearwater Inc. Delgado i inni, krytyczny przegląd w Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992)
-COOH C-końcowa, Asp, Glu Polimer, np. PEG, z grupą estrową lub amidową Ugrupowanie węglowodanowe mPEG-Hz Sprzęganie in vitro Shearwater Inc.
-SH Cys Polimer, np. PEG, z grupą disiarczkową, maleimidową lub winylowosulfonową Ugrupowanie węglowodanowe PEG-winylosulfon PEG-maleimid Sprzęganie in vitro Shearwater Inc. Delgado i inni, krytyczny przegląd w Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3,4):249-304 (1992)
-OH Ser, Thr, Lys, OH- Ugrupowanie cukrowe PEG z grupą estrową, eterową, karbaminianową lub węglanową O-glikozylacja in vivo
-CONH2 Asn jako część miejsca N-glikozylacji Ugrupowanie cukrowe Polimer, np. PEG N-glikozylacja in vivo
Reszta aromatyczna Phe, Tyr, Trp Ugrupowanie węglowodanowe Sprzęganie in vitro
-CONH2 Gln Ugrupowanie węglowodanowe Sprzęganie in vitro Yan i Wold, Biochemistry, 1984, 31 lipiec; 23(16): 3759-65
Aldehyd Keton Utleniony oligosacharyd Polimer, np. PEG, PEG-hydrazyd PEG-ilacja Andresz i inni, 1978, MakromoI. Chem. 179:301, WO 92/16555, WO 00/23114
Grupa przyłączająca Aminokwas Przykłady ugrupowań niepolipeptydowych Metoda sprzęga- nia/Aktywo- wany PEG Literatura
Grupa guanidynowa Arg Ugrupowanie węglowodanowe Sprzęganie in vitro Lundblad i Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Florida, USA
Pierścień imidazolowy His Ugrupowanie węglowodanowe Sprzęganie in vitro Jak dla guanidyny
W przypadku N-glikozylacji in vivo określenie „grupa przyłączająca” stosuje się w niekonwencjonalny sposób, aby wskazać resztę aminokwasową stanowiącą miejsce N-glikozylacji (z sekwencją N-X-S/T/C, gdzie X oznacza dowolną resztę aminokwasową z wyjątkiem proliny, N oznacza asparaginę i S/T/C oznacza serynę, treoninę lub cysteinę, korzystnie serynę lub treoninę, a najkorzystniej treoninę). Choć reszta asparaginianowa miejsca N-glikozylacji jest tą, do której przyłączane jest ugrupowanie cukrowe podczas
PL 204 285 B1 glikozylacji, takie przyłączenie nie może zostać osiągnięte, gdy inne reszty aminokwasowe nie są obecne w miejscu N-glikozylacji.
Zgodnie z tym, gdy ugrupowanie niepolipeptydowe jest ugrupowaniem cukrowym, a sprzęganie zachodzi w wyniku N-glikozylacji, określenie „reszta aminokwasowa zawierająca grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego” stosowane w połączeniu ze zmianami sekwencji aminokwasów danego polipeptydu należy rozumieć jako znaczący, że jedna lub większa liczba reszt aminokwasowych stanowiących miejsce N-glikozylacji jest zmieniona tak, że funkcjonalne miejsce N-glikozylacji jest wprowadzone do sekwencji aminokwasów lub usunięte ze wspomnianej sekwencji.
W opisie niniejszego zgłoszenia nazwy aminokwasów i atomów (np. CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C, itd.) stosowano w sposób zdefiniowany w Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org) w oparciu o nomenklaturę IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names, etc.), Eur. J. Biochem., 138,9-37 (1984) wraz z Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)).
Określenie „reszta aminokwasowa” oznacza resztę aminokwasową z grupy obejmującej resztę alaniny (Ala lub A), cysteiny (Cys lub C), kwasu asparaginowego (Asp lub D), kwasu glutaminowego (Glu lub E), fenyloalaniny (Phe lub F), glicyny (Gly lub G), histydyny (His lub H), izoleucyny (Ile lub I), lizyny (Lys lub K), leucyny (Leu lub L), metioniny (Met lub M), asparaginy (Asn lub N), proliny (Pro lub P), glutaminy (Gln lub Q), argininy (Arg lub R), seryny (Ser lub S), treoniny (Thr lub T), waliny (Val lub V), tryptofanu (Trp lub W) L tyrozyny (Tyr lub Y).
Terminologię zastosowaną do identyfikacji pozycji aminokwasów można zilustrować następująco: G124 oznacza, że w pozycji 124 znajduje się reszta glicyny w sekwencji aminokwasów przedstawionej SEQ ID NO: 1. G124R oznacza, że reszta glicyny w pozycji 124 została podstawiona resztą argininy. Alternatywne podstawienia wskazano symbolem „/”, np. K32D/E oznacza sekwencję aminokwasów, w której lizynę w pozycji 32 podstawiono kwasem asparaginowym lub kwasem glutaminowym. Wielokrotne podstawienia oznaczono jako „+”, np. K143N+N145S/T oznacza sekwencję aminokwasów zawierającą podstawienie reszty lizyny w pozycji 143 resztą asparaginy i podstawienie reszty asparaginy w pozycji 145 resztą seryny lub treoniny. Wstawienie dodatkowej reszty aminokwasowej, takie jak wstawienie reszty alaniny po G124 oznaczono przez G124GA. Delecję reszty aminokwasowej wskazano przez gwiazdkę. Tak np. delecję glicyny w pozycji 124 oznaczono przez G124*. Gdy nie zostanie to wskazane inaczej, numeracja reszt aminokwasowych tutaj przedstawiona odnosi się do sekwencji aminokwasów FVII/FVIIa typu dzikiego, pokazanej w SEQ ID NO: 1.
Określenie „różni się od” użyte w związku ze specyficznymi mutacjami wskazuje na możliwość istnienia innych różnic poza wymienioną różnicą w aminokwasach. Przykładowo dodatkowo poza usunięciem i/lub wprowadzeniem reszt aminokwasowych zawierających grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego polipeptyd FVII lub FVIIa może zawierać inne podstawienia, które nie są związane z wprowadzeniem i/lub usunięciem takich reszt aminokwasowych. Zatem, dodatkowo poza zmianami aminokwasów tutaj ujawnionymi, wykonanymi w celu usunięcia i/lub wprowadzenia miejsc przyłączania ugrupowania niepolipeptydowego, należy zrozumieć, że sekwencja aminokwasów polipeptydu według wynalazku może, jeżeli jest to wymagane, zawierać inne zmiany, które nie muszą być związane z wprowadzeniem lub usunięciem miejsc przyłączania, to jest inne podstawienia, wstawienia lub delecje. Mogą one np. obejmować skrócenie N- i/lub C-końca o jeden lub większą liczbę reszt aminokwasowych lub dodanie jednej lub większej liczby dodatkowych reszt do N- i/lub C-końca, np. dodanie reszty metioniny do N-końca, a także „konserwatywne podstawienia aminokwasów”, czyli podstawienia wykonywane w obrębie grup aminokwasów o podobnych cechach, np. małych aminokwasów, kwasowych aminokwasów, polarnych aminokwasów, zasadowych aminokwasów, hydrofobowych aminokwasów i aromatycznych aminokwasów.
Korzystne podstawienia mogą być w szczególności wybrane z grup konserwatywnych podstawień wymienionych w poniższej tabeli.
1 Alanina (A) Glicyna (G) Seryna (S) Treonina (T)
2 Kwas asparaginowy (D) Kwas glutaminowy (E)
3 Asparagina (N) Glutamina (Q)
4 Arginina (R) Histydyna (H) Lizyna (K)
5 Izoleucyna (I) Leucyna (L) Metionina (M) Walina (V)
6 Fenyloalanina (F) Tyrozyna (Y) Tryptofan (W)
PL 204 285 B1
Określenia „mutacja” i „podstawienie” stosuje się tutaj zamiennie.
Określenie „sekwencja nukleotydów” oznacza kolejno połączone dwie lub większą liczbę cząsteczek nukleotydów. Sekwencja nukleotydów może być pochodzenia genomowego, cDNA, RNA, półsyntetycznego, syntetycznego lub z jakiegokolwiek ich połączenia.
Określenie „reakcja łańcuchowa polimerazy” lub „PCR ogólnie oznacza metodę namnożenia wymaganej sekwencji nukleotydowej in vitro, jak opisano np. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 4683195. Ogólnie, metoda PCR obejmuje powtarzane cykle syntezy z wydłużaniem starterów, za pomocą starterów oligonukleotydowych zdolnych do hybrydyzacji wybiórczo z matrycowym kwasem nukleinowym.
„Komórka”, „komórka gospodarz”, „linia komórkowa” i „hodowla komórek” są stosowane tutaj zamiennie i należy rozumieć, że takie określenia obejmują komórki potomne wynikające ze wzrostu lub hodowli komórki. Określenia „transformacja” i „transfekcja” stosuje się zamiennie i dotyczą one procesów wprowadzania DNA do komórki.
„Funkcjonalnie połączony” oznacza kowalencyjne połączenie dwóch lub większej liczby sekwencji nukleotydów drogą ligacji enzymatycznej lub w inny sposób, w takiej konfiguracji względem siebie, że może być realizowane normalne funkcjonowanie sekwencji. Przykładowo sekwencja nukleotydów kodująca presekwencję lub liderową sekwencję wydzielniczą jest funkcjonalnie połączona z sekwencją nukleotydów kodującą polipeptyd, gdy ulega ekspresji jako prebiałko, które uczestniczy w wydzielaniu polipeptydu: promotor lub wzmacniacz jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kodującą, gdy wpływa na transkrypcję sekwencji; miejsce wiązania rybosomu jest funkcjonalnie połączone z sekwencją kodującą, gdy jest umiejscowione tak, by ułatwić translację. Ogólnie „funkcjonalnie połączony” oznacza, że połączone sekwencje nukleotydów sąsiadują ze sobą oraz, w przypadku wydzielniczej sekwencji liderowej, sąsiadują i w ramce odczytu. Łączenie można wykonać przez ligację w odpowiednich miejscach restrykcyjnych. Gdy takie miejsca nie istnieją, stosuje się syntetyczne adaptory lub łączniki, w połączeniu ze standardowymi metodami rekombinacji DNA.
Określenie „wprowadzić” oznacza wprowadzenie aminokwasu zawierającego grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego, w szczególności przez podstawienie reszty aminokwasowej lub, alternatywnie, przez wstawienie dodatkowej reszty iminokwasowej.
Określenie „usunąć” oznacza usunięcie reszty aminokwasowej zawierającej grupę przyłączającą ugrupowanie niepolipeptydowe, w szczególności przez podstawienie reszty aminokwasowej, która ma zostać usunięta, przez inny aminokwas lub, alternatywnie, przez delecję (bez podstawienia) reszty aminokwasowej, która ma zostać usunięta.
Określenie „FVII” lub „polipeptyd FVII” oznacza cząsteczkę FVII w postaci pojedynczego łańcucha.
Określenie „FVIIa” lub „polipeptyd FVIIa” oznacza cząsteczkę FVIIa w aktywowanej postaci dwułańcuchowej, w której wiązanie pomiędzy R152 i I153 postaci jednołańcuchowej zostało przecięte. Gdy sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 stosuje się tutaj do opisania FVIIa należy rozumieć, że jeden z łańcuchów zawiera reszty 1-152, a drugi łańcuch zawiera reszty 153-406.
Określenia „rFVII” i „rFVIIa” dotyczą cząsteczek odpowiednio FVII i FVIIa, wytworzonych technikami rekombinacji.
Określenia „hFVII” i „hPVEa” dotyczą odpowiednio ludzkich FVII i FVIIa typu dzikiego.
Określenie „miejsce katalityczne” oznacza katalityczną triadę złożoną z S344, D242 i H193, polipeptydu FVII.
Określenia „aktywny FVIIa”, „aktywny polipeptyd FVIIa”, „aktywny koniugat FVIIa” lub „aktywny koniugat oznacza polipeptyd FVIIa lub koniugat, wykazujące co najmniej 10% aktywności katalitycznej hFVIIa typu dzikiego. Aktywność katalityczną, omawianą w niniejszym opisie, można odpowiednio określać w teście opisanym w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności katalitycznej” lub „Sposób pomiaru niskich poziomów aktywności katalitycznej” (patrz poniżej Materiały i metody). Korzystnie aktywny koniugat wykazuje co najmniej 15%, tak jak co najmniej 20%, np. co najmniej 25%, korzystniej co najmniej 30%, tak jak co najmniej 40%, najkorzystniej co najmniej 50%, np. co najmniej 60% aktywności katalitycznej hFVIIa typu dzikiego, przy badaniu jak opisano powyżej.
Korzystnie, aktywny koniugat potrafi wiązać czynnik tkankowy i dalej aktywować osoczowe czynniki X i/lub IX. Zatem, w korzystnej postaci, aktywny polipeptyd FVIIa lub jego koniugat wykazuje zdolność tworzenia skrzepu wynoszącą co najmniej 25% wartości dla FVIIa typu dzikiego, taką jak aktywność tworzenia skrzepu wynoszącą co najmniej 50% wartości dla FVIIa typu dzikiego, np. aktywność tworzenia skrzepu wynoszącą co najmniej 75% wartości dla FVII typu dzikiego. Zatem, aktywność tworzenia skrzepu aktyw8
PL 204 285 B1 nego polipeptydu FVIIa lub jego koniugatu korzystnie jest w zakresie 25-200% wartości dla FVII typu dzikiego. W szczególności, korzystne jest, aby polipeptyd FVIIa lub jego koniugat posiadały aktywność tworzenia skrzepu w zakresie 30-150% wartości dla FVII typu dzikiego, taka jak aktywność tworzenia skrzepu w zakresie 30-100% wartości dla FVII typu dzikiego. Aktywność tworzenia skrzepu można określić jakąkolwiek znaną metodą, jak poniżej omówiono w części Materiały i metody. Jednakże, szczególnie korzystnie aktywność tworzenia skrzepu określa się metodą opisaną w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu” (patrz część „Materiały i Metody”).
Określenie „immunogenność” stosowane w połączeniu z daną substancją wskazuje zdolność tej substancji do wywoływania odpowiedzi układu immunologicznego. Odpowiedź immunologiczna może być odpowiedzią komórkową lub pośredniczoną przez przeciwciała (dalsza definicja immunogenności patrz np. Roitt: Essential Immunology (wyd. 8, Blackwell)). Normalnie, obniżona reaktywność przeciwciał jest wyznacznikiem obniżonej immunogenności. Obniżoną immunogenność można określić z zastosowaniem jakiejkolwiek odpowiedniej znanej metody, np. in vivo lub in vitro.
Określenia „nieaktywny FVIIa”, „nieaktywny polipeptyd FVIla”, „nieaktywny koniugat FVIIa” lub „nieaktywny koniugat” oznaczają tutaj polipeptyd FVIIa lub koniugat posiadające mniej niż 10% aktywności katalitycznej hFVIIa typu dzikiego. Aktywność katalityczną, omawianą w niniejszym opisie, można odpowiednio określić na podstawie testu opisanego w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności katalitycznej” lub „Sposób pomiaru niskich wartości aktywności katalitycznej” (patrz poniżej Materiały i metody). Korzystnie nieaktywny koniugat wykazuje mniej niż 8%, tak jak mniej niż 6%, np. mniej niż 5%, korzystniej mniej niż 4%, tak jak mniej niż 3%, najkorzystniej mniej niż 2%, np. mniej niż 1% aktywności katalitycznej hFVIIa typu dzikiego, przy badaniu w testach opisanych powyżej.
Zazwyczaj, nieaktywny koniugat ma znacząco obniżoną aktywność tworzenia skrzepu in vitro lub in vivo w porównaniu z hFVIIa typu dzikiego. Nieaktywny polipeptyd lub koniugat FVII lub FVIIa może współzawodniczyć z FVII lub FVIIa typu dzikiego w wiązaniu czynnika tkankowego, przez co może hamować aktywność tworzenia skrzepu. Korzystnie nieaktywny polipeptyd lub koniugat FVII lub FVIIa posiada mniej niż 1% aktywności tworzenia skrzepu w porównaniu z hFVII lub hFVIIa typu dzikiego. Korzystniej nieaktywny polipeptyd lub koniugat z FVII lub FVIIa posiada mniej niż 0,05% aktywności tworzenia skrzepu w porównaniu z hFVII lub hFVIIa typu dzikiego. Najkorzystniej nieaktywny polipeptyd lub koniugat FVII lub FVIIa posiada mniej niż 0,01% aktywności tworzenia skrzepu w porównaniu hFVII lub hFVIIa. Podobnie, jak opisano powyżej, aktywność tworzenia skrzepu można określić jakąkolwiek znaną metodą, jak niżej opisano w części Materiały i metody, ale korzystnie określa się ją zgodnie z metodą opisaną w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu”.
Określenie „funkcjonalny okres półtrwania in vivo stosowane jest w swoim normalnym znaczeniu, czyli oznacza czas, w którym 50% aktywności biologicznej polipeptydu lub koniugatu jest nadal obecne w organizmie/docelowym narządzie lub czas, w którym aktywność polipeptydu lub koniugatu wynosi 50% wartości początkowej. Alternatywnie do określania funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo, można określić „okres półtrwania w surowicy”, czyli czas w którym 50% cząsteczek polipeptydu lub koniugatu krąży w surowicy lub krwioobiegu przed klirensem. Określenie okresu półtrwania w surowicy jest często prostsze niż określenie funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo i wielkość okresu półtrwania w surowicy jest zazwyczaj dobrym wskaźnikiem wielkości funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo. Inne określenia okresu półtrwania w surowicy obejmują „okres półtrwania w osoczu”, „okres półtrwania w krążeniu”, „klirens surowiczy”, „klirens osoczowy” i „okres połowicznego klirensu”. Polipeptyd lub koniugat są usuwane przez działanie układów siateczkowo-śródbłonkowych (RES), nerek, śledziony lub wątroby, przez czynnik tkankowy, receptor SEC lub drogą usuwania mediowanego przez inne receptory, lub przez specyficzną lub niespecyficzną proteolizę. Normalnie klirens zależy od wielkości, (względem odcinającej filtracji kłębuszkowej), ładunku, przyłączonych łańcuchów węglowodanów uraz występowania komórkowych receptorów dla białka. Aby funkcjonalność utrzymała się jest normalnie wybrana spośród aktywności prokoagulacyjnej, proteolitycznej lub wiązania receptora. Funkcjonalny okres półtrwania in vivo i surowiczy okres półtrwania można określić odpowiednią znaną metodą, jak dalej omówiono poniżej w części Materiały i metody.
Określenie „wydłużony” stosowane odnośnie funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo lub okresu półtrwania w osoczu oznacza, że odnośny okres półtrwania koniugatu lub polipeptydu jest statystycznie istotnie wydłużony względem okresu półtrwania cząsteczki odniesienia, takiej jak niesprzężony rFVIIa (np. NovoSeven®), określa się w porównywalnych warunkach. Przykładowo odnośny okres półtrwania może być wydłużony co najmniej o około 25%, tak jak co najmniej o około 50%, np. co najmniej o około 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 500% lub 1000%.
PL 204 285 B1
Określenie „klirens nerkowy” jest stosowane w swoim zwykłym znaczeniu i oznacza klirens zachodzący w nerkach, np. przez filtrację kłębuszkową, wydalanie kanalikowe lub rozkład w komórkach kanalików. Klirens nerkowy zależy od cech fizycznych koniugatu, włącznie z rozmiarem (średnicą), objętością hydrodynamiczną, symetrią, kształtem/sztywnością i ładunkiem. Normalnie, uważa się, że masa cząsteczkowa około 67 kDa jest wartością odcięcia dla klirensu nerkowego. Klirens nerkowy można określić z użyciem dowolnego odpowiedniego testu, np. testu in vivo. Zazwyczaj, klirens nerkowy określa się przez podanie pacjentowi znakowanego (np. znakowanej radioaktywnie lub fluorescencyjnie) sprzężonego polipeptydu i pomiar aktywności znacznika w moczu zebranym od pacjenta. Obniżony klirens nerkowy określa się względem odpowiedniego polipeptydu odniesienia, np. odpowiedniego niesprzężonego polipeptydu, niesprzężonego odpowiadającego polipeptydu typu dzikiego lub innego sprzężonego polipeptydu (takiego jak sprzężony polipeptyd nie według wynalazku) w porównywalnych warunkach. Korzystnie szybkość klirensu nerkowego koniugatu jest zmniejszona o co najmniej 50%, korzystnie o co najmniej 75%, a najkorzystniej o co najmniej 90% w porównaniu z odpowiednim polipeptydem odniesienia.
Najważniejsza jest zdolność koniugatów według wynalazku do wykazywania obniżonej wrażliwości na rozkład proteolityczny. Kompozycje zawierające produkty rozkładu zazwyczaj posiadają mniej specyficzną aktywność w porównaniu z kompozycjami, w których nie nastąpił rozkład lub tylko niewielka część koniugatu uległa rozkładowi. Ponadto, zawartość niefizjologicznych produktów rozkładu w kompozycji, która ma być podana, może uruchomić układ immunologiczny pacjenta.
Określenie „zmniejszona wrażliwość na rozkład proteolityczny” oznacza przede wszystkim, że koniugat posiada obniżoną wrażliwość na rozkład proteolityczny w porównaniu z niesprzężonym FVIIa typu dzikiego, w badaniach prowadzonych w porównywalnych warunkach. Korzystnie, rozkład proteolityczny jest zmniejszony o co najmniej 10%, tak jak co najmniej o 25% (np. o 10-25%), korzystniej o co najmniej 35%, tak, jak co najmniej o 50%, (np. o 10-50%, tak jak o 25-50%), jeszcze korzystniej o co najmniej 60%, tak jak co najmniej o 75% lub nawet co najmniej o 90%. Najkorzystniej, rozkład proteolityczny jest obniżony o 100%. Zatem, korzystnie koniugat według wynalazku ulega rozkładowi proteolitycznemu w mniejszym stopniu niż FVIIa typu dzikiego, czyli w porównaniu z nie-sprzężonym FVIIa typu dzikiego rozkład proteolityczny koniugatu według wynalazku jest korzystnie obniżony o 10100%, tak jak o 25-100%, korzystniej o 50-100%, a najkorzystniej o 75-100%.
Opracowano odpowiedni wstępny test in vitro, który można stosować do oceny, czy takie koniugaty wykazują obniżoną wrażliwość na trawienie proteolityczne (zmniejszona autoproteoliza). Zatem, w korzystnej postaci wynalazku koniugat według wynalazku ma obniżoną wrażliwość na rozkład proteolityczny (jak zdefiniowano powyżej) w porównaniu z FVIIa typu dzikiego, przy oznaczaniu metodą opisanej w części zatytułowanej „Pomiar zmniejszonej wrażliwości na rozkład proteolityczny”, przy oznaczaniu metodą opisaną w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności katalitycznej” lub przy oznaczaniu metodą opisaną w części zatytułowanej „Sposób pomiaru niskich wartości aktywności katalitycznej” (patrz część Materiały i metody poniżej).
Określenie „macierzysty FVII” lub „macierzysty polipeptyd” oznacza cząsteczkę, która ma zostać zmodyfikowana zgodnie z wynalazkiem. Typowym macierzystym FVII jest hFVII lub hFVIIa (włącznie z rFVIIa (NovoSeven®)) o sekwencji aminokwasów przedstawionej jako SEQ ID NO: 1.
„Wariant” oznacza polipeptyd różniący się jedną lub większą liczbą reszt aminokwasowych od polipeptydu macierzystego, normalnie 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 lub 15 resztami aminokwasowymi.
Koniugat według wynalazku
Koniugat według wynalazku jest wynikiem ogólnie nowej strategii opracowywania ulepszonych cząsteczek FVII lub FVIIa. W szczególności, przez usunięcie i/lub wprowadzenie reszty aminokwasowej zawierającej grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego możliwe jest specyficzne dostosowanie polipeptydu, tak by uczynić cząsteczkę bardziej podatną na sprzęgnięcie z wybranym ugrupowaniem niepolipeptydowym, aby zoptymalizować układ sprzęgania (np. aby zapewnić optymalne rozmieszczenie i liczbę ugrupowań niepolipeptydowych na powierzchni cząsteczki FVII lub FVIIa, oraz zapewnić by tylko grupy przyłączające, które mają być sprzęgnięte, były obecne w cząsteczce) i tak otrzymać nową sprzęgniętą cząsteczkę, która wykazuje lub nie wykazuje aktywności FVII i dodatkowo jedną lub większą liczbę ulepszonych właściwości w porównaniu z cząsteczkami FVII i FVIIa obecnie dostępnymi. Przykładowo, gdy całkowita liczba reszt aminokwasowych zawierających grupę przyłączającą dla wybranego ugrupowania niepolipeptydowego zostanie zwiększona lub zmniejszona do optymalnego
PL 204 285 B1 poziomu, klirens nerkowy koniugatu będzie zazwyczaj znacznie obniżony ze względu na zmieniony kształt, wielkość i/lub ładunek cząsteczki otrzymanej w wyniku sprzęgania.
W korzystnych postaciach wynalazku zmieniona jest więcej niż jedna reszta aminokwasowa polipeptydu FVII lub FVIIa, np. zmiana obejmuje usunięcie, a także wprowadzenie reszt aminokwasowych zawierających grupę przyłączającą dla wybranego ugrupowania niepolipeptydowego. Poza usunięciem i/lub wprowadzeniem reszt aminokwasowych polipeptyd może zawierać inne podstawienia lub miejsca glikozylacji, które nie są związane z wprowadzeniem i/lub usunięciem reszt aminokwasowych zawierających grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego. Ponadto polipeptyd może zostać przyłączony np. do inhibitora proteinazy serynowej, tak by hamować katalityczne miejsce polipeptydu.
Resztę aminokwasową zawierającą grupę przyłączającą dla ugrupowania niepolipeptydowego, która ma zostać usunięta lub wstawiona, wybiera się na podstawie natury wybranego ugrupowania niepolipeptydowego oraz w większości przypadków na podstawie sposobu osiągania sprzęgania polipeptydu i ugrupowania niepolipeptydowego. Przykładowo, gdy ugrupowanie niepolipeptydowe jest cząsteczką polimerową, taką jak cząsteczka pochodząca od glikolu polietylenowego lub politlenku alkilenu, reszty aminokwasowe zawierające grupę przyłączającą można wybrać z grupy obejmującej lizynę, cysteinę, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, histydynę i tyrozynę, korzystnie, cysteinę i lizynę, w szczególności lizynę.
Gdy grupa przyłączająca dla ugrupowania niepolipeptydowego ma zostać wprowadzona lub usunięta z polipeptydu FVII lub FVIIa zgodnie z wynalazkiem pozycja, która ma zostać zmodyfikowana w polipeptydzie jest korzystnie zlokalizowana na powierzchni polipeptydu i korzystniej zajmowana jest przez resztę aminokwasową, której ponad 25% łańcucha bocznego jest odsłonięta na działanie rozpuszczalnika, korzystnie której ponad 50% łańcucha bocznego jest odsłonięta na działanie rozpuszczalnika. Takie pozycje zidentyfikowano na podstawie struktury trójwymiarowej ludzkich cząsteczek FVII lub FVIIa, jak opisano poniżej w części Materiały i metody. Ponadto, pozycję korzystnie wybiera się z części cząsteczki FVII zlokalizowanej na zewnątrz regionu miejsca wiązania czynnika tkankowego i/lub regionu miejsca aktywnego. Regiony te zidentyfikowano w części „Materiały i metody poniżej”. Jednakże należy podkreślić, że w pewnych sytuacjach, np. w przypadku, gdy wymagany jest zdezaktywowany koniugat, korzystne może być przeprowadzenie modyfikacji w takich regionach lub w ich sąsiedztwie. Przykładowo uważ a się, że jedna lub większa liczba grup przyłączających dla ugrupowań niepolipeptydowych, takich jak grupy przyłączające miejsc N-glikozylacji in vivo, mogą korzystnie zostać wstawione w region miejsca aktywnego lub na grzbiecie szczeliny wiążącej miejsca aktywnego cząsteczki FVII. Region miejsca aktywnego i grzbiet szczeliny wiążącej miejsca aktywnego zdefiniowano poniżej w części Materiały i metody i składają się one z następujących reszt: I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 i F405 (region miejsca aktywnego); oraz N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 i T370 (grzbiet szczeliny wiążącej miejsca aktywnego).
Aby określić optymalne rozmieszczenie grup przyłączających, obliczono odległość pomiędzy resztami aminokwasowymi umieszczonymi na powierzchni cząsteczki FVII lub FVIIa na podstawie struktury trójwymiarowej polipeptydu. W szczególności, określono odległość pomiędzy resztami aminokwasowymi CB zawierającymi takie grupy przyłączające, lub pomiędzy grupą funkcjonalną (NZ dla lizyny, CG dla kwasu asparaginowego, CD dla kwasu glutaminowego, SG dla cysteiny) jednej i CB innej reszty aminokwasowej zawierającej grupę przyłączającą. W przypadku glicyny, zamiast CB użyto CA. W części koniugatu według wynalazku w postaci polipeptydu FVII lub FVIIa, każda ze wspomnianych odległości wynosi korzystnie ponad 0,8 nm (8 A), w szczególności ponad 1 nm (10 A), aby zapobiec sprzęganiu heterologicznemu lub zmniejszyć je.
W przypadku usuwania grupy przyłączającej, odpowiednia reszta aminokwasowa zawierająca taką grupę i zajmująca pozycję według powyższej definicji jest korzystnie podstawiona inną resztą aminokwasową, która nie zawiera grupy przyłączającej dla danego ugrupowania niepolipeptydowego. Normalnie resztą aminokwasową, która ma być usunięta, jest ta, z którą sprzęganie jest niekorzystne, np. reszta aminokwasowa znajdująca się w pobliżu miejsca funkcjonalnego polipeptydu (ze względu na to, że sprzęgnięcie w takim miejscu może wywołać dezaktywację lub obniżoną aktywność FVII lub
PL 204 285 B1
FVIIa powstałego koniugatu ze względu na zaburzone rozpoznawanie receptora). W tym kontekście określenie „miejsce funkcjonalne” oznacza jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych, które jest/są istotne do lub w inny sposób związane z działaniem lub skutecznością FVII lub FVIIa. Takie reszty aminokwasowe są częścią miejsca funkcjonalnego. Miejsce funkcjonalne można wyznaczyć znanymi metodami, a korzystnie identyfikuje się je przez analizę struktury kompleksu FVIIa-czynnik tkankowy (patrz Banner i inni, Nature 1996; 380:41-46).
W przypadku wprowadzenia grupy przyłączającej, resztę aminokwasową zawierającą taką grupę wprowadza się do określonej pozycji, korzystnie przez podstawienie reszty aminokwasowej zajmującej tę pozycję.
Dokładna liczba grup przyłączających obecnych i dostępnych do sprzęgania w polipeptydzie FVII lub FVIIa zależy od wymaganego efektu, który ma zostać osiągnięty przez sprzęgnięcie. Efekt, który ma zostać osiągnięty, zależy np. od natury i stopnia sprzęgania, (czyli od rodzaju ugrupowania niepolipeptydowego, liczby ugrupowań niepolipeptydowych wymaganych lub możliwych do sprzężenia z polipeptydem, miejsc, w których powinny one być sprzężone lub miejsc, w których powinno się unikać sprzęgania itd.).
Funkcjonalny okres półtrwania in vivo, zależny między innymi od masy cząsteczkowej koniugatu oraz liczba grup przyłączających, wymaganej do zapewnienia wydłużonego okresu półtrwania, zależy w zwią zku z tym od masy czą steczkowej danego ugrupowania niepolipeptydowego. W jednej postaci, koniugat według wynalazku ma masę cząsteczkową co najmniej 67 kDa, w szczególności co najmniej 70 kDa, np. mierzoną metodą SDS-AGE według Laemmli, U.K., Nature tom 227 (1970), str. 680-85. FVII ma masę cząsteczkową około 53 kDa, a zatem wymagane jest dodatkowe 10-20 kDa aby osiągnąć wymagany efekt. Można o wykonać, np. przez sprzęgnięcie z 2-4 cząsteczkami 10 kDa PEG lub w inny sposób tutaj opisany.
Aby zapobiec zbyt dużemu zaburzeniu struktury i działania macierzystej cząsteczki, polipeptydowa część koniugatu zazwyczaj zawiera sekwencję aminokwasów o ponad 90% identyczności sekwencji z SEQ ID NO: 1, korzystnie ponad 95%, tak jak ponad 96%. W szczególności, polipeptydowa część koniugatu zazwyczaj zawiera sekwencję aminokwasów o ponad 97% identyczności z SEQ ID NO: 1, tak jak ponad 98%, ponad 99%, ponad 99,25% lub ponad 99,5%.
Homologię/identyczność sekwencji aminokwasów dogodnie określa się z porównania sekwencji stosując np. program ClustalW, wersja 1.8, czerwiec 1999, stosując domyślne ustawienia parametrów (Thompson i inni, 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680) lub z bazy danych rodzin PFAM wersja 4,0 (http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res. 1999, 1 styczeń; 27(1):260-2) przy użyciu GENEDOC wersja 2.5 (Nicholas, K.B., Nicholas H.B.Jr. i Deerfield, D.W. E. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4:14; Nicholas, K.B. i Nicholas H.B.Jr. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation).
Mówiąc inaczej, całkowita liczba reszt aminokwasowych, które mogą być zmienione według wynalazku (w porównaniu z sekwencją aminokwasów przedstawioną w SEQ ID NO: 1) zazwyczaj nie przekracza 15. Korzystnie, polipeptydowa FVII lub FVIIa część koniugatu według wynalazku lub polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów różniącą się 1-15 resztami aminokwasowymi od sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 1, zazwyczaj 1-10 lub 2-10 resztami aminokwasowymi, np. 1-8 lub 2-8 resztami aminokwasowymi, tak jak 3-7 lub 4-6 resztami aminokwasowymi od sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO: 1. Zatem, normalnie polipeptydowa część koniugatu lub polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów różniącą się od sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 1 najwyż ej 15 resztami aminokwasowymi (np. 15 resztami aminokwasowymi), najwyż ej 14 resztami aminokwasowymi (np. 14 resztami aminokwasowymi), najwyżej 13 resztami aminokwasowymi (np. 13 resztami aminokwasowymi), najwyżej 12 resztami aminokwasowymi (np. 12 resztami aminokwasowymi), najwyżej 11 resztami aminokwasowymi (np. 11 resztami aminokwasowymi), najwyżej 10 resztami aminokwasowymi (np. 10 resztami aminokwasowymi), najwyżej 9 resztami aminokwasowymi (np. 9 resztami aminokwasowymi), najwyżej 8 resztami aminokwasowymi (np. 8 resztami aminokwasowymi), najwyżej 7 resztami aminokwasowymi (np. 7 resztami aminokwasowymi), najwyżej 6 resztami aminokwasowymi (np. 6 resztami aminokwasowymi), najwyżej 5 resztami aminokwasowymi (np. 5 resztami aminokwasowymi), najwyżej 4 resztami aminokwasowymi (np. 4 resztami aminokwasowymi), najwyżej 3 resztami aminokwasowymi (np. 3 resztami aminokwasowymi) lub najwyżej 2 resztami aminokwasowymi (np. 2 resztami aminokwasowymi).
PL 204 285 B1
Analogicznie koniugat może zawierać, np. 1-15 ugrupowań niepolipeptydowych, zazwyczaj 1-10 ugrupowań niepolipeptydowych lub 2-10 ugrupowań niepolipeptydowych, tak jak 1-8 lub 2-8 ugrupowań niepolipeptydowych, np. 1-6, 1-4, 3-7 lub 4-6 ugrupowań niepolipeptydowych.
Korzystnie koniugat według wynalazku posiada jedną lub większą liczbę ulepszonych właściwości: wydłużony funkcjonalny okres półtrwania in vivo, wydłużony okres półtrwania w osoczu, zmniejszony klirens w nerkach i obniżony rozkład proteolityczny w porównaniu z rFVIIa (np. NovoSeven®).
Wiadomo, np. z WO 88/10295, że rozkład proteolityczny FVII/FVIIa głównie zachodzi w różnych miejscach proteolitycznych cząsteczki, w szczególności w pozycjach, K32, K38, I42, Y44, K143, R290, R315, K341, R392, R396 i R402 (lub raczej pomiędzy pozycjami K32-D33, K38-L39, I42-S43, Y44-S45, K143-R144, R290-G291, R315-K316, K341-G342, R392-S393, R396-P397 i R402-A403). Zatem, jedną ze strategii, np. wydłużania funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo, wydłużenia czasu półtrwania w osoczu lub zmniejszenia rozkładu proteolitycznego, jest zmodyfikowanie macierzystego polipeptydu w i/lub w pobliżu jednego lub większej liczby miejsc rozkładu proteolitycznego, np. przez wprowadzenie ugrupowań niepolipeptydowych w i/lub obok tych miejsc. Zatem, grupę przyłączającą można wprowadzać w jednym lub większej liczbie powyżej wymienionych zidentyfikowanych pozycji lub w pozycji -4, -3, -2, -1, 1, 2, 3, 4, korzystnie w pozycji -2, -1, 1, 2, np. w pozycji -1, 1, względem pozycji bezpośrednio związanej z rozkładem proteolitycznym.
W szczególności niewystępujące naturalnie in vivo miejsce glikozylacji, w szczególności niewystępujące naturalnie miejsce N-glikozylacji in vivo (patrz dalej poniżej) można wprowadzać w pozycjach wybranych z grupy obejmującej 28-48, 139-147, 286-294, 311-319, 338-345 i 388-406. W szczególności, miejsce glikozylacji in vivo, takie jak miejsce N-glikozylacji in vivo (patrz dalej poniżej) można wprowadzać w pozycje wybrane z grupy obejmującej 30-34, 36-46, 141-144, 288-292, 313-317, 341-343, 390-398 i 400-404. Miejsce glikozylacji in vivo, takie jak miejsce N-glikozylacji in vivo (patrz dalej poniżej) można wprowadzić w pozycje wybrane z grupy obejmującej 31-33 (np. pozycje 31, 32 lub 33), 37-39 (np. pozycje 37, 38 lub 39), 41-46 (np. pozycje 41, 42, 43, 44, 45 lub 46), 142-144 (np. pozycje 142, 143 lub 144), 289-291 (np. pozycje 289, 290 lub 291), 314-316, (np. pozycje 314, 315 lub 316), 341-343 (np. pozycje 341, 342 lub 343), 391-393 (np. pozycje 391, 392 lub 393), 395-397 (np. pozycje 395, 396 lub 397) i 401-403 (np. pozycje 401, 402 lub 403). Wprowadzenie korzystnie prowadzi się przez podstawienie.
Koniugat, w którym ugrupowaniem niepolipeptydowym jest cząsteczka zawierająca lizynę jako grupę przyłączającą.
Ugrupowanie niepolipeptydowe może zawierać lizynę jako grupę przyłączającą, czyli koniugat ten jest koniugatem, który zawiera co najmniej jedno ugrupowanie niepolipeptydowe kowalencyjnie połączone z polipeptydem, gdzie sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od FVII lub FVIIa typu dzikiego przedstawionego w SEQ ID NO: 1 co najmniej jedną resztą lizynową, która została wprowadzona lub usunięta.
FVIl/FVIIa zawiera 17 reszt lizyny. Trzy reszty lizyny (K18, K62 i K85) są umiejscowione w domenie wiążącej czynnik tkankowy, a dwie reszty lizyny (K197 i K341) są umiejscowione w regionie miejsca aktywnego.
Z powodu stosunkowo dużej liczby reszt lizyny w macierzystym polipeptydzie przewiduje się, że co najmniej jedną resztę lizyny powinno się korzystnie usunąć, w szczególności przez podstawienie reszty lizyny resztą nielizynową, aby uniknąć nadmiernego sprzęgania z ugrupowaniami niepolipeptydowymi.
Zatem, sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydowej części koniugatu może różnić się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta lizyny, np. 1-15 reszt lizyny, w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 reszt lizyny, została usunięta, korzystnie przez podstawienie. Przykładowo resztę(y) lizyny, która ma zostać usunięta, korzystnie przez podstawienie, wybiera się z grupy obejmującej K18, K32, K38, K62, K85, K109, K137, K143, K148, K157, K161, K197, K199, K316, K337, K341, K389 i ich kombinacje. W szczególności, korzystne jest usunięcie jednej lub większej liczby reszt lizyny, które stanowią część miejsca wiązania czynnika tkankowego i/lub regionu miejsca aktywnego, czyli reszty K18, K62, K85, K197, K341 lub ich kombinacje. Reszta lizyny może zostać podstawiona jakąkolwiek inną resztą aminokwasową, ale korzystnie podstawiona jest R, Q, N lub H, korzystniej R.
Sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydowej części koniugatu może różnić się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta lizyny, np. 1-15 reszt lizyny, w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 reszty lizyny, została wprowadzona, korzystnie przez podstawienie. Należy zdawać sobie sprawę, że szczególnie korzystne jest, aby co najmniej jedna z reszt lizyny, które zostały wprowadzone w wyznaczone miejsce cząsteczki macierzystej, była połączona z co najmniej jednym z wyżej wymienionych usunięć reszt lizyny. Zatem, sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydowej części koniugatu
PL 204 285 B1 może różnić się od przedstawionej, w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta lizyny została usunięta i co najmniej jedna reszta lizyny została wprowadzona.
Przykłady pozycji, w które można wprowadzić reszty lizyny obejmują, lecz nie wyłącznie, pozycje w miejscach rozkładu proteolitycznego opisanych powyżej lub w ich pobliżu. Zatem, podstawienie reszty nielizynowej resztę lizynową można wybrać z grupy obejmującej I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K oraz ich kombinacje, w szczególności z grupy obejmującej R290K, R315K, R392K, R396K, R402K oraz ich kombinacje.
Podczas gdy ugrupowanie niepolipeptydowe koniugatu może być jakąkolwiek cząsteczką, gdy stosuje się dany sposób sprzęgania, w której lizyna jest grupą przyłączającą, korzystne jest, aby ugrupowanie niepolipeptydowe stanowiła cząsteczka polimeru. Cząsteczka polimeru może być którąkolwiek z cząsteczek wspomnianych w części „Sprzęganie z cząsteczką polimeru”, na przykład jest wybrana z grupy obejmującej liniowy i rozgałęziony glikol polietylenowy lub inny politlenek alkilenu. Przykłady cząsteczek polimerów obejmują np. SS-PEG, NPC-PEG, aldehydo-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM, mPEG-BTC z Shearwater Polymers, Inc, SC-PEG z Enzon, Inc., tresylowany mPEG, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5880255 lub oksykarbonyloksy-N-dikarboksyimido-PEG (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5122614).
Normalnie do sprzęgania reszty lizyny ugrupowanie niepolipeptydowe ma masę cząsteczkową około 5-20 kDa, taką jak około 5-10 kDa, np. około 5 kDa lub około 10 kDa.
Należy zdawać sobie sprawę, że jakiekolwiek zmiany aminokwasowe, w szczególności podstawienia, wymienione w tej części można połączyć z jakimikolwiek innymi zmianami aminokwasowymi, korzystnie podstawieniami wymienionymi w poniższych częściach ujawniających konkretne modyfikacje aminokwasowe, obejmujące wprowadzenie i/lub usunięcie miejsc glikozylacji.
Koniugat, w którym ugrupowanie niepolipeptydowe jest cząsteczką zawierającą cysteine jako grupę przyłączającą.
Ugrupowanie niepolipeptydowe może zawierać cysteinę jako grupę przyłączającą, czyli koniugat ten jest koniugatem, który zawiera co najmniej jedno ugrupowanie niepolipeptydowe kowalencyjnie połączone z polipeptydem, gdzie sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od FVII lub FVIIa typu dzikiego przedstawionego w SEQ ID NO: 1 co najmniej jedną resztą cysteinową, która została wprowadzona lub usunięta.
FVII/FVIIa zawiera 24 reszty cysteiny, a mostki disulfidowe są utworzone pomiędzy następującymi resztami cysteiny: C17 i C22, C50 i C61, C55 i C70, C72 i C81, C91 i C102, C98 i C112, C114 i C127, C135 i C262, C159 i C164, C178 i C194, C310 i C329 oraz pomiędzy C340 i C368.
Sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydowej części koniugatu może różnić się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta cysteiny, np. 1-15 reszt cysteiny, w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 reszty cysteiny, zostało wprowadzonych, korzystnie przez podstawienie.
Przykłady pozycji, w których reszty cysteiny mogą zostać wprowadzone obejmują, ale nie wyłącznie, pozycje w miejscach rozkładu proteolitycznego opisanych powyżej lub w ich pobliżu.
Zatem, resztę(y) lizyny, która ma zostać wprowadzona, korzystnie przez podstawienie można wybrać z grupy obejmującej I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C oraz ich kombinacje, w szczególności wybiera się z grupy obejmującej K32C, Y44C, K143C, R290C, R315C, K341C, R392C, R396C, R402C oraz ich kombinacje.
Resztę(y) cysteiny można wstawiać w pozycję, która w hFVII typu dzikiego jest zajmowana przez resztę treoniny lub seryny posiadających co najmniej 25% łańcucha bocznego odsłoniętych na powierzchni. Przykładowo resztę cysteiny polipeptydu FVII lub FVIIa wprowadza się, korzystnie przez podstawienie, do co najmniej jednej pozycji wybranej z grupy obejmującej S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, S232, T233, T238, T239, T255, T267, T293, T307, S320, T324, S333, S336, T370 i S393. Korzystniej resztę cysteiny wprowadza się do co najmniej jednej pozycji hFVII zawierającej resztę S, którą to pozycję wybiera się z grupy obejmującej S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S232, S320, S333, S336 i S393.
Resztę(y) cysteiny można wprowadzać w pozycję, która w hFVII jest zajmowana przez resztę treoniny lub seryny posiadające co najmniej 50% łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni. Przykładowo resztę cysteiny polipeptydu FVII lub FVIIa wprowadza się, korzystnie przez podstawienie, do co
PL 204 285 B1 najmniej jednej pozycji wybranej z grupy obejmującej S23, S43, S52, S53, S60, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214, T238, T267 i T293, a zwłaszcza do pozycji wybranej z grupy obejmującej S23, S43, S52, S53, S60, S67, S111, S119, S147 i S214.
Resztę cysteiny można wprowadzać w co najmniej jedną pozycję wybraną z wymienionych powyżej pozycji, które nie znajdują się w regionie miejsca aktywnego. Korzystnie pozycja zajmowana jest przez resztę T lub S. Przykładowo, polipeptyd FVII zawiera resztę cysteiny wprowadzoną w pozycję wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, T255, T267, T307, S320, S333, S336, T370 i S393 (posiadających ponad 25% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S320, S333, S336 i S393 (zajmowanej przez resztę S) oraz korzystniej wybraną z grupy obejmującej S23, S43, S52, S53, S60, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214 i T267 (posiadających ponad 50% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S23, S43, S52, S53, S60, S67, S111, S119, S147 i S214 (zajmowanej przez resztę S).
Resztę cysteiny można wprowadzać w co najmniej jedną pozycję, wybraną z którejkolwiek z powyższych list, która nie znajduje się w regionie wiązania czynnika tkankowego. Korzystnie, pozycja jest zajmowana przez resztę T lub S. Przykładowo, polipeptyd FVII zawiera resztę cysteiny wprowadzoną w pozycję wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S45, S52, S53, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, S232, T233, T238, T239, T255, T267, T293, S320, T324, S333, S336, T370 i S393 (posiadających ponad 25% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S45, S52, S53, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S232, S320, S333, S336 i S393 (zajmowanej przez resztę S) oraz korzystniej wybraną z grupy obejmującej S23, S52, S53, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214, T238, T267 i T293 (posiadających ponad 50% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S23, S52, S53, S67, S111, S119, S147 i S214 (zajmowanej przez resztę S).
Resztę cysteiny można wprowadzać w co najmniej jedną pozycję, wybraną z którejkolwiek z powyższych list, która nie znajduje się w regionie wiązania czynnika tkankowego ani w regionie miejsca aktywnego. Korzystnie, pozycja jest zajmowana przez resztę T lub S. Przykładowo, polipeptyd FVII zawiera resztę cysteiny wprowadzoną w pozycję wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S45,
552, S53, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, T255, T267, S320, S333, S336, T370 i S393 (posiadających ponad 25% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S12, S23, S45, S52,
553, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S320, S333, S336 i S393 (zajmowanej przez resztę S) oraz korzystniej z grupy obejmującej S23, S52, S53, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214 i T267 (posiadających ponad 50% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni), w szczególności wybraną z grupy obejmującej S23, S52, S53, S67, S111, S119, S147 i S214 (zajmowanej przez resztę S).
Podczas gdy ugrupowanie niepolipeptydowe koniugatu może być dowolną cząsteczką, gdy stosuje się daną metodę sprzęgania, w której lizyna jest grupą przyłączającą, korzystnie jest, aby ugrupowanie niepolipeptydowe było cząsteczką polimeru. Cząsteczka polimeru może być którąkolwiek z cząsteczek wspomnianych w części „Sprzęganie z cząsteczką polimeru”, ale korzystnie jest wybrana z grupy obejmującej liniowy lub rozgałęziony glikol polietylenowy lub inny politlenek alkilenu. Cząsteczką polimeru może być PEG, taki jak VS-PEG. Sprzęganie pomiędzy polipeptydem i polimerem można osiągnąć w jakikolwiek odpowiedni sposób, np. tak jak opisano w części „Sprzęganie z cząsteczką polimeru”, np. stosując metodę jednoetapową lub sposób kilkuetapowy, wspomniany w tej części. Gdy polipeptyd FVII lub FVIIa zawiera tylko jedną sprzęgalną resztę cysteiny, najlepiej sprzęgany jest z ugrupowaniem niepolipeptydowym o masie cząsteczkowej około 5-20 kDa, np. około 10-20 kDa, takiej jak masa cząsteczkowa około 5 kDa, około 10 kDa, około 12 kDa, około 15 kDa lub około 20 kDa, bezpośrednio lub pośrednio przez polimer o niskiej masie cząsteczkowej (jak ujawniono w WO 99/55377). Gdy koniugat zawiera dwa lub większą liczbę sprzęgalnych reszt cysteiny, normalnie każde ugrupowanie niepolipeptydowe ma masę cząsteczkową około 5-10 kDa, np. około 5 kDa lub około 10 kDa.
Należy zdawać sobie sprawę, że jakiekolwiek zmiany aminokwasowe, w szczególności podstawienia, wymienione w tej części można połączyć z jakimikolwiek innymi zmianami aminokwasowymi,
PL 204 285 B1 korzystnie podstawieniami wymienionymi w innych częściach ujawniających specyficzne modyfikacje aminokwasowe, obejmujące wprowadzenie i/lub usunięcie miejsc glikozylacji.
Koniugat, w którym ugrupowanie niepolipeptydowe jest cząsteczką zawierającą kwas asparaginowy lub kwas glutaminowy jako grupę przyłączającą.
Ugrupowanie niepolipeptydowe może zawierać kwas asparaginowy lub kwas glutaminowy jako grupę przyłączającą, czyli koniugat ten jest koniugatem, który zawiera co najmniej jedno ugrupowanie niepolipeptydowe kowalencyjnie połączone z polipeptydem, gdzie sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od FVII lub FVIIa typu dzikiego przedstawionego w SEQ ID NO: 1 wprowadzoną lub usuniętą co najmniej jedną resztą kwasu asparaginowego i/lub co najmniej jedną resztą kwasu glutaminowego.
Sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydu może różnić się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta kwasu asparaginowego i/lub kwasu glutaminowego, np. 1-15 reszt kwasu asparaginowego i/lub kwasu glutaminowego, w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 reszt kwasu asparaginowego i/lub kwasu glutaminowego, zostało wprowadzonych, korzystnie przez podstawienie.
Przykłady pozycji, w których reszty kwasu asparaginowego lub reszty kwasu glutaminowego mogą zostać wprowadzone obejmują, ale nie wyłącznie, pozycje w miejscach rozkładu proteolitycznego opisanych powyżej lub w ich pobliżu.
Zatem, resztę kwasu asparaginowego i/lub resztę kwasu glutaminowego, która ma zostać wprowadzona, korzystnie przez podstawienie można wybierać z grupy obejmującej I30D/E, K32D/E, A34D/E,
T37D/E, K38D/E, W41D/E, Y44D/E, S45D/E, D46C, L141D/E, E142D/E, K143D/E, R144D/E, L288D/E, R290D/E, G291D/E, A292D/E, Q313D/E, S314D/E, R315D/E, K316D/E, V317D/E, L390D/E, M391D/E, R392D/E, S393D/E, P395D/E, R396D/E, P397D/E, G398D/E, V399D/E, L401D/E, R402D/E, A403D/E,
P404D/E oraz ich kombinacje, w szczególności z grupy obejmującej K32D/E, Y44D/E, K143D/E, R290D/E, R315D/E, K341D/E, R392D/E, R396D/E, R402D/E oraz ich kombinacje.
Dodatkowo do powyżej wymienionych podstawień, polipeptyd koniugatu może obejmować usunięcie, korzystnie przez podstawienie, co najmniej jednej reszty kwasu asparaginowego i/lub co najmniej jednej reszty kwasu glutaminowego.
Wskutek stosunkowo dużej liczby reszt kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego w macierzystym polipeptydzie przewiduje się, że co najmniej jedną resztę kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego powinno się korzystnie usunąć, w szczególności przez podstawienie, aby uniknąć nadmiernego sprzęgania z ugrupowaniami niepolipeptydowymi.
Zatem, sekwencja aminokwasów FVII lub FVIIa polipeptydowej części koniugatu może różnić się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, np. 1-15 reszt kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 reszty kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, zostały usunięte, korzystnie przez podstawienie. Przykładowo resztę(y) kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, które mają być usunięte, korzystnie przez podstawienie, wybiera się z grupy obejmującej D33, D46, D48, E77, E82, D86, D87, E94, E99, D104, E116, D123, E132, E142, E163, D196, E210, D212, E215, D217, D219, E220, D256, E265, E270, D289, E296, D309, D319, E325, D334, D338, D343, E385, E394 oraz ich kombinacje.
Co najmniej jedna z reszt kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego, które są wprowadzone w wyznaczone miejsce w cząsteczce macierzystej, może być połączona z co najmniej jednym z powyżej wymienionych usunięć reszt kwasu asparaginowego lub kwasu glutaminowego. Zatem, sekwencja aminokwasów polipeptydowej FVII lub FVIIa części koniugatu może różnić się od pokazanej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna reszta kwasu asparaginowego lub reszta kwasu glutaminowego została usunięta, korzystnie przez podstawienie i co najmniej jedna reszta kwasu asparaginowego lub reszta kwasu glutaminowego została wprowadzona, korzystnie przez podstawienie.
Podczas gdy ugrupowanie niepolipeptydowe koniugatu, który zawiera grupę kwasu asparaginowego lub grupę kwasu glutaminowego jako grupę przyłączającą, może być ugrupowaniem niepolipeptydowym o takiej właściwości, korzystne jest, aby ugrupowanie niepolipeptydowe było cząsteczką polimeru lub organicznym środkiem modyfikującym, w szczególności cząsteczką polimeru, a koniugat wytwarza się, np. w sposób opisany przez Sakane i Pardridge, Pharmaceutical Research, tom 14, nr 8, 1997, str. 1085-1091.
Należy zdawać sobie sprawę, że jakiekolwiek zmiany aminokwasowe, w szczególności podstawienia, wymienione w tej części, można połączyć z jakimikolwiek innymi zmianami aminokwasowymi,
PL 204 285 B1 zwłaszcza podstawieniami wymienionymi w innych częściach ujawniających specyficzne modyfikacje aminokwasowe, obejmujące wprowadzenie i/lub usunięcie miejsc glikozylacji.
Koniugat według wynalazku, w którym ugrupowaniem niepolipeptydowym jest ugrupowanie cukrowe.
Koniugat według wynalazku jest koniugatem, który zawiera jedno ugrupowanie cukrowe kowalencyjnie przyłączone do polipeptydu, w którym sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od FVII lub FVIIa typu dzikiego przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że jedno niewystępujące naturalnie miejsce glikozylacji zostało wprowadzone przez podstawienie T106N lub V253N. Niewystępujące naturalnie miejsce glikozylacji może być wprowadzone w połączeniu z usunięciem naturalnie występującego miejsca glikozylacji. Wprowadzone miejsce glikozylacji jest w szczególności miejscem N-glikozylacji in vivo.
Przy stosowaniu w obecnym kontekście określenie „naturalnie występujące miejsce glikozylacji” dotyczy miejsc glikozylacji w pozycjach N145, N322, S52 i S60. W podobny sposób określenie „naturalnie występujące miejsce O-glikozylacji in vivo” obejmuje pozycje S52 i S60, podczas gdy „naturalnie występujące miejsce N-glikozylacji in vivo” obejmuje pozycje N145 i N322.
Zazwyczaj, sekwencja aminokwasów polipeptydu FVII lub FVIla różni się od przedstawionej w SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedno niewystępujące naturalnie miejsce glikozylacji (np. co najmniej jedno niewystępujące naturalnie miejsce N-glikozylacji in vivo), np. 1-15 niewystępujących naturalnie miejsc glikozylacji (np. 1-15 niewystępujących naturalnie miejsc N-glikozylacji in vivo), w szczególności 1-10, 1-6 lub 2-4 niewystępujące naturalnie miejsca glikozylacji (np. 1-10, 1-6 lub 2-4 niewystępujące naturalnie miejsca N-likozylacji in vivo), zostało wprowadzone, korzystnie przez podstawienie.
Należy zdawać sobie sprawę, że aby przygotować koniugat, w którym polipeptyd koniugatu zawiera jedno lub większą liczbę miejsc glikozylacji, polipeptyd musi ulegać ekspresji w komórce gospodarzu zdolnej do przyłączania ugrupowań cukrowych (oligosacharydowych) w miejscu(miejscach) glikozylacji lub inaczej zostać poddany glikozylacji in vitro. Przykłady glikozylujących komórek gospodarzy umieszczono poniżej w części zatytułowanej „Sprzęganie z ugrupowaniem cukrowym”.
W interesującej postaci wynalazku, miejsce glikozylacji in vivo jest wprowadzane w pozycję macierzystej cząsteczki FVII lub FVIIa zajmowaną przez resztę aminokwasową odsłoniętą na powierzchni cząsteczki, korzystnie z ponad 25% łańcucha bocznego odsłoniętego na działanie rozpuszczalnika, w szczególności z ponad 50% łańcucha bocznego odsłoniętego na działanie rozpuszczalnika (pozycje te zidentyfikowano tutaj w części Metody). Zatem miejsce N-glikozylacji wprowadza się tak, że reszta N wspomnianego miejsca jest zlokalizowana we wspomnianej pozycji. Analogicznie, miejsce O-glikozylacji wprowadza się tak, aby reszta S lub T tworząca takie miejsce była zlokalizowana we wspomnianej pozycji. Przykłady takich pozycji obejmują K32S/T, I42S/T, Y44S/T, K143S/T, R290S/T, R315S/T, K341S/T, R392S/T, R396S/T, R402S/T oraz ich kombinacje.
W odniesieniu do N-glikozylacji, miejsce glikozylacji in vivo wprowadza się do pozycji, w której wymagana jest tylko jedna mutacja, aby wytworzyć miejsce (przy czym wszystkie inne reszty aminokwasowe wymagane do utworzenia funkcjonalnego miejsca glikozylacji są już obecne w cząsteczce).
Innymi słowy, koniugat według wynalazku jest korzystnie koniugatem, w którym sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna naturalnie występująca sekwencja N-X'-X została podstawiona sekwencją N-X'-S lub N-X'-T, gdzie X' oznacza dowolny aminokwas, z wyjątkiem P, a X oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem S i T.
Podobnie, koniugat według wynalazku jest korzystnie koniugatem, w którym sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna naturalnie występująca sekwencja X-X'-S lub X-X'-T obecna w SEQ ID NO: 1 została podstawiona sekwencją N-X'-S lub N-X'-T, w której X' oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem P, a X oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem N.
Specyficzne przykłady takich podstawień tworzących miejsce N-glikozylacji in vivo obejmują podstawienia wybrane z grupy obejmującej F4S/T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S/T, E82S/T, N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S/T, G179N, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S/T, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N oraz ich kombinacje. Korzystnie, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej F4S/T, P10N, Q21N, W41N, A51N, G58N, G59S/T, N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S/T, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N, E220N, V253N, E265N, T267N, E270N, L280N, G291N, P303S/T, G318N, G331N, D334N, K337N, R353N, Y357N, M391N oraz ich kombinacje.
PL 204 285 B1
Alternatywnie, miejsce glikozylacji in vivo może być wprowadzone w pozycję zajmowaną przez resztę lizyny lub resztę argininy, korzystnie zajmowaną przez resztę lizyny, w szczególności tak, że reszta N miejsca N-glikozylacji lub reszta S lub T miejsca O-glikozylacji podstawia resztę lizyny.
Określając to inaczej, koniugat może stanowić koniugat, w którym sekwencja aminokwasów polipeptydu różni się od SEQ ID NO: 1 tym, że co najmniej jedna sekwencja K-X'-X lub sekwencja R-X'X, korzystnie sekwencja K-X'-X, naturalnie występująca w SEQ ID NO: 1 jest podstawiona sekwencją N-X'-S lub N-X'-T, w której X' oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem P, a X oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem S i T.
Konkretne przykłady takich podstawień tworzących miejsce N-glikozylacji in vivo obejmują podstawienia wybrane z grupy obejmującej K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, K62N+Q64S/T,
K85N+D87S/T, K137N+P139S/T, K143N+N145S/T, K148N+Q149S/T, K161N+E163S/T, K197N+K199S/T, K199N+W201S/T, K316N+G318S/T, K337N, K341N+D343S/T, K389N+M391S/T oraz ich kombinacje.
Miejsce glikozylacji, w szczególności miejsce N-glikozylacji, można wprowadzić w pozycje w miejsca rozkładu proteolitycznego opisane powyżej lub w ich pobliżu (patrz sekcja zatytułowana „Koniugat według wynalazku”).
Zatem konkretne przykłady takich podstawień tworzących miejsce N-glikozylacji in vivo obejmują podstawienie wybrane z grupy obejmujące K32N+A34S/T, F31N+D33S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T,
K38N+F40S/T, T37N+L39S/T, R36N+K38S/T, L39N+W41S/T, F40N+I42S/T, W41N, I42N+Y44S/T, S43N, Y44N+D46S/T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T, L141N+K143S/T, I140N+E142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, R290N+A292S/T, D289N+G291S/T, L288N+R290S/T, L287N+D289S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T, Q313N+R315S/T, Q312N, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, K341N+D343S/T, S339N+K341S/T, G342N, D343N+G345S/T, R392N+E394S/T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T, E394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+G398S/T,
P397N+V399S/T, G398N+L400S/T, V399N+L401S/T, L400N+R402S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+F405S/T, P404N+P406S/T oraz ich kombinacje, takie jak K143N+N145S/T+R315N+V317S/T.
Korzystnie, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T,
K143N+N145S/T, R290N+A292S/T, R315N+V317S/T, K341N+D343S/T, R392N+E394S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T oraz ich kombinacje, takie jak K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Korzystniej, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej K32N+A34T, K38N+F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R290N+A292T, R315N+V317T, K341N+D343T, R392N+E394T, R396N+G398T, R402N+P404T oraz ich kombinacje, w szczególności K143N+N145T+R315N+V317T.
Miejsce glikozylacji in vivo może zostać wprowadzone w pozycję, która nie tworzy ani części miejsca wiązania czynnika tkankowego, ani nie tworzy regionu miejsca aktywnego oraz grzbietu szczeliny wiążącej miejsca aktywnego, jak tutaj zdefiniowano. Przewiduje się, że takie warianty glikozylacyjne będą głównie należały do klasy aktywnych koniugatów, jak to zdefiniowano powyżej.
Zatem specyficzne przykłady podstawień tworzących takie miejsca N-glikozylacji in vivo mogą obejmować podstawienia wybrane z grupy obejmującej K32N+A34S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T,
K38N+F40S/T, T37N+L39S/T, W41N, Y44N+D46S/T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T, L141N+K143S/T, I140N+E142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, L288N+R290S/T, L287N+D289S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, R392N+E394S/T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T,
E394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+L400S/T, V399N+L401S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+F405S/T, P404N+P406S/T oraz ich kombinacje, takie jak K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Korzystnie, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej K32N+A34S/T,
K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+N145S/T, R315N+V317S/T, R392N+E394S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T oraz ich kombinacje, takie jak K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Korzystniej, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej K32N+A34T, K38N+F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R315N+V317T, R392N+E394T, R396N+G398T, R402N+P404T oraz ich kombinację, w szczególności K143N+N145T+R315N+V317T.
Miejsce glikozylacji in vivo może zostać wprowadzone w pozycję, która nie tworzy części czynnika tkankowego, ale tworzy część regionu miejsca aktywnego oraz grzbietu szczeliny wiążącej miejsca aktywnego, jak tutaj zdefiniowano. Przewiduje się, że takie warianty glikozylacyjne będą głównie należały do klasy nieaktywnych koniugatów, jak to zdefiniowano powyżej.
Zatem specyficzne przykłady podstawień tworzącym miejsce N-glikozylacji in vivo mogą obejmować podstawienia wybrane z grupy obejmującej I153N+G155S/T, Q167N+L169S/T, V168N+L170S/T,
PL 204 285 B1
L169N+L171S/T, L170N+V172S/T, L171N+N173S/T, A175S/T, A175N+L177S/T, L177N+G179S/T, G179N, G180N+L182S/T, T181N+I183S/T, V188N, V189N+A191S/T, S190N+A192S/T, A191N+H193S/T, H193N+F195S/T, F195N+K197S/T, D196N+I198S/T, K197N+K199S/T, I198N+N200S/T, K199N+W201S/T, W201N+N203S/T, R202S/T, I205S/T, V228N+I230S/T, I229N+P231S/T, I230N, P231N, S232N+Y234S/T, T233N+V235S/T, Y234N+P236S/T, V235N+G237S/T, P236N, G237N, T238N+N240S/T, T239N+H241S/T, H241N+I243S/T, D242S/T, I243N+L245S/T, A244N+L246S/T, L245N+R247S/T, L246N+L246S/T, V281N+G283S/T, S282N+W284S/T, G283N+G285S/T, W284N+Q286S/T, G285N+L287S/T, Q286N+L288S/T, D289N+G291S/T, R290N+A292S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, P321N+I323S/T, T324N+Y326S/T, E325N+M327S/T, Y326N+F327S/T, F328N+A330S/T, S339N+K341S/T, K341N+D343S/T, G342N+S344S/T, D343N+G345S/T, S344N+G346S/T, G345N+P347S/T, P347N+A349S/T, H348N, L358N+G360S/T, T359N+I361S/T, G360N+V362S/T, I361N, V362N+W364S/T, S363N+G365S/T, W364N+Q366S/T, G365N+G367S/T, T370N+G372S/T, V376N, Y377N+R379S/T, T378N+V380S/T, R379N, V380N+Q382S/T, Q382N+I384S/T, Y383N+E385S/T, W386N+Q388S/T, L387N+K389S/T, L400N+R402S/T oraz ich kombinacje. Korzystnie, podstawienie wybiera się z grupy obejmującej D289N+G291S/T, R290N+A292S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, S339N+K341S/T, K341N+D343S/T, G342N+S344S/T, D343N+G345S/T oraz ich kombinacje. Korzystniej, podstawienie wybiera się z grupy obejmują cej D289N+G291T, R290N+A292T, G291N, A292N+A294T, T293N+L295T, S339N+K341T, K341N+D343T, G342N+S344T, D343N+G345T oraz ich kombinacje.
Dodatkowo, poza ugrupowaniem cukrowym, koniugat może zawierać dodatkowe ugrupowania niepolipeptydowe, w szczególności cząsteczki polimeru, jak tutaj opisano, sprzężone z jedną lub większą liczbą grup przyłączających, obecnych w polipeptydowej części koniugatu.
Należy zdawać sobie sprawę, że jakiekolwiek zmiany aminokwasowe, w szczególności podstawienia, wymienione w tej części, można połączyć z jakimikolwiek innymi zmianami aminokwasowymi, w szczególnoś ci podstawieniami wymienionymi w innych częściach ujawniają cych specyficzne modyfikacje aminokwasowe.
Przykładowo jakiekolwiek glikozylowane warianty ujawnione w tej części, zawierające wprowadzone i/lub usunięte co najmniej jedno miejsce glikozylacji, takie jak wariant zawierający podstawienia R315N+V317T i/lub K143N+N145T, mogą być ponadto sprzężone z cząsteczką polimeru, taką jak PEG lub jakimkolwiek innym ugrupowaniem niepolipeptydowym. W tym celu sprzężenie można osiągnąć za pomocą grup przyłączających już obecnych w polipeptydzie FVII lub FVIIa, albo grup przyłączających, które zostały wprowadzone i/lub usunięte, w szczególności takich, że całkowita liczba 1-6, w szczególnoś ci 3-4 lub 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 grup przyłączających jest dostę pnych do sprzężenia.
Korzystnie, w koniugacie, w którym polipeptyd FVII lub FVIla zawiera dwa miejsca glikozylacji, liczbę i masę cząsteczkową ugrupowań niepolipeptydowych wybiera się tak, żeby całkowita masa cząsteczkowa dodana przez ugrupowanie niepolipeptydowe wynosiła 5-25 kDa, np. 10-25 kDa, w szczególności około 5 kDa, około 12 kDa, około 15 kDa lub około 20 kDa.
Nieaktywny koniugat
Koniugatom według wynalazku można zapewnić nieaktywność przez usunięcie co najmniej jednej reszty aminokwasowej zajmującej pozycję wybraną z grupy obejmującej R152, I153, S344, D242 i H193 w SEQ ID NO: 1. Usunię cie moż e wynikać z podstawienia lub delecji jednej lub wię kszej liczby zidentyfikowanych powyżej reszt aminokwasowych. Korzystnie, usunięcie wynika z podstawienia, w szczególności z konserwatywnego podstawienia. Zgodnie z tym, stosowany tutaj nieaktywny polipeptyd FVII lub FVIIa może zawierać jedno lub większą liczbę z następujących podstawień: R152X, I153X, S344X, D242X lub H193X, gdzie X oznacza dowolną resztę aminokwasową, korzystnie taką, która prowadzi do podstawienia konserwatywnego. Przykładowo nieaktywny polipeptyd FVII lub FVIIa zawiera mutację R152X, w której X oznacza dowolną resztę aminokwasową inną niż lizyna (ze względu na to, że lizyna tworzy część miejsca cięcia proteazowego). Inne przykłady specyficznych podstawień obejmują I153A/V/L; S344T/A/G/Y; D242E/A i/lub H193R/A.
Alternatywnie, aktywnemu polipeptydowi FVII lub FVIIa można zapewnić nieaktywność przez karbamylowanie grupy α-aminowej I153 lub przez skompleksowanie polipeptydu z inhibitorem proteazy serynowej. Odpowiedni inhibitor proteazy serynowej wybrany jest przykładowo z grupy obejmującej związek fosforoorganiczny, fluorek sulfanylu, chlorowcometyloketon peptydu, korzystnie chlorometyloketon Dansylo-Phe-Pro-Arg, chlorometyloketon Dansylo-Glu-Glu-Arg, chlorometyloketon DansyloPhe-Phe-Arg lub chlorometyloketon Phe-Phe-Arg lub azapeptyd.
Koniugatowi można także zapewnić nieaktywność przez wprowadzenie co najmniej jednego miejsca glikozylacji w pozycję wybraną tak, żeby następująca potem glikozylacja dezaktywowała koniugat.
PL 204 285 B1
Jak wyjaśniono powyżej w ostatniej części sekcji zatytułowanej „Koniugat według wynalazku, w którym ugrupowanie niepolipeptydowe jest ugrupowaniem cukrowym” korzystne jest, aby takie miejsca glikozylacji były wprowadzone w pozycji, która nie tworzy części czynnika tkankowego, ale tworzy część regionu miejsca aktywnego i grzbiet szczeliny wiążącej miejsca aktywnego, jak tutaj zdefiniowano. Konkretne przykłady korzystnych podstawień zamieszczono powyżej w części zatytułowanej „Koniugat według wynalazku, w którym ugrupowanie niepolipeptydowe jest ugrupowaniem cukrowym”.
Ugrupowanie niepolipeptydowe koniugatu według wynalazku
Jak wskazano dokładniej powyżej, ugrupowanie niepolipeptydowe koniugatu według wynalazku stanowi ugrupowanie cukrowe (na drodze glikozylacji in vivo). Może ono nadać wymagane właściwości polipeptydowej części koniugatu, w szczególności może wydłużyć funkcjonalny okres półtrwania in vivo i/lub wydłużyć okres półtrwania w osoczu. Polipeptydowa część koniugatu jest normalnie sprzężona z tylko jednym typem ugrupowania niepolipeptydowego, ale może być także sprzężona z dwoma lub większą liczbą typów ugrupowań niepolipeptydowych, np. z cząsteczką polimeru i ugrupowaniem cukrowym, grupą lipofilową i ugrupowaniem cukrowym, z organicznym środkiem modyfikującym i ugrupowaniem cukrowym, z grupą lipofilową i czą steczką polimeru, itd. Sprz ę ganie z dwoma lub większą liczbą różnych ugrupowań niepolipeptydowych można wykonać równocześnie lub kolejno.
Sposoby wytwarzania koniugatu według wynalazku
W poniż szych częściach „Sprzęganie ze związkiem lipofilowym”, „Sprzę ganie z ugrupowaniem cukrowym” oraz „Sprzęganie z organicznym środkiem modyfikującym” opisano sprzęganie z konkretnymi typami ugrupowań niepolipeptydowych. Ogólnie, sprzężony polipeptyd według wynalazku można wytwarzać przez hodowlę odpowiednich komórek gospodarzy w warunkach zapewniających ekspresję polipeptydu oraz odzyskiwania polipeptydu, przy czym a) polipeptyd zawiera jedno miejsce N-glikozylacji, a komórka gospodarz jest komórką eukariotyczną zdolną do glikozylacji in vivo i/lub b) polipeptyd poddaje się sprzęganiu z ugrupowaniem niepolipeptydowym in vitro.
Należy zdawać sobie sprawę, że sprzęganie powinno być zaprojektowane tak, aby wytworzyć optymalną cząsteczkę w odniesieniu do liczby przyłączonych ugrupowań niepolipeptydowych, wielkości i postaci takich cząsteczek (np. czy są one liniowe lub rozgałęzione) oraz miejsc(a) przyłączają cego polipeptydu. Masa cząsteczkowa ugrupowania niepolipeptydowego, które ma być zastosowane, może np. zostać wybrana na podstawie wymaganego efektu, który ma zostać osiągnięty. Przykładowo, gdy pierwszym celem sprzęgania jest otrzymanie koniugatu o wysokiej masie cząsteczkowej (np. aby zmniejszyć klirens nerkowy), zazwyczaj wymagane jest sprzęganie tak niewielu ugrupowań niepolipeptydowych o wysokiej masie cząsteczkowej, jak to tylko jest możliwe, aby osiągnąć wymaganą masę cząsteczkową. Gdy wymagany jest wysoki stopień ekranowania, można go osiągnąć za pomocą wystarczająco dużej liczby ugrupowań niepolipeptydowych o niskiej masie cząsteczkowej (np. o masie cząsteczkowej około 300 Da - 5 kDa, np. o masie cząsteczkowej około 300 Da - 2 kDa), aby skutecznie osłaniać wszystkie lub większość miejsc trawienia proteazy lub innych trudnych do obrony miejsc polipeptydu.
Sprzęganie ze związkiem lipofilowym
Polipeptyd i związek lipofilowy można sprzęgać ze sobą, bezpośrednio lub za pomocą łącznika. Związek lipofilowy może być naturalnym związkiem, takim jak nasycony lub nienasycony kwas tłuszczowy, diketon kwasu tłuszczowego, terpen, prostaglandyna, witamina, karotenoid lub steryd, albo związkiem syntetycznym, takim jak kwas węglowy, alkohol, amina i kwas sulfonowy, z jednym lub większą liczbą alkilowych-, arylowych-, alkenylowych- lub innych wielonienasyconych związków. Sprzęganie polipeptydu ze związkiem lipofilowym, ewentualnie przez łącznik, można wykonać znanymi sposobami, np. jak opisano w Bodanszky, Peptide Synthesis, John Wiley, Nowy Jork, 1976 oraz w WO 96/12505.
Sprzęganie cząsteczki polimeru, obejmujące sprzęganie cząsteczki polimeru z N-końcem polipeptydu
Cząsteczkę polimeru, którą sprzęga się z polipeptydem, może być jakąkolwiek odpowiednią cząsteczką polimeru, taką jak naturalny homopolimer lub heteropolimer, zazwyczaj o masie cząsteczkowej w zakresie około 300-100000 Da, np. około 500-20000 Da, korzystniej w zakresie około 500-15000 Da, jeszcze korzystniej w zakresie około 2-12 kDa, np. w zakresie około 3-10 kDa. Gdy określenie „około” stosuje się tutaj w powiązaniu z pewną masą cząsteczkową, słowo „około” oznacza przybliżoną średnią masę cząsteczkową i odzwierciedla fakt, że normalnie będzie występować pewien rozrzut masy cząsteczkowej w danym preparacie polimeru.
Przykłady homopolimerów obejmują poliole (tj. poli-OH), poliaminy (tj. poli-NH2) i polikwasy karboksylowe (tj. poli-COOH). Heteropolimer jest polimerem zawierającym różne grupy sprzęgające, takie jak grupa hydroksylowa i grupa aminowa.
PL 204 285 B1
Przykłady odpowiednich cząsteczek polimerów obejmują cząsteczki polimerów wybrane z grupy obejmującej politlenek alkilenu (PAO), włącznie z glikolem polialkilenowym (PAG), takim jak glikol polietylenowy (PEG) i glikol polipropylenowy (PPG), rozgałęzione PEG, polialkohol winylowy (PVA), polikarboksylan, poli(winylopirolidon), kopolimer etylen-bezwodnik maleinowy, kopolimer styrenbezwodnik maleinowy, dekstran, w tym karboksymetylodekstran lub inne biopolimery odpowiednie do zmniejszania immunogenności i/lub wydłużania funkcjonalnego czasu półtrwania in vivo i/lub czasu półtrwania w surowicy. Innym przykładem cząsteczki polimeru jest ludzka albumina lub inne powszechne białko osocza. Ogólnie, polimery pochodzące od glikolu polialkilenowego wykazują zgodność biologiczną, nie są toksyczne, nie są antygeniczne, nie są immunogenne, posiadają różną rozpuszczalność w wodzie i są łatwo wydalane z organizmów żywych.
PEG jest korzystną cząsteczką polimerową, ze względu na to, że posiada tylko kilka grup reaktywnych zdolnych do sprzęgania w porównaniu z, np. polisacharydami, takimi jak dekstran. W szczególności, monofunkcjonalny PEG, np. glikol metoksypolietylenowy (mPEG), jest interesujący, gdyż chemizm jego sprzęgania jest stosunkowo prosty (tylko jedna grupa reaktywna jest dostępna do sprzęgania z grupami przyłączającymi polipeptydu). W konsekwencji wyeliminowane jest ryzyko tworzenia wiązań poprzecznych, przez co powstałe koniugaty polipeptydów są bardziej homogenne, a reakcja cząsteczek polimeru z polipeptydem jest łatwiejsza do kontrolowania.
Aby osiągnąć przyłączenie kowalencyjne cząsteczki (cząsteczek) polimeru do polipeptydu, końcowe grupy hydroksylowe muszą być w postaci aktywowanej, czyli z reaktywnymi grupami funkcyjnymi (których przykładami są pierwszorzędowe grupy aminowe, hydrazydowe (HZ), tiolowe, bursztynianowe (SUC), sukcynoimidylo-bursztynianowe (SS), sukcynoimidylo-sukcynoamidowe (SSA), sukcynoimidylo-propionianowe (SPA), sukcynoimidylo-karboksymetylanowe (SCM), benzotriazolo-węglanowe (BTC), N-hydroksysukcynoimidowe (NHS), aldehydowe, nitrofenylo-węglanowe (NPC) i tresylanowe (TRES)). Odpowiednie aktywowane cząsteczki polimerów są dostępne w handlu, np. z Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA, lub z PolyMASC Pharmaceuticals plc, UK.
Alternatywnie, cząsteczki polimerów można aktywować zwykłymi, znanymi sposobami, np. ujawnionymi w WO 90/13540. Konkretne przykłady aktywowanych liniowych lub rozgałęzionych cząsteczek polimerów do zastosowań według wynalazku opisano w katalogach Shearwater Polymers, Inc. na rok 1997 i 2000 Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol i Derivatives).
Do konkretnych przykładowych aktywowanych polimerów PEG należą następujące liniowe PEG: NHS-PEG (np. SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG i SCM-PEG) oraz NOR-PEG, BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG i MAL-PEG i rozgałęzione PEG, takie jak PEG2-NHS oraz ujawnione w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki 5932462 i 5643575. Ponadto, poniższe publikacje, ujawniają użyteczne cząsteczki polimerów i/lub chemizm PEG-ilacji: opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5824778 i 5476653, WO 97/32607, EP 229108, EP 402378, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4902502, 5281698, 5122614 i 5219564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921131, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5736625, WO 98/05363, EP 809996, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5629384, WO 96/41813, WO 96/07670, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5473034 i 5516673, EP 605963, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5382657, EP 510356, EP 400472, EP 183503 i EP 154316.
Sprzęganie polipeptydu i aktywowanej cząsteczki polimeru prowadzi się dowolnym znanym sposobem, np. opisanym w poniższych pozycjach literaturowych (które także opisują odpowiednie sposoby aktywacji cząsteczek polimerów): R.F. Taylor, (1991), „Protein immobilisation. Fundamental and applications”, Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), „Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press, Floryda, USA; G.T. Hermanson i inni, (1993), „Immobilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, N.Y.). Fachowiec będzie zdawać sobie sprawę, żeby sposób aktywacji i/lub chemizm sprzęgania, które mają zostać zastosowane, zależą od grup(y) przyłączającej(ych) polipeptydu (których przykłady podano powyżej), a także od grup funkcyjnych polimeru (np. w postaci grupy aminowej, hydroksylowej, karboksylowej, aldehydowej, sulfydrylowej, sukcynoimidylowej, maleimidowej, winylosulfonowej lub chlorowcooctanowej). PEG-ilacja może być ukierunkowana na sprzęganie ze wszystkimi doPL 204 285 B1 stępnymi grupami przyłączającymi na polipeptydzie (czyli takimi grupami przyłączającymi, które są odsłonięte na powierzchni polipeptydu) lub może być ukierunkowana do jednej lub większej liczby określonych grup przyłączających, np. N-końcowej grupy aminowej, jak opisano w opisie patentowym Stanów zjednoczonych Ameryki nr 5985265. Ponadto sprzęganie można przeprowadzić w jednym etapie lub w sposób stopniowy (np. jak opisano w WO 99/55377).
Należy zdawać sobie sprawę, że PEG-ilację projektuje się tak, aby otrzymać optymalną cząsteczkę w odniesieniu do liczby przyłączonych cząsteczek PEG, wielkości i postaci tych cząsteczek (np. czy są one liniowe czy rozgałęzione) i miejsc(a) przyłączenia w polipeptydzie. Masę cząsteczkową stosowanego polimeru można np. wybrać na podstawie wymaganego efektu, który ma zostać osiągnięty. Przykładowo, gdy pierwszym celem sprzęgania jest osiągnięcie koniugatu o wysokiej masie cząsteczkowej (np. takiej, aby zmniejszyć klirens nerkowy), zazwyczaj wymagane jest sprzęgnięcie możliwie jak najmniejszej liczby cząsteczek polimeru o dużej masie cząsteczkowej. Gdy wymagany jest wysoki stopień osłaniania, można go osiągnąć przy użyciu wystarczająco dużej liczby cząsteczek polimeru o niskiej masie cząsteczkowej (np. o masie cząsteczkowej około 300 Da - 5 kDa), aby skutecznie osłaniać wszystkie lub większość miejsc trawienia proteazy lub innych trudnych do obrony miejsc polipeptydu. Przykładowo można stosować 2-8, np. 3-6 takich cząsteczek polimerów.
W powiązaniu z sprzęganiem z tylko pojedynczą grupą przyłączającą na białku (np. N-końcową grupą aminową), korzystne może być, aby cząsteczka polimeru, która może być liniowa lub rozgałęziona, miała wysoką masę cząsteczkową, korzystnie około 10-25 kDa, tak jak około 15-25 kDa, np. około 20 kDa.
Normalnie, sprzęganie polimeru przeprowadza się w warunkach dostosowanych do przereagowania jak największej liczby dostępnych grup przyłączania polimeru z cząsteczkami polimeru. Można to osiągnąć przez użycie odpowiedniego nadmiaru molowego polimeru względem polipeptydu. Zazwyczaj, stosunek molowy aktywowanych cząsteczek polimeru do polipeptydu wynosi do około 1000:1, np. do około 200:1, lub do około 100:1. W niektórych przypadkach stosunek może być jednak nieco niższy, taki jak do około 50:1, 10:1 lub 5:1 w celu osiągnięcia optymalnego przereagowania.
Możliwe jest także sprzęganie cząsteczek polimeru z polipeptydem przez łącznik. Odpowiednie łączniki są dobrze znane fachowcom. Korzystnym przykładem jest chlorek cyjanurowy (Abuchowski i inni, (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4179337; Shafer i inni, (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378).
Po sprzęganiu pozostałe aktywowane cząsteczki polimerów blokuje się znanymi sposobami, np. przez dodanie pierwszorzędowej aminy do mieszaniny reakcyjnej i powstałe zdezaktywowane cząsteczki polimerów usuwa się w odpowiedni sposób.
Należy zdawać sobie sprawę, że zależnie od okoliczności, np. od sekwencji aminokwasów polipeptydu, charakter stosowanego aktywowanego związku PEG i konkretnych warunków PEG-ilacji, włącznie ze stosunkiem molowym PEG do polipeptydu, można osiągnąć zmienne stopnie PEG-ilacji, przy czym wyższy stopień PEG-ilacji ogólnie osiąga się przy wyższym stosunku PEG do polipeptydu. PEG-ilowane polipeptydy otrzymane w danym procesie PEG-ilacji będą, jednakże, normalnie charakteryzować się stochastycznym rozkładem koniugatów polipeptydów o nieznacznie różniącym się stopniu PEG-ilacji.
Koniugat polipeptydu według wynalazku może zawierać cząsteczkę polimeru kowalencyjnie przyłączoną do A1 na końcu N polipeptydu FVII lub FVIIa typu dzikiego przedstawionego w SEQ ID NO: 1, przy czym ta cząsteczka polimeru jest jedyną cząsteczką polimeru przyłączoną do polipeptydu. Korzystnie, takie koniugaty polipeptydu są tymi, które zawierają pojedynczą cząsteczkę PEG przyłączoną do N-końca polipeptydu i nie zawierają innych cząsteczek PEG. W szczególności, korzystna jest liniowa lub rozgałęziona cząsteczka PEG o masie cząsteczkowej co najmniej około 5 kDa, w szczególności około 10-25 kDa, tak jak około 15-25 kDa, np. około 20 kDa. Koniugat polipeptydu może ponadto zawierać jedno lub większą liczbę ugrupowań cukrowych przyłączonych do miejsca Nlub O-glikozylacji polipeptydu lub ugrupowania cukrowe przyłączone przez glikozylację in vitro.
Koniugat polipeptydu może zawierać cząsteczki polimerów kowalencyjnie przyłączone do A1 N-końca i do I153 N-końca polipeptydu FVIIa typu dzikiego przedstawionego w SEQ ID NO: 1, przy czym te cząsteczki polimerów są jedynymi cząsteczkami polimeru przyłączonymi do polipeptydu. Takie koniugaty polipeptydu są tymi, które zawierają cząsteczkę PEG przyłączoną do obydwu N-końców FVIIa i nie zawierają innych cząsteczek PEG. W szczególności, korzystna jest liniowa lub rozgałęziona cząsteczka PEG o masie cząsteczkowej co najmniej około 5 kDa, w szczególności około 10-25 kDa, tak jak około 15-25 kDa, np. około 20 kDa. Koniugat polipeptydu według tej postaci może ponadto zawie22
PL 204 285 B1 rać jedno lub większą liczbę ugrupowań cukrowych przyłączonych do miejsca N- lub O-glikozylacji polipeptydu lub ugrupowania cukrowe przyłączone przez glikozylację in vitro.
Jednym korzystnym sposobem selektywnego sprzęgania cząsteczek polimeru, takich jak cząsteczki PEG, z N-końcem polipeptydu, jest sposób opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5985265. Sposób ten polega na redukcyjnym alkilowaniu (reakcji N-końcowej grupy aminowej polipeptydu z polipeptydem zawierającym grupę aldehydową, takim jak aldehydoPEG, w obecności środka redukującego, takiego jak NaCNBH3). Sposób ten wykorzystuje różną reaktywność różnych typów pierwszorzędowych grup aminowych (lizynowej względem N-końcowej) dostępnych do modyfikacji w polipeptydzie, co powoduje zasadniczo selektywną modyfikację polipeptydu na N-końcu cząsteczką polimeru zawierającą grupę karbonylową, taką jak aldehydo-PEG. Reakcję prowadzi się przy pH, które umożliwia wykorzystanie różnicy pKa pomiędzy grupami ε-aminowymi reszty lizyny, a grupą α-aminową reszty N-końcowej polipeptydu. Aby osiągnąć taką różniącą się reaktywność, reakcję typowo przeprowadza się w lekko kwasowych warunkach. Specyficzne przykłady odpowiednich zakresów pH obejmują pH 4,5-7, takie jak pH 4,5-6, np. pH 5-6, w szczególności pH około 5.
Sprzężony polipeptyd może zawierać cząsteczkę PEG przyłączoną do każdej reszty lizyny w polipeptydzie, dostępnej do PEG-ilacji, w szczególności liniową lub rozgałęzioną cząsteczkę PEG, o masie cząsteczkowej około 1-15 kDa, zazwyczaj około 2-12 kDa, tak jak około 3-10 kDa, np. około 5 lub 6 kDa.
W jeszcze innej postaci, sprzężony polipeptyd może zawierać cząsteczkę PEG przyłączoną do każdej reszty lizyny dostępnej do PEG-ilacji w polipeptydzie i dodatkowo do N-końcowej reszty aminokwasowej polipeptydu.
Kowalencyjne sprzęganie in vitro ugrupowań węglowodanowych (takich jak dekstran) z resztami aminokwasowymi polipeptydu można także stosować, np. jak opisano w WO 87/05330 oraz w Aplin i inni, CRC Crit Rev. Biochem, str. 259-306, 1981. Sprzęganie in vitro ugrupowań węglowodanowych lub PEG z resztami Gln związanymi z białkiem lub peptydem można przeprowadzać z użyciem transglutaminaz (TGaz). Transglutaminazy katalizują przeniesienie donorowych grup aminowych na związane z białkiem lub peptydem reszty Gln w tak zwanej reakcji sieciowania. Donorowe grupy aminowe mogą być związane z białkiem lub peptydem, tak jak grupa ε-aminowa w resztach Lys lub mogą być częścią małej lub dużej cząsteczki organicznej. Przykładem małej cząsteczki organicznej działającej jako donor aminowy w katalizowanym TGazą sieciowaniu jest putrescyna (1,4-diaminobutan). Przykładem większej cząsteczki organicznej działającej jako donor aminowy w katalizowanym TGazą sieciowaniu jest zawierający grupę aminową PEG (Sato i inni, 1996, Biochemistry 35,13072-13080).
TGazy, ogólnie, są wysoce specyficznymi enzymami i nie każda reszta Gln odsłonięta na powierzchni białka jest dostępna do katalizowanego TGazą sieciowania z substancjami zawierającymi grupę aminową. Przeciwnie, tylko kilka reszt Gln jest naturalnie działającymi substratami TGazy, ale dokładne parametry decydujące o tym, która reszta Gln jest dobrym substratem TGazy, pozostają niewyjaśnione. Zatem aby nadać białku podatność na reakcje sieciowania katalizowane TGazą, często wstępnie w pewnych pozycjach dodaje się fragmenty sekwencji aminokwasów, odnośnie których wiadomo, że działają bardzo dobrze jako substrat dla TGazy. Znanych jest kilka sekwencji aminokwasów, które są lub zawierają doskonałe naturalne substraty dla TGazy, np. substancja P, elafina, fibrynogen, fibronektyna, inhibitor a2-plazminy, α-kazeiny i β-kazeiny.
Sprzęganie z ugrupowaniem cukrowym
Aby osiągnąć glikozylację in vivo cząsteczki FVII zawierającej jedno lub większą liczbę miejsc glikozylacji, sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd musi zostać wstawiona do glikozującego, eukariotycznego gospodarza ekspresji. Ekspresyjną komórkę gospodarza można wybrać z komórek grzybów (grzybów nitkowatych lub drożdży), owadów lub zwierząt lub z transgenicznych komórek roślinnych. W jednej postaci komórką gospodarzem jest komórka ssacza, taka jak komórka CHO, BHK lub HEK, np. HEK 293, lub komórka owada, taką jak komórka SF9, albo komórką drożdży, np. S. cerevisiae lub Pichia pastoris, lub którakolwiek z komórek gospodarzy wymienionych poniżej.
Sprzęganie z organicznym środkiem modyfikującym
Kowalencyjną modyfikację polipeptydu można przeprowadzić przez reakcję jednej lub większej liczby grup przyłączających polipeptydu z organicznym środkiem modyfikującym. Odpowiednie modyfikujące środki i sposoby są znane. Przykładowo, reszty cysteinylowe najczęściej poddaje się reakcji z α-chlorowcooctanami (i odpowiednimi aminami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid, z otrzymaniem pochodnych karboksymetylowych lub karboksyamidometylowych. Reszty cysteinylowe modyfikuje się także przez reakcję z bromotrifluoroacetonem, kwasem a-bromo-e-(4-imidozoilo)propionowym, fosforanem chloroacetylu,
PL 204 285 B1
N-alkilomaleimidami, disulfidem 3-nitro-2-pirydylu, disulfidem metylo-2-pirydylu, p-chlorobenzoesanem rtęciowym, 2-chloromerkurio-4-nitrofenolem lub chloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolem. Reszty histydylowe modyfikuje się przez reakcję z pirowęglanem dietylu przy pH 5,5-7,0, ze względu na to, że ten środek jest stosunkowo specyficzny dla histydylowego łańcucha bocznego. Bromek p-bromofenacylu jest także przydatny. Reakcję korzystnie przeprowadza się w 0,1 M kakodylanie sodu w pH 6,0. Reszty lizynylowe i końcowe reszty aminowe poddaje się reakcji z bezwodnikiem bursztynowym lub bezwodnikiem innego kwasu karboksylowego. Modyfikacja za pomocą tych środków wywołuje odwrócenie ładunku reszt lizynylowych. Inne odpowiednie odczynniki do modyfikacji reszt zawierających grupy α-aminowe obejmują imidoestry, takie jak pikolinoimidan metylu, fosforan pirydoksalu, pirydoksal, chloroborowodorek, kwas trinitrobenzenosulfonowy, O-metyloizomocznik, 2,4-pentanodion i katalizowaną transaminazą reakcję z glioksylanem. Reszty arginylowe modyfikuje się przez reakcję z jednym lub większą liczbą standardowych odczynników, między innymi z fenyloglioksalem, 2,3-butanodionem, 1,2-cykloheksanodionem i ninhydryną. Modyfikacja reszt argininy wymaga, aby przeprowadzać reakcję w warunkach zasadowych, ze względu na wysokie pKa guanidynowej grupy funkcyjnej.
Ponadto, odczynniki te mogą reagować z grupami lizyny, a także guanidynową grupą argininy. Karboksylowe łańcuchy boczne (asparaginowy i glutamylowy) selektywnie modyfikuje się przez reakcję z karbodiimidami (R-N=C=N-R'), gdzie R i R' oznaczają różne grupy alkilowe, takimi jak 1-cyklooheksylo-3-(2-morfolinylo-4-etylo)karbodiimid lub 1-etylo-3-(4-azonia-4,4-dimetylopentylo)karbodiimid. Ponadto reszty asparaginowa i glutamylowa mogą zostać przeprowadzone w reszty asparaginylowe i glutaminylowe, w reakcji z jonami amoniowymi.
Blokowanie miejsca aktywnego
Opisano, że nadmierne sprzęganie z polimerem może prowadzić do utraty aktywności polipeptydu, z którym sprzęgnięte jest ugrupowanie niepolipeptydowe. Problem ten może zostać wyeliminowany, np. przez usunięcie grup przyłączających umiejscowionych w miejscu aktywnym lub przez odwracalne zablokowanie miejsca aktywnego przed sprzęganiem, tak by miejsce aktywne było zablokowane podczas sprzęgania. Ostatnia strategia stanowi kolejne postacie wynalazku (pierwsza strategia została poparta przykładami powyżej, np. przez usunięcie reszt lizyny, które mogą być zlokalizowane w pobliżu miejsca aktywnego). W szczególności, według drugiej strategii sprzęganie polipeptydu z ugrupowaniem niepolipeptydowym przeprowadza się w warunkach, w których miejsce aktywne polipeptydu jest zablokowane przez cząsteczkę pomocniczą, np. czynnik tkankowy zdolny do wiązania miejsca aktywnego polipeptydu lub inhibitor proteazy serynowej.
Korzystnie, cząsteczka pomocnicza jest taką, która specyficznie rozpoznaje miejsce aktywne polipeptydu, np. receptor, w szczególności czynnik tkankowy, pełnej długości lub odpowiednio skrócona forma czynnika tkankowego lub są to dwie cząsteczki, z których jedną stanowi czynnik tkankowy, a drugą peptyd lub inhibitor peptydowy wiążącym się z obszarem wokół triady katalitycznej (korzystnie zdefiniowanym jako reszty aminokwasowe w obrębie 1 nm (10 A) od któregokolwiek atomu triady katalitycznej) i w ten sposób chroniącym go.
Alternatywnie, cząsteczka pomocnicza może być przeciwciałem, w szczególności przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym polipeptyd FVII. W szczególności, cząsteczką pomocniczą może być neutralizujące przeciwciało monoklonalne.
Polipeptyd może mieć możliwość oddziaływania z cząsteczką pomocniczą przed przeprowadzeniem sprzęgania. Zapewnia to, że miejsce czynne polipeptydu jest osłaniane lub chronione i w konsekwencji niedostępne do modyfikacji przez ugrupowanie niepolipeptydowe, takie jak polimer. Po wyeluowaniu od cząsteczki pomocniczej, koniugat pomiędzy ugrupowaniem niepolipeptydowym i polipeptydem można odzyskać z co najmniej częściowo zachowanym miejscem funkcyjnym.
Sprzęganie, następujące po zablokowaniu w polipeptydzie miejsca czynnego, z polimerem, związkiem lipofilowym, ugrupowaniem cukrowym, organicznym środkiem modyfikującym lub z jakimkolwiek innym środkiem, prowadzi się normalnie, np. w sposób opisany w powyższych częściach zatytułowanych „Sprzęganie z
Bez względu na naturę cząsteczki pomocniczej, która ma być zastosowana do osłonięcia miejsca aktywnego polipeptydu przed sprzęgnięciem, wymagane jest, aby cząsteczka pomocnicza nie zawierała wcale lub zawierała tylko kilka grup przyłączających dla wybranego ugrupowania niepolipeptydowego w części cząsteczki, w której sprzęgnięcie z takimi grupami przeszkodzi w desorpcji sprzężonego polipeptydu od cząsteczki pomocniczej. W ten sposób można osiągnąć selektywne sprzęganie z grupą przyłączającą obecną w nieosłanianych częściach polipeptydu i możliwe jest ponowne użycie cząsteczki pomocniczej w powtarzanych cyklach sprzęgania. Przykładowo, gdy ugrupowanie niepolipeptydowe jest cząsteczką
PL 204 285 B1 polimeru, taką jak PEG, która zawiera grupę ε-aminową lizyny lub N-końcową resztę aminokwasową jako grupę przyłączającą, wymagane jest aby cząsteczka pomocnicza była zasadniczo wolna od sprzęgalnych grup ε-aminowych, korzystnie wolna od jakichkolwiek grup ε-aminowych. Zgodnie z tym, cząsteczka pomocnicza może być białkiem lub peptydem zdolnym do wiązania miejsca czynnego polipeptydu, które to białko lub peptyd są wolne od jakichkolwiek sprzęgalnych grup przyłączających dla wybranego ugrupowania niepolipeptydowego.
Cząsteczka pomocnicza może być najpierw kowalencyjnie wiązana z fazą stałą, taką jak materiały stanowiące wypełnienie kolumny, np. perełki Sephadex'u lub agarozowe, lub z powierzchnią, np. naczynia reakcyjnego. Następnie, polipeptyd nanosi się na materiał kolumny niosący cząsteczkę pomocniczą i sprzęganie przeprowadza się zgodnie ze znanymi sposobami, np. jak opisano w powyższych częściach zatytułowanych „Sprzęganie z....”. Procedura ta pozwala, aby sprzężony polipeptyd został oddzielony od cząsteczki pomocniczej przez eluowanie. Sprzężony polipeptyd eluuje się standardowymi technikami w warunkach fizykochemicznych, które nie prowadzą do zasadniczego rozkładu koniugatu polipeptydu. Fazę ciekłą zawierającą sprzężony polipeptyd oddziela się od fazy stałej, z którą zostaje kowalencyjnie związana cząsteczka pomocnicza. Rozdzielenie można wykonać w inny sposób: cząsteczkę pomocniczą można przykładowo zmodyfikować drugą cząsteczką (np. biotyną), która może być rozpoznawana przez specyficzny czynnik wiążący (np. streptawidynę). Specyficzny czynnik wiążący można związać z fazą stałą, co pozwoli oddzielić sprzężony polipeptyd od kompleksu cząsteczka pomocnicza-druga cząsteczka przez przepuszczenie przez drugą kolumnę cząsteczka pomocnicza-faza stała, która zatrzyma, po przeprowadzonym następnie eluowaniu, kompleks cząsteczka pomocnicza-druga cząsteczka, ale nie sprzężony polipeptyd. Sprzężony polipeptyd można uwolnić od cząsteczki pomocniczej w jakikolwiek odpowiedni sposób. Odbezpieczenie można wykonać zapewniając warunki, w których cząsteczka pomocnicza dysocjuje z miejsca aktywnego FVII, z którym jest związana. Przykładowo kompleks pomiędzy przeciwciałem, z którym polimer jest sprzężony, i przeciwciałem przeciw-idiotypowym może ulec dysocjacji przez doprowadzenie pH do wartości kwasowych lub zasadowych. Jeszcze korzystniejsze jest użycie przeciwciała specyficznego względem konformacji, rozpoznającego specyficzną dla Ca+ konformację FVII, które w konsekwencji może zostać wyeluowane z użyciem EDTA w łagodnych warunkach.
Przyłączenie inhibitora proteazy serynowej
Przyłączenie inhibitora proteazy serynowej można przeprowadzić w sposób opisany w WO 96/12800.
Sprzęganie znakowanego polipeptydu
W alternatywnej postaci polipeptyd jest eksprymowany jako białko fuzyjne ze znacznikiem, czyli sekwencją aminokwasów lub peptydem, zawierającymi zazwyczaj 1-30, np. 1-20 reszt aminokwasowych. Oprócz zapewniania szybkiego i łatwego oczyszczania, znacznik jest dogodnym narzędziem do osiągnięcia sprzęgania pomiędzy znakowanym polipeptydem i ugrupowaniem niepolipeptydowym. W szczególności znacznik można stosować do osiągnięcia sprzężenia na płytkach do mikromianowania lub innych nośnikach, takich jak kulki paramagnetyczne, na których znakowany polipeptyd może być unieruchomiony przez znacznik. Sprzęganie znakowanego polipeptydu np. na płytkach do mikromianowania ma tę zaletę, że znakowany polipeptyd może być unieruchomiony na płytkach do mikromianowania bezpośrednio z pożywki hodowlanej (zasadniczo bez oczyszczania) i poddany sprzęganiu. Zatem, całkowita liczba etapów obróbki (od ekspresji do sprzęgania) może zostać zmniejszona. Ponadto, znacznik może działać jako cząsteczka rozdzielająca, zapewniająca lepszą dostępność unieruchomionego polipeptydu, który ma być sprzęgany. Sprzęganie z użyciem znakowanego polipeptydu można przeprowadzić z którymkolwiek z ugrupowań niepolipeptydowych tutaj ujawnionych, np. z cząsteczką polimeru, taką jak PEG.
Konkretny znacznik, który ma zostać zastosowany, nie ma decydującego znaczenia, pod warunkiem, że znacznik może być eksprymowany z polipeptydem i jest zdolny do unieruchomienia na odpowiedniej powierzchni lub materiale nośnikowym. W handlu dostępnych jest wiele odpowiednich znaczników, np. z Unizyme Laboratories, Dania. Przykładowo znacznik może stanowić którakolwiek z poniższych sekwencji:
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln lub którakolwiek z poniższych:
PL 204 285 B1
EQKLISEEDL (C-końcowy znacznik opisany w Mol. Cell. Biol. 5:3610-16,1985)
DYKDDDDK (C- lub N-końcowy znacznik)
YPYDVPDYA
Przeciwciała przeciw powyższym znacznikom są dostępne w handlu, np. z ADI, Aves Lab and Research Diagnostics.
Znacznik może zostać następnie odcięty od polipeptydu z użyciem enzymów dostępnych w handlu.
Sposoby wytwarzania polipeptydu według wynalazku lub polipeptydu koniugatu według wynalazku
Polipeptyd według wynalazku lub polipeptydową część koniugatu według wynalazku, w postaci glikozylowanej, można wytwarzać dowolnym, odpowiednim, znanym sposobem. Sposoby takie obejmują skonstruowanie sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd i eksprymowanie sekwencji w odpowiednim transformowanym lub transfekowanym gospodarzu. Komórka gospodarz jest komórką γ-karboksylującą, taką jak komórka ssacza. Jednakże polipeptydy według wynalazku można wytwarzać, aczkolwiek mniej wydajnie, przez syntezę chemiczną lub połączenie syntez chemicznych lub przez połączenie syntezy chemicznej i technologii rekombinacji DNA.
Sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd lub polipeptydową część koniugatu według wynalazku można skonstruować przez wyodrębnienie lub syntezę sekwencji nukleotydów kodującej macierzysty FVII, taki jak hFVII o sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 1, a następnie zmienić sekwencje nukleotydów, tak by osiągnąć wprowadzenie (czyli insercję lub podstawienie) lub usunięcie (czyli delecję lub podstawienie) odpowiedniej (ch) reszt(y) aminokwasowej(ych).
Sekwencję nukleotydów dogodnie modyfikuje się przez ukierunkowaną mutagenezę standardowymi metodami. Alternatywnie, sekwencję nukleotydów wytwarza się na drodze syntezy chemicznej, np. z użyciem syntetyzatora oligonukleotydów, w którym oligonukleotydy są zaprojektowane w oparciu o sekwencję aminokwasów wymaganego polipeptydu i korzystnie z wybraniem kodonów, które są preferowane w komórce gospodarzu, w której będzie wytwarzany zrekombinowany polipeptyd. Przykładowo kilka krótkich oligonukleotydów kodujących części wymaganego polipeptydu można zsyntetyzować i złożyć metodami PCR, ligacji lub reakcji łańcuchowej ligazy (LCR) (Barany, PNAS 88:189-193,1991). Poszczególne oligonukleotydy zazwyczaj zawierają na 5' lub 3' końcu sekwencje homologiczne do komplementarnego składania.
W alternatywnych metodach modyfikacji sekwencji nukleotydów można wytworzyć warianty polipeptydów do wysokowydajnego przeszukiwania, np. metodami obejmującymi homologiczną wymianę, takimi jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5093257 oraz metodami obejmującymi tasowanie genów, czyli rekombinację pomiędzy dwoma lub większą liczbą homologicznych sekwencji nukleotydów, powodujące powstanie nowej sekwencji nukleotydów zawierającej szereg zmian nukleotydów w porównaniu z wyjściową sekwencją nukleotydów. Tasowanie genów (znane także jako tasowanie DNA) obejmuje jeden lub większą liczbę cykli losowej fragmentacji i ponownego składania sekwencji nukleotydów, a następnie przeszukanie w celu wybrania sekwencji nukleotydów kodujących polipeptydy o wymaganych właściwościach. Aby zaszło tasowanie kwasu nukleinowego w oparciu o homologię, dane części sekwencji nukleotydów powinny być korzystnie identyczne co najmniej w 50%, tak jak identyczne co najmniej w 60%, korzystniej identyczne co najmniej w 70%, tak jak identyczne co najmniej w 80%. Rekombinację można wykonać in vitro lub in vivo.
Przykłady odpowiednich metod tasowania genów in vitro ujawniono w Stemmer i inni (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA; tom 91, str. 10747-10751; Stemmer (1994), Nature, tom 370, str. 389-391; Smith (1994), Nature, tom 370, str. 324-325; Zhao i inni, Nat. Biotechnol. 1998, marzec; 16(3): 258-61; Zhao H. i Arnold, FB, Nucleic Acids Research, 1997, tom 25, nr 6, str. 1307-1308; Shao i inni, Nucleic Acids Research 1998, 15 styczeń; 26(2): str. 681-83 oraz WO 95/17413.
Przykład odpowiedniej metody tasowania in vivo ujawniono w WO 97/07205. Inne techniki mutagenezy sekwencji kwasów nukleinowych przez rekombinację in vitro lub in vivo ujawniono np. w WO 97/20078 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5837458. Przykłady specyficznych technik tasowania obejmują „tasowanie w obrębie rodziny”, „tasowanie syntetyczne” i „tasowanie in silico”.
Tasowanie w obrębie rodziny obejmuje poddanie rodziny homologicznych genów z różnych gatunków, jednemu lub kilku cyklom tasowania, a następnie przeszukiwanie lub selekcję. Techniki tasowania w obrębie rodziny ujawniono w Crameri i inni (1998), Nature, tom 391, str. 288-291; Christians i inni (1999), Nature Biotechnology, tom 17, str. 259-264; Chang i inni (1999), Nature Biotechnology, tom 17, str. 793-797 oraz Ness i inni (1999), Nature Biotechnology, tom 17, 893-896.
Tasowanie syntetyczne obejmuje dostarczenie bibliotek zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów w oparciu np. o porównanie sekwencji badanych homologicznych genów. Synte26
PL 204 285 B1 tycznie wytworzone oligonukleotydy są rekombinowane i powstałe tak zrekombinowane sekwencje kwasu nukleinowego przeszukuje się i w razie potrzeby stosuje do kolejnych cykli tasowania. Techniki tasowania syntetycznego ujawniono w WO 00/42561.
Tasowanie in silico dotyczy procedury tasowania DNA, którą przeprowadza się lub modeluje za pomocą komputera, w ten sposób częściowo lub całkowicie zapobiegając potrzebie fizycznego manipulowania kwasami nukleinowymi. Techniki do tasowania in silico ujawniono w WO 00/42560.
Po złożeniu (na drodze syntezy, ukierunkowanej mutagenezy lub inną metodą) sekwencją nukleotydów kodującą polipeptyd wstawia się do wektora rekombinacyjnego i funkcjonalnie łączy z sekwencjami kontrolnymi potrzebnymi do ekspresji FVII w wymaganej transformowanej komórce gospodarzu.
Należy oczywiście rozumieć, że nie wszystkie wektory i sekwencje kontrolujące ekspresję działają równie dobrze w eksprymowaniu sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd tutaj opisany. Także nie wszyscy gospodarze będą równie dobrze działać z tym samym układem ekspresyjnym. Jednakże fachowiec może dokonać selekcji wśród tych wektorów, sekwencji kontroli ekspresji oraz gospodarzy bez wykonywania zbyt wielu doświadczeń. Przykładowo przy wybieraniu wektora należy uwzględnić gospodarza, gdyż wektor musi replikować się w gospodarzu i musi być zdolny do włączenia się do chromosomu. Należy także wziąć pod uwagę liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania liczby kopii oraz ekspresję jakichkolwiek innych białek kodowanych przez wektor, takich jak markery antybiotykowe. Przy wybieraniu sekwencji kontrolującej ekspresję należy wziąć pod uwagę wiele różnych czynników. Obejmują one np. względną siłę sekwencji, możliwość jej kontrolowania oraz jej zgodność z sekwencją nukleotydów kodującą polipeptyd, w szczególności pod względem potencjalnych struktur drugorzędowych. Gospodarzy należy wybierać uwzględniając ich zgodność z wybranym wektorem, toksyczność produktu kodowanego przez sekwencję nukleotydów, charakterystykę wydzielania, ich zdolność do poprawnego składania białek, ich wymagania fermentacyjne lub hodowlane oraz łatwość oczyszczania produktów kodowanych przez sekwencje nukleotydów.
Zrekombinowany wektor może być autonomiczne replikującym się wektorem, czyli wektorem, który występuje jako jednostka pozachromosomalna, którego replikacja zależy od replikacji chromosomalnej, np. plazmidem. Inaczej, wektor jest taki, że gdy wprowadzi się go do komórki, włącza się do genomu komórki gospodarza i replikuje razem z chromosomem/chromosomami, do którego/których się włączył.
Wektor jest korzystnie wektorem ekspresyjnym, w którym sekwencja nukleotydów kodująca polipeptyd według wynalazku jest funkcjonalnie połączona z dodatkowymi segmentami wymaganymi do transkrypcji sekwencji nukleotydów. Wektor zazwyczaj jest wyprowadzony z plazmidowego lub wirusowego DNA. Kilka odpowiednich wektorów ekspresyjnych do ekspresji w komórkach gospodarzach tutaj opisanych jest dostępnych w handlu lub zostało opisane w literaturze. Użyteczne wektory ekspresyjne dla gospodarzy eukariotycznych obejmują np. wektory zawierające sekwencje kontroli ekspresji z SV40, bydlęcego wirusa brodawczaka, adenowirusa i cytomegalowirusa. Specyficznymi wektorami są np., pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i pCI-neo (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Użyteczne wektory ekspresyjne dla komórek drożdżowych obejmują plazmid 2μ i jego pochodne, wektor POT1 (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4931373), wektor pJSO37 opisany w Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996, i pPICZ A, B lub C (Invitrogen). Użyteczne wektory dla komórek owadzich obejmują pVL941, pBG311 (Gate i inni, „Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, str. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 i pMelbac (oba dostępne z Invitrogen). Użyteczne wektory ekspresyjne dla gospodarzy bakteryjnych obejmują znane plazmidy bakteryjne, takie jak plazmidy z E. coli, włącznie z pBR322, pET3a i pET12a (obydwa z Novagen Inc., WI, USA), plazmidy o szerszym zakresie gospodarzy, takie jak RP4, fagowy DNA, np. liczne pochodne faga lambda, np. NM989 i inne fagi DNA, takie jak M13 i nitkowate fagi z pojedynczą nicią DNA.
Inne wektory do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują takie, które umożliwiają namnożenie sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd do dużej liczby kopii. Obejmują one np. wektory zdolne do namnożenia przez amplifikację DHFR (patrz np. Kaufman, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4470461, Kaufman i Sharp, „Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression”, Mol. Cell. Biol., 2, str. 1304-19 (1982)) i amplifikację syntetazy glutaminy („GS”) (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5122464 i EP 338841).
Zrekombinowany wektor może ponadto zawierać sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w danej komórce gospodarzu. Przykładem takiej sekwencji (gdy komórką gospodarzem jest komórka ssaPL 204 285 B1 cza) jest miejsce startu replikacji z SV40. Gdy komórka gospodarz jest komórką drożdżową, odpowiednimi sekwencjami umożliwiającymi replikację wektora są geny replikacyjne plazmidu 2 μ, REP 1-3 oraz miejsce startu replikacji.
Wektor może także zawierać marker selekcyjny, np. gen, którego produkt komplementuje defekt w komórce gospodarzu, taki jak gen kodują cy reduktaz ę dihydrofolanu (DHFR) lub gen TPI ze Schizosaccharomyces pombe (opisany w P.R. Russell, Gene 40, 1985, str. 125-130) albo taki, który nadaje komórce oporność na lek, np. ampicylinę, kanamycynę, tetracyklinę, chloramfenikol, neomycynę, higromycynę lub metotreksat. Dla Saccharomyces cerevisiae, markery selekcyjne obejmują ura3 i leu2. Dla grzybów nitkowatych, markery selekcyjne obejmują amdS, pyrG, arcB, niaD i sC.
Określenie „sekwencje kontrolne” definiuje się tutaj jako obejmujące wszystkie składniki, które są potrzebne lub korzystne dla ekspresji polipeptydu według wynalazku. Każda sekwencja kontrolna może być natywna lub obca względem sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd. Takie sekwencje kontrolne obejmują, lecz nie wyłącznie, sekwencję liderową, sekwencje poliadenylacji, sekwencję propeptydową, promotor, wzmacniacz lub sekwencję aktywującą leżącą w górę od miejsca startu transkrypcji, peptydową sekwencję sygnałową oraz terminator transkrypcji. Minimalnie sekwencje kontrolne obejmują promotor.
Wiele różnych sekwencji kontrolujących ekspresję można stosować zgodnie z wynalazkiem. Takie użyteczne sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują sekwencje kontrolujące ekspresję związane z genami strukturalnymi powyższych wektorów ekspresyjnych, a także jakąkolwiek sekwencje, o której wiadomo, ż e kontroluje ekspresję genów komórek prokariotycznych i eukariotycznych lub ich wirusów oraz różnych ich połączeń.
Przykłady odpowiednich sekwencji kontrolnych do kierowania transkrypcją w komórkach ssaczych obejmują wczesne i późne promotory SV40 i adenowirusa, np. główny późny promotor adenowirusa 2, promotor MT-1 (gen metalotioneiny) promotor, promotor genów bezpośrednich-wczesnych ludzkiego cytomegalowirusa (CMV), promotor ludzkiego czynnika wydłużania 1α (EF-Ια), promotor minimalnego białka szoku cieplnego 70 z Drosophila, promotor wirusa mięsaka Rousa (RSV), promotor ludzkiej ubikwityny C (UbC), ludzki terminator genu hormonu wzrostu, sygnały poliadenylacji regionu Elb z SV40 lub adenowirusa oraz sekwencję konsensusową Kozak (Kozak, M. J Mol Biol 1987, 20 sierpień;196(4):947-50).
Aby polepszyć ekspresję w komórkach ssaczych, syntetyczny intron można wstawić do 5' regionu nie ulegającego translacji sekwencji nukleotydów kodującej polipeptyd. Przykładem syntetycznego intronu jest intron z plazmidu pCI-Neo (dostępnego z Promega Corporation, WI, USA).
Przykłady odpowiednich sekwencji kontrolnych do kierowania transkrypcją w komórkach owadzich obejmują promotor polihedryny, promotor P10, promotor podstawowych białek z wirusa poliedrozy Autographa californica, promotor 1 bezpośrednich wczesnych genów bakulowirusa i promotor 39K opóźnionych-wczesnych genów bakulowirusa oraz sekwencja poliadenylacji z SV40. Przykłady odpowiednich sekwencji kontrolnych do stosowania w drożdżowych komórkach gospodarzach obejmują promotory drożdżowego układu typu płciowego α, promotor drożdżowej izomerazy fosforanu triozy (TPI), promotory drożdżowych genów glikolitycznych i genów dehydrogenazy alkoholowej, promotor ADH2-4c i indukowalny promotor GAL. Przykłady odpowiednich sekwencji kontrolnych do stosowania w komórkach gospodarzach grzybów nitkowatych obejmują promotor i terminator ADH3, promotor pochodzący z genów kodujących amylazę TAKA, izomerazę fosforanu triozy lub proteazę zasadową Aspergillus oryzae, α-amylazę z A. niger, glukoamylazę z A. niger lub A. nidulans, acetoamidazę z A. nidulans, proteinazę asparaginianową lub lipazę z Rhizomucor miehei, terminator TPI1 i terminator ADH3. Przykłady odpowiednich sekwencji kontrolnych do stosowania w bakteryjnych komórkach gospodarzach zawierają promotory systemu lac i systemu trp, systemu TAG lub TRC i główne regiony promotorowe faga lambda.
Obecność lub brak peptydu sygnałowego będzie np. zależeć od komórki gospodarza ekspresji użytej do wytwarzania polipeptydu, który ma być eksprymowany (czy jest to wewnątrzkomórkowy czy zewnątrzkomórkowy polipeptyd) oraz od tego, czy wymagane jest osiągnięcie wydzielania. Do stosowania w grzybach nitkowatych, peptyd sygnałowy może dogodnie być wyprowadzony z genu kodującego amylazę lub glukoamylazę Aspergillus sp., genu kodującego lipazę lub proteazę Rhizomucor miehei lub lipazę Humicola lanuginosa. Peptyd sygnałowy korzystnie pochodzi z genu kodującego amylazę TAKA A. oryzae, obojętną α-amylazę A. niger, odporną na działanie kwasu amylazę A. niger lub glukoamylazę A. niger. Do stosowania w komórkach owadzich, peptyd sygnałowy może dogodnie pochodzić z genu owadziego (patrz WO 90/05783), takiego jak prekursor hormonu adypokinetycznego z Lepidopteran
PL 204 285 B1 manduca sexta, (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5023328), melityny pszczoły miodnej (Invitrogen), UDPglukozylotransferazy ekdysteroidowej (egt) (Murphy i inni, Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) lub ludzkiej lipazy trzustkowej (hpl) (Methods in Enzymology 284, str. 262-272, 1997). Korzystnym peptydem sygnałowym do stosowania w komórkach ssaczych jest peptyd sygnałowy z hFVII lub lekkiego łańcucha kappa mysiej Ig (Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89104). Stwierdzono, że do stosowania w komórkach drożdżowych odpowiednimi peptydami sygnałowymi są peptyd sygnałowy czynnika α z S. cereviciae (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4870008), zmodyfikowany peptyd sygnałowy karboksypeptydazy (patrz L.A. Valls i inni, Cell 48, 1987, str. 887-897), drożdżowy peptyd sygnałowy BAR1 (patrz WO 87/02670), drożdżowy peptyd sygnałowy proteazy asparaginianowej 3 (YAP3) (patrz M. Egel-Mitani i inni, Yeast 6, 1990, str. 127-137) i syntetyczna sekwencja liderowa TA57 (WO 98/32867). Stwierdzono, że do stosowania w komórkach E. coli odpowiednim peptydem sygnałowym jest peptyd sygnałowy ompA (EP 581821).
Sekwencja nukleotydowa według wynalazku kodująca polipeptyd FVII, wytworzona drogą ukierunkowanej mutagenezy, syntezy, PCR lub innymi metodami, może dodatkowo zawierać sekwencję nukleotydów kodującą peptyd sygnałowy. Peptyd sygnałowy jest obecny, gdy polipeptyd ma być wydzielony z komórki, w której jest eksprymowany. Taki peptyd sygnałowy, gdy jest obecny, powinien być rozpoznawany przez komórkę wybraną do ekspresji polipeptydu. Peptyd sygnałowy może być homologiczny (czyli może być tym, który jest normalnie związany z hFVII) lub heterologiczny (czyli może pochodzić z innego źródła niż hFVII) względem polipeptydu albo homologiczny lub heterologiczny względem komórki gospodarza, czyli może być peptydem sygnałowym normalnie eksprymowanym w komórce gospodarzu lub takim, który nie jest normalnie eksprymowany w komórce gospodarzu. Zgodnie z tym, peptyd sygnałowy może być prokariotyczny, np. pochodzący z bakterii takiej jak E. coli lub eukariotyczny, np. pochodzący z komórki ssaczej lub owadziej albo drożdżowej.
Jakikolwiek odpowiedni gospodarz może zostać użyty do produkcji polipeptydu lub polipeptydowej części koniugatu według wynalazku, włącznie z bakteryjnymi, grzybowymi (w tym z drożdżowymi), roślinnymi, owadzimi, ssaczymi lub innymi zwierzęcymi komórkami lub liniami komórkowymi, a także transgenicznych zwierząt lub roślin. Przykłady bakteryjnych komórek gospodarzy obejmują bakterie Gram-dodatnie, takie jak szczepy Bacillus, np. B. brevis lub B. subtilis, Pseudomonas lub Streptomyces lub bakterie Gram-ujemne, takie jak szczepy E. coli. Wprowadzenie wektora do bakteryjnej komórki gospodarza można np. wykonać przez transformację protoplastu (patrz np. Chang i Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), stosując komórki kompetentne (patrz np. Young i Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, lub Dubnau i Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), elektroporację (patrz np. Shigekawa i Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) lub koniugację (patrz np. Koehler i Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). Przykłady odpowiednich komórek gospodarzy grzybów nitkowatych obejmują Aspergillus, np. A. oryzae, A. niger, lub A. nidulans, Fusarium lub Trichoderma. Komórki grzybów można stransformować sposobem obejmującym tworzenie protoplastu, transformację protoplastów i regenerację ściany komórkowej w znany sposób. Odpowiednie procedury transformacji komórek gospodarzy Aspergillus opisano w EP 238023 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5679543. Odpowiednie sposoby transformacji gatunków Fusarium opisano w Malardier i inni, 1989, Gene 78: 147-156 i WO 96/00787. Przykłady odpowiednich drożdżowych komórek gospodarzy obejmują szczepy Saccharomyces, np. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, takie jak P. pastoris lub P. methanolica, Hansenula, takie jak H. Polymorplia lub Yarrowia. Drożdże można transformować według procedur opisanych w Becker i Guarente, w Abelson, J.N. i Simon, M.I., red., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, tom 194, str. 182-187, Academic Press, Inc., Nowy Jork; Ito i inni, 1983, Journal of Bacteriology 153:163; Hinnen i inni, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: oraz jak ujawniono w Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA (w protokole dla produktu Yeastmaker™ Yeast Transformation System Kit). Przykłady odpowiednich owadzich komórek gospodarzy obejmują linie komórek Lepidoptora, takie jak Spodoptera frugiperda (Sf9 lub Sf21) lub komórek Trichoplusioa ni (High Five) (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 5077214). Transformację komórek owadzich oraz produkcje w nich heterologicznych polipeptydów można wykonać jak opisano przez Invitrogen. Przykłady odpowiednich ssaczych komórek gospodarzy obejmują linię komórkową komórek jajowych chomika chińskiego (CHO), (np. CHO-K1; ATCC CCL-61), linie komórkowe Green Monkey (COS) (np. COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); komórki mysie (np. NS/O), linie komórkowe nerek noworodków chomika (BHK) (np. ATCC CRL-1632 lub ATCC CCL-10), i ludzkie komórki (np. HEK 293 (ATCC
PL 204 285 B1
CRL-1573)), a także komórki roślinne w hodowli tkankowej. Dodatkowe odpowiednie linie komórkowe są znane w dziedzinie wynalazku i dostępne z publicznych depozytów, takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Także, komórka ssacza, taka jak komórka CHO, może zostać zmodyfikowana tak by eksprymowała sialilotransferazę, np. 1,6-sialilotransferazę, np. jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5047335, w celu zapewnienia ulepszonej glikozylacji polipeptydu FVII lub FVIIa.
Aby uzyskać wzrost wydzielania, szczególnie interesujące może być wytworzenie polipeptydu według wynalazku razem z endoproteazą, w szczególności PACE (enzymem konwertującym sparowane zasadowe aminokwasy) (np. jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5986079), taka jak endoproteaza Kex2 (np. jak opisano w WO 00/28065).
Sposoby wprowadzania egzogennego DNA do ssaczych komórek gospodarzy obejmują transfekcję pośredniczoną przez fosforan wapnia, elektroporację, transfekcję pośredniczoną przez DEAE-dekstran, transfekcję pośredniczoną przez liposomy, wektory wirusowe oraz metodę transfekcji opisaną przez Life Technologies Ltd, Paisley, UK, z użyciem Lipofectamine 2000. Sposoby te są dobrze znane i są przykładowo opisane w Ausubel i inni, (red.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Nowy Jork, USA. Hodowle komórek ssaczych prowadzi się ustalonymi sposobami, np. ujawnionymi w (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Nigel Jenkins, red., 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USA oraz Harrison MA i Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
W sposobach wytwarzania według wynalazku komórki hoduje się w podłożu odżywczym odpowiednim do wytwarzania polipeptydu stosując metody znane w dziedzinie wynalazku. Przykładowo komórkę można hodować w hodowli w kolbach do wytrząsania, w fermentacji na małą skalę lub na dużą skalę (włącznie z fermentacją ciągłą, periodyczną, periodyczną z zasilaniem lub w stanie stałym) w laboratoryjnych lub przemysłowych fermentorach, w odpowiednim podłożu i w warunkach pozwalających na ekspresję i/lub wyizolowanie polipeptydu. Hodowlę prowadzi się w odpowiednim podłożu odżywczym zawierającym źródła węgla i azotu oraz sole nieorganiczne z zastosowaniem znanych procedur. Odpowiednie podłoża są dostępne od handlowych dostawców lub mogą zostać przygotowane według opublikowanych składów (np. w katalogach American Type Culture Collection). Gdy polipeptyd jest wydzielany do podłoża odżywczego, powinien być odzyskiwany bezpośrednio z podłoża. Gdy polipeptyd nie jest wydzielany, może zostać odzyskany z lizatów komórkowych.
Powstały polipeptyd można odzyskać znanymi sposobami. Przykładowo polipeptyd można odzyskać z podłoża odżywczego standardowymi procedurami obejmującymi, lecz nie wyłącznie, odwirowanie, filtrację, ekstrakcję, suszenie rozpryskowe, odparowanie lub wytrącenie.
Polipeptydy można oczyszczać różnymi znanymi procedurami, obejmującymi, lecz nie wyłącznie, chromatografię (np. jonowymienną, powinowactwa, hydrofobową, ogniskowania i żelową), procedury elektroforetyczne (np. preparatywne ogniskowanie izoelektryczne), na podstawie różnic w rozpuszczalności (np., wytrącenie siarczanem amonu), SDS-PAGE lub ekstrakcję (patrz np. Protein Purification, J.-C. Janson i Lars Ryden, red., VCH Publishers, Nowy Jork, 1989).
Jednołańcuchowy FVII może zostać oczyszczony i uaktywniony do dwułańcuchowego FVIIa wieloma sposobami, opisanymi w literaturze (Broze i Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255:1242-47 oraz Hedner i Kisiel, 1983, J. Clin. Invest. 71:1836-41). Innym sposobem, którym można oczyścić jednołańcuchowy FVII, jest wprowadzenie jonów Zn podczas oczyszczania, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5700914.
Polipeptyd można oczyszczać w postaci jednołańcuchowego FVII, który jest następnie PEGilowany. PEG-ilowany jednołańcuchowy polipeptyd FVII uaktywnia się za pomocą unieruchomionego enzymu (np. czynników Ila, IXa, Xa i XIIa) lub przez autoaktywację z użyciem dodatnio naładowanej matrycy jonowymiennej lub podobnie.
Korzystnie najpierw oczyszcza się w postaci jednołańcuchowej, następnie PEG-iluje się go (gdy jest to wymagane) i na koniec uaktywnia jednym ze sposobów opisanych powyżej lub przez autoaktywację, jak opisano w Pedersen i inni, 1989, Biochemistry 28: 9331-36. Zaletą przeprowadzania PEGilacji przed aktywacją jest to, że unika się PEG-ilacji N-końca nowo powstałego w wyniku przecięcia w R152-I153. PEG-ilacja tego nowego N-końca mogłaby uczynić cząsteczkę nieaktywną, gdyż utworzenie wiązania wodorowego pomiędzy D242 i N-końcową I153 jest konieczne dla aktywności.
Środek farmaceutyczny według wynalazku i jego zastosowanie
Środek farmaceutyczny oprócz koniugatu według wynalazku może zawierać również polipeptyd według wynalazku lub nieaktywny koniugat, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.
PL 204 285 B1
Koniugat, polipeptyd lub środek farmaceutyczny według wynalazku można stosować jako lek.
Korzystnie, polipeptyd lub (aktywny) koniugat można stosować do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby lub zaburzenia związanego z FVIIa/TF u ssaków. Przykładowo polipeptyd lub (aktywny) koniugat można stosować do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki chorób, w przypadku których wymagane jest zwiększone tworzenie skrzepu, przykładowo do leczenia pacjentów cierpiących na choroby prowadzące do nieodpowiedniego krzepnięcia krwi w odpowiedzi na uszkodzenie naczyń krwionośnych. W szczególności polipeptyd lub (aktywny) koniugat można stosować do wytwarzania leku do leczenia pacjentów z hemofilią, pacjentów z hemofilią z inhibitorami FVIII i FIX, pacjentów z małopłytkowością, pacjentów z trombocytopatiami, takimi jak zaburzenia uwalniania płytek w trombastenii Glanzmanna i zaburzenia puli magazynowej, pacjentów z chorobą von Willebranda, pacjentów z chorobami wątroby lub ludzi zdrowych pod innymi względami, ale z poważnymi problemami krwawienia, np. ze względu na uraz lub poważną operację, u których rozwinęły się inhibitory FVIIa, zaburzeń krwawienia, takich jak u hemofilików i innych zazwyczaj związanych z poważnymi uszkodzeniami tkanek.
Analogicznie, nieaktywny koniugat można stosować do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki choroby lub zaburzenia związanego z FVIIa/TF u ssaków. Przykładowo nieaktywny koniugat można stosować do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki chorób, w przypadku których wymagane jest zmniejszone tworzenie skrzepu, przykładowo do leczenia lub profilaktyki pacjentów w stanach nadkrzepliwości, np. u pacjentów z posocznicą, zakrzepicą żył głębokich, pacjentów z ryzykiem zakażenia mięśnia sercowego lub udaru zakrzepowego, zatorem żyły płucnej, pacjentów z ostrymi zespołami wieńcowymi (zawałem mięśnia sercowego i niestabilną dusznicą bolesną), pacjentów przechodzących operacje wieńcowo-sercowe, do zapobiegania problemom z sercem i restenozie u pacjentów po angioplastyce, pacjentów z chorobami naczyń obwodowych. Nieaktywny koniugat można także stosować do leczenia chorób oddechowych, oraz wzrostu i przerzutów nowotworu.
W innym aspekcie polipeptyd lub (aktywny) koniugat lub środek farmaceutyczny zawierający (aktywny) koniugat według wynalazku można stosować w sposobie leczenia ssaka cierpiącego na chorobę lub zaburzenie związane z FVIIa/TF (takie jak jedna lub większa liczba chorób lub zaburzeń wymienionych powyżej), polegającym na podawaniu ssakowi potrzebującemu leczenia skutecznej ilości takiego polipeptydu, koniugatu lub środka.
Analogicznie, nieaktywny koniugat lub środek farmaceutyczny zawierający taki nieaktywny koniugat można stosować w sposobie leczenia ssaka cierpiącego na chorobę lub zaburzenie związane z FVIIa/TF (takie jak jedna lub większa liczba chorób lub zaburzeń wymienionych powyżej), polegającym na podawaniu ssakowi potrzebującemu leczenia skutecznej ilości takiego nieaktywowanego koniugatu lub środka.
Polipeptydy lub koniugaty według wynalazku podaje się pacjentom w terapeutycznie skutecznej dawce, zwykle zbliżonej do stosowanej w leczeniu rFVII, takiej jak w NovoSeven® lub w wyższej dawce. „Terapeutycznie skuteczna dawka” oznacza dawkę wystarczającą do wytwarzania żądanego działania w stosunku do stanu, w którym jest ona podawana. Dokładna dawka będzie zależeć od okoliczności i będzie ustalana przez fachowca, znanymi technikami. Zazwyczaj dawka powinna zapewniać profilaktykę lub zmniejszenie ostrości lub rozprzestrzenienia leczonego stanu lub wskazania. Dla fachowców będzie jasne, że skuteczna ilość polipeptydu, koniugatu lub środka według wynalazku zależy, między innymi, od choroby, dawki, trybu podawania, od tego czy polipeptyd lub koniugat lub środek są podawane same czy w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi, okresu półtrwania preparatu w osoczu oraz ogólnego zdrowia pacjenta. Korzystnie, polipeptyd, koniugat lub środek według wynalazku podaje się w skutecznej dawce, w szczególności w dawce wystarczającej do znormalizowania zaburzenia krzepliwości.
Polipeptyd lub koniugat według wynalazku są korzystnie podawane w postaci środka zawierającego farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. „Farmaceutycznie dopuszczalny” oznacza nośnik lub zaróbkę, które nie wywołują jakichkolwiek nieprzewidzianych skutków u pacjentów, którym są podawane. Takie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i zaróbki są dobrze znane (patrz np. Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, A. R. Gennaro, red., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer i L. Hovgaard, red., Taylor i Francis [2000]; oraz Handbook of Pharmaceutical Excipients, wyd. 3, A. Kibbe, red., Pharmaceutical Press [2000]).
Polipeptyd lub koniugat według wynalazku można formułować w środek farmaceutyczny dobrze znanymi sposobami. Odpowiednie środki opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin (Mark Publ. Co., wyd. 16, 1980).
Polipeptyd lub koniugat według wynalazku można stosować „jako takie” i/lub w postaci ich soli. Odpowiednie sole obejmują, lecz nie wyłącznie, sole metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych,
PL 204 285 B1 takich jak sód, potas, wapń i magnez, a także np. sole cynku. Te sole lub kompleksy mogą być w postaci krystalicznej i/lub amorficznej.
Środek farmaceutyczny według wynalazku można podawać sam lub w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi. Środki te można wprowadzać jako część samego środka farmaceutycznego lub mogą być podawane oddzielnie od polipeptydu lub koniugatu według wynalazku, równocześnie lub zgodnie z innym trybem leczenia. Dodatkowo polipeptyd, koniugat lub środek farmaceutyczny według wynalazku można stosować jako adiuwant w innych terapiach.
„Pacjent” w opisie oznacza zarówno ludzi, jak i zwierzęta. Zatem sposoby można stosować zarówno w terapii ludzi, jak i w zastosowaniach weterynaryjnych. Środek farmaceutyczny polipeptydu lub koniugatu według wynalazku można formułować w wielu postaciach, np. jako ciecz, żel albo w postaci liofilizowanej lub jako sprasowany środek stały. Korzystna postać będzie zależeć od konkretnego leczonego wskazania, co jest oczywiste dla fachowców.
W szczególności środek farmaceutyczny zawierający polipeptyd lub koniugat według wynalazku można formułować w postać liofilizowaną lub stabilnie rozpuszczalną. Polipeptyd lub koniugat można liofilizować wieloma znanymi sposobami. Polipeptyd lub koniugat może być w stabilnej rozpuszczalnej postaci, gdy miejsca rozkładu proteolitycznego zostaną usunięte lub osłonięte. Korzyść uzyskania stabilnego rozpuszczalnego środka leży w łatwiejszym posługiwaniu się nim przez pacjenta oraz, w przypadku nagłych wypadków, szybszym działaniu, co potencjalnie może uratować życie. Korzystna postać będzie zależeć od konkretnego leczonego wskazania, co jest oczywiste dla fachowców.
Preparaty według wynalazku można podawać wieloma drogami, takimi jak, ale nie wyłącznie, doustnie, podskórnie, dożylnie, domózgowo, donosowo, przezskórnie, śródotrzewnowo, domięśniowo, dopłucnie, dopochwowo, doodbytniczo, śródocznie lub w jakikolwiek inny dopuszczalny sposób. Środki można podawać ciągle jako wlewy, jednakże duże zastrzyki są dopuszczalne, z użyciem znanych technik, takich jak pompy lub wszczepienia. W niektórych przypadkach preparaty można bezpośrednio stosować w postaci roztworu lub aerozolu.
Środki do podawania pozajelitowego
Korzystnym przykładem środka farmaceutycznego jest roztwór przeznaczony do podawania pozajelitowego. Choć w wielu przypadkach roztwory środków farmaceutycznych dostarczane są w postaci ciekłej, odpowiedniej do bezpośredniego użycia, to takie środki farmaceutyczne mogą być również dostarczone w postaci zamrożonej lub liofilizowanej. W pierwszym przypadku, środek musi zostać rozmrożony przed użyciem. Druga postać jest często stosowana w celu zwiększenia trwałości substancji czynnej, zawartej w środku, w szerszym zakresie warunków przechowywania, gdyż jak jest to wiadome fachowcom, liofilizowane preparaty są ogólnie bardziej stabilne niż ich ciekłe odpowiedniki. Takie liofilizowane preparaty roztwarza się przed użyciem przez dodanie jednej lub większej liczby odpowiednich farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników, takich jak jałowa woda do iniekcji lub jałowy fizjologiczny roztwór soli.
W przypadku środków do podawania pozajelitowego, przygotowuje się je do przechowywania w postaci preparatów liofilizowanych lub wodnych roztworów przez zmieszanie, zależnie od wymagań, polipeptydu o wymaganym stopniu czystości z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, zaróbek lub stabilizatorów typowo stosowanych w dziedzinie wynalazku (z których wszystkie określa się terminem „zaróbki”), np. środków buforujących, środków stabilizujących, środków konserwujących, środków nadających izotoniczność, niejonowych środków powierzchniowo czynnych lub detergentów, przeciwutleniaczy i/lub różnych innych dodatków.
Środki buforujące pomagają utrzymać pH w zakresie przybliżającym warunki fizjologiczne. Zazwyczaj są one obecne w stężeniach w zakresie około 2-50 mM. Odpowiednie środki buforujące do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują zarówno organiczne, jak i nieorganiczne kwasy i ich sole, takie jak bufory cytrynianowe (czyli mieszanina cytrynian monosodowy - cytrynian disodowy, mieszanina kwas cytrynowy cytrynian trisodowy, mieszanina kwas cytrynowy - cytrynian monosodowy itd.), bufory bursztynianowe (czyli mieszanina kwas bursztynowy - bursztynian monosodowy, mieszanina kwas bursztynowy - wodorotlenek sodu, mieszanina kwas bursztynowy - bursztynian disodowy itd.), bufory winianowe (czyli mieszanina kwas winowy - winian sodu, mieszanina kwas winowy - winian potasu, mieszanina kwas winowy - wodorotlenek sodu itd.), bufory fumaranowe (czyli mieszanina kwas fumarowy - fumaran monosodowy, mieszanina kwas fumarowy - fumaran disodowy, mieszanina fumaran monosodowy - fumaran disodowy itd.), bufory glukonianowe (czyli mieszanina kwas glukonowy - glukonian sodu, mieszanina kwas glukonowy - wodorotlenek sodu, mieszanina kwas glukonowy - glukonian potasu itd.), bufory szczawianowe (czyli mieszanina kwas szczawiowy - szczawian sodu, mieszanina kwas szczawiowy - wodorotlenek sodu, mieszanina kwas szczawiowy 32
PL 204 285 B1 szczawian potasu itd.), bufory mleczanowe (czyli mieszanina kwas mlekowy - mleczan sodu, mieszanina kwas mlekowy - wodorotlenek sodu, mieszanina kwas mlekowy - mleczan potasu, itd.) oraz bufory octanowe (czyli mieszanina kwas octowy - octan sodu, mieszanina kwas octowy - wodorotlenek sodu itd.). Dodatkowymi możliwościami są bufory fosforanowe, bufory histydynowe i sole trimetyloaminy, takie jak Tris.
Środki stabilizujące stanowią szeroką kategorię zarobek, które mogą mieć zakres funkcji od środków wypełniających do dodatków stabilizujących środek terapeutyczny lub pomagających zapobiec denaturacji lub przywieraniu do ściany pojemnika. Typowymi stabilizatorami mogą być wielowodorotlenowe alkohole cukrowe (wymienione powyżej), aminokwasy, takie jak arginina, lizyna, glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, alanina, ornityna, L-leucyna, 2-fenyloalanina, kwas glutaminowy, treonina itd., organiczne cukry lub alkohole cukrowe, takie jak laktoza, trehaloza, stachioza, mannitol, sorbitol, ksylitol, rybitol, mioinozytol, galaktytol, gliceryna itp., włącznie z cyklitolami, takimi jak inozytol; glikol polietylenowy, polimery aminokwasów, środki redukujące zawierające siarkę, takie jak mocznik, glutation, kwas 1,2-ditiolano-3-pentanowy, tioglikolan sodu, tiogliceryna, α-monotioglicerol oraz tiosiarczan sodu; polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (czyli zawierające < 10 reszt); białka, takie jak ludzka albumina surowicza, bydlęca albumina surowicza, żelatyna lub immunoglobuliny; polimery hydrofilowe, takie jak poliwinylopirolidon; monosacharydy, takie jak ksyloza, mannoza, fruktoza i glukoza; disacharydy, takie jak laktoza, maltoza i sacharoza; trisacharydy, takie jak rafinoza oraz polisacharydy, takie jak dekstran. Stabilizatory zazwyczaj są obecne w ilości w zakresie 0,1 - 10000 części wagowych w przeliczeniu na masę białka czynnego.
Środki konserwujące dodaje się w celu opóźnienia wzrostu drobnoustrojów i zazwyczaj dodaje się je w ilościach około 0,2%-1% (wag./obj.). Odpowiednie środki konserwujące do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują fenol, alkohol benzylowy, m-krezol, metyloparaben, propyloparaben, chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, halogenki benzalkoniowe (np. chlorek, bromek lub jodek benzalkoniowy), chlorek heksametoniowy, alkiloparabeny, takie jak metylo lub propylo paraben, katechol, rezorcynol, cykloheksanol i 3-pentanol.
Środki nadające izotoniczność dodaje się, by zapewnić izotoniczność płynnych preparatów i obejmują one wielowodorotlenowe alkohole cukrowe, korzystnie triwodorotlenowe lub wyższe alkohole cukrowe, takie jak gliceryna, erytryt, arabitol, ksylitol, sorbitol oraz mannitol. Wielowodorotlenowe alkohole mogą być obecne w ilości w zakresie 0,1 - 25% wag., zazwyczaj 1 - 5%, uwzględniając względne ilości innych składników.
Niejonowe środki powierzchniowo czynne lub detergenty (znane także jako „środki zwilżające”) mogą być obecne w celu ułatwienia rozpuszczania środka terapeutycznego oraz aby chronić peptyd terapeutyczny przed agregacją wywołaną wstrząsaniem, co także pozwala, aby preparat był wystawiony na większe naprężenia ścinające powierzchni bez powodowania denaturacji polipeptydu. Odpowiednie niejonowe środki powierzchniowo czynne obejmują polisorbaty (20, 80 itd.), poloksamery (184, 188 itd.), poliole Pluronic®, monoetery polioksyetylenosorbitanu (Tween®-20, Tween®-80 itd.).
Dodatkowe różnorodne zaróbki obejmują środki wypełniające lub wypełniacze (np. skrobię), środki chelatujące (np. EDTA), przeciwutleniacze (np. kwas askorbinowy, metionina, witamina E) i współrozpuszczalniki.
Substancja czynna może zostać zamknięta w mikrokapsułkach przygotowanych np. przez techniki koacerwacji lub drogą polimeryzacji na granicy faz, np. w mikrokapsułkach hydroksymetylocelulozowych, żelatynowych lub z polimetakrylanu metylu, w koloidalnych układach dostarczania leków (np. w liposomach, mikrosferach albuminowych, mikroemulsjach, nanocząstkach i nanokapsułkach) lub w makroemulsjach. Takie techniki ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences, jak wyżej.
Aby preparaty do podawania pozajelitowego mogły być stosowane do podawania in vivo, muszą być jałowe. Można to łatwo osiągnąć przez np. filtrację przez jałowe membrany filtrujące.
Środki o przedłużonym uwalnianiu
Przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu stanowią półprzepuszczalne matryce ze stałych polimerów hydrofobowych zawierających polipeptyd lub koniugat, matryce mające odpowiednią postać, taką jak warstewka, lub mikrokapsułki. Przykłady matryc o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele (np. poli(metakrylan 2-hydroksyetylu) lub poli(alkohol winylowy), polilaktydy, kopolimery kwasu L-glutaminowego i L-glutaminianu etylu, nieulegający degradacji kopolimer etylen-octan winylu, ulegające degradacji kopolimery kwasu mlekowego z kwasem glikolowym, takie jak technologia ProLease® lub Lupron Depot® (wstrzykiwane mikrokulki złożone z kopolimeru kwasu mlekowego z kwasem glikolowym i octanu leuprolidu) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymasłowy. Podczas gdy polimery, takie jak kopolimer etylen - octan winylu i kopolimer kwasu mlekowego z kwasem glikolowym umożliwiają uwalnianie cząsteczek przez długie okresy czasu, przykładowo przez ponad 100 dni, pewne hydrożele
PL 204 285 B1 uwalniają białka przez krótsze okresy czasu. Gdy zamknięte polipeptydy pozostają w organizmie przez dłuższy okres czasu, ulegają denaturacji i agregacji w wyniku wystawienia na działanie wilgoci w 37°C, co powoduje utratę aktywności biologicznej i możliwe zmiany prowadzące do immunogenności. Można opracować racjonalne strategie stabilizacji zależnie od konkretnego mechanizmu. Przykładowo, gdy ustali się, że mechanizm agregacji polega na tworzeniu międzycząsteczkowych wiązań S-S przez wymianę grupy tiolowe - disulfidowe, stabilizację można osiągnąć modyfikując reszty sulfhydrylowe, liofilizację z kwaśnych roztworów, kontrolowanie zawartości wilgoci, stosowanie odpowiednich dodatków oraz opracowanie odpowiednich polimerowych kompozycji matrycowych.
Wynalazek dokładniej ilustrują poniższe przykłady.
Lista sekwencji
SEQ ID NO: 1 przedstawia białko hFVII (włącznie z γ-karboksylowanymi resztami).
SEQ ID NO: 2 przedstawia sekwencję cDNA kodującą białko hFVII.
SEQ ID NO: 3 przedstawia białko hFVII (bez γ-karboksylowanych reszt).
SEQ ID NO: 4 przedstawia kasetę ekspresyjną do ekspresji FVII w komórkach ssaczych.
SEQ ID NO: 5 przedstawia starter CBProFpr174.
SEQ ID NO: 6 przedstawia starter CBProFpr175.
SEQ ID NO: 7 przedstawia starter CBProFpr216.
SEQ ID NO: 8 przedstawia starter CBProFpr229.
SEQ ID NO: 9 przedstawia starter CBProFpr221.
SEQ ID NO: 10 przedstawia starter CBProFpr228.
SEQ ID NO: 11 przedstawia starter CBProFpr226.
Materiały i metody
Metody stosowane do ustalania aminokwasów do zmodyfikowania
Obszar dostępnej powierzchni (ASA)
Program komputerowy Access (B. Lee i F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)) wersja 2 (© 1983 Yale University) zastosowano do obliczenia obszaru dostępnej powierzchni (ASA) poszczególnych atomów w strukturze. Metoda ta standardowo stosuje rozmiar sondy 0,14 nm (1,4 A) i definiuje Obszar Dostępnej Powierzchni (ASA) jako obszar utworzony przez centrum sondy. Przed tym obliczeniem, wszystkie cząsteczki wody i wszystkie atomy wodoru powinno się usunąć z układu współrzędnych, podobnie jak inne atomy niezwiązane bezpośrednio z białkiem.
Ułamkowy ASA łańcuchów bocznych
Ułamkowy ASA łańcuchów bocznych oblicza się dzieląc sumę ASA atomów w łańcuchu bocznym przez wartość odpowiadającą ASA atomów w łańcuchu bocznym tego typu reszty w rozszerzonym tripeptydzie Ala-x-Ala (patrz, Hubbard, Campbell i Thornton (1991) J. Mol. Biol., 220, 507-530). W tym przykładzie atom CA uważa się za część łańcucha bocznego reszty glicyny, ale nie pozostałych reszt. Następującą tabelę stosuje się jako standardowe 100% ASA dla łańcucha bocznego:
Ala 0,6923 nm2 Leu 1,4076 nm2
Arg 2,0035 nm2 Lys 1,6250 nm2
Asn 1,0625 nm2 Met 1,5608 nm2
Asp 1,0206 nm2 Phe 1,6390 nm2
Cys 0,9669 nm2 Pro 1,1965 nm2
Gln 1,4058 nm2 Ser 0,7816 nm2
Glu 1,3461 nm2 Thr 1,0167 nm2
Gly 0,3228 nm2 Trp 2,1089 nm2
His 1,4700 nm2 Tyr 1,7661 nm2
Ile 1,3791 nm2 Val 1,1414 nm2
Reszty nie wykryte w strukturze definiuje się jako posiadające 100% ekspozycji, gdyż uważa się, że zajmują one regiony giętkie. Kwasy γ-karboksyglutaminowe w pozycjach 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 i 35, wszystkie definiuje się jako wyeksponowane w 100%.
Określanie odległości pomiędzy atomami
PL 204 285 B1
Odległość pomiędzy atomami najłatwiej można określić stosując oprogramowanie grafiki cząsteczkowej np. InsightII® v. 98,0, MSI INC.
Region miejsca katalitycznego
Region miejsca katalitycznego definiuje się jako jakiekolwiek reszty posiadające co najmniej jeden atom w obrębie 1 nm (10 A) od jakiegokolwiek atomu triady katalitycznej (reszty H193, D242, S344).
Określanie miejsca wiązania czynnika tkankowego
Miejsce wiązania receptora definiuje się jako zawierające wszystkie reszty, które zmieniają swój obszar dostępnej powierzchni po związaniu z receptorem. Określa się to przez co najmniej dwa obliczenia ASA; jedno na wyizolowanym ligandzie (ligandach) w kompleksie ligand(y)/receptor(y) i jedno na kompletnym kompleksie ligand(y)/receptor(y).
Metody badania właściwości FVII i FVIIa
Pomiar funkcjonalnego okresu półtrwania in vivo
Pomiar biologicznego okresu półtrwania in vivo można przeprowadzić na wiele sposobów, co opisano w literaturze. Przykład testu do pomiaru okresu półtrwania in vivo rFVIIa lub jego wariantów opisano w FDA, numer odniesienia 96-0597. W skrócie, aktywności tworzenia skrzepu przez FVII mierzy się w osoczu pobranym przed i podczas 24-godzinnego okresu po podaniu koniugatu, polipeptydu lub środka. Mierzy się średnią pozorną objętość rozkładu w stanie stacjonarnym i określa średni klirens.
Pomiar obniżonej wrażliwości na rozkład proteolityczny
Przygotowano preparat zawierający koniugat (100-750 μg/ml, korzystnie 600 μg/ml), 1,5 mg Ca2+/ml (w postaci chlorku wapnia), mannitol (30 μg/ml), polisorbat 80 (0,1 mg/ml), chlorek sodu (3 mg/ml) i bufor glicylo-glicynowy (1,3 mg/ml, pH 5,5).
Przygotowano podobny preparat zawierający rFVIIa typu dzikiego.
Następnie określono początkową aktywność tworzenia skrzepu lub, inaczej, początkową aktywność amidolityczną, jak opisano w części zatytułowanej „Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu” lub jak opisano w części zatytułowanej “Sposób pomiaru niskich poziomów aktywności katalitycznej” lub „Sposób pomiaru aktywności katalitycznej”.
Następnie preparaty inkubowano w 37°C do czasu, gdy preparat zawierający rFVIIa typu dzikiego stracił co najmniej 25%, korzystnie co najmniej 50%, swojej początkowej aktywności tworzenia skrzepu lub aktywności amidolitycznej.
Zmierzono aktywność tworzenia skrzepu lub amidolityczną preparatu zawierającego koniugat według wynalazku.
Obniżoną wrażliwość na rozkład proteolityczny koniugatu według wynalazku w porównaniu z rFVIIa typu dzikiego wyrażono procentach.
Alternatywne sposoby pomiaru obniżonej wrażliwości na rozkład proteolityczny
Rozkład proteolityczny można zmierzyć stosując test opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 5580560, przykład 5, w którym proteolizę stanowi autoproteoliza.
Obniżoną proteolizę można ponadto zbadać w modelu in vivo stosując próbki znakowane radioaktywnie i porównując proteolizę typu dzikiego i koniugatu przez pobieranie próbek krwi i poddawanie ich SDS-PAGE i autoradiografii.
Bez względu na test zastosowany do pomiaru rozkładu proteolitycznego, „obniżony rozkład proteolityczny” oznacza mierzalne zmniejszenie cięcia w porównaniu z osiąganym dla niesprzężonego FVIIa typu dzikiego, co mierzy się przez skanowane żelu SDS-PAGE barwionego Coomassie, HPLC lub mierzy się jako zachowaną aktywność katalityczną w porównaniu z typem dzikim, z użyciem testu chromogenicznego, opisanego poniżej.
Określanie masy cząsteczkowej rFVII oraz jego koniugatów
Masę cząsteczkową sprzężonych lub niesprzężonych rFVII lub ich koniugatów określono z zastosowaniem SDS-PAGE, filtracji żelowej, analizy Western Blot, spektrometrii masowej z matrycowym wspomaganiem desorpcji laserowej lub wirowania równowagowego, np. SDS-PAGE według Laemmli, U.K., Nature, tom 227 (1970), str. 680-85.
Sposób pomiaru niskich poziomów aktywności katalitycznej
Aktywność amidolityczną w rozcieńczonych próbkach FVII/FVIIa i cieczy fermentacyjnej/kondycjonowanego podłoża można określić stosując COASET® FVII (Chromogenix, artykuł nr 821900). Aktywność amidolityczną określa się według instrukcji producenta. W skrócie FX jest obecny w nadmiarze i ulega przemianie do FXa przez FVIIa w 37°C. Następnie wytworzony FXa hydrolizuje chromogenny substrat S2765 (Ν-α-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA) powodując uwolnienie cząsteczki chromoforowej, p-nitroaniliny (pNA) absorbującej światło przy długości fali 405 nm. Reakcja jest zatrzymywana przez dodanie kwaPL 204 285 B1 su octowego. Ilość FVII/FVIIa w próbce oznaczano przez porównanie z krzywą wzorcową przygotowaną z FVIIa (w zakresie od 125 pg/ml do 1 ng/ml w buforze do testu).
Sposób pomiaru aktywności katalitycznej
Zdolność koniugatu do trawienia małych substratów peptydowych można zmierzyć stosując chromogenny substrat S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid). Zrekombinowany FVIIa rozcieńczano w 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8,3 zawierającym 0,1% BSA. Reakcję rozpoczynano przez dodanie substratu S-2288 do 1 mM i mierzono absorpcję przy 405 nm po inkubacji przez 30 minut w 37°C.
Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu
Aktywność FVIIa zmierzono w standardowym jednoetapowym teście tworzenia skrzepu zasadniczo w sposób opisany w WO 92/15686. W skrócie, badaną próbę rozcieńczano 50 mM Tris (pH 7,5), 0,1% BSA i porcję 100 μl inkubowano z 100 μl osocza pozbawionego FVII i 200 μl tromboplastyny C zawierającej 10 mM Ca++. Zmierzono czas tworzenia skrzepu i porównano z krzywą standardową stosując pulę normalnego osocza ludzkiego z dodatkiem cytrynianu, w kolejnych rozcieńczeniach.
Sposób pomiaru aktywności przeciwkoagulacyjnej
Aktywność przeciwkoagulacyjną nieaktywnego koniugatu FVII lub FVIIa można zmierzyć stosując jednoetapowy test tworzenia skrzepu opisany powyżej (Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu), gdzie nieaktywny koniugat współzawodniczy z FVII typu dzikiego w ograniczaniu zawartości ponownie lipidowanego czynnika tkankowego. Test wykonano zasadniczo jak opisano w WO 92/15686, przykład III. Zdolność nieaktywnego koniugatu do wydłużania czasu tworzenia skrzepu przez FVII typu dzikiego rejestrowano i przyjmowano za miarę aktywności przeciwkoagulacyjnej.
P r z y k ł a d 1
Strukturę rentgenowską hFVIIa w kompleksie z rozpuszczalnym czynnikiem tkankowym z Banner i inni, J Mol Biol, 1996; 285:2089 zastosowano w tym przykładzie. Należy zwrócić uwagę, że numeracja reszt w tej publikacji nie jest taka, jak w sekwencji. W tym przypadku zastosowano numerację zgodną z SEQ ID NO: 1. Kwasy γ-karboksyglutaminowe w pozycjach 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 i 35 wszystkie oznaczono jako GLU (skrót trzyliterowy) lub E (skrót jednoliterowy). Reszty 143-152 nie są obecne w strukturze.
Wystawienie na powierzchnię
Wykonanie pomiarów ułamkowego ASA samych fragmentów FVII w połączeniu z definicją dostępności niestandardowych i/lub brakujących reszt opisaną w metodach dało wynik, że następujące reszty miały ponad 25% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni: A1, N2, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35, R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109, S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125, S126, T128, P129, T130, V131, E132, I140, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158, P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193, K197, K199, N200, R202, N203, I205, S214, E215, H216, D217, G218, D219, S222, R224, S232,
T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H249, Q250, P251, V253, T255, D256, E265, R266,
T267, E270, R271, F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292, T293,
L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, V317, G318, D319,
S320, P321, N322, T324, E325, Y326, Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353,
G354, Q366, G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394, P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 i P406.
Następujące reszty miały ponad 50% swojego łańcucha bocznego odsłoniętego na powierzchni: A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8, R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34, E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58, S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79, E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106, G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131, E132, L141, E142,
K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174,
A175, K197, K199, N200, R202, S214, E215, H216, R224, V235, P236, G237, T238, H249, Q250,
V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291, A292, T293, L295, N301, M306,
Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315, K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367,
V371, E385, K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 i P406.
Miejsce wiązania czynnika tkankowego
PL 204 285 B1
Przy obliczeniach ASA następujące reszty ludzkiego FVII zmieniły swój ASA w kompleksie. Reszty te zdefiniowano jako stanowiące miejsce wiązania receptora: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43, S60, K62, D63, Q64, L65, I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78, R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276, R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 i R379.
Region miejsca aktywnego
Region miejsca aktywnego zdefiniowano jako jakąkolwiek resztę zawierającą co najmniej jeden atom w odległości 1 nm (10 A) od któregokolwiek atomu triady katalitycznej (reszty H193, D242, S344): I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177, C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194, F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233, Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244, L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325, Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345, G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365, C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 i F405.
Grzbiet szczeliny wiążącej miejsca aktywnego
Brzeg regionu szczeliny wiążącej miejsca aktywnego zdefiniowano przez wzrokową ocenę struktury FVIIa 1FAK.pdb jako: N173, A175, K199, N200, N203, D289, R290, G291, A292, P321 i T370.
P r z y k ł a d 2
Projektowanie kasety ekspresyjnej do ekspresji ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VII w komórkach ssaczych
Sekwencję DNA przedstawioną w SEQ ID NO: 2, obejmującą krótką postać pełnej długości cDNA kodującego ludzki czynnik krzepliwości krwi VII ze swoim natywnym krótkim peptydem sygnałowym (Hagen i inni, 1986, PNAS 83:2412), zsyntetyzowano w celu ułatwienia wysokiej ekspresji w komórkach ssaczych. Najpierw kontekst kodonu startu ATG zmodyfikowano według sekwencji konsensusowej Kozaka (Kozak, M. J Mol Biol 20 czerwca 1987; 196 (4): 947-50), tak, aby osiągnąć dokładne dopasowanie do sekwencji konsensusowej w górę od kodonu startu ATG. Następnie cDNA otwartej ramki odczytu natywnego ludzkiego czynnika krzepliwości krwi został zmodyfikowany przez wprowadzenie zmian w kodonach użytych na kodony często używane w genach ludzkich ulegających wysokiej ekspresji. Dalej, dwa kodony stop translacji wstawiono na koniec otwartej ramki odczytu, aby ułatwić skuteczne zatrzymanie translacji. Całkowicie syntetyczny i zoptymalizowny pod względem ekspresji ludzki gen FVII złożono z 70-merowych oligonukleotydów DNA i ostatecznie zamplifikowano z użyciem starterów końcowych wstawiając miejsca BamHI i Hindlll odpowiednio na 5' i 3' końcu, za pomocą standardowych technik PCR, i w efekcie otrzymano następującą sekwencję (SEQ ID NO:4): ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggctgccgtcttcgtcacccaggag gaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagagctccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagagg aacagtgcagctttgaggaagcccgggagattttcaaagacgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcg cctccagcccttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggggcgcaattgcga aacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactgcagcgatcacacgggcacgaagcggagct gccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcctgcacgcccacggtggaatacccttgcgggaagattcccattctagaaa agcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggcgggaaggtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtca acggggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagattaagaattggcggaacct catcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtcccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacctatgtg cctggcacgaccaatcacgatatcgctctgctccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggac ctttagcgaacgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggggccagctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggt gctcaacgtcccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcccgcaaagtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgct ggctatagcgatggctccaaggatagctgcaagggggactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccggg atcgtcagctggggccagggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctcatg cggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaagctt
Wektor do klonowania wytworzonego produktu PCR zawierającego kasetę ekspresyjną dla natywnego ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VII otrzymano przez wklonowanie intronu z pCINeo (Promega). Syntetyczny intron z pCI-Neo zamplifikowano stosując standardowe warunki PCR, jak opisano powyżej, oraz startery:
CBProFpr174:5' - AGCTGGCTAGCCACTGGGCAGGTAAGTATCA -3' i
CBProFpr175:5' - TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT -3' i otrzymano fragment PCR o długości 332 bp. Fragment strawiono Nhel i BamHl przed wklonowaniem do pCDNA3.1/HygR (otrzymanego z In Vitro Gen) i otrzymano PF nr 34.
PL 204 285 B1
Kasetę ekspresyjną natywnego ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VII wklonowano pomiędzy miejsca BamHI i HindIII PF nr 34 i otrzymano plazmid PF nr 226.
P r z y k ł a d 3
Konstrukcja kaset ekspresyjnych kodujących zmienne postacie ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VII, które zawierają dodatkowe miejsca glikozylacji in vivo.
PCR z wydłużaniem zwisów sekwencji (SOE) zastosowano do wytworzenia konstruktów zawierających zmienne otwarte ramki odczytu ludzkiego czynnika krzepliwości krwi z podstawionymi kodonami. W SOE-PCR zarówno N-końcowa część, jak i C-końcowa część otwartej ramki odczytu FVII zostały najpierw zamplifikowane w pojedynczych wstępnych reakcjach PCR.
Przykładowo w celu zmienienia kodonów R315 i V317 na kodony N315 i T317 następujące startery zastosowano do sparowania z pierwszymi produktami PCR:
CBProFpr216: 5' - CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3' oraz
CBProFpr229: 5' - GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3', oraz
CBProFpr221: 5' - ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3' oraz
CBProFpr228: 5' - GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3'.
Następnie pierwsze produkty PCR zostały połączone i końcowe startery (CBProFpr216 i CBProFpr221) dodano z wytworzeniem drugiego produktu pełnej długości, kodującego wymagany wariant R315N + V317T FVII. Drugi produkt PCR przycięto BamHl i Hindlll przed wklonowaniem do wektora PF nr 34 pomiędzy miejscami BamHl i Hindlll, z wytworzeniem PF nr 249.
Ponadto, w przypadku gdy wprowadzona mutacja(-e) była(-y) wystarczająco blisko unikatowego miejsca restrykcyjnego endonukleazy w plazmidzie ekspresyjnym, skonstruowano warianty genów stosując procedurę konstrukcji obejmującą pojedynczy etap PCR, a następnie klonowanie. Przykładowo podstawienie K143N+N145T wprowadzono z użyciem starterów PCR:
CBProFpr226: 5' - CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3' oraz
CBProFpr221: 5' - ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3' w pojedynczej reakcji PCR.
Następnie produkt PCR wklonowano stosując miejsca restrykcyjne dla endonukleaz Xbal i Hindlll.
Stosując powyższą strategię, otrzymano następujące glikozylowane koniugaty i zbadano ich aktywności amidolityczne, jak opisano w części zatytułowanej Sposób pomiaru niskich poziomów aktywności katalitycznej. Ponadto niektóre z koniugatów poddano jednoetapowemu testowi tworzenia skrzepu opisanemu w części zatytułowanej Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu. Otrzymane wyniki zebrano w tabeli poniżej.
Koniugat glikozylowany Aktywność amidolityczna Aktywność tworzenia skrzepu
T106N + +
K143N+N145T + nd
V253N + nd
R290N+A292T - nd
G291N - nd
R315N+V317T + +
K143N+N145T+R315N+V317T + nd
+: Mierzalna aktywność
-: Aktywność niemierzalna nd: nie oznaczano
P r z y k ł a d 4
Polepszenie wykorzystywania miejsca glikozylacji przez wprowadzenie innego proksymalnego (umieszczonego na N-końcu) miejsca glikozylacji
W celu zapobiegania autolizie ludzkiego FVII typu dzikiego wprowadzono miejsce glikozylacji w pozycji 315 przez wykonanie podstawień R315N i V317T, w sposób opisany powyżej, otrzymując PF nr 249.
W wyniku transfekcji komórek CHO K1 z użyciem Lipofactamine 2000, otrzymano niskie poziomy przejściowej ekspresji. Badając 24-godzinny przejściowy supernatant w teście amidolitycznym, COASET® FVII, wykazano, że wariant był aktywny. Po selekcji z użyciem 400 μg/ml higromycyny B otrzy38
PL 204 285 B1 mano pulę stabilnych klonów. Pula ta eksprymowała wariant R315N+V317T w ilości około 0,2 μg/ml, co umożliwiało przeprowadzenie analizy hybrydyzacji Western w celu określenia stopnia wykorzystywania wprowadzonego miejsca glikozylacji. 24-godzinne supernatanty ze stabilnej puli zbadano metodą analizy Western blot i wykazano częściowe wykorzystywanie wprowadzonego miejsca glikozylacji w pozycji 315, tak że w przybliżeniu połowa całkowicie obrobionego wydzielanego białka była zglikozylowana. Jednakże, gdy natywne miejsce glikozylacji w pozycji 145 przesunięto w pozycję 143, przez wykonanie podstawienia K143N+N145T, wprowadzone miejsce glikozylacji w pozycji 315 było całkowicie zglikozylowane, co wykazała analiza Western blot.
P r z y k ł a d 5
Ekspresja FVII w komórkach HEK 293
Linię komórkową HEK 293 (ATCC nr CRL-1573) wysiano do 20% zlania w kolbach T-25 z użyciem wysoko glukozowej DMEM, 10% inaktywowanej cieplnie FCS (Gibco/BRL nr kat. 10091), 5 μg/ml filochinonu i hodowano do zlania. Zlaną monowarstwę komórek transfekowano 1,2, 5, 10 i 20 μg plazmidu p226 opisanego powyżej, z użyciem środka transfekującego Lipofectamine 2000 (Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Po 24 godzinach od transfekcji pobrano próbkę podłoża. Stężenie FVII w 24-godzinnych doświadczeniach przejściowej ekspresji wynosiło średnio 0,15 μg/ml.
Następnie do komórek dodano podłoże selekcyjne zawierające 100 μg/ml higromycyny B. Po trzech tygodniach selekcji, ze zmienianiem podłoża co 3 lub 4 dni, komórki oporne na higromycynę uległy zlaniu w kolbach, w których nastąpiła transfekcja 1 μg plazmidowego DNA i 2 μg plazmidowego DNA. Komórki z każdej z pięciu kolb zebrano i połączono. Otrzymaną stabilną pulę transfektantów eksprymujących natywny ludzki czynnik krzepliwości krwi VII zamrożono w ciekłym azocie w znany sposób.
P r z y k ł a d 6
Wytwarzanie komórek HEK293 stabilnie eksprymujących FVII
Fiolkę z transfekowaną pulą HEK293 PF nr 226 rozmrożono i komórki wysiano w 75-cm2 kolbie do hodowli tkankowej zawierającej 15 ml DMEM wysoko glukozowej, 10% PCS, filochinon (5 μg/ml), 100 U/litr penicyliny, 100 μg/litr streptomycyny, którą stosowano we wszystkich kolejnych doświadczeniach i prowadzono hodowlę przez 24 godziny. Komórki zebrano, rozcieńczono i wysiano do 96studzienkowych płytek do mikromianowania przy gęstości komórek 1/2 komórki/studzienkę. Po 12 dniach kolonie po około 20-100 komórek były obecne w studzienkach i oznaczano te studzienki zawierające tylko jedną kolonię. Po kolejnych dwóch dniach hodowli do każdej studzienki dodano jeszcze 100 μl podłoża. Dwa dni później podłoże zmieniono we wszystkich studzienkach zawierających tylko jedną kolonię. Pierwsze kolonie przeniesiono do 25-cm2 kolb do hodowli tkankowych po 3 dniach i zależnie od poziomu zlania kolonie przeniesiono do 25-cm2 kolb do hodowli tkankowych po kolejnych 11 dniach. Po osiągnięciu zlania w kolbach do hodowli tkankowych T-25 podłoże zmieniono i klony zostawiono do wydzielania FVII do podłoża hodowlanego przez 24 godziny, po czym supernatanty zebrano i zbadano na obecność czynnika VII, stosując test amidolityczny COASET FVII. Stwierdzono, że jeden klon, C18, eksprymował 29 μq/ml FVII.
P r z y k ł a d 7
Ekspresja wariantów glikozylacyjnych FVII bez aktywności amidolitycznej, zdolnych do hamowania działania FVIIa
Plazmidy ekspresyjne do ekspresji mutantów grzbietu miejsca aktywnego R290N+A292T i G291N skonstruowano zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 3.
Stosując test amidolityczny COASET® FVII (patrz powyżej) oznaczono zdolność dwóch wariantów glikozylacyjnych FVII, R290N+A292T i G291N, do hamowania aktywności rFVIIa. Plazmid PF nr 250 kodujący R290N+A292T i plazmid PF nr 294 kodujący G291N transfekowano do prawie zlanych, hodowanych w surowicy, komórek HEK293, z użyciem Lipofectamine 2000. Transfekowane komórki inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez trzy godziny po transfekcji, po czym podłoże zmieniono na wolne od surowicy (DMEM, ITS-A, ExCyte, Phylloquinone, P/S). Czterdzieści godzin po transfekcji kondycjonowane podłoże zebrano i oczyszczono do analizy przez wirowanie.
Wykonano krzywą standardową z rFVIIa: 0,0125 ng, 0,025 ng, 0,05 ng, 0,075 ng i 0,1 ng. Próbki po 50 μl nierozcieńczonego, 2-krotnie rozcieńczonego, 5-krotnie rozcieńczonego, 10-krotnie rozcieńczonego i 50-krotnie rozcieńczonego kondycjonowanego podłoża z każdego z dwóch nieaktywnych wariantów glikozylacyjnych R290N+A292T i G291N lub kondycjonowanego podłoża z transfekcji pozornej zbadano z 0,025 ng rFVIIa. W teście COASET FVII 0,025 ng FVIIa odpowiada sygnałowi OD405 = 0,35 (pierwszy przebieg) i OD405 = 0,26 (drugi przebieg). Uzyskane wyniki zestawiono w poniższej tabeli
PL 204 285 B1
Koniugat glikozylowany Rozcieńczenie OD405
Standard 0,35 0,26
Pozorna 50 0,38 0,19
25 0,31 0,16
10 0,21 0,15
5 0,22 0,14
1 0,08 0,07
R290N+A292T 50 0,23 -
25 0,12 -
10 0,07 -
5 0,04 -
1 0,04 -
G291N 50 - 0,16
25 - 0,08
10 - 0,06
5 - 0,05
1 - 0,04
Jak widać z powyższych danych, glikozylowane koniugaty G291N i R290N+A292T hamują działanie rFVIIa.
P r z y k ł a d 8
Oczyszczanie FVII, a następnie aktywacja
Oczyszczanie czynnika VII typu dzikiego i jego koniugatów prowadzono w 4°C. Supernatant z komórek eksprymujących koniugat (lub FVII typu dzikiego) wyjałowiono przez filtrację (0,22 μτη) i rozcieńczono 2-krotnie w zimnej wodzie milliQ. Dodano EDTA do stężenia 5 mM, pH doprowadzono do 8,6, przewodnictwo wynosiło poniżej 10 mS/cm. Próbkę naniesiono na złoże Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia) równoważone w 4°C w 10 mM Tris pH 8,6. Po naniesieniu próbki kolumnę przemyto 10 mM Tris (pH 8,6), 150 mM NaCl, do czasu gdy absorpcja przy 280 nm osiągnęła poziom linii podstawowej. Kolumnę zrównoważono w 10 mM Tris (pH 8,6), 100 mM NaCl. Związany koniugat (lub FVII typu dzikiego) wymyto 10 mM Tris (pH 8,6), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2. Frakcje wzbogaconego koniugatu (lub FVII typu dzikiego) połączono i zatężono przez dializę lub z użyciem jednostek zatężających Vivaspin (Vivascience).
Autoaktywację koniugatu (lub FVII typu dzikiego) osiągnięto przez zatężenie i inkubację wymytego białka w 10 mM Tris (pH 7,8-8,6), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2.
Alternatywnie, koniugat (lub FVII typu dzikiego) aktywowano w 37°C za pomocą czynnika Xa sprzężonego z CNBr-aktywowaną sefarozą w 10 mM Tris (pH 7,4-8,0) 100 mM NaCl, 5 M CaCl2.
Bufor koniugatu (lub FVII typu dzikiego) zmieniono na roztwór zawierający 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl, 3% mannitolu, 0,05% Tween 80, buforowany do pH 5,6, i wyjałowiono przez filtrację i przechowywano w -80°C.
P r z y k ł a d 9
PEG-ilacja N-końca FVII
Czynnik VII sprzężono z glikolem metoksypolietylenowym (mPEG) o masie cząsteczkowej około 5 kDa z użyciem M-PEG-CHO (M-ALD-5000, otrzymany z Shearwater) w buforze zawierającym 10 mM cytrynian sodu, 20 mM CaCl2, 100 mM NaCl, pH 5,5. M-PEG-CHO użyto w 50-100-krotnym molowym nadmiarze, a stężenie białka wynosiło 0,2-0,5 mg/ml. Reakcję prowadzono w partiach 300-1500 μl w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem, dodano NaBH3CN do 500-1000 molowego nadmiaru i kontynuowano inkubację przez noc z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
PEG-ilowanemu FVII zmieniono bufor na A (10 mM Tris pH 7,6) i naniesiono w 4°C na kolumnę mono Q (Pharmacia) równoważoną buforem A. Związane białko wymyto z gradientem 0-100% B (10 mM Tris (pH 7,6), 500 mM NaCl) w ilości odpowiadającej 40 objętościom kolumny.
PL 204 285 B1
P r z y k ł a d 10
Badania farmakokinetyczne na szczurach
FVII typu dzikiego i koniugat według wynalazku sformułowano z 1,3 mg/ml buforu glicylo-glicynowego, pH 5,5 zawierającego 1,5 mg/ml CaCl2, 30 mg/ml mannitolu, 0,1 mg/ml polisorbatu 80 i 3 mg/ml NaCl. Do oznaczenia okresu półtrwania in vivo każdy preparat podano szczurom Sprague-Dawley w postaci jednego dużego dożylnego zastrzyku. Zastrzyki wykonano powoli przez 10 s, aby zmniejszyć potencjalne ryzyko zawału serca ze względu na duże stężenie Ca2+. Próbki krwi pobierano od każdego z dziewięciu uśpionych szczurów w odpowiednich odstępach czasu, np. 1 minuta, 15 minut, 30 minut, 45 minut i 1 godzina, po iniekcji. Próbki krwi zbierano do probówek o pojemności 1 ml zawierających 50 μl roztworu cytrynian-fosforan-dekstroza z adeniną (Sigma nr C4431), aby zapobiec krzepnięciu. Zaraz po zebraniu próbki przechowywano w około 0°C do czasu odwirowania, a następnie zebrano cytrynianowe supernatanty osocza do testu. Próbki badano w jednoetapowym teście tworzenia skrzepu, jak opisano w części Sposób pomiaru aktywności tworzenia skrzepu i obliczono czasy półtrwania.

Claims (16)

1. Koniugat polipeptydowy o zdolności tworzenia skrzepu, znamienny tym, że zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która różni się od sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VII (hFVII) lub ludzkiego czynnika VIla (hFVIIa) przedstawionej w SEQ ID NO: 1 o nie więcej niż 15 reszt aminokwasowych oraz zawiera miejsce N-glikozylacji in vivo wprowadzone przez podstawienie T106N lub V253N, oraz ugrupowanie cukrowe kowalencyjnie przyłączone do tego miejsca N-glikozylacji in vivo.
2. Polipeptyd zawierający jedno wprowadzone miejsce N-glikozylacji, który to polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową, która różni się od sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VII (hFVII) lub ludzkiego czynnika VIla (hFVIIa) przedstawionej w SEQ ID NO: 1 o nie więcej niż 15 reszt aminokwasowych oraz zawiera miejsce N-glikozylacji in vivo wprowadzone przez podstawienie T106N lub V253N.
3. Sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd określony w zastrz. 2.
4. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 3.
5. Komórka gospodarz zawierająca sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 3 lub wektor ekspresyjny określony w zastrz. 4, która to komórka gospodarz jest komórką γ-karboksylującą zdolną do glikozylacji in vivo.
6. Sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza określoną w zastrz. 5 w warunkach prowadzenia ekspresji polipeptydu, oraz odzyskuje się polipeptyd, przy czym komórka gospodarza jest komórką eukariotyczną zdoln ą do glikozylacji in vivo.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza hoduje się komórkę ssaczą.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza hoduje się komórkę CHO, komórkę BHK lub komórkę HEK.
9. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera koniugat polipeptydowy określony w zastrz. 1 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę.
10. Koniugat polipeptydowy określony w zastrz. 1 do stosowania jako lek.
11. Zastosowanie koniugatu polipeptydowego określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia u ssaka choroby lub zaburzenia, w którym pożądane jest zwiększone tworzenie się skrzeplin.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym chorobę lub zaburzenie stanowi hemofilia.
13. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane urazem.
14. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane operacją chirurgiczną.
15. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym chorobę lub zaburzenie stanowi małopłytkowość.
16. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym chorobę lub zaburzenie stanowi krwawienie spowodowane uszkodzeniem tkanki.
PL362856A 2000-02-11 2001-02-12 Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego PL204285B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000218 2000-02-11
DKPA200001558 2000-10-18
PCT/DK2001/000094 WO2001058935A2 (en) 2000-02-11 2001-02-12 FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362856A1 PL362856A1 (pl) 2004-11-02
PL204285B1 true PL204285B1 (pl) 2009-12-31

Family

ID=26068765

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386364A PL206148B1 (pl) 2000-02-11 2001-02-12 Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego
PL362856A PL204285B1 (pl) 2000-02-11 2001-02-12 Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386364A PL206148B1 (pl) 2000-02-11 2001-02-12 Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego

Country Status (18)

Country Link
US (13) US6806063B2 (pl)
EP (3) EP2319541A1 (pl)
JP (2) JP2003521930A (pl)
CN (1) CN100488562C (pl)
AT (1) ATE428445T1 (pl)
AU (3) AU783512B2 (pl)
CA (2) CA2397347C (pl)
CY (1) CY1109614T1 (pl)
DE (1) DE60138364D1 (pl)
DK (1) DK1257295T3 (pl)
ES (1) ES2325877T3 (pl)
IL (2) IL150692A0 (pl)
NO (1) NO20023804L (pl)
NZ (1) NZ521257A (pl)
PL (2) PL206148B1 (pl)
PT (1) PT1257295E (pl)
RU (1) RU2278123C2 (pl)
WO (1) WO2001058935A2 (pl)

Families Citing this family (168)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6747003B1 (en) 1997-10-23 2004-06-08 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
EP1198565A1 (en) * 1999-07-07 2002-04-24 Maxygen Aps A method for preparing modified polypeptides
ATE428445T1 (de) * 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US7220837B1 (en) 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7812132B2 (en) 2000-04-28 2010-10-12 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
CA2420892A1 (en) 2000-09-13 2002-03-21 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
IL154520A0 (en) * 2000-09-13 2003-09-17 Novo Nordisk As Human coagulation factor vii variants
US7173000B2 (en) 2000-11-09 2007-02-06 The Scripps Research Institute Modified factor VIIa
CA2441580A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-03 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii derivatives
US7235638B2 (en) 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
ATE532858T1 (de) * 2001-09-27 2011-11-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Menschliche gerinnungsfaktor-vii-polypeptide
US7052868B2 (en) 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
SG177002A1 (en) * 2001-10-10 2012-01-30 Novo Nordisk As Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US6960657B2 (en) 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
ES2490590T3 (es) 2001-11-02 2014-09-04 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación humana
US7125846B2 (en) 2001-11-09 2006-10-24 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and factor V polypeptides
KR20040065278A (ko) * 2001-12-21 2004-07-21 노보 노르디스크 에이/에스 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물
WO2003055512A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
US20050069551A1 (en) * 2002-03-08 2005-03-31 Emory University Cytotoxic compound-protein conjugates as suppressors of tumor growth and angiogenesis
US20060229239A9 (en) * 2002-03-08 2006-10-12 Mamoru Shoji Novel curcuminoid-factor VIIa constructs as suppressors of tumor growth and angiogenesis
DE60334983D1 (de) * 2002-04-30 2010-12-30 Bayer Healthcare Llc Faktor vii oder faktor viia polypeptidvarianten
US20040009918A1 (en) * 2002-05-03 2004-01-15 Hanne Nedergaard Stabilised solid compositions of modified factor VII
PT1517710E (pt) * 2002-06-21 2011-07-08 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformas do factor vii peguilado
DE60336555D1 (de) 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
PL207018B1 (pl) 2002-06-21 2010-10-29 Novo Nordisk Helth Care Ag Kompozycja farmaceutyczna, sposób przygotowania stabilnego polipeptydu czynnika VII i zastosowanie polipeptydu czynnika VII
US6911323B2 (en) 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
ATE454403T1 (de) * 2002-09-25 2010-01-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Menschliche koagulationsfaktor vii polypeptide
DK1549677T3 (da) * 2002-09-30 2011-07-18 Bayer Healthcare Llc FVII- eller FVIIa-varianter med forøget koagulationsaktivitet
US7803777B2 (en) 2003-03-14 2010-09-28 Biogenerix Ag Branched water-soluble polymers and their conjugates
KR101204712B1 (ko) 2003-03-18 2012-11-27 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Ｇｌａ-잔기 함유 세린 프로테아제의 제조 방법
AU2004222625A1 (en) * 2003-03-18 2004-09-30 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid, aqueous, pharmaceutical compositions of factor VII polypeptides
EP2085470B1 (en) * 2003-03-20 2012-05-16 Bayer HealthCare LLC FVII or FVIIa variants
US7897734B2 (en) 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
MXPA05010773A (es) 2003-04-09 2005-12-12 Neose Technologies Inc Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos.
US7691603B2 (en) 2003-04-09 2010-04-06 Novo Nordisk A/S Intracellular formation of peptide conjugates
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2004103275A2 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
ATE454900T1 (de) * 2003-05-23 2010-01-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Stabilisierung von proteinen in lösung
RU2373282C2 (ru) * 2003-06-19 2009-11-20 Байер Хелткэр Ллк ВАРИАНТЫ ДОМЕНА GLA ФАКТОРА VII ИЛИ VIIa
JP4658041B2 (ja) 2003-06-25 2011-03-23 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子ポリペプチドの液体組成物
ES2335994T3 (es) * 2003-07-01 2010-04-07 Novo Nordisk Health Care Ag Composicion farmaceutica liquida, acuosa de polipeptidos factor vii.
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
WO2005025623A2 (en) * 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
EP1654004A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Novo Nordisk A/S Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides
US20060198819A1 (en) * 2003-08-08 2006-09-07 Novo Nordisk Healthcare A/G Use of galactose oxidase for selective chemical conjugation of protractor molecules to proteins of therapeutic interest
KR20120104619A (ko) * 2003-08-14 2012-09-21 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드의 액상 수성 약학적 조성물
WO2005024006A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
ES2381110T3 (es) * 2003-09-09 2012-05-23 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación
WO2005032581A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-14 Novo Nordisk Health Care Ag Hybrid molecules having factor vii/viia activity
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
JP4874806B2 (ja) 2003-12-01 2012-02-15 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 液体因子ｖｉｉ組成物のウイルス濾過
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
CN1917861B (zh) 2003-12-19 2012-03-21 诺和诺德医疗保健公司 因子vii多肽的稳定化固体组合物
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
EP2033662B1 (en) * 2004-01-21 2012-10-17 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
KR100545720B1 (ko) * 2004-05-31 2006-01-24 메덱스젠 주식회사 당화된 면역글로불린 및 이를 포함하는 면역접합체
WO2005123916A2 (en) * 2004-06-21 2005-12-29 Novo Nordisk Health Care Ag Glycosylation-disrupted factor vii variants
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2006013202A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-09 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugation of fvii
DK1781782T3 (da) * 2004-08-17 2010-08-23 Csl Behring Gmbh Modificerede vitamin K-afhængige polypeptider
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
US7632921B2 (en) * 2004-11-12 2009-12-15 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
US9187549B2 (en) 2004-12-23 2015-11-17 Novo Nordisk Healthcare A/G Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest
EP2514757A3 (en) 2005-01-10 2014-03-05 ratiopharm GmbH Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006121569A2 (en) * 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1893230A2 (en) * 2005-04-26 2008-03-05 Maxygen Holdings Ltd. Use of modified factor vii for treating bleeding
EP1891231A4 (en) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
BRPI0611710A2 (pt) * 2005-06-24 2011-12-20 Drugrecure Aps administração às vias aéreas de inibidor do passo de fator tissular, em condições inflamatórias que afetam o trato respiratório
EP1904528B1 (en) 2005-07-13 2012-10-31 Novo Nordisk Health Care AG Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090017007A1 (en) * 2005-08-26 2009-01-15 Maxygen Holdings Ltd. Liquid factor vii composition
EP1924689B1 (en) 2005-09-01 2014-08-13 Novo Nordisk Health Care AG Hydrophobic interaction chromatography purification of factor vii polypeptides
WO2007031559A2 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
US20090011992A1 (en) * 2005-09-21 2009-01-08 Novo Nordisk Healthcare A/G Human Coagulation Factor VII Polypeptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
ES2399138T3 (es) * 2006-03-16 2013-03-26 Stellaris Pharmaceuticals Aps Tratamiento local con factor VII
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
BRPI0708832A2 (pt) 2006-03-31 2011-06-14 Baxter Int construÇço proteinÁcea
JP5759102B2 (ja) * 2006-04-07 2015-08-05 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー Ｖｉｉ因子・組織因子共有結合複合体
PL2007885T3 (pl) * 2006-04-11 2010-12-31 Csl Behring Gmbh Sposób zwiększania odzysku peptydów terapeutycznych in vivo
EP2213733A3 (en) * 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
FR2901707B1 (fr) 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
MX2008016169A (es) 2006-07-07 2009-01-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Nuevos conjugados de proteina y metodos para su preparacion.
JP2009543841A (ja) * 2006-07-17 2009-12-10 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 増加した活性を有する第ｖｉｉａ因子アナログの新規用途
WO2008011633A2 (en) * 2006-07-21 2008-01-24 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
FR2904558B1 (fr) * 2006-08-01 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees"
ES2531934T3 (es) 2006-09-01 2015-03-20 Novo Nordisk Health Care Ag Glicoproteínas modificadas
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
US8777971B2 (en) * 2006-10-17 2014-07-15 Amj Bv Device and method for joining vessels in anastomosis
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
AU2007338298B2 (en) 2006-12-22 2013-02-07 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
US20100143326A1 (en) * 2007-01-03 2010-06-10 Novo Nordisk Healthcare A/G SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION OF COAGULATION FACTOR VIIa-RELATED POLYPEPTIDES
EP1972687A1 (en) * 2007-03-23 2008-09-24 GenOdyssee Polynucleotides and polypeptides of human factor VII gene, SNPs
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
CN101743309B (zh) 2007-04-13 2014-01-29 催化剂生物科学公司 修饰的因子ⅶ多肽及其应用
US9186323B2 (en) * 2007-05-02 2015-11-17 Novo Nordisk Healthcare Ag High concentration factor VII polypeptide formulations comprising an aromatic preservative and an antioxidant
MX2009013259A (es) 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
US20100268055A1 (en) * 2007-07-19 2010-10-21 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self-Anchoring MEMS Intrafascicular Neural Electrode
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
WO2009051717A2 (en) * 2007-10-15 2009-04-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Human factor ix variants with an extended half life
EP2235197B1 (en) 2007-12-27 2017-07-26 Baxalta GmbH Cell culture processes
RU2573587C2 (ru) 2008-02-27 2016-01-20 Ново Нордиск А/С Конъюгированные молекулы фактора viii
TWI465247B (zh) 2008-04-11 2014-12-21 Catalyst Biosciences Inc 經修飾的因子ｖｉｉ多肽和其用途
EP2811017A2 (en) * 2008-04-21 2014-12-10 Novo Nordisk Health Care AG Hyperglycosylated human coagulation factor IX
RU2496521C2 (ru) * 2008-04-24 2013-10-27 Кантаб Байофармасьютикалз Патентс Лимитед Конъюгаты фактора ix с увеличенным временем полужизни
WO2009141433A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Novo Nordisk Health Care Ag Low viscosity compositions comprising a pegylated gla-domain containing protein
JP2011520999A (ja) * 2008-05-23 2011-07-21 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 高濃度の芳香族保存料を有するペグ官能化セリンプロテアーゼの製剤
KR20110039348A (ko) 2008-08-06 2011-04-15 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 효능을 가지는 콘쥬게이트된 단백질
WO2010084173A1 (en) 2009-01-22 2010-07-29 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
ES2610356T3 (es) 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
HUE037163T2 (hu) 2009-06-09 2018-08-28 Prolong Pharmaceuticals Llc Hemoglobin készítmények
WO2010149172A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Rigshospitalet SYSTEMIC PRO-HEMOSTATIC EFFECT OF CLOTTING FACTORS IN COMBINATION WITH SYMPATHICOMIMETICS WITH AGONISTIC EFFECTS ON α-ADRENERGIC AND/OR β-ADRENERGIC RECEPTORS OF THE SYMPATHETIC NERVOUS SYSTEM, RELATED TO IMPROVED CLOT STRENGTH.
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011017055A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
ES2856055T3 (es) 2009-07-27 2021-09-27 Baxalta GmbH Glicopolisialilación de proteínas diferentes de las proteínas de coagulación de la sangre
CN102612376A (zh) 2009-08-06 2012-07-25 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
WO2011018515A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
EP3222287A1 (en) * 2009-08-24 2017-09-27 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
US20110150843A1 (en) * 2009-10-30 2011-06-23 National Institute Of Immunology Method for the therapeutic correction of hemophilia a by transplanting bone marrow cells
CA2787895A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Novo Nordisk Health Care Ag Stable growth hormone compounds
MX345736B (es) 2010-01-22 2017-02-14 Novo Nordisk Healthcare Ag Hormonas de crecimiento con eficacia in vivo prolongada.
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
AU2011262494B2 (en) 2010-06-04 2016-01-21 Tiumbio Co., Ltd. Fusion protein having factor VII activity
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
EP2646548B1 (en) 2010-12-03 2017-03-22 Gene Stream Pty Ltd. Improved light-emitting molecules
WO2012087838A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
MX354493B (es) * 2011-10-06 2018-03-08 Hanmi Science Co Ltd Derivados de los factores de coagulacion sanguinea vii y viia, conjugados y complejos que comprenden los mismos, y uso de los mismos.
DK2822577T3 (en) 2012-02-15 2019-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc RECOMBINANT FACTOR VIII PROTEINS
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
WO2013156488A2 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Leverton Licence Holdings Limited Optimised subcutaneous therapeutic agents
JP2015533152A (ja) 2012-10-15 2015-11-19 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 第ｖｉｉ因子コンジュゲート
JP2015532307A (ja) * 2012-10-15 2015-11-09 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 凝固因子ｖｉｉポリペプチド
SG10201710593UA (en) 2012-12-24 2018-02-27 Bayer Healthcare Llc Short-acting factor vii polypeptides
ES2841123T3 (es) 2013-04-05 2021-07-07 Formulacion Del Compuesto De La Hormona De Crecimiento Formulación del compuesto de la hormona de crecimiento
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
BR112016008039A2 (pt) * 2013-10-15 2017-10-17 Novo Nordisk Healthcare Ag polipeptídeos do fator vii da coagulação
TWI741992B (zh) 2015-08-03 2021-10-11 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法
RU2633588C2 (ru) * 2015-11-03 2017-10-13 Евгений Федорович Чередников Способ эндоскопического лечения язвенного гастродуоденального кровотечения
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
MA52630B1 (fr) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Procédés de traitement de l'hémophilie a
US20210069306A1 (en) 2019-08-15 2021-03-11 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment
KR20220131221A (ko) 2019-11-13 2022-09-27 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. 바코드화된 xten 폴리펩티드 및 이의 조성물, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
KR20240116466A (ko) * 2021-10-29 2024-07-29 시질론 테라퓨틱스, 인크. 세포 기반 치료 및 관련 방법을 위한 조성물

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
ZA862768B (en) * 1985-04-17 1986-12-30 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
DE3688920D1 (de) 1985-07-03 1993-09-30 Genencor Int Hybride Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung.
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
HU206897B (en) 1985-10-25 1993-01-28 Zymogenetics Inc Process for utilizing bar-1 gen for selecting strange proteins
US5180583A (en) 1985-11-26 1993-01-19 Hedner Ulla K E Method for the treatment of bleeding disorders
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5258288A (en) * 1986-07-25 1993-11-02 Genzyme Corporation Vector containing DNA encoding mature human protein S
DK323587D0 (da) 1987-06-25 1987-06-25 Novo Industri As Protein
FI882746A7 (fi) 1987-06-12 1988-12-13 Hoechst Japan Hybridiproteiini C ja menetelmä sen valmistamiseksi.
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5648254A (en) 1988-01-15 1997-07-15 Zymogenetics, Inc. Co-expression in eukaryotic cells
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
JPH0246296A (ja) 1988-08-09 1990-02-15 Hoechst Japan Ltd 雑種プロテインｃ及びその製造方法
JP2928287B2 (ja) * 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5349052A (en) 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
AU4647889A (en) 1988-11-18 1990-06-12 Cetus Corporation Insect signal peptide mediated secretion of recombinant proteins
US5041376A (en) 1988-12-09 1991-08-20 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method for identifying or shielding functional sites or epitopes of proteins that enter the exocytotic pathway of eukaryotic cells, the mutant proteins so produced and genes encoding said mutant proteins
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
DK0893439T3 (da) 1989-04-19 2005-09-05 Enzon Inc Fremgangsmåde til fremstilling af et modificeret polypeptid indeholdende et polypeptid og et polyalkylenoxid
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2085297T3 (es) 1989-05-27 1996-06-01 Sumitomo Pharma Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada.
US5093317A (en) * 1989-06-05 1992-03-03 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factor
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US4973317A (en) 1989-07-14 1990-11-27 Bobrove Arthur M Automatic sheath protection of hypodermic needle
US5023328A (en) 1989-08-04 1991-06-11 The Texas A&M University System Lepidopteran AKH signal sequence
US5580560A (en) * 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5225537A (en) 1989-12-29 1993-07-06 Zymogenetics, Inc. Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins
DE69101634D1 (de) 1990-01-26 1994-05-11 Immuno Ag Wien Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus.
EP0521873B1 (en) * 1990-01-29 1999-06-02 Zymogenetics, Inc. Anticoagulant proteins
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5583107A (en) 1990-09-04 1996-12-10 Cor Therapeutics, Inc. Agents affecting thrombosis and hemostasis
US5531916A (en) 1990-10-03 1996-07-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Hydrofluorocarbon cleaning compositions
WO1992008790A1 (en) 1990-11-14 1992-05-29 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
IE914102A1 (en) 1990-11-26 1992-06-03 Genetics Inst Expression of pace in host cells and methods of use thereof
US5817788A (en) * 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5833982A (en) * 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
HU218890B (hu) 1991-02-28 2000-12-28 Novo Nordisk A/S Véralvadást gátló módosított VII faktorok, ezeket kódoló polinukleotid molekulák, polinukleotid molekulával transzfektált emlős sejtek és a véralvadást gátló módosított VII faktorokat tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint a készítmények ...
AU1676992A (en) 1991-03-18 1992-10-21 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5504064A (en) * 1991-04-10 1996-04-02 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with an activator of FVII
DE4113487C1 (pl) 1991-04-25 1992-11-05 Fleischgrosshandel Hans-Werner & Bernd Meixner Gmbh, 6301 Wettenberg, De
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
DK38293D0 (da) 1993-03-31 1993-03-31 Novo Nordisk As Fremstilling af proteiner
US5871384A (en) * 1993-04-20 1999-02-16 Kichijo; Hiroshi Block assembly and devices formed thereby
JPH0720127A (ja) * 1993-05-07 1995-01-24 Eisai Co Ltd 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬
ATE210458T1 (de) 1993-05-21 2001-12-15 Zymogenetics Inc Modifizierter faktor vii zur hemmung der vaskulären restenosis und thrombozytenablagerung
AU7097094A (en) 1993-06-01 1994-12-20 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
KR960705579A (ko) 1993-11-10 1996-11-08 에릭에스. 딕커 개선된 인터페론 중합체 결합체(Improved interferon polymer conjugates)
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5686110A (en) 1994-06-02 1997-11-11 Enzon, Inc. Water soluble complex of an alkyl or olefinic end capped polyalkylene oxide and a water insoluble substance
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
ATE294871T1 (de) 1994-06-30 2005-05-15 Novozymes Biotech Inc Nicht-toxisches, nicht-toxigenes, nicht- pathogenes fusarium expressionssystem und darin zu verwendende promotoren und terminatoren
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
DE4437604A1 (de) 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
WO1997007206A1 (en) 1995-08-11 1997-02-27 Okkels, Jens, Sigurd Method for preparing polypeptide variants
DE19531637A1 (de) 1995-08-28 1997-03-06 Immuno Ag Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Blutgerinnungsstörugnen, Verfahren zur Herstellung derselben und deren Verwendung
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US6077939A (en) 1996-08-02 2000-06-20 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Methods and kits for making polypeptides having a single covalently bound N-terminal water-soluble polymer
DE69735597T2 (de) * 1996-11-08 2006-12-21 Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma Verwendung eines modifizierten protein-c
US5837843A (en) * 1996-11-08 1998-11-17 Oklahoma Medical Research Foundation Modified protein C
WO1998032867A1 (en) 1997-01-24 1998-07-30 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
EP1017794A1 (en) 1997-02-06 2000-07-12 Novo Nordisk A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
JP2002505574A (ja) 1997-04-30 2002-02-19 エンゾン，インコーポレイテッド ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
WO1998055500A1 (en) 1997-06-06 1998-12-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Chemically modified polypeptides
US6475725B1 (en) * 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AT407255B (de) * 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
CA2296770A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
WO1999003498A1 (en) 1997-07-18 1999-01-28 Novo Nordisk A/S USE OF FVIIa OR FVIIai FOR THE TREATMENT OF ADVERSE CONDITIONS RELATED TO THE FVIIa MEDIATED INTRACELLULAR SIGNALLING PATHWAY
US6747003B1 (en) * 1997-10-23 2004-06-08 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6693075B1 (en) * 1997-10-23 2004-02-17 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6017882A (en) 1997-10-23 2000-01-25 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
KR100622796B1 (ko) 1998-04-28 2006-09-13 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. 폴리올-ｉｆｎ-베타 공액체
AT408613B (de) 1998-06-17 2002-01-25 Immuno Ag Pharmazeutisches faktor vii-präparat
NZ511291A (en) 1998-10-30 2003-08-29 Novozymes As A method for selecting a protein variant that has reduced immunogenicity as compared with the parent or wild-type protein
EP1124946B1 (en) 1998-10-30 2007-06-20 Novozymes A/S Glycosylated proteins having reduced allergenicity
EP1127154B1 (en) 1998-11-06 2008-09-10 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of fvii
AU3210100A (en) 1999-01-19 2000-08-01 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
AU3629800A (en) 1999-03-16 2000-10-04 Children's Hospital Of Philadelphia, The Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors
US6432826B1 (en) * 1999-11-29 2002-08-13 Applied Materials, Inc. Planarized Cu cleaning for reduced defects
ATE428445T1 (de) * 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US7220837B1 (en) * 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
AU2001254624A1 (en) 2000-05-03 2001-11-12 Novo-Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) * 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
US20030211094A1 (en) * 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
IL154520A0 (en) 2000-09-13 2003-09-17 Novo Nordisk As Human coagulation factor vii variants
CA2420892A1 (en) * 2000-09-13 2002-03-21 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
AU2001291652B2 (en) * 2000-10-02 2007-09-13 Novo Nordisk Health Care Ag Factor VII glycoforms
US7173000B2 (en) 2000-11-09 2007-02-06 The Scripps Research Institute Modified factor VIIa
DE60334983D1 (de) * 2002-04-30 2010-12-30 Bayer Healthcare Llc Faktor vii oder faktor viia polypeptidvarianten
DK1549677T3 (da) 2002-09-30 2011-07-18 Bayer Healthcare Llc FVII- eller FVIIa-varianter med forøget koagulationsaktivitet
EP2085470B1 (en) 2003-03-20 2012-05-16 Bayer HealthCare LLC FVII or FVIIa variants
RU2373282C2 (ru) * 2003-06-19 2009-11-20 Байер Хелткэр Ллк ВАРИАНТЫ ДОМЕНА GLA ФАКТОРА VII ИЛИ VIIa

Also Published As

Publication number Publication date
US20060252689A1 (en) 2006-11-09
IL150692A0 (en) 2003-02-12
AU2010200296A1 (en) 2010-02-18
US7517974B2 (en) 2009-04-14
US20070142280A1 (en) 2007-06-21
WO2001058935A3 (en) 2001-11-29
NO20023804D0 (no) 2002-08-09
AU3153501A (en) 2001-08-20
EP2319541A1 (en) 2011-05-11
US20060240525A1 (en) 2006-10-26
WO2001058935A2 (en) 2001-08-16
CN1400910A (zh) 2003-03-05
US20060252127A1 (en) 2006-11-09
AU2006200448A1 (en) 2006-03-02
US20060258585A1 (en) 2006-11-16
PL362856A1 (pl) 2004-11-02
AU2006200448B2 (en) 2009-11-12
US7598056B2 (en) 2009-10-06
US7442524B2 (en) 2008-10-28
EP1982732A3 (en) 2011-06-08
US20060252690A1 (en) 2006-11-09
CN100488562C (zh) 2009-05-20
EP1982732A2 (en) 2008-10-22
DK1257295T3 (da) 2009-08-10
US20060228782A1 (en) 2006-10-12
RU2002124129A (ru) 2004-03-20
NO20023804L (no) 2002-09-25
US20120171765A1 (en) 2012-07-05
RU2278123C2 (ru) 2006-06-20
NZ521257A (en) 2004-10-29
US8084591B2 (en) 2011-12-27
JP2005270110A (ja) 2005-10-06
AU783512B2 (en) 2005-11-03
US7754682B2 (en) 2010-07-13
CA2397347C (en) 2011-07-12
US20060019336A1 (en) 2006-01-26
PL206148B1 (pl) 2010-07-30
US20030096338A1 (en) 2003-05-22
US7511024B2 (en) 2009-03-31
JP2003521930A (ja) 2003-07-22
US20060240524A1 (en) 2006-10-26
JP4509846B2 (ja) 2010-07-21
IL199497A0 (en) 2011-07-31
EP1257295A2 (en) 2002-11-20
US7414022B2 (en) 2008-08-19
US7371543B2 (en) 2008-05-13
DE60138364D1 (de) 2009-05-28
ATE428445T1 (de) 2009-05-15
US6806063B2 (en) 2004-10-19
CY1109614T1 (el) 2014-08-13
US20090023635A1 (en) 2009-01-22
IL199497A (en) 2013-08-29
PT1257295E (pt) 2009-07-16
EP1257295B1 (en) 2009-04-15
US7427592B2 (en) 2008-09-23
CA2739933A1 (en) 2001-08-16
US20070243588A1 (en) 2007-10-18
ES2325877T3 (es) 2009-09-23
CA2397347A1 (en) 2001-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2278123C2 (ru) Молекулы, подобные фактору vii или viia
CA2502162C (en) Fvii or fviia variants having increased clotting activity
US7700733B2 (en) Factor VII or VIIa polypeptide variants
AU2014253469A1 (en) FVII or FVIIa variants having increased clotting activity

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification