JP5147692B2 - 治療用タンパク質生成のための宿主細胞タンパク質ノックアウト細胞 - Google Patents
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Description
（発明の分野）
本発明は、極僅か又は無視しうる量のタンパク質混入物を有するビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物を生成するための方法及び該方法から得られる組成物に関する。このような方法は相対含量のタンパク質混入物を少なくするために単独で用いても、他の方法と組み合わせて用いてもよい。特に、本発明は、トロンビンポリペプチド(ＦII／ＦIIa)、第X因子ポリペプチド(ＦX／ＦXa)、第IX因子ポリペプチド(ＦIX／ＦIXa)、第VII因子ポリペプチド(ＦVII／ＦVIIa)、及び抗凝固プロテインＣから選択される凝固因子、特に第VII因子ポリペプチドの組成物の調製に関する。
本発明は、極僅か又は無視しうる量のタンパク質混入物を有するビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物を生成するための方法及び該方法から得られる組成物に関する。このような方法は相対含量のタンパク質混入物を少なくするために単独で用いても、他の方法と組み合わせて用いてもよい。特に、本発明は、トロンビンポリペプチド(ＦII／ＦIIa)、第X因子ポリペプチド(ＦX／ＦXa)、第IX因子ポリペプチド(ＦIX／ＦIXa)、第VII因子ポリペプチド(ＦVII／ＦVIIa)、及び抗凝固プロテインＣから選択される凝固因子、特に第VII因子ポリペプチドの組成物の調製に関する。
（発明の背景）
微生物又は細胞株の培養物からの組み換えタンパク質の生成において、最終的な生成工程は、対象とする生成物の回収と場合によって濃縮である。また、細胞が生育し、分泌されたタンパク質、特に対象とする細胞内タンパク質を含む細胞溶解物を含有する細胞培養物は、多かれ少なかれ、培地成分、核酸などの他の混入物以外に、細胞によって生成された他のタンパク質を含む。したがって、精製されたタンパク質生成物を得るために、対象とするタンパク質を含有する粗材料中の他のタンパク質やポリペプチド及び他の不純物から対象とするタンパク質を分離する必要がある。しかしながら、対象とするポリペプチドと同じ性質のドメインを含むタンパク質混入物を取り除くことは難しいことが多い。
ビタミンＫ依存性タンパク質は、分子のアミノ末端部分において共通の構造的特徴を共有することによって、他のタンパク質と区別される。Ｇｌａ-ドメインとも称されるこれらのタンパク質のＮ末端は、γ-グルタミルカルボキシラーゼ酵素によって触媒されるビタミンＫ依存性反応においてグルタミン酸塩から合成される異常なアミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸に豊富にある。およそ９〜１２のＧｌａ残基があるために、Ｇｌａ-ドメインは、Ｃａ２＋などの二価の陽イオンを結合しうるという特徴がある。金属イオンの結合の際に、これらのタンパク質は、円二色性及び蛍光発光などの様々な技術によって測定されうる立体配置的変化を生じる。
微生物又は細胞株の培養物からの組み換えタンパク質の生成において、最終的な生成工程は、対象とする生成物の回収と場合によって濃縮である。また、細胞が生育し、分泌されたタンパク質、特に対象とする細胞内タンパク質を含む細胞溶解物を含有する細胞培養物は、多かれ少なかれ、培地成分、核酸などの他の混入物以外に、細胞によって生成された他のタンパク質を含む。したがって、精製されたタンパク質生成物を得るために、対象とするタンパク質を含有する粗材料中の他のタンパク質やポリペプチド及び他の不純物から対象とするタンパク質を分離する必要がある。しかしながら、対象とするポリペプチドと同じ性質のドメインを含むタンパク質混入物を取り除くことは難しいことが多い。
ビタミンＫ依存性タンパク質は、分子のアミノ末端部分において共通の構造的特徴を共有することによって、他のタンパク質と区別される。Ｇｌａ-ドメインとも称されるこれらのタンパク質のＮ末端は、γ-グルタミルカルボキシラーゼ酵素によって触媒されるビタミンＫ依存性反応においてグルタミン酸塩から合成される異常なアミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸に豊富にある。およそ９〜１２のＧｌａ残基があるために、Ｇｌａ-ドメインは、Ｃａ２＋などの二価の陽イオンを結合しうるという特徴がある。金属イオンの結合の際に、これらのタンパク質は、円二色性及び蛍光発光などの様々な技術によって測定されうる立体配置的変化を生じる。
Ｇｌａ含有タンパク質の高次構造変化を誘発する金属の発見(Nelsestuen等, J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893)とともに高次構造特有のポリクローナル抗体の同定(Furie等, J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987)により、高次構造特有の免疫親和性クロマトグラフィの導入の道が開かれた。これらの抗体は、Ｃａ２＋イオンがある場合にはＧｌａ-ドメインを認識して結合しうるが、ＥＤＴＡ又はクエン酸塩などのＣａ２＋キレート剤を用いてＣａ２＋イオンが除去されている場合には、タンパク質を放出しうる。
１９８０年代には、高次構造に金属誘発性の変化を起こさせるために、Ｇｌａ含有タンパク質固有の性質を用いて高次構造特有の偽親和性クロマトグラフィが開発された。用いる固定した親和性リガンドがないという点で、偽親和性クロマトグラフィは従来の親和性クロマトグラフィと異なり、従来のクロマトグラフィの基質上で行われる(Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218)。Ｇｌａタンパク質は、二価金属イオンを取り除くことによって陰イオン交換物質に吸着されうる。その後、Ｃａ２＋を溶出緩衝液に加えることによって溶出を行った。
１９８０年代には、高次構造に金属誘発性の変化を起こさせるために、Ｇｌａ含有タンパク質固有の性質を用いて高次構造特有の偽親和性クロマトグラフィが開発された。用いる固定した親和性リガンドがないという点で、偽親和性クロマトグラフィは従来の親和性クロマトグラフィと異なり、従来のクロマトグラフィの基質上で行われる(Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218)。Ｇｌａタンパク質は、二価金属イオンを取り除くことによって陰イオン交換物質に吸着されうる。その後、Ｃａ２＋を溶出緩衝液に加えることによって溶出を行った。
１９８６年には、Bjorn及びThimは、ＦVIIのＧｌａ-ドメインのＣａ２＋結合性質を利用する陰イオン交換物質でのｒＦVIIの精製を報告した(Bjorn S. and Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962.)。吸着はＣａ２＋を含まないバッファ中で行い、低イオン強度のＣａ２＋含有バッファを用いた穏やかな条件下でのＦVIIの溶出が可能であった。Yan等は、組み換えヒトプロテインＣの精製に同じ原理を用いた(Yan S. B.等, Bio/technology. 1990; 8, 655-661)。
Brown等 (Brown等, J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.)は、Ｇｌａ残基に特異的なモノクローナル抗体を報告している。これらの抗体は、すべての試験したＧｌａタンパク質：第VII因子、第IX因子、第II因子、プロテインＣ、プロテインＳ、ＧＡＳ-６、骨マトリックスＧｌａタンパク質、コナントキンＧ(conantokin G)を認識しうる。あるＧｌａタンパク質に対して生じるいくつかの高次構造特有の抗体は他のＧｌａタンパク質との交差反応を示す(Furie B. and Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771；Church等, J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267)。
Brown等 (Brown等, J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.)は、Ｇｌａ残基に特異的なモノクローナル抗体を報告している。これらの抗体は、すべての試験したＧｌａタンパク質：第VII因子、第IX因子、第II因子、プロテインＣ、プロテインＳ、ＧＡＳ-６、骨マトリックスＧｌａタンパク質、コナントキンＧ(conantokin G)を認識しうる。あるＧｌａタンパク質に対して生じるいくつかの高次構造特有の抗体は他のＧｌａタンパク質との交差反応を示す(Furie B. and Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771；Church等, J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267)。
Ｇｌａ-ドメインの存在が他のタンパク質からのＧｌａ含有タンパク質の分離に有益であるのに対して、本発明の発明者等は、Ｇｌａ含有タンパク質の類似の特性及び行動が互いに他から分離することを難しくしていることを明らかにした。
Ｇｌａ-ドメインを有するタンパク質は、以下のタンパク質：ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンを含む。
宿主細胞は、ポリペプチドの使用の際に望ましくない免疫原性応答を引き起こしうるタンパク質混入物を有意な量で産生しうるので、対象とするＧｌａ-ドメイン含有ポリペプチドなどの、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をタンパク質混入物から効率的に分離する必要性は、細胞培養物中で産生される該ポリペプチドの精製を扱う際に特に関連する問題である。
Ｇｌａ-ドメインを有するタンパク質は、以下のタンパク質：ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンを含む。
宿主細胞は、ポリペプチドの使用の際に望ましくない免疫原性応答を引き起こしうるタンパク質混入物を有意な量で産生しうるので、対象とするＧｌａ-ドメイン含有ポリペプチドなどの、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をタンパク質混入物から効率的に分離する必要性は、細胞培養物中で産生される該ポリペプチドの精製を扱う際に特に関連する問題である。
（発明の概要）
本発明は、広義の態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物であって、宿主細胞から発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないかあるいは実質的にない組成物の生成に関する。
したがって、第一の態様では、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。一実施態様では、宿主細胞は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトが形質移入されている。
本明細書中で用いる「修飾した」なる用語は、任意の合成分子又は産業に有用な細胞生物学的技術ないしは方法によって操作されている細胞に関する。
本発明は、広義の態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物であって、宿主細胞から発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないかあるいは実質的にない組成物の生成に関する。
したがって、第一の態様では、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。一実施態様では、宿主細胞は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトが形質移入されている。
本明細書中で用いる「修飾した」なる用語は、任意の合成分子又は産業に有用な細胞生物学的技術ないしは方法によって操作されている細胞に関する。
第二の態様では、本発明は、本発明の宿主細胞を生成するための方法であって、
a) 場合によって対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する；及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
a) 場合によって対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する；及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 本発明に記載の宿主細胞を生成する；及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
a) 本発明に記載の宿主細胞を生成する；及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞を成長培地中で生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する工程を含んでなる方法に関する。
更なる態様では、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物であって、宿主細胞から発現されるタンパク質混入物がないかあるいは実質的にない組成物の生成のために有用な、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する修飾した細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を少なくするか又は除去するための方法であって、このとき宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
更なる態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳをコードする新規の核酸配列に関する。
更なる態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳの新規のアミノ酸配列に関する。
更なる態様では、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を少なくするか又は除去するための方法であって、このとき宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
更なる態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳをコードする新規の核酸配列に関する。
更なる態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳの新規のアミノ酸配列に関する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、組み換えタンパク質の生成のための宿主細胞であって、該宿主細胞が、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。
混在タンパク質の発現を減少するための任意の方法又は技術が用いられうることが理解されるであろう。ｓｉＲＮＡターゲティング、標的遺伝子ノックアウト、転写因子の形質移入、及びタンパク質混入物をコードするＤＮＡ鎖の部位特異的切断を含む方法の例は、いかなる形であれ限定して解釈されるものではない。原則として、任意の分子生物学、細胞生物学又は選別法を用いて、特定のタンパク質混入物の発現レベルを低減しうる。本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が一又は複数のタンパク質混入物と密接に関係している場合、例えばタンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である場合に特に有用である。対象とするビタミンＫ依存性タンパク質とタンパク質混入物との密接な関係のために、つまりタンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である場合、このようなタンパク質混入物は精製方法による除去が非常に困難でありうる。
本発明は、組み換えタンパク質の生成のための宿主細胞であって、該宿主細胞が、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞に関する。
混在タンパク質の発現を減少するための任意の方法又は技術が用いられうることが理解されるであろう。ｓｉＲＮＡターゲティング、標的遺伝子ノックアウト、転写因子の形質移入、及びタンパク質混入物をコードするＤＮＡ鎖の部位特異的切断を含む方法の例は、いかなる形であれ限定して解釈されるものではない。原則として、任意の分子生物学、細胞生物学又は選別法を用いて、特定のタンパク質混入物の発現レベルを低減しうる。本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が一又は複数のタンパク質混入物と密接に関係している場合、例えばタンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である場合に特に有用である。対象とするビタミンＫ依存性タンパク質とタンパク質混入物との密接な関係のために、つまりタンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である場合、このようなタンパク質混入物は精製方法による除去が非常に困難でありうる。
さらに、本発明は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないか又は実質的にない、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物に関する。
本発明の一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される。ビタミンＫ依存性タンパク質は活性型又は非活性型のいずれかでよく、例えば第II因子及び第IIa因子、並びに第X因子及び第Xa因子でよい。
本発明の一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される。ビタミンＫ依存性タンパク質は活性型又は非活性型のいずれかでよく、例えば第II因子及び第IIa因子、並びに第X因子及び第Xa因子でよい。
本発明の一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は、例えばＦVII又はＦVIIaポリペプチドなどの凝固因子である。一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は野生型ヒトのＦVIIaである。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物は第二の異なるビタミンＫ依存性タンパク質である。したがって、対象とするタンパク質とタンパク質混入物がともにビタミンＫ依存性タンパク質であってもよい。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物はプロテインＳである。一実施態様では、タンパク質混入物はハムスタープロテインＳである。
本発明の一実施態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物は第二の異なるビタミンＫ依存性タンパク質である。したがって、対象とするタンパク質とタンパク質混入物がともにビタミンＫ依存性タンパク質であってもよい。
本発明の一実施態様では、タンパク質混入物はプロテインＳである。一実施態様では、タンパク質混入物はハムスタープロテインＳである。
本発明の一実施態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される。
さらに、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、このとき該宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含む宿主細胞に関する。
本明細書中で用いる「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、分子生物学の分野で公知の短い干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られていることが多い、小干渉ＲＮＡを指す。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンＫ依存性タンパク質である。
本明細書中で用いる「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、分子生物学の分野で公知の短い干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして知られていることが多い、小干渉ＲＮＡを指す。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンＫ依存性タンパク質である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインＳである。
また、本発明は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞に関する。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている。一実施態様では、プロテインＳをコードする内因性遺伝子は、エクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている。
また、本発明は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞に関する。
一実施態様では、宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている。一実施態様では、プロテインＳをコードする内因性遺伝子は、エクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンＫ依存性タンパク質である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインＳである。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、プロテインＳについて破壊された遺伝子を含んでなり、該プロテインＳはエクソン１の欠失によって破壊される。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするＤＮＡ鎖の部位特異的な切断のために少なくとも一のヌクレアーゼ融合タンパク質を形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインＳである。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、プロテインＳについて破壊された遺伝子を含んでなり、該プロテインＳはエクソン１の欠失によって破壊される。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするＤＮＡ鎖の部位特異的な切断のために少なくとも一のヌクレアーゼ融合タンパク質を形質移入することによって修飾されている。
さらに、本発明は、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物に結合する転写因子を含んでなる、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞に関する。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするＤＮＡ配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンＫ依存性タンパク質である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするＤＮＡ配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインＳである。
本発明の一実施態様では、転写因子はＺｉｎｃフィンガータンパク質である。本発明の一実施態様では、Ｚｉｎｃフィンガータンパク質は、配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する。
本発明の一実施態様では、Ｚｉｎｃフィンガータンパク質はGGAGAGGAGGGGGGG ＤＮＡエレメントを結合する。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするＤＮＡ配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物は第二のビタミンＫ依存性タンパク質である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、少なくとも一のタンパク質混入物をコードするＤＮＡ配列に結合する転写因子を含んでなり、該タンパク質混入物はプロテインＳである。
本発明の一実施態様では、転写因子はＺｉｎｃフィンガータンパク質である。本発明の一実施態様では、Ｚｉｎｃフィンガータンパク質は、配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する。
本発明の一実施態様では、Ｚｉｎｃフィンガータンパク質はGGAGAGGAGGGGGGG ＤＮＡエレメントを結合する。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている。
また、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ｓｉＲＮＡの使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ランダム突然変異誘発法の使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ターゲティングノックアウトの使用を含んでなる方法である。
また、本発明は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法に関する。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ｓｉＲＮＡの使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ランダム突然変異誘発法の使用を含んでなる方法である。
一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法は、ターゲティングノックアウトの使用を含んでなる方法である。
さらに、本発明は、配列番号３の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ ｃＤＮＡ配列又はその任意の機能的断片を含んでなる核酸配列に関する。
また、本発明は、配列番号４の配列を有するＣＨＯ プロテインＳコード配列又はその任意の機能的断片を含んでなる核酸配列に関する。
本発明は、配列番号５の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ配列又はその任意の機能的断片を含んでなるアミノ酸配列に関する。
また、本発明は、配列番号４の配列を有するＣＨＯ プロテインＳコード配列又はその任意の機能的断片を含んでなる核酸配列に関する。
本発明は、配列番号５の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ配列又はその任意の機能的断片を含んでなるアミノ酸配列に関する。
本明細書中に記載の方法及び手段は、原則として、タンパク質混入物がないか又は実質的にない、任意の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物を生成するために応用しうる。
「ポリペプチド」は、野生型タンパク質、並びにその「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」それぞれのアミノ酸配列を含んでなる任意のタンパク質を意味する。
特に、本明細書中で用いられる、「第VII因子ポリペプチド」又は「ＦVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１−４０６、その変異体、並びに第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを含んでなる任意のタンパク質を意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すＦVII変異体、第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
「ポリペプチド」は、野生型タンパク質、並びにその「変異体」、「関連したポリペプチド」、「誘導体」及び「コンジュゲート」それぞれのアミノ酸配列を含んでなる任意のタンパク質を意味する。
特に、本明細書中で用いられる、「第VII因子ポリペプチド」又は「ＦVIIポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第VIIa因子(すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１−４０６、その変異体、並びに第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートを含んでなる任意のタンパク質を意味する。これには、野生型ヒト第VIIa因子と相対的に同じか改善された生物学的活性を実質的に示すＦVII変異体、第VII因子関連のポリペプチド、第VII因子誘導体及び第VII因子コンジュゲートが含まれる。
「第VII因子」なる用語は、非切断(チモーゲン)型の第VII因子ポリペプチド、並びにその生理活性型を得るようにタンパク質分解的にプロセシングされているもの(第VIIa因子と称されうるもの)を包含することを意図する。概して、第VII因子は、残基１５２と１５３の間で切断されて第VIIa因子となる。
第VII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、変更した特異的活性などを含む、ヒト第VII因子と相対的に異なる性質を表しうる。
また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」には、存在し、ある個体から他の個体に生じうる天然の対立遺伝子変異体が含まれる。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞や宿主の細胞性環境の性質に応じて異なりうる。
本明細書中で用いられる「野生型ヒトＦVIIa」は、米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
第VII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合性、変更した特異的活性などを含む、ヒト第VII因子と相対的に異なる性質を表しうる。
また、上記の定義の範囲内の「第VII因子」又は「第VIIa因子」には、存在し、ある個体から他の個体に生じうる天然の対立遺伝子変異体が含まれる。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択した宿主細胞や宿主の細胞性環境の性質に応じて異なりうる。
本明細書中で用いられる「野生型ヒトＦVIIa」は、米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本明細書中で用いられる「第VII因子誘導体」なる用語は野生型第VII因子に対して相対的に同じか又は改善された生物学的活性を実質的に示すＦVIIポリペプチドを表すことを意図し、このＦVIIポリペプチドにおいて、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成又はアミドなどによって遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に修飾されている。これには、ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子、システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。第VII因子誘導体の非限定的な例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国公開特許第２００４００４３４４６号、同第２００４００６３９１１号、同第２００４０１４２８５６号、同第２００４０１３７５５７号及び同第２００４０１３２６４０号(Neose Technologies, Inc.)に開示されるグリコＰＥＧ化ＦVII誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国公開特許第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)及び国際公開第０２／０２７６４号、米国公開特許第２００３０２１１０９４号(University of Minnesota)に開示されるＦVIIコンジュゲートが含まれる。
「改善された生物学的活性」なる用語は、i) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有するＦVIIポリペプチド、又はii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したＴＦ結合活性を有するＦVIIポリペプチド、又はiii) 組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加した血漿中の半減期を有するＦVIIポリペプチドを指す。「ＰＥＧ化されたヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。ＰＥＧ分子が第VIIa因子ポリペプチドのいずれかのアミノ酸残基又は糖鎖を含む第VIIa因子ポリペプチドのいずれかの部分に付着しうることは理解される。「システイン-ＰＥＧ化ヒト第VIIa因子」なる用語は、ヒト第VIIa因子に導入されるシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされるＰＥＧ分子を有する第VIIa因子を意味する。
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じ又は増加したタンパク質分解活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、Ｓ５２Ａ-ＦVIIa、Ｓ６０Ａ-ＦVIIa( Lino等, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示される、増加したタンパク質分解性安定性を表すＦVIIa変異体；残基２９０と２９１又は残基３１５と３１６の間でタンパク質分解的に切断されている第VIIa因子(Mollerup等, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第VIIa因子の酸化型(Kornfelt等, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第０２／０７７２１８号に対応する)に開示されるＦVII変異体；及び、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示される、増加したタンパク分解性安定性を表すＦVII変異体；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び同第６７４７００３号、米国公開特許第２００３０１００５０６号(University of Minnesota)及び国際公開第００／６６７５３号、米国公開特許第２００１００１８４１４号、同第２００４２２０１０６号、及び同第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び同第６６９３０７５号(University of Minnesota)に開示される、変性Ｇｌａ-ドメインを有し、亢進した膜結合を示すＦVII変異体；及び、国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国公開特許第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示される、ＦVII変異体が含まれる。
野生型ＦVIIaと比較して増加した生物学的活性を有するＦVII変異体の非限定的な例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、国際公開第０３／０２７１４７号、国際公開第０４／０２９０９０号、国際公開第０５／０７５６３５号、及び出願番号０５１０８７１３．８(Novo Nordisk A/S)の欧州特許出願、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)に開示されるＦVII変異体；及び、特願２００１０６１４７９(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示される、亢進された活性を有するＦVIIa変異体が含まれる。
第VII因子の変異体の例には、P10Q-第VII因子、K32E-第VII因子、P10Q/K32E-第VII因子、L305V-第VII因子、L305V/M306D/D309S-第VII因子、L305I-第VII因子、L305T-第VII因子、F374P-第VII因子、V158T/M298Q-第VII因子、V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K337A-第VII因子、M298Q-第VII因子、V158D/M298Q-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-第VII因子、K157A-第VII因子、E296V-第VII因子、E296V/M298Q-第VII因子、V158D/E296V-第VII因子、V158D/M298K-第VII因子、及びS336G-第VII因子、L305V/K337A-第VII因子、L305V/V158D-第VII因子、L305V/E296V-第VII因子、L305V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T-第VII因子、L305V/K337A/V158T-第VII因子、L305V/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/K337A/E296V-第VII因子、L305V/K337A/V158D-第VII因子、L305V/V158D/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V-第VII因子、L305V/V158T/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V-第VII因子、L305V/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/K316H-第VII因子、S314E/K316Q-第VII因子、S314E/L305V-第VII因子、S314E/K337A-第VII因子、S314E/V158D-第VII因子、S314E/E296V-第VII因子、S314E/M298Q-第VII因子、S314E/V158T-第VII因子、K316H/L305V-第VII因子、K316H/K337A-第VII因子、K316H/V158D-第VII因子、K316H/E296V-第VII因子、K316H/M298Q-第VII因子、K316H/V158T-第VII因子、K316Q/L305V-第VII因子、K316Q/K337A-第VII因子、K316Q/V158D-第VII因子、K316Q/E296V-第VII因子、K316Q/M298Q-第VII因子、K316Q/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D-第VII因子、S314E/L305V/E296V-第VII因子、S314E/L305V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158T-第VII因子、S314E/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/K337A/E296V-第VII因子、S314E/L305V/K337A/V158D-第VII因子、S314E/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V-第VII因子、S314E/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V-第VII因子、S314E/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D-第VII因子、K316H/L305V/E296V-第VII因子、K316H/L305V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316H/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316H/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316H/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316H/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316H/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158T-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/K337A/V158D-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V-第VII因子、K316Q/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/K337A-第VII因子、F374Y/V158D-第VII因子、F374Y/E296V-第VII因子、F374Y/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T-第VII因子、F374Y/S314E-第VII因子、F374Y/L305V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158D-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158T-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/S314E/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/M298Q-第VII因子、F374Y/K337A/V158T/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/K337A/M298Q/V158D-第VII因子、F374Y/K337A/E296V/V158D-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158D/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/E296V-第VII因子、F374Y/V158T/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/E296V-第VII因子、F374Y/E296V/S314E/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-第VII因子、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-第VII因子、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-第VII因子、S52A-Factor VII, S60A-第VII因子；R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、T106N-第VII因子、K143N/N145T-第VII因子、V253N-第VII因子、R290N/A292T-第VII因子、G291N-第VII因子、R315N/V317T-第VII因子、K143N/N145T/R315N/V317T-第VII因子；及び、２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVII；及び、１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇまでのアミノ酸配列に置換、付加又は欠失を有するＦVIIが含まれるがこれらに限定されるものではない。
したがって、第VII因子ポリペプチドの置換変異体には、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｌ３０５、Ｌ３０５、Ｆ３７４、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７での置換、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失；又はＩ１５３からＲ２２３まで、又はこれらの組み合わせ、特に、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔなどの変異、及びＴ２３３からＮ２４０まで、又はＲ３０４からＣ３２９まで、又はＩ１５３からＲ２２３までのアミノ酸配列中の置換、付加又は欠失、又はこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書中で用いられる「対象とするビタミンＫ依存性タンパク質」なる用語は、最も純粋な形態で得るために関係する、宿主細胞によって生産される単一のビタミンＫ依存性タンパク質生成物を指す。一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は宿主細胞によって最も多量に生産されるタンパク質生成物である。一実施態様では、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は宿主細胞に形質移入される。
本明細書中で用いられる「組成物」は、任意の組成物、例えば水溶性の液体組成物などの液体組成物を意味する。
最も一般的には、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は細胞培養条件下で産生されたものである。すなわち、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は細胞培養物上清の成分として直接得られるか、一又は複数の続く精製方法の工程の後に細胞培養物上清から得られる。
本明細書中で用いられる「組成物」は、任意の組成物、例えば水溶性の液体組成物などの液体組成物を意味する。
最も一般的には、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は細胞培養条件下で産生されたものである。すなわち、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は細胞培養物上清の成分として直接得られるか、一又は複数の続く精製方法の工程の後に細胞培養物上清から得られる。
一般的に、非精製組成物中のタンパク質混入物の総含量は、少なくとも２００ｐｐｍ、例えば少なくとも３００ｐｐｍ、例えば少なくとも４００ｐｐｍ又は少なくとも５００ｐｐｍである。また一般的に、非精製組成物中のプロテインＳ混入物の総含量は、少なくとも２００ｐｐｍ、例えば少なくとも３００ｐｐｍ、例えば少なくとも４００ｐｐｍ又は少なくとも５００ｐｐｍである。
本明細書中で用いられる「タンパク質混入物」及び「複数のタンパク質混入物」は、宿主細胞によって内因的に生産され、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質との関係で不純物を構成するタンパク質ないしはポリペプチド成分を意味する。したがって、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は、明らかにタンパク質混入物とみなさない。
本明細書中で用いられる「〜がないか又は実質的にない」とは、組成物中のタンパク質混入物の総含量が多くとも５００ｐｐｍ、例えば多くとも１００ｐｐｍ、例えば多くとも１０ｐｐｍ、例えば多くとも１ｐｐｍ、又は多くとも０．１ｐｐｍである組成物を指す。また一般的に、組成物中のプロテインＳ混入物の総含量は、多くとも５００ｐｐｍ、例えば多くとも１００ｐｐｍ、例えば多くとも１０ｐｐｍ、例えば多くとも１ｐｐｍ、又は多くとも０．１ｐｐｍである。
本明細書中で用いられる「タンパク質混入物」及び「複数のタンパク質混入物」は、宿主細胞によって内因的に生産され、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質との関係で不純物を構成するタンパク質ないしはポリペプチド成分を意味する。したがって、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質は、明らかにタンパク質混入物とみなさない。
本明細書中で用いられる「〜がないか又は実質的にない」とは、組成物中のタンパク質混入物の総含量が多くとも５００ｐｐｍ、例えば多くとも１００ｐｐｍ、例えば多くとも１０ｐｐｍ、例えば多くとも１ｐｐｍ、又は多くとも０．１ｐｐｍである組成物を指す。また一般的に、組成物中のプロテインＳ混入物の総含量は、多くとも５００ｐｐｍ、例えば多くとも１００ｐｐｍ、例えば多くとも１０ｐｐｍ、例えば多くとも１ｐｐｍ、又は多くとも０．１ｐｐｍである。
本明細書中で用いられる「少なくとも一のタンパク質混入物を実質的に少ない量で発現する」なる表現は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％減少する内因性タンパク質混入物の発現レベルを指す。
特に関連のあるタンパク質混入物の種類は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質に非常に類似したタンパク質、例えばタンパク質：ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第Xa因子、第IXa因子、プロテインＣ、第VIIa因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンを含む、Ｇｌａ-ドメインを含有する任意の他のタンパク質である。
特に関連のあるタンパク質混入物の種類は、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質に非常に類似したタンパク質、例えばタンパク質：ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第Xa因子、第IXa因子、プロテインＣ、第VIIa因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンを含む、Ｇｌａ-ドメインを含有する任意の他のタンパク質である。
非限定的な例として、プロテインＳは哺乳動物細胞中での組み換えＦVIIaの生成において不純物とみなされることが多い。プロテインＳは、ＥＧＦ-様ドメイン及びγ-カルボキシグルタミン酸(Ｇｌａ)ドメインを含有するＦVIIaビタミンＫ依存性血漿糖タンパク質に似ている。ＦVII(a)とプロテインＳとの構造的な類似のために、プロテインＳとの混入なしに上記クロマトグラフィ法によってＦVIIを回収することは難しい。したがって、宿主細胞によってプロテインＳの発現を予防することが望ましい。これは、ｍＲＮＡ又はゲノムを標的とすることによって得られうる。
小干渉ＲＮＡであるｓｉＲＮＡの安定した発現は、標的としたｍＲＮＡの減少、それによる哺乳動物細胞での標的とした遺伝子発現の抑制を可能にする新規の技術である(T. R. Brummelkamp, R. Bernards, 及びR. Agami. Science 296(5567): 550-553, 2002及びM. Mivaaishi及びK Taira. Nat Biotechnol 20(5): 497-200, 2002)。多くの個々のｓｉＲＮＡは、参考文献において記述されるものと類似の方策で生成されている。これらのｓｉＲＮＡのいくつかは有用であることが判明した(実施例２)。
小干渉ＲＮＡであるｓｉＲＮＡの安定した発現は、標的としたｍＲＮＡの減少、それによる哺乳動物細胞での標的とした遺伝子発現の抑制を可能にする新規の技術である(T. R. Brummelkamp, R. Bernards, 及びR. Agami. Science 296(5567): 550-553, 2002及びM. Mivaaishi及びK Taira. Nat Biotechnol 20(5): 497-200, 2002)。多くの個々のｓｉＲＮＡは、参考文献において記述されるものと類似の方策で生成されている。これらのｓｉＲＮＡのいくつかは有用であることが判明した(実施例２)。
また、いくつかの変異が宿主細胞でのｍＲＮＡの生成を阻害しうる、ゲノム変異を宿主細胞に導入するためのランダム突然変異誘発の使用が開発されうる。これは、細胞中に点突然変異を誘発する、エチルメタンスルホン酸(ＥＭＳ)などの変異誘発物質にてＣＨＯ細胞群を処理することによって達成されうる。これらの突然変異のために、生存している細胞は変更した表現型を表しうる。細胞を、スクリーニング形式(例えば９６ウェルプレート)に播き、クローン細胞群の単離を可能にしてもよい。増殖期後、培地をウェルから回収し、プロテインＳ含量についてアッセイしてもよい。プロテインＳ発現のないクローンを単離して、無プロテインＳ第VII因子の産生に用いてもよい。
ゲノムの破壊は、遺伝子ターゲティング又はノックアウト技術によって得られうる(実施例３)。ノックアウト細胞の生成は、内因性タンパク質の発現を無くすためによく記載される技術であり、ＣＨＯノックアウト細胞はYamane-Ohnuki等 Biotechnol. Bioeng. 87 (5): 614-622, 2004において最近記述された。
ゲノムプロテインＳノックアウトプラスミドを生成し、ＣＨＯ細胞に形質移入した。相同組み換えによって、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳ遺伝子を破壊した。この手順は、プロテインＳ遺伝子のすべての対立遺伝子が安定して取り除かれるまで繰り返した(実施例３)。
ゲノムの破壊は、遺伝子ターゲティング又はノックアウト技術によって得られうる(実施例３)。ノックアウト細胞の生成は、内因性タンパク質の発現を無くすためによく記載される技術であり、ＣＨＯノックアウト細胞はYamane-Ohnuki等 Biotechnol. Bioeng. 87 (5): 614-622, 2004において最近記述された。
ゲノムプロテインＳノックアウトプラスミドを生成し、ＣＨＯ細胞に形質移入した。相同組み換えによって、ＣＨＯ細胞中のプロテインＳ遺伝子を破壊した。この手順は、プロテインＳ遺伝子のすべての対立遺伝子が安定して取り除かれるまで繰り返した(実施例３)。
転写の下方制御のための転写因子操作は、遺伝子発現を変更する代替的な方法である(実施例４)。
これらの方法は、理論的には、任意の望ましくない宿主細胞タンパク質混入物を除去するために好適でありうる。応用されるこれらの方法のすべてについて、混入タンパク質の遺伝子配列の情報が必要である。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のプロテインＳの配列は公的に利用可能でなく、実施例１に記載され配列番号１として開示されるＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡのクローニングを行った。ＣＨＯプロテインＳコード配列及びＣＨＯプロテインＳアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び３として開示される。
これらの方法は、理論的には、任意の望ましくない宿主細胞タンパク質混入物を除去するために好適でありうる。応用されるこれらの方法のすべてについて、混入タンパク質の遺伝子配列の情報が必要である。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のプロテインＳの配列は公的に利用可能でなく、実施例１に記載され配列番号１として開示されるＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡのクローニングを行った。ＣＨＯプロテインＳコード配列及びＣＨＯプロテインＳアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２及び３として開示される。
さらに、本発明は以下の実施例によって例示するが、これら実施例は保護範囲を限定するものとして解釈されるものではない。前述の説明及び以下の実施例に開示される特徴は、単独でもそのいずれかの組み合わせでも、その多様な形態で本発明を理解するための材料となりうる。
本発明の実施態様：
１．宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないか又は実質的にない、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物。
２．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
３．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１に記載の組成物。
４．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１に記載の組成物。
５．宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
６．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
７．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様６に記載の細胞。
８．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様６又は７に記載の細胞。
９．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
１０．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様９に記載の細胞。
１１．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様９又は１０に記載の細胞。
１２．前記該プロテインＳ遺伝子がエクソン１の欠失によって破壊されている、実施態様９から１１のいずれか一に記載の細胞。
１３．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物に結合する転写因子を含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
１４．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１３に記載の細胞。
１５．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１３又は１４に記載の細胞。
１６．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様１３から１５のいずれか一に記載の細胞。
１７．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質がGGAGAGGAGGGGGGG ＤＮＡエレメントを結合する、実施態様１５又は１６に記載の細胞。
１８．対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法。
１９．前記方法がｓｉＲＮＡの使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２０．前記方法がランダム突然変異誘発の使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２１．前記方法がターゲティングノックアウトの使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２２．配列番号１の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ ｃＤＮＡ配列を含んでなる核酸配列。
２３．配列番号２の配列を有するＣＨＯ プロテインＳコード配列を含んでなる核酸配列。
２４．配列番号３の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ配列を含んでなるアミノ酸配列。
１．宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物がないか又は実質的にない、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物。
２．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
３．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１に記載の組成物。
４．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１に記載の組成物。
５．宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１に記載の組成物。
６．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
７．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様６に記載の細胞。
８．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様６又は７に記載の細胞。
９．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物について破壊された遺伝子を含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
１０．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様９に記載の細胞。
１１．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様９又は１０に記載の細胞。
１２．前記該プロテインＳ遺伝子がエクソン１の欠失によって破壊されている、実施態様９から１１のいずれか一に記載の細胞。
１３．さらに、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物に結合する転写因子を含んでなる、実施態様１から５のいずれか一に記載の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞。
１４．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１３に記載の細胞。
１５．前記の少なくとも一のタンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１３又は１４に記載の細胞。
１６．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様１３から１５のいずれか一に記載の細胞。
１７．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質がGGAGAGGAGGGGGGG ＤＮＡエレメントを結合する、実施態様１５又は１６に記載の細胞。
１８．対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物中の少なくとも一のタンパク質混入物の含量を低減するための方法であって、宿主細胞によって発現される少なくとも一のタンパク質混入物が阻害される方法。
１９．前記方法がｓｉＲＮＡの使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２０．前記方法がランダム突然変異誘発の使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２１．前記方法がターゲティングノックアウトの使用を含んでなる、実施態様１８に記載の方法。
２２．配列番号１の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ ｃＤＮＡ配列を含んでなる核酸配列。
２３．配列番号２の配列を有するＣＨＯ プロテインＳコード配列を含んでなる核酸配列。
２４．配列番号３の配列を有するＣＨＯ プロテインＳ配列を含んでなるアミノ酸配列。
本発明の更なる実施態様：
１ａ．対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞。
２ａ．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１ａに記載の宿主細胞。
３ａ．前記タンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１ａ又は２ａに記載の宿主細胞。
４ａ．前記タンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１ａから３ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
５ａ．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１ａから４ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
６ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様１ａから５ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
７ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様１ａから６ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
８ａ．プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様７ａに記載の宿主細胞。
９ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様１ａから８ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
１０ａ．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様９ａに記載の宿主細胞。
１１ａ．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質が配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する、実施態様１０ａに記載の宿主細胞。
１２ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様１ａから１１ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
１３ａ．実施態様１ａから１２ａのいずれか一に記載の宿主細胞の生成方法であって、
a) 場合によって対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する；及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法。
１４ａ．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１３ａに記載の方法。
１５ａ．前記タンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１３ａ又は１４ａに記載の方法。
１６ａ．前記タンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１３ａから１５ａのいずれか一に記載の方法。
１７ａ．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１３ａから１６ａのいずれか一に記載の方法。
１８ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様１３ａから１７ａのいずれか一に記載の方法。
１９ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様１３ａから１８ａのいずれか一に記載の方法。
２０ａ．プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様１９ａに記載の方法。
２１ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様１３ａから２０ａのいずれか一に記載の方法。
２２ａ．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様２１ａに記載の方法。
２３ａ．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質が配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する、実施態様２２ａに記載の方法。
２４ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様１３ａから２３ａのいずれか一に記載の方法。
２５ａ．内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 実施態様１３ａから２４ａのいずれか一に記載の方法に従って宿主細胞を生成する；及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法。
２６ａ．実施態様項２５ａに記載の方法によって生成される組成物。
２７ａ．配列番号１の配列を含んでなる核酸配列。
２８ａ．配列番号２の配列を含んでなる核酸配列。
２９ａ．配列番号３の配列を含んでなるアミノ酸配列。
１ａ．対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞。
２ａ．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１ａに記載の宿主細胞。
３ａ．前記タンパク質混入物がビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１ａ又は２ａに記載の宿主細胞。
４ａ．前記タンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１ａから３ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
５ａ．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１ａから４ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
６ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様１ａから５ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
７ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様１ａから６ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
８ａ．プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様７ａに記載の宿主細胞。
９ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様１ａから８ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
１０ａ．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様９ａに記載の宿主細胞。
１１ａ．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質が配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する、実施態様１０ａに記載の宿主細胞。
１２ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様１ａから１１ａのいずれか一に記載の宿主細胞。
１３ａ．実施態様１ａから１２ａのいずれか一に記載の宿主細胞の生成方法であって、
a) 場合によって対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する；及び、
b) 内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程をいずれかの順序で含んでなる方法。
１４ａ．前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、実施態様１３ａに記載の方法。
１５ａ．前記タンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である、実施態様１３ａ又は１４ａに記載の方法。
１６ａ．前記タンパク質混入物がプロテインＳである、実施態様１３ａから１５ａのいずれか一に記載の方法。
１７ａ．前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、実施態様１３ａから１６ａのいずれか一に記載の方法。
１８ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、実施態様１３ａから１７ａのいずれか一に記載の方法。
１９ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、実施態様１３ａから１８ａのいずれか一に記載の方法。
２０ａ．プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、実施態様１９ａに記載の方法。
２１ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される前記タンパク質混入物をコードする遺伝子のＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一の転写因子を形質移入することによって修飾されている、実施態様１３ａから２０ａのいずれか一に記載の方法。
２２ａ．前記転写因子がＺｉｎｃフィンガータンパク質である、実施態様２１ａに記載の方法。
２３ａ．前記Ｚｉｎｃフィンガータンパク質が配列番号３５の配列を含んでなるＤＮＡエレメントを結合する、実施態様２２ａに記載の方法。
２４ａ．前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるタンパク質混入物をコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、実施態様１３ａから２３ａのいずれか一に記載の方法。
２５ａ．内因的に発現される少なくとも一のタンパク質混入物を、修飾がない場合の宿主細胞よりも実質的に少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 実施態様１３ａから２４ａのいずれか一に記載の方法に従って宿主細胞を生成する；及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法。
２６ａ．実施態様項２５ａに記載の方法によって生成される組成物。
２７ａ．配列番号１の配列を含んでなる核酸配列。
２８ａ．配列番号２の配列を含んでなる核酸配列。
２９ａ．配列番号３の配列を含んでなるアミノ酸配列。
実施例１：ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡのクローニング。
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のプロテインＳ ｃＤＮＡ配列は、任意のヌクレオチド又はタンパク質データベースから公知でないが、他の齧歯動物のプロテインＳのヌクレオチド配列に高い同一性を有することが予測された。
ＣＨＯプロテインＳ ＰＣＲ断片を、マウスとラットとのプロテインＳ ｃＤＮＡ配列ないしはゲノム配列間の配列比較から設定したプライマーを用いてＣＨＯ ｃＤＮＡから生成した。ｃＤＮＡ断片を配列決定して、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子の完全長コード配列を形成するように集合体化(アセンブル)した。完全長ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡを、プライマー「ＣＨＯ ＰｒｏｔＳフォワード」と「ＣＨＯ ＰｒｏｔＳリバース」及びＣＨＯ-Ｋ１由来のｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲによりクローニングした。
予測されたＣＨＯプロテインＳアミノ酸配列は、ラットプロテインＳに９０．５％の同一性、及びマウスプロテインＳに９０．７％の同一性があった。
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)のプロテインＳ ｃＤＮＡ配列は、任意のヌクレオチド又はタンパク質データベースから公知でないが、他の齧歯動物のプロテインＳのヌクレオチド配列に高い同一性を有することが予測された。
ＣＨＯプロテインＳ ＰＣＲ断片を、マウスとラットとのプロテインＳ ｃＤＮＡ配列ないしはゲノム配列間の配列比較から設定したプライマーを用いてＣＨＯ ｃＤＮＡから生成した。ｃＤＮＡ断片を配列決定して、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子の完全長コード配列を形成するように集合体化(アセンブル)した。完全長ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡを、プライマー「ＣＨＯ ＰｒｏｔＳフォワード」と「ＣＨＯ ＰｒｏｔＳリバース」及びＣＨＯ-Ｋ１由来のｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲによりクローニングした。
予測されたＣＨＯプロテインＳアミノ酸配列は、ラットプロテインＳに９０．５％の同一性、及びマウスプロテインＳに９０．７％の同一性があった。
ＣＨＯ ＰｒｏｔＳフォワード(配列番号１)：
5'-GCCCAGGCTCGCAGCTCCTCTGG-3'
5'-GCCCAGGCTCGCAGCTCCTCTGG-3'
ＣＨＯ ＰｒｏｔＳリバース(配列番号２)：
5'-CAGGTGACACCTGCCAGCTGGTG-3'
5'-CAGGTGACACCTGCCAGCTGGTG-3'
ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡ配列(配列番号３)：
gcccaggctcgcagctcctctgggcggagcgccggctcggtccccgctgcgccagccgtgatccccggcagcctgctcagcaatgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaatgtctgttttctgtgcttataatgcccctttccttgtaattatgctcacgcccctatcaccagctggcaggtgtcacctgtgaagtgcaatgtttgaaatgatgtggtactttgtccttcagatttttgttatataaaccacgttttttttttttttttaaagtctttcttctattgctgtctagaaattaaataa
gcccaggctcgcagctcctctgggcggagcgccggctcggtccccgctgcgccagccgtgatccccggcagcctgctcagcaatgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaatgtctgttttctgtgcttataatgcccctttccttgtaattatgctcacgcccctatcaccagctggcaggtgtcacctgtgaagtgcaatgtttgaaatgatgtggtactttgtccttcagatttttgttatataaaccacgttttttttttttttttaaagtctttcttctattgctgtctagaaattaaataa
ＣＨＯプロテインＳコード配列(配列番号４)：
atgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaa
atgagggtcctgagcgcgcgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaactttttgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacggattatttttatccaaaatatttgggttgtctgggcatgttccgtgctggcctgttcagtgctgcgcggcagtctgttaatgcttaccccgacctcaggagctgtgtcaatgccatcccagaccaatgtgatcctatgccatgcaatgaagatgggtatctgagctgcaaagatggccaagctgctttcacatgcatctgcaaaccaggatggcaaggggacaaatgccagtttgatgtaaatgaatgtaaagatcccttaaatgtaaatgggggctgcagccagatttgtgacaacactcctggaagttaccactgctcctgcagaagtggctttgctatgctttcaaacaaaaaagactgcaaagatgtggatgaatgctctatgaagcccagtgtttgtggctcagctgtgtgcaagaacactccaggagactatgagtgtgaatgtcctgacggctacagatatgatccctcatcgaagtcttgcaaagatgtggacgaatgctctgagaacatgtgtgctcaattgtgtgtcaattaccctggaggctactcttgttactgtgatggaaagaaaggattcaagcttgcccaagatcagaagagttgtgagggtattccagtgtgccttcccttgaaccttgacaaaaattatgaattattgtacttggctgagcagtttgtaggagttgtcttatatctgaaatttcgtttgccagaaattaccagattttcagctgaatttgattttcggacatatgattcagagggcatcatcctgtatgcagaatctcttgatcactcaaattggctcctgattgcacttcgtgatggaaaaattgaagttcagtttaagaatgagttttcaacccaaatcacaaccggaggcaatgttattaacaatggtaaatggaacatggtatccgtggaagaattagacgacagtgttagcattaaaatagctaaagaagctgtgatgaatataaataaatttgggagcctctttaaacctacagatggatttctggacaccaaaatatactttgcaggattacctcgggtagtggaaagtgcactcattaaaccgattaaccctcgtctggatggatgtatacgaggctggaacttgatgaaacaaggagctttaggtgcaaaggaaattattcaaggaaaacaaaataagcattgcttcctcatggtggagaagggctcctactaccctggttctggaattgctcggttcagcatagattacaataatgtaaccaatgcagagggctggcaaataaatgtgaccttgaatattcgtccatccactggcactggaattatgcttgccttggtttctggagacaaagtgccctttgccttgtccttggtgggctccagctctgaaaattctcaggatattgtggtatttgttgaaaattcagtggtggctcgaatggaggccataactctgtgttctgaccagcaatcccaactgaaatgtaatgttaacagacatggcctagagctatggagcccactgaagaaagatgtcatctactctaaagatattcaaggacaactagcagtcttggacaaagcaatgaaaggaaacgtggccacttatctgggtggcattccagatctttccttcagtgccacgccagtgaatgccttctacagtggctgcatggaagtgaacatcaacggggtgcagttggatctggatgaagccatttctaaacataatgacatcagagctcactcatgtccttcagttaagaaaatccagaagaacgtctaa
ＣＨＯプロテインＳアミノ酸配列(配列番号５)：
mrvlsarcrlllvclalvlpasetnflskehasqvlvrkrrantlleetkkgnlerecieelcnkeearevfennpetdyfypkylgclgmfraglfsaarqsvnaypdlrscvnaipdqcdpmpcnedgylsckdgqaaftcickpgwqgdkcqfdvneckdplnvnggcsqicdntpgsyhcscrsgfamlsnkkdckdvdecsmkpsvcgsavckntpgdyececpdgyrydpssksckdvdecsenmcaqlcvnypggyscycdgkkgfklaqdqkscegipvclplnldknyellylaeqfvgvvlylkfrlpeitrfsaefdfrtydsegiilyaesldhsnwllialrdgkievqfknefstqittggnvinngkwnmvsveelddsvsikiakeavmninkfgslfkptdgfldtkiyfaglprvvesalikpinprldgcirgwnlmkqgalgakeiiqgkqnkhcflmvekgsyypgsgiarfsidynnvtnaegwqinvtlnirpstgtgimlalvsgdkvpfalslvgsssensqdivvfvensvvarmeaitlcsdqqsqlkcnvnrhglelwsplkkdviyskdiqgqlavldkamkgnvatylggipdlsfsatpvnafysgcmevningvqldldeaiskhndirahscpsvkkiqknv
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実施例２：小干渉ＲＮＡを用いたＣＨＯプロテインＳ ｍＲＮＡの分解。
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞のプロテインＳのｍＲＮＡは、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の細胞への導入によって分解されうる。ｓｉＲＮＡは、細胞内で分離しうる短い二本鎖ＲＮＡであり、分子のアンチセンス部分は相補的なｍＲＮＡにハイブリダイズし、ダイサーヌクレアーゼが重要な役割を果たす様式によってこのｍＲＮＡの切断を誘導しうる。ｓｉＲＮＡの作用は、Elbashir-SM等, Nature 411 (2001) 494-498において記述される。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡとして合成されてもよく、その後アニールして二本鎖ｓｉＲＮＡ分子形成しうる。その後、ｓｉＲＮＡ分子を細胞に一過性に形質移入してその機能を発揮させうる。あるいは、Brummelkamp TR; Bernards R; Agami R, Science 296 (2002) 550-553に記載のように、ｓｉＲＮＡはポリメラーゼIIIプロモータの制御下でヘアピン分子として発現されうる。
個々のプロモーターによって各々２つの相補鎖の転写を可能にするベクターは、発明者等の研究所において開発した。ランダムなＤＮＡが挿入されているのでこのベクターをＲａｎｓｉＲＮＡと称し、挿入物の両方の鎖が転写されうる。ＲａｎｓｉＲＮＡベクターは、ヒトＨ１ポリメラーゼIIIプロモーター及びマウスＵ６ポリメラーゼIIIプロモーターを含有する。２つのプロモーターは、各々の方向からｓｉＲＮＡ鋳型に対して配位し、それぞれｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写する。また、ベクターはハイグロマイシン薬剤耐性遺伝子を有している。ＲａｎｓｉＲＮＡベクターは、Kaykas & Moon (Kaykas-A & Moon-RT, BMC Cell Biology Vol. 5 (1) pp. 16 (2004)によって記述されるｐＨｉｐｐｙベクターに似ているが同一ではない。
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞のプロテインＳのｍＲＮＡは、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の細胞への導入によって分解されうる。ｓｉＲＮＡは、細胞内で分離しうる短い二本鎖ＲＮＡであり、分子のアンチセンス部分は相補的なｍＲＮＡにハイブリダイズし、ダイサーヌクレアーゼが重要な役割を果たす様式によってこのｍＲＮＡの切断を誘導しうる。ｓｉＲＮＡの作用は、Elbashir-SM等, Nature 411 (2001) 494-498において記述される。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡとして合成されてもよく、その後アニールして二本鎖ｓｉＲＮＡ分子形成しうる。その後、ｓｉＲＮＡ分子を細胞に一過性に形質移入してその機能を発揮させうる。あるいは、Brummelkamp TR; Bernards R; Agami R, Science 296 (2002) 550-553に記載のように、ｓｉＲＮＡはポリメラーゼIIIプロモータの制御下でヘアピン分子として発現されうる。
個々のプロモーターによって各々２つの相補鎖の転写を可能にするベクターは、発明者等の研究所において開発した。ランダムなＤＮＡが挿入されているのでこのベクターをＲａｎｓｉＲＮＡと称し、挿入物の両方の鎖が転写されうる。ＲａｎｓｉＲＮＡベクターは、ヒトＨ１ポリメラーゼIIIプロモーター及びマウスＵ６ポリメラーゼIIIプロモーターを含有する。２つのプロモーターは、各々の方向からｓｉＲＮＡ鋳型に対して配位し、それぞれｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写する。また、ベクターはハイグロマイシン薬剤耐性遺伝子を有している。ＲａｎｓｉＲＮＡベクターは、Kaykas & Moon (Kaykas-A & Moon-RT, BMC Cell Biology Vol. 5 (1) pp. 16 (2004)によって記述されるｐＨｉｐｐｙベクターに似ているが同一ではない。
いくつかの標的ｓｉＲＮＡ配列をＣＨＯプロテインＳコード配列から選択し、配列AGN17CT(配列番号６)を含有する標的のみを選択した。各々の標的配列は、リバース方向及びフォワード方向で転写される場合に終結シグナルとして働く、A's 5'から標的に及びT's 3'から標的に伸展する２つの相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドとして購入した。また、オリゴヌクレオチドはＢｇｌII制限酵素部位(GATC)適合性のある４つの塩基対５'-オーバーハングを有する。アニールしたオリゴヌクレオチドはＲａｎｓｉＲＮＡ-ｈｙｇｒｏベクターのＢｇｌII部位にクローニングした。
特定のｓｉＲＮＡコンストラクトを、ヒトＦVII類似体を発現しているＣＨＯ Ｋ１細胞株に、安定して形質移入した。細胞を、２×１０５細胞／ウェルの濃度で完全培地(１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸及びビタミンＫを含有するＤＭＥＭ培地)を含む６ウェルプレートに播いた。２日後に、細胞を９０％の集密度に移した。製造業者の指示に従ってリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いた形質移入を行った。４８時間後に、細胞を選択培地へ移した。この選択培地は３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンが付加的に添加されている完全培地からなる。１４日間の選別の後、限界希釈によって細胞をクローン化した。クローンが育った後、以下のＥＬＩＳＡにおいてウシプロテインＳの検出を避けるために、ＦＢＳ含有完全培地を無血清培地(ビタミンＫを添加したＰＦ ＣＨＯ、Hyclone)に変えた。各々のｓｉＲＮＡコンストラクトについておよそ１００のクローンからの上清を、ヒトプロテインＳを標準物質として用いたプロテインＳ ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。また、同じ上清を、ヒトＦVII ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。プロテインＳを最も少なく発現し、ＦVIIの発現を失っていないクローンをさらに特徴付けた。親のＣＨＯ Ｋ１ ＦVII発現細胞株によって示される発現レベルのたった１０％のレベルにプロテインＳの発現を下方制御したクローンを単離した。
特定のｓｉＲＮＡコンストラクトを、ヒトＦVII類似体を発現しているＣＨＯ Ｋ１細胞株に、安定して形質移入した。細胞を、２×１０５細胞／ウェルの濃度で完全培地(１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸及びビタミンＫを含有するＤＭＥＭ培地)を含む６ウェルプレートに播いた。２日後に、細胞を９０％の集密度に移した。製造業者の指示に従ってリポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いた形質移入を行った。４８時間後に、細胞を選択培地へ移した。この選択培地は３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンが付加的に添加されている完全培地からなる。１４日間の選別の後、限界希釈によって細胞をクローン化した。クローンが育った後、以下のＥＬＩＳＡにおいてウシプロテインＳの検出を避けるために、ＦＢＳ含有完全培地を無血清培地(ビタミンＫを添加したＰＦ ＣＨＯ、Hyclone)に変えた。各々のｓｉＲＮＡコンストラクトについておよそ１００のクローンからの上清を、ヒトプロテインＳを標準物質として用いたプロテインＳ ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。また、同じ上清を、ヒトＦVII ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。プロテインＳを最も少なく発現し、ＦVIIの発現を失っていないクローンをさらに特徴付けた。親のＣＨＯ Ｋ１ ＦVII発現細胞株によって示される発現レベルのたった１０％のレベルにプロテインＳの発現を下方制御したクローンを単離した。
ｓｉＲＮＡ標的配列
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１標的(配列番号７)：
5'-agtgtgaatgtcctgacggct-3'
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１上方オリゴ(配列番号８)：
5'-gatctaaaaaagtgtgaatgtcctgacggctttttta-3'
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１下方オリゴ(配列番号９)：
5'-gatctaaaaaagccgtcaggacattcacactttttta-3'
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１標的(配列番号７)：
5'-agtgtgaatgtcctgacggct-3'
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１上方オリゴ(配列番号８)：
5'-gatctaaaaaagtgtgaatgtcctgacggctttttta-3'
＃８２１ ｓｉＲＮＡ１下方オリゴ(配列番号９)：
5'-gatctaaaaaagccgtcaggacattcacactttttta-3'
＃８２２ ｓｉＲＮＡ２標的(配列番号１０)：
5'-agctgcaaagatggccaagct-3'
＃８２２ ｓｉＲＮＡ２上方オリゴ(配列番号１１)：
5'-gatctaaaaaagctgcaaagatggccaagctttttta-3'
＃８２２ ｓｉＲＮＡ２下方オリゴ(配列番号１２)：
5'-gatctaaaaaagcttggccatctttgcagctttttta-3'
5'-agctgcaaagatggccaagct-3'
＃８２２ ｓｉＲＮＡ２上方オリゴ(配列番号１１)：
5'-gatctaaaaaagctgcaaagatggccaagctttttta-3'
＃８２２ ｓｉＲＮＡ２下方オリゴ(配列番号１２)：
5'-gatctaaaaaagcttggccatctttgcagctttttta-3'
＃８３５ ｓｉＲＮＡ４標的(配列番号１３)：
5'-agaacatgcctcgcaagtcct-3'
＃８３５ ｓｉＲＮＡ４上方オリゴ(配列番号１４)：
5'-gatctaaaaaagaacatgcctcgcaagtcctttttta-3'
＃８３５ ｓｉＲＮＡ４下方オリゴ(配列番号１５)：
5'-gatctaaaaaaggacttgcgaggcatgttctttttta-3'
5'-agaacatgcctcgcaagtcct-3'
＃８３５ ｓｉＲＮＡ４上方オリゴ(配列番号１４)：
5'-gatctaaaaaagaacatgcctcgcaagtcctttttta-3'
＃８３５ ｓｉＲＮＡ４下方オリゴ(配列番号１５)：
5'-gatctaaaaaaggacttgcgaggcatgttctttttta-3'
＃８３６ ｓｉＲＮＡ５標的(配列番号１６)：
5'-agaaactaaaaagggcaatct-3'
＃８３６ ｓｉＲＮＡ５上方オリゴ(配列番号１７)：
5'-gatctaaaaaagaaactaaaaagggcaatctttttta-3'
＃８３６ ｓｉＲＮＡ５下方オリゴ(配列番号１８)：
5'-gatctaaaaaagattgccctttttagtttctttttta-3'
5'-agaaactaaaaagggcaatct-3'
＃８３６ ｓｉＲＮＡ５上方オリゴ(配列番号１７)：
5'-gatctaaaaaagaaactaaaaagggcaatctttttta-3'
＃８３６ ｓｉＲＮＡ５下方オリゴ(配列番号１８)：
5'-gatctaaaaaagattgccctttttagtttctttttta-3'
＃８３７ ｓｉＲＮＡ６標的(配列番号１９)：
5'-agccagatttgtgacaacact-3'
＃８３７ ｓｉＲＮＡ６上方オリゴ(配列番号２０)：
5'-gatctaaaaaagccagatttgtgacaacactttttta-3'
＃８３７ ｓｉＲＮＡ６下方オリゴ(配列番号２１)：
5'-gatctaaaaaagtgttgtcacaaatctggctttttta-3'
5'-agccagatttgtgacaacact-3'
＃８３７ ｓｉＲＮＡ６上方オリゴ(配列番号２０)：
5'-gatctaaaaaagccagatttgtgacaacactttttta-3'
＃８３７ ｓｉＲＮＡ６下方オリゴ(配列番号２１)：
5'-gatctaaaaaagtgttgtcacaaatctggctttttta-3'
実施例３：ＣＨＯプロテインＳの遺伝子ターゲティング
プロテインＳのタンパク質発現を無効にする確実な方法は、遺伝子を破壊することである。マウスの「遺伝子ターゲティング」又は「遺伝子ノックアウト」の技術は長年知られている。また、培養細胞の遺伝子ターゲティングは十分に確立されており、ＣＨＯノックアウト細胞の例は近年Yamane-Ohnukiet等 Biotechnology and Bioengineering, 87(5): 614-622, 2004に記述された。
発明者等は、ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡのヒト遺伝子に対するアライメントによって、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子のエクソン構造を予測した。ＣＨＯプロテインＳのエクソン１及びエクソン２において結合するように設定されたプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に用い、ＣＨＯゲノムＤＮＡを鋳型とした。増幅された４．４ｋｂ生成物を配列決定した。エクソン２及びエクソン３を結合するプライマーを用いてイントロン２のＰＣＲ増幅を行った。イントロン２を有する３．５ｋｂの増幅された断片をクローニングして配列決定した。
プロテインＳのタンパク質発現を無効にする確実な方法は、遺伝子を破壊することである。マウスの「遺伝子ターゲティング」又は「遺伝子ノックアウト」の技術は長年知られている。また、培養細胞の遺伝子ターゲティングは十分に確立されており、ＣＨＯノックアウト細胞の例は近年Yamane-Ohnukiet等 Biotechnology and Bioengineering, 87(5): 614-622, 2004に記述された。
発明者等は、ＣＨＯプロテインＳ ｃＤＮＡのヒト遺伝子に対するアライメントによって、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子のエクソン構造を予測した。ＣＨＯプロテインＳのエクソン１及びエクソン２において結合するように設定されたプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に用い、ＣＨＯゲノムＤＮＡを鋳型とした。増幅された４．４ｋｂ生成物を配列決定した。エクソン２及びエクソン３を結合するプライマーを用いてイントロン２のＰＣＲ増幅を行った。イントロン２を有する３．５ｋｂの増幅された断片をクローニングして配列決定した。
マウス及びラットのプロテインＳのエクソン１の上流領域を配列比較し、高い同一性を有する配列範囲を用いてＰＣＲでの使用のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設定した。１６５０ｂｐの５'ＵＴ／プロモーターバンドをクローニングして配列決定した。
遺伝子ターゲティングコンストラクトは、「１．６ｋｂの５'ＵＴ／プロモーター断片」、「Ｐｌｏｘ-ＰＧＫ-ハイグロマイシン耐性遺伝子-Ｐｌｏｘ」、「イントロン１」、「エクソン２」及び「ＰＧＫ-ＴＫ」を結合するであろう。このコンストラクトは、アミノ酸MRVLSVRCRLLLVCLALVLPASETN(配列番号２２)をコードする、ＣＨＯプロテインＳのエクソン１コード配列を欠失している。ブラストサイジン薬剤耐性遺伝子を含有する第二のコンストラクトを同様な方法で作製することができる。
遺伝子ターゲティングコンストラクトは、「１．６ｋｂの５'ＵＴ／プロモーター断片」、「Ｐｌｏｘ-ＰＧＫ-ハイグロマイシン耐性遺伝子-Ｐｌｏｘ」、「イントロン１」、「エクソン２」及び「ＰＧＫ-ＴＫ」を結合するであろう。このコンストラクトは、アミノ酸MRVLSVRCRLLLVCLALVLPASETN(配列番号２２)をコードする、ＣＨＯプロテインＳのエクソン１コード配列を欠失している。ブラストサイジン薬剤耐性遺伝子を含有する第二のコンストラクトを同様な方法で作製することができる。
「ハイグロマイシン」-遺伝子ターゲティングコンストラクトはＣＨＯ細胞に電気穿孔して、細胞を培養皿に播くことができる。次の日、細胞を、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンと１マイクロモルのガンシクロビルに曝す。直ちに、クローンを、ハイグロマイシン耐性遺伝子に関して、そして単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に対して選択する。コロニーが出現した後、９６ウェルのプレートへ移す。細胞を集密になるまで生育させ、プレートの複製を作製する。ゲノムＤＮＡを細胞クローンから回収し、コンストラクトに存在するプロモーターへのプライマー３'とハイグロマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。ポジティブＰＣＲ-バンドを有するクローンをフラスコ中で生育させ、サザンブロットを行ってＰＣＲ結果を確認する。
第二に、ブラストサイジン耐性遺伝子を有するターゲティングコンストラクトを、半接合ＣＨＯ細胞に電気穿孔して、その後細胞を、１０μｇ／ｍｌブラストサイジンと１マイクロモルのガンシクロビルを用いて、ブラストサイジン耐性遺伝子に関して、そしてチミジンキナーゼ遺伝子に対して選択する。再び、細胞クローンを、コンストラクトに存在するプロモーターへのプライマー３'とブラストサイジン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ確認を行った。さらにポジティブクローンをサザンブロットによって試験する。
ホモ接合の破壊株は、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドを形質移入されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘ部位を再結合して、薬剤耐性遺伝子を取り除く。
第二に、ブラストサイジン耐性遺伝子を有するターゲティングコンストラクトを、半接合ＣＨＯ細胞に電気穿孔して、その後細胞を、１０μｇ／ｍｌブラストサイジンと１マイクロモルのガンシクロビルを用いて、ブラストサイジン耐性遺伝子に関して、そしてチミジンキナーゼ遺伝子に対して選択する。再び、細胞クローンを、コンストラクトに存在するプロモーターへのプライマー３'とブラストサイジン耐性遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ確認を行った。さらにポジティブクローンをサザンブロットによって試験する。
ホモ接合の破壊株は、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現プラスミドを形質移入されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘ部位を再結合して、薬剤耐性遺伝子を取り除く。
イントロン１プライマー：
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン１-ｆｏｒｗ２(配列番号２３)：
5'-CTGCTGGTATGCCTAGCCCTGGTG-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン２-ｒｅｖ２(配列番号２４)：
5'-TGCAGAGCTCTTCGATGCATTCTC-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン１-ｆｏｒｗ２(配列番号２３)：
5'-CTGCTGGTATGCCTAGCCCTGGTG-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン２-ｒｅｖ２(配列番号２４)：
5'-TGCAGAGCTCTTCGATGCATTCTC-3'
イントロン２プライマー：
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン２-ｆｏｒｗ２(配列番号２５)：
5'-AAGGGCAATCTTGAAAGAGAATGC-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン３ｒｅｖ(配列番号２６)：
5'-CCAAATATTTTGGATAAAAATAATC-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン２-ｆｏｒｗ２(配列番号２５)：
5'-AAGGGCAATCTTGAAAGAGAATGC-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ-エクソン３ｒｅｖ(配列番号２６)：
5'-CCAAATATTTTGGATAAAAATAATC-3'
５'ＵＴ／プロモータープライマー：
ＰＳ-ＣＨＯプロモーターｆ２(配列番号２７)：
5'-AARCAACCCCTTTTGACCAT-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ.プロモーターＲｅｖ１(配列番号２８)：
5'-CCCAGAGGAGCTGCGAGCCTG-3'
ＰＳ-ＣＨＯプロモーターｆ２(配列番号２７)：
5'-AARCAACCCCTTTTGACCAT-3'
ＣＨＯ-プロテインＳ.プロモーターＲｅｖ１(配列番号２８)：
5'-CCCAGAGGAGCTGCGAGCCTG-3'
５'ＵＴ／プロモーター(コード配列のすぐ５'側)(配列番号２９)：
aarcaaccccttttgaccatacacatttctactctttgtgtttgctggagctgttttctccccacactcaaccccctttgctgaagcctggaacttgctttccacagcttaagttgttataggtttcaatcatctgtccacctccctgactttcataattttgtgaaatacccttgcatatatatatgggactaaatattattttctcctggttgtccataatagattaatttaattcctaaacaaagaacagaacatagattggtatagtagaagagtttcccttctccctactgcatgaatggaaattccccaaaccatccttatcagagaaattaactcacatactagtcacctttcattcagctggatgacaaaatcattttaaaaaaagagaataaagaaaacagataagaacaactagatctaggaataatacttaaaatatgattctgcttagtaggtttcattcacacacctagaaaaaaaaatcagtcaatgtttcctttgggcagaaaatgagcaataatgggtatgcattgaccactactgttggacatagccttattgcttcatatagcatctattcaaagtctcagatcaacactatgaaaacctgtcatctctgtattagatgatgtgactggggctgtaaagggtaagctcttttcttacagctatacaacaacgctaagaccaagttctgtgctttgagcccaggcagtttagtttcccaggagcaacctaaagcctgattcacaggcatatgtatgatccaaactgaatggtagtacatcaataccaaaacaatctattggtggaaacacaccataggtgatcgaaatactccattttcttttcctctcatgacttctgttctgagcagtcctcttcctaaagtctacattgtcttctgagttcaggctgacatcttgacatcctcctggctggcacagtctctggacaaggagggaagaaggagagaaggggaaagggagaggagggggggagggagagaaagaatgggaagaggaaggatatgaaagagagaagagaggagggaaggcgggaggaagggagggagggagggagggagagagggagagagaggagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagggagagggagagagagacagagagagagagagggagagggagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagtgaggagagagagagagagttttcttcaccattggacattcctaaagaaaagaagtaaatgcaggattggggacagtgacagaggacctctgataaactttctgaggcctctgacctcactctctcggagccctcctccaccacccaccccccccctccctagctgagaaaagcttccaggaaatgtcccagtcatcgcttcccctcccgggctgggggctgggagcgggcggtcccctcaggccagggctgctccggccgcgctcgggcagggccacaacagagctgggaaagctgagcccaggctcgcagctcctctgggcggagcgccggctcggtccccgctgcgccagccgtgatccccggcagcctgctcagca
aarcaaccccttttgaccatacacatttctactctttgtgtttgctggagctgttttctccccacactcaaccccctttgctgaagcctggaacttgctttccacagcttaagttgttataggtttcaatcatctgtccacctccctgactttcataattttgtgaaatacccttgcatatatatatgggactaaatattattttctcctggttgtccataatagattaatttaattcctaaacaaagaacagaacatagattggtatagtagaagagtttcccttctccctactgcatgaatggaaattccccaaaccatccttatcagagaaattaactcacatactagtcacctttcattcagctggatgacaaaatcattttaaaaaaagagaataaagaaaacagataagaacaactagatctaggaataatacttaaaatatgattctgcttagtaggtttcattcacacacctagaaaaaaaaatcagtcaatgtttcctttgggcagaaaatgagcaataatgggtatgcattgaccactactgttggacatagccttattgcttcatatagcatctattcaaagtctcagatcaacactatgaaaacctgtcatctctgtattagatgatgtgactggggctgtaaagggtaagctcttttcttacagctatacaacaacgctaagaccaagttctgtgctttgagcccaggcagtttagtttcccaggagcaacctaaagcctgattcacaggcatatgtatgatccaaactgaatggtagtacatcaataccaaaacaatctattggtggaaacacaccataggtgatcgaaatactccattttcttttcctctcatgacttctgttctgagcagtcctcttcctaaagtctacattgtcttctgagttcaggctgacatcttgacatcctcctggctggcacagtctctggacaaggagggaagaaggagagaaggggaaagggagaggagggggggagggagagaaagaatgggaagaggaaggatatgaaagagagaagagaggagggaaggcgggaggaagggagggagggagggagggagagagggagagagaggagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagggagagggagagagagacagagagagagagagggagagggagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagtgaggagagagagagagagttttcttcaccattggacattcctaaagaaaagaagtaaatgcaggattggggacagtgacagaggacctctgataaactttctgaggcctctgacctcactctctcggagccctcctccaccacccaccccccccctccctagctgagaaaagcttccaggaaatgtcccagtcatcgcttcccctcccgggctgggggctgggagcgggcggtcccctcaggccagggctgctccggccgcgctcgggcagggccacaacagagctgggaaagctgagcccaggctcgcagctcctctgggcggagcgccggctcggtccccgctgcgccagccgtgatccccggcagcctgctcagca
エクソン１(配列番号３０)：
atgagggtcctgagcgtacgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaac
atgagggtcctgagcgtacgctgtcggctactgctggtatgcctagccctggtgctgccagcctcggagacaaac
イントロン１(配列番号３１)：
tgtaagtaatccatacctcctggcttctccattccctatgtgccccggcttgaagattttccactaggctgtttgctgcctcctaagtttccagtaagtccgccaccattcagagagtcgcggcagcctgggtctggtgggcagtgtaaaggtgggacaggatcaaagcttgccttgctttgagaaccattgtccacaggacttgattccagaacccgggtgacactaagtgtcaaaggaattgcttgaacatagtcctaaatattgctaggaaagctaagtcaagcctgttgccctcctcccgtttacaagagtgccccagcccgcaccctctcctgcggctaaccttccttttgcaatttctggactttgaacttgattgactggtctcacattgacaaactgtttggggactgctggggtgttacatatgattctctaaccttgatataagaaatagctgttggatgttaccttgtaccgaggatcattttctgagggttttgactgttgccgctttgagatggcagcaagaattctgtacaacacacacatttttgtgtttcttggtctttcctcttcccattctcagattccgggcagtatatcgagttttctcttagaaatataaaacgaaccacaaggttttagtacattttaatggtcaattaaattgtttttagaagcttaaatatgttcataattaacactgctttcttttgctcttttgtagtcccagtcactggcatgggagcaataactgtataacaaataccacttaggtcactgcgagcaccaaagaaacttttcaaagatggtaattaagtaggagtttgctggaattgcaagtttttattaattagtaaggaatctagcctgatatttttaaatgtctaactaagttaaagaccagaatgaaactggttcactttttattgaggataaacaagttacagttataaagcctcaacaatcaaagccctacgatgaagcagcgtgtgactgtatgcacatgatctatcttgttcagaggaacaatcaaacattttcagatagcatcagggcggtggtggtactcgcctataatcctagcaaagtcagaggcaagcagatctctgtgttcaaggccagcctagtctacagagtgagttccaggacaactggggctacacagagaaacctgtctcagagaaaaacaaaataaaaccaaattcagatagctggtgtttgggaaaagagcaaaagacagcagtgctggccacacagagagtagacaagttcattctacaaggacatcacagaaagaatatgtgacccaatgacgaccataaactttcttgttcctgtgtcaaattatctccggtttattgatgaagaaccagacactatgagctgcgtctcctccttaagattttgttttggtgtcttgtttttgtcaaggggtttcattgtggccctgagcattagatccagggctttgtgcatgctaggccagggagctatattcccgaactccagaagactaggaatttgagatataaatagaatttgaattaccttctgtacaattgattgtatggttctagaaatattgctatattaagggaagcctttgcagaagacagttattttgagatggtgcataacacaaaagaaatgaactaaagcctgaggcctgctctgtagctctgccttgcccttagcctacaataactttctttacctttcaagcatgtgccaccacgcctgactttcaggcccttcattttaacaagaaagcaagtattcagttatcaactgactttccaaatgcatttgtatgaataaaaactacaaaaatataaaaataagaactatacacacaaaagccttgtatttaaaatttacgctgtggacatattttgctcatcattcgtgagagcttgcggtaaaaaggcaaaggggaagaggaggatatctattttgggtaggctaatttggccttatccagacttcccttttgggtggatgcagtctgcccagcacactattggcccatttcttctacatggctttgtgctctgctctgcccttagctaattgtcccctttgacatgcttttgtctttccttaaagtttctatacttcaaaaaccatcccgctacactaatggagtgattttctcaagggttgctttatgtttggggtttgtactgcaagagttagtttctgatatagcaatggtgatagtatagtcttctaccatgaactctatgccagcaagtacaggggtatatttcacatgggtgttttctgttcactgagtttcatgtcttctttgtatctttttgttttgttttgtgagacagggtttctctgtagcttttgagtcagtcctggaacttgctggccggccttgaactcacagagattcacctgcctctgcctcccaagtgctgggatttaaggtgtgagtcaccactgccaggttttttctttgtatcttgagtgaactaaataggtaagctttaaataataatatgagcagtctatttatatacattaaatattaaatgcattgtgagatgagcatagcctttgaggcccaggaacagaaagatttacttcacattgtaaatatactggtatacatacaaacgtacatacnnnnnngtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcatgccatagcacacatgtgaagtccagagtacagcattctctttttctacctttctgtagattcttgtggtcagagtcaggtcaaatcaaatcagacagatgcatgtataaaatgctcttacccactgaaccatcttgctgcttggtccacaagcttagtggaagaatgctgggaagtgaatagtatgtttttaaatgtagttaaccttgactttttgttgttgttgctgttattgaggccacattttcattgttctgagaaaatattactattttcctcagacagaattatatatttatttgaagttcatgaattccatattattttcctgtatttattacaaatagcatgcttaaacacttccaagtagtgaaacagctgctcatgtaggacacggattattgacagtgctgccatttatcagccagtaatccacttggcaggtagcacgctcatcgttatcctttatgcacacaaagccttgtttgaattttatcttttaatgagtgtcaatgaaatggaaagagataagagttaaaaatacaacccaaactattgtatttacatttctcttttagaagaaacctaaagcagcattacttcttgcccatatttaataaataacatcatttacccttgttccctgcctccagactctcccatatactcctctttcaattttattggcccctttaaatgacatatcattacatgtatatccctacacataagtataaccagttcagtttgtataatgttacttgcatgtgtgttttcaatgctgatcatttggtagtggataaccaatggtgtgccctatgaaggggcagagtatttgtatcatgcttagcattcctttgttgactgtaggattttgtttaaggttgaggtctcttggtctttcccctgtctgcttctgcatgtccatggccatccttgttcagctcatgtttatgtagtcatgctgatgaggctttatggatgtagcttctgacattgctaagcaacacagtctcagcaaactccccagtcctctggttcttacaatctttccacactgtttcaccatgttgtctgagccttaggtgctgaagttgttttgtgtctgtatccattgggactaggctccacatgtctgcattttgattacttgtggttttctgtaacggtctctatgtgttgcaacgagaaggagtagttgctttgacgatgtgtaaagactatcttgtgggtataaggacaaatatttgcatgaagctatggattatgctggtctcaagcatgaactggataaattgtacagctcacacaaaacagctatagctagctgcacagtcaggcatgcactgatctgcttggggagttgttaaccaaagggcttacatagctatgtattttctaagctctagttttactatcacaaagaaaattaattcacccttaattgtttaataagatgatatatcttagggaaaaaatgaaggtctttttttgacttatataaaagcttatgttttctacagttt
tgtaagtaatccatacctcctggcttctccattccctatgtgccccggcttgaagattttccactaggctgtttgctgcctcctaagtttccagtaagtccgccaccattcagagagtcgcggcagcctgggtctggtgggcagtgtaaaggtgggacaggatcaaagcttgccttgctttgagaaccattgtccacaggacttgattccagaacccgggtgacactaagtgtcaaaggaattgcttgaacatagtcctaaatattgctaggaaagctaagtcaagcctgttgccctcctcccgtttacaagagtgccccagcccgcaccctctcctgcggctaaccttccttttgcaatttctggactttgaacttgattgactggtctcacattgacaaactgtttggggactgctggggtgttacatatgattctctaaccttgatataagaaatagctgttggatgttaccttgtaccgaggatcattttctgagggttttgactgttgccgctttgagatggcagcaagaattctgtacaacacacacatttttgtgtttcttggtctttcctcttcccattctcagattccgggcagtatatcgagttttctcttagaaatataaaacgaaccacaaggttttagtacattttaatggtcaattaaattgtttttagaagcttaaatatgttcataattaacactgctttcttttgctcttttgtagtcccagtcactggcatgggagcaataactgtataacaaataccacttaggtcactgcgagcaccaaagaaacttttcaaagatggtaattaagtaggagtttgctggaattgcaagtttttattaattagtaaggaatctagcctgatatttttaaatgtctaactaagttaaagaccagaatgaaactggttcactttttattgaggataaacaagttacagttataaagcctcaacaatcaaagccctacgatgaagcagcgtgtgactgtatgcacatgatctatcttgttcagaggaacaatcaaacattttcagatagcatcagggcggtggtggtactcgcctataatcctagcaaagtcagaggcaagcagatctctgtgttcaaggccagcctagtctacagagtgagttccaggacaactggggctacacagagaaacctgtctcagagaaaaacaaaataaaaccaaattcagatagctggtgtttgggaaaagagcaaaagacagcagtgctggccacacagagagtagacaagttcattctacaaggacatcacagaaagaatatgtgacccaatgacgaccataaactttcttgttcctgtgtcaaattatctccggtttattgatgaagaaccagacactatgagctgcgtctcctccttaagattttgttttggtgtcttgtttttgtcaaggggtttcattgtggccctgagcattagatccagggctttgtgcatgctaggccagggagctatattcccgaactccagaagactaggaatttgagatataaatagaatttgaattaccttctgtacaattgattgtatggttctagaaatattgctatattaagggaagcctttgcagaagacagttattttgagatggtgcataacacaaaagaaatgaactaaagcctgaggcctgctctgtagctctgccttgcccttagcctacaataactttctttacctttcaagcatgtgccaccacgcctgactttcaggcccttcattttaacaagaaagcaagtattcagttatcaactgactttccaaatgcatttgtatgaataaaaactacaaaaatataaaaataagaactatacacacaaaagccttgtatttaaaatttacgctgtggacatattttgctcatcattcgtgagagcttgcggtaaaaaggcaaaggggaagaggaggatatctattttgggtaggctaatttggccttatccagacttcccttttgggtggatgcagtctgcccagcacactattggcccatttcttctacatggctttgtgctctgctctgcccttagctaattgtcccctttgacatgcttttgtctttccttaaagtttctatacttcaaaaaccatcccgctacactaatggagtgattttctcaagggttgctttatgtttggggtttgtactgcaagagttagtttctgatatagcaatggtgatagtatagtcttctaccatgaactctatgccagcaagtacaggggtatatttcacatgggtgttttctgttcactgagtttcatgtcttctttgtatctttttgttttgttttgtgagacagggtttctctgtagcttttgagtcagtcctggaacttgctggccggccttgaactcacagagattcacctgcctctgcctcccaagtgctgggatttaaggtgtgagtcaccactgccaggttttttctttgtatcttgagtgaactaaataggtaagctttaaataataatatgagcagtctatttatatacattaaatattaaatgcattgtgagatgagcatagcctttgaggcccaggaacagaaagatttacttcacattgtaaatatactggtatacatacaaacgtacatacnnnnnngtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcatgccatagcacacatgtgaagtccagagtacagcattctctttttctacctttctgtagattcttgtggtcagagtcaggtcaaatcaaatcagacagatgcatgtataaaatgctcttacccactgaaccatcttgctgcttggtccacaagcttagtggaagaatgctgggaagtgaatagtatgtttttaaatgtagttaaccttgactttttgttgttgttgctgttattgaggccacattttcattgttctgagaaaatattactattttcctcagacagaattatatatttatttgaagttcatgaattccatattattttcctgtatttattacaaatagcatgcttaaacacttccaagtagtgaaacagctgctcatgtaggacacggattattgacagtgctgccatttatcagccagtaatccacttggcaggtagcacgctcatcgttatcctttatgcacacaaagccttgtttgaattttatcttttaatgagtgtcaatgaaatggaaagagataagagttaaaaatacaacccaaactattgtatttacatttctcttttagaagaaacctaaagcagcattacttcttgcccatatttaataaataacatcatttacccttgttccctgcctccagactctcccatatactcctctttcaattttattggcccctttaaatgacatatcattacatgtatatccctacacataagtataaccagttcagtttgtataatgttacttgcatgtgtgttttcaatgctgatcatttggtagtggataaccaatggtgtgccctatgaaggggcagagtatttgtatcatgcttagcattcctttgttgactgtaggattttgtttaaggttgaggtctcttggtctttcccctgtctgcttctgcatgtccatggccatccttgttcagctcatgtttatgtagtcatgctgatgaggctttatggatgtagcttctgacattgctaagcaacacagtctcagcaaactccccagtcctctggttcttacaatctttccacactgtttcaccatgttgtctgagccttaggtgctgaagttgttttgtgtctgtatccattgggactaggctccacatgtctgcattttgattacttgtggttttctgtaacggtctctatgtgttgcaacgagaaggagtagttgctttgacgatgtgtaaagactatcttgtgggtataaggacaaatatttgcatgaagctatggattatgctggtctcaagcatgaactggataaattgtacagctcacacaaaacagctatagctagctgcacagtcaggcatgcactgatctgcttggggagttgttaaccaaagggcttacatagctatgtattttctaagctctagttttactatcacaaagaaaattaattcacccttaattgtttaataagatgatatatcttagggaaaaaatgaaggtctttttttgacttatataaaagcttatgttttctacagttt
エクソン２(配列番号３２)：
tgtcaaaagaacatgcctcgcaagtcctggtgaggaagcgccgcgcaaataccttgcttgaagaaactaaaaagggcaatcttgaaagagaatgcatcgaagagctctgcaataaagaggaagccagggaggtctttgaaaacaatcccgaaacg
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イントロン２(配列番号３３)：
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エクソン３(配列番号３４)：
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gattatttttatccaaaatatttgg
実施例４：転写因子の操作。
プロテインＳの発現は、プロテインＳ ｍＲＮＡの転写の下方制御によって低減されるか無効にされうる。転写因子は、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡエレメントを結合するように設定されうる。Ｚｉｎｃフィンガータンパク質はこのような操作に適しており、一般的な手順はWolfe-SA等 Annu. Rev. Biophys. Struct. vol 3:183-212, 1999及びJamieson-AC等 Nature Reviews, vol 2:361-368, 2003に総説される。一般的に、単一のＺｉｎｃフィンガーは、同じＤＮＡ鎖の各々に隣接する３つの塩基と、相補鎖上の前方の塩基を結合する。したがって、いくつかのＺｉｎｃフィンガーが組み合わさって、所望のＤＮＡエレメントを結合しうる。実際にゲノム中で普遍的でありうる１５〜１８塩基対のＤＮＡエレメントの認識には、５〜６のＺｉｎｃフィンガーの組合せが必要である。
ＣＨＯプロテインＳプロモーターの配列GGAGAGGAGGGGGGG(配列番号３５)を有するＤＮＡエレメントを選択して、ＤＮＡエレメントを結合するＺｉｎｃフィンガータンパク質を、Liu-PQ等, Journal of Biological Chemistry, Vol. 276 (14), pp. 11323-11334, 2001及びZhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000による刊行物に基づいて予測した。Zhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000の記載のように、ＳＰ１及びＢＴＥＢ４に基づく合成した５つのＺｉｎｃフィンガータンパク質を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドからのＰＣＲによって作製する。Ｚｉｎｃフィンガー５ CXXCXXXXXQSGHLQRHXXXH(配列番号３６)はＧＧＡｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー４ CXXXXCXXXXXRSDNLARHXXXH(配列番号３７)はＧＡＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー３ CXXCXXXXXRSDNLTRHXXXH(配列番号３８)はＧＡＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー２ CXXXXCXXXXXRSDHLTRHXXXH(配列番号３９)はＧＧＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー１ CXXXXCXXXXXRSDHLARHXXXH(配列番号４０)はＧＧＧａと相互作用する；そして、ＺｉｎｃフィンガーのＮ末端であるＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインが挿入される。
プロテインＳの発現は、プロテインＳ ｍＲＮＡの転写の下方制御によって低減されるか無効にされうる。転写因子は、ＣＨＯプロテインＳ遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡエレメントを結合するように設定されうる。Ｚｉｎｃフィンガータンパク質はこのような操作に適しており、一般的な手順はWolfe-SA等 Annu. Rev. Biophys. Struct. vol 3:183-212, 1999及びJamieson-AC等 Nature Reviews, vol 2:361-368, 2003に総説される。一般的に、単一のＺｉｎｃフィンガーは、同じＤＮＡ鎖の各々に隣接する３つの塩基と、相補鎖上の前方の塩基を結合する。したがって、いくつかのＺｉｎｃフィンガーが組み合わさって、所望のＤＮＡエレメントを結合しうる。実際にゲノム中で普遍的でありうる１５〜１８塩基対のＤＮＡエレメントの認識には、５〜６のＺｉｎｃフィンガーの組合せが必要である。
ＣＨＯプロテインＳプロモーターの配列GGAGAGGAGGGGGGG(配列番号３５)を有するＤＮＡエレメントを選択して、ＤＮＡエレメントを結合するＺｉｎｃフィンガータンパク質を、Liu-PQ等, Journal of Biological Chemistry, Vol. 276 (14), pp. 11323-11334, 2001及びZhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000による刊行物に基づいて予測した。Zhang-L等 Journal of Biological Chemistry, Vol. 275 (43), pp. 33850-33860, 2000の記載のように、ＳＰ１及びＢＴＥＢ４に基づく合成した５つのＺｉｎｃフィンガータンパク質を、オーバーラップするオリゴヌクレオチドからのＰＣＲによって作製する。Ｚｉｎｃフィンガー５ CXXCXXXXXQSGHLQRHXXXH(配列番号３６)はＧＧＡｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー４ CXXXXCXXXXXRSDNLARHXXXH(配列番号３７)はＧＡＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー３ CXXCXXXXXRSDNLTRHXXXH(配列番号３８)はＧＡＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー２ CXXXXCXXXXXRSDHLTRHXXXH(配列番号３９)はＧＧＧｇと相互作用する；Ｚｉｎｃフィンガー１ CXXXXCXXXXXRSDHLARHXXXH(配列番号４０)はＧＧＧａと相互作用する；そして、ＺｉｎｃフィンガーのＮ末端であるＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインが挿入される。
GGAGAGGAGGGGGGG(配列番号４１)ＤＮＡエレメントへの操作したＺｉｎｃフィンガータンパク質の結合により、ＣＨＯプロテインＳ転写は下方制御されると予測された。
ＣＨＯプロテインＳプロモーター領域(配列番号２９)を、ｐＧＬ３-ベーシック(Promega, Madison)にクローニングして、ＺＮＦ-ＰＳの効果を決定するためにルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてレポーターコンストラクトとして用いた。ＺＮＦ-ＰＳ遺伝子をコードするプラスミドとＣＨＯプロテインＳレポータープラスミドとを、ＣＨＯ-Ｋ１細胞に形質移入して、ルシフェラーゼ活性を決定した。ＺＮＦ-ＰＳは、用量-反応非依存性の様式でプロテインＳ転写を５０％下方制御しうる。図３ａにプロテインＳのＺＮＦ-ＰＳ下方制御を例示する。
同様な実験において、ＣＨＯ-Ｋ１細胞に、ＺＮＦ-ＰＳとｐＥＧＦＰ(高感度緑色蛍光タンパク質)を形質移入して、プロテインＳとｐＥＧＦＰ ｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにて測定した。ｐＥＧＦＰを形質移入コントロールとした。図３ｂにプロテインＳの５０％の下方制御を示す。
ＣＨＯプロテインＳプロモーター領域(配列番号２９)を、ｐＧＬ３-ベーシック(Promega, Madison)にクローニングして、ＺＮＦ-ＰＳの効果を決定するためにルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてレポーターコンストラクトとして用いた。ＺＮＦ-ＰＳ遺伝子をコードするプラスミドとＣＨＯプロテインＳレポータープラスミドとを、ＣＨＯ-Ｋ１細胞に形質移入して、ルシフェラーゼ活性を決定した。ＺＮＦ-ＰＳは、用量-反応非依存性の様式でプロテインＳ転写を５０％下方制御しうる。図３ａにプロテインＳのＺＮＦ-ＰＳ下方制御を例示する。
同様な実験において、ＣＨＯ-Ｋ１細胞に、ＺＮＦ-ＰＳとｐＥＧＦＰ(高感度緑色蛍光タンパク質)を形質移入して、プロテインＳとｐＥＧＦＰ ｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにて測定した。ｐＥＧＦＰを形質移入コントロールとした。図３ｂにプロテインＳの５０％の下方制御を示す。
ＺＮＦ-ＰＳ(配列番号４２)
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実施例５：ＣＨＯ Ｋ１ゲノム中のプロテインＳ対立遺伝子の数の決定
２２の染色体を有するチャイニーズハムスターと比較して、ＣＨＯ-Ｋ１細胞株は２１しか染色体を持っておらず、これら２１の８のみが正常であった。１３には、変化した染色体の転座、欠失及び動原体周囲の逆位が検出された(Deaven & Petersen, Chromosoma 1973; 41(2), 129-144)。プロテインＳ遺伝子が正常染色体と変化した染色体のどちらに存在するか、ないしはどのくらい多くの対立遺伝子がＣＨＯ-Ｋ１ゲノムに存在するかはわからない。
SeeDNA Biotech Inc. companyは、発明者等がクローン化して供給したｐＣＲ２.１(Invitrogen, Carlsbad)中にプロテインＳイントロン１プローブ(配列番号４３)を含有するプラスミドを用いて、ＣＨＯ Ｋ１細胞(ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ-６１)のゲノムのＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)分析を行った。ＦＩＳＨ分析の結果を図４に示す。
プロテインＳ遺伝子は、同じ中期で２つの異なる染色体上に配位する。遺伝子座Ａ(矢印によって示される)を有する染色体はサブメタセントリックであり、大きさが小さく。遺伝子座Ｂ(矢頭によって示される)を有する染色体はメタセントリックであり、大きさが大きい。また、これら２つの染色体のバンドパターンは異なる。
２２の染色体を有するチャイニーズハムスターと比較して、ＣＨＯ-Ｋ１細胞株は２１しか染色体を持っておらず、これら２１の８のみが正常であった。１３には、変化した染色体の転座、欠失及び動原体周囲の逆位が検出された(Deaven & Petersen, Chromosoma 1973; 41(2), 129-144)。プロテインＳ遺伝子が正常染色体と変化した染色体のどちらに存在するか、ないしはどのくらい多くの対立遺伝子がＣＨＯ-Ｋ１ゲノムに存在するかはわからない。
SeeDNA Biotech Inc. companyは、発明者等がクローン化して供給したｐＣＲ２.１(Invitrogen, Carlsbad)中にプロテインＳイントロン１プローブ(配列番号４３)を含有するプラスミドを用いて、ＣＨＯ Ｋ１細胞(ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ-６１)のゲノムのＦＩＳＨ(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)分析を行った。ＦＩＳＨ分析の結果を図４に示す。
プロテインＳ遺伝子は、同じ中期で２つの異なる染色体上に配位する。遺伝子座Ａ(矢印によって示される)を有する染色体はサブメタセントリックであり、大きさが小さく。遺伝子座Ｂ(矢頭によって示される)を有する染色体はメタセントリックであり、大きさが大きい。また、これら２つの染色体のバンドパターンは異なる。
プロテインＳイントロン１プローブ(配列番号４３)
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実施例６：Ｚｉｎｃフィンガー-ヌクレアーゼ融合タンパク質によって亢進するＣＨＯプロテインＳの遺伝子ターゲティング。
哺乳動物細胞において起こる体細胞組み換えは相同的であることがあまりないので、相同組み換えによる遺伝子ターゲティングは難しくて骨の折れる作業である。しかしながら、ＤＮＡ鎖の部位特異的な切断は相同組み換えを促しうる。エンドヌクレアーゼに融合するＤＮＡ結合Ｚｉｎｃフィンガーの操作により、ＤＮＡ切断がどこに起こるのかをほぼ正確に設定することができる(Durai等, Nucleic Acids Research, 2005; 33(18), 5970-5990、及びSmith等, Nucleic Acids Research, 2000; 28(17), 3361-3369)。5'-GTCCTGAGC-3'(右のフィンガー)及び5'-GCTGGTATG-3'(左のフィンガー)エレメントを結合するように設定された、２つのＺｉｎｃフィンガータンパク質を、Mani等 (Mani等, Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 335; 447-457)によって公開されたフレームワーク内に作製した。ＺｉｎｃフィンガーのＺｉｎｃフィンガーＤＮＡ結合特異性は既に報告されている(Rebar-EJ,等 Nature Medicine 8 (2002) 1427-1432；Liu-PQ,等 Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 11323-11334；Ren-D,等 Genes & Development 16 (2002) 27-32；Mani-M,等 Biochemical and Biophysical Research Communications 335 (2005) 447-457)。
哺乳動物細胞において起こる体細胞組み換えは相同的であることがあまりないので、相同組み換えによる遺伝子ターゲティングは難しくて骨の折れる作業である。しかしながら、ＤＮＡ鎖の部位特異的な切断は相同組み換えを促しうる。エンドヌクレアーゼに融合するＤＮＡ結合Ｚｉｎｃフィンガーの操作により、ＤＮＡ切断がどこに起こるのかをほぼ正確に設定することができる(Durai等, Nucleic Acids Research, 2005; 33(18), 5970-5990、及びSmith等, Nucleic Acids Research, 2000; 28(17), 3361-3369)。5'-GTCCTGAGC-3'(右のフィンガー)及び5'-GCTGGTATG-3'(左のフィンガー)エレメントを結合するように設定された、２つのＺｉｎｃフィンガータンパク質を、Mani等 (Mani等, Biochemical and Biophysical Research Communications 2005, 335; 447-457)によって公開されたフレームワーク内に作製した。ＺｉｎｃフィンガーのＺｉｎｃフィンガーＤＮＡ結合特異性は既に報告されている(Rebar-EJ,等 Nature Medicine 8 (2002) 1427-1432；Liu-PQ,等 Journal of Biological Chemistry 276 (2001) 11323-11334；Ren-D,等 Genes & Development 16 (2002) 27-32；Mani-M,等 Biochemical and Biophysical Research Communications 335 (2005) 447-457)。
左右のＺｉｎｃフィンガーは、どちらもＦｏｋI及びＳｔｓI制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合させた(配列番号４４−５１)。ＦｏｋI及びＳｔｓI制限酵素はＤＮＡを切断するためにホモ二量体化するために必要であり、これによってＺｉｎｃフィンガー対の特異性も上がる。操作したヌクレアーゼの機能を、図５及び６に例示する。ゲノムＤＮＡがＺｉｎｃフィンガーヌクレアーゼによって切断される場合、たぶん相同組み換えによって、修復機構はギャップを修復しようとするであろう。プロテインＳ遺伝子を欠く遺伝子ターゲティングコンストラクト(配列番号５２)はヌクレアーゼとともに形質移入されるであろう。ゲノム中のプロテインＳエクソン１の場所にＥＧＦＰ遺伝子が挿入されるであろう。図６に相同組み換えをフロー式で例示する。遺伝子ターゲティングコンストラクトは、プロテインＳレポーターコンストラクト(実施例４)のルシフェラーゼ遺伝子をＥＧＦＰ-遺伝子と入れ替えて、ポリＡシグナルの後にさらにプロテインＳイントロン１を挿入して作製した。コンストラクトは、タンパク質Ｓプロモーター、ＥＧＦＰ-遺伝子、ポリＡ-シグナル及びプロテインＳイントロン１からなるが、エクソン１は含まない。プロテインＳシグナルペプチドが欠失されて、転写生成物がポリＡシグナルによってＥＧＦＰコード配列の直後で切断されるので、ホモ接合の組み換えＣＨＯ細胞株はプロテインＳでなくＥＧＦＰを発現するであろう。ヘテロ接合の細胞クローンは最も多いことが予測され、発明者等がホモ接合の細胞クローンの作製に成功したかどうかは、ＰＣＲ分析により明らかとなるであろう。選別を容易にするために、ヘテロ接合の細胞クローンを、ＥＧＦＰ遺伝子の代わりに抗生物質の耐性遺伝子を含有するターゲティングベクターにて２回処理する。
(配列番号４４) 左のＺｉｎｃフィンガー-ＦｏｋI ＤＮＡ配列
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(配列番号４５) 左のＺｉｎｃフィンガー-ＳｔｓI ＤＮＡ配列
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(配列番号４６) 右のＺｉｎｃフィンガー-ＦｏｋI ＤＮＡ配列
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(配列番号４７) 右のＺｉｎｃフィンガー-ＳｔｓI ＤＮＡ配列
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(配列番号４８) 左のＺｉｎｃフィンガー-ＦｏｋI タンパク質配列
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(配列番号４９) 左のＺｉｎｃフィンガー-ＳｔｓI タンパク質配列
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(配列番号５０) 右のＺｉｎｃフィンガー-ＦｏｋI タンパク質配列
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(配列番号５１) 右のＺｉｎｃＺｎフィンガー-ＳｔｓI タンパク質配列
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(配列番号５２) プロテインＳプロモーター-ＥＧＦＰ-プロテインＳイントロン１ターゲティングコンストラクト
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Claims (22)
- 対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を発現する宿主細胞であって、内因的に発現されるタンパク質混入物としてのプロテインＳを、修飾がない場合の宿主細胞で発現される量よりも少ない量で発現するように修飾されている宿主細胞。
- 前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
- 前記タンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である、請求項１又は２に記載の宿主細胞。
- 前記タンパク質混入物がプロテインＳである、請求項１から３のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、請求項１から５のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、請求項１から５のいずれか一に記載の宿主細胞。
- プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、請求項７に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される、配列番号３５の配列を含むＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一のＺｉｎｃフィンガータンパク質を形質移入することによって修飾されている、請求項１から８のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、請求項１から５のいずれか一に記載の宿主細胞。
- 請求項１から１０のいずれか一に記載の宿主細胞の生成方法であって、
a) 対象とするビタミンＫ依存性タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを該細胞に形質移入する；及び、
b) 内因的に発現されるタンパク質混入物としてのプロテインＳを、修飾がない場合の宿主細胞で発現される量よりも少ない量で発現するように該細胞を修飾する
という工程を含んでなる方法。 - 前記の対象とするビタミンＫ依存性タンパク質が、ＧＡＳ-６、プロテインＳ、第II因子(プロトロンビン)、第X因子、第IX因子、プロテインＣ、第VII因子、プロテインＺ、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質１、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質２、膜貫通型γカルボキシグルタミン酸タンパク質３、膜貫通型γ‐カルボキシルグルタミン酸タンパク質４、骨Ｇｌａタンパク質、マトリックスＧｌａタンパク質、及びオステオカルシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
- 前記タンパク質混入物が第二のビタミンＫ依存性タンパク質である、請求項１１又は１２に記載の方法。
- 前記タンパク質混入物がプロテインＳである、請求項１１から１３のいずれか一に記載の方法。
- 宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３(ＨＥＫ２９３)細胞、ＢＫＨ細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＳＰ２／０細胞及びＮＳ０細胞からなる群から選択される、請求項１１から１４のいずれか一に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも一のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドコンストラクトを形質移入することによって修飾されている、請求項１１から１５のいずれか一に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードする少なくとも一の内因性遺伝子の遺伝子ノックアウトによって破壊することによって修飾されている、請求項１１から１５のいずれか一に記載の方法。
- プロテインＳをコードする内因性遺伝子がエクソン１の遺伝子ノックアウトによって破壊されている、請求項１７に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現される、配列番号３５の配列を含むＤＮＡエレメントに結合する少なくとも一のＺｉｎｃフィンガータンパク質を形質移入することによって修飾されている、請求項１１から１８のいずれか一に記載の方法。
- 前記細胞が、前記宿主細胞によって内因的に発現されるプロテインＳをコードする少なくとも一の内因性遺伝子の破壊のためにランダム突然変異誘発によって修飾されている、請求項１１から１５のいずれか一に記載の方法。
- 内因的に発現されるプロテインＳを、修飾がない場合の宿主細胞よりも少ない量で有する対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含有してなる組成物の生成方法であって、
a) 請求項１１から２０のいずれか一に記載の方法に従って宿主細胞を生成する；及び、
b) 成長培地中で該宿主細胞を生育させ、対象とするビタミンＫ依存性タンパク質を含んでなる該成長培地を回収する
という工程を含んでなる方法。 - 請求項２１に記載の方法によって生成される組成物。
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