JP6262665B2 - 単純な糖型を有する組換えタンパク質の産生 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、単純な糖型を有する組換えタンパク質に関する。特に、本発明は、１つ以上の末端マンノース残基を有する組換え糖タンパク質を産生するための組成物および方法に関する。

発明の背景
Ｎ結合型グリコシル化は、多くの分泌型および膜結合型糖タンパク質上で見出される共通のタンパク質修飾である。複合糖型の合成は、真核生物細胞の小胞体およびゴルジ装置の中で段階的な様式で実行される一連の酵素反応を必要とする。大部分の組換え治療用タンパク質が、免疫原性を回避するため、およびタンパク質の半減期を改善するために、複合グリカンの存在を必要とする一方、単純なＮグリカン構造を有する糖タンパク質についての応用もまた存在する。例えば、単純な糖型を有する組換えタンパク質は、Ｘ線結晶学研究のために有利である。加えて、末端マンノース残基のみを有する単純な糖型は、これらのタンパク質のためのマンノース受容体が媒介する取り込みを容易にすることによって、いくつかの治療剤の効力の増加をもたらすことができる。

しかし、治療用糖タンパク質の産生のために使用される多くの細胞株は、不均一または複雑なＮ結合糖型を有するタンパク質を産生する。従って、単純な糖型を有する組換え糖タンパク質を産生するよう操作されている細胞株についての必要性が存在している。さらに、これらの操作された細胞株は、化学的に規定された培養培地中で高いタンパク質の生産性および強固な増殖を維持しながら、末端マンノース残基を有するタンパク質を安定して産生することが所望されている。

概要
本開示の様々な態様の中に、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍｇａｔ１）が欠損している細胞株の提供がある。１つの態様において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、Ｍｇａｔ１タンパク質を産生しない。別の態様において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない親の細胞株と比較して、Ｍｇａｔ１タンパク質の量の減少を生じる。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードしている不活化染色体配列を含む。Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼを用いて不活化できる。特定の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、および部位特異的エンドヌクレアーゼから選択される。１つの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、少なくとも１つの塩基対の欠失、少なくとも１つの塩基対の挿入、少なくとも１つの塩基対の置換、またはこれらの組み合わせに起因して不活化される。特定の実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードしている染色体配列は、２〜５５塩基対の欠失に起因して不活化される。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株はまた、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはこれらの組み合わせもまた欠損している。別の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株はＣＨＯ細胞株である。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株はＣＨＯ細胞株であり、そこでは、単一コピーのＭｇａｔ１をコードする染色体配列が欠失によって不活化されており、この細胞株はＭｇａｔ１を産生しない。別の実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株はＣＨＯ ＧＳ−／−細胞株であり、ここでは、単一コピーのＭｇａｔ１をコードする染色体配列が欠失によって不活化され、この細胞株はＭｇａｔ１を産生しない。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、単純な糖型を有する少なくとも１つの糖タンパク質を発現し、ここで、単純な糖型は、１つ以上の末端マンノース残基を含む。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株に匹敵する増殖速度を有する。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株に匹敵するタンパク質のレベルを生じる。

本開示の別の態様は、Ｍｇａｔ１を欠損している細胞を産生するための方法を包含する。この方法は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列中の特定の配列を標的とする標的エンドヌクレアーゼを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることを含む。標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、または部位特異的エンドヌクレアーゼであり得る。１つの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。１つの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはこれらの組み合わせもまた欠損している。１つの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。別の実施形態において、宿主細胞はＧＳ−／−ＣＨＯ細胞である。１つの実施形態において、トランスフェクトされた宿主細胞は、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）アグルチニン−Ｉ（ＲＣＡ−Ｉ）とともにインキュベートされる。

本開示のさらに別の態様は、１つ以上の末端マンノース残基を有する組換えタンパク質を産生するための方法である。この方法は、Ｍｇａｔ１をコードしているすべての染色体配列が不活化されており、その結果、細胞株がＭｇａｔ１を産生しない細胞株に、組換えタンパク質をコードする核酸を導入すること、および組換えタンパク質を発現することを含む。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、および部位特異的エンドヌクレアーゼから選ばれる標的エンドヌクレアーゼによって不活化される。１つの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。１つの実施形態において、不活化されたＭｇａｔ１をコードする染色体配列は２〜５５塩基対の欠失を含む。１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１を産生しない細胞株はＣＨＯ細胞株である。別の実施形態において、Ｍｇａｔ１を産生しない細胞株はＧＳ−／−ＣＨＯ細胞株である。１つの実施形態において、発現された組換えタンパク質は、１つ以上の末端マンノース残基を含む単純な糖型を有する。

本開示の他の態様および反復は以下により詳細に記載される。

図１は、Ｎ−グリカン合成におけるＭｇａｔ１の役割を示す概略図である。Ｍｇａｔ１は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ５）糖型へのＧｌｃＮＡｃ残基の転移を触媒する。

図２は、Ｍｇａｔ１を標的とするフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計および検証を図示する。（Ａ）ＺＦＮがＭｇａｔ１コード領域において結合および切断するよう設計されている位置の概略図を提示する。（Ｂ）Ｃｅｌ１ヌクレアーゼアッセイによるＺＦＮ活性の検証を示す。モックトランスフェクト細胞、ＤＮＡでトランスフェクトした細胞、およびＲＮＡでトランスフェクトした細胞からのトランスフェクションの３日後および１０日後のゲノムＤＮＡ消化を示す。２つのＤＮＡフラグメント、２２０ｂｐおよび１９７ｂｐが、トランスフェクションの３日後および１０日後の両方の消化物中に存在する。

図３は、ＲＣＡ−Ｉ富化の前後のＣｅｌ１分析を提示する。ＲＣＡ−Ｉ富化前後でのＤＮＡまたはＲＮＡでトランスフェクトされた細胞、ならびにモックトランスフェクト細胞のゲノムＤＮＡ消化物が示される。デンシトメトリーによって決定されるような、修飾されたパーセンテージが各レーンの下に列挙される。

図４は、ＲＣＡ−Ｉ富化あるなしでのＭｇａｔ１ ＺＦＮトランスフェクト細胞のＩｇＧ糖プロフィールを示す。（Ａ）モックトランスフェクト細胞、ＺＦＮ ＤＮＡまたはＲＮＡでトランスフェクトし、ＲＣＡ−Ｉ選択を伴わない細胞、およびＺＦＮ ＤＮＡまたはＲＮＡでトランスフェクトし、ＲＣＡ−Ｉ選択を伴う細胞によって産生されたＩｇＧにおける各糖型（Ｍａｎ５、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、およびＧ２Ｆ）のパーセントを提示する。（Ｂ）アッセイされた各糖型の構造の略図。

図５は、Ｍｇａｔ１が破壊されたＩｇＧ産生クローンの遺伝子型を提示する。以下の細胞株：非トランスフェクト野生型（野生型）；ＺＦＮトランスフェクションおよびクローン単離を受けた２つの野生型クローン（＃１５、＃４６）；ＲＣＡ−Ｉなしで選択された２つのＭｇａｔ１が破壊された細胞株（＃７３、＃９２）、およびＲＣＡ−Ｉの存在下で選択されたＭｇａｔ１が破壊された４つの細胞株（＃２１、＃２５、＃２７、＃３７）の配列アラインメントが示される。影をつけた領域はＺＦＮ切断部位をマークしている。

図６は、ＲＣＡ−Ｉに対するＭｇａｔ１ノックアウトクローンの不感受性を図示する。ＲＣＡ−Ｉの非存在下および存在下で増殖させたときの、野生型クローン（野生型、＃１５、＃４６）およびＭｇａｔ１ノックアウトクローン（＃７３、＃９２、＃２１、＃２５、＃２７、＃３７）のバッチ培養におけるピークの生存細胞密度がプロットされている。

図７は、野生型およびＭｇａｔ１ノックアウトＩｇＧ産生クローンのＩｇＧ糖プロフィールを示す。（Ａ）トランスフェクトしていないクローン（野生型）および野生型クローン（＃１５、＃４６）からの５日目に収集されたＩｇＧサンプルにおける様々な糖型のパーセンテージを示す。（Ｂ）６個のＭｇａｔ１ノックアウトクローン（＃７３、＃９２、＃２１、＃２５、＃２７、＃３７）から５日目に収集されたＩｇＧサンプルにおける様々な糖型のパーセンテージを提示する。（Ｃ）野生型クローンから８日目に収集されたＩｇＧサンプルにおける様々な糖型のパーセンテージを示す。（Ｄ）６個のＭｇａｔ１ノックアウトクローンから８日目に収集されたＩｇＧサンプルにおける様々な糖型のパーセンテージを提示する。ＮＤ＝検出されず。

図８は、時間の経過に対する、野生型クローンおよびＭｇａｔ１ノックアウトクローンの増殖を図示する。（Ａ）バッチ培養における１３日間にわたる、野生型クローン（野生型、＃１５、＃４６）およびＭｇａｔ１ノックアウトクローン（＃７３、＃９２、＃２１、＃２５、＃２７、＃３７）における生存細胞のパーセントを提示する。（Ｂ）１３日間にわたる、野生型クローンおよび６つのＭｇａｔ１ノックアウトクローンのバッチ培養における生存細胞密度を示す。

図９は、野生型クローンおよびＭｇａｔ１ノックアウトクローンのＩｇＧ生産性を示す。野生型クローン（野生型、＃１５、＃４６）およびＭｇａｔ１ノックアウトクローン（＃７３、＃９２、＃２１、＃２５、＃２７、＃３７）におけるピーク体積測定的生産性がプロットされている。

発明の詳細な説明
本開示は、単純な糖型を有する組換えタンパク質の産生の組成物および方法を提供し、ここで、単純な糖型は１つ以上の末端マンノース残基を含む。特に、本開示は、マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍｇａｔ１）が欠損している細胞株を提供する。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、細胞株がＭｇａｔ１を産生しないように、不活化されたかまたはノックアウトされた、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列を含む。結果として、この細胞株は、１つ以上の末端マンノース残基を有する糖タンパク質を産生する。末端マンノース残基を有する糖タンパク質は、マンノース受容体媒介性の取り込みを容易にするので、本明細書中に開示されたＭｇａｔ１欠損細胞株はワクチン産生のために有用である。加えて、単純な糖型を有する糖タンパク質はＸ線結晶学研究のために有用である。さらに、本明細書に開示されるＭｇａｔ１欠損細胞は、ランダム化学変異誘発に付随する潜在的な調節の懸念を回避し、親の細胞株に匹敵する増殖および生産性の特性を維持する。

本開示はまた、Ｍｇａｔ１欠損細胞を調製するための方法を提供する。例えば、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列を不活化するために標的エンドヌクレアーゼを使用することによって調製できる。本明細書に開示されるＭｇａｔ１欠損細胞を使用して単純な糖型を有する組換え糖タンパク質を産生するための方法もまた提供される。

（Ｉ）Ｍｇａｔ１欠損細胞株
（ａ）細胞株の特性
本開示の１つの態様は、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株を包含する。Ｍｇａｔ１は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＡｃ−ＴＩまたはＧｎＴＩ）またはＮ−グリコシル−オリゴサッカリド−糖タンパク質Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩとしてもまた知られている。Ｍｇａｔ１は、成長しているＮ−グリカンのオリゴマンノースコア（すなわち、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ５）部分）へのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の転移を触媒する（図１を参照のこと）。

ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、親の細胞株と比較して、Ｍｇａｔ１のレベルが減少している。例えば、Ｍｇａｔ１欠損細胞株におけるＭｇａｔ１のレベルは、Ｍｇａｔ１が欠損していない親の細胞株と比較して、約５％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、または約９０％〜約９９．９％減少できる。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、本質的にＭｇａｔ１を産生しない。本明細書で使用される場合、「Ｍｇａｔ１が本質的にない」という用語は、Ｍｇａｔ１欠損細胞株または当該分野において周知である手順を使用してそこから誘導された溶解物の中で、Ｍｇａｔ１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質が検出できないことを意味する。ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定するための適切な手順の非限定的な例には、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。

Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、単純な糖型を有する糖タンパク質を産生する。単純な糖型とは、１つ以上の末端マンノース残基を含む糖型をいう。一般的に、単純な糖型は、ガラクトースおよび／またはシアル酸残基を欠いている。例示的な単純な糖型はＭａｎ５ＧｌｃＮａｃ２またはＭａｎ５である。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、末端マンノース残基のレベルが約１．１倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約１０倍〜約３０倍、約３０倍〜約１００倍、または約１００倍より多く増加されている糖タンパク質を生成できる。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、末端ガラクトースおよび／またはシアル酸残基のレベルが、約１．１倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約１０倍〜約３０倍、約３０倍〜約１００倍、または約１００倍より多く減少している糖タンパク質を産生できる。

Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株に匹敵する、レベルのタンパク質産生または生産性を有する。本明細書で使用される場合、「匹敵するタンパク質産生」とは、Ｍｇａｔ１欠損細胞株が、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株よりも、ほぼ同じレベルかまたはそれ以上のタンパク質を産生することを意味する。タンパク質生産性は、単位体積あたりに産生されるタンパク質の量（すなわち、ピーク体積測定的生産性）を決定することによって定量化できる。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株によって産生されるタンパク質の量は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株によって産生される量と比較して、±１０％変動する可能性がある。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株によって産生されるタンパク質の量は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株によって産生される量と比較して、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、または約４０％〜約５０％増加できる。

Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株の増殖速度に匹敵する増殖速度を有する。本明細書で使用される場合、「に匹敵する増殖速度」とは、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株と比較して増加するか、またはＭｇａｔ１が欠損していない細胞株と比較して約５０％未満減少するかのいずれかである増殖速度をいう。培養中の特定の時間の期間後、増殖速度は、単位体積あたりの生存細胞のパーセンテージまたは生存細胞の数（すなわち、生存細胞密度）を決定することによって定量できる。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株と比較して、増殖速度の増加を有した。例えば、Ｍｇａｔ１欠損細胞株における生存細胞のパーセンテージまたは生存細胞密度は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株と比較して、約１％〜約１０％、約１０％〜約３０％、約３０％〜約５％、約５０％〜約１００％、または１００％より多く増加できる。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株における生存細胞のパーセンテージまたは生存細胞の密度は、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株と比較して、約１％〜約１０％、約１０％〜約３０％、約３０％〜約５０％減少できる。

本明細書に開示されるＭｇａｔ１欠損細胞株は安定な表現系を有する。例えば、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、長期間の間、および／または数え切れないほどの細胞世代にわたって、単純な糖型を有する糖タンパク質を産生する。別の言い方をすれば、本明細書に開示される細胞株は、複合糖型を有する糖タンパク質を産生するように戻ることがない。加えて、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、長期間の間、および／または数え切れないほどの細胞世代にわたって、高いレベルのタンパク質の生産性および優秀な増殖速度を維持する。

（ｂ）不活化された、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列
ある実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、不活化された、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列を含む。例えば、この細胞株のゲノムは、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列を不活化するために編集できる。本明細書で使用される場合、「不活化された染色体配列」という用語は、タンパク質産物を生成することが不可能な染色体配列をいう。細胞株が正倍数体細胞を含む実施形態において、不活化された、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、細胞株が減少レベルのＭｇａｔ１を産生するように、単一対立遺伝子性であり得る。細胞株が正倍数体細胞を含む他の実施形態において、不活化された、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、細胞株がＭｇａｔ１を産生しないように二対立遺伝子性であり得る。細胞株が異数性である他の実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列の１つ以上のコピーは、細胞が減少量のＭｇａｔ１を産生するように、不活化できる。細胞株が異数性であるなお他の実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列のすべてのコピーは、細胞株がＭｇａｔ１を産生しないように、不活化できる。１つの例示的な実施形態において、細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列について半数体であり、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列の不活化はＭｇａｔ１発現の完全な喪失を生じる。

Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、少なくとも１つの塩基対（ｂｐ）の欠失、少なくとも１ｂｐの挿入、少なくとも１ｂｐの置換、またはこれらの組み合わせによって不活化できる。欠失、挿入、および／または置換の結果として、Ｍｇａｔ１コード配列は、読み枠のシフトを受け、それによって、タンパク質産物の産生を妨害する。Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、以下のセクション（ＩＩ）において詳述されるように、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術を使用して不活化できる。様々な実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、Ｍｇａｔ１の発現が無効にされるように、エキソンのコード領域のすべてもしくは一部の欠失、制御領域のすべてもしくは一部の欠失、および／またはスプライシング部位の欠失によって不活化できる。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、細胞株がＭｇａｔ１を産生することが不可能であるように、早発性の停止コドン、新たなスプライシング部位、および／またはＳＮＰを染色体配列に導入するための欠失、挿入、および／またはヌクレオチド置換を介して不活化できる。

１つの実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列の約１ｂｐから全体のコード領域までの範囲の欠失を含む。別の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１のコード領域の約２ｂｐ〜約５５ｂｐ、約５５ｂｐ〜約１００ｂｐ、約１００ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１２００ｂｐ、または約１２００ｂｐより多くの範囲の欠失を含む。例示的な実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列の２ｂｐ、４ｂｐ、７ｂｐ、１０、ｂｐ、１８ｂｐ、２４ｂｐ、２８ｂｐ、または５５ｂｐの欠失を含む。別の例示的な実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードする１０４ｂｐの染色体配列の挿入によって置き換えられる１５７ｂｐの欠失を含む。

（ｃ）任意のさらなる欠損
ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株はまた、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはこれらの組み合わせにおける欠損も含む。ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴにおける欠損は、天然に存在し得る。あるいは、ＧＳ、ＤＨＦＲ、および／またはＨＰＲＴにおける欠損は操作できる。細胞がＧＳ、ＤＨＦＲ、またはＨＰＲＴをそれぞれコードしている不活化染色体配列を含むので、その細胞はＧＳ、ＤＨＦＲ、またはＨＰＲＴを欠損していることがあり得る。ある実施形態において、ＧＳ、ＤＨＦＲ、またはＨＰＲＴをコードする染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集によって不活化できる。例示的な実施形態において、ＧＳ、ＤＨＦＲ、またはＨＰＲＴをコードする染色体配列のすべてのコピーは、細胞株がＧＳ、ＤＨＦＲ、またはＨＰＲＴを、それぞれ産生しないように不活化される。例示的な実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株はＧＳ−／−である。

（ｄ）細胞株の種類
Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株の種類は変動できる。細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、非哺乳動物脊椎動物細胞株、脊椎動物細胞株、または酵母細胞株であり得る。

適切な哺乳動物細胞株の非限定的な例には以下が挙げられる：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウスミエローマＮＳ０細胞、マウス胎児線維芽３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウスメラノーマＢ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウスミエローマＳＰ２／０細胞；マウス胎児間葉Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス胸部ＥＭＴ６細胞；マウス肝癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウスミエローマＪ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ−５Ｆ細胞；マウスメラノーマＸ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞；ラットグリア芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫 Ｂ３５細胞；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ−４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ−７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ−７６）細胞；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞。哺乳動物細胞株の広範なリストは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）カタログ（ＡＴＣＣ，Ｍａｍａｓｓａｓ，ＶＡ）の中で見いだされてもよい。

適切な非哺乳動物細胞株の例には、Ｘｅｎｏｐｕｓ細胞株（例えば、Ｓ３、ＸＴＣ、ＢＢ７、ｆｆ−２、１５／０、および１５／４０）；ゼブラフィッシュ細胞株（例えば、ＺＦ４、ＰＡＣ２など）；昆虫細胞株（例えば、ＳＦ９、Ｓ２等）；ならびにＰｉｃｈｉａ細胞株およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞株などの酵母細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。

例示的な実施形態において、細胞株は、組換えタンパク質、例えば、抗体、糖タンパク質等の産生のために広範に使用される型である。例示的な実施形態において、細胞株はＣＨＯ細胞株である。多数のＣＨＯ細胞株がＡＴＣＣから利用可能である。適切なＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびその誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。

（ｅ）任意の核酸
ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含んでもよい。一般的に、組換えタンパク質は異種であり、そのタンパク質が細胞にとってネイティブではないことを意味する。組換えタンパク質は、非限定的に、抗体、抗体のフラグメント、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝血（または凝固）因子、血液成分、酵素、治療タンパク質、栄養補助タンパク質、前述のいずれかの機能的フラグメントまたは機能的改変体、または前述のタンパク質および／もしくはその機能的フラグメントもしくはその改変体のいずれかを含む融合タンパク質であってもよい。

ある実施形態において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、ＨＰＲＴ、ＤＨＦＲ、および／またはＧＳが増幅可能な選択可能なマーカーとして使用されてもよいように、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、および／またはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする核酸配列に連結されてもよい。

ある実施形態において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は染色体外であってもよい。すなわち、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、または別の染色体外構築物から一過性に発現されてもよい。発現構築物は、さらなる発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。さらなる情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３ ｏｒ 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１において見出すことができる。

他の実施形態において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、細胞のゲノムに染色体に組み込まれてもよい。従って、組換えタンパク質は安定して発現できる。この実施形態のいくつかの反復において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、適切な異種発現制御配列（すなわち、プロモーター）に作動可能に連結されてもよい。他の反復において、組換えタンパク質をコードする核酸配列は、内因性発現制御配列の制御下に配置されてもよい。核酸配列をコードする組換えタンパク質は、同種組換え、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集、ウイルスベクター、トランスポゾン、プラスミド、および他の周知の手段を使用して細胞株のゲノムに組み込むことができる。さらなるガイダンスが、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３、前出およびＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、前出において見出すことができる。

（ｆ）例示的な実施形態
１つの例示的な実施形態において、細胞株が、単一コピーのＭｇａｔ１をコードする染色体配列が不活化されている（すなわち、細胞の遺伝子型がＭｇａｔ１−／０である）ＣＨＯ細胞株である。別の例示的な実施形態において、細胞株は、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列の単一コピーが不活化されている（すなわち、細胞の遺伝子型がＧＳ−／−、Ｍｇａｔ１−／０である）、ＧＳ−／−ＣＨＯ細胞株である。一般的に、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列は、コード配列一部の欠失によって不活化されている。

（ＩＩ）Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株を調製するための方法
Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は様々な方法によって調製できる。特定の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集プロセスによって調製できる。他の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、ＲＮＡｉ法、ランダム変異誘発、部位特異的組換えシステム、または当該分野において公知である他の方法によって調製できる。

Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、１つ以上の末端マンノース残基を有する糖タンパク質を産生する。さらなる実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、トウゴマアグルチニン−Ｉ（ＲＣＡ−Ｉ）とのインキュベーションによってさらに富化できる。ＲＣＡ−Ｉは、末端マンノース残基を結合せず、それゆえに、Ｍｇａｔ１活性を欠いている細胞の選択を可能にする細胞毒性レクチンである。このような細胞は末端マンノース残基を有する糖タンパク質を産生するからである。

（ａ）標的エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集
標的エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を編集（すなわち、不活化または修飾）するために使用できる。特定の染色体配列は、特定の染色体配列を標的とするように操作されている、標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入することによって不活化できる。１つの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を認識および結合し、ならびに非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復プロセスによって修復される二本鎖の切れ目を導入する。ＮＨＥＪエラーを起こす傾向があるので、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換が起こってもよく、それによって、染色体配列の読み枠を破壊し、その結果、タンパク質産物が産生されない。別の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼはまた、標的とされた染色体配列の一部との実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを同時導入することによって、同種組換え反応を介して染色体配列を編集するために使用できる。標的エンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖の切れ目は、相同性指向性の修復プロセスによって修復され、その結果、染色体配列は、編集される染色体配列が生じる様式で、そのポリヌクレオチドと交換される。

（ｉ）標的エンドヌクレアーゼ
様々な標的エンドヌクレアーゼが染色体配列を編集するために使用できる。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または操作されたタンパク質であり得る。１つの実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列によって特徴つけられるエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識配列は、一般的に、約１２塩基対〜約４０塩基対の範囲である。この要件の結果として、認識配列は、一般的には、任意の所定のゲノム中に１つのみ存在する。メガヌクレアーゼの中で、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧと名付けられたホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーが、ゲノムの研究およびゲノム操作の価値あるツールとなった。メガヌクレアーゼは、その認識配列を当業者に周知である技術を使用して修飾することにより、特定の染色体配列に標的化できる。

別の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであり得る。ＴＡＬＥは、新たなＤＮＡ標的に結合するように容易に操作できる植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓからの転写因子である。ＴＡＬＥまたはその短縮型バージョンは、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを作製するために、Ｆｏｋｌなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結されてもよい（Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１）：１７１−１９２）。

なお別の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼであり得る。特に、部位特異的エンドヌクレアーゼは、「レア−カッター」エンドヌクレアーゼであり得、その認識配列は、ゲノム中にまれに存在する。一般的に、部位特異的エンドヌクレアーゼの認識配列はゲノム中に１つのみ存在する。代替的なさらなる実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、人工的な標的ＤＮＡ二本鎖の切れ目誘導因子であり得る。

例示的な実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。典型的には、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、その両方が以下に記載される。

ジンクフィンガー結合ドメイン。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した任意の核酸配列を認識し、それに結合するように操作できる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２−７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５：５８０９−５８１４を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有してもよい。操作方法には、合理的設計および様々な型の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、２つ組、３つ組、および／または４つ組のヌクレオチド配列、ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、そこでは、各々の２組、３つ組、または４つ組のヌクレオチド配列は、特定の３つ組または４つ組の配列を結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照のこと。これらの開示は、それらの全体が参照により組み込まれる。１つの例として、米国特許第６，４５３，２４２号に記載されているアルゴリズムが、ジンクフィンガー結合ドメインを設計してあらかじめ選択された配列を標的とするために使用できる。縮重していない認識コード表を使用する合理的設計などの代替方法もまた、ジンクフィンガー結合ドメインを設計して特定の配列を標的とするために使用されてもよい（Ｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列における潜在的な標的部位を同定すること、ならびにジンクフィンガー結合ドメインを設計することのための、公的に利用可能なウェブに基づくツールは当該分野において公知である。例えば、ＤＮＡ配列における潜在的な標的部位を同定するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇ．において見出される。ジンクフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ．において見出される。（Ｍａｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５．もまた参照のこと）

ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチド長〜約２１ヌクレオチド長までの範囲のＤＮＡ配列を認識およびそれに結合するように設計できる。１つの実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、約９〜約１８ヌクレオチド長までの範囲のＤＮＡ配列を認識およびそれに結合するように設計できる。一般的に、本発明でジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３個のジンクフィンガー認識領域またはジンクフィンガーを含み、ここで、各ジンクフィンガーは３個のヌクレオチドを結合する。１つの実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは４個のジンクフィンガー認識領域を含む。別の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、５個のジンクフィンガー認識領域を含む。さらに別の実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、６個のジンクフィンガー認識領域を含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適切な標的ＤＮＡ配列に結合するように設計できる。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号；同第６，５３４，２６１号および同第６，４５３，２４２号を参照のこと。これらの開示は、それらの全体が参照により組み込まれる。

ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系が挙げられ、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に記載されており、これらの開示は、それらの全体が参照により組み込まれる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインのための結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されており、これらの全体の開示は参照により組み込まれる。

ジンクフィンガー結合ドメインおよび融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に公知であり、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号に詳細に記載されており、これは、その全体が参照により組み込まれる。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む、適切なリンカー配列を使用して、一緒に連結できる。６アミノ酸長以上のリンカー配列の非限定的な例については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照のこと。これらの開示は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個別のジンクフィンガー間に適切なリンカーの組み合わせを含んでもよい。

ある実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、染色体中の標的配列における二本鎖の切れ目を導入するために、核へのジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質の標的化を容易にするアミノ酸配列である。核局在化シグナルは当該分野において公知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ６：１０２５−１０２７を参照のこと。

切断ドメイン。ジンクフィンガーヌクレアーゼは切断ドメインもまた含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが得られるエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、
制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｒ Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３もまた参照のこと。１つ以上のこれらの酵素（またはこれらの機能的フラグメント）は、切断ドメインの供給源として使用できる。

切断ドメインはまた、切断活性のためにダイマー化を必要とする、上記のような酵素またはその一部から誘導できる。各ヌクレアーゼが活性酵素ダイマーのモノマーを含むので、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼは切断が必要であり得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素ダイマーを作製するために、両方のモノマーを含むことができる。本明細書で使用される場合、「活性酵素ダイマー」は、核酸分子を切断することが可能である酵素ダイマーである。２つの切断モノマーは同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）から誘導でき、または各モノマーは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）から誘導できる。

２つの切断モノマーは活性酵素ダイマーを形成するために使用され、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、好ましくは、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのそれぞれの認識部位への結合が、切断モノマーを、互いに対して、例えば、ダイマー化によって切断モノマーが活性酵素ダイマーを形成することを可能にする空間的配向に置くように配置される。結果として、認識部位の近傍の端が約５〜約１８ヌクレオチド離れることができる。例えば、近傍の端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチド離れることができる。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの認識部位の間に介在できることが理解される（例えば、約２〜約５０ヌクレオチド対以上）。例えば、本明細書に詳細に記載されたものなどのジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近傍の端は６ヌクレオチド分離することができる。一般的に、切断部位は、認識部位の間に位置する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合すること（認識部位において）、および結合の部位またはその近傍でＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除外された部位においてＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋｌは、ＤＮＡの二本鎖切断を、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他方のその認識部位から１３ヌクレオチドで触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号；および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１９７８−３１９８２を参照のこと。このように、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメインおよび１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができ、これは、操作されていてもよいし、操作されていなくてもよい。例示的なＩＩＳ型制限酵素は、例えば、国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５に記載されており、この開示は、その全体が参照により組み込まれる。さらなる制限酵素もまた、別々の結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらもまた、本開示によって意図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋｌである。この特定の酵素はダイマーとして活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０−１０，５７５）。従って、本開示の目的のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて使用されるＦｏｋｌ酵素の一部は切断可能なモノマーと見なされる。このように、Ｆｏｋｌ切断ドメインを使用する標的二本鎖切断のために、各々がＦｏｋｌ切断モノマーを含む２つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素ダイマーを再構築するために使用できる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋｌ切断モノマーを含有する単一ポリペプチド分子もまた使用できる。

特定の実施形態において、切断ドメインは、ホモダイマー化を最小化または防止する１つ以上の操作された切断モノマーを含む。非限定的な例として、Ｆｏｋｌの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基はすべて、Ｆｏｋｌ切断ハーフドメインのダイマー化に影響を与えるための標的である。必須のヘテロダイマーを形成するＦｏｋｌの例示的な操作された切断モノマーは、第１の切断モノマーがＦｏｋｌの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断モノマーが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む、対を含む。

このように、操作された切断モノマーの１つの実施形態において、４９０位のアミノ酸の変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；５３８位のアミノ酸の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；４８６位のアミノ酸の変異はＧｉｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置き換え；
そして４９９位のアミノ酸の変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換える。詳細には、操作された切断モノマーは４９０位をＥからＫに、および５３８位をＩからＫに変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と名付けられた操作された切断モノマーを産生すること、ならびに、別の切断モノマー中で、４８６位をＱからＥに、および４９９位をＩからＫに変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｋ」と名付けられた操作された切断モノマーを産生することによって調製できる。上記に記載された操作された切断モノマーは、異常な切断が最小化または無効にされている必須のヘテロダイマー変異体である。操作された切断モノマーは、適切な方法を使用して、例えば、その全体が参照により組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号に記載されるような野生型切断モノマー（Ｆｏｋｌ）の部位特異的変異誘発によって調製できる。

（ｉｉ）任意のポリヌクレオチド
ある実施形態において、標的ゲノム編集のための方法は、標的切断部位の少なくとも一方の配列に対して実質的な配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含む。例えば、ポリヌクレオチドは、標的切断部位の一方の配列に対して実質的な配列同一性を有する第１の配列、および標的切断部位の他方の配列に対して実質的な配列同一性を有する第２の配列を含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、標的切断部位の一方の配列に対して実質的な配列同一性を有する第１の配列、および標的切断部位から離れて位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する第２の配列を含んでもよい。標的切断部位から離れて位置する配列は、標的切断部位の数十ヌクレオチド、数百ヌクレオチド、または数千ヌクレオチド上流または下流であってもよい。

染色体配列の配列に対して実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドにおける第１の配列および第２の配列の長さは、変動でき、変動するであろう。一般的に、ポリヌクレオチドにおける第１の配列および第２の配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド長である。様々な実施形態において、染色体配列との実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチド配列は、約１０〜３０ヌクレオチド、約３０〜約１００ヌクレオチド、約１００〜約３００ヌクレオチド、約３００〜約１０００ヌクレオチド、約１０００〜約３０００ヌクレオチド、または３０００より上の長さの範囲であり得る。

「実質的な配列同一性」という語句は、ポリヌクレオチドの配列が、関心対象の染色体配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドが少なくとも１ヌクレオチドの欠失、挿入、および／または置換を含有し、その結果、相同組み換えの際に、変化した配列が染色体配列に導入される以外は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの配列が、標的とされる染色体配列に対して同一であり得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、関心対象の染色体配列と、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することができる。

代替の実施形態において、ポリヌクレオチドは、染色体配列と実質的な配列同一性を有する配列によって隣接されるさらなる配列を含むことができる。相同組換えの際に、さらなる配列は、染色体配列統合することができ、それによって、染色体配列を不活化し、および／または染色体配列を修飾する。

ポリヌクレオチドの長さは、変動でき、変動するであろう。例えば、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長から、約２００，０００ヌクレオチド長までの範囲であり得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長、約１０００ヌクレオチド〜約１０，０００ヌクレオチド長、約１０，０００ヌクレオチド〜約１００，０００ヌクレオチド長、または約１００，０００ヌクレオチド〜約２００，０００ヌクレオチド長の範囲である。

典型的には、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの直鎖状部分、ＰＣＲフラグメント、裸の核酸、またはリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸であり得る。

ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらにマーカーを含むことができる。適切なマーカーの非限定的な例には、制限部位、蛍光タンパク質、または選択マーカーが挙げられる。このようなマーカーは、標的化組み込みのためのスクリーニングを可能にする。

（ｉｉｉ）細胞への導入
標的エンドヌクレアーゼは、標的エンドヌクレアーゼをコードするタンパク質として、または核酸として、細胞に導入できる。標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）であってもよい。コードする核酸がｍＲＮＡである実施形態において、ｍＲＮＡは５‘キャップされ、および／または３’ポリアデニル化されてもよい。コードする核酸がＤＮＡである実施形態において、ＤＮＡは直鎖状または環状であり得る。ＤＮＡはベクターの一部であり得、ここで、コードするＤＮＡは、任意に、適切なプロモーターに作動可能に連結されている。適切なベクター、プロモーター、他の制御エレメント、およびベクターを細胞に導入する手段は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，２００３，前出および／またはＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前出において見出すことができる。

標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および上記の任意のポリヌクレオチドは、様々な手段によって細胞に導入できる。適切な送達手段には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、インパレフェクション、光学的トランスフェクション、独自の剤で増強される核酸の取り込み、およびリポソーム、イムノリポソーム、または人工ビリオンを介した送達が挙げられる。特定の実施形態において、標的エンドヌクレアーゼ分子および任意のポリヌクレオチドは、ヌクレオフェクションまたはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。

１つより多くの標的エンドヌクレアーゼ分子および１つより多くのポリヌクレオチドが細胞に導入される実施形態において、分子は同時または逐次的に導入できる。例えば、各々が標的とされる切断部位に特異的である標的エンドヌクレアーゼ分子（および任意にポリヌクレオチド）は、同時に導入できる。あるいは、各標的エンドヌクレアーゼ分子、ならびに任意のポリヌクレオチドは、逐次的に導入できる。

標的エンドヌクレアーゼ（または核酸をコードする）分子対任意のポリヌクレオチドの比率は、変動でき、変動するであろう。一般的に、標的エンドヌクレアーゼ分子対ポリヌクレオチドの比率は、約１：１０〜約１０：１の範囲であり得る。様々な実施形態において、標的エンドヌクレアーゼ分子対ポリヌクレオチドの比率は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１である。１つの実施形態において、この比率は約１：１である。

（ｉｖ）例示的な実施形態
ある実施形態において、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株は、Ｍｇａｔ１遺伝子における特定の配列を切断するためにジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を操作することによって調製される。親の細胞株へのＺＦＮまたはＺＦＮをコードする核酸の導入の際に、ＺＦＮは、Ｍｇａｔ１遺伝子における特定の配列に結合し、これを切断する。誤りがちなＮＨＥＪプロセスはＭｇａｔ１遺伝子における二本鎖の切れ目を修復し、それによって少なくとも１ｂｐの欠失、挿入、および／または置換を導入し、その結果、Ｍｇａｔ１遺伝子が不活化される。一般的に、読み枠が破壊され、かつＭｇａｔ１タンパク質が、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株によって産生されないように、Ｍｇａｔ１コード配列の領域は欠失している。ある実施形態において、ＺＦＮ媒介ゲノム編集を介して生成されたＭｇａｔ１欠損細胞株遺伝子は、ＲＣＡ−Ｉの存在下での選択によってさらに富化される。ある実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、ＣＨＯ細胞株をＭｇａｔ１に標的化されたＺＦＮと接触させることによって調製される。ある場合において、ＣＨＯ細胞株はＧＳ−／−である。

（ｂ）ＲＮＡ干渉
別の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、標的ｍＲＮＡまたは転写物の発現を阻害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）因子を使用して調製できる。ＲＮＡｉ因子は、標的ｍＲＮＡまたは転写物の切断を導くことができる。あるいは、ＲＮＡｉ因子は、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を妨害または破壊できる。

ある実施形態において、ＲＮＡｉ因子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。一般的に、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約２９ヌクレオチド長の範囲である二本鎖ＲＮＡ分子を含む。ｓｉＲＮＡは、約１６〜１８、１７〜１９、２１〜２３、２４〜２７、または２７〜２９ヌクレオチド長であり得る。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは約２１ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、任意に、１つまたは２つの一本鎖突出、例えば、一方または両方の末端に３’突出をさらに含むことができる。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成でき、または、代替的には、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から生成できる（以下を参照のこと）。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、完全に相補性であり、その結果、ミスマッチまたはバルジが２つの配列間に形成された二重鎖に存在しない。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は実質的に相補性であり、その結果、１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジが２つの配列間に形成された二重鎖に存在してもよい。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの一方または両方の５’末端はリン酸基を有するのに対して、他の実施形態において、一方または両方の５’末端はリン酸基を欠いている。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの一方または両方の３’末端はヒドロキシル基を有するのに対して、他の実施形態において、一方または両方の５’末端はヒドロキシル基を欠いている。

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」といわれるｓｉＲＮＡの１つの鎖は、標的転写物とハイブリダイズする部分を含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写物の領域と完全に相補性であり、すなわち、これは、約１５から約２９ヌクレオチド長の間、好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは約１８〜２０ヌクレオチド長の標的領域にわたって、単一のミスマッチまたはバルジなしで、標的転写物にハイブリダイズする。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、標的転写物の領域と実質的に相補性であり、すなわち、１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジが、アンチセンス鎖および標的転写物によって形成される二重鎖に存在してもよい。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写物のエキソン配列に標的化される。当業者は、標的転写物のためにｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズム、および／または商業的なサービスに精通している。例示的な例は、Ｒｏｓｅｔｔａ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）およびＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）である。あるいは、ｓｉＲＮＡは、当該分野において周知であるオリゴヌクレオチド合成技術を使用して、化学的に合成できる。

他の実施形態において、ＲＮＡｉ因子は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。一般的に、ｓｈＲＮＡは、ハイブリダイズされておりまたはハイブリダイズしてＲＮＡ干渉（上記のような）を媒介することが可能な少なくとも２つの相補的部分、および、二重鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分を含むＲＮＡ分子である。この構造はステム−ループ構造とも呼ばれており、ステムが二重鎖部分である。ある実施形態において、この構造の二重鎖部分は完全に相補性であり、その結果、ミスマッチまたはバルジはｓｈＲＮＡの二重鎖領域には存在しない。他の実施形態において、この構造の二重鎖部分は実質的に相補性であり、その結果、１つ以上のミスマッチまたはバルジがｓｈＲＮＡの二重鎖領域には存在する。この構造のループは、約１〜約２０ヌクレオチド長、好ましくは、約４〜約１０ヌクレオチド長、より好ましくは、約６〜約９ヌクレオチド長であり得る。ループは、標的転写物に相補性である領域の５’末端または３’末端のいずれかに位置することができる（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）。

ｓｈＲＮＡは、５’末端または３’末端に突出をさらに含むことができる。任意の突出は、約１〜約２０ヌクレオチド長、より好ましくは約２〜約１５ヌクレオチド長であり得る。ある実施形態において、突出は１つ以上のＵ残基、例えば、約１から約５個の間のＵ残基を含む。ある実施形態においては、ｓｈＲＮＡの５’末端はリン酸基を有するのに対して、他の実施形態においては、これはリン酸基を有しない。他の実施形態においては、ｓｈＲＮＡの３’末端はヒドロキシル基を有するのに対して、他の実施形態においては、これはヒドロキシル基を有しない。一般的に、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡにプロセシングされる。このように、ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡの前駆体であり、ｓｈＲＮＡの一部（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）に相補性である標的転写物の発現を阻害することが同様に可能である。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計および合成のために利用可能な資源（上記に詳述されたようなもの）に精通している。例示的な例はＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。

なお他の実施形態において、ＲＮＡｉ因子はＲＮＡｉ発現ベクターであり得る。典型的には、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ因子の細胞内（インビボ）合成のために使用される。１つの実施形態において、２つの別々の相補性ｓｉＲＮＡ鎖は、２つのプロモーターを含有する単一のベクターを使用して転写され、これらの各々は、単一のｓｉＲＮＡの転写を指向する（すなわち、各プロモーターは、転写が起こってもよいようにｓｉＲＮＡの鋳型に作動可能に連結されている）。２つのプロモーターは、同じ方向にあることができ、その場合、各々が、相補ｓｉＲＮＡ鎖のうちの１つについての鋳型に作動可能に連結されている。あるいは、２つのプロモーターは反対の方向であり得、単一の鋳型に隣接し、その結果、プロモーターの転写は２つの相補性ｓｉＲＮＡ鎖の合成を生じる。別の実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクターは、転写物がｓｈＲＮＡを形成するように、２つの相補性領域を含む単一のＲＮＡ分子の転写を推進するプロモーターを含有することができる。

当業者は、１つより多くの転写物単位の転写を介してインビボで産生されることがｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ因子にとって好ましいことを認めている。一般的に言えば、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位のインビボ発現を指向するために利用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）についてのプロモーターであってもよい。Ｕ６またはＨ１プロモーターなどの特定のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、転写領域の中で、シス作用性エレメントを必要とせず、従って、特定の実施形態にいて好ましい。他の実施形態において、Ｐｏｌ ＩＩのプロモーターは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位の発現を推進するために使用できる。ある実施形態において、組織特異的、細胞特異的、または誘導性Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用できる。

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のための鋳型を提供する構築物は、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して産生でき、真核生物細胞中での発現のために適切である広範な種々の異なるベクターのいずれかに挿入できる。組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，２００３，前出およびＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，前出において記載されている。当業者はまた、ベクターが、選択マーカー配列と同様に、さらなる制御配列（例えば、ターミネーター配列、翻訳制御配列など）を含むことができることを認めている。ＤＮＡプラスミドは当該分野で公知であり、これには、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣなどに基づくものが挙げられる。多くの発現ベクターがすでにプロモーターを含有しているので、プロモーターに関して適切な位置に関心対象のＲＮＡｉ因子をコードする核酸配列を挿入することが必要であるかもしれない。ウイルスベクターもまた、ＲＮＡｉ因子の細胞内発現を提供するために使用できる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ＴＲＣ ｓｈＲＮＡ製品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において提供されるようなものなどの、ｓｈＲＮＡレンチウイルスベースのベクターまたはレンチウイルス粒子である。

ＲＮＡｉ因子またはＲＮＡｉ発現ベクターは、当業者に周知である方法を使用して細胞に導入できる。このような技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３、前出またはＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、前出に記載されている。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクター、例えば、ウイルスベクターは、細胞のゲノムに安定に組み込まれ、その結果、引き続く細胞世代にわたって、Ｍｇａｔ１発現が破壊される。

（ｃ）部位特異的組換え
代替の実施形態において、Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、部位特異的組換え技術を使用して調製できる。例えば、部位特異的組換え技術は、関心対象の染色体配列のすべてまたは一部を欠失させるために、または関心対象の染色体配列に一塩基変異多型（ＳＮＰ）を導入するために使用できる。１つの実施形態において、関心対象の染色体配列は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換え系、Ｆｌｐ−ＦＲＴ部位特異的組換え系、またはこれらの改良型を使用して標的化される。このような組換え系は商業的に利用可能であり、これらの技術についてのさらなる教示は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，前出において見出される。

（ＩＩＩ）単純な糖型を有する組換えタンパク質を産生するための方法
単純な糖型を有する組換えタンパク質を産生するためにＭｇａｔ１欠損細胞を使用するための方法もまた提供される。単純な糖型とは、１つ以上の末端マンノース残基を含む糖型をいう。一般的に、単純な糖型は、ガラクトースおよび／またはシアル酸残基を欠いている。例示的な単純な糖型はＭａｎ５ＧｌｃＮａｃ２またはＭａｎ５である。上記に言及したように、単純な糖型を有する糖タンパク質は、Ｘ線結晶学研究のために有用である。例えば、Ｍｇａｔ１欠損細胞は、ワクチン産生のために使用できる。Ｍｇａｔ１欠損細胞は、末端マンノース残基を含有する糖タンパク質を産生する。抗原上の末端マンノース残基は、抗原提示細胞上でマンノース受容体によるその取り込みを可能にする。次いで、抗原提示細胞（すなわち、マクロファージまたは樹状細胞）は、Ｔ細胞による認識のための抗原を提示し、それによって、免疫応答を仕掛ける。末端マンノース残基を含む抗原の使用は、Ｔ細胞に対する抗原提示の効力を増強できる。加えて、末端マンノース残基のみを有する糖タンパク質は、マンノース受容体によるこれらのタンパク質の取り込みを容易にすることによって、他の治療目的のために有用であるかもしれない。

単純な糖型を有する糖タンパク質が調製できる。本開示のさらなる態様は、単純な糖型を有する組換えタンパク質を産生するための方法を包含する。この方法は、Ｍｇａｔ１が欠損している細胞株に、組換えタンパク質をコードする核酸を導入すること、および、１つ以上の末端マンノース残基を含む組換えタンパク質を発現させることを含む。Ｍｇａｔ１欠損細胞株は、セクション（Ｉ）において上記に記載されている。

Ｍｇａｔ１欠損細胞株において産生された組換え糖タンパク質は、任意の適切な糖タンパク質であり得、これには、治療タンパク質およびタンパク質生物製剤が挙げられる。例えば、組換えタンパク質は、非限定的に、抗体、抗体のフラグメント、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝血（または凝固）因子、血液成分、酵素、栄養補助タンパク質、前述のいずれかの機能的フラグメントまたは機能的改変体、または前述のタンパク質および／もしくはその機能的フラグメントもしくはその改変体のいずれかを含む融合タンパク質であり得る。例示的な実施形態において、組換え糖タンパク質はヒトタンパク質である。

組換えタンパク質を産生するための方法は当該分野で公知であり、さらなる教示はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３ 前出によって提供される。一般的に、組換えタンパク質は、外因的に導入される核酸から発現される。セクション（Ｉ）（ｅ）において上記に詳述されたように、組換えタンパク質をコードする核酸は、染色体外性であってもよく、または組換えタンパク質をコードする核酸は、ゲノムに組み込まれてもよい。

組換えタンパク質が発現されるように細胞株を培養するための方法は当該分野で公知である。適切な培地および培養系は当該分野で公知であり、商業的に利用可能である。１つの実施形態において、組換えタンパク質は、無血清懸濁培養を介して、本明細書に開示される細胞株によって産生される。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通して理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅおよびＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ａｎｄ Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、他に特定されない限り、以下の用語はこれらに基づく意味を有する。

本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「その（ｔｈｅ）」および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つ以上の要素が存在することを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する」という用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外のさらなる要素があってもよいことを意味する。

本明細書で使用される場合、「内因性配列」という用語は、細胞にとってネイティブである染色体配列をいう。

「外因性配列」という用語は、細胞にとってネイティブではない染色体配列、またはそのネイティブな位置が染色体中の異なる位置にある染色体配列をいう。

「編集」、「ゲノム編集」または「染色体編集」という用語は、それによって特定の染色体配列が変化されるプロセスをいう。編集された染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含んでもよい。

「遺伝子」とは、本明細書で使用される場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソンおよびイントロンを含む）、ならびに遺伝子産物の産生を調節するＤＮＡ領域をいい、このような調節配列は、コード配列および／または転写された配列に隣接しているか否かに関わらない。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、バウンダリーエレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域が挙げられるがこれらに限定されない。

「異種」という用語は、関心対象の細胞または種に対してネイティブではない実体をいう。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、直鎖状または環状の立体構造であり、一本鎖型または二本鎖型のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するとは解釈されない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸の部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートバックボーン）を包含できる。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対特異性を有し；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対を形成する。

「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチドアナログであってもよい。ヌクレオチドアナログとは、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドをいう。ヌクレオチドアナログは、天然に存在するヌクレオチド（例えば、イノシン）または天然に存在しないヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分の修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに、塩基の炭素原子および窒素原子の他の原子による置換（例えば、７−デアザプリン）が挙げられる。ヌクレオチドアナログにはまた、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも挙げられる。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをいうために交換可能に使用される。

「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスをいう。本開示の目的のために、「相同組換え」とは、例えば、細胞の中で二本鎖の切れ目の修復の間に起こるこのような交換の、特別な型をいう。このプロセスは、２つのポリヌクレオチド間の配列類似性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖の切れ目を受けたもの）の鋳型修復のための「ドナー」または「交換」分子を使用し、そして「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られている。なぜなら、ドナーから標的までの遺伝情報の移動に導くからである。任意の特定の理論によって束縛されるわけではないが、このような移動は、破壊された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖のミスマッチ訂正、および／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」を含むことができる。このような特定の相同組換えは、しばしば、標的分子の配列の変化を生じ、その結果、ドナーポリヌクレオチドの一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、編集される染色体配列の一部を規定し、標的エンドヌクレアーゼが認識、結合、および切断する核酸配列をいう。

「上流」または「下流」という用語は、固定された位置に対する核酸配列中の位置をいう。上流とは、その位置に対して５’（すなわち、鎖の５’末端近傍）である領域、下流とはその位置に対して３’（すなわち、鎖の３’末端近傍）である領域をいう。

核酸およびアミノ酸の配列同一性を決定するための技術は当該分野で公知である。典型的には、このような技術には、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびに、それによって、これらの配列を、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列に対して比較することが挙げられる。ゲノム配列もまた、この様式で決定および比較できる。一般的に、同一性とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の、ヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致をいう。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較できる。核酸配列であるか、アミノ酸配列であるかに関わらず、２つの配列の同一性パーセントは、より短い配列の長さによって除算し、１００を乗算した、２つの整列された配列間の正確な一致の数である。核酸配列のおよその整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用でき、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって標準化される。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは、一般的に当該分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターとともに使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用できる：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイト上で見出すことができる。本明細書に記載される配列に関して、所望の程度の配列の同一性の範囲は、およそ８０％〜１００％、およびその間の任意の値である。典型的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、および最も好ましくは９８％の配列同一性である。

本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が上記の細胞および方法において行うことができるので、上記の記載および以下に与えられる実施例に含有されるすべての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味に解釈されるべきではないことが意図される。

実施例
以下の実施例は本発明の特定の態様を例証する。

実施例１：ＺＦＮを使用する、ＣＨＯ細胞中のＭｇａｔ１の破壊
Ａ．ＺＦＮ発現ベクターおよびＭｇａｔ１に標的化されたＺＦＮ ｍＲＮＡの調製
ＺＦＮ媒介ノックアウト技術は、ＣＨＯ細胞中のＭｇａｔ１遺伝子をノックアウトまたは不活化するために利用され、それによって、末端Ｍａｎ５部分を含有する均一な単純Ｎ−グリカンプロフィールを有するタンパク質を産生する細胞を生成した。Ｍｇａｔ１遺伝子座を含有するＭｇａｔ１ゲノムコンティグ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９：７３５−７４１）は、マウス相同性を使用して注釈を付けた。ＣＨＯ Ｍｇａｔ１コード領域の中の特定の部位を標的とするＺＦＮは、独自のアルゴリズムを使用して設計した。図２Ａは、Ｍｇａｔ１における標的部位の位置を図示する。Ｍｇａｔ１における標的配列は、５’−ＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣｃｃａｇｃａＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：１；大文字のＺＦＮ結合部位および小文字の切断部位）であった。Ｍｇａｔ１ ＺＦＮ発現構築物は標準的な手順を使用して調製し、Ｍｇａｔ１ ＺＦＮ ｍＲＮＡは、ＣＯＭＰＯＺＲ（登録商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製品情報に記載されたように、インビトロ転写、ｍＲＮＡポリアデニル化、およびキャッピング方法を使用して、ＺＦＮプラスミドＤＮＡから産生された。手短に述べると、プラスミドＺＦＮ ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムＤＮＡ抽出を使用して、線状化および精製された。ＭｅｓｓａｇｅＭａｘ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ−Ｃａｐｐｅｄ Ｍｅｓｓａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．）が使用されて、線状化ＤＮＡにキャップを付した。Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）が使用されて、ポリ（Ａ）テールを付加した。ＺＦＮ ｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製された。

Ｂ．ＩｇＧ産生ＣＨＯ細胞株におけるＭｇａｔ１を標的とするＺＦＮのトランスフェクション
組換え抗狂犬病ヒトＩｇＧを発現するＣＨＯＺＮ（商標）（ＧＳ−／−）細胞（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）は、２５μＭ メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を補充したＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＨＯ ＣＤ融合培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の懸濁培養として維持された。トランスフェクションの１日前に、細胞は、バイオリアクターチューブ中に０．５×１０^６細胞／ｍＬで播種された。１５０μＬ増殖培地中１×１０^６細胞および５μｇ Ｍｇａｔ１ ＺＦＮ ＤＮＡまたはｍＲＮＡが各トランスフェクションのために使用された。トランスフェクションは、０．２ｃｍキュベット中、１４０Ｖおよび９５０μＦでのエレクトロポレーションによって行われた。エレクトロポレーションを行った細胞は、６ウェルプレート静置培養中の２ｍＬ増殖培地中に配置した。トランスフェクションの３日後および１０日後に、細胞は培養から取り出され、ゲノムＤＮＡはＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離された。ＣＯＭＰＯＺＲ（登録商標）ノックアウトＺＦＮ製品情報に記載されているようなＣｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイが、ＺＦＮ媒介遺伝子切断の効力を決定するために実行された。

図２Ｂは、ＺＦＮトランスフェクトされた（ＺＦＮプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡトランスフェクション）細胞プールにおけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示すゲルを描写する。２つの切断フラグメント、２２０および１９７ｂｐは、トランスフェクションの３日後と１０日後の両方において、ゲノムＤＮＡ消化物中に存在し、両方の時点でのポジティブなＺＦＮ活性を示した。３日目と１０日目のＺＦＮ活性は、それぞれ、８．８％および９．６％であった。両方の時点において、ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、わずかにより強いバンドを有した。時間の経過に伴う安定なＺＦＮ活性は、Ｍｇａｔ１破壊に関連する見かけの細胞毒性または増殖阻害がないことを暗示する。換言すれば、ＺＦＮ修飾細胞を超えた野生型の増殖の利点は、ＺＦＮトランスフェクト集団においては観察されなかった。

実施例２：単一細胞クローンのレクチン選択および単離
Ｍｇａｔ１ ＺＦＮトランスフェクト細胞は、破壊されたＭｇａｔ１を有する細胞について富化するために、ガラクトースを結合するがマンノースを結合しない細胞毒性レクチンであるトウゴマアグルチニン−Ｉ（ＲＣＡ−Ｉ）で一晩処理された。トランスフェクションの１４日後に、細胞のアリコートが、生存細胞について、ＦＡＣＳを使用して、単一細胞クローニングのためにプレートされた。細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および４ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＨａｍ’ｓ−Ｆ１２栄養ミックス中で、ウェルあたり１細胞でプレートされた。残りの細胞は１８日まで拡大され、次いで、Ｔ懸濁培養フラスコ（Ｃｏｒｉｎｇ）中で１×１０^６細胞／ｍＬで播種した。細胞は、増殖培地中、１０μｇ／ｍＬ最終濃度のＲＣＡ−Ｉとともに一晩インキュベートされ、次いでＰＢＳで洗浄され、増殖培地に戻された。細胞はＴフラスコまで拡大し、１０日間培養し、次いで、上記のように単一細胞クローニングのためにプレートされた、ＲＣＡ−Ｉ処理の１０日後、細胞はＺＦＮ活性についてアッセイされた。

図３は、ＲＣＡ−１富化の前後のＺＦＮトランスフェクト細胞プールにおけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示すゲルを描写する。ＲＣＡ−Ｉで選択された細胞は、約３３〜３６％のＺＦＮ活性を示し、これは非選択細胞についての３．８〜５．５％と比較され、Ｍｇａｔ１破壊細胞についての富化の成功を示した。

実施例３：分泌された組換え抗狂犬病ヒトＩｇＧの糖プロフィール
比較的高スループットのＳＥＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）／Ｑ−Ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ（商標））ワークフローが糖分析のために使用された。このワークフローは、細胞培養上清からのＩｇＧのプロテインＡ精製を利用し、続いて、インタクトなＩｇＧ重鎖構成要素の正確な質量分析を利用した。プロテインＡ精製は、９６ウェルフィルタープレートを使用し、ウェルあたり５０μｌプロテインＡ樹脂および７５０μｌクローン上清を用いて実施した。ＩｇＧは１００μｌの２５ｍＭ クエン酸、ｐＨ３．０で溶出された。質量データ分析は、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、自動化様式で実施されるデコンボリューションおよびデータ処理により実施された。糖ペプチド型は、選択されたサンプルのトリプシン消化によって確認され、ならびに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより糖ペプチドレベルで、グリカン同定および相対的分布（総グリカンの％として報告される）の検証により確認された。

分泌された組換え抗狂犬病ヒトＩｇＧの糖プロフィールは、各細胞のプールについて評価された（ＺＦＮトランスフェクトまたはモックトランスフェクト、ＲＣＡ−Ｉ選択を伴うかまたは伴わない）。ＲＣＡ−Ｉ富化プールは、ＲＣＡ−Ｉに曝露しなかった細胞と比較して、Ｍａｎ５糖型のレベルの増加を示した（図４）。モックトランスフェクト細胞は、Ｍｇａｔ１ ＺＦＮトランスフェクト細胞についての１３．７％、およびＲＣＡ−Ｉ選択を介して富化されたＺＦＮトランスフェクト細胞についての９２．８％と比較して、０．３％Ｍａｎ５を実証した。Ｇ０ＦおよびＧ１Ｆ糖型は、モックトランスフェクト細胞およびＲＣＡ−Ｉに供されなかったＺＦＮトランスフェクト細胞において最も豊富であった。

実施例４：Ｍｇａｔ１修飾単一細胞クローンの遺伝子型特徴付け
ゲノムＤＮＡは、単一細胞クローンの培養から単離された（ＩｇＧ産生または宿主ＧＳ（−／−）細胞株のいずれか）。Ｍｇａｔ１遺伝子の一部がＰＣＲによって増幅され、ＰＣＲ産物はＴＯＰＯシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールスバッド，カリフォルニア州）を使用してクローニングされた。サンプルはＤＮＡシークエンシングのために調製された。最小限１０ＴＯＰＯクローンが遺伝子型特徴付けのためにシークエンシングされた。

ＲＣＡ−Ｉ富化の存在下または非存在下でのＭｇａｔ１修飾クローンの頻度を比較するために、ＲＣＡ−Ｉを伴って、または伴わずに培養されたＺＦＮトランスフェクト細胞は、上記のように、ＦＡＣＳによって単一細胞クローニングされた。非富化プールのために、７６クローンのうちの２クローン（２．６３％）がＭｇａｔ１遺伝子における短い欠失を有した（図５および表１を参照のこと；クローン＃７３および＃９２）。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して得られた細胞溶解物からのネスト化ＰＣＲ産物の初期シークエンシングは、ＲＣＡ−Ｉ富化集団からのすべてのクローン（５２／５２）が、破壊されたＭｇａｔ１遺伝子配列を含有したことを示した。これらのクローンのシークエンシングは、２ｂｐ欠失から５５ｂｐ欠失までのＭｇａｔ１の欠失を明らかにした（図５および表１を参照のこと、クローン＃２１、＃２５、＃２７、および＃３７）。各クローンは、１つの破壊された対立遺伝子を含有し、野生型配列は検出されなかった。従って、これらの細胞の遺伝子型はＭＧＡＴ−１（−／０）およびＧＳ（−／−）である。

以下のＩｇＧ産生Ｍｇａｔ１ノックアウトクローンがさらなる特徴付けのために選択された：ＲＣＡ−Ｉ選択なしで単離された２クローン（クローン＃７３および＃９２）；野生型配列を保持したＺＦＮトランスフェクションプロセスを経由した２クローン（＃１５および＃４６）；および一定の欠失の長さの範囲を伴う４つのＲＣＡ−Ｉ選択クローン（＃２１、＃２５、＃２７、および＃３７）。これらのノックアウトクローンのいずれもＲＣＡ−Ｉに対する感受性を示さず（図６）、ＩｇＧ生産性または増殖の分布の有意な変化も観察されなかった。

実施例５：Ｍｇａｔ１ノックアウトＩｇＧ産生細胞クローンの特徴付け
分泌型組換え抗狂犬病ヒトＩｇＧの糖プロフィールは、上記に言及された単一細胞クローンの各々について評価された（本質的に、実施例３において上記に詳述されるように）。図７Ａ−Ｂは、５日目のバッチ培養における、野生型およびノックアウトクローンの糖プロフィールをそれぞれ提示し、図７Ｃ−Ｄは、８日目のバッチ培養における、野生型およびノックアウトクローンの糖プロフィールをそれぞれ示す。最も豊富なグリカン種は、Ｍｇａｔ１ノックアウトクローンにおいてＭａｎ５であったのに対して、野生型クローンは最高のＧ０Ｆピークを表示した。Ｍａｎ５％は、Ｍｇａｔ１ ノックアウトクローンにおいて有意に高かった（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定、Ｗｅｌｃｈ’ｓ補正付き）。

Ｍｇａｔ１ノックアウトクローンの増殖および生産性を分析するために、細胞は、２連で、ＴＰＰバイオリアクターチューブ中の３０ｍＬの増殖培地中、０．３×１０^６細胞／ｍｌで播種した。細胞の密度および生存度は、ＶｉＣｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定された。図８Ａ−Ｂに示されるように、Ｍｇａｔ１ノックアウト細胞クローンは、野生型Ｍｇａｔ１を有する細胞と比較して、時間の経過とともに、細胞の生存度および細胞密度によって測定されるような同じまたは改善された増殖を示した。

体積測定的なＩｇＧ生産性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ（登録商標）分析装置（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する干渉分光法によって決定された。図９に示されるように、Ｍｇａｔ１ノックアウト細胞クローンは、野生型細胞と同じか、または改善されたピーク体積測定的生産性を示した。

実施例６：ＣＨＯ宿主細胞株におけるＭｇａｔ１ノックアウトクローンの単離
生物薬剤適用のために本方法をさらに評価するために、ＺＦＮトランスフェクションおよびクローン単離が、ＣＨＯ Ｋ１ ＧＳ（−／−）宿主細胞株を使用して反復された。ＧＳ（−／−）を有する宿主細胞株（ＣＨＯＺＮ（登録商標）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、本質的に実施例１において上記に記載されるように、Ｍｇａｔ１ ＺＦＮ ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。Ｃｅｌ−１アッセイを使用するＺＦＮ活性の確認の際に、トランスフェクト細胞は、本質的に実施例２に記載されるように、０．５細胞／ウェルで限界希釈を使用して単一細胞クローニングされた。クローン性および増殖が、プレーティングの７日後と１４日後にそれぞれ顕微鏡的に確認された。これらの細胞は、さらなる選択のために、ＲＣＡ−Ｉで処理されなかった。

ＣＨＯＺＮ（登録商標）ＧＳ（−／−）宿主細胞株から生成した９０クローンのうちの５クローン（５．６％）がＭｇａｔ１破壊を含有していた。ＲＣＡ−Ｉ富化なしで生成した、これらのクローン中で同定された欠失は７〜２８ｂｐであった（表２を参照のこと）。ＩｇＧ産生クローンを用いて観察されるように、これらの親のクローンは、１つのみの破壊された対立遺伝子を有し、野生型配列が同定された。レクチン細胞毒性アッセイはＲＣＡ−Ｉを使用して実施され、ＩｇＧ産生クローンと同様に、いずれのＭｇａｔ１ノックアウトクローンについても細胞毒性は観察されなかった。

実施例７：Ｍｇａｔ１ノックアウト宿主細胞株の安定なＩｇＧ発現およびＩｇＧ糖プロファイリング
５つのＭｇａｔ１ノックアウト宿主細胞株クローン（表２に列挙）は、ヒト抗狂犬病ヒトＩｇＧコード配列および組換えハムスターＧＳ発現カセットを含有する発現ベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間前に、細胞は５×１０^５細胞／ｍＬで播種された。トランスフェクションは、３０μｇ プラスミドＤＮＡを使用して、実施例１に記載されるように、エレクトロポレーションによって行われた。エレクトロポレーションした細胞は、５ｍＬ増殖培地中、２５ｃｍ^２細胞培養フラスコの懸濁液に配置された。細胞は、トランスフェクションの４８時間後にＬ−グルタミンが欠損した培地に移され、選択が完了し（１２〜１４日間）、安定にトランスフェクトされた培養が樹立されるまで、５％ ＣＯ_２中、３７℃で培養された。別個のトランスフェクションにおいて、細胞は、マイナスグルタミン選択のために２００μＬ中で９６ウェルプレートにおいて５０００細胞／セルでプレートされ、選択の完了の際に、培養を「ミニプール」するために、２４ウェル（１ｍＬ）、２５ｃｍ^２フラスコ（５ｍＬ）、およびＴＰＰチューブ（３０ｍＬ）までスケールアップした。これらの安定な系統から、ＴＰＰ培養が、以前に記載されたのと同様に設定され、培養は、化学的に定義された栄養とともに、４日目および７日目に２ｇ／Ｌ グルコースを供給された。培養は８日目に収集され、上清は３４００ｒｐｍの遠心分離によって清澄化され、続いて、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒｅ ４メンブレン透析チューブ（ＭＷＣＯ １２ｋＤａ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）を使用して、１×ＰＢＳに対して、４℃で２４時間透析され、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で精製された。ＩｇＧは０．１ Ｍ クエン酸 ｐＨ ３．０で溶出し、画分は、１／１０体積１．０Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ ｐＨ９．０の添加によってすぐに中和された。糖プロファイリングは、本質的に実施例３に記載されるように実施された。

５つすべてのＭｇａｔ１ノックアウト宿主細胞株において産生された抗狂犬病ヒトＩｇＧは、極めて類似した糖プロフィールを実証し、Ｍａｎ５が優勢種であり、複合グリカンは検出されなかった。ＭＳ分析は、Ｍｇａｔ１ノックアウト細胞株における優性なグリカンピーク（すなわち、５０１６８−５０１７２）の、野生型細胞（すなわち、５０４００）と比較した分子量シフトを実証した。ＢＣ９およびＢＨ１「ミニプール」において産生されたＩｇＧは、それらの「バルク」選択された安定なプールに匹敵する糖プロフィールを実証した。

Claims (11)

1. マンノシル（α−１，３−）−糖タンパク質β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍｇａｔ１）およびグルタミン酸シンテターゼ（ＧＳ）が欠損している、遺伝的に改変された哺乳動物細胞株であって、Ｍｇａｔ１における欠損が、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列のコード領域における２ｂｐから２００ｂｐの欠失、欠失に加えて任意の挿入を含み、その結果、Ｍｇａｔ１をコードする染色体配列が不活化されている、遺伝的に改変された哺乳動物細胞株。
2. コード領域における欠失が
   （ａ）２ｂｐ〜５５ｂｐまでの範囲である、または
   （ｂ）１０４ｂｐの挿入によって置き換えられる１５７ｂｐの欠失を含む、
   のいずれかである、請求項１に記載の哺乳動物細胞株。
3. 染色体配列が標的エンドヌクレアーゼで不活化されている、請求項１または２に記載の哺乳動物細胞株。
4. 標的エンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項３に記載の哺乳動物細胞株。
5. 細胞株がＭｇａｔ１を産生しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株。
6. 細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株。
7. ＣＨＯ細胞株がＧＳ−／−細胞株である、請求項６に記載の哺乳動物細胞株。
8. 細胞株が１つ以上の末端マンノース残基を含む少なくとも１つの糖タンパク質を発現する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株。
9. 細胞株が、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株の増殖速度に匹敵する増殖速度を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株。
10. 細胞株が、Ｍｇａｔ１が欠損していない細胞株のタンパク質のレベルに匹敵するタンパク質のレベルを産生する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の哺乳動物細胞株。
11. １つ以上の末端マンノース残基を有する組換えタンパク質を産生するための方法であって：
    ａ）組換えタンパク質をコードする核酸を請求項１に記載の細胞株に導入すること；および
    ｂ）組換えタンパク質を発現すること
    を含む、方法。

Images