BR112014016614A2 - produção de proteínas recombinantes com glicoformas simples - Google Patents
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Abstract
produção de proteínas recombinantes com glicoformas simples. a presente invenção refere-se a linhagens celulares deficientes em manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,2-n-acetilglucosaminiltransferase i (mgat1). são também fornecidos métodos para produzir a linhagem celular deficiente em mga1 e métodos para usar a linhagem celular deficiente em mgat1 para a produção de proteínas recombinantes, tendo glicoformas simples.
Description
"PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES COM GLICOFORMAS SIMPLES". Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a proteínas recombinantes com glicoformas simples. Em particular, a presente invenção refere-se às composições e métodos para a produção de glicoproteínas recom- binantes, tendo um ou mais resíduos de manose terminal. Antecedentes da Invenção
[002] Glicosilação N-lig é uma modificação de proteína comum encontrada em muitas glicoproteínas secretadas e membrana-limite. A síntese de complexos glicoformas requer uma série de reações enzi- máticas, realizadas de forma faseada no retículo endoplasmático e aparelho de Golgi das células eucarióticas. Enquanto a maioria das proteínas recombinantes terapêuticas exige a presença dos glicanos complexos para evitar a imunogenicidade e melhorar a meia vida da proteína, pedidos de glicoproteínas com estruturas simples de N- glicano também existem. Por exemplo, proteínas recombinantes com glicoformas simples são vantajosas para estudos de cristalografia de raios x. Além disso, glicoformas simples, com apenas os resíduos de manose terminal podem levar a maior eficácia de algumas terapêuti- cas, facilitando a absorção mediada por receptores de manose para estas proteínas.
[003] A maioria das linhagens de células usadas para a produção de glicoproteínas terapêuticas produzem proteínas com glicoformas N- lig heterogêneos ou complexos, no entanto. Assim, há uma necessida- de de linhagens de células que são projetados para produzir recombi- nantes glicoproteínas com glicoformas simples. Além disso, é desejável que estas linhas de célula projetada estável produzam proteínas com resíduos de manose terminal, mantendo a proteína alta produtividade e crescimento robusto em meios de cultura quimicamente definida.
Sumário
[004] Entre os vários aspectos da divulgação presente é a pres- tação de uma linhagem de células deficiente em manose (alfa-1,3-)- glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferase | (Mgat1i). Em uma modalidade, a linhagem de células deficiente em Mgat1 não pro- duz nenhuma proteína de Mgat1. Em outra modalidade, a linhagem de células deficiente em Mgat1 produz uma quantidade reduzida de prote- ínas Mgat1 em relação à linhagem de células parental que não é defi- ciente em Mgat1. Em uma modalidade, a linhagem de células deficien- te de Mgat1 é composta por uma sequência cromossômica inativada codificação Mgat1. A sequência cromossômica codificação Mgat1 po- de ser inativada com uma endonuclease de direcionamento. Em de- terminadas modalidades, o direcionamento endonuclease é seleciona- do uma nuclease dedo de zinco, uma nuclease efetoras como ativador de transcrição (TALEN), um meganuclease e uma endonuclease de local específico. Em uma modalidade, o direcionamento endonuclease é uma nuclease dedo de zinco. A sequência cromossômica codifican- do Mgat1 é inativada devido a uma exclusão de pelo menos um par de bases, uma inserção pelo menos um par de bases, uma substituição pelo menos um par de bases, ou suas combinações. Em determinadas modalidade, a sequência cromossômica codificação Mgat1 é inativada devido a uma exclusão de 2-55 pares de bases. Em uma modalidade da célula linha deficiente em Mgat1 também é deficiente em glutamina sintaxe (GS), di-hidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina fos- foribosiltransferase (HPRT) ou uma combinação destes. Em outra mo- dalidade, a linhagem de células deficiente de Mgat1 é uma linhagem de células CHO. Em uma modalidade, a linhagem de células deficiente em Mgat1 é uma linhagem de células CHO em que a única cópia da sequência cromossômica que codifica Mgat1 é inativada Mgat1 é inati- vada por um apagamento e a linhagem de células não produz Mgat1.
Em outra modalidade, a linhagem de células deficiente em Mgat1 é uma linhagem de células de GS -/- CHO, em que a única sequência cromossómica que codifica Mgat1 é inativada por apagamento e a li- nha celular não produz Mgat1. Em uma modalidade a linhagem de cé- lulas deficiente de Mgat1 expressa pelo menos uma glicoproteína ten- do um glicoforma simples, em que o glicoforma simples é composto por um ou mais resíduos de manose terminal. Em uma modalidade, a linhagem de células deficiente de Mgat1 tem uma taxa de crescimento comparável a uma linhagem de células sem deficiência alguma em Mgat1. Em uma modalidade, a linhagem de células deficiente em Mgat1i produz um nível de proteína comparável a uma linhagem de células sem deficiência alguma em Mgat1.
[005] Outro aspecto da divulgação engloba um método para pro- duzir uma célula deficiente em Mgat1. Método que compreende trans- fecção de uma célula hospedeira com uma endonuclease de direcio- namento que tem como alvo uma sequência específica em uma se- quência cromossômica codificando Mgat1. A endonuclease de direcio- namento pode ser uma nuclease dedo de zinco, uma nuclease efeto- ras como ativador de transcrição (TALEN), um meganuclease ou uma endonuclease de sítio específico. Em uma modalidade o direciona- mento de endonuclease é uma nuclease dedo de zinco. Em uma mo- dalidade, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Em outra modalidade a célula hospedeira também é deficiente em glutamina sin- taxe (GS), di-hidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina fosfo- ribosiltransferase (HPRT) ou uma combinação destes. Em uma moda- lidade, a célula hospedeira é uma célula CHO. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de GS -/- CHO. Em uma modalidade, a célula hospedeira transfectada é incubada com Ricinus communis a- glutinina-| (RCA-l).
[006] Ainda outro aspecto da divulgação presente é um método para produzir uma proteína recombinante, tendo um ou mais resíduos de manose terminal. O método que compreende a introdução de um ácido nucleico codificando a proteína recombinante em uma linhagem de células, em que todas as sequências cromossômicas codificação Mgat1 são inativadas tal que a linha celular produz sem Mgat1 e ex- pressando a proteína recombinante. Em uma modalidade, a sequência cromossômica codificação Mgat1i é inativada por uma endonuclease de direcionamento escolhido de uma nuclease dedo de zinco, uma transcrição de nuclease de fusão de efetores semelhante (TALEN), um meganuclease e uma endonuclease de local específico. Em uma mo- dalidade, o direcionamento endonuclease é uma nuclease dedo de zinco. Em uma modalidade, a sequência cromossômica codificando Mgat1i compreende uma exclusão de 2-55 pares de bases. Em uma modalidade, a linhagem de células que não produz Mgat1 é uma linha de células CHO. Em outra encarnação, a linhagem de células que pro- duz não Mgat1 é uma linhagem de células GS -/- CHO. Em uma en- carnação, a proteína recombinante expressa tem um glicoforma sim- ples, composto por um ou mais resíduos de manose terminal.
[007] Outros aspectos e iterações da divulgação são descritas mais detalhadamente abaixo. Breve Descrição das Figuras
[008] A Figura 1 é um diagrama esquemático mostrando o papel de Mgat1 na síntese de N-glicano. O Mgat1 catalisa a transferência de um resíduo de GIcNAc para uma glicoforma Man5GIcNAc2 (Man5).
[009] A Figura 2 ilustra o projeto e a validação de direcionamento de nucleases dedo de zinco (ZFNs) Mgat1. (A) Apresenta uma moda- lidade esquemática da posição que ZFNs são projetados para ligar e cortar na região de codificação Mgat1. (B) mostra a validação da ativi- dade ZFN por um ensaio de nuclease celular. Digestões de DNA ge- nômico são mostradas no dia 3 e no dia 10 pós-transfecção de células transfectadas simuladas, células transfectadas com DNA e células transfectadas com RNA. Dois fragmentos de DNA, 220 e 197pb, estão presentes em ambos os dias 3 e dia 10 digere após a transfecção.
[0010] A Figura 3 apresenta a análise de células antes e depois do enriquecimento RCA-l. São mostrados DNA genômicos digeridos de células transfectadas com DNA ou RNA, antes e depois da RCA-I en- riquecimento, bem como células transfectadas simuladas. A percenta- gem modificada, conforme determinado pela densitometria, está lista- da em cada faixa.
[0011] A Figura 4 mostra os glicoperfis de IG de Mgat1 ZFN de transfectadas células com ou sem RCA-l enriquecimento. (A) apresen- ta a porcentagem de cada glicoforma (Man5, GO, GOF, G1 F e G2F) em IgGs produzida pelas células transfectadas simuladas, células transfectadas com ZFN DNA ou RNA sem RCA-lI seleção e células transfectadas com ZFN DNA ou RNA com RCA-l seleção. (B) os dia- gramas da estrutura de cada glicoforma que foi analisada.
[0012] A Figura 5 apresenta os genótipos de Mgat1 interrompidos IgG produzindo clones. É mostrado o alinhamento da sequência das seguintes linhas de célula: sua não transfectadas de tipo selvagem (wt); dois clones do tipo selvagem (f15, t46) que foram submetidos ao transfecção ZFN e isolamento de clone; duas linhagens de células Mgat1 rompidas selecionadas sem RCA-l (473, f192) e linhagens de células rompidas selecionados na presença de RCA-I (t21, %25, f27, 37). A área sombreada marca o corte local ZFN.
[0013] A Figura 6 ilustra a insensibilidade dos clones de nocaute Mgat1 para RCA-l. A densidade de células viáveis de pico é plotado em culturas de lote do tipo selvagem (wt, %15, tft46) e Mgat1 clones de nocaute (t%73, 92 H, ft21, tt25, tHt27, H37) quando cultivado na ausência ou presença de RCA-Il.
[0014] A Figura 7 mostra o glicoperfil de IgG do tipo selvagem e
Mgat1 IgG clones de produção de nocaute. (A) mostra as percenta- gens da glicoformas diferentes em amostras IgG colhidas no dia 5 de não transfectadas (wt) e dois clones do tipo selvagem (ft15, *46). (B) apresenta as percentagens de diferentes glicoformas de glicoformas em amostras IgG colhidas no dia 5 de seis clones de nocaute Mgat1 (H73, 92, H21, tHt25, t127, 437). (C) apresenta as percentagens de dife- rentes glicoformas de IgG de amostras colhidas no dia 08 de clones do tipo selvagem. (D) apresenta as percentagens de diferentes glicofor- mas de IgG de amostras colhidas no dia 8 de seis clones de nocaute Mgat1. ND = não detectado.
[0015] A Figura 8 ilustra o crescimento de tipo selvagem e clones de nocaute Mgat1 ao longo do tempo. (A) apresenta a percentagem de células viáveis no tipo selvagem (wt, 115, tt46) e Mgat1 clones de no- caute (*%73, f192, 121, tt25, H127, f37) por mais de 13 dias em cultura de lote. (B) mostra a densidade de células viáveis nas culturas de lote de tipo selvagem e seis Mgat1 clones de nocaute por mais de 13 dias.
[0016] A Figura 9 mostra a produtividade de IgG do tipo selvagem e clones de nocaute. Mgat1. A produtividade volumétrica de pico no tipo selvagem é plotadas (wt, ft15, 446) e os clones de nocaute (tt73, 492, t21, H25, 127, 437) Mgat1. Descrição Detalhada da Invenção
[0017] A presente divulgação fornece composições e métodos pa- ra a produção de proteínas recombinantes, tendo glicoformas simples, em que uma simples glicoforma é composta por um ou mais resíduos de manose terminal. Em particular, a presente divulgação fornece |i- nhagens de células deficientes em manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1, 2-N-acetilglucosaminiltransferase | (Mgat1). Em algumas mo- dalidades, a linhagem de células deficiente de Mgat1 é composta por uma sequência cromossômica inativada ou eliminada codificando Mgat1, tal que a linha celular não produz Mgat1. Como consequência,
a linha celular produz glicoproteínas tendo um ou mais resíduos de manose terminal. As linhas de célula deficientes Mgat1 divulgadas neste documento são úteis para a produção de vacinas porque glico- proteínas com resíduos de manose terminal facilitam absorção media- da por receptores de manose. Além disso, glicoproteínas com glico- formas simples são úteis para estudos de cristalografia de raios x. A- lém disso, as células de Mgat1 deficientes divulgadas neste documen- to evitam potenciais preocupações regulamentares associadas com a mutagênese química aleatória e mantêm características de crescimen- to e de produtividade que são comparáveis das linhas de célula paren- tal.
[0018] A presente divulgação também fornece métodos para pre- parar as células deficientes Mgat1. Por exemplo, as células deficientes em Mgat1 podem ser preparadas usando as endonucleases direcio- namentos para inativar as sequências cromossômicas de codificação Mgat1. São também fornecidos métodos para a produção de glicopro- teínas recombinantes com glicoformas simples usando as células defi- cientes Mgat1 divulgadas neste documento. Linhagens de células deficientes em Mgat1 Propriedades da linhagem de células
[0019] Um aspecto da divulgação presente engloba linhagens de células deficientes em Mgat1. Mgat1 é também conhecido como N- acetilglucosaminiltransferase | (GlIcAc-Tl ou GnTI) ou N-glicosil- oligossacarídeo-glicoproteína N-acetilglucosaminiltransferase |. Mgat1 catalisa a transferência de N-acetilglicosamina (GIcNAc) para o núcleo oligomanose (ou seja, Man5GIcNAc2 (Man5) metade) de um crescente N-glicano (ver figura 1).
[0020] Em algumas modalidades, a linhagem de células deficiente de Mgat1 reduziu os níveis de Mgat1 em relação à linhagem de células parental. Por exemplo, os níveis de Mgat1 na linhagem de células de-
ficiente de Mgat1 podem ser reduzidos de cerca de 5% a cerca de 10%, de cerca de 10% a 20%, de cerca de 20% a cerca de 30%, de cerca de 30% a cerca de 40%, de cerca de 40% a cerca de 50%, de cerca de 50% a cerca de 60%, de cerca de 60% a cerca de 70%, de cerca de 70% a cerca de 80%, de cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 99,9% em relação à linhagem de células pa- rentais que não é deficiente em Mgat1. Em outras modalidades, a li- nhagem de células deficiente de Mgat1 produz essencialmente ne- nhum Mgat1. Como usado aqui, o termo "essencialmente nenhum Mgat1" significa que nenhum Mgat1 mRNA e/ou proteínas podem ser detectados nas linhagens de células deficientes em Mgat1 ou lisatos derivados delas usando procedimentos conhecidos na técnica. Exem- plos não limitados de procedimentos adequados para a determinação do nível de MRNA ou proteína incluem PCR, qPCR, Western blotting e ensaio ELISA.
[0021] As linhas de célula deficientes em Mgat1 produzem glico- proteínas com glicoformas simples. Uma simples glicoforma se refere a uma glicoforma composta por um ou mais resíduos de manose ter- minal. Em geral, uma simples glicoforma é desprovida de resíduos de galactose e/ou ácido siálico. Uma glicoforma simples exemplar é Man5GlcNac2 ou Man5. Em algumas modalidades, as linhagens de células deficientes em Mgat1 podem produzir glicoproteínas em que aumentam os níveis de resíduos de manose terminal de cerca de 1,1 vezes a cerca de 3 vezes, de cerca de 3 vezes a cerca de 10 vezes, de cerca de 10 vezes a cerca 30 vezes, de 30 vezes a cerca de 100 vezes, ou mais do que cerca de 100 vezes. Em outras modalidades, a linhagem de células deficiente de Mgat1 pode produzir glicoproteínas no qual os níveis de resíduos terminais de galactose e/ou ácido siálico são diminuídos de cerca de 1,1 vezes a aproximadamente 3 vezes, de aproximadamente 3 vezes a aproximadamente 10 vezes, de aproxi-
madamente 10 vezes a aproximadamente 30 vezes, de aproximada- mente 30 vezes a 100 vezes, ou mais do que aproximadamente 100 vezes.
[0022] A linhagem de células deficiente Mgat1 tem níveis de pro- dução de proteína ou de produtividade que são comparáveis a linhas celulares que não são deficientes em Mgat1. Como usado aqui, "pro- dução de proteína comparável" significa que a linha celular deficiente produz cerca de mesmo nível ou mais proteína do que linhagem de células que não são deficientes em Mgat1. A produtividade de proteína pode ser quantificada, determinando a quantidade de proteína produ- zida por unidade de volume (ou seja, produtividade volumétrica de pi- co). Em algumas modalidades, a quantidade de proteína produzida pelas linhagens de células deficientes em Mgat1 pode variar em + 10% em relação ao que produziu por linhas celulares que não são deficien- tes em Mgat1. Em outras modalidades, a quantidade de proteína pro- duzida pelas linhagens de células deficientes em Mgat1 pode ser au- mentada de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, de a- proximadamente 20% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 40% ou de aproximadamente 40% a aproxi- madamente 50% em relação ao que produziu por linhas celulares que não são deficientes em Mgat1.
[0023] A linhagem de células deficiente em Mgat1 a ter taxas de crescimento que são comparáveis a linhagens de células que não são deficientes em Mgat1. Como usado aqui, "taxas de crescimento com- paráveis" referem-se às taxas de crescimento que são aumentadas em relação à linhagem de células que não é deficiente em Mgat1 ou dimi- nuída por menos de cerca de 50% em relação à linhagem de células que não é deficiente em Mgat1. Taxas de crescimento podem ser quantificadas pela determinação da percentagem de células viáveis ou o número de células viáveis por unidade de volume (ou seja, densida-
de de células viáveis) após um determinado período de tempo em cul- tura. Em algumas modalidades, as linhagens de células deficientes em Mgat1i aumentaram taxas de crescimento em relação à linhagem de células que não são deficientes em Mgat1. Por exemplo, a percenta- gem de células viáveis ou densidade de células viáveis na linha celular deficiente pode ser aumentada de aproximadamente 1% a aproxima- damente 10%, passando de aproximadamente 10% a aproximada- mente 30%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%, ou mais de 100% em relação à linhagem de células que não é deficiente em Mgat1 o Mgat1. Em outras modalidades, a percentagem de células viáveis ou densidade de células viáveis nas linhagens de células deficiente de Mgat1i pode diminuir de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, passando de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 50% em relação à li- nhagem de células que não é deficiente em Mgat1.
[0024] As linhagens de células deficientes em Mgat1 divulgadas neste documento têm fenótipos estáveis. Por exemplo, as linhagens de células deficientes em Mgat1 produzem glicoproteínas com glico- formas simples por longos períodos de tempo e/ou ao longo de inúme- ras gerações de célula. Dito de outra forma, a linhagens de células di- vulgadas neste documento não são revertidas para a produção de gli- coproteínas com glicoformas complexas. Além disso, as linhas de cé- lula deficientes em Mgat1 mantêm altos níveis de produtividade de proteína e taxas de crescimento excelente por longos períodos de tempo e/ou ao longo de gerações de célula inumeráveis. (b) Sequência cromossômica inativada codificando Mgat1
[0025] Em algumas modalidades, a linhagem de células deficiente em Mgat1i compreende uma sequência codificada cromossômica inati- vada Mgat1. Por exemplo, o genoma da linhagem de células pode ser editado para inativar a sequência cromossômica codificando Mgat1. Como usado aqui, o termo "sequência cromossômica inativada" refere- se a uma sequência cromossômica que é incapaz de gerar um produto de proteína. Nas modalidades em que a linhagem de células é com- posta por células euploide, a sequência cromossômica inativada codi- ficando Mgat1 pode ser monoalélicos tal que a linha celular produz re- dução dos níveis de Mgat1. Em outras modalidades em que a linha celular compreende células euploides, a sequência cromossômica ina- tivada codificando Mgat1 pode ser bialélica, tal que a linha celular pro- duz sem Mgat1. Em outras modalidades em que a linha celular é a- neuploide, uma ou mais cópias das sequências cromossômicas de co- dificação do Mgat1 podem ser inativadas, tal que a célula produza uma quantidade reduzida de Mgat1. Em outras modalidades ainda, em que a linha celular é aneuploide, todas as cópias das sequências cromos- sômicas de codificação do Mgat1 o podem ser inativadas tal que a li- nha celular produz sem Mgat1. Em uma modalidade exemplar, a linha celular é haploide para a sequência codificada cromossômica Mgat1 e sequência codificada cromossômica inativada Mgat1 resulta em uma perda completa de expressão de Mgat1.
[0026] A sequência cromossômica inativada codificando o Mgat1 pode ser inativada por uma exclusão pelo menos um par de bases (pb), uma inserção pelo menos um pb, uma substituição de pelo me- nos um pb, ou suas combinações. Como consequência a inserção(s) de apagamento(s), e/ou substituição(s), a sequência de código Mgat1 sofre uma mudança no quadro de leitura, evitando assim que a produ- ção de um produto de proteína. A sequência cromossômica codifica- ção Mgat1 pode ser inativada usando segmentação genoma mediada por endonuclease edição tecnologia, conforme detalhado abaixo, na seção (Il). Em várias modalidades, a sequência cromossômica inativa- da codificando Mgat1 pode ser inativada pela exclusão de toda ou par-
te da região de codificação exônica, exclusão de todo ou parte de uma região de controle e/ou exclusão de um sítio de restrição tal que seja abolida a expressão de Mgat1. Em outras modalidades, a sequência cromossômica codificada Mgat1 pode ser inativada via deleções, in- serções, e/ou substituições de nucleotídeos para introduzir um códon de parada prematuro, novos sítio de restrição, e/ou SNPs na sequên- cia cromossômica, tal qual a linhagem de células é incapaz de produzir Mgat1.
[0027] Em uma, a linhagem de células deficiente de Mgat1 com- preende uma exclusão que variam de aproximadamente 1 pb para to- da a região sequência cromossômica inativada codificando Mgat1. Em outra modalidade, a linhagem de células deficiente de Mgat1 que compreende uma exclusão que varia de aproximadamente 2 pb a a- proximadamente 55 pb, de aproximadamente 55 pb a aproximadamen- te 100 pb, de aproximadamente 100 pb a aproximadamente 300 pb, de aproximadamente 300 pb a aproximadamente 600 pb, de aproxima- damente 600 pb sobre 1200 pb, ou de mais aproximadamente 1200 pb de codificação da região Mgat1. Em modalidades exemplares, a linha- gem de células deficiente de Mgat1 compreende uma exclusão de 2 pb, 4 pb, 7 pb, 10 pb, 18 pb, 24 pb, 28 pb, ou 55 pb da sequência cro- mossômica codificação Mgat1. Em outra modalidade exemplar, a li- nhagem de células deficiente de Mgat1 que compreende uma exclu- são de 157 pb que é substituída por uma inserção de 104 pb da se- quência cromossômica inativada codificação Mgat1. (c) Deficiências adicionais opcionais
[0028] Em algumas modalidades, a linhagem de células deficiente em Mgat1i compreende também uma deficiência em glutamina sintaxe (GS), di-hidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina Fosforibo- siltransferase (HPRT) ou suas combinações. A deficiência na GS, DH- FR, e/ou HPRT pode estar ocorrendo naturalmente. Alternativamente,
pode ser projetada a deficiência na GS, DHFR, e/ou HPRT. Por exem- plo, a célula pode ser deficiente em GS, DHFR ou HPRT porque a cé- lula compreende uma sequência cromossômica inativada codificação GS, DHFR ou HPRT, respectivamente. Em algumas modalidades, a(s) sequência(s) cromossômica(s) codificando GS, DHFR ou HPRT pode ser inativado por segmentação de genoma mediada por endonuclea- ses de edição. Em modalidades exemplares, todas as cópias da(s) se- quência(s) cromossômica(s) codificando GS, DHFR ou HPRT são ina- tivadas tal que as linhas de célula não produzem nenhum GS, DHFR ou HPRT, respectivamente. Em uma modalidade exemplar, a linhagem de células deficiente de Mgat1 é GS -/-. (d) Tipos de linhagem de células
[0029] O tipo de linhagem de células que é deficiente em Mgat1 pode variar. A linhagem de células pode ser uma linhagem de células humana, uma linhagem de células de mamíferos não humanos, uma linhagem de células de vertebrados não mamíferos, uma linhagem de células de invertebrados ou uma linhagem de celular de levedura.
[0030] Exemplos não limitantes de linhagem de células de mamiífe- ros adequadas são exemplos que incluem células de ovário de hams- ter chinês (CHO), células de rim hamster de bebê (BHK); mieloma das células de camundongo NSO, fibroblastos embrionários de camundon- go 3T3 (NIH3T3), as células do linfoma de camundongo A20 B; células de melanoma de camundongo B16; células de mioblasto de camun- dongo C2C12; células de SP2/0 do mieloma múltiplo; rato mesenqui- mais C3H-10T1/2 as células embrionárias; células de carcinoma CT26 de rato, rato células DuCuP da próstata; células de mama EMTG6 rato; células de hepatoma de camundongo Hepa1cic7; células de mieloma de camundongo J5582; células epiteliais de camundongo MTD-1A; células do miocárdio de camundongo MyEnd; células renais de ca- mundongo RenCa; células pancreáticas de camundongo RIN-5F célu-
las de melanoma de camundongo x64; células do linfoma de camun- dongo YAC-1; células do glioblastoma de camundongo 9L; células RBL do rato B linfoma; células de neuroblastoma B35 rato; células de hepatoma de camundongo (HTC); células hepáticas de rato do tipo búfalo 3A BRL; células de rim canino (MDCK); células mamárias cani- nas (CMT); células de osteossarcoma de camundongo D17; células de monócitos/macrófagos de camundongo DH82; células de fibroblastos transformadas de rim de macaco SV-40 (COS7); células de rim de macacoCVl-76; células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de rim humano embrionário (HEK293, HEK293T); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); células humanas de os- teossarcoma U2-OS, células humanas A549, células humanas A-431 e células humanas K562. Uma extensa lista de linhagens de células de mamíferos pode ser encontrada no catálogo American Type Culture Collection (ATCC, Mamassas, VA).
[0031] Exemplos de linhagem de células adequada de não mamí- feros incluem, mas não estão limitados a, linhagem de células de Xe- nopus (tais como S3, XTC, BB7, ff-2, 0/15 e 15/40); linhagem de célu- las de peixe paulistinha (por exemplo, ZF4, PAC?2 etc.); linhagem de células de insetos (tais como SF9, S2 e similares); e linhagem de célu- las de levedura como linhagem de células de Pichia e linhagem de cé- lulas de Saccharomyces.
[0032] Em modalidades exemplares, a linhagem de células é um tipo que é amplamente utilizado para a produção de proteínas recom- binantes, tais como anticorpos, glicoproteínas e afins. Em modalidades exemplares, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO. Numerosas linhagens de células CHO estão disponíveis ATCC. Linha- gens de células CHO apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, células CHO-K1 e seus derivados.
(e) Ácido nucleico opcional
[0033] Em algumas modalidades, a linhagem de células deficiente de Mgat1 pode incluir ainda pelo menos uma sequência de ácido nu- cléico, codificação de uma proteína recombinante. Em geral, a proteí- na recombinante é heteróloga, significando que a proteína não é nativa para a célula. A proteína recombinante pode ser, sem limite, um anti- corpo, um fragmento de um anticorpo, um anticorpo monocilonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, um an- ticorpo quimérico, uma molécula de IgG, uma pesada corrente de IgG, uma cadeia leve de IgG, uma molécula de IgA, uma molécula de |gD, uma molécula de IgE, uma molécula de IgM, uma vacina, um fator de crescimento, uma citosina, um interferon, uma interleucina, um hormô- nio, um fator de coagulação (ou coagulação), um componente do san- gue, uma enzima, uma proteína terapêutica, uma proteína de nutra- cêuticos, um fragmento funcional ou variante funcional de qualquer renúncia, ou uma proteína de fusão composto por qualquer uma das proteínas acima e/ou fragmentos funcionais ou suas variantes.
[0034] Em algumas modalidades, a sequência codificada do ácido nucleico da proteína recombinante pode estar ligada a uma sequência codificada do ácido nucleico hipoxantina-guanina fosforibosiltransfera- se (HPRT), di-hidrofolato redutase (DHFR), e/ou glutamina sintaxe (GS), tal que HPRT, DHFR, e/ou GS podem ser usados como um marcador selecionável ampliável.
[0035] Em algumas modalidades, a sequência codificada do ácido nucleico da proteína recombinante pode ser extracromossômica. Ou seja, a codificação da proteína recombinante de ácidos nucleicos pode ser transitoriamente expressa de um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial, um minicromossoma ou outro construto extra- cromossomal. A construção da expressão pode incluir sequências de controle de expressão adicional (por exemplo, sequências de realça-
dor, Kozak sequências Kozak, sequências de poliadenilação, sequên- cias de terminação transcricional, etc.), sequências de marcador sele- cionável (por exemplo, genes de resistência a antibióticos), origens de replicação e afins. Informações adicionais podem ser encontradas em "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 ou "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY, 3º Edição, 2001.
[0036] Em outras modalidades, a sequência codificada do ácido nucleico da proteína recombinante pode ser cromossomicamente inte- grada no genoma da célula. Nesse sentido, a proteína recombinante pode ser expressa de forma estável. Em algumas iterações desta mo- dalidade, a sequência codificada do ácido nucleico da proteína recom- binante pode estar ligada operacionalmente a uma sequência de con- trole adequada da expressão heteróloga (ou seja, promotor). Em ou- tras iterações, a sequência codificada do ácido nucleico da proteína recombinante pode ser colocada sob o controle de uma sequência de controle de expressão endógena. A sequência codificada do ácido nu- cleico da proteína recombinante pode ser integrada no genoma da |i- nha de células usando a recombinação homóloga, mediada por endo- nuclease genoma edição, vetores virais, plasmídeos, transposons e outros meios conhecidos de direcionamento. Orientação adicional po- de ser encontrada em Ausubel et al 2003, supra e Sambrook & Rus- sell, 2001, supra. (f) Modalidades exemplares
[0037] Em uma modalidade exemplar, a linhagem de células é uma linhagem de células CHO em que a única cópia da sequência de codificação cromossômica Mgat1 é inativada (ou seja, o genótipo da célula é Mgat1-/0). Em outra modalidade exemplar, a célula é uma li- nhagem de células GS -/- CHO em que a única cópia da sequência de codificação cromossômica Mgat1 é inativada (ou seja, o genótipo da célula é GS -/-, Mgat1 -/0). Em geral, a sequência de codificação cro- mossômica Mgat1 é inativada por uma exclusão de parte da sequência de codificação. (Il) Métodos para a preparação de linhagem de células deficientes em Mgat1
[0038] As linhagens de células deficientes em Mgat1 podem ser preparadas por uma variedade de métodos. Em determinadas modali- dades, a linhagem de células deficiente em Mgat1 pode ser preparada por um direcionamento endonuclease mediada por genoma, processo de edição. Em outras modalidades, a linhagem de células deficiente em Mgat1 pode ser preparada por métodos RNAi, mutagênese aleató- ria, sistemas de recombinação de sítio específico ou outros métodos conhecidos na técnica.
[0039] As linhagens de células deficientes em Mgat1i produzem glicoproteínas tendo um ou mais resíduos de manose terminal. Em modalidades adicionais, as linhas de celular deficiente de Mgat1 po- dem ser ainda mais enriquecidas pela incubação com Ricinus commu- nis aglutinina-| (RCA-I). RCA-I é uma lecitina citotóxica que não se liga a resíduos de manose terminal e, portanto, permite a seleção de célu- las desprovidas de atividade Mgat1 porque tais células produzem gli- coproteínas com resíduos de manose terminal. Direcionamento de genoma mediado por endonuclease
[0040] O direcionamento de endonucleases pode ser usado para editar (ou seja, desativar ou modificar) uma sequência cromossômica específica. Uma sequência cromossômica específica pode ser inativa- da introduzindo em uma célula, um direcionamento endonuclease ou um ácido nucleico a endonuclease direcionada, que é projetada para atingir uma sequência cromossômica específica de codificação. Em uma modalidade, a endonuclease direcionamento reconhece e vincula a sequência cromossômica específica e introduz uma pausa de dupla- hélice que é reparada por um processo de reparação de (NHEJ) jun- ção de extremidade não homóloga. Porque NHEJ é propenso a erros, pode ocorrer um apagamento, inserção e/ou substituição de pelo me- nos um nucleotídeo, rompendo, assim, o quadro de leitura da sequên- cia cromossômica tal que nenhum produto de proteína é produzido. Em outra modalidade, as endonucleases direcionadoras também po- dem ser usadas para editar uma sequência cromossômica através de uma reação via recombinação homóloga cointroduzindo um polinu- cleotídeo que tem identidade de sequências substancial com uma por- ção da sequência alvo cromossômica. A ruptura de dupla-hélice intro- duzida pelo direcionamento endonuclease é reparada por um processo de reparação por uma homologia dirigida tal que a sequência cromos- sômica é trocada com o polinucleotídeo de uma forma que resulta na sequência cromossômica sendo editada.
Endonucleases direcionadas
[0041] Uma variedade de endonucleases direcionadas pode ser usada para editar a sequência cromossômica. A endonuclease dire- cionada pode ser uma proteína natural ou uma proteína engenharia. Em uma modalidade, a endonuclease direcionada pode ser uma me- ganuclease. Meganucleases são caracterizadas por longas sequên- cias de reconhecimento, ou seja, de endodeoxiribonucleases, a se- quência de reconhecimento geralmente varia de cerca de 12 pares de bases de cerca de 40 pares de bases. Como consequência desta exi- gência, a sequência de reconhecimento geralmente ocorre apenas uma vez em qualquer determinado genoma. Entre meganucleases, a família de endonucleases de habitação chamada LAGLIDADG tornou- se uma ferramenta valiosa para o estudo de genomas e genoma de engenharia. Una meganuclease pode ser direcionada para uma se- quência cromossômica específica, modificando sua sequência de re-
conhecimento usando técnicas bem conhecidas para aqueles versa- dos na técnica.
[0042] Em outra modalidade, a endonuclease direcionada pode ser uma nuclease de transcrição ativadora como efetoras (TALE). TA- LE são fatores de transcrição do patógeno vegetal Xantomonas que podem ser facilmente projetados para vincular novos alvos de DNA. TALE ou truncadas versões respectivas podem estar ligadas ao domí- nio catalítico de endonucleases tais como Fokl para criar a endonucle- ase direcionada chamada nucleases TALE ou TALENs (Sanjana et al, 2012, Nat Protoc, 7(1):171 -192).
[0043] Em outra modalidade, a endonuclease direcionada pode ser uma endonuclease sítio-específica Em particular, a endonuclease sítio-específica pode ser uma endonuclease de corte raro, cuja se- quência de reconhecimento raramente ocorre em um genoma. Geral- mente, a sequência de reconhecimento da endonuclease sítio- específica ocorre somente uma vez em um genoma. Em uma modali- dade mais alternativa, a endonuclease direcionada pode ser um DNA alvo artificial de agente indutor de fita dupla de intervalo.
[0044] Em modalidades exemplares, a endonuclease direcionada pode ser uma nuclease de dedo de zinco (ZFN). Normalmente, um ZFN compreende um domínio de ligação do DNA (isto é, dedos de zinco) e um domínio de clivagem (ou seja, nuclease), ambos os quais são descritos abaixo.
[0045] Domínio de ligação dedo de zinco. Domínios de ligação de dedo de zinco podem ser projetados para reconhecer e ligar a qual- quer sequência de ácido nucléico de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:41 1-416; Zhang et al. (2000) J. Biol.
Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat.
Biotechnol. 26:702-708; e Santiago et al. (2008) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 105:5809-5814. Um domínio de ligação do dedo de zinco projetado pode ter uma especificidade de ligação nova comparada a uma proteí- na do dedo do zinco naturalmente.
Métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a, projeto racional e vários tipos de seleção.
Projeto racional inclui, por exemplo, usando bancos de dados compre- endendo duplos, triplos, e/ou sequências de nucleotídeos quádruplos e sequências de aminoácidos do dedo do zinco individuais, na qual cada sequência nucleotídica dupla, tripla ou quádrupla está associada uma ou mais sequências de aminoácidos dos dedos de zinco, que se ligam a determinada sequência dupla, tripla ou quádrupla.
Ver, por exemplo, Pat.
U.S. 6.453.242 e 6.534.261, as divulgações das quais são incor- poradas por referência neste documento em suas totalidade.
Como um exemplo, o algoritmo descrito na patente US 6.453.242 pode ser usa- do para criar um domínio de ligação do dedo de zinco para direcionar uma sequência pré-selecionada.
Métodos alternativos, tais como o projeto racional, usando uma tabela de códigos de reconhecimento não degenerado também podem ser usados para criar um domínio de ligação do dedo de zinco para uma sequência específica de destino (Sera et al (2002) Biochemistry 41:7074-7081). Publicamente disponí- veis ferramentas baseadas na web para identificar potenciais locais de destino em sequências de DNA, bem como projetar o dedo de zinco vinculando domínios são conhecidas na técnica.
Por exemplo, ferra- mentas para a identificação de potenciais locais de destino em se- quências de DNA podem ser encontradas em http://www .zincfingertools.org.
Ferramentas para a criação de domí- nios de ligação de dedo de zinco podem ser encontradas em http://zifit. partners .org/ZiFiT. (Ver também, Mandell et al. (2006). Nuc.
Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al (2007). Nuc.
Acid Res.
35:W599-W605).
[0046] Um domínio de ligação do dedo de zinco pode ser projeta- do para reconhecer e ligar uma sequência de DNA que varia de apro- ximadamente 3 nucleotídeos a cerca de 21 nucleotídeos de compri- mento. Em uma modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco pode ser projetado para reconhecer e ligar uma sequência de DNA que varia de cerca de 9 a aproximadamente 18 nucleotídeos de com- primento. Em geral, os domínios de ligação zinco dedo de nucleases de dedo do zinco usados neste documento que compreende pelo me- nos três regiões de reconhecimento de dedo de zinco ou zinco dedos, onde cada dedo de zinco liga 3 nucleotídeos. Em uma modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco que compreende quatro regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em outra modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco é composto por cinco regiões de reconhe- cimento de dedo de zinco. Em ainda outra modalidade, o domínio de ligação do dedo de zinco é composto por seis regiões de reconheci- mento de dedo de zinco. Um domínio de ligação do dedo de zinco po- de ser projetado para ligar para qualquer destino adequado sequência de DNA. Ver, por exemplo, Pat. U.S. Nº 6.607.882; 6.534.261 e
6.453.242, as divulgações das quais são incorporadas por referência neste documento em suas totalidades.
[0047] Métodos exemplares de selecionar uma região de reconhe- cimento do dedo de zinco incluem exibição do fago e sistemas do hí- brido duplo, que são descritos em Pat. U.S. Nº 5.789.538; 5.925.523;
6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; assim como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/278/78, WO 01/88197 e GB 2.338.237, cada um dos quais é incorporado por refe- rência neste documento na íntegra. Além disso, o aumento da especi- ficidade de ligação para domínios de ligação de dedo de zinco tem si- do descrito, por exemplo, no WO 02/077227, cuja divulgação inteira é incorporada a adendo por referência.
[0048] Domínios de ligação de dedo de zinco e métodos para a concepção e construção de proteínas de fusão (e os mesmos polinu- cleotídeos que codificam) são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos detalhadamente, por exemplo, Pat. U.S. Nº
7.888.121, que é incorporado por referência neste documento na ínte- gra. Regiões de reconhecimento de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco de múltiplos dedos podem ser ligadas usando sequências de conexão adequadas, incluindo, por exemplo, conexões de cinco ou mais aminoácidos de comprimento. Ver Pat. U.S. Nº 6.479.626;
6.903.185; e 7.153.949, as divulgações das quais são incorporadas por referência neste documento em suas totalidades, para não limitar exemplos de sequências de conexões de seis ou mais aminoácidos de comprimento. O dedo de zinco de conexão descrito no domínio neste documento pode incluir uma combinação de conexões adequadas en- tre os dedos de zinco individuais da proteína.
[0049] Em algumas modalidades, a nuclease dedo de zinco mais compreende um sinal de localização nuclear ou sequência (NLS). À NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita o direcionamento da proteína da nuclease dedo do zinco nuclease para o núcleo para intro- duzir uma pausa encalhada dobro na sequência de destino no cro- mossomo. Um sinal de localização nuclear é versado na técnica. Ver, por exemplo, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027.
[0050] Domínio de clivagem. Uma nuclease dedo de zinco inclui também um domínio de clivagem. A parte de domínio de clivagem de nuclease de dedo do zinco pode ser obtida a partir de qualquer endo- nuclease ou de exonuclease. Exemplos de não limitação de endonu- cleases da qual um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitados a, as endonucleases de restrição e as habita- ções de endonucleases Ver, por exemplo, New England Biolabs Cata-
log ou Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam DNA são conhecidas (por exemplo, S1 Nuclea- se; mung bean nuclease; DNase | pancreática; micrococo nuclease; fermento de endonuclease HO). Ver também Linn et al. (eds.) Nucle- ases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. Uma ou mais destas enzimas (ou fragmentos funcionais respectivos) podem ser usado co- mo uma fonte de domínios de clivagem.
[0051] Um domínio de clivagem também pode ser derivado de uma enzima ou fração, como descrito acima, que requer dimerização para atividade de clivagem. Duas nucleases de dedo de zinco podem ser necessárias para a segmentação, como cada nuclease compreen- de um monômero do dímero enzima ativa. Alternativamente, uma nu- clease de dedo de zinco único pode abranger ambos os monômeros para criar um dímero de enzima ativa. Como usado aqui, um "dímero de enzima ativa" é um dímero de enzima capaz de clivagem de uma molécula de ácido nucléico. Os monómeros de duas clivagens podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais res- pectivos), ou cada monômero pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais respectivos).
[0052] Quando dois monómeros de clivagem são usados para formar um dímero de enzima ativa, os locais de reconhecimento para as duas nucleases de dedo do zinco de preferência sejam descartados tais que a vinculação de duas nucleases de dedo do zinco a seus lo- cais de reconhecimento respectivos lugares os monômeros de cliva- gem em uma orientação espacial para o outro que permite que os mo- nômeros de clivagem formem um dímero de enzima ativa, por exem- plo, dimerização. Como resultado, as bordas perto dos sites de reco- nhecimento podem ser separadas por aproximadamente 5 a aproxi- madamente 18 nucleotídeos. Por exemplo, as próximas bordas podem ser separadas por cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos. No entanto será entendido que qualquer número integral de pares de nucleotídeos ou nucleotídeos pode intervir entre dois locais de reconhecimento (por exemplo, de cerca de 2 a 50 pares de nucleotídeos ou mais). As bordas perto dos sites de reconhecimen- to de nucleases de dedo do zinco, como por exemplo, aqueles descri- tos em detalhes neste documento, podem ser separadas por 6 nucleo- tídeos. Em geral, o sítio de clivagem situa-se entre os sites de reco- nhecimento.
[0053] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de se ligarem em se- quencias específicas ao DNA (em um local de reconhecimento) e cli- vagem de DNA no ou perto do local da ligação. Certas enzimas de res- trição (por exemplo, tipo IIS) o DNA em locais retirados do site de re- conhecimento e têm domínios separáveis de vinculação e clivagem. Por exemplo, a enzima do tipo IIS Fokl catalisa a clivagem de fita du- pla do DNA, em 9 nucleotídeos do seu local de reconhecimento em um fio e 13 nucleotídeos do seu local de reconhecimento do outro. Ver, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5,356,802; 5,436,150 e 5,487,994; tanto quanto Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982. Assim, uma nuclease dedo de zinco pode compreender o domínio de clivagem de pelo menos uma enzima de restrição do tipo IIS e um ou mais zinco dedo vinculação domínios, que podem ou não podem ser modificados. Enzimas de restrição de tipo IIS exemplares são descritas por exemplo na Publicação Internacional WO 07/014,275 cuja divulgação é incorporada por referência neste documento na íntegra. Enzimas de restrição adicionais também con- têm ligação separável e domínios de clivagem, e estas também são contempladas pela presente divulgação. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acid Res 31:418-420.
[0054] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplar, cujo domínio de clivagem está separável do domínio de ligação, é Fokl. Esta enzima específica é ativa como um dímero (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). Por conseguinte, para efeitos da presente divulgação, a porção da enzima Fokl usada em uma nuclea- se dedo de zinco é considerada um monômero de clivagem. Assim, para a segmentação de fita dupla alvo usando um domínio de cliva- gem Fokl, duas nucleases de dedo de zinco, cada uma contendo um monômero de clivagem Fokl, podem ser usadas para reconstituir um dímero de enzima ativa. Como alternativa, uma única molécula de po- lipeptídio que contém que um domínio de ligação do dedo de zinco e dois monômeros de clivagem de Fokl também podem ser usados.
[0055] Em determinadas modalidades, o domínio de clivagem é composto por um ou mais monômeros de clivagem projetados para minimizar ou prevenir homodimerização. Por meio de limitação de não exemplo, resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fokl são todos alvos para influenciar a dimerização dos Fokl decote meia-domínios. Monômeros de clivagem de engenharia exemplar de Fokl, que forma heterodímeros obrigatórios, incluem um par no qual um monômero de clivagem a primeira inclui as mutações nas posições de resíduo de aminoácido 490 e 538 de Fokl e de um monómero de clivagem segundo que inclui as mutações nas posições de resíduos do aminoácido 486 e 499.
[0056] Assim, em uma modalidade de monômeros a clivagem pro- jetada, uma mutação na posição do ácido aminado 490 substitui Glu (E) com Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 538 substitui Iso (1) com Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 486 subs- titui Gin (Q) com Glu (E); e uma mutação na posição 499 substitui Iso
(1) com Lys (K). Especificamente, os monômeros de clivagem projeta- da podem ser preparados por posições mutação 490 de E para Ke 538 de | de K em um monômero de clivagem para produzir um monô- mero de clivagem engenharia designado "E490K:1538K" e por posi- ções de mutação 486 do Q E 499 de | a K em outro monômero de cli- vagem para produzir um monômero de clivagem projetada designado "Q486E:|499K." Os monômeros de clivagem projetada acima descrita são mutantes heterodímeros obrigatórios em que clivagem de mutação é minimizada ou abolida. Monômeros de clivagem projetada podem ser preparados utilizando um método apropriado, por exemplo, por mutagêneses direcionadas ao sítio de monômeros de clivagem do tipo selvagem (Fokl), conforme descrito na Pat. U.S. Nº 7,888,121, que é incorporada aqui na íntegra.
(ii) polinucleotídeo opcional
[0057] Em algumas modalidades o método para edição de geno- ma alvo é compreendido ainda por introduzir na célula pelo menos um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de identidade de se- quência substancial para uma sequência de pelo menos um lado do local alvo de clivagem. Por exemplo, o polinucleotídeo pode incluir uma primeira sequência tendo identidade de sequência substancial com a sequência em um lado do sítio de clivagem direcionado, e uma segunda sequência tendo identidade de sequência substancial com a sequência do outro lado do sítio de clivagem direcionado. Alternativa- mente, o polinucleotídeo pode incluir uma primeira sequência tendo identidade substancial de sequência a sequência em um lado do site de clivagem alvo e uma segunda sequência tendo identidade substan- cial de sequência para uma sequência localizada longe do local de cli- vagem alvo. A sequência localizada longe do local de clivagem alvo pode ser dezenas, centenas ou milhares de nucleotídeos a montante ou a jusante do site de clivagem alvo.
[0058] Os comprimentos das primeiras e segundas sequências no polinucleotídeo que tem identidade de sequência substancial para se- quências na sequência cromossômica podem e variarão. Em geral, cada uma das primeiras e segundas sequências no polinucleotídeo é pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Em várias mo- dalidades, as sequências de polinucleotídeos tem identidade de se- quência substancial com as sequências cromossômicas podem variar de cerca de 10 a 30 nucleotídeos, de cerca de 30 a cerca de 100 nu- cleotídeos, de cerca de 100 a cerca de 300 nucleotídeos, de cerca de 300 a nucleotídeos a cerca de 1000, de cerca de 1000 a cerca de 3000 nucleotídeos, ou mais de 3000 de comprimento.
[0059] A frase "identidade de sequência substancial" significa que as sequências no polinucleotídeo têm pelo menos uns 75% de identi- dade de sequência com as sequências cromossômicas de interesse. Por exemplo, pelo menos uma das sequências no polinucleotídeo po- de ser idêntica à sequência cromossômica alvo exceto que ele contém uma exclusão, inserção, e/ou substituição pelo menos um nucleotídeo tal que, mediante a recombinação homóloga, uma sequência alterada seja introduzida na sequência cromossômica. Em várias modalidades, as sequências no polinucleotídeo podem ter cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência com a sequência cromossômica de interesse.
[0060] Nas modalidades alternativas, o polinucleotídeo pode a- branger uma sequência adicional que é ladeada pelas sequências de ter identidade de sequência substancial com a sequência cromossômi- ca. A recombinação homóloga, a sequência adicional pode ser inte- grada na sequência cromossômica, assim, inativando a sequência cromossômica e/ou modificando a sequência cromossômica.
[0061] O comprimento do polinucleotídeo pode e variará. Por e-
xemplo, a polinucleotídeo pode variar de cerca de 20 nucleotídeos em comprimento até cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades, o polinucleotídeo varia de cerca de 20 nucleotí- deos a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 1000 nucleotídeos a cerca de 10.000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10.000 nucleotídeos a cerca de 100.000 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 100.000 nucleotídeos a cerca de
200.000 nucleotídeos de comprimento.
[0062] Normalmente, o polinucleotídeo será o DNA. O DNA pode ser fita única ou fita dupla. O polinucleotídeo doador pode ser um plasmídeo de DNA, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um vetor viral, uma parte li- near de DNA, um fragmento PCR, um ácido nucleico livre ou um ácido nucleico complexado com um veículo de entrega como um lipossoma ou poloxâmero.
[0063] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ainda pode compreender um marcador. Exemplos não limitantes de marcadores adequados incluem sítios de restrição, proteínas fluorescentes, ou marcadores selecionáveis. Tais marcadores permitem o rastreio para integrações direcionadas. (iii) introduzindo na célula
[0064] A endonuclease de direcionamento pode ser introduzida na célula como uma proteína ou um ácido nucleico que codifica a endo- nuclease de direcionamento. O ácido nucleico que codifica a endonu- clease de direcionamento de codificação pode ser DNA ou RNA (ou seja, MRNA). Nas modalidades em que a codificação do ácido nuclei- co é MRNA, o mRNA pode ser 5' capeados e/ou 3' poliadenilada. Nas modalidades em que a codificação de ácido nucleico é o DNA, o DNA pode ser linear ou circular. O DNA pode ser parte de um vetor, em que o DNA de codificação, opcionalmente, é opcionalmente ligado operati- vamente a um promotor adequado. Informações adicionais relaciona- das aos vetores apropriados, promotores, outros elementos de contro- le e meios de introdução do vetor na célula podem ser encontrados, por exemplo, em Ausubel et a/, 2003, supra e/ou Sapeka & Russell, 2001, supra.
[0065] A endonuclease de direcionamento ou ácido nucleico que codifica a endonuclease de direcionamento e o opcional polinucleotí- deo descrito acima pode ser introduzido na célula por uma variedade de meios. Entrega adequada significa inclui micro injeção, eletropora- ção, sonoporação, biolística, transfecção mediada por fosfato de cál- cio, transfecção catiônica, transfecção em lipossomas, transfecção dendrímeros, transfecção de choque do calor, transfecção de nucleo- fecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção óptica, absorção reforçada do agente de propriedade dos ácidos nucleicos e entrega através de lipossomas, imunolipossomas, virossomas ou ví- rions artificiais. Em certas modalidades a molécula da endonuclease de direcionamento e polinucleotídeos opcionais são introduzidas em uma célula por nucleofecção ou eletroporação.
[0066] Nas modalidades em que mais do que uma molécula de endonuclease alvo e mais do que um polinucleotídeo são introduzidos em uma célula, as moléculas podem ser introduzidas simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, como as moléculas de endonuclea- se alvo, cada específico para um sítio de clivagem alvo (e polinucleotí- deos opcionais) pode ser introduzido ao mesmo tempo. Alternativa- mente, cada molécula de endonuclease de direcionamento, bem como os polinucleotídeos opcionais (s) pode ser introduzida em sequência.
[0067] A relação da molécula de endonuclease de direcionamento (ou codificação do ácido nucleico) para o polinucleotídeo opcional po- de e irá variar. Em geral, a relação da molécula de endonuclease de direcionamento para o polinucleotídeo pode variar de cerca de 1:10 a cerca de 10:1. Em várias modalidades, a relação entre a molécula de endonuclease alvo para o polinucleotídeo é aproximadamente 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 1:6, 7:1, 8:91, 9:1, ou 10:1. Em uma modalidade, a relação é cerca de 1: 1. (iv) modalidades exemplares
[0068] Em algumas modalidades, a linha celular deficiente em Mgat1 é preparada pela projeção de uma nuclease do dedo de zinco (ZFN) para clivar uma sequência específica no gene Mgat1. Após a introdução do ZFN ou ácido nucleico codificando o ZFN para a linha celular parental, o ZFN liga e cliva a sequência específica no gene Mgat1. Processo NHEJ propenso a erro repara a interrupção da fita dupla no gene Mgat1, assim, a introdução de uma exclusão, inserção, e/ou substituição pelo menos um pb tal que o gene Mgat1 é inativado. Em geral, uma região da sequência de codificação Mgat1 é eliminada e tal que o quadro de leitura é interrompido e nenhuma proteína de Mgat1 é produzida pela linha celular deficiente em Mgat1. Em algumas modalidades, a linhagem de células deficiente de Mgat1 gerada por meio da edição de genoma ZFN mediada é ainda enriquecida pela se- leção na presença de RCA-I. Em algumas modalidades, a linha celular deficiente de Mgat1 é preparada por entrar em contato com uma linha- gem das células CHO com um ZFN direcionado para Mgat1. Em al- guns casos, a linha celular CHO é GS -/-. (b) interferência de RNA
[0069] Em outra modalidade, a linhagem de células deficiente de Mgat1 pode ser preparada usando um agente de interferência (RNAi) do RNA que inibe a expressão de um alvo de mRNA ou transcrição. O agente de RNAi pode levar a clivagem do destino de mMRNA ou trans- crição. Alternativamente, o agente de RNAi pode impedir ou interrom- per a tradução do alvo RNAm nas proteínas.
[0070] Em algumas modalidades, o agente de RNAi pode ter uma interferência curta de RNA (siRNA). Em geral, um siRNA compreende uma molécula de RNA de fita dupla que varia de cerca de 15 a cerca de 29 nucleotídeos de comprimento. O siRNA pode ter cerca de 16-18, 17-19, 21 -23, 24-27, ou 27-29 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade específica, o siRNA tem cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. O siRNA pode opcionalmente ainda compreender uma ou duas saliências de fita única, por exemplo, uma saliência 3' em uma ou ambas as extremidades. O siRNA pode ser formado a partir de du- as moléculas de RNA que hibridizam juntos ou, alternativamente, po- dem ser geradas a partir de um RNA hairpin curto (ShRNA) (veja abai- xo). Em algumas modalidades, as duas fitas do siRNA são totalmente complementares, tal que nenhuma incompatibilidades ou protuberân- cias existem no duplex formado entre as duas sequências. Em outras modalidades, as duas vertentes do siRNA são substancialmente com- plementares, tais que uma ou mais incompatibilidades e/ou protube- râncias podem existir no duplex formado entre as duas sequências. Em determinadas modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' do SiRNA tem um grupo fosfato, enquanto em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' faltam um grupo fosfato. Em outras mo- dalidades, uma ou ambas as extremidades 3' do siRNA tem um grupo hidroxila, enquanto em outras modalidades, uma ou ambas as extre- midades 5' faltam um grupo hidroxila.
[0071] Uma fita do siRNA, que é referido como a "fita antissense" ou "fita de guia", inclui uma parte que hibridiza com a transcrição do alvo. Em determinadas modalidades, a fita antissense do siRNA é to- talmente complementar com uma região das transcrições alvo, ou se- ja, -se hibridiza para a transcrição alvo sem uma única incompatibili- dade ou protuberância sobre uma região alvo entre cerca de 15 e cer- ca de 29 nucleotídeos de comprimento, de preferência pelo menos 16 nucleotídeos de comprimento e mais de preferência cerca de 18-20 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a fita antissen- se é substancialmente complementar para a região alvo, ou seja, uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias podem existir no du- plex formado pela fita antissense e a transcrição do alvo. Normalmen- te, os SIRNAs são direcionados para sequências exônicas das trans- crições do alvo. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com programas, algoritmos, e/ou serviços comerciais que desenha siRNAs para transcrições de alvo. Um exemplo exemplar é o Rosetta siRNA Design Algoritmo (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA) e MIS- SIONº siRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O siRNA pode ser sinte- tizado enzimaticamente in vitro usando métodos conhecidos para a- queles versados na técnica. Alternativamente, o siRNA pode ser qui- micamente sintetizado usando técnicas de síntese do oligonucleotídeo que são bem conhecidas na técnica.
[0072] Em outras modalidades, o agente de RNAi pode ser um RNA hairpin curto (ShRNA). Em geral, um sShRNA é uma molécula de RNA, compreendendo com menos duas partes complementares que são hibridizadas ou são capazes de hibridização para formar uma es- trutura de fita dupla suficientemente longa para mediar a interferência do RNA (como descrito acima) e pelo menos uma parte da fita única que forma uma alça ligando as regiões de ShRNA que formam o du- plex. A estrutura também é chamada de uma estrutura de haste-laço, com o tronco, sendo a parte duplex. Em algumas modalidades, a parte duplex da estrutura é completamente complementar, tal que não exis- tem incompatibilidades ou protuberâncias na região duplex do sShRNA. Em outras modalidades, a parte duplex da estrutura é substancialmen- te complementar, tal que uma ou mais incompatibilidades e/ou protu- berâncias existem na parte duplex do sShRNA. O laço da estrutura po- de ser de cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, de preferência de cerca de 4 a cerca de 10 cerca de nucleotídeos de comprimento e mais de preferência de cerca de 6 a cerca de 9 nucleo- tídeos em comprimento. O laço pode ser localizado na extremidade 5' ou 3' da região, que é complementar a transcrição do alvo (ou seja, a parte antissense do sShRNA).
[0073] O shRNA pode ainda compreender uma saliência na ex- tremidade 5' ou 3'. A saliência opcional pode ser de cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento e mais, de preferência de cerca de 2 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, a saliência compreende um ou mais resíduos de U, por exemplo, entre cerca de | e cerca de 5 resíduos de U. Em algumas modalida- des, extremidade 5' do ShnRNA tem um grupo de fosfato, enquanto em outras modalidades isto não existe. Em outras modalidades, a extre- midade 3' do ShRNA tem um grupo de hidroxila, enquanto em outras modalidades isto não existe. Em geral, ShRNAs são transformados em SIRNAs pela maquinaria de RNAi celular conservada. Assim, SGRNAs são precursores de siRNAs e são igualmente capazes de inibir a ex pressão de uma transcrição alvo que é complementar a uma parte do ShRNA (ou seja, a parte antissense do ShRNA). Aqueles versados na técnica estão familiarizados com os recursos disponíveis para o proje- to e a síntese de ShRNAs (como detalhado acima). Um exemplo e- xemplar é MISSIONO shRNAs (Sigma-Aldrich).
[0074] Ainda em outras modalidades, o agente de RNAi pode ser um vetor de expressão de RNAi. Normalmente, um vetor de expressão de RNAi é usado para síntese (in vivo) intracelular dos agentes de RNAi, tais como siRNAs ou sSshRNAs. Em uma modalidade, duas fitas complementares de siRNA separadas são transcritas usando um único vetor contendo dois promotores, cada qual direciona a transcrição de uma fita única de siRNA (ou seja, cada promotor é operavelmente |i- gado a um modelo para o siRNA para que ocorra a transcrição). Os dois promotores podem estar na mesma orientação, no qual cada caso operavelmente é ligado a um modelo para uma das fitas complementa- res de siRNA. Alternativamente, podem ser os dois promotores em o- rientações opostas, flanqueando um modelo único para que a transcri- ção para os promotores resulte na síntese de duas fitas complementa- res de siRNA. Em outra modalidade, o vetor de expressão de RNAi pode conter um promotor que impulsiona a transcrição de uma única molécula de RNA, que compreende duas regiões complementares, tais que a transcrição, forme um shRNA.
[0075] Aqueles versados na técnica apreciarão que isso é preferí- vel para agentes de siRNA e shRNA para ser produzidos in vivo atra- vés da transcrição de mais de uma unidade de transcrição. De um modo geral, os promotores utilizaram a expressão direta de in vivo de SIRNA a uma ou mais unidades de transcrição de ShRNA podendo ser promotores para RNA polimerase Ill (Pol Ill). Certos promotores Pol Ill, tais como promotores U6 ou H1, não requerem elementos reguladores de cis- agindo dentro da região transcrita e assim, são preferidos em determinadas modalidades. Em outras modalidades, promotores para Pol I|l podem ser usados para direcionar a expressão a um ou mais unidades de transcrição de siRNA ou shRNA. Em algumas modalida- des, tecidos específicos, células específicas, ou promotores induzíveis Pol |l podem ser usados.
[0076] Uma construção que fornece um modelo para a síntese de SIRNA ou shRNA podem ser produzidos usando métodos padrões de DNA recombinante e inserido em qualquer uma de uma grande varie- dade de diferentes vetores apropriados para expressão em células eu- carióticas. Técnicas recombinante de DNA são descritas em Ausubel et al, 2003, supra e Sambrook & Russell, 2001 , supra. Aqueles versa- dos na técnica também apreciam que os vetores podem compreender sequências reguladoras adicionais (por exemplo, a sequência de ter-
minação, sequência de controle de translação, etc.), como sequências de marcador bem selecionável. Plasmídeos de DNA são conhecidos na técnica, incluindo os baseados em pBR322, PUC e assim por dian- te. Desde que muitos vetores de expressão já contenham um apropri- ado promotor ou promotores, pode ser apenas necessário inserir a se- quência do ácido nucleico que codifica o agente de RNAi de interesse em um local apropriado com relação a promotores. Vetores virais tam- bém podem ser usados para fornecer uma expressão intracelular dos agentes de RNAi. Vetores virais adequados incluem vetores retrovi- rais, vetores lentivírus, vetores adenovírus, vetores de vírus adenoas- sociados, vetores de vírus de herpes e assim por diante. Em uma mo- dalidade específica, o vetor de expressão de RNAi é um vetor com ba- se em partículas de Lentivírus ShRNA ou partícula lentivírus, como o fornecido nos produtos de MISSIONº TRC shRNA (Sigma-Aldrich).
[0077] Os agentes de RNAi ou vetores de expressão de RNAi po- dem ser introduzidos na célula usando métodos conhecidos para a- queles versados na técnica. Essas técnicas são descritas em Ausubel et al., 2003, supra ou Sambrook & Russell, 2001 , supra, por exemplo. Em determinadas modalidades, o vetor de expressão de RNAi, por e- xemplo, um vetor viral, está estavelmente integrado no genoma da cé- lula, tal que a expressão Mgat1 é interrompida ao longo das gerações subsequentes de célula. (c) recombinação sítio-específica
[0078] Em modalidades alternativas, a linha celular deficiente de Mgat1 pode ser preparada utilizando técnicas de recombinação sítio- específica. Por exemplo, as técnicas de recombinação sítio-específica podem ser usadas para excluir toda ou parte de uma sequência cro- mossômica de interesse, ou introduzir polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na sequência cromossômica de interesse. Em uma mo- dalidade, destina-se a sequência cromossômica de interesse usando um sistema de recombinação sítio-específica Cre-loxP, um sistema de recombinação sítio-específica FID-FRT ou variantes disso. Tal siste- mas de recombinação estão comercialmente disponíveis, e o ensina- mento adicional para estas técnicas é encontrado em Ausubel! et al., 2003, supra, por exemplo. (IN) Métodos para a Produção de Proteínas Recombinantes com Glicoformas Simples
[0079] Também fornecidos estão os métodos para usar as células deficientes Mgat1 para produzir proteínas recombinantes com glico- formas simples. Uma glicoforma simples se refere a uma glicoforma compreendendo um ou mais resíduos de manose terminal. Em geral, uma glicoforma simples é desprovida de resíduos de galactose e/ou ácido siálico. Um exemplar glicoforma simples é Man5GlcNac2 ou Man5. Como mencionado acima, glicoproteínas com glicoformas sim- ples são úteis para estudos de cristalografia dos raios x. Glicoproteí- nas com glicoformas simples tem aplicações adicionais. Por exemplo, as células deficientes Mgat1 podem ser usadas para produção de va- cinas. As células deficientes Mgat1 produzem glicoproteínas que con- tenham resíduos de manose terminal. Os resíduos de manose terminal no antígeno permitem sua absorção pelos receptores de manose nas células apresentadoras de antígeno. O antígeno apresentador das cé- lulas (ou seja, os macrófagos ou células dendríticas), em seguida, a- presenta o antígeno para o reconhecimento pelas células T, assim, montam uma resposta imune. Uso de antígenos compreendendo resí- duos de manose terminal pode aumentar a eficácia da apresentação de antígeno das células T. Adicionalmente, glicoproteínas com apenas resíduos de manose terminal podem ser úteis para outros fins terapêu- ticos, facilitando a absorção mediada por receptores de manose des- tas proteínas.
[0080] Glicoproteínas com glicoformas simples podem ser prepa-
radas A ainda um aspecto da divulgação presente abrange um método para produzir uma proteína de recombinação com uma glicoforma simples. O método compreende a introdução de um ácido nucleico que codifica a proteína recombinante em uma linha celular deficiente em Mgat1 e expressa a proteína de recombinação, em que a proteína re- combinante expressa compreende um ou mais resíduos de manose terminal. Linha celular deficiente de Mgat1 é descrita acima na seção (1).
[0081] A glicoproteína recombinante produzida na linha celular de- ficiente de Mgat1 pode ser qualquer glicoproteína adequada, incluindo proteínas terapêuticas e biologias de proteína. Por exemplo, a proteína recombinante pode ser, sem limite, um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo quimérico, uma mo- lécula de IgG, uma cadeia pesada de IgG, uma cadeia leve de IgG, uma molécula de IgA, uma molécula de I|IgD, uma molécula de IgE, uma molécula de IgM, uma vacina, um fator de crescimento, uma cito- cina, um interferon, uma interleucina, um hormônio, um fator de coagu- lação (ou coagulação), um componente do sangue, uma enzima, uma proteína de nutracêuticos, um fragmento funcional ou variante funcio- nal de qualquer renúncia, ou uma proteína de fusão compreendendo qualquer uma das proteínas acima e/ou fragmentos funcionais ou suas variantes. Em modalidades exemplares, a glicoproteína recombinante é uma proteína humana.
[0082] Métodos para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica e o ensinamento adicional é fornecido por Ausubel et al., 2003 supra. Em geral, a proteína recombinante é ex- pressa de uma forma exógena introduzida do ácido nucleico. Como detalhado acima na seção (l)(e), a codificação da proteína recombi- nante dos ácidos nucleicos pode ser extracromossômica ou o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser integrado no genoma.
[0083] Métodos de cultivo da linha celular, tal que as proteínas re- combinantes expressas são bem conhecidas na técnica. Sistemas a- dequados de meios de comunicação e cultura são conhecidos na arte e comercialmente disponíveis. Em uma modalidade, a proteína recom- binante é produzida por linhas celulares aqui divulgadas através de cultura de suspensão livre de soro. Definições
[0084] A não ser que definido de outra forma a seguir, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o signifi- cado que normalmente é entendido por uma pessoa versada na técni- ca à qual pertence esta invenção. As referências seguintes fornecem a um indivíduo versado na técnica com uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2º ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glos- sary of Genetics, 5º Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como usado aqui, os seguintes termos tem o significado atribuído a eles menos que especificado de outra forma.
[0085] Quando os elementos de introdução da divulgação da pre- sente ou as modalidades preferidas (s) dos mesmos, os artigos "um", "uns", "o" e "referido" destinam-se a dizer que existe um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" estão destinados a ser inclusivo e significam que pode existir elementos adi- cionais que não sejam os elementos listados.
[0086] Como usado neste documento, o termo "sequência endó- gena" refere-se a uma sequência cromossômica que é nativa para a célula.
[0087] O termo "sequência exógena" refere-se a uma sequência cromossômica que não é nativa para a célula, ou uma sequência cro- mossômica cuja localização cromossômica nativa está em um local diferente em um cromossomo.
[0088] Os termos "edição", "edição de genoma", ou "edição cro- mossômica" referem-se a um processo pelo qual uma sequência cro- mossômica específica é alterada. A sequência cromossômica editada pode compreender uma inserção pelo menos um nucleotídeo, uma exclusão pelo menos um nucleotídeo, e/ou a substituição de pelo me- nos um nucleotídeo.
[0089] Um "gene", como usado aqui, refere-se a uma região de DNA (incluindo éxons e íntrons) codificando um produto do gene, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto do gene, ou não tais sequências reguladoras são adjacentes para codifi- cação e/ou sequências transcritas. Por conseguinte, um gene inclui, mas não é necessariamente limitado, sequências de promotor, termi- nadores, sequências reguladoras translacionais como sítios de ligação do ribossoma e sítios de entrada interna do ribossoma, potenciadores, silenciadores, isoladores, elementos de limitação, origens de replica- ção, sítios de fixação de matriz e regiões de controle de locus.
[0090] O termo "heteróloga" refere-se a uma entidade que não é nativa para a célula ou a espécie de interesse.
[0091] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeos" referem-se ao polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, conformação linear ou circular, em qualquer forma de fita única ou dupla. Para efei- tos da presente divulgação, estes termos não devem ser interpretados como limitação no que diz respeito ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos na- turais, bem como nucleotídeos que são modificados nas metades de base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, estrutura principal de fosforo-
tioato). Em geral, um análogo de nucleotídeo específico tem a mesma especificidade pareante de base; ou seja, um análogo de A será um par de bases com T.
[0092] O termo "nucleotídeo" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser nucleotídeos padrões (ou seja, adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina) ou análo- gos de nucleotídeo. Um análogo de nucleotídeo refere-se a um nucleo- tídeo tendo uma purina modificada ou base de pirimidina ou uma fra- ção de ribose modificada. Um análogo nucleotídeo pode ser um nucle- otídeo que ocorre naturalmente (por exemplo, inosina) ou um nucleotí- deo que ocorre não naturalmente. Exemplos não limitantes de modifi- cações sobre as frações de açúcar ou a base de um nucleotídeo inclu- em a adição (ou remoção) de grupos acetila, grupos aminoácidos, grupos carboxila, grupos carboximetila, grupos hidroxila, grupos metila, grupos fosforila e grupos tiol, bem como a substituição dos átomos de carbono e nitrogênio das bases com outros átomos (por exemplo, pu- rinas 7-desaza). Os análogos de nucleotídeo também incluem nucleo- tídeos dideóxi, nucleotídeos 2'-O-metila, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) e morfolinos.
[0093] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados indistin- tamente para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos.
[0094] O termo "recombinação" refere-se a um processo de troca de informação genética entre dois polinucleotídeos. Para efeitos de divulgação, "recombinação homóloga" refere-se à forma especializada de tal troca que ocorre, por exemplo, durante a reparação de quebras da fita dupla nas células. Este processo requer a similaridade da se- quência entre os dois polinucleotídeos, usando uma molécula "doador" ou "troca" para reparação de modelo de uma molécula "alvo" (ou seja, aquele que experimentou a quebra da fita dupla), e é variavelmente conhecida como "conversão do gene não-crossover" ou "conversão de gene de trato curto", pois leva à transferência de informação genética do doador para o alvo. Sem ser limitada por qualquer teoria particular, tal transferência pode envolver a correção da incompatibilidade do DNA heteroduplex que se forma entre o alvo quebrado e o doador, e/ou "síntese dependente da fita de anelamento", em que o doador é usado para ressintetizar a informação genética que se tornará parte do alvo, e/ou processos relacionados. Tal recombinação homóloga espe- cializada muitas vezes resulta em uma alteração da sequência da mo- lécula alvo tal que parte ou a totalidade da sequência do doador poli- nucleotídeo é incorporado a alvos polinucleotídeos.
[0095] Como usado aqui, os termos "sítio alvo" ou "sequência al- vo" referem-se a uma sequência do ácido nucleico que define uma parte de uma sequência cromossômica para ser editado e ao qual uma endonuclease de direcionamento é projetada para reconhecer, ligação e clivagem.
[0096] Os termos "a montante" e "a jusante" referem-se aos locais em uma sequência do ácido nucleico em relação a uma posição fixa. A montante refere-se à região que é 5' (ou seja, perto da extremidade 5' da fita) para a posição e a jusante, refere-se à região que é 3' (ou seja, no final 3' da fita) para a posição.
[0097] As técnicas para a determinação de identidade da sequên- cia dos ácidos nucleicos e aminoácidos são conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, tipicamente, a determinação da sequência no nucleotídeo do MRNA de um gene e/ou determinar a sequência dos aminoácidos codificados assim, e comparando estas sequências para uma segunda sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos. Sequên- cias genômicas também podem ser determinadas e comparadas desta forma. Em geral, a identidade se refere a um exato nucleotídeo para nucleotídeo ou aminoácido para aminoácido correspondente de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo, respectivamente. Du-
as ou mais sequências (polinucleotídeos ou aminoácidos) podem ser comparados pela determinação da percentagem da identidade.
A iden- tidade da porcentagem das duas sequências, se as sequências dos ácidos nucleicos ou aminoácidos, é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas divididas pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicada por 100. Um alinhamento aproximado para sequências dos ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo local homologia de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Esse algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos usando a matriz de Pontuação desenvol- vida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.
Da- yhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundati- on, Washington, D.C., USA, e normalizada por Gribskov, Nucl.
Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Uma implementação exemplar desse algoritmo para determinar a porcentagem da identidade de uma se- quência é fornecida pelo Genetics Computer Group (Madison, Wis) no "BestFit" pedido utilitário.
Outros programas apropriados para o cálculo da porcentagem da identidade ou similaridade entre as sequências geralmente são conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros padrão.
Por exem- plo, BLASTN e BLASTP podem ser usados utilizando os seguintes pa- râmetros padrão: código genético=padrão; filtro=nenhum; fitazambos; corte=60; esperar=10; Matriz=BLOSUMG62; Descrições=50 sequências; classificar por=-PONTUAÇÃO ELEVADA; Bancos de dados=não re- dundante, traduções do GenBank+EMBL+DDBJ+APO+GenBank CDS+Svwissprotein+Spupdate+PIR.
Detalhes destes programas podem ser encontrados no site do GenBank.
No que diz respeito a sequências aqui descritas, o intervalo dos graus desejados da identidade de se- quência é aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro entre estes.
Tipicamente as porcentagens das identidades entre as sequên-
cias são pelo menos 70-75%, de preferência 80-82%, mais de prefe- rência 85-90%, até mais de preferência 92%, ainda mais de preferên- cia 95% e preferencialmente mais de 98% de identidade da sequência.
[0098] Como várias alterações podem ser feitas nas células acima descritas e métodos sem partir do âmbito da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e nos exemplos abaixo, deve ser interpretada como ilustrativas e não em um sentido limitante. Exemplos
[0099] Os exemplos a seguir ilustram alguns aspectos da inven- ção. Exemplo 1: Interrupção de Mgat1 nas células CHO usando ZFNs Preparação dos vetores de expressão ZFN e ZEN mRNA direcionados para Mgat1
[00100] Mediada pelas técnicas de nocaute de ZFN foram emprega- das para nocautear ou inativar o gene Mgat1 nas células CHO, gerando, assim, as células que produzem proteínas com um perfil homogêneo de N-glicano simples contendo partes de Man5 terminais. Contigs genômi- cos Mgat1 contendo o locus Mgat1 (Xu et al., 201 1, Nat Biotechnol, 29:735-741) foram anotados usando homologia de camundongo. ZFNs, direcionando um local específico dentro do CHO região de codificação Mgat1 foram projetados usando um algoritmo proprietário. A Figura 2A diagrama de localização do sítio alvo em Mgat1. A sequência do alvo em Mgat1 foi S-AACAAGTTCAAGTTCccageaGCTGTGGTAGTGGAGGAC- 3' (SEQ ID Nº: 1; ZFN sítios de ligação em letras maiúsculas e o sítio de clivagem em letras minúsculas). Construto de expressão Mgat1 ZFN foi preparado utilizando procedimentos padrão e Mgat1 ZFN mRNA foi pro- duzido a partir do DNA do plasmídeo ZFN conforme descrito em COM- POZRº Knockout Zinc Finger Nuclease (ZFN) (Sigma-Aldrich) informa- ções sobre o produto usando a transcrição in vitro, mMRNA poliadenilação e métodos de capeamento. Resumidamente, o DNA do plasmídeo ZFN foi linearizado e purificado usando a extração de DNA de fe- nol/clorofórmio. MessageMax'ty T7 ARCA-Capped Message Transcripti- on Kit (Cell Script Inc.) foi usada para capeamento do DNA linear. Um Poly(a) Polymerase Tailing Kit (EpiCentre) foi usado para adicionar uma cauda poli(A). O mRNA ZFN foi purificado usando o kit de MEGAcIear Ty (Ambion). B. Transfecção de ZFNs de direcionamento Mgat1 em um IgG produzindo CHO linha celular
[00101] —"CHOZNº (GS -/-) células (Sigma-Aldrich) expressão recom- binante humana contra a raiva IgG mantiveram-se como culturas de suspensão naEX-CELLº CHO CD Meio de Fusão (Sigma-Aldrich) su- plementada com 25 uM metionina sulfoximina (MSX). As células foram semeadas em 0.5 x 10º células/mL em tubos de biorreator um dia an- tes para a transfecção. Células 1 x 10º em meios de crescimento de 150 ul e 5 g Mgat1 ZEN DNA ou mRNA foram utilizadas para cada transfecção. Transfecções foram conduzidas por eletroporação em 140 V e cubetas de 950 em 0,2 cm. As células eletroporadas foram colocadas em 2 mL meios de crescimento em uma cultura de estática de placa de 6 poços. Nos dias 3 e 10 da pós-transfecção, as células foram retiradas de cultura e o DNA genômico foi isolado usando Ge- neElute'" Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich). Um Cel-I ensaio nuclease, conforme descrito no COMPOZRº nocaute ZFN as informações sobre o produto foi realizado para determinar a eficiên- cia de clivagem do gene ZFN mediado.
[00102] A Figura 2B retrata um gel mostrando os resultados de um ensaio de Cel-l em ZFN transfectados (DNA do Plasmídeo ZFN ou mMRNA transfecções) laços celulares. Dois fragmentos de clivagem, 220 e 197 pb, estavam presentes em ambos Dia 3 e Dia 10 pós- transfecção nas digestões de DNA genômicos, indicando atividade ZFN positiva em ambos os pontos de tempo. Atividade ZFN no dia 3 e dia 10 foi de 8,8% e 9,6%, respectivamente. Em ambos os pontos de tempo, as células transfectadas com RNA tinham bandas ligeiramente mais intensas. A atividade ZFN estável ao longo do tempo não implica nenhuma inibição de citotoxicidade ou crescimento aparente relacio- nada à interrupção de Mgat1. Em outras palavras, nenhuma vantagem crescimento de tipo selvagem sobre as células modificadas ZFN foi observada na população transfectada ZFN. Exemplo 2: Seleção de Lectina e Isolamento dos Clones da Célula Única
[00103] As células transfectadas Mgat1 ZFN foram tratadas durante a noite com Ricinus communis aglutinina-l (RCA-lI), uma lectina citotó- xica que liga a galactose, mas não a manose, a fim de enriquecer as células com Mgat1 interrompido. No dia 14 da pós-transfecção, uma alíquota das células foi chapeada para única célula clonagem usando FACS para células viáveis. As células foram banhadas em uma célula por poço, usando um classificador de célula FACSAria'“Y Ill (Becton- Dickinson) placas de cultura de tecidos de 96 poços tratados (Corning) em Ham - mistura de nutriente F12 suplementado com 10% Soro Bo- vino Fetal (FBS) e 4 mM L-glutamina. As células restantes foram ex- pandidas até o dia 18 e então semeadas em 1 x 10º células/ml em frascos de cultura de suspensão T (retirada do núcleo). As células fo- ram incubadas com concentração final de 10 g/ymL de RCA-| em meios de crescimento durante a noite, em seguida, lavadas com PBS e re- tornou ao meio de crescimento. Células foram expandidas para fras- cos de T e cultivadas por 10 dias e chapeadas então para a clonagem de célula única conforme descrito acima. Dez dias após o tratamento RCA-l, as células foram doseadas para atividade ZFN.
[00104] A Figura 3 retrata um gel mostrando os resultados de um ensaio de Cel-| dos laços de células transfectados ZFN antes e depois do enriquecimento RCA-1. Células selecionadas com RCA-I atividade
ZFN exibida de cerca de 33-36% em comparação com 3,8-5,5% para células não selecionadas, indicando enriquecimento bem sucedido pa- ra as células interrompidas Mgat1. Exemplo 3: Glicoperfil de Recombinação Humana Secretada con- tra raiva IgG
[00105] Um fluxo de trabalho SEC-MS relativamente alto rendimen- to (Waters Acquity UPLC?/Q- Tof PremierT") foi usado para glicoanáli- ses. O fluxo de trabalho utilizou a purificação da Proteína-A de IgG de sobrenadantes de cultura celular seguido de análise em massa exata dos constituintes de cadeia pesada de IgG intacta. Purificação da pro- teína A foi realizada usando uma placa de filtro de 96 poços com 50 ul da resina da proteína A e 750 ul sobrenadante de clone por poço. O IgG foi eluído com 100 ul de citrato de 25 mM, pH 3.0. Análise de da- dos em massa foi realizada por deconvolução e processamento de dados executado em um modo automatizado usando software Bio- pharmaLynx'"“ (águas). As formas de glicopeptídeo foram confirmadas por tripsina digest das amostras e verificação selecionadas da identifi- cação glicano e distribuição relativa (relatado como um % dos glicanos totais) no nível do glicopeptídeo por MALDI-TOF.
[00106] Os glicoperfisdo recombinante humano secretado contra a raiva IgG foram avaliados para cada laço das células (ZFN transfecta- das e reação transfectadas, com ou sem seleção RCA-I). Os laços en- riquecidos por RCA-I exibidos aumentam os níveis de Man5 glicoforma em relação a células não exposta ao RCA-I (Figura 4). As células transfectadas simuladas demonstraram 0,3% Man5 comparado com 13,7% para as células transfectadas Mgat1 ZFN e 92,8% para as célu- las transfectadas ZFN enriquecidas através da seleção RCA-l. As gli- coformas GOF e G1F foram mais abundantes nas células transfecta- das simuladas e as células transfectadas ZFN que não foram sujeitos ao enriquecimento RCA-Il.
Exemplo 4: Caracterização do Genótipo de Clones Monocelulares Modificados Mgat1
[00107] DNA genômico foi isolado de culturas dos clones monocelu- lares (produzindo IgG ou as linhas de célula do hospedeiro GS (-/-)). Uma parte do gene Mgat1 foi amplificada por PCR e os produtos PCR foram clonados usando o sistema TOPO (Life Technologies, Carlsbad, CA). As amostras foram preparadas para sequenciamento de DNA. Um mínimo de 10 clones TOPO foram sequenciados para caracteriza- ção genotípica. A fim de comparar as frequências dos clones modificados Mgat1i na presença ou ausência de enriquecimento RCA-l, células cultivadas transfectadas ZFN com ou sem RCA-Il foi a única célula clonada por FACS, conforme descrito acima. Para os laços não enriquecidos, dois clones de saída 76 (2,63%) tinham deleções curtas no gene Mgat1 (Ver Figura 5 e a Tabela 1; clones f73 e f92). O sequenciamento ini- cial dos produtos PCR aninhados de lisado celular obtido usando So- lução de Extração de DNA QuickExtract'"y (Epicentro) indicou que to- dos os clones (52/52) a partir da população de RCA-I enriquecido con- tinha sequências do gene interrompido Mgat1. O sequenciamento des- tes clones revelou a exclusão em Mgat1 de 2 pb exclusões para 55 pb exclusão (Ver Figura 5 e a Tabela 1, clones, 421, tt25, 1127 e 37). Ca- da clone continha um alelo interrompido, sem sua sequência detecta- da. Assim, o genótipo dessas células é MGAT-1 (-/0) e GS (-/-). se Linha da Célula Hospedeira CHO 73 102
[00108] O seguinte IgG produzindo clones de nocaute Mgat1 foram selecionados para a caracterização ainda: dois clones isolados sem seleção RCA-I (clones 473 e f92); dois clones que atravessou o pro- cesso de transfecção ZFN que manteve a sequência do tipo selvagem (H15 e H46); e quatro dos clones de selecionados RCA-I (%21, ft25, 427 e 37), com um intervalo de comprimentos de exclusão. Nenhum destes clones de nocaute exibiu sensibilidade para RCA-I (Figura 6), nem de mudanças significativas na distribuição de produtividade de IgG ou crescimento observado. Exemplo 5: Caracterização de Nocaute Mgat1i produzindo Clones de células IgG
[00109] Os glicoperfisdo recombinante humano secretado contra a raiva IgG foram avaliados (essencialmente como detalhado acima, no Exemplo 3) para cada um dos clones monocelulares acima menciona- dos. A Figura 7A-B apresenta o glicoperfil de tipo selvagem e clones de nocaute, respectivamente, no Dia 5 culturas de lote, e Figura 7C-D mostra o glicoperfil de tipo selvagem e clones de nocaute, respectiva- mente, no Dia 8 nas culturas de lote. As espécies mais abundantes de glicano é Man5 no clone de nocaute Mgat1, considerando que o tipo de selvagem de clones exibidos nos picos mais altos GOF. O Man5% é significativamente maior nos clones de nocaute Mgat1 (p < 0.0001, t- teste não pareada com correção de Welch).
[00110] Para analisar o crescimento e a produtividade dos clones de nocaute Mgat1, as células foram semeadas em 0,3 10º células/ml em 30 mL do meio de crescimento em tubos de biorreator TPP nas duplicatas. Densidade celular e a viabilidade foram determinadas uti- lizando um Analisador de Viabilidade Celular ViCell (Beckmann Coul- ter). Conforme mostrado na Figura 8A-B, os clones de células de no- caute Mgat1 exibiram o mesmo crescimento ou aprimorado como medido pela viabilidade celular e densidade celular ao longo do tem-
po, em comparação com células que possuem o tipo selvagem Mgat1.
[00111] A produtividade IgG volumétrica foi determinada por interfe- rometria usando um OCTETO ForteBioº analisador (Pall Life Scien- ces). Conforme mostrado na Figura 9, os clones de células de nocaute Mgat1 exibem a produtividade volumétrica aprimorada ou mesmo as células de tipo selvagem. Exemplo 6: Isolamento de Clones de Nocaute Mgat1 em uma Li- nha de Célula Hospedeira CHO
[00112] Para ainda avaliar este método para os pedidos biofarma- cêuticos, foi repetido o isolamento de clone e transfecção ZFN usando uma linha das células hospedeiras de CHO K1 GS (-/-). Uma linha de células hospedeiras com GS (-/-) (CHOZNº Sigma-Aldrich) foi transfec- tada com Mgat1 ZFN mRNA essencialmente como descrito acima no Exemplo 1. Mediante confirmação de atividade ZFN usando o ensaio de Cel-1, as células transfectadas foram clonadas de uma monocélula usando diluição limitante de 0,5 célula/poço essencialmente como descrito acima no Exemplo 2. A clonalidade e crescimento microscopi- camente foram verificados no Dia 7 e no Dia 14 pós-chapeamento, respectivamente. Estas células não foram tratadas com RCA-I para seleção adicional. Cinco de 90 (5,6%) clones gerados a partir do CHOZNº GS (-/-) linha de célula hospedeira contidas nas interrupções Mgat1. As exclusões identificadas nestes clones, gerados sem enriquecimento RCA-l, foram de 7 a 28 pb (ver Tabela 2). Como observado com os clones de pro- dução de IgG, estes clones parentais tem apenas um alelo perturbado e sem a sequência do tipo selvagem foi identificada. Um ensaio de ci- totoxicidade lectina foi conduzido usando RCA-I, e semelhante aos clones produzindo IgG, não citotoxicidade foi observada para qualquer um dos clones de nocaute Mgat1.
Tabela 2: Genótipo de Clones de Monocélulas de Nocaute Mgat1 da Linha BH11 157 bp de exclusão substituí- | Não detectado Nocaute dos por 104 bp de inserção esmas esa | Exemplo 7. Expressão estável de IgG e Glicoperfil IgG da Linha de célula Hospedeira Mgat1
[00113] Cinco clones de linha de célula hospedeira de nocaute Mgat1 (listados na Tabela 2) foram transfectadas com um vetor de ex- pressão contendo sequência de codificação humana contra raiva IgG e uma cassete de expressão GS de hamster recombinante. Quarenta e oito horas antes da transfecção, células foram semeadas em 5 x 10º células/mL. Transfecções foram conduzidos por eletroporação, con- forme descrito no Exemplo 1 usando o DNA do plasmídeo de 30g. As células electroporadas foram colocadas em suspensão frascos de cul- tura de células de 25 cm? em 5 mL de meio de crescimento. Células foram transferidas em deficiente do meio de transfecção de post de 48 horas de L-glutamina e cultivadas a 37 em 5% de C O, até seleção foi completo (12-14 dias) e culturas estavelmente transfectadas foram estabelecidas. Em uma transfecção separada, células foram chapea- das em 5000 células/poço em placas de 96 poços em 200 yL para menos seleção de glutamina e ampliadas após a conclusão da seleção de culturas "minilaço" para culturas de 24 poços (1 mL), frascos de 25cm? (5 mL) e tubos de TPP (30 mL). Destas linhas estável, culturas de TPP foram criadas da mesma forma como anteriormente descritas,
e culturas alimentados 2 g/L de glicose juntamente com alimentação quimicamente definida no dia 4 e 7. Culturas foram colhidas no dia 8, e o sobrenadante clarificado por centrifugação a 3400 rpm e contra diáli- se posteriormente 1xXPBS usando um Spectra/Pore 4 da membrana tubulação da diálise (MWCO 12kDa, Spectrum Labs, Rancho Domin- guez, CA) durante 24 horas a 4º e purificado em um sistema de AK- TA FPLC (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) usando uma coluna Fast Flow de 1 ml de proteína A HiTrap (GE Healthcare). IgG foi eluído em 0,1 M de citrato pH 3,0 e frações imediatamente neutralizadas pela adição de 1/10 volume 1,0M Tris HCI pH 9,0. Glicoperfil realizou-se essencialmente como descrito no Exemplo 3.
[00114] IgG contra raiva produzida em todos as cinco linhas de cé- lula hospedeira de nocaute Mgat1i demonstrou glicoperfis altamente similares, com Man5 sendo a espécie predominante com sem os com- plexos glicanos detectados. A análise MS demonstrou uma mudança em massa do pico glicano predominante nas linhas de célula de no- caute Mgat1 (ou seja, 50168-50172) em comparação com as células de tipo selvagem (ou seja, 50400). O IgG produzido em BC9 e BH11 "minilaços" demonstrou glicoperfis comparáveis as suas "massa" de laços estáveis selecionados.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES1. Linhagem celular, caracterizada pelo fato de que é defi- ciente em manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosa- miniltransferase | (Mgat1).2. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizada pelo fato de que a linhagem celular compreende uma se- quência cromossômica inativada codificando Mgat1.3. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que a sequência cromossômica é inativada com uma endonuclease de direcionamento.4. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 3, ca- racterizada pelo fato de que a endonuclease de direcionamento é uma nuclease de dedo de zinco.5. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Figu- ras 2 a 4, caracterizada pelo fato de que a sequência cromossômica inativada compreende uma exclusão de 2 pb a 55 pb.6. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Figu- ras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular não produz Mgat1.7. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Figu- ras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular ainda compreende uma deficiência em glutamina sintase (GS), di-hidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT) ou uma combinação destes.8. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Figu- ras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular é uma linhagem celular de ovário de Hamster chinês (CHO).9. Linhagem de acordo com a reivindicação 8, caracteriza- da pelo fato de que a linhagem celular de CHO é uma linhagem celular GS -/-.11. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Fi- guras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular ex- pressa pelo menos uma glicoproteína composta por um ou mais resí- duos de manose terminal.12. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Fi- guras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular tem uma taxa de crescimento comparável com a de uma linhagem celular com nenhuma deficiência em Mgat1.13. Linhagem celular de acordo com qualquer uma das Fi- guras anteriores, caracterizada pelo fato de que a linhagem celular produz um nível de proteína comparável com o de uma linhagem celu- lar com nenhuma deficiência em Mgat1.14. Método, caracterizado pelo fato de que para produzir uma célula deficiente em Mgat1 compreendendo a transfecção de uma célula hospedeira com uma endonudease de direcionamento que tem como alvo uma sequência específica em uma sequência cromossômi- ca codificando Mgat1.15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a endonuclease de direcionamento é uma nuclea- se de dedo de zinco.16. Método de acordo com as Figuras 13 ou 14, caracteri- zado pelo fato de que ainda compreende a incubação da célula trans- fectada com Ricinus communis aglutinina-l| (RCA-I).17. Método de acordo com qualquer uma das Figuras 13 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente: introdução de um ácido nucleico codificando uma proteína recombinante para a célula; e expressão da proteína recombinante.18. Método para produzir uma proteína recombinante, ten- do um ou mais resíduos de manose terminal, o método caracterizado pelo fato de que compreende: introdução de um ácido nucleico codificando a proteína re- combinante em uma linhagem celular na qual uma endonudease de direcionamento inativou todas as sequências cromossômicas codifi- cando Mgat1, tal que a linha celular produz não Mgat1; e expressão da proteína recombinante.
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