JP6751347B2 - ウイルス耐性細胞及びその使用 - Google Patents

Description

本開示は、ウイルス耐性を有するよう操作された哺乳類細胞株、及び生物学的製造系に関するウイルス混入を減少または防止するための当該細胞株の使用に関する。

癌及び自己免疫疾患のような多くの疾患または容態の治療のための組換え製造した治療用タンパク質の使用は増え続けている。しかしながら、これらのタンパク質治療薬の大規模製造は、なおも課題を残している。例えば、商業的な製造方法は、微量のみを許容する、好ましくは混入物のない、極めて純粋な生成物を製造する川下工程を用いて確実に高処理量を供給しなければならない。

動物成分非含有培地の使用は、偶然のウイルス混入の発生を著しく減少させてきた。加えて、バルク材料の限外濾過、高温短時間処理、及び／または短波長紫外線照射のような手順の実施は、混入の発生をさらに減少させてきた。それにもかかわらず、ウイルス混入の危険性はなおも残っている。混入発生は、製造品の損失、市場に対する一時的な撤退、及び多額の汚染除去経費の点で、製造元にとっては破滅的であろう。したがって、ウイルス感染に対する耐性を高めた哺乳類細胞株の必要がある。

本開示の種々の態様の中にあるのは、哺乳類細胞におけるウイルス侵入及び／またはウイルス増殖を妨害または防止するよう操作された哺乳類細胞株の提供である。いくつかの実施形態において、当該哺乳類細胞株は、少なくとも１つのウイルスの侵入及び／または増殖が、修飾されていない親細胞株と比較して減少または除去されるよう遺伝的に修飾されている、種々の実施形態において、本明細書示した哺乳類細胞株は、少なくとも１つの修飾された染色体配列を含む。さらなる実施形態において、当該修飾された染色体配列は、当該細胞株が、コードされたタンパク質生成物をまったく産生しないようまたは減少したレベルで産生するよう失活している。

一実施形態において、当該細胞株は、Ｃｏｒｅ１酵素シャペロン（ＣＯＳＭＣ）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。別の実施形態において、ＣＯＳＭＣをコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＣＯＳＭＣをまったく産生しない。代替的な実施形態において、当該細胞株は、溶質輸送体ファミリー３５（ＣＭＰシアル酸輸送体）メンバーＡ１（Ｓｌｃ３５Ａ１）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。別の実施形態において、Ｓｌｃ３５Ａ１をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、細胞株はＳｌｃ３５Ａ１をまったく産生しない。なおも別の実施形態において、当該細胞株は、ｃｏｒｅ１伸長酵素（Ｃ１ＧａｌＴ１）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、Ｃ１ＧａｌＴ１をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＣ１ＧａｌＴ１をまったく産生しない。さらなる実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１型（Ｓｔ３Ｇａｌ１）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。別の実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ１をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ１をまったく産生しない。代替的な実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２型（Ｓｔ３Ｇａｌ２）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。別の実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ２をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ２をまったく産生しない。さらに別の実施形態において、当該細胞株はＳｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３型（Ｓｔ３Ｇａｌ３）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ３をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ３をまったく産生しない。なおも別の実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４型（Ｓｔ３Ｇａｌ４）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。別の実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ４をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ４をまったく産生しない。代替的な実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５型（Ｓｔ３Ｇａｌ５）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ５をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ５をまったく産生しない。さらに別の実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ６型（Ｓｔ３Ｇａｌ６）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ６をコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、当該細胞株はＳｔ３Ｇａｌ６をまったく産生しない。代替的な実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及びＳｔ３Ｇａｌ６の任意の２つをコードする失活した染色体配列を含む。さらに別の実施形態において、当該細胞株は、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及びＳｔ３Ｇａｌ６の任意の３つをコードする失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、ＣＯＳＭＣ、Ｓｌｃ３５Ａ１、Ｃ１ＧａｌＴ１、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする失活した染色体配列を含む細胞株はさらに、マンノシル（アルファ−１，３−）−糖タンパク質ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１型（Ｍｇａｔ１）、マンノシル（アルファ−１，６−）−糖タンパク質ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２型（Ｍｇａｔ２）、マンノシル（アルファ−１，４−）−糖タンパク質ベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３型（Ｍｇａｔ３）、マンノシル（アルファ−１，３−）−糖タンパク質ベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ４型（Ｍｇａｔ４）、及び／またはマンノシル（アルファ−１，６−）−糖タンパク質ベータ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ５型（Ｍｇａｔ５）をコードする失活した染色体配列を含む。修飾した染色体配列を含む本明細書に開示した哺乳類細胞株は、修飾していない親細胞株と比較して、ウイルス侵入及び／またはウイルス増殖に対する耐性亢進を有している。なおも他の実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする失活した染色体配列を含む細胞株はさらに、２，６−結合を作る原因である少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｔ６ベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１型（Ｓｔ６Ｇａｌ１）、Ｓｔ６ベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ２型（Ｓｔ６Ｇａｌ２）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド１型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ１）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド２型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ２）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド３型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ３）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド４型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ４）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド５型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ５）、及び／またはＳｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド６型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ６））を過剰発現するよう操作される。

いくつかの実施形態において、当該哺乳類細胞株は、非ヒト細胞株である。他の実施形態において、当該哺乳類細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。具体的な実施形態において、当該細胞株は、ＣＯＳＭＣ、Ｓｌｃ３５Ａ１、Ｃ１ＧａｌＴ１、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、Ｓｔ３Ｇａｌ６、またはこれらの組み合わせをコードする失活した染色体配列を含むＣＨＯ細胞株である。

ある実施形態において、本明細書に開示した哺乳類細胞株は、パルボウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノ随伴ウイルス、カリチウイルス、パラインフルエンザウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルス、ノロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオーマウイルス、またはこれらの組み合わせから選択されるウイルスの侵入及び／または増殖に対して耐性を呈する。いくつかの実施形態において、パロウイルスは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、マウスパルボウイルス１型、マウスパルボウイルス２型、マウスパルボウイルス３型、ブタパルボウイルス１型、ウシパロウイルス１型、ヒトパロウイルスＢ１９型、ヒトパロウイルス４型、ヒトパロウイルス５型、またはこれらの組み合わせである。追加の実施形態において、レオウイルスは、哺乳類レオウイルス３型、哺乳類オルトレオウイルス、鳥類オルトレオウイルス、またはこれらの組み合わせである。

種々の実施形態において、本明細書に開示した哺乳類細胞株は、標的エンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム修飾技術を用いて、少なくとも１つの染色体配列を修飾することによって調製される。標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、または人工標的化ＤＮＡ二本鎖破壊誘導因子であることができる。具体的な実施形態において、標的エンドヌクレアーゼは、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示した哺乳類細胞株はさらに、抗体、抗体フラグメント、ワクチン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、凝固因子、または別の治療用タンパク質から選択される組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む。

本開示の別の態様は、組換えタンパク質生成物に関するウイルス混入の低下方法または防止方法を包含し、当該方法は、本明細書に開示したウイルス耐性哺乳類細胞株を得ること、及び当該細胞株において当該組換えタンパク質生成物を発現させることを含む。

本開示のさらなる態様は、生物学的製造系に関するウイルス混入の危険性の低下方法を提供し、この中で、当該方法は、当該生物学的製造系における使用のための本明細書に開示したウイルス耐性哺乳類細胞株を提供することを含む。

本開示のなおも別の態様は、本明細書に開示したウイルス耐性哺乳類細胞株及び少なくとも１つのウイルスを含む組成物を包含し、この中で、当該細胞株は、当該少なくとも１つのウイルスによる感染に対する耐性を呈する。

本開示の他の態様及び反復は、以下により詳細に説明する。

サザンブロット分析によってアッセイされるようなＭＶＭウイルス感染の時間経過を表している。野生型細胞（ＣＨＯＺＮ ＧＳ−／−）、Ｓｌｃ３５Ａ１ ＫＯ、ＣＯＳＭＣ ＫＯ、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＧ０３、及びＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＨ０５について２４、４８、７２及び９６時間時に検出されたＭＶＭウイルスＤＮＡの相対量でプロットした。クローンＨ０５は、１２ｂｐのフレーム内欠失を有している（すなわち、フレームシフト突然変異はない）。 プラークアッセイによって検出されるようなＭＶＭウイルス感染の時間経過を示している。野生型細胞（ＣＨＯＺＮ）、Ｓｌｃ３５Ａ１ ＫＯ、ＣＯＳＭＣ ＫＯ、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＧ０３、及びＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＨ０５について２４、４８、７２及び９６時間時に検出したｐｆｕ／ｍＬをプロットしている。 細胞増殖に及ぼすＭＭＶ感染の効果を示している。感染多重度が１または８のＭＶＭウイルスの非存在下（実線）及び存在下（破線）での野生型（２Ｅ３）細胞（Ａ）及びＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７細胞（Ｂ）についての１２０時間の時間経過にわたる生細胞の数（個／ｍｌ）をプロットしている。 ＭＭＶ感染後の細胞結合ウイルスの時間経過を表している。感染多重度が１（Ａ）または８（Ｂ）のＭＶＭウイルスの存在下での野生型（２Ｅ３）細胞（実線）及びＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７細胞（破線）についての１２０時間の時間経過にわたる定量的ＰＣＲを介して検出した細胞１個当たりのＭＶＭウイルスゲノムコピー数（ｖｇｃ）（各感染細胞が２×１０^４個のｖｇｃを産生することができるという過程を基にしている）をプロットしている。 示された細胞株におけるＭＭＶ複製の時間経過を示している。感染多重度が０．３（Ａ）または０．０３（Ｂ）でのＭＶＭウイルス感染の０時間後及び２１時間後のｖｇｃ／試料をプロットしている。 示された細胞株におけるレオウイルス３型複製の時間経過を表している。レオ３ウイルスによる感染の０時間後及び２４時間後の野生型細胞（２Ｅ３）に対するｖｇｃ／試料をプロットしている。 ＭＶＭウイルスの非存在下（ＵＮ）または存在下（ＩＮ）で増殖した細胞についての増殖アッセイを表している。パネルＡは、１０日間にわたる野生型（ＧＳ）、Ｓｌｃ３５Ａ１ ＫＯ、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７、及びＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＧ０３についての生細胞密度（ＶＣＤ）を表している。パネルＢは、野生型（ＧＳ）、ＣＯＳＭＣ ＫＯクローンＦ０７由来のＩｇＧ産生クローン７１Ｈ１及び７１Ｃ３についての８日間にわたるＶＣＤを表している。 ＭＶＭウイルスの非存在下（ＵＮ）または存在下（ＩＮ）で増殖した細胞についての増殖アッセイを表している。９日間にわたる野生型（ＧＳ）、Ｓｔ３Ｇａｌ４ ＫＯクローン７Ｄ１０、Ｓｔ３Ｇａｌ４ ＫＯクローン１Ｂ０８、及びＳｔ３Ｇａｌ４ ＫＯクローン１Ｂ１０についてのＶＣＤをプロットしている。

（詳細な説明）
本開示は、哺乳類細胞株におけるウイルス侵入及び／またはウイルス増殖を妨害または防止するよう操作された当該細胞株を提供する。ウイルス耐性を有する操作された細胞株は、修飾された（例えば、失活した）染色体配列を含有するよう遺伝的に修飾することができる。組換えタンパク質を生成するための本明細書に開示した細胞株の使用方法も提供され、この中で、当該組換えタンパク質は、ウイルス混入が本質的にない。ウイルス感染に耐性のある細胞株の使用はそれゆえ、生物学的製造系及びその結果としてのタンパク質生成物に関するウイルス混入の危険性を低下または除去する。

（Ｉ）ウイルス耐性細胞株
本開示の一態様は、ウイルス耐性を有するよう操作された哺乳類細胞株を包含する。別の方法で述べると、本明細書に開示した細胞株は、修飾されていない親細胞株と比較して少なくとも１つのウイルスによる感染に対する高まった耐性を有している。より具体的には、当該ウイルスの侵入及び／または当該ウイルスの増殖は、修飾されていない親細胞株と比較して本明細書で開示した操作された細胞株において減少しまたは除去されている。いくつかの実施形態において、当該哺乳類細胞株は、遺伝的に修飾されており、かつ少なくとも１つの修飾された染色体配列を含有する。概して、当該修飾された配列は突然変異を含む。具体的な実施形態において、当該修飾された染色体配列は、コードしたタンパク質生成物が当該細胞株によって産生されないよう失活している（またはノックアウトされている）。

概して、ウイルス感染に対する耐性（または感受性）は、１つまたは複数のウイルスへの曝露に対する操作された哺乳類細胞株の応答を、同じウイルス負荷に対する修飾されていない（操作されていない）親細胞の応答と比較することによって判定することができる。当該細胞株のウイルス感染及び／または当該細胞株におけるウイルス増殖は、種々の技術によって分析することができる。適切な技術の非限定例としては、核酸検出法（例えば、具体的なウイルス核酸の存在を検出するサザン核酸ブロッティングアッセイ、ウイルス核酸を検出するＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、配列決定法、及びこれらに類するもの）、抗体系技術（例えば、抗ウイルスタンパク質抗体を用いるウイルスイムノブロッティング技術、ＥＬＩＳＡ法など）、バイオアッセイ（例えば、プラークアッセイ、細胞変性効果アッセイ、及びこれらに類するもの）、及び顕微鏡技術（例えば、ウイルス粒子を検出する電子顕微鏡など）が挙げられる。いくつかの実施形態において、操作された哺乳類細胞株内でのウイルスの感染及び／またはウイルス増殖は、修飾されていない親細胞株のものと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、または約９９％超ほど減少させることができる。具体的な実施形態において、当該操作された哺乳類細胞株は、ウイルス感染に対して耐性があり、すなわち、当該ウイルスは当該操作された哺乳類細胞株において侵入及び／または増殖することができない。

本明細書に開示した哺乳類細胞株は、ウイルス耐性を付与する種々の異なる方法で操作することができる。いくつかの実施形態において、当該細胞株は、細胞表面受容体を介するウイルス侵入が減少しまたは除去されるよう修飾することができる。他の実施形態において、当該細胞株は、複製及び／または感染性に関与する具体的なウイルスタンパク質を阻害または遮断する分子を発現するよう操作することができる。なおも他の実施形態において、当該細胞株は、具体的な細胞抗ウイルスタンパク質を過剰発現するよう操作することができる。いくつかの実施形態において、当該操作は遺伝的であることができ、この中で、ゲノム配列または染色体配列が修飾される。別の方法で述べると、当該細胞株は、遺伝的に修飾される。他の実施形態において、当該操作は、エピジェネティックまたは染色体外であることができる。

（ａ）ウイルス耐性の機序
（ｉ）細胞表面受容体の撹乱
特定の実施形態において、当該哺乳類細胞株は、変化した細胞表面受容体を含有するよう操作される。ウイルスは、細胞の表面上の相補的受容体への特異的結合を介して細胞に侵入することができる。多くのウイルスについて、これらの細胞表面受容体は、タンパク質（または脂質）へ結合したグリカン構造を含む。シアル酸またはその誘導体において終止するグリカンは、多くのウイルスのための受容体として機能する（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈら，２０１３，Ｔｏｐ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ，ＤＯＩ：１０．１００７／１２８＿２０１３＿４６６）。したがって、末端シアル酸残基を有するＯ結合またはＮ結合グリカンを含む糖タンパク質は、数多くのウイルスのための細胞表面受容体として機能することができる。シアル酸は、ノイラミン酸の誘導体といわれ、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮＡＮＡ）及びＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮＧＮＡ）を含む。

いくつかの実施形態において、当該細胞株は、末端シアル酸残基を欠失する糖タンパク質を含むよう操作される。末端シアル酸残基は、グリカン鎖の合成に関与する酵素及び／またはタンパク質を欠失し（すなわちノックアウトさせ）または変化させることによって除去することができる。適切な標的には、Ｏ結合グリカンの合成に関与する酵素若しくはタンパク質、Ｎ結合グリカンの合成に関与する酵素若しくはタンパク質、及び／またはシアル酸の合成若しくは輸送に関与する酵素若しくはタンパク質を含む。

特定の実施形態において、当該細胞株は、上記の標的となった酵素またはタンパク質（または上記の標的の任意の組み合わせ）の少なくとも１つにおいて欠損していることができる。本明細書で使用する場合、「欠損した」は、標的となった酵素若しくはタンパク質の減少した若しくは検出不可能なレベル、または標的となった酵素若しくはタンパク質の減少した若しくは検出不可能な活性を指す。標的となった酵素若しくはタンパク質の量若しくは活性は、標的となったタンパク質若しくは酵素をコードする少なくとも１つの染色体配列を修飾することによって減少させまたは除去することができる。例えば、当該染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、またはこれらの組み合わせを含有するよう修飾することができる。したがって、欠失（複数可）、挿入（複数可）、及び／または置換（複数可）は、タンパク質生成物が産生されないように染色体配列の読み枠を移動させることができる（すなわち、染色体配列は失活する）。あるいは、修飾された染色体配列における欠失（複数可）、挿入（複数可）、及び／または置換（複数可）は、変化したタンパク質生成物の産生をもたらす可能性がある。対象の染色体配列の修飾は、標的となったエンドヌクレアーゼにより仲介されるゲノム編集技術を用いて達成することができ、当該技術は、後述の第（III）（ａ）節において詳述する。標的となった酵素またはタンパク質をコードする１つの染色体配列が失活している場合、操作された細胞株は、レベルの下がった標的となった酵素またはタンパク質を産生する。標的となった酵素またはタンパク質をコードする染色体配列（複数可）のコピーがすべて失活している場合、操作された細胞株は、標的となった酵素またはタンパク質を産生しない（すなわち、当該細胞株はノックアウトつまりＫＯである）。なおも他の実施形態において、標的となった酵素またはタンパク質のレベルは、ＲＮＡ干渉仲介性機序を用いて減少しまたは除去することができ、当該機序は、後述の第（ＩＩＩ）（ｂ）節において説明する。

いくつかの実施形態において、標的となった酵素またはタンパク質のレベルは、少なくとも約５％、約５〜１０％、約１０〜２０％、約２０〜３０％、約３０〜４０％、約４０〜５０％、約５０〜６０％、約６０〜７０％、約７０〜８０％、約８０〜９０％、または約９０〜約１００％ほど低下させることができる。他の実施形態において、標的となった酵素またはタンパク質のレベルは、当該分野において標準的な技術（例えば、ウェスタンイムノブロッティングアッセイ、ＥＬＩＳＡ酵素アッセイ、及びこれらに類するもの）を用いて検出不可能なレベルまで低下させることができる。

いくつかの実施形態において、当該細胞株は、Ｏ結合グリコシル化に関与する酵素またはタンパク質が欠損していることができる。例えば、当該細胞株は、ｃｏｒｅ１伸長酵素（ｃｏｒｅ１シンターゼ糖タンパク質−Ｎ−アセチルガラクトサミン３−ベータ−ガラクトシルトランスフェラーゼ１型またはＣ１ＧａｌＴ１とも呼ぶ）、ｃｏｒｅ１酵素シャペロン（Ｃ１ＧａｌＴ１特異的シャペロンまたはＣＯＳＭＣとも呼ぶ）、またはこれらの両者が欠損していることができる。ＣＯＳＭＣは、折り畳み、安定性、及び活性Ｃ１ＧａｌＴ１を促進し、当該Ｃ１ＧａｌＴ１は、ガラクトース残基の、タンパク質のセリンまたはトレオニンへＯ結合しているＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基への転移を触媒する。具体的な実施形態において、当該細胞株は、Ｃ１ＧａｌＴ１、ＣＯＳＭＣ、またはこれらの両方が欠損している。当該欠損性は、低くなったレベルのまたはまったくないＣ１ＧａｌＴ１及び／またはＣＯＳＭＣタンパク質を産生するよう、Ｃ１ＧａｌＴ１及び／またはＣＯＳＭＣをコードする失活した染色体配列によることができる。いくつかの場合において、Ｃ１ＧａｌＴ１及び／またはＣＯＳＭＣをコードする少なくとも１つの染色体配列は失活している。他の場合において、Ｃ１ＧａｌＴ１及び／またはＣＯＳＭＣをコードする染色体配列のコピーはすべて失活しており、それにより当該細胞株は、Ｃ１ＧａｌＴ１タンパク質及び／またはＣＯＳＭＣタンパク質を欠いている。

他の実施形態において、当該細胞株は、少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）が欠損していることができる。当該シアリルトランスフェラーゼは、アルファ−２，３結合立体配座においてガラクトースへシアル酸を付加するシアリルトランスフェラーゼ、アルファ−２，６結合立体配座においてガラクトース若しくはＮ−アセチルガラクトサミンへシアル酸を付加するシアリルトランスフェラーゼ、またはアルファ−２，８結合立体配座において他のシアル酸単位へシアル酸を付加するシアリルトランスフェラーゼであることができる。適切なシアリルトランスフェラーゼの非限定例としては、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ１型（Ｓｔ３Ｇａｌ１）、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ２型（Ｓｔ３Ｇａｌ２）、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ３型（Ｓｔ３Ｇａｌ３）、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４型（Ｓｔ３Ｇａｌ４）、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ５型（Ｓｔ３Ｇａｌ５）、Ｓｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ６型（Ｓｔ３Ｇａｌ６）、Ｓｔ６ベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１型（Ｓｔ６Ｇａｌ１）、Ｓｔ６ベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ２型（Ｓｔ６Ｇａｌ２）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド１型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ１）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド２型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ２）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド３型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ３）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド４型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ４）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド５型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ５）、Ｓｔ６（アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニル−２，３−ベータ−ガラクトシル−１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニド６型（Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ６）、Ｓｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ１型（Ｓｔ８Ｓｉａ１）、Ｓｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ２型（Ｓｔ８Ｓｉａ２）、Ｓｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ３型（Ｓｔ８Ｓｉａ３）、Ｓｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ４型（Ｓｔ８Ｓｉａ４）、Ｓｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ５型（Ｓｔ８Ｓｉａ５）、またはＳｔ８アルファ−Ｎ−アセチル−ノイラミニドアルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼ６型（Ｓｔ８Ｓｉａ６）とともに挙げられる。

具体的な実施形態において、当該細胞株は、少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６）が欠損していることができる。当該欠損性は、低くなったレベルの当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼが作られるまたは当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼがまったく作られないよう、当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする失活した染色体配列によることができる。いくつかの場合において、当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの染色体配列は失活していることができる。他の場合において、当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする染色体配列のコピーはすべて失活していることができ、それにより当該細胞株は当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼを欠いている。別の方法で述べると、Ｓｔ３Ｇａｌ１、２、３、４、５、及び／または６をコードする染色体配列はノックアウトされていることができる。

当該細胞株が当該少なくとも１つのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６）をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含むいくつかの場合、当該細胞株はさらに、２，６−結合をなす原因となる少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｔ６Ｇａｌ１、Ｓｔ６Ｇａｌ２、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ１、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ２、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ３、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ４、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ５、及び／またはＳｔ６ＧａｌＮａｃ６）を過剰発現するよう操作することができる。したがって、このような細胞株は、減少した数の末端２，３−結合したシアル酸残基を有する（または末端２，３−結合したシアル酸残基をまったく有さない）及び増加した数の末端２，６−結合したシアル酸残基を有する糖タンパク質を含むことができる。

さらなる実施形態において、当該細胞株は、シアル酸の合成または輸送に関与する少なくとも１つの酵素またはタンパク質が欠損していることができる。シアル酸の合成または輸送に関与する酵素またはタンパク質の例としては、制限なしで、グルコサミン（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル）−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ）、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンテターゼ（ＣＭＡＳ）、及びシチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、溶質輸送体ファミリー３５（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）、メンバーＡ１（Ｓｌｃ３５Ａ１）が挙げられる。特定の実施形態において、当該細胞株は、ＣＭＰ−シアル酸をゴルジ体へ輸送するＳｌｃ３５Ａ１が欠損していることができる。いくつかの場合において、Ｓｌｃ３５Ａ１をコードする少なくとも１つの染色体配列は失活していることができる。他の場合において、Ｓｌｃ３５Ａ１をコードする染色体配列のコピーはすべて失活していることができ、それにより当該細胞はＳｌｃ３５Ａ１タンパク質を欠いている。

追加の実施形態において、当該細胞株は、Ｎ−グリコシル化に関与する少なくとも１つの酵素またはタンパク質が欠損していることができる。いくつかの場合において、Ｎ−グリコシル化に関与する酵素またはタンパク質は、Ｎ結合したグリカンのベータ結合したマンノース残基へＧｌｃＮＡｃ残基を付加するＮ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼであることができる。例としては、マンノシル（アルファ−１，３−）−糖タンパク質ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１型（Ｍｇａｔ１）、マンノシル（アルファ−１，６−）−糖タンパク質ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２型（Ｍｇａｔ２）、マンノシル（アルファ−１，４−）−糖タンパク質ベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ３型（Ｍｇａｔ３）、マンノシル（アルファ−１，３−）−糖タンパク質ベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ４型（Ｍｇａｔ４）、及びマンノシル（アルファ−１，６−）−糖タンパク質ベータ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ５型（Ｍｇａｔ５）が挙げられる。他の場合において、Ｎ−グリコシル化に関与する酵素またはタンパク質は、Ｎ結合したグリカンのＧｌｃＮＡｃ残基へ、ベータ１，４結合におけるガラクトース残基を付加するガラクトシルトランスフェラーゼであることができる。当該ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド１（Ｂ４ＧａｌＴ１）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド２（Ｂ４ＧａｌＴ２）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド３（Ｂ４ＧａｌＴ３）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド４（Ｂ４ＧａｌＴ４）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド５（Ｂ４ＧａｌＴ５）、ＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド６（Ｂ４ＧａｌＴ６）、またはＵＤＰ−Ｇａｌ：ベータＧｌｃＮＡｃベータ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド７（Ｂ４ＧａｌＴ７）であることができる。ある場合において、当該細胞株は、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコイルアミニルトランスフェラーゼ及び／またはガラクトシルトランスフェラーゼが欠損していることができる。いくつかの反復において、当該少なくとも１つのＮ−アセチルグルコイルアミニルトランスフェラーゼ及び／またはガラクトシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの染色体配列は失活していることができる。他の場合において、当該少なくとも１つのＮ−アセチルグルコイルアミニルトランスフェラーゼ及び／またはガラクトシルトランスフェラーゼをコードする染色体配列のコピーはすべて失活していることができ、それにより当該細胞株は、当該少なくとも１つのＮ−アセチルグルコイルアミニルトランスフェラーゼ及び／またはガラクトシルトランスフェラーゼが欠けている。

（ｉｉ）ウイルスタンパク質への干渉
他の実施形態において、当該哺乳類細胞株は、ウイルスの複製及び／または感染性を阻害または遮断する分子を発現するよう操作することができる。例えば、当該細胞株は、複製及び／または感染性に関与する特異的なウイルスタンパク質に対する少なくとも１つのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）因子を安定して発現させるよう操作することができる。適切なウイルスタンパク質の非限定例としては、ＮＳ１またはＮＳ２のような非構造タンパク質、及びＶＰ１またはＶＰ２のようなカプシドタンパク質が挙げられる。ＲＮＡｉ因子は、標的転写産物へ結合し、当該転写産物切断の切断を仲介することまたは当該転写産物の翻訳を崩壊させることによってタンパク質発現を防止する。

いくつかの実施形態において、当該ＲＮＡｉ因子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であることができる。概して、ｓｉＲＮＡは、長さ約１５〜約２９ヌクレオチド、またはより一般的には長さ約１９〜約２３ヌクレオチドに及ぶ二本鎖ＲＮＡ分子を含む。具体的な実施形態において、当該ｓｉＲＮＡは、長さ約２１ヌクレオチドであることができる。このｓｉＲＮＡは任意に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハング、例えば、片端または両端における３’オーバーハングをさらに含むことができる。当該ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子から形成することができ、またはそれに代わるものとして、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から生成することができる（後述を参照されたい）。いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡの２つの鎖は完全に相補的であることができ、それにより当該２つの配列間に形成される二重鎖においてミスマッチまたはバルジは存在しない。他の実施形態において、当該ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、実質的に相補的であることができ、それにより当該２つの配列間に形成される二重鎖においてミスマッチ及び／またはバルジは存在する。ある実施形態において、当該ｓｉＲＮＡの５’末端の１つまたは両方はリン酸基を有することができるのに対し、他の実施形態において、当該５’末端の１つまたは両方はリン酸基を欠乏していることができる。

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」とも呼ぶ当該ｓｉＲＮＡの１つの鎖には、標的転写産物とハイブリッド形成する部分を含む。いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は標的転写産物の領域と完全に相補的であることができ、すなわち、当該アンチセンス鎖は、当該ｓｉＲＮＡの長さのいたるところで単一のミスマッチまたはバルジがなく標的転写産物へハイブリッド形成する。他の実施形態において、当該アンチセンス鎖は、標的領域と実質的に相補的であることができ、すなわち、１つ以上のミスマッチ及び／またはバルジは、当該アンチセンス鎖及び標的転写産物によって形成される二重鎖において存在することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写産物のエキソン配列を標的としている。当業者は、標的転写産物についてのｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズム、及び／または市販のサービスに精通している。

他の実施形態において、当該ＲＮＡｉ因子は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることができる。概して、ｓｈＲＮＡは、二本鎖の十分に長鎖の〜中鎖のＲＮＡ干渉（上述のように）を形成するようハイブリッド形成したまたはハイブリッド形成することのできる少なくとも２つの相補的な部分と、当該二重鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分とを含むＲＮＡ分子である。当該構造は、ステムループ構造とも呼ぶことができ、当該ステムは二重鎖部分である。いくつかの実施形態において、当該構造の二重鎖部分は完全に相補的であることができ、それにより当該ｓｈＲＮＡの二重鎖領域にミスマッチまたはバルジがない。他の実施形態において、当該構造の二重鎖部分は実質的に相補的であることができ、それにより１つ以上のミスマッチ及び／またはバルジは当該ｓｈＲＮＡの二重鎖部分において存在することができる。当該構造のループは、長さ約１〜約２０ヌクレオチド、具体的には長さ約６〜約９ヌクレオチドであることができる。当該ループは、当該標的転写産物（すなわち、当該ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）に相補的な領域の５’末端または３’末端のいずれかに存在することができる。

当該ｓｈＲＮＡはさらに、５’末端または３’末端上にオーバーハングを含むことができる。任意のオーバーハングは、長さ約１〜約２０ヌクレオチド、またはより具体的には長さ約２〜約１５ヌクレオチドであることができる。いくつかの実施形態において、当該オーバーハングは、１つ以上のＵ残基、例えば約１〜約５Ｕ残基を含むことができる。いくつかの実施形態において、当該ｓｈＲＮＡの５’末端はリン酸基を有することができる。概して、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉマシナリーによってｓｉＲＮＡへと加工される。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、ｓｈＲＮＡの部分と相補的な標的転写産物（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の発現を同様に阻害することができる。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計及び合成のための利用可能な資源に精通している。例示的な例は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。

当該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉ発現コンストラクトからインビボで発現させることができる。適切なコンストラクトには、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を含む。一実施形態において、当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びこれらのバリアント）であることができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、２つのプロモーター制御配列を含むことができ、この中で、各々は、2つの別個の相補的ｓｉＲＮＡ鎖が転写可能となるよう、操作可能に連結された適切なコード配列である。当該２つのプロモーター制御配列は、同じ向きにまた逆向きにあることができる。別の実施形態において、当該ＲＮＡｉ発現ベクターは、２つの相補的領域を含む単一ＲＮＡ分子の転写を駆動するプロモーター制御配列を含有することができ、それにより、当該転写はｓｈＲＮＡを形成する。概して、当該プロモーター制御配列（複数可）は、Ｕ６またはＨ１プロモーターのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモーターであるだろう。他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーター制御配列を使用することができる（いくつかの例を下記に呈する）。ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、転写終結配列、選択可能なマーカー配列などのような、追加の配列エレメントを含有することができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、標準的な手順を用いて、対象の細胞株へと導入することができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、安定した発現のために当該細胞株において染色体に組み込むことができる。あるいは、当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、安定した発現のために当該細胞株において染色体外（例えば、エピソーム）であることができる。

なおも他の実施形態において、当該細胞株は、複製及び／または感染力に関与するドミナントネガティブ形態のウイルスタンパク質を安定して発現するよう操作することができる。ドミナントネガティブ形態のタンパク質は、野生型タンパク質を負かすまたは阻害するよう変化または突然変異する。適切なタンパク質の非限定例としては、ＮＳ１またはＮＳ２のようなウイルス非構造的タンパク質、及びＶＰ１またはＶＰ２のようなウイルスカプシドタンパク質が挙げられる。具体的な実施形態において、当該細胞株は、ドミナントネガティブ形態の１つ以上のＮＳ１タンパク質を発現するよう操作することができる。

ドミナントネガティブタンパク質は、野生型タンパク質に対する欠失、挿入、及び／または置換を有することができる（Ｌａｇｎａら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，３６：７５〜９８）。当該欠失、挿入、及び／または置換は、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部位置であることができる。突然変異体タンパク質の生成手段（部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ系突然変異誘発、ランダム突然変異誘発など）は、ドミナントネガティブ効果を有するタンパク質の識別手段と同様に、当該技術分野で周知である。細胞株は、当該ドミナントネガティブタンパク質（複数可）をコードする配列を含む発現コンストラクト（複数可）（上述を参照されたい）を用いてトランスフェクトすることができ、この中で、当該コード配列は、発現のためのＰｏｌＩＩプロモーター制御配列へ操作可能に連結されている。プロモーター制御配列は、恒常的であることができ、調節されることができ、または組織特異的であることができる。

適切な恒常的プロモーター制御配列には、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）−アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの断片、または上述のいずれかの組み合わせを含むが、それらに限定しない。適切な調節型プロモーター制御配列の例としては、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節されるものが含まれるが、これらに限定しない。組織特異的プロモーターの非限定例としては、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、Ｎｐｈｓｌプロモーター、ＯＧ−２プロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、及びＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。当該プロモーター配列は、野生型であることができ、または当該プロモーター配列はより効率的なまたは効果的な発現のために修飾することができる。

当該発現コンストラクトは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点、及びこれらに類するものを含むことができる。追加の情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，第３版、２００１において認めることができる。

（ｉｉｉ）抗ウイルス応答に関与する細胞タンパク質の過剰発現
代替的な実施形態において、当該哺乳類細胞株は、宿主細胞抗ウイルス応答に関与する細胞タンパク質を過剰発現するよう操作することができる。抗ウイルス応答に関与するタンパク質の非限定例としては、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ、真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ２またはＥｉｆ２ａｋ２としても公知である）、受容体相互作用プロテインキナーゼ２（ＲＩＰＫ２）、インターフェロン（例えば、Ｉ型およびＩＩ型）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１及びＩＬ−６）、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロン調節因子１、ＳＴＡＴ、ｐ５３、活性化転写因子３、ＮＦ−κＢ、真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）、アポトーシスタンパク質の阻害因子（ＩＡＰ）、及びＺｎフィンガー抗ウイルスタンパク質（ＺＡＰ）が挙げられる。具体的な実施形態において、当該細胞株は、ＰＫＲを過剰発現するよう操作することができる。

過剰発現は、対象のタンパク質をコードする核酸配列の１つ以上の外来性コピーを導入することによって達成することができる。対象の細胞タンパク質をコードする配列は、ＰｏｌＩＩプロモーター制御配列へ操作可能に連結される（上述を参照されたい）。当該コード配列の複数のコピーは、直列に連結して、単一のプロモーター制御配列の制御下に置くことができる。対象のタンパク質をコードする配列（複数可）は、発現コンストラクトの一部として細胞株へと導入することができる（上述を参照されたい）。したがって、当該発現コンストラクトは、染色体位置へと挿入することができ、またはそれに代わるものとして、当該発現コンストラクトは、安定した発現のために染色体外（例えば、エピソーム）にあることができる。

過剰発現は、対象のタンパク質をコードする内在性染色体配列のプロモーター制御配列を修飾することによっても達成することができる。例えば、当該内在性プロモーター制御配列は、少なくとも１つの外来性の「強い」（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼ及び／または関連因子に対する高い親和性を有する）プロモーター制御配列を挿入することによって修飾することができる（当該プロモーター制御配列の例は、先に呈されている）。あるいは、当該内在性プロモーター制御配列の配列は、「強い」プロモーター制御配列を模倣するよう修飾することができる。内在性染色体配列は、以下の第（ＩＩＩ）節に詳述するターゲティングエンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム修飾技術を用いて修飾することができる。

（ｂ）細胞タイプ
本明細書に開示するウイルス耐性細胞株は、哺乳類細胞株である。いくつかの実施形態において、ウイルス感染に対する耐性を有する細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、マウス胚線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞、マウス胚間葉系Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２細胞、マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞、マウス乳房ＥＭＴ６細胞、マウス肝細胞腫Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞、マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞、マウス上皮ＭＴＤ−１Ａ細胞、マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞、マウス腎ＲｅｎＣａ細胞、マウス膵ＲＩＮ−５Ｆ細胞、マウス黒色腫Ｘ６４細胞、マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞、ラット神経膠芽腫９Ｌ細胞、ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞、ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞、ラット肝細胞腫細胞（ＨＴＣ）、バッファローラット肝ＢＲＬ ３Ａ細胞、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、イヌ乳房（ＣＭＴ）細胞、ラット骨肉腫Ｄ１７細胞、ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞、サル腎ＳＶ−４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）、サル腎ＣＶＩ−７６細胞、アフリカミドリザル腎（ＶＥＲＯ−７６）細胞、ヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ−４３１細胞、またはヒトＫ５６２細胞に由来することができる。哺乳類細胞株の広範なリストは、米国培養細胞系統保存機関カタログ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス市）において認め得る。他の実施形態において、ウイルス耐性を有する細胞株は、非ヒト哺乳類細胞株である。さらなる実施形態において、ウイルス耐性を有する細胞株は、非ヒト、非マウスの哺乳類細胞株である。特定の実施形態において、ウイルス耐性を有する細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。数多くのＣＨＯ細胞株は、ＡＴＣＣから入手可能である。適切なＣＨＯ細胞株には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びこれらの誘導体が含まれるが、それらに限定しない。

種々の実施形態において、当該細胞株は、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、またはこれらの組み合わせが欠損していることができる。例えば、ＧＳ、ＤＨＦＲ、及び／またはＨＰＲＴをコードする染色体配列は失活していることができる。具体的な実施形態において、ＧＳをコードする染色体配列はすべて、当該細胞株において失活している。

（ｃ）ウイルス
ウイルス耐性を有する操作された哺乳類細胞株は、種々の哺乳類ウイルスに耐性があり得る。当該ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得、当該ウイルスは外被があるまたは外被がない（「裸である」）ことができる。シアル酸受容体を介して哺乳類細胞へ結合及び進入することのできるウイルスの非限定例としては、パルボウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノ随伴ウイルス、カリシウイルス、パラインフルエンザウイルス、ルベラウイルス、コロナウイルス、ノロウイルス、脳心筋炎ウイルス、及びポリオーマウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態において、操作された哺乳類細胞株は、少なくとも１つのパルボウィルスによる感染に耐性がある。適切なパルボウイルスの非限定例としては、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）（マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）または齧歯類プロトパルボウイルス１型としても公知である）、マウスパルボウイルス１型（ＭＰＶ−１）、マウスパルボウイルス２型（ＭＰＶ−２）、マウスパルボウイルス３型（ＭＰＶ−３）、ブタパルボウイルス１型、ウシパルボウイルス１型、及びヒトパルボウイルス（例えば、ヒトパルボウイルスＢ１９型、ヒトパルボウイルス４型、ヒトパルボウイルス５型など）が挙げられる。特定の実施形態において、当該パルボウイルスはＭＶＭであることができる。他の実施形態において、当該ウイルスは、哺乳類レオウイルス３型、哺乳類オルトレオウイルス、鳥類オルトレオウイルス、及びこれらに類するもののような、レオウイルスであることができる。

いくつかの実施形態において、ウイルス感染に対する耐性を有する操作された哺乳類細胞株は、モリキュート目の生命体による感染に対する耐性も有することができる。特に、本明細書に開示する細胞株は、マイコプラズマ属またはスピロプラズマ属による感染に対して耐性があり得る。

（ｄ）組換えタンパク質をコードする任意の核酸
いくつかの実施形態において、ウイルス感染に対する耐性を有する哺乳類細胞株は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含むことができる。概して、当該組換えタンパク質は異種性であり、当該タンパク質が当該細胞特有ではないことを意味している。当該組換えタンパク質は、抗体、抗体のフラグメント、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、ＩｇＡ分子、ＩｇＤ分子、ＩｇＥ分子、ＩｇＭ分子、ワクチン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、ホルモン、凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）（または凝結（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ））因子、血液成分、酵素、治療用タンパク質、機能性食品タンパク質、上述のいずれかの機能的フラグメント若しくは機能的バリアント、あるいは上述のタンパク質及び／またはこれらの機能的フラグメント若しくはバリアントのいずれかを含む融合タンパク質から選択される治療用タンパク質であってもよいが、それらに限定しない。

いくつかの実施形態において、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、及び／またはグルタミンシンターゼ（ＧＳ）をコードする配列へ連結することができ、それによりＨＰＲＴ、ＤＨＦＲ、及び／またはＧＳは、増幅可能な選択可能なマーカーとして使用してもよい。当該組換えタンパク質をコードする核酸は、少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子をコードする配列及び／または蛍光タンパク質のようなマーカータンパク質をコードする配列へ連結することもできる。いくつかの実施形態において、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクトの一部であることができる。他所で詳述したように、発現コンストラクトまたは発現ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列、複製起点、及びこれらに類するものを含むことができる。追加の情報は、上述のＡｕｓｕｂｅｌら、２００３ならびに上述のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，２００１において認めることができる。

いくつかの実施形態において、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、染色体外に位置することができる。すなわち、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、または別の染色体外コンストラクトから一過性に発現することができる。他の実施形態において、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、当該細胞のゲノムへと染色体に組み込むことができる。当該組み込みは、無作為でありまたは標的化することができる。したがって、当該組換えタンパク質は、安定して発現することができる。本実施形態のいくつかの反復において、当該組換えタンパク質をコードする核酸配列は、適切な異種性発現制御配列（すなわち、プロモーター）へと操作可能に連結することができる。他の反復において、当該組換えタンパク質をコードする核酸は、内在性発現制御配列の制御下に置くことができる。当該組換えタンパク質をコードする核酸は、相同的組換え、ターゲティングエンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム編集、ウイルスベクター、トランスポゾン、プラスミド、および他の周知の手段を用いて当該細胞株のゲノムへと組み込むことができる、追加の手引きは、上述のＡｕｓｕｂｅｌら、２００３ならびに上述のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，２００１において認めることができる。

（ｅ）組成物
特定の実施形態において、ウイルス耐性を呈するよう操作した哺乳類細胞株は、組成物の一部であることができ、当該組成物は、少なくとも１つのウイルスも含む。当該組成物はそれゆえ、本明細書に開示する操作した細胞株（組換えタンパク質をコードする核酸を任意にさらに含む）及びウイルスを含み、この中で、少なくとも１つのウイルスの侵入及び／または増殖は、操作した哺乳類細胞株において減少または除去される。したがって、当該組成物中の細胞は増殖することができるが、当該組成物中のウイルスは、当該細胞内への当該ウイルスの侵入及び／または複製が減少または除去されるので、増殖することはできない。当該組成物はさらに、当該操作した哺乳類細胞株細胞の増殖を支援するための少なくとも１つの細胞増殖培地を含むことができる。いくつかの場合において、当該細胞増殖培地は、動物成分非含有培地である。

（ｆ）例示的な実施形態
具体的な実施形態において、ウイルス耐性を有する哺乳類細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。ウイルス耐性ＣＨＯ細胞株は、マウス最小ウイルス（ＭＶＭ）（マウス最小ウイルス（ＭＭＶ）または齧歯類プロトパルボウイルス１としても公知である）及び／または哺乳類レオウイルス３による感染に対して耐性があり得る。具体的には、当該遺伝的に修飾したＣＨＯ細胞株は、修飾されていない親ＣＨＯ細胞株と比較した場合、ＭＶＭ感染またはレオウイルス３感染に対する高くなった耐性を有している。いくつかの実施形態において、修飾されていない親細胞株は、ＣＨＯ（ＧＳ−／−）細胞株である。

ウイルス耐性ＣＨＯ細胞株は、ＣＯＳＭＣ、Ｓｌｃ３５Ａ１、Ｃ１ＧａｌＴ１、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする少なくとも１つの失活した染色体配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＳＭＣ、Ｓｌｃ３５Ａ１、Ｃ１ＧａｌＴ１、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする染色体配列のコピーはすべて、ＣＨＯ細胞株において失活しておりまたはノックアウトされている。他の実施形態において、ＣＯＳＭＣ、Ｓｌｃ３５Ａ１、Ｃ１ＧａｌＴ１、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする失活した染色体配列を含むＣＨＯ細胞はさらに、Ｍｇａｔ１、Ｍｇａｔ２、Ｍｇａｔ３、Ｍｇａｔ４、及び／またはＭｇａｔ５をコードする失活した染色体配列を含む。さらなる実施形態において、Ｓｔ３Ｇａｌ１、Ｓｔ３Ｇａｌ２、Ｓｔ３Ｇａｌ３、Ｓｔ３Ｇａｌ４、Ｓｔ３Ｇａｌ５、及び／またはＳｔ３Ｇａｌ６をコードする失活した染色体配列を含むＣＨＯ細胞はさらに、Ｓｔ６Ｇａｌ１、Ｓｔ６Ｇａｌ２、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ１、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ２、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ３、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ４、Ｓｔ６ＧａｌＮａｃ５、及び／またはＳｔ６ＧａｌＮａｃ６を過剰発現するよう操作される。

（ＩＩ）ウイルス混入の低下または予防方法
本開示の別の態様は、組換えタンパク質生成物のウイルス混入の減少または予防方法、あるいは生物学的生成系のウイルス混入の危険性の低下方法を包含する。概して、当該方法は、少なくとも１つのウイルスの侵入及び／または増殖が減少または除去される操作した哺乳類細胞株を提供すること、ならびに当該組換えタンパク質の生成のために当該細胞株を使用することを含む。当該操作した哺乳類細胞株は、先の第（Ｉ）節に詳述している。操作した哺乳類細胞株は、非修飾の親細胞株と比較して、ウイルス感染に対する高くなった耐性を呈する。当該操作した哺乳類細胞株は、第（Ｉ）（ｃ）節において説明するウイルスに対する耐性を呈する。適切な組換えタンパク質は、第（Ｉ）（ｄ）節に説明する。組換えタンパク質の生成または製造手段は、当該分野で周知である（例えば、「Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ（編）、２０１２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；ＩＳＢＮ：９７８−３−５２７−３３０２９−４を参照されたい）。具体的な実施形態において、当該操作した哺乳類細胞株は、当該細胞株がウイルス感染に対して耐性があるよう、少なくとも１つの修飾した染色体配列を含むよう遺伝的に修飾される。

概して、本明細書に開示する操作した哺乳類細胞株の使用は、複製可能なウイルスのレベルが微量レベルまたは、理想的には、産業標準の最良の実施によって検出できないレベルであるよう、発酵槽または他の生物製造容器中でウイルスが複製する能力を低下させる。適切な方法には、核酸検出方法（例えば、ウイルス核酸を検出するためのサザンブロッティング、ウイルス核酸を検出するためのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、配列決定法、及びこれらに類するもの）、抗体系技術（例えば、抗ウイルスタンパク質抗体を用いるウェスタンイムノブロッティング、ＥＬＩＳＡ法、など）、及び顕微鏡技術（細胞変性効果アッセイ、ウイルス粒子を検出するための電子顕微鏡、など）を含む。

（ＩＩＩ）ウイルス耐性細胞株の調製方法 本開示のさらに別の態様は、先に第（Ｉ）（ａ）（ｉ）節で詳述したように、変化した細胞表面受容体を有するウイルス耐性細胞の調製方法を提供する。グリカン鎖の合成に関与する酵素またはタンパク質をコードする染色体配列は、ウイルス耐性細胞株を生成するための手術の技術を用いてノックダウンまたはノックアウトすることができる。いくつかの実施形態において、当該ウイルス耐性細胞株は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム修飾方法によって調製することができる。他の実施形態において、当該ウイルス耐性細胞株は、ＲＮＡ干渉仲介性機序によって調製することができる。なおも他の実施形態において、当該ウイルス耐性細胞株は、部位特異的組換え系、ランダム突然変異誘発、または当該技術分野で公知の他の方法によって調製することができる。

（ａ）ターゲティングエンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム編集
ターゲティングエンドヌクレアーゼは、対象の具体的な染色体配列を修飾（すなわち、失活または変更）するために使用することができる。具体的な染色体配列は、ターゲティングエンドヌクレアーゼまたは当該ターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞中へと導入し、当該ターゲティングエンドヌクレアーゼが特定の染色体配列を標的とすることによって失活させることができる。一実施形態において、当該ターゲティングエンドヌクレアーゼは、特定の染色体配列を認識及び結合して、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）修復過程によって修復する二本鎖切断を導入する。ＮＨＥＪは誤りがちであるので、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、及び／または置換が生じることがあり、それにより、タンパク質生成物が生じないよう当該染色体配列のリーディングフレームを破壊することがある。別の実施形態において、当該ターゲティングエンドヌクレアーゼは、標的とする染色体配列の一部と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを同時に導入することによる相同的組換え反応を介して染色体配列を変更するために使用することもできる。当該ターゲティングエンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断は、結果的に当該染色体配列が変化または変更する様式で当該ポリヌクレオチドと交換されるような相同性指向化修復過程によって修復される。

種々のターゲティングエンドヌクレアーゼは、対象の染色体配列（複数可）を修飾するために使用することができる。当該ターゲティングエンドヌクレアーゼは、天然タンパク質または操作されたタンパク質であることができる。適切なターゲティングエンドヌクレアーゼには、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、部位特異的エンドヌクレアーゼ、及び人工標的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤を含むが、これらに限定しない。

（ｉ）Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ
具体的な実施形態において、当該ターゲティングエンドヌクレアーゼは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であることができる。ＺＦＮは、特異的な標的とする配列へ結合し、標的とする配列へ二本鎖切断を導入する。典型的には、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、Ｚｎフィンガー）及び切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、それらの各々は以下に説明する。

ＤＮＡ結合ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインまたはＺｎフィンガーは、選択する任意の核酸配列を認識してそれに結合するよう操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５〜１４１、Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３〜３４０、Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６〜６６０、Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２〜６３７、Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１〜４１６、Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３８５０〜３３８６０、Ｄｏｙｏｎら（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７０２〜７０８、及びＳａｎｔｉａｇｏら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：５８０９〜５８１４を参照されたい。操作したＺｎフィンガー結合ドメインは、天然のＺｎフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有することがある。操作方法には、合理的設計及び種々の種類の選択を含むが、これらに限定しない。合理的設計には例えば、二重、三重、及び／または四重ヌクレオチド配列ならびに個々のＺｎフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを含み、この中で、各二重、三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列を結合するＺｎフィンガーの１つ以上のアミノ酸と結合している。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号及び第６，５３４，２６１号を参照されたく、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例として、米国特許第６，４５３，２４２号において説明されるアルゴリズムは、事前に選択した配列を標的とするためのＺｎフィンガー結合ドメインを設計するよう使用することができる。非変性認識コード表を用いた合理的な設計のような代替的な方法も、特異的配列を標的とするためのＺｎフィンガー結合ドメインを設計するために使用してもよい（Ｓｅｒａら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：７０７４〜７０８１）。ＤＮＡ配列における可能性のある標的部位を識別するための及びＺｎフィンガー結合ドメインを設計するための公的に入手可能なウェブ系ツールは、当該技術分野で公知である。例えば、ＤＮＡ配列における可能性のある標的部位を識別するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇにおいて認めることができる。Ｚｎフィンガー結合ドメインを設計するためのツールは、ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴにおいて認めることができる（Ｍａｎｄｅｌｌら（２００６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３４：Ｗ５１６〜Ｗ５２３、Ｓａｎｄｅｒら（２００７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：Ｗ５９９〜Ｗ６０５も参照されたい）。

Ｚｎフィンガー結合ドメインは、長さ約３ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドにまで及ぶＤＮＡ配列を認識及び結合するよう設計することができる。一実施形態において、当該Ｚｎフィンガー結合ドメインは、長さ約９〜約１８ヌクレオチドに及ぶＤＮＡ配列を認識及び結合するよう設計することができる。概して、本明細書で使用するＺｎフィンガーヌクレアーゼのＺｎフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのＺｎフィンガー認識領域またはＺｎフィンガーを含み、この中で各Ｚｎフィンガーは３つのヌクレオチドを結合する。一実施形態において、当該Ｚｎフィンガー結合ドメインは、４つのＺｎフィンガー認識領域を含む。別の実施形態において、当該Ｚｎフィンガー結合ドメインは、５つのＺｎフィンガー認識領域を含む。なおも別の実施形態において、当該Ｚｎフィンガー結合ドメインは、６つのＺｎフィンガー認識領域を含む。Ｚｎフィンガー結合ドメインは、任意の適切な標的ＤＮＡ配列へ結合するよう設計することができる。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号、第６，５３４，２６１号及び第６，４５３，２４２号を参照されたく、それらの開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。

Ｚｎフィンガー認識領域の例示的な選択方法には、ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含み、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号、及び第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７及び英国特許第２，３３８，２３７号に説明されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、Ｚｎフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の亢進は、例えばＷＯ０２／０７７２２７に説明されており、その全体的な開示は参照により本明細書に組み込まれる。

Ｚｎフィンガー結合ドメインならびに融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築方法は、当業者に公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号に詳細に説明されている。Ｚｎフィンガー認識領域及び／または多指化Ｚｎフィンガータンパク質は、例えば、長さ５アミノ酸以上のリンカーを含む適切なリンカー配列を用いて互いに連結することができる。長さ６アミノ酸以上のリンカー配列に関する非限定例については、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、及び第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に説明するＺｎフィンガー結合ドメインには、当該タンパク質の個々のＺｎフィンガー間の適切なリンカーの組み合わせを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼはさらに、核移行シグナルまたは配列（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、染色体における標的配列に二本鎖切断を導入するために核内へとＺｎフィンガーヌクレアーゼタンパク質を向かわせることを促進するアミノ酸配列である。核局在シグナルは、当該技術分野で公知である。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈら（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６：１０２５〜１０２７を参照されたい。

切断ドメイン Ｚｎフィンガーヌクレアーゼには、切断ドメインも含む。当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが得られることのできるエンドヌクレアーゼの非限定例としては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定しない。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓカタログまたはＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９〜３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素は公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、リョクトウヌクレアーゼ、膵ＤＮアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上は、切断ドメインの源として使用することができる。

切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、先に説明したような酵素またはその部分から得ることもできる。２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼは、各ヌクレアーゼが、活性のある酵素二量体の単量体を含むので、切断に必要とすることができる。あるいは、単一のＺｎフィンガーヌクレアーゼは、活性のある酵素二量体を作るために両単量体を含むことができる。本明細書で使用する場合、「活性のある酵素二量体」は、核酸分子を切断することのできる酵素二量体である。当該２つの切断単量体は、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から得ることができ、または各単量体は、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）から得ることができる。

２つの切断単量体が活性のある酵素二量体を形成するのに使用される場合、当該２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼについての認識部位は好ましくは、例えば二量体化によって活性のある酵素二量体を当該切断単量体に形成させるたがいに対して空間的な向きで、当該２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼの個々の認識部位への当該２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼの結合が、当該切断単量体を配置するように配備される。結果として、当該認識部位の近端は、約５〜約１８ヌクレオチドほど分離することができる。例えば、当該近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドほど分離することができる。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの認識部位（例えば、約２〜約５０ヌクレオチド対以上）間に介在することができることは理解されるであろう。例えば本明細書で詳細に説明されるもののような当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６ヌクレオチドほど分離することができる。概して、切断部位は認識部位間にある。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位における）ＤＮＡに対して配列特異的に結合することができ、結合部位におけるまたは当該結合部位の近くにあるＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から取り出された部位におけるＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有している。例えば、ＩＩＳ型酵素であるＦｏｋＩは、片方の鎖における当該酵素の認識部位から９ヌクレオチドにおいて及びもう一方の鎖における当該酵素の認識部位から１３ヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５〜４２７９、Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４〜２７６８、Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３〜８８７、Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１９７８〜３１９８２を参照されたい。したがって、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン及び１つ以上のＺｎフィンガー結合ドメインを含むことができ、当該ドメインは操作されていてもよくまたは操作されていなくてもよい。例示的なＩＩＳ型制限酵素は、例えば、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０７／０１４，２７５において説明されている。追加の制限酵素も分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを含有しており、これらも本開示によって熟慮されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８〜４２０を参照されたい。

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性がある（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０〜１０，５７５）。したがって、本開示の目的のために、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼにおいて使用するＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体とみなす。このように、ＦｏｋＩ切断ドメインを用いた標的とした二本鎖切断のために、ＦｏｋＩ切断単量体を各々含む２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼは、活性のある酵素二量体を再構成するために使用することができる。あるいは、Ｚｎフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子も使用することができる。

特定の実施形態において、当該切断ドメインは、ホモ二量体化を最小限にするまたは防止する１つ以上の操作された切断単量体を含む。非限定例として、ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、及び５３８におけるアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断半ドメインの二量体化に影響するための標的である。必須のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断単量体には、第一の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基位置４９０及び５３８における突然変異を含む一対、及びアミノ酸残基位置４８６及び４９９における突然変異を含み第二の切断単量体を含む。

このように、操作した切断単量体の一実施形態において、アミノ酸位置４９０における突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換え、アミノ酸残基５３８における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換え、アミノ酸残基４８６における突然変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）と置き換え、位置４９９における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置き換える。具体的には、操作された切断単量体は、１つの切断単量体における位置４９０をＥからＫへ、かつ５３８をＩからＫへ突然変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名される操作された切断単量体を生成することによって、及び別の切断単量体において位置４８６をＱからＥへ、かつ４９９をＩからＫへ突然変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｋ」と命名される操作された切断単量体を生成することによって調製することができる。上記の操作された切断単量体は、異常な切断を最小限にするまたは排除する必須のヘテロ二量体突然変異体である。操作された切断単量体は、適切な方法を用いて、例えば、全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，８８８，１２１号において説明される野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的突然変異誘発によって調製することができる。

追加のドメイン
いくつかの実施形態において、当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼはさらに、少なくとも１つの核移行配列（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内へと向かわせることを促進して、染色体における標的配列の二本鎖切断を導入するアミノ酸配列である。核移行シグナルは当該技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい）。例えば、一実施形態において、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）のような単深裂（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列であることができる。別の実施形態において、ＮＬＳは、二深裂配列（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）であることができる。なおも別の実施形態において、ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）であることができる。ＮＬＳは、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置することができる。

追加の実施形態において、当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つの細胞浸透ドメインも含むことができる。一実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質に由来する細胞浸透ペプチド配列であることができる。例として、当該ＴＡＴ細胞浸透配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）であることができる。別の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、ヒトＢ型肝炎ウイルスに由来する細胞浸透ペプチド配列であるＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５））であることができる。なおも別の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）であることができる。追加の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８））、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞浸透ペプチドまたはポリアルギニンペプチド配列であることができる。当該細胞浸透ドメインは、当該ＺｎフィンガーヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端または内部位置に位置することができる。

なおも他の実施形態において、当該Ｚｎフィンガーヌクレアーゼはさらに、少なくとも１つのマーカードメインを含むことができる。マーカードメインの非限定例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、及びエピトープタグが挙げられる。一実施形態において、当該マーカードメインは、蛍光タンパク質であることができる。適切な蛍光タンパク質の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、Ｚｓグリーン１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、Ｙペット、ファイＹＦＰ、Ｚｓイエロー１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍカラマ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、青緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシシアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍチェリー、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍラズベリー、ｍストロベリー、Ｊレッド）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラオレンジ、単量体クサビラオレンジ、ｍタンジェリン、ｔｄトマト）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。別の実施形態において、当該マーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであることができる。適切なタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンを含むが、これらに限定しない。マーカードメインは、当該ＺｎフィンガーヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置することができる。

マーカードメインは、２Ａペプチドによって当該Ｚｎフィンガーへ連結することができる（Ｓｚｙｍｃｚａｋら，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５８９（５）：５８９〜５９４）。当該２Ａペプチドは元々、プラス鎖ＲＮＡウイルスにおいて特徴づけられ、当該ウイルスは、成熟した個々のタンパク質への翻訳中に「切断した」ポリタンパク質を生成する。より具体的には、当該２Ａペプチド領域（約２０アミノ酸）は、それ自体のＣ末端で「切断」を仲介してそれ自体を当該ポリタンパク質の下流領域から放出する。概して、２Ａペプチド配列は、グリシン及びプロリン残基で終結する。２Ａペプチドの翻訳中に、リボソームはグリシン残基後で休止し、結果的に新生ポリペプチド鎖の放出を生じる。翻訳が再開するとともに、当該２Ａ配列のプロリン残基は当該下流タンパク質の第一のアミノ酸となる。

（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
他の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから得られるＲＮＡ先導型エンドヌクレアーゼである。細菌及び古細菌は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に挿入された短鎖パリンドローム反復）タンパク質及びＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ結合）タンパク質を用いて、侵入中のウイルスまたはプラスミドを検出および破壊するＲＮＡ系適応性免疫系を進化させてきた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的特異的合成先導ＲＮＡを提供することによって、標的となる部位特異的二本鎖切断を導入するようプログラムすることができる（Ｊｉｎｅｋら，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６〜８２１）。

エンドヌクレアーゼ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の系から得ることができる。適切なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６が挙げられる。

一実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムから得られる。例示的な実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質から得られる。当該Ｃａｓ９タンパク質は、Ａ群溶血性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ノカルジオプシス・ダソンヴィレィ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・ヴィリドクロモゲンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ヴィリドクロモゲンズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリヴァリゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラ・マリーナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリアレス・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニヴォランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチクム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダタス・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラネロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニクム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルドゥス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウム・ヴィノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドロバクター・ラセミフェル（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノドゥラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、またはアカリオクロリス・マリーナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）に由来することができる。一実施形態において、当該Ｃａｓ９タンパク質は、Ａ群溶血性レンサ球菌由来である。

概して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識ドメイン及び／またはＲＮＡ結合ドメインを含む。ＲＮＡ認識ドメイン及び／またはＲＮＡ結合ドメインは、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質が特異的染色体または染色体配列（すなわち、標的部位）に向かうよう、先導ＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインも含むことができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または野生型若しくは修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントから得ることができる。当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性及び／若しくは特異性を高め、酵素活性を変化させ、ならびに／または当該タンパク質の別の特性を変化させるよう修飾することができる。例えば、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾、欠失、または失活させることができる。当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、当該タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するよう切り詰めることができる。当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、当該タンパク質または当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と融合したエフェクタードメインの活性を最適化するよう切り詰めまたは修飾することもできる。

いくつかの実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片から得ることができる。他の実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、修飾されたＣａｓ９タンパク質から得ることができる。例えば、当該Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、当該タンパク質の１つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変化させるよう修飾することができる。あるいは、ＲＮＡ先導型切断に関与しないＣａｓ９タンパク質のドメインは、修飾されたＣａｓ９タンパク質が野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さくなるよう、当該タンパク質から除去することができる。

概して、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮアーゼ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは互いに作用して一本鎖を切断して、ＤＮＡ二本鎖切断をなす（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６〜８２１）。一実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質から得られ、２つの機能ヌクレアーゼドメインを含む。

天然に発生するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識される標的部位は、典型的には、約１４〜１５ｂｐの長さを有する（Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９〜８２３）。当該標的部位は、先導ＲＮＡの５’に相補的な配列（すなわち、プロトスペーサー配列と呼ばれる）の直後（３’または下流）には共通配列が続く。この共通配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（またはＰＡＭ）としても公知である。ＰＡＭの例としては、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、及びＮＮＡＧＡＡＷが挙げられるが、これらに限定しない（式中、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、かつＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）。典型的な長さで、当該標的部位の約５〜７％のみが標的ゲノム内に特有であろうし、オフターゲット効果が有意であり得ることを示している。当該標的部位の長さは、2つの結合事象を必要とすることによって伸長することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ系エンドヌクレアーゼは、当該エンドヌクレアーゼが二本鎖配列のうちの一本鎖しか切断することができないよう修飾することができる（すなわち、ニッカーゼへ転換される）。このように、２つの異なる先導ＲＮＡとのＣＲＩＳＰＲ系ニッカーゼの併用は本質的に、二本鎖切断をなおももたらしながら、標的部位の長さを２倍にするであろう。

それゆえ、いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９由来エンドヌクレアーゼは、たった１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様のいずれかのヌクレアーゼドメイン）を含有するよう修飾することができる。例えば、Ｃａｓ９由来タンパク質は、もはや機能的ではないようヌクレアーゼドメインのうちの１つを欠失ま多は突然変異させるよう修飾することができる（すなわち、当該ドメインはヌクレアーゼ活性を欠失している）。当該ヌクレアーゼドメインのうちの１つが不活性であるいくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９由来タンパク質は、ニックを二本鎖核酸へ導入することができる（このようなタンパク質は「ニッカーゼ」と呼ぶ）が、当該二本鎖ＤＮＡを切断することはできない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）転換は、当該Ｃａｓ９由来タンパク質を「ＨＮＨ」ニッカーゼへ転換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの（Ｈ８４０Ａ）転換（いくつかの場合においては、当該ヒスチジンは位置８３９にある）は、当該Ｃａｓ９由来タンパク質を「ＲｕｖＣ」ニッカーゼへと転換する。このように、例えば、一実施形態において、当該Ｃａｓ９由来ニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ドメインにおいてアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）転換を有する。別の実施形態において、当該Ｃａｓ９由来ニッカーゼは、ＨＮＨドメインにおいてヒスチジンからアラニンへの（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）転換を有する。当該Ｃａｓ９由来ニッカーゼの当該ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインは、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ仲介性突然変異誘発、及び全遺伝子合成のような周知の方法、ならびに当該技術分野で公知の他の方法を用いて修飾することができる。

追加のドメイン
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼは概して、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む。例えば、一実施形態において、当該ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）のような単深裂配列であることができる。別の実施形態において、当該ＮＬＳは、二深裂配列であることができる。なおも別の実施形態において、当該ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）であることができる。当該ＮＬＳは、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置することができる。

いくつかの実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼはさらに、少なくとも１つの細胞浸透ドメインを含むことができる。当該細胞浸透ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質から得られる細胞浸透ペプチド配列であることができる。例として、当該ＴＡＴ細胞浸透配列は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）であることができる。別の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、ヒトＢ型肝炎ウイルスから得られる細胞浸透ペプチド配列であるＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５））であることができる。なおも別の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７））であることができる。追加の実施形態において、当該細胞浸透ドメインは、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８））、単純ヘルペスウイルス由来の細胞浸透ペプチドであるＶＰ２２、またはポリアルギニンペプチド配列であることができる。当該細胞浸透ドメインは、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置することができる。

なおも他の実施形態において、当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼはさらに、少なくとも１つのマーカードメインを含むことができる。マーカードメインの非限定例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、及びエピトープタグが挙げられる。一実施形態において、当該マーカードメインは、蛍光タンパク質であることができる。適切な蛍光タンパク質の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、Ｚｓグリーン１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、Ｙペット、ファイＹＦＰ、Ｚｓイエロー１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍカラマ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、青緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシシアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍチェリー、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍラズベリー、ｍストロベリー、Ｊレッド）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラオレンジ、単量体クサビラオレンジ、ｍタンジェリン、ｔｄトマト）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。別の実施形態において、当該マーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであることができる。適切なタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンを含むが、これらに限定しない。マーカードメインは、当該ＺｎフィンガーヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部位置に位置することができる。マーカードメインは、２ＡペプチドによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼへ連結することができる（Ｓｚｙｍｃｚａｋらめ、２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５８９（５）：５８９〜５９４）。

ガイドＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、先導ＲＮＡによって標的とする部位へ先導される。先導ＲＮＡは、染色体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び標的部位の両方と相互作用し、この部位でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼは、二本鎖配列の少なくとも１つの鎖を切断する。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸とともに細胞内へ導入することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの両方をコードするＤＮＡを細胞内へ導入することができる。

ガイドＲＮＡは、３つの領域、すなわち、標的部位において配列と相補的である５’末端における第一の領域、ステムループ構造を形成する第二の内部領域、及び本質的に一本鎖のままである第三の３’領域を含む。各ガイドＲＮＡの第一の領域は、各ガイドＲＮＡが特異的標的部位に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼを先導するよう異なっている。各ガイドＲＮＡの第二及び第三の領域（足場領域とも呼ぶ）は、ガイドＲＮＡすべてにおいて同じであることができる。

ガイドＲＮＡの第一の領域は、ガイドＲＮＡの第一の領域が標的部位における配列と塩基対形成することができるよう標的部位における配列（すなわち、プロトスペーサー配列）と相補的である。概して、ガイドＲＮＡの第一の領域の配列と標的部位における配列の間にはミスマッチがない（すなわち、相補性は完全である）。種々の実施形態において、ガイドＲＮＡの第一の領域は、約１０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド超まで含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの第一の領域と染色体配列における標的部位の間の塩基対形成の領域は、長さ約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、または２５超のヌクレオチドであることができる。例示的な実施形態において、ガイドＲＮＡの第一の領域は、長さ約１９または２０ヌクレオチドである。

ガイドＲＮＡは、二次構造を形成する第二の領域も含む。いくつかの実施形態において、二次構造は、ステム（またはヘアピン）及びループを含む。ループ及びステムの長さは種々であることができる。例えば、ループは長さ約３〜約１０ヌクレオチドに及ぶことができ、ステムは長さ約６〜約２０塩基対に及ぶことができる。ステムは、１〜約１０ヌクレオチドの１つ以上のバルジを含むことができる。このように、第二の領域の全体長は、長さ約１６〜約６０ヌクレオチドに及ぶことができる。例示的な実施形態において、ループは長さ約４ヌクレオチドであり、ステムは約１２塩基対を含む。

ガイドＲＮＡはまた、本質的に一本鎖のままである３’末端において第三の領域を含む。このように、第三の領域は対象の細胞における任意の染色体配列に対して相補性がなく、およびガイドＲＮＡの残りに対して相補性がない。第三の領域の長さは種々であることができる。概して、第三の領域は、長さ約４ヌクレオチド超である。例えば、第三の領域の長さは、長さ約５〜約６０ヌクレオチドに及ぶことができる。

ガイドＲＮＡの第二及び第三の領域（または足場）の組み合わさった長さは、長さ約３０〜約１２０ヌクレオチドに及ぶことができる。一態様において、ガイドＲＮＡの第二及び第三の領域の組み合わさった長さは、長さ約７０〜約１００ヌクレオチドに及ぶ。

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、３つの領域全部を含む１つの分子を含む。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、２つの別個の分子を含むことができる。第一のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第一領域、及びガイドＲＮＡの第二の領域の「ステム」の半分を含むことができる。第二のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡの第二の領域の「ステム」のもう半分、及びガイドＲＮＡの第三の領域を含むことができる。このように、本実施形態において、第一及び第二のＲＮＡ分子は各々、互いに相補的であるヌクレオチドの配列を含有する。例えば、一実施形態において、第一及び第二のＲＮＡ分子は各々、機能的ガイドＲＮＡを形成するためにもう片方の配列と塩基対形成する（約６〜約２０ヌクレオチドの）配列を含む。

（ｉｉｉ）他のターゲティングエンドヌクレアーゼ
さらなる実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼであることができる。メガヌクレアーゼは、長い認識配列を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識配列は概して、約１２塩基対から約４０塩基対に及ぶ。この必要条件の結果として、認識配列は概して、任意の付与されたゲノム中にたった１回生じる。メガヌクレアーゼのうち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧという名のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノム及びゲノム操作の研究のための価値のあるツールとなってきた（例えば、Ａｒｎｏｕｌｄら、２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２４（１〜２）：２７〜３１を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を用いてその認識配列を修飾することによって特異的染色体配列を標的とすることができる。

追加の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであることができる。ＴＡＬＥは、新たなＤＮＡ標的を結合するよう容易に操作することのできる植物病原体キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）由来の転写因子である。ＴＡＬＥまたはその切り詰め版は、ＦｏｋＩのようなエンドヌクレアーゼの触媒ドメインへ連結して、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮと呼ばれるターゲティングエンドヌクレアーゼを生成することがある（Ｓａｎｊａｎａら、２０１２，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，７（１）：１７１〜１９２）。

なおも他の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼであることができる。特に、部位特異的エンドヌクレアーゼは、認識配列がゲノム中にまれに生じる「まれなカッター」であるエンドヌクレアーゼであることができる。あるいは、部位特異的エンドヌクレアーゼは、対象の部位を切断するよう操作することができる（Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆら、２００７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５２：１１１０１２３）。概して、部位特異的エンドヌクレアーゼの認識配列は、ゲノム中にたった１回生じる。代替的なさらなる実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼは、人工の標的とされるＤＮＡ二本鎖の切断誘導剤であることができる。

（ｉｖ）任意のポリヌクレオチド
標的となるゲノム修飾のための方法はさらに、ターゲティングエンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断が相同性に関する修復過程によって修復することができかつ当該ポリヌクレオチドの配列内在性染色体配列と交換されてそれにより内在性染色体配列を修飾するよう、標的となる切断部位の少なくとも片側にある配列と実質的に配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞内へ導入することを含むことができる。例えば、当該ポリヌクレオチドは、標的となる切断部位の片側にある配列と実質的な配列同一性を有する第一の配列、及び標的となる切断部位のもう片側にある配列と実質的な配列同一性を有する第二の配列を含む。あるいは、当該ポリヌクレオチドは、標的となる切断部位の片側にある配列と実質的な配列同一性を有する第一の配列、及び標的となる切断部位から離れて位置する配列と実質的な配列同一性を有する第二の配列を含む。標的となる切断部位から離れて位置する配列は、標的となる切断部位の上流または下流の数十、数百、または数千のヌクレオチドであることがある。

標的となる染色体配列中の配列と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドにおける第一及び第二の配列の長さは種々であることができ、そうであろう。概して、当該ポリヌクレオチドにおける第一及び第二の配列の各々は、長さ少なくとも約１０ヌクレオチドである。種々の実施形態において、染色体配列と実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチド配列は、長さ約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または１００超ヌクレオチドであることができる。

「実質的な配列同一性」という句は、当該ポリヌクレオチド中の配列が対象の染色体配列と少なくとも約７５％配列同一性を有することを意味する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中の配列は、関心対象の染色体配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性である。

当該ポリヌクレオチドの長さは種々であることができ、そうであろう。例えば、当該ポリヌクレオチドは、長さ約２０ヌクレオチドから長さ約２００，０００ヌクレオチドにまで及ぶことができる。種々の実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、長さ約２０ヌクレオチドから長さ約１００ヌクレオチドにまで、長さ約１００ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチドにまで、長さ約１０００ヌクレオチドから約１０，０００ヌクレオチドにまで、長さ約１０，０００ヌクレオチドから約１００，０００ヌクレオチドにまで、または長さ約１００，０００ヌクレオチドから約２００，０００ヌクレオチドにまで及ぶ。

典型的には、当該ポリヌクレオチドはＤＮＡである。当該ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であることができる。当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線形ピース、ＰＣＲ断片、裸の核酸、またはリポソーム若しくはポロキサマーのような送達ビヒクルと複合体形成した核酸であることができる。特定の実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、一本鎖である。例示的な実施形態において、当該ポリヌクレオチドは、約２００ヌクレオチド未満を含む一本鎖オリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、当該ポリヌクレオチドはさらに、マーカーを含む。このようなマーカーは、標的となる組み込みについてのスクリーニングを可能にすることがある。いくつかの実施形態において、当該マーカーは、制限エンドヌクレアーゼ部位である。他の実施形態において、当該マーカーは、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグである。適切な蛍光タンパク質の非限定例としては、適切な蛍光タンパク質の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、Ｚｓグリーン１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、Ｙペット、ファイＹＦＰ、Ｚｓイエロー１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍカラマ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、青緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシシアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍチェリー、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍラズベリー、ｍストロベリー、Ｊレッド）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラオレンジ、単量体クサビラオレンジ、ｍタンジェリン、ｔｄトマト）または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態において、当該マーカーは、精製タグ及び／またはエピトープタグであることができる。例示的なタグには、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンを含むが、これらに限定しない。

（ｖ）細胞への送達
当該方法は、対象の細胞へたーティングエンドヌクレアーゼを導入することを含む。ターゲティングエンドヌクレアーゼは、精製された単離タンパク質として、またはターゲティングエンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内へ導入することができる。当該核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。コードする核酸がｍＲＮＡである実施形態において、当該ｍＲＮＡは、５’キャップされ及び／または３’ポリアデニル化されていてもよい。コード核酸がＤＮＡである実施形態において、当該ＤＮＡは線状または環状であってもよい。当該ＤＮＡは、ベクターの一部であってもよく、この中でコードＤＮＡは、適切なプロモーターへ操作可能に連結されていてもよい。当業者は、適切なベクター、プロモーター、他の制御エレメント、及び対象の細胞内への当該ベクターの導入手段に精通している。

先に説明したターゲティングエンドヌクレアーゼ分子（複数可）及び任意のポリヌクレオチド（複数可）は、種々の手段によって細胞内へ導入することができる。適切な送達手段には、微量注入法、電気穿孔法、超音波穿孔法（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光トランスフェクション、核酸の知的財産により保護された薬剤により増強した取り込み。及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンを介した送達を含む。具体的な実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ分子（複数可）及びポリヌクレオチド（複数可）は、ヌクレオフェクションによって細胞内へ導入される。

１つを超えるターゲティングエンドヌクレアーゼ分子及び１つを超えるポリヌクレオチドが細胞内へ導入される実施形態において、当該分子は同時にまたは連続して導入することができる。例えば、標的となる切断部位（及び任意のポリヌクレオチド）に各々特異的なターゲティングエンドヌクレアーゼ分子は、同時に導入することができる。あるいは、各ターゲティングエンドヌクレアーゼ分子、及び任意のポリヌクレオチド（複数可）は連続して導入することができる。

ターゲティングエンドヌクレアーゼ分子（複数可）と任意のポリヌクレオチド（複数可）の比は種々であることができ、そうであろう。概して、ターゲティングエンドヌクレアーゼ分子（複数可）とポリヌクレオチド（複数可）の比は、約１：１０〜約１０：１にまで及ぶ。種々の実施形態において、ターゲティングエンドヌクレアーゼ分子（複数可）とポリヌクレオチド（複数可）の比は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であり得る。一実施形態において、当該比は約１：１である。

（ｖｉ）細胞培養
当該方法はさらに、（ｉ）染色体配列が少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入及び／または置換によって修飾されるような非相同的末端結合修復過程、（ｉｉ）染色体配列が修飾されるように染色体配列がポリヌクレオチドの配列と交換されるような相同性に関する修復過程によって、ターゲティングエンドヌクレアーゼによって導入される二本鎖切断が修復することができるような適切な条件下で、細胞を維持することを含む。ターゲティングエンドヌクレアーゼ（複数可）をコードする核酸（複数可）が細胞内へ導入される実施形態において、当該方法は、細胞がターゲティングエンドヌクレアーゼ（複数可）を発現するような適切な条件下で細胞を維持することを含む。

概して、当該細胞は、細胞増殖及び／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏら（２００８）ＰＮＡＳ １０５：５８０９〜５８１４、Ｍｏｅｈｌｅら（２００７）ＰＮＡＳ １０４：３０５５〜３０６０、Ｕｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６〜６５１、及びＬｏｍｂａｒｄｏら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９８〜１３０６において説明されている。当業者は、細胞培養方法が当該技術分野で公知でありかつ細胞タイプに応じて種々であろうことを認識している。所定の最適化は、すべての場合において、特定の細胞タイプについての最良の技術を判断するために使用してもよい。

本方法のこの工程の間、ターゲティングエンドヌクレアーゼ（複数可）は、染色体配列における標的となる切断部位（複数可）における二本鎖切断（複数可）を認識、結合、及び生成し、二本鎖切断（複数可）の修復の間、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、及び／または置換は、標的となる染色体配列へと導入される。具体的な実施形態において、標的となる染色体配列は失活している。

対象の染色体配列が修飾されたことを確認する際に、単一の細胞クローンを単離して（ＤＮＡ配列決定及び／またはタンパク質分析を介して）遺伝子型判定することができる。１つの修飾された染色体配列を含む細胞は、標的となるゲノム修飾の１回以上の追加の回を経験して、追加の染色体配列を修飾することができる（例えば、実施例１を参照されたい）。

（ｂ）ＲＮＡ干渉
別の実施形態において、ウイルス耐性細胞株は、標的ｍＲＮＡまたは転写産物の発現を阻害するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤を使用して調製することができる。ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡまたは転写産物の切断をもたらすことができる。あるいは、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を防止または中断することができる。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であることができる。概して、ｓｉＲＮＡは、長さ約１５〜約２９ヌクレオチドに及ぶ二本鎖ＲＮＡ分子を含む。ｓｉＲＮＡは、長さ約１６〜１８、１７〜１９、２１〜２３、２４〜２７、または２７〜２９ヌクレオチドであることができる。具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは長さ約２１ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは任意に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハング、例えば３’オーバーハングを片側または両方の末端に含むことができる。ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子から形成することができ、またはそれに代わるものとして、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から生成することができる（下記を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は完全に相補的であり、それによりミスマッチもバルジもこの２つの配列間に形成される二重鎖において存在しない。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は実質的に相補的であり、それにより１つ以上のミスマッチ及び／またはバルジが、この２つの配列間に形成される二重鎖において存在し得る。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡの５’末端の片側または両方はリン酸基を有しているのに対し、他の実施形態において、５’末端の片側または両方はリン酸基を欠失している。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの３’末端の片側または両方はヒドロキシル基を有しているのに対し、他の実施形態において、５’末端の片側または両方はヒドロキシル基を欠失している。

「アンチセンス鎖」または「先導鎖」と呼ばれるｓｉＲＮＡの１つの鎖には、標的転写産物とハイブリッド形成する部分を含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的転写産物の領域と完全に相補的であり、すなわち、当該アンチセンス鎖は、長さ約１５〜約２９ヌクレオチドの、好ましくは長さ少なくとも１６ヌクレオチドの、より好ましくは長さ約１８〜２０ヌクレオチドの標的領域にわたり、単一のミスマッチまたはバルジを有することなく、標的転写産物とハイブリッド形成する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は実質的に要的領域と相補的であり、すなわち、１つ以上のミスマッチ及び／またはバルジは、アンチセンス鎖及び標的転写産物によって形成される二重鎖に存在し得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写産物のエキソン配列を標的とする。当業者は、標的転写産物についてのｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズム、及び／または商業的サービスに精通している。例示的な例は、ロゼッタｓｉＲＮＡ設計アルゴリズム（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，ワシントン州ノースシアトル）及びＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ミズーリ州セントルイス市）である。ｓｉＲＮＡは、当業者に周知の方法を用いて、インビトロで酵素により合成することができる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野で周知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。

他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることができる。概して、ｓｈＲＮＡは、（先に説明したような）ＲＮＡ干渉を仲介するのに十分長い二本鎖構造、及び二重鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を結合するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分を形成するようハイブリッド形成するまたはハイブリッド形成することのできる少なくとも２つの相補的な部分を含むＲＮＡ分子である。当該構造は、ステムループ構造とも呼ばれ、ステムは二重鎖部分である。いくつかの実施形態において、当該構造の二重鎖部分は完全に相補的であり、それによりミスマッチもバルジもｓｈＲＮＡの二重鎖領域には存在しない。他の実施形態において、当該構造の二重鎖部分は実質的に相補的であり、それにより１つ以上のミスマッチ及び／またはバルジは、ｓｈＲＮＡの二重鎖部分に存在する。当該構造のループは、長さ約１〜約２０ヌクレオチド、好ましくは長さ約４〜約１０約ヌクレオチド、より好ましくは長さ約６〜約９ヌクレオチドであることができる。当該ループは、標的転写産物と相補的な領域（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の５’末端または３’末端のいずれかに位置することができる。

ｓｈＲＮＡはさらに、５’末端または３’末端のオーバーハングを含むことができる。任意のオーバーハングは、長さ約１〜約２０ヌクレオチド、より好ましくは長さ約２〜約１５ヌクレオチドであることができる。いくつかの実施形態において、当該オーバーハングは、１つ以上のＵ残基、例えば約１〜約５個のＵ残基を含む。いくつかの実施形態において、当該ｓｈＲＮＡの５’末端はリン酸基を有しているのに対し、他の実施形態においては有していない。他の実施形態において、当該ｓｈＲＮＡの３’末端はヒドロキシル基を有しているのに対し、他の実施形態においては有していない。概して、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉマシナリーによってｓｉＲＮＡへと加工される。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、ｓｈＲＮＡの一部に対して相補的な標的転写産物（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の発現を同様に阻害することができる。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計及び合成のための（先に説明したような）入手可能な資源に精通している。

なおも他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ発現ベクターであることができる。典型的には、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのようなＲＮＡｉ剤の細胞内（インビボ）合成に使用される。一実施形態において、２つの別個の相補的なｓｉＲＮＡ鎖は、２つのプロモーターを含有する単一のベクターを用いて転写され、当該プロモーターの各々は、単一のｓｉＲＮＡ鎖の転写に向かう（すなわち、各プロモーターは、転写が生じ得るようにｓｉＲＮＡのためのテンプレートへ作用可能に連結される）。当該２つのプロモーターは、同じ向きにあることができ、この場合、各々は、相補的ｓｉＲＮＡ鎖のうちの１つのためのテンプレートへ操作可能に連結される。あるいは、当該２つのプロモーターは、当該プロモーターについての転写が結果的に２つの相補的なｓｉＲＮＡ鎖の合成を生じるよう、単一のテンプレートに隣接した対向する向きにあることができる。別の実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクターは、２つの相補的な領域を含む単一のＲＮＡ分子の転写を駆動するプロモーターを含有することができ、それにより、転写産物はｓｈＲＮＡを形成する。

当業者は、１つを超える転写単位の転写を介してインビボで生成されるためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ剤に好ましいことを認識しているであろう。一般的に言って、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位のインビボでの発言を検出するために利用するプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のためのプロモーターであり得る。Ｕ６またはＨ１プロモーターのようなある特定のＰｏｌＩＩＩプロモーターは、転写される領域内のシス作用性調節エレメントを必要とせず、このように、ある実施形態において好ましい。他の実施形態において、ＰｏｌＩＩのためのプロモーターは、１つ以上のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ転写単位の発現を駆動するのに使用することができる。いくつかの実施形態において、組織特異的、細胞特異的または誘導性ＰｏｌＩＩプロモーターを使用することができる。

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供するコンストラクトは、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて製造することができ、真核細胞における発現に適した広範な種々の異なるベクターのうちのいずれかへ挿入することができる。組換えＤＮＡ技術は、上述のＡｕｓｕｂｅｌら，２００３ならびに上述のＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，２００１において説明されている。当業者は、ベクターが追加の調節配列（例えば、終結配列、翻訳制御配列など）を、選択可能なマーカー配列と同様に含むことができることも認識している。ＤＮＡプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣなどを基にしたものを含め、当該技術分野で公知である。多くの発現ベクターはすでに適切な１つのまたは複数のプロモーターを含有しているので、当該プロモーター（複数可）に関して適切な位置で対象のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を挿入するのに必要であるのみであり得る。ウイルスベクターも、ＲＮＡｉ剤の細胞内発現を提供するのに使用することができる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどを含む。具体的な実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクターは、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ＴＲＣ ｓｈＲＮＡ製品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において提供されるもののような、ｓｈＲＮＡレンチウイルス系ベクターまたはレンチウイルス粒子である。

ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ発現ベクターは、当業者に公知の方法を用いて細胞内へ導入することができる。このような技術は例えば、上述のＡｕｓｕｂｅｌら，２００３または上述のｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，２００１において説明されている。ある実施形態において、ＲＮＡｉ発現ベクター、例えば、ウイルスベクターは、細胞のゲノム内へ安定して組み込まれ、それによりＭｇａｔ１発現はその後の細胞世代にわたって崩壊している。

（ｃ）部位特異的組換え
代替的な実施形態において、ウイルス耐性細胞株は、部位特異的組換え技術を用いて調製することができる。例えば、部位特異的組換え技術は、対象の染色体配列の全部若しくは一部を欠失するために、または対象の染色体配列内へ単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を導入するために使用することができる。一実施形態において、関心対象の染色体配列は、Ｃｒｅ−ＩｏｘＰ部位特異的組換え系、Ｆｌｐ−ＦＲＴ部位特異的組換え系、またはこれらのバリアントを用いて標的とされる。このような組換え系は市販されており、これらの技術についての追加の教示は、例えば上述のＡｕｓｕｂｅｌら、２００３において認められている。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明の属する分野における当業者によって通常理解される意味を有している。以下の参考文献、すなわち、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）、Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）、Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、ならびにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）は、本発明において使用する用語の多くの一般的な定義を当業者に提供している。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、当該用語に帰する意味を有している。

本開示またはその好ましい実施形態（複数可）の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「ｓａｉｄ」は、当該要素のうちの１つ以上があることを意味するよう企図している。用語「ｃｏｍｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的であるよう企図されており、列挙した要素以外の追加の要素があるかもしれないことを意味している。

本明細書で使用する場合、「欠損した」は、標的となる酵素若しくはタンパク質の低下した若しくは検出不可能なレベル、または標的となる酵素若しくはタンパク質の低下した若しくは検出不可能な活性を指す。

本明細書で使用する場合、「内在性配列」という用語は、細胞特有の染色体配列を指す。

「外来性配列」という用語は、細胞特有ではない染色体配列、または異なる染色体位置へ移動した染色体配列を指す。

「遺伝的に修飾された」細胞は、ゲノムが修飾された細胞を指し、すなわち、当該細胞は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、及び／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含有するよう操作された少なくとも１つの染色体配列を含有する。

「ゲノム修飾」及び「ゲノム編集」という用語は、染色体配列が修飾されるよう具体的な染色体配列が変化する方法を指す。染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、及び／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むよう修飾され得る。修飾した染色体配列は、生成物が作られないよう失活している。あるいは、染色体配列は、変化した生成物が生成されるよう修飾されることができる。

「遺伝子」は、本明細書で使用する場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソン及びイントロンを含む）、及び遺伝子産物の生成を、調節配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわらず、調節するすべてのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、終結因子、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位のような翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、及び遺伝子座制御領域のような翻訳調節配列を含むが、これらに必ずしも限定しない。

「異種性の」という用語は、対象の細胞または種に特有ではない実体を指す。

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、線状または環状の立体配座にあるデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されることにはなっていない。当該用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分及び／またはリン酸部分において修飾されたヌクレオチドを包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有しており、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成するであろう。核酸またはポリヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホチオアート、ホスホラミダイト、ホスホロジアミダート結合、またはこれらの組み合わせによって連結され得る。

「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、及びウリジン）またはヌクレオチド類似体であり得る。ヌクレオチド類似体は、修飾されたプリン塩基若しくはピリミジン塩基または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分に関する修飾の非限定例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、及びチオール基の付加（または除去）、ならびに当該塩基の炭素原子及び窒素原子と他の原子（例えば、７−デアザプリン）との置換が挙げられる。ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びモルホリノも含まれる。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に使用する。

本明細書で使用する場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、修飾または編集されることになっている染色体配列の一部を定義する核酸配列を指し、当該配列に対してターゲティングエンドヌクレアーゼが認識及び結合するよう操作され、ただし、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。

「上流」及び「下流」という用語は、固定した位置に対する核酸配列における位置を指す。上流は、当該位置に対して５’（すなわち、鎖の５’末端近く）である領域を指し、下流は、当該位置に対して３’（すなわち、鎖の３’末端近く）である領域を指す。

本明細書で使用する場合、「ウイルス耐性」は、細胞がウイルス感染に抵抗する能力を指す。より具体的には、ウイルスの侵入及び／またはウイルスの増殖は、修飾されていない親細胞株と比較して、本明細書に開示した操作した細胞株において低下または除去される。

核酸及びアミノ酸配列同一性の判定技術は、当該技術分野で公知である。典型的には、このような技術には、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を判定し、及び／またはコードしたアミノ酸配列を判定し、それによりこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの様式で判定及び比較することができる。概して、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれの実際のヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、これらの％同一性を判定することによって比較することができる。２つの配列の％同一性は、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、短い方の配列の長さによって除して１００を乗じた２つの整列した配列間の実際のマッチの数である。核酸配列についての適切な整列は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ 付録３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５〜６７６３（１９８６）によって標準化されたスコア化マトリックスを用いることによってアミノ酸配列へ適用することができる。配列の％同一性を判定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおける遺伝学コンピュータグループ（ウィスコンシン州マディソン市）によって提供される。配列間の％同一性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは概して、当該技術分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、既定パラメータを用いて使用する。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下の既定パラメータ、すなわち、遺伝暗号＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ値＝６０、予測値＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０配列、選択基準＝ハイスコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用することができる。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトにおいて認めることができる。本明細書に説明する配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％及びこの間の任意の整数値である。典型的には、配列間の％同一性は少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

種々の変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞及び方法においてなされ得るので、先の説明及び以下に付与する実施例に含まれる事項はすべて、実例と居て解釈すべきであり、限定的な意味において解釈すべきではないことは企図されている。

以下の実施例は、本発明のある特定の態様を説明する。

実施例１：標的となる遺伝子により修飾されたＣＨＯ細胞株の調製 ＺＦＮ仲介性遺伝子修飾技術を採用して、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化反応に関与する酵素またはタンパク質をコードする遺伝子を失活させた（すなわち、ノックアウトした）。概して、対象の遺伝子のコード領域内の複数対のＺＦＮターゲティング特異的部位は、所有権のあるアルゴリズムを用いて設計した。ＺＦＮ発現コンストラクトは、標準的な手順を用いて調製し、ＺＦＮ ｍＲＮＡは、ＣＯＭＰＯＺｒ（登録商標）ノックアウトＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製品情報において説明されるとおり、インビトロ転写、ｍＲＮＡポリアデニル化、及びキャッピング法を用いてＺＦＮプラスミドＤＮＡから作製した。簡潔には、プラスミドＺＦＮ ＤＮＡを線状化し、フェノール・クロロホルムＤＮＡ抽出を用いて精製した。ＭｅｓｓａｇｅＭａｘ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡキャッピング化メッセージ転写キット（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｉｐｔ社）を用いて、線状化ＤＮＡをキャッピングした。ポリ（Ａ）ポリメラーゼテイリングキット（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）を用いて、ポリ（Ａ）尾部を付加した。ＺＦＮ ｍＲＮＡは、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製した。親細胞は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＨＯ ＣＤ融合培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に懸濁培養として維持した。細胞をトランスフェクションの前日にバイオリアクターチューブの中に０．５×１０^６個／ｍＬで播種した。典型的には、各トランスフェクションは、１５０μＬの増殖培地及び５μｇのＺＦＮ ＤＮＡまたはｍＲＮＡ中に１×１０^６個を含有した。トランスフェクションは、０．２ｃｍのキュベット中で１４０Ｖ及び９５０μＦでの電気穿孔法によって実施した。電気穿孔した細胞は、６穴プレートでの静置培養において２ｍＬの増殖培地中に入れておいた。

トランスフェクション３日後及び１０日後、細胞を培養物から取り出し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（商標）哺乳類ゲノムＤＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。ＺＦＮ誘導性切断は、ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）ノックアウトＺＦＮ産物情報において説明されている通り、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを用いて実証した。このアッセイを実施して、先に説明した通り（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，２５：７７８〜７８５）、ＺＦＮ仲介性遺伝子突然変異の効率性を測定する。本アッセイは、ＺＦＮ誘導性ＤＮＡ二本鎖切断の非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）仲介性不完全修復の結果として野生型から逸脱する標的となる遺伝子座の対立遺伝子を検出する。ＺＦＮ処理した細胞のプールからの標的となる領域のＰＣＲ増幅は、野生型（ＷＴ）及び突然変異体アンプリコンからなる混合物を生じる。この混合物の融解及び再アニーリングは結果的に、ＷＴ及び突然変異体の対立遺伝子のヘテロ二重鎖間に形成するミスマッチを生じさせる。ミスマッチの部位に形成されるＤＮＡ「気泡」は、検査ヌクレアーゼＣｅｌ−１によって切断され、切断産物は、ゲル電気泳動法によって分離することができる。

ＺＦＮ活性の確認の際に、ＺＦＮをトランスフェクトした細胞を、限界希釈法を用いて単一細胞クローン化した。このために、細胞を８０％ＣＨＯ無血清クローン化培地、２０％ならし培地、及び４ｍＬのＬ−グルタミンからなる混合物を用いて、約０．５個／ウェルの概算密度で播種した。クローン性及び増殖はそれぞれ、播種７日後及び１４日後に顕微鏡で実証した。増殖のあるクローンを増やし、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって遺伝子型判定した。

Ｍｇａｔ１ノックアウト細胞株
Ｍｇａｔ１は、複合体Ｎ−グリカン合成の一部として、ＧｌｎＮａｃをＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ結合型グリカン構造へ付加する。ＣＨＯ Ｍｇａｔ１遺伝子における５’−ＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣｃｃａｇｃａＧＣＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号９、上の場合にはＺＦＮ結合部位及び下の場合には切断部位）を標的とするよう、一対のＺＦＮを設計した。親細胞株は、グルタミン酸シンテターゼをノックアウトしたＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とした。この親細胞株は、野生型Ｎ−及びＯ−グリカン構造を生じる。ＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）細胞株は、本質的には先に詳述したようにＭｇａｔ１ ＺＦＮ ＤＮＡを用いてトランスフェクトした。Ｃｅｌ−１アッセイで、トランスフェクション３日後及び１０日後の両方に、ＺＦＮ活性を示す２つの切断断片２２０ｂｐ及び１９７ｂｐの存在を確認した。単一細胞クローンは、１つの対立遺伝子において２ｂｐ〜５５ｂｐに及ぶ欠失とともに識別した（第二の対立遺伝子は検出されなかった）。この細胞株は、５つのマンノース残基で終止する切り詰められたＮ結合型構造（すなわち、Ｍａｎ５ＮｅｕＡｃ２グリコフォーム）及び野生型Ｏグリカン構造を産生する。

ＣＯＳＭＣノックアウト細胞株
Ｏ−グリコシル化における最も共通した第二の整合性工程は、ｃｏｒｅ−１伸長である。ｃｏｒｅ−１伸長は、機能するために単一の酵素Ｃ１ＧａｌＴ１（別名Ｔ−シンターゼ）によって触媒され、当該酵素は専用シャペロンであるＣＯＳＭＣを必要とする。ＣＯＳＭＣは、Ｔ−シンターゼに特異的に結合するようにみえかつゴルジ体におけるその完全な活性を確実にする小胞体タンパク質である。ＣＯＳＭＣ遺伝子を崩壊させるために、ＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）細胞を、ＣＨＯ ＣＯＳＭＣ遺伝子における配列５’−ＧＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡａａａｇｔｇＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号１０）標的とするよう設計したＺＦＮをコードするＤＮＡまたはＲＮＡでトランスフェクトした。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイで、ＺＦＮトランスフェクト細胞における３つの切断断片（すなわち、３１８、１８４、１３４ｂｐ）の存在を確認した。ＣＯＳＭＣの１つの対立遺伝子（第二の対立遺伝子は検出されなかった）における４ｂｐ欠失を有する単一の細胞クローンを単離した。当該細胞株は、切り付けられた（すなわち、未成熟な）Ｏ−グリカン構造及び野生型Ｎ−グリカンを産生する。

ＣＯＳＭＣ／Ｍｇａｔ３ノックアウト細胞株
Ｍｇａｔ３のコード領域における５’−ＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡｃｃｃｇｇｔＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号１１）を標的とするよう、一対のＺＦＮを設計した。先に詳述したＣＯＳＭＣノックアウト細胞に、先に詳述したＺＦＮ ＤＮＡをトランスフェクトした。ＺＦＮ切断の確認後、単一細胞クローンを単離した。配列決定は、Ｍｇａｔ３遺伝子における９、１０、１１、または４１ｂｐの欠質を有していた。この細胞株は、野生型Ｎ−グリカン及び切り詰められたＯ−グリカンを産生する（すなわち、親細胞株と類似している）。

ＣＯＳＭＣ／Ｍｇａｔ３／Ｍｇａｔ５ノックアウト細胞株 先に詳述したＣＯＳＭＣ／Ｍｇａｔ３ノックアウト細胞株を、Ｍｇａｔ５のコード領域における５’−ＴＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＡｇｃａｇｃｇＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１２）を標的とするよう設計したＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。Ｍｇａｔ５遺伝子において１２９ｂｐの欠失を有する単一細胞クローンを単離した。この細胞株は、側方分枝の少ないＮ−グリカン及び切り詰められたＯ−グリカンを産生する。

実施例２：ウイルス感染及びウイルス耐性検査アッセイ
上記のＣＨＯ細胞株を増殖させ、当該細胞株がプロトタイプＭＶＭウイルス（ＭＶＭｐ株）を用いた負荷後の感染を支持または提供する能力について検査した。簡潔には、細胞を適切な培地中で増殖させ、ＭＶＭｐウイルスを１または１０のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）で添加し、感染した細胞をアッセイ前にさらに２４、４８または７２時間インキュベートした。感染していない細胞も、酵素ノイラミニダーゼで処理して、表面グリカン（Ｎ結合型及びＯ結合型の両方）から末端シアル酸を除去した後、示されるＭＯＩで感染させた。

感染細胞及び非感染細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について、示される時点で視覚的に検査し、細胞を遠心分離によって収集した。ウイルスＤＮＡ感染力及び生成物を、全ゲノムＤＮＡに関するサザンブロット分析及び抗ウイルスタンパク質抗体を用いたウェスタンイムノブロット分析を用いてスクリーニングした。サザン分析については、２４時間で採取した二つ組試料由来の細胞ペレットを収集し、全ゲノムＤＮＡを単離した。ＤＮＡは、ナノドロップ分光法を介して定量化し、試料を標準化して、サイズ分画のためにアガロースゲル上での等しい負荷を確実にした。サイズ分画したＤＮＡは、帯電したメンブレンへ転写し（サザンブロット法）、^３２Ｐ標識したウイルスＤＮＡプローブを用いてウイルスＤＮＡ合成について当該メンブレンを探索した。特異的な^３２Ｐ標識したウイルス二本鎖ＤＮＡバンドの定量化は、リン撮像によって獲得したので、相対的な値を表１に報告する。

ウェスタン分析のために、２４時間時に収集した細胞ペレットをＳＤＳ緩衝液中に溶解し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンへ転写し、ブロッキングして、抗ＮＳ１抗体を用いてウイルスＮＳ１タンパク質の存在についてイムノブロットした（ウェスタンイムノアッセイ）。ウェスタンブロット法を介して検出したウイルスタンパク質のレベルは表２に示す。

当該ウイルスのＭＶＭｐ株を用いて感染させた場合、親細胞株ＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）（すなわち、野生型グリカン構造を有する）は、予測した通り、ウイルスＤＮＡ及びタンパク質合成の従来の感染力及び産生を示した。ウイルスＤＮＡ及びウイルスタンパク質産物は、細胞がいずれかのＭＯＩで感染した場合、感染２４時間後に明白であった。ウイルス産物の強い産生は、より後期の時点で同様に観られた。感染していない野生型細胞は、期待した通り、時点にかかわらず感染の証拠は示さなかった。

野生型細胞を酵素ノイラミニダーゼ（ＮＡ）で処理して、細胞表面シアル酸を除去し、細胞をその後ＭＶＭｐで感染させた場合、ウイルスの産生低下（感染の低下を示している）も観察された（ＭＯＩ＝１０での５．３２倍からＭＯＩ＝１での７．３４倍にまで及ぶ）。ＮＡ処理した細胞がなおも感染に対するわずかな感受性を示したが、ＣＨＯ細胞は、このような処理後にシアル酸（ＳＡ）構造を迅速に再生することは公知である。それゆえ、観察された低レベルの感染は、末端ＳＡグリカンを再生した細胞に由来するかもしれず、したがって、当該ウイルスについての侵入を提供するかもしれない。

ＣＨＯ Ｍｇａｔ１遺伝子を失活させ、かつＭｇａｔ１酵素がまったく作られていないＭｇａｔ１ノックアウト細胞のウイルス感染は結果的に、ウイルス感染に対するわずかな耐性のみを生じた（例えば、ブロットのリン撮像によって測定されるような２．１〜２．７倍の減少）。この細胞株は、切り詰められたＮグリカンを有しているので、これらの結果は、２〜３個の結合したシアル酸を有する比較的高い桁のＮグリカン受容体が、初期のウイルスカプシド結合及び細胞へのウイルス侵入におけるわずかな役割 しか担っていないかもしれないことを示唆している。

ＣＯＳＭＣノックアウト細胞をＭＶＭｐウイルスに感染させた場合、この細胞株は、ウイルス感染に対する有意な耐性を示した。倍数耐性（野生型細胞株と比較した場合）は、５．５倍（ＭＯＩ＝１０）から１９０倍（ＭＯＩ＝１）にまで及んだ。Ｍｇａｔ３遺伝子（ＣＨＯ細胞における偽遺伝子であると仮定）及びＭｇａｔ５遺伝子（より高い桁のＮ結合型分枝に起因）を標的とする追加の遺伝子ノックアウトは、類似の結果を付与した。ウェスタンブロット分析は類似の結果を付与しており、Ｏグリカン構造が切り詰められている場合にウイルス耐性を生じることを示した。これらの研究は、シアル酸受容体の崩壊がＭＶＭ結合及び／または細胞への侵入を劇的に低下させることを明らかにした。

実施例３：追加のＣＯＳＭＣノックアウト細胞株及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株の作製
新たなＣＯＳＭＣノックアウト細胞株クローンは実施例１において先に説明した通り、ＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）細胞及び、ＣＨＯ ＣＯＳＭＣ遺伝子のエキソン２における配列５’−ＧＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＧＧＡａａａｇｔｇＴＣＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号１０）を標的とするよう設計した一対のＺＦＮを用いて作製した。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイは、ＺＦＮトランスフェクト細胞において３つの切断断片（すなわち、３１８、１８４、１３４ｂｐ）の存在を確認した。５つの単一細胞クローンを単離して、配列決定は、以下に示す通り、１〜１２ｂｐの欠失を明らかにした。

クローンＦ０７はさらに、標準的な手順を用いてヒトＩｇＧを発現する修飾した。識別した多くのクローンのうち、２つのＩｇＧ産生クローンをさらなる検査（以下を参照されたい）のために単離した（及び７１Ｈ１、７１Ｃ３として識別した）。

ヌクレオチド糖輸送体（ＣＭＰ−シアル酸輸送体）をコードするＳｌｃ３５Ａ１遺伝子は、５’−ＡＧＣＴＴＡＴＡＣＣＧＴＡＧＣＴＴＴａａｇａｔａＣＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡ−３’（配列番号１３）を標的とするよう設計したＺＦＮまたはＣＨＯ Ｓｌｃ３５Ａ１遺伝子のエキソン１における５’−ＴＴＣＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１７）を標的とするよう設計したＺＦＮを用いてＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）細胞においてノックアウトした。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイは、ＺＦＮトランスフェクト細胞における２つの切断断片の存在を確認した。１つの単一細胞クローン（Ｂ１２）を単離し、配列決定はＺＦＮ結合部位の周りの１ｂｐの欠失を明らかにした。Ｓｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株は、末端シアル酸なしでＮ結合型及びＯ結合型グリカン構造を形成する。

ビオチン化イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ Ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レクチンＩＩ（ＭＡＬＩＩ、２０μｇ／ｍＬ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジン（５μｇ／ｍＬ）を用いた染色は、親細胞株と比較してＣＯＳＭＣノックアウト細胞クローンＦ０７、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンＧ０３、及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株における有意に低下した染色を明らかにした（ノックアウト細胞株における末端シアル酸残基の非存在を示す）。

実施例４：ＭＭＶウイルスに対するＣＯＳＭＣノックアウト細胞株及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株の耐性
野生型（すなわち、ＣＨＯＺＮ ＧＳ−／−）、ＣＯＳＭＣノックアウト（実施例１及び実施例３において先に作製）、及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト(実施例３において先に作製)細胞を、実施例２において先に本質的に説明した通り、 ０．３のＭＯＩのＭＶＭｐウイルスに感染させた。感染は、サザン分析（本質的には先に説明した通り）及び標準的なプラークアッセイを介してアッセイした。

図１に示すように、野生型細胞は高レベルのウイルスＤＮＡを呈したのに対し、Ｓｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株及びＣＯＳＭＣノックアウト細胞株は、非常に低レベルのウイルスＤＮＡを有しており、ＣＯＳＭＣＦ０７ノックアウトクローン及びＣＯＳＭＣＧ０３ノックアウトクローンは、低レベルのウイルスＤＮＡを有しており、１２ｂｐの欠失を有するＣＯＳＭＣ Ｈ０５ ＦＯクローンは、親細胞株と類似のウイルスＤＮＡのレベルを有していた。Ｈ０５における欠失はフレーム内であったので、当該細胞がほぼ野生型レベルでウイルス感受性を呈したことは驚くことではない。プラークアッセイ結果は図２に示す。Ｓｌｃ３５Ａ１ノックアウト、ＣＯＳＭＣノックアウト、ＣＯＳＭＣ Ｆ０７ノックアウト、及びＣＯＳＭＣ Ｇ０３ノックアウト細胞は、極度に低いウイルスレベルを有していた。

野生型（すなわち、ＣＨＯＺＮ ＧＳ−／−、２Ｅ３とも呼ぶ）、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンＦ０７及びＧ０３、ならびにＳｌｃ３５Ａ１ノックアウトクローンＢ１２を用いて、追加のウイルス耐性検査を実施した。細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミンで補強した培地中で増殖させ、１または８のいずれかのＭＯＩでＭＭＶｐに感染させ、適切な条件下でインキュベートした。細胞の試料は、０、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間時に取り出し、細胞生存率は、トリパンブルー染色でアッセイし、ＭＭＶ定量化は定量的ＰＣＲによって測定した。

細胞生存率は、図３に呈する。感染１２０時間後、細胞生存率は野生型細胞（すなわち、２Ｅ３）においては約５０％まで低下した（パネルＡを参照されたい）のに対し、ＣＯＳＭＣクローンＦ０７においては、細胞の少なくとも９３％が感染１２０時間後に生存していた（パネルＢを参照されたい）。図４は、１のＭＯＩ（パネルＡを参照されたい）または８のＭＯＩ（パネルＢを参照されたい）における野生型（２Ｅ３）及びＣＯＳＭＣクローンＦ０７におけるＭＭＶ感染後の細胞結合ウイルス（細胞１個あたりのウイルスゲノムコピー（ｖｇｃ））の時間経過を示す（当該算出は、各感染した細胞が２×１０^４ｖｇｃを産生することができるという仮定に基づいた）。各条件下で感染した細胞の分数は以下に呈する。

野生型（すなわち、２Ｅ３）、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンＦ０７、Ｇ０３、及びＨ０４、ならびにＳｌｃ３５Ａ１ノックアウトクローンＢ１２細胞に０．３または０．０３のいずれかのＭＯＩでＭＭＶｐを時刻−３時間時に感染させた。時刻０時間時に、細胞を増殖培地で３回洗浄した後、２１時間（すなわち、単一の複製周期）インキュベートした。ウイルス複製は、０時間時及び２１時間時に細胞結合ウイルスを測定することによってアッセイした。図５に示すように、ウイルス複製は、ＣＯＳＭＣノックアウト細胞株において低下し、Ｓｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株において除去された。

実施例５：レオウイルス３に対するＣＯＳＭＣノックアウト細胞株及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株の耐性 野生型（すなわち、２Ｅ３）、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンＦ０７、及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウトクローンＢ１２細胞に時刻３時間時に２回希釈（ＴＣＩＤ_５０＝５．６Ｅ＋０７及び５．６Ｅ＋０６）したレオウイルス３を感染させた。時刻０時間時に、細胞を３回洗浄した後、２４時間（すなわち、単一の複製周期）インキュベートした。ウイルス複製は、０時間時及び２４時間時に細胞結合ウイルスを測定することによってアッセイした。細胞結合ウイルスのレベルは、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンにおいて２４時間時に劇的に低下し、Ｓｌｃ３５Ａ１ノックアウトクローンにおいてほぼ除去された（図６を参照されたい）。

実施例６：ＣＯＳＭＣノックアウト細胞株及びＳｌｃ３５Ａ１ノックアウト細胞株の増殖アッセイ
野生型（すなわち、ＣＨＯＺＮ ＧＳ−／−）、ＣＯＳＭＣノックアウトクローンＦ０７及びＧ０３、ならびにＳｌｃ３５Ａ１ノックアウトクローンＢ１２を８〜１０日間、（０．１のＭＯＩにおける）ＭＶＭｐウイルスの非存在下または存在下で増殖させた。細胞増殖は、０、１、２、３、６、７、８、及び１０日後に（トリパンブルー染色を介して）生細胞密度を測定することによってモニターした。図７のパネルＡに示すように、種々のノックアウト細胞は、ウイルスの存在下または非存在下で類似の増殖特性を有しており、ウイルス感染に対する耐性を示した。対照的に、野生型細胞は、感染していない培養物と比較した場合、従来の感染力、増殖障害、及び低い細胞生存率を示した。

野生型及びＣＯＳＭＣノックアウトクローンＦ０７のＩｇＧ産生クローン（すなわち、７１Ｈ１及び７１Ｃ３）の細胞増殖は、本質的には先に詳述した通り、ウイルスの非存在下または存在下でモニターした。図７のパネルＢに示すように、ＩｇＧ産生ノックアウト細胞株は、ウイルス感染に対する有意な耐性も示した。感染した培養物は、感染していない培養物と類似の速度で、ピーク細胞密度まで増殖した。これらのデータは、細胞表面ＩｇＧを分泌することが、ＣＯＳＭＣノックアウト親によって呈されるウイルス耐性の程度に及ぼす識別可能な影響を有していないことを示している。両方のＩｇＧ産生細胞株は、野生型細胞と比較した低速で増殖したが、両方のＩｇＧ産生体は、ウイルス感染に対する耐性を示した（すなわち、感染していない培養物と比較した場合差がなかった）。

実施例７：Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト細胞株の作製及び細胞増殖アッセイ Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト細胞は、本質的には実施例１において先に説明した通り、ＣＨＯ Ｓｔ３Ｇａｌ４遺伝子における５’−ＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＣＧＴＣ ｇｔｔｇｔｇＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＧＣ（配列番号１４）を標的とするよう設計したＺＦＮを用いて作製した。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイで、ＺＦＮトランスフェクト細胞における３つの切断断片（すなわち、３４４ｂｐ、２１０ｂｐ、及び１３５ｂｐ）の存在を確認した。４つの単一細胞クローンを単離し、配列決定は、以下の突然変異を明らかにした。Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト細胞は、低レベルの２〜３個の結合したシアル酸構造を有している。

Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト（すなわち、クローン７Ｄ１０、１Ｂ８、及び１Ｂ１０）及び野生型細胞は、０．１のＭＯＩでＭＶＭｐウイルスの非存在下または存在下で増殖させ、細胞増殖は９日間モニターした。Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト細胞は、図８に示すようにウイルス感染に対する有意な耐性も示した。感染したノックアウト培養物は、感染していないノックアウト培養物と類似の速度でピーク細胞密度まで増殖した。これらの研究は、細胞表面上の特異的な２〜３個の結合したシアル酸構造の崩壊が、このような細胞へのＭＶＭ侵入の劇的な低下も考えられることを明らかにした。

実施例８：Ｓｔ３Ｇａｌ４及びＳｔ３Ｇａｌ６二重ノックアウト細胞株の作製
Ｓｔ３Ｇａｌ４ノックアウト（すなわち、クローン７Ｄ１０、１Ｂ８、及び１Ｂ１０）細胞株は、出発細胞として、ノックアウトＳｔ３Ｇａｌ６遺伝子も含有した細胞株を作製するために使用した。ＺＦＮは、５’−ＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴｔｔｇｃｃＣＴＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号１５）を標的とするよう設計し、遺伝子編集は、本質的には実施例１において説明するとおり実施した。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイで、ＺＦＮトランスフェクト細胞における３つの切断断片（すなわち、３０８ｂｐ、１７１ｂｐ、及び１３７ｂｐ）の存在を確認した。６つの単一細胞クローンを単離し、配列決定は以下の突然変異を明らかにした。

実施例９：Ｃ１ＧａｌＴ１ノックアウト細胞株の作製 Ｃ１ＧａｌＴ１遺伝子は、本質的には実施例１において説明する通り、５’−ＡＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＡＧＡＣａｔｔｔａＧＡＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１６）を標的とするよう設計したＺＦＮを用いてＣＨＯＫ１（ＧＳ−／−）細胞においてノックアウトされた。Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイで、ＺＦＮトランスフェクト細胞における２つの切断断片（すなわち、２２３ｂｐ及び１４８ｂｐ）の存在を確認した。７個の単一細胞クローンを単離し、配列決定は以下の突然変異を明らかにした。

ビオチン化ＭＡＬＩＩ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジンを用いた染色は、親細胞株と比較して、Ｃ１ＧａｌＴ１ノックアウトクローン２Ｃ１２における染色の有意な低下を明らかにした。

実施例１０：Ｓｔ６Ｇａｌ１過剰発現細胞株の作製
ＭＶＭウイルスがアルファ−２，６結合型シアル酸に結合しないという仮説を立てたので、Ｓｔ６Ｇａｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞株を作製した。チャイニーズハムスターＳｔ６Ｇａｌ１のコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＢ４９２８５５）及びｃｈｏｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ ＡＱ２（ＡＦＴＤ０１０６１７８９及びＡＦＴＤ０１０６１７９０）から得た。オープンリーディングフレームは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）へ付加したコザック配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡａｔｇ−３’、配列番号１８）を用いて商業的に合成した。合成した断片は、発現ベクターｐＪ６０２（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州メンロパーク地区）内へとクローン化した。ＣＨＯ（ＧＳ−／−）宿主細胞株及びＩｇＧ発現ＣＨＯ細胞株に、このコンストラクトを（電気穿孔法を介して）トランスフェクトした。単一細胞クローンを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩ細胞選別機を用いて単離した。このために、細胞は、α−２，６結合したシアル酸を結合するＦＩＴＣ結合型セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ Ｎｉｇｒａ）レクチン（ＦＩＴＣ−ＳＮＡ）を用いて染色し、上位５％の蛍光を有する細胞を１個／ウェルで播種し、培養した。単一細胞クローンは、α−２，３結合型シアル酸を結合するビオチン化ＭＡＬＩＩ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識ストレプトアビジンを用いた染色後に、ＭＡＣＳＱｕａｎｔＶＲ分析装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カリフォルニア州サンディエゴ市）において２色ＦＡＣＳ分析へ供した。Ｓｔ６Ｇａｌ１を過剰発現する単一細胞クローンは、トランスフェクトしていない親細胞株と比較して、高い比率のＦＩＴＣ対ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒを有していた。

ＩｇＧは、２つのＳｔ６Ｇａｌ１過剰発現クローン（すなわち、クローン３１及びクローン３２）及び親細胞クローンから単離した。ＩｇＧまたは全細胞タンパク質抽出物は、標準的な手順に従って還元及びカルボキシアミドメチル化した後、３７℃で一晩（１２〜１６時間）トリプシン処理した。トリプシンは、１００℃で５分間加熱することによって非活性化した。断片の精製は、Ｃ１８ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，３００ｍｇパッキング）を用いて実施した。５％酢酸（ＡｃＯＨ）による洗浄後、ペプチド／糖ペプチドを２０％イソプロパノール／５％ＡｃＯＨ、４０％イソプロパノール／５％ＡｃＯＨ、及び１００％イソプロパノール中で連続して溶出した。溶離剤を乾燥させ、ＰＮＧアーゼＦを含有するリン酸緩衝液中で再構成し、３７℃で一晩インキュベートした。放出したグリカンをＣ１８カートリッジを用いて精製し、完全メチル化し、１ｍＭ炭酸リチウム／５０％ＭｅＯＨ中へ希釈し、ナノスプレーイオン化のために０．５ｍＬ／分の流量でＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと直接注入した。完全フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）スペクトルを各試料について３０，０００分解能で得、どのグリカンがシアル酸を含有しているかを判定した。シアル酸化グリカンのシアル酸結合は、ＭＳｎ分析によって測定した。各試料は、単一ガラクトースへ複合体型グリカンを分解するためにイオントラップ内での多重イオン選別及び断片化工程へ供した後、断片化パターンを観察した。

ＧＳ（−／−）宿主細胞株と２つのＳｔ６Ｇａｌ１過剰発現細胞株（すなわち、クローン３１及び３２）のＮ−グリカン特性間に顕著な差があった。特に、少量のため、宿主細胞株においてシアル酸化グリカンは識別されなかった。対照的に、一シアル酸化、二シアル酸化、三シアル酸化、及び四シアル酸化Ｎ−グリカンは、両Ｓｔ６Ｇａｌ１過剰発現細胞株において識別された。特に、クローン３２における１つを除くすべてが、α−２，３結合及びα−２，６結合の両方を含有することを示した。

Claims (11)

1. マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）の侵入及び／または増殖が、修飾されていない親細胞株と比較して減少または除去される、遺伝的に修飾された哺乳類細胞株であって、
   ここで遺伝的に修飾された哺乳類細胞株が修飾された染色体配列を含み、修飾された染色体配列がＳｔ３ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４型（Ｓｔ３Ｇａｌ４）が該細胞株より産生されないように失活しており、かつ
   遺伝的に修飾された哺乳類細胞株が修飾された染色体配列をさらに含み、修飾された染色体配列がマンノシル（アルファ−１，３−）−糖タンパク質ベータ−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ１型（Ｍｇａｔ１）が該細胞株より産生されないように失活している、
   遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
2. 前記修飾された染色体配列は、標的エンドヌクレアーゼ仲介性ゲノム修飾技術を用いて修飾される、請求項１に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
3. 前記標的エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
4. 抗体、抗体フラグメント、ワクチン、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、または凝固因子から選択される組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
5. 前記細胞株は、非ヒト細胞株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
6. 前記細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
7. グルタミンシンテターゼをコードする少なくとも１つの失活した染色体配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
8. 生物学的製造系における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株及び少なくとも１つのウイルスを含む組成物であって、前記細胞株はＭＶＭ感染に対する耐性を呈する、前記組成物。
10. 生物製造系に関するウイルス混入の危険性の低下方法であって、前記生物製造系における使用のために請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株を提供することを含む、前記方法。
11. 組換えタンパク質生成物に関するウイルス混入の減少方法または予防方法であって、
    ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された哺乳類細胞株を得ること、及び
    ｂ）前記遺伝的に修飾された哺乳類細胞株において前記組換えタンパク質生成物を発現させること
    を含む、前記方法。

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