BR112016020287B1

BR112016020287B1 - Uso de uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (cho) geneticamente modificada, composição e métodos para reduzir o risco de contaminação viral de um sistema de produção biológico e para reduzir ou prevenir a contaminação viral de um produto de proteína recombinante

Info

Publication number: BR112016020287B1
Application number: BR112016020287-2A
Authority: BR
Inventors: Nan Lin; Joaquina Mascarenhas; Audrey Chang; David ONIONS; Henry George; Kevin Kayser
Original assignee: Sigma-Aldrich Co. Llc
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-03
Publication date: 2022-06-28
Also published as: KR20160127780A; JP6751347B2; JP2017506903A; IL247460A0; SG11201607038TA; CN106661569A; BR112016020287A2; EP3114222A1; KR20220013460A; CN111849921A; EP3736325A1; CN106661569B; EP3114222B1; IL276679A; SG10201807208RA; IL276679B; IL247460B; US20160369240A1; KR102354633B1; EP3114222A4

Abstract

CÉLULAS RESISTENTES A VÍRUS E USOS DAS MESMAS. A presente invenção fornece linhagens celulares de mamíferos que foram geneticamente projetadas, fazendo com que essas linhagens celulares, ficassem resistentes à entrada e/ou propagação viral, e fornece métodos de uso das referidas linhagens celulares para reduzir ou prevenir a contaminação viral de sistemas de produção biológicos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a linhagens de células de mamíferos manipuladas para ter resistência viral e o uso das referidas linhagens de células para reduzir ou prevenir a contaminação viral de sistemas de produção biológica.

ANTECEDENTES

[002] O uso de proteínas terapêuticas produzidas de forma recombinante para o tratamento de muitas doenças ou condições, como câncer e doenças autoimunes, continua a aumentar. No entanto, a produção em larga escala destes agentes terapêuticos de proteínas continua a ser um desafio. Por exemplo, o processo de fabricação comercial deve entregar um rendimento alto com segurança com processos a jusante que produzem um produto extremamente puro permitindo apenas quantidades vestigiais, de um modo preferencial, sem contaminantes.

[003] O uso de meios isentos de componente animal reduziu significativamente a incidência de contaminação viral acidental. Além disso, a implementação de procedimentos, como processamento em ultrafiltração, processamento de curto período de tempo em alta temperatura e/ou irradiação UVC de materiais a granel, reduziu ainda a incidência de contaminação. No entanto, o risco de contaminação viral ainda permanece. Um incidente de contaminação seria catastrófico para o fabricante em termos de perda de produto, suspensão temporária para o mercado e custos de descontaminação extensivos. Assim, há uma necessidade de aumentar a resistência à infecção viral nas linhagens de células de mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[004] A FIG. 1 apresenta um período de infecção viral por MVM testada pela análise de Southern blot. Representada com a quantidade relativa de DNA viral de MVM detectado em 24, 48, 72 e 96 horas para células do tipo selvagem (CHOZN GS -/-), Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC KO clone F07, COSMC KO clone G03, e COSMC KO clone H05. Clone H05 tem deleção in-frame de 12 bp (ou seja, sem mutação por deslocamento no quadro de leitura).

[005] A FIG. 2 mostra um período de tempo da infecção viral por MVM detectada por ensaios de placa. Está representado pfu/mL detectado em 24, 48, 72 e 96 horas para células do tipo selvagem (CHOZN), Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC KO clone F07, COSMC KO clone G03 e COSMC KO clone H05.

[006] A FIG. 3 ilustra o efeito da infecção por MMV no crescimento celular. Está representado o número de células viáveis (células/ml) no período de 120 horas para células (2E3) de tipo selvagem (A) e COSMC KO clone F07 (B), na ausência (linhas sólidas) e na presença (linhas tracejadas) do vírus MVM em MOI de 1 ou 8.

[007] A FIG. 4 apresenta um período do vírus associado à células após a infecção por MMV. Está representada a cópia do genoma do vírus MVM (VGC) por célula (com base na suposição de que cada célula infectada pode produzir 4 2 x 104 vgc) conforme detectado via qPCR em um período de 120 horas para células (2E3) de tipo selvagem (linhas sólidas) e e COSMC KO clone F07 (linhas tracejadas) na presenta de vírus MVM em MOI 1 (A) ou 8 (B).

[008] A FIG. 5 mostra período de tempo da replicação de MMV nas linhagens de células indicadas. Está representado vgc/amostra em 0 e 21 horas após a infecção com vírus MVM em MOI de 0,3 (A) ou 0,03 (B).

[009] A FIG. 6 apresenta um período de tempo da replicação do Reovírus-3 nas linhagens de células indicadas. Está representando vgc/amostra em relação as células do tipo selvagem (2E3) em 0 e 24 horas após a infecção com o vírus Reo-3.

[0010] A FIG. 7 apresenta ensaios de crescimento para células cultivadas na ausência (UN) ou presença (IN) do vírus MVM. O Painel A apresenta a densidade de células viáveis (VCD) para (GS) de tipo selvagem, Slc35A1 KO, COSMC KO clone F07 e COSMC KO clone G03 ao longo de 10 dias. O Painel B apresenta VCD de (GS) de tipo selvagem, clones produtores de IgG 71H1 e 71C3 derivado de COSMC KO clone F07 ao longo de 8 dias.

[0011] A FIG. 8 apresenta ensaios de crescimento para células cultivadas na ausência (UN) ou presença (IN) do vírus MVM. Está representado VCD para (GS) de tipo selvagem, St3Gal4 KO clone 7D10, St3Gal4 KO clone 1B08 e St3Gal4 KO clone 1B10 ao longo de 9 dias. SUMÁRIO

[0012] Dentre vários aspectos da presente invenção está o fornecimento de linhagens de células de mamíferos que são manipuladas para dificultar ou impedir a entrada viral e/ou propagação viral nas células. Em algumas modalidades, as linhagens de células de mamífero geneticamente modificadas de modo que entrada e/ou propagação de pelo menos um vírus seja reduzida ou eliminada em comparação com linhagens de células parental não modificadas. Em várias modalidades, as linhagens de células de mamíferos descritas neste documento compreendem, pelo menos, uma sequência cromossômica modificada. Em outras modalidades, a sequência cromossômica modificada está inativa de modo que a linhagem de células produza nenhum ou níveis reduzidos do produto de proteína codificada.

[0013] Em uma modalidade, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica chaperona de enzima de Núcleo 1 (COSMC). Em outra modalidade, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam COSMC estão inativas e a linhagem de células não produz COSMC. Em uma modalidade alternativa, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica família de transportador de soluto 35 (transportador de CMP-ácido siálico) membro A1 (Slc35A1). Em outra modalidade, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam Slc35A1 são inativas e a linhagem de células não produz Slc35A1. Ainda em outra uma modalidade, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica enzima de alongamento núcleo 1 (C1GalT1). Em uma modalidade adicional, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam C1GalT1 estão inativas e a linhagem de células não produz C1GalT1. Em uma modalidade adicional, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica que codifica St3 beta-galactosídeo alfa-2,3- sialiltransferase 1 (St3Gal1). Em outra modalidade, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam Slc3Gal1 são inativas e a linhagem de células não produz St3Gal1. Em uma modalidade alternativa, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica St3 beta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 2 (St3Gal2). Em outra modalidade, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam St3Gal2 são inativas e a linhagem de células não produz St3Gal2. Ainda em outra modalidade, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica que codifica St3 beta-galactosídeo alfa-2,3- sialiltransferase 3 (St3Gal3). Em uma modalidade adicional, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam St3Gal3 estão inativas e a linhagem de células não produz St3Gal3. Ainda em outra modalidade, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica St3 beta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 4 (St3Gal4). Em outra modalidade, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam St3Gal4 são inativas e a linhagem de células não produz St3Gal4. Em uma modalidade alternativa, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica St3 beta- galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 5 (St3Gal5). Em uma modalidade adicional, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam St3Gal5 estão inativas e a linhagem de células não produz St3Gal5. Ainda em outra modalidade, a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica que codifica St3 beta- galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 6 (St3Gal6). Em uma modalidade adicional, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam St3Gal6 estão inativas e a linhagem de células não produz St3Gal6. Em uma modalidade alternativa, a linhagem de células compreende sequências cromossômicas inativas que codificam quaisquer dois dentre St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e St3Gal6. Ainda em outra modalidade, a linhagem de células compreende sequências cromossômicas inativas que codificam quaisquer três dentre St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e St3Gal6. Em modalidades adicionais, as linhagens de células que compreendem sequências cromossômicas inativas que codificam COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e/ou St3Gal6 compreendem ainda sequências cromossômicas inativas que codificam manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,2-N- acetilglucosaminiltransferase 1 (Mgat1), manosil (alfa-1,6-)- glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferase 2 (Mgat2), manosil (alfa-1,4-)-glicoproteína beta-1,4-N- acetilglucosaminiltransferase 3 (Mgat3), manosil (alfa-1,3-)- glicoproteína beta-1,4-N- acetilglucosaminiltransferase 4 (Mgat4) e/ou manosil (alfa-1,6-)-glicoproteína beta-1,6-N- acetilglucosaminiltransferase 5 (Mgat5). As linhagens de células de mamíferos aqui descritas compreendendo sequência cromossômica modificada têm maior resistência à entrada viral e/ou propagação viral em comparação com as linhagens de células parental não modificadas. Ainda em outras modalidades, as linhagens de células que compreendem sequências cromossômicas inativas que codificam St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e/ou St3Gal6 são ainda manipuladas para superexpressar pelo menos uma sialiltransferase responsável por fazer ligações 2,6 (por exemplo, St6 beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltranferase 1 (St6Gal1), St6 beta-galactosamida alfa-2,6- sialiltranferase 2 (St6Gal2), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta- galactosil- 1,3)-N-acetilgalactosaminida 1 (St6GalNac1), St6 (alfa-N-acetil- neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 2 (St6GalNac2), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N- acetilgalactosaminida 3 (St6GalNac3), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3- beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 4 (ST6GalNac4), St6 (alfa-N- acetil-neuraminul-2,3-beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 5 (St6GalNac5) e/ou St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N- acetilgalactosaminida 6 (St6GalNac6).

[0014] Em algumas modalidades, as linhagens de células de mamífero são linhagens de células de não humanos. Em outras modalidades, as linhagens de células de mamífero são linhas da célula do ovário de hamster Chinês (CHO). Em modalidades específicas, a linhagem de células é uma linhagem de células de CHO que compreende sequências cromossômicas inativas que codificam COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, St3Gal6 ou suas combinações.

[0015] Em certas modalidades, as linhagens de células de mamífero aqui divulgadas apresentam resistência à entrada e/ou propagação de vírus escolhidos dentre parvovírus, reovírus, rotavírus, vírus influenza, vírus adenoassociado, calicivírus, vírus parainfluenza, vírus da rubéola, coronavírus, norovírus, vírus da encefalomiocardite, poliomavírus ou suas combinações. Em algumas modalidades, o parvovírus é um vírus minuto do camundongo (MVM), parvovírus tipo 1 de camundongo, parvovírus tipo 2 de camundongo, parvovírus tipo 3 de camundongo, parvovírus 1 porcino, parvovírus 1 bovino, parvovírus B19 humano, parvovírus 4 humano, parvovírus 5 humano ou suas combinações. Em modalidades adicionais, o reovírus é um reovírus-3 de mamífero, ortoreovírus de mamífero, ortoreovírus de aves ou suas combinações.

[0016] Em várias modalidades, as linhagens de células de mamíferos divulgadas neste documento são preparadas pela modificação de pelo menos uma sequência cromossômica usando uma técnica de modificação de genoma mediada por endonuclease de direcionamento. A endonuclease de direcionamento pode ser nucleases de dedo de zinco, CRISPR/Cas endonuclease, nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE), meganuclease, endonuclease específica do sítio ou agente indutor de ruptura de fita dupla do DNA direcionado artificial. Em modalidades específicas, a endonuclease de direcionamento é um par de nucleases de dedo de zinco.

[0017] Em algumas modalidades, as linhagens de células de mamífero divulgadas neste documento que compreendem ainda pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante escolhida dentre um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma vacina, um fator de crescimento, uma citocina, um hormônio, um fator de coagulação ou outra proteína terapêutica.

[0018] Outro aspecto da presente divulgação abrange um método para reduzir ou prevenir a contaminação viral de um produto de proteína recombinante, compreendendo o método a obtenção de uma linhagem de células de mamífero resistentes a vírus conforme divulgado neste documento e a expressão do produto de proteína recombinante na linhagem de células.

[0019] Outro aspecto da presente divulgação fornece um método para reduzir o risco de contaminação viral de um sistema de produção biológica, em que o método compreende o fornecimento de uma linhagem de células de mamífero resistentes a vírus, conforme divulgado neste documento, para uso no sistema de produção biológica.

[0020] Ainda em outro aspecto da presente divulgação abrange uma composição que compreende uma linhagem de células de mamífero resistentes a vírus, conforme divulgado neste documento, e pelo menos um vírus, em que a linhagem de células apresenta resistência à infecção por pelo menos um vírus.

[0021] Outro aspecto e iterações da divulgação são descritas mais detalhadamente abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0022] A presente divulgação fornece linhagens de células de mamíferos manipuladas para dificultar ou impedir a entrada viral e/ou propagação viral nas linhagens de células. As linhagens de células manipuladas com resistência viral podem ser geneticamente modificadas para conter sequências cromossômicas (por exemplo, inativas) modificadas. São fornecidos também métodos de uso de linhagens de células aqui divulgados para a produção de proteínas recombinantes, em que os produtos de proteínas recombinantes são essencialmente desprovidos de contaminação viral. O uso das linhagens de células que são resistentes à infecção virai, por conseguinte, reduz ou elimina o risco de contaminação viral de sistemas de produção biológica e dos produtos de proteína resultantes. (I) Linhagens de Células Resistentes a Vírus

[0023] Um aspecto da presente divulgação abrange linhagens de células de mamífero que são manipuladas para ter resistência viral. Dito de outra maneira, as linhagens de células aqui divulgadas aumentaram a resistência à infecção por pelo menos um vírus em comparação com as linhagens de células parental não modificadas. Mais especificamente, a entrada do vírus e/ou propagação do vírus é reduzida ou eliminada nas linhagens de células manipuladas aqui divulgadas em comparação com as linhagens de células parental não modificadas. Em algumas modalidades, as linhagens de células de mamíferos são geneticamente modificadas e contêm pelo menos uma sequência cromossômica modificada. Em geral, a sequência modificada compreende uma mutação. Em modalidades específicas, a sequência cromossômica modificada está inativa (ou que sofre nocaute) de modo que o produto de proteína codificada não seja produzido pela linhagem de células.

[0024] Em geral, a resistência (ou sensibilidade) à infecção virai pode ser determinada pela comparação da resposta das linhagens de células de mamífero manipuladas à exposição a um vírus com a resposta das células parental não modificadas (não manipuladas) ao mesmo desafio viral. A infecção viral da linhagem de células e/ou propagação viral na linhagem de células pode ser analisada por várias técnicas. Exemplos não limitantes de técnicas adequadas incluem métodos de detecção de ácido nucleico (por exemplo, ensaio Southern blot de ácido nucleico para detectar a presença de ácidos nucleicos virais específicos, PCR ou RT-PCR para detectar ácidos nucleicos virais, métodos de sequenciamento e similares), técnicas baseadas em anticorpos (por exemplo, técnicas de Western imunoblotting usando anticorpos de proteína antiviral, métodos de ELISA e assim por diante), bioensaios, (por exemplo, ensaios de placa, ensaios de efeito citopático e similares), e técnicas microscópicas (por exemplo, microscopia eletrônica para detectar partículas virais, etc.). Em algumas modalidades, a infecção e/ou propagação do vírus nas linhagens de células de mamífero manipuladas pode ser reduzida em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 99%, ou mais do que cerca de 99% em relação a de células parental não modificadas. Em modalidades específicas, as linhagens de células de mamífero manipuladas são resistentes à infecção viral, isto é, o vírus não é capaz de entrar e/ou propagar nas linhagens de células de mamífero manipuladas.

[0025] As linhagens de células de mamíferos aqui divulgadas podem ser manipuladas de diversas maneiras para conferir resistência viral. Em algumas modalidades, as linhagens de células podem ser modificadas de modo que a entrada do vírus pelos receptores de superfície celular seja reduzida ou eliminada. Em outras modalidades, as linhagens de células podem ser manipuladas para expressar moléculas que inibem ou bloqueiam proteínas virais específicas envolvidas na replicação e/ou a infectividade. Ainda em outras modalidades, as linhagens de células podem ser manipuladas para superexpressar proteínas antivirais celulares específicas. Em algumas modalidades, a manipulação pode ser genética, em que as sequências de genômicas ou cromossômicas são modificadas. Dito de outra maneira, as linhagens de células são geneticamente modificadas. Em outras modalidades, a manipulação pode ser epigenética ou extracromossômica. (a) Mecanismo de resistência viral (i) Perturbação de receptores de superfície celular

[0026] Em certas modalidades, as linhagens de células de mamífero são manipuladas para conter receptores de superfície celular alterados. Os vírus podem entrar nas células pela ligação específica com receptores complementares na superfície das células. Para muitos vírus, esses receptores de superfície celular compreendem estruturas de glicano ligadas a proteínas (ou lipídios). Os glicanos que terminam em ácido siálico ou seus derivados atuam como receptores para muitos vírus (Matrosovich et al., 2013, Top Curr Chem, DOI: 10.1007/128_2013_466). Assim, as glicoproteínas que compreendem glicanos ligados em O ou N com resíduos de ácido siálico terminais podem funcionar como receptores de superfície celular para diversos vírus. O ácido siálico se refere a derivados do ácido neuramínico e inclui, por exemplo, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac ou NANA) e ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc ou NGNA).

[0027] Em algumas modalidades, as linhagens de células são manipuladas para compreender glicoproteínas sem resíduos de ácido siálico terminais. Os resíduos de ácido siálico terminal podem ser eliminados por deleção (isto é, por nocaute) ou alteração das enzimas e/ou proteínas envolvidas na síntese das cadeias de glicano. Os alvos adequados incluem enzimas ou proteínas envolvidas na síntese de glicanos O-ligados, enzimas ou proteínas envolvidas na síntese de glicanos N-ligados e/ou enzimas ou proteínas envolvidas na síntese ou transporte de ácido siálico.

[0028] Em certas modalidades, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma das proteínas ou enzimas direcionadas supracitadas (ou qualquer combinação dos alvos supracitados). Como usado neste documento, "deficiente" se refere a níveis reduzidos ou não detectáveis de proteínas ou enzimas direcionadas ou atividade reduzida ou não detectável de enzimas ou proteínas direcionadas. A quantidade ou atividade da proteína ou enzima direcionada pode ser reduzida ou eliminada pela modificação de pelo menos uma sequência cromossômica que codifica a proteína ou enzima direcionada. Por exemplo, a sequência cromossômica pode ser modificada para conter uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, uma substituição de pelo menos um nucleotídeo ou uma combinação destes. Por conseguinte, as deleções, inserções e/ou substituições podem deslocar o quadro de leitura da sequência cromossômica de modo que nenhum produto de proteína seja produzido (isto é, a sequência cromossômica é inativa). Alternativamente, as deleções, inserções e/ou substituições na sequência cromossômica modificada podem resultar na produção de um produto de proteína alterado. A modificação das sequências cromossômicas de interesse pode ser obtida usando técnicas de edição genômica mediada por endonucleases direcionadas, que são detalhadas abaixo na seção (III)(a). Em casos em que uma sequência cromossômica que codifica proteína ou enzima direcionada está inativa, a linhagem de células manipulada produz níveis reduzidos de proteína ou enzima direcionada. Em outros casos em que todas as cópias das sequências cromossômicas que codificam a proteína ou enzima direcionada estão inativas, a linhagem de células manipuladas não produz nenhuma proteína ou enzima direcionada (isto é, a linhagem de células é nocaute ou KO). Ainda em outras modalidades, o nível da proteína ou enzima direcionada pode ser reduzido ou eliminado usando mecanismos mediados por interferência de RNA, os quais são descritos abaixo na seção (III)(b).

[0029] Em algumas modalidades, o nível da proteína ou enzima direcionada pode ser reduzida em pelo menos cerca de 5%, de cerca de 5 a 10%, de cerca de 10 a 20%, de cerca de 20 a 30%, de cerca de 30 a 40%, de cerca de 40 a 50%, de cerca de 50 a 60%, de cerca de 60 a 70%, de cerca de 70 a 80%, de cerca de 80 a 90% ou de cerca de 90 a cerca de 100%. Em outras modalidades, o nível da proteína ou enzima direcionada pode ser reduzido para níveis não detectáveis usando técnicas convencionais no campo (por exemplo, ensaios Western immunoblotting, ensaios de enzimas ELISA e outros similares).

[0030] Em algumas modalidades, a linhagem de células pode ser deficiente em enzimas ou proteínas envolvidas na glicosilação ligada a O. Por exemplo, a linhagem de células pode ser deficiente na enzima de alongamento núcleo 1 (também chamada sintase glicoproteína-N- acetilgalactosamina 3-beta-galactosiltransferase 1 da core 1 ou C1GalT1), chaperona da enzima core 1 (também chamada chaperona específica de C1GalT1 ou COSMC) ou em ambas. A COSMC facilita a dobragem, estabilidade e atividade de C1GalT1, que catalisa a transferência de um resíduo galactose em resíduo de N- acetilgalactosamina (GalNAc) que é ligado ao O a uma serina ou treonina de uma proteína. Em modalidades específicas, a linhagem de células é deficiente em C1GalT1, COSMC ou em ambas. A deficiência pode ser devido a sequências cromossômicas inativas que codificam C1GalT1 e/ou COSMC de modo que os níveis sejam reduzidos ou que não seja feita proteína C1GalT1 e/ou COSMC. Em alguns casos, pelo menos uma sequência cromossômica que codifica C1GalT1 e/ou COSMC está inativa. Em outros casos, todas as cópias das sequências cromossômicas que codificam C1GalT1 e/ou COSMC estão inativas, de modo que a linhagem de células é desprovida de proteína C1GalT1 e/ou proteína COSMC.

[0031] Em outras modalidades, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma sialiltransferase (ST). A sialiltransferase pode ser uma sialiltransferase que adiciona ácido siálico à galactose em uma conformação de ligação alfa-2,3, uma sialiltransferase que adiciona o ácido siálico à galactose ou N-acetilgalactosamina em uma conformação de ligação alfa-2,6 ou uma sialiltransferase que adiciona ácido siálico a outras unidades de ácido siálico em uma conformação de ligação alfa-2,8. Os exemplos não limitantes de sialiltransferases adequadas incluem com St3 beta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 1 (St3Gal1), St3 beta- galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 2 (St3Gal2), St3 beta- galactosídeoalfa-2,3-sialiltransferase 3 (St3Gal3), St3 beta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 4 (St3Gal4), St3 beta-galactosídeo alfa-2,3- sialiltransferase 5 (St3Gal5), St3 beta-galactosídeo alfa-2,3- sialiltransferase 6 (St3Gal6), St6 beta-galactosamida alfa-2,6- sialiltranferase 1 (St6Gal1), St6 beta-galactosamida alfa-2,6- sialiltranferase 2 (St6Gal2) , St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta- galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 1 (St6GalNac1), St6 (alfa-N-acetil- neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 2 (St6GalNac2), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N- acetilgalactosaminida 3 (St6GalNac3), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3- beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 4 (ST6GalNac4), St6 (alfa-N- acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N-acetilgalactosaminida 5 (St6GalNac5), St6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-1,3)-N- acetilgalactosaminida 6 (St6GalNac6), St8 alfa-N-acetil-neuraminida alfa- 2,8-sialiltransferase 1 (St8Sia1), St8 alfa-N-acetil-neuraminida alfa-2,8- sialiltransferase 2 (St8Sia2) , St8 alfa-N-acetil-neuraminida alfa-2,8- sialiltransferase 3 (St8Sia3), St8 alfa-N-acetil-neuraminida alfa-2,8- sialiltransferase 4 (St8Sia4), St8 alfa-N-acetil-neuraminida alfa-2,8- sialiltransferase 5 (St8Sia5),

[0032] Em modalidades específicas, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma alfa-2,3-sialiltransferase (por exemplo, St3Gal1, St3Gal2, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e/ou St3Gal6). A deficiência pode ser devido a sequências cromossômicas inativas que codificam pelo menos uma alfa-2,3-sialiltransferase de modo que níveis reduzidos ou inexistentes de pelo menos uma alfa-2,3-sialiltransferase ocorram. Em alguns casos, pelo menos uma sequência cromossômica que codifica pelo menos um alfa-2,3-sialiltransferase pode estar inativa. Em outros casos, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam pelo menos uma alfa-2,3-sialiltransferase podem estar inativas, de modo que as linhagens de células estão desprovidas de pelo menos uma alfa-2,3- sialiltransferase. Dito de outra forma, as sequências cromossômicas que codificam ST3Gal 1, 2, 3, 4, 5 e/ou 6 podem sofrer nocaute.

[0033] Em alguns casos em que a linhagem de células compreende pelo menos uma sequência cromossômica inativa que codifica pelo menos um alfa-2,3-sialiltransferase (por exemplo, St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e/ou St3Gal6), a linhagem de células pode ser manipulada ainda para superexpressar pelo menos uma sialiltransferase responsável para fazer as ligações 2,6 (por exemplo, St6Gal 1, St6Gal 2, St6GalNac1, St6GalNac2, St6GalNac3, ST6GalNac4, St6GalNac5 e/ou St6GalNac6). Assim, essas linhagens de células podem compreender glicoproteínas com números reduzidos (ou não) de resíduos de ácido siálico ligados ao terminal 2,3 e aumento do número de resíduos de ácido siálico ligados ao terminal 2,6.

[0034] Em modalidades adicionais, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma enzima ou proteína envolvida na síntese ou transporte de ácido siálico. Os exemplos de enzimas ou proteínas envolvidas na síntese ou transporte de ácido siálico incluem, entre outros, glucosamina (UDP-N-acetil)-2-epimerase/N-acetilmanosamina- cinase (GNE), sintase do ácido N-acetilneuramínico (NANS), fosfatase do ácido N-acetilneuramínico (NANP), Sintetase do ácido N- acetilneuramínico citidina monofosfato (CMAS) e hidroxilase do ácido N-acetilneuramínico citidina monofosfato (CMAH), transportador de soluto família 35 (transportador de ácido CMP-siálico), membro A1 (Slc35A1). Em certas modalidades, a linhagem de células pode ser deficiente em Slc35A1, a qual transporta o ácido CMP-siálico para o Golgi. Em alguns casos, pelo menos uma sequência cromossômica que codifica Slc35A1 pode estar inativa. Em outros casos, todas as cópias das sequências cromossômicas que codificam Slc35A1 estão inativas, de modo que a linhagem de células é desprovida de proteína Slc35A1.

[0035] Em modalidades adicionais, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma enzima ou proteína envolvida na N- glicosilação. Em alguns casos, a enzima ou proteína envolvida na N- glicosilação pode ser uma N-acetilglicosilaminiltransferase, que adiciona um resíduo GlcNAc a um resíduo de manose ligada a beta de um glicano N-ligado. Exemplos incluem manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferase 1 (Mgat-1), manosil (alfa-1,6-)- glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosaminiltransferase 2 (Mgat-2), manosil (alfa-1,4-)-glicoproteína beta-1,4-N- acetilglucosaminiltransferase 3 (Mgat-3), manosil (alfa-1,3-)-beta- glicoproteína 1,4-N-acetilglucosaminiltransferase 4 (Mgat-4) e manosil (alfa-1,6-)-glicoproteína beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferase 5 (Mgat-5). Em outros casos, a enzima ou proteína envolvida na N- glicosilação pode ser uma galactosiltransferase, que adiciona um resíduo de galactose a em uma ligação beta 1,4 a um resíduo GlcNAc de um glicano N-ligado. A galactosiltransferase pode ser UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 1 (B4GalT1), UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 2 (B4GalT2), UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 3 (B4GalT3), UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4- galactosiltransferase, polipeptídeo 4 (B4GalT4), UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 5 (B4GalT5), UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 6 (B4GalT6) ou UDP-Gal: BetaGlcNAc beta 1,4-galactosiltransferase, polipeptídeo 7 (B4GalT7). Em certos casos, a linhagem de células pode ser deficiente em pelo menos uma N-acetilglicoilaminiltransferase e/ou galactosiltransferase. Em algumas interações, pelo menos uma sequência cromossômica que codifica pelo menos uma N- acetilglicoilaminiltransferase e/ou galactosiltransferase pode estar inativa. Em outros casos, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam pelo menos uma N- acetilglicoilaminiltransferase e/ou galactosiltransferase podem estar inativas, de modo que as linhagens de células estão desprovidas de pelo menos uma N-acetilglicoilaminiltransferase e/ou galactosiltransferase.

(ii) Interferência em proteínas virais

[0036] Em outras modalidades, as linhagens de células de mamífero podem ser manipuladas para expressar moléculas que inibem ou bloqueiam replicação e/ou infectividade. Por exemplo, as linhagens de células podem ser manipuladas para expressar de forma estável pelo menos um agente de interferência de RNA (RNAi) em relação a proteínas virais específicas que estão envolvidas na replicação e/ou infectividade. Os exemplos não limitantes de proteínas adequadas incluem proteínas virais não estruturais virais como NS1 ou NS2 e proteínas do capsídeo como VP1 ou VP2. Os agentes de RNAi se ligam a transcritos alvo e impedem a expressão da proteína pela mediação da clivagem da clivagem do transcrito ou interrupção da tradução do transcrito.

[0037] Em algumas modalidades, o agente de RNAi pode ser um RNA interferente curto (siRNA). Em geral, um siRNA compreende uma molécula de RNA de fita dupla que varia de cerca de 15 a cerca de 29 nucleotídeos de comprimento, ou mais geralmente, de cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades específicas, o siRNA pode ter cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, o siRNA pode compreender ainda uma ou duas alças de fita simples, por exemplo, uma alça 3' em uma ou ambas as extremidades. O siRNA pode ser formado a partir de duas moléculas de RNA que hibridizam juntas ou, alternativamente, podem ser geradas a partir de um RNA hairpin curto (shRNA) (veja abaixo). Em algumas modalidades, as duas fitas do siRNA são totalmente complementares, de modo que não haja nenhuma incompatibilidade ou protuberância no duplex formado entre as duas sequências. Em outras modalidades, as duas fitas do siRNA são substancialmente complementares, de modo que exista uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias no duplex formado entre as duas sequências. Em determinadas modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' do siRNA têm um grupo fosfato, enquanto que em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' não têm um grupo fosfato.

[0038] Uma fita do siRNA, que é referida como a "fita antissenso" ou "fita de guia," inclui uma porção que hibrida com o transcrito alvo. Em algumas modalidades, a fita antissenso do siRNA pode ser completamente complementar a uma região do transcrito alvo, ou seja, que hibrida com o transcrito alvo sem uma única discordância ou protuberância em todo o comprimento do siRNA. Em outras modalidades, a fita antissenso é substancialmente complementar para a região alvo, ou seja, uma ou mais discordâncias e/ou protuberâncias podem existir no duplex formado pela fita antissenso e o transcrito alvo. Normalmente, os siRNAs são direcionados para sequências exônicas dos transcritos alvo. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com programas, algoritmos, e/ou serviços comerciais que desenham siRNAs para transcritos alvo.

[0039] Em outras modalidades, o agente de RNAi pode ser um RNA hairpin curto (shRNA). Em geral, um shRNA é uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas porções complementares que são hibridadas ou são capazes de hibridar para formar uma estrutura de fita dupla com comprimento suficiente para mediar a interferência de RNA (tal como descrito acima), e, pelo menos, uma porção de fita simples que forma um circuito que liga as regiões do shRNA que formam o dúplex. A estrutura também pode ser denominada uma estrutura em ansa pedunculada, com a haste sendo a porção dúplex. Em algumas modalidades, a porção dúplex da estrutura pode ser completamente complementar, tal que não existem incompatibilidades ou protuberâncias na região dúplex do shRNA. Em outras modalidades, a porção dúplex da estrutura pode ser substancialmente complementar, tal que uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias podem existir na porção duplex do shRNA. O circuito da estrutura pode ser de cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, mais especificamente desde cerca de 6 a cerca de 9 nucleotídeos de comprimento. A ansa pode ser localizada na extremidade 5' ou 3' da região, que é complementar ao transcrito alvo (ou seja, a porção antissenso do shRNA).

[0040] O shRNA pode ainda compreender uma saliência na extremidade 5 'ou 3'. A saliência opcional pode ser desde cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, ou mais especificamente a partir de cerca de 2 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a saliência compreende um ou mais resíduos U, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 5 resíduos U. Em algumas modalidades, a extremidade 5' do shRNA pode ter um grupo fosfato. Em geral, shRNAs são transformados em siRNAs pela maquinaria celular conservada de RNAi. Assim, shRNAs são precursores de siRNAs e são igualmente capazes de inibir a expressão de um transcrito alvo que é complementar a uma parte do shRNA (ou seja, a porção antissenso do shRNA). Aqueles versados na técnica estão familiarizados com os recursos disponíveis para o projeto e a síntese de shRNAs. Um exemplo exemplificativo são shRNAs MISSION® (Sigma-Aldrich).

[0041] O siRNA ou shRNA podem ser expressos in vivo a partir de uma construção de expressão de RNAi. Construções adequadas incluem vetores de plasmídeo, fagemídeos, cosmídeos, mini- cromossomas/artificiais, transposons, e vetores virais (por exemplo, vetores lentivirais, vetores virais adenoassociados, etc.). Numa modalidade, a construção de expressão de RNAi pode ser um vetor de plasmídeo (por exemplo, pUC, pBR322, PET, pBluescript, e variantes dos mesmos). A construção de expressão de RNAi pode compreender duas sequências de controle de promotor, em que cada uma está ligada operativamente sequência de codificação apropriada de tal modo que dois fios, de siRNA complementares separados podem ser transcritos. As sequências de controle de dois promotores podem estar na mesma orientação ou em orientações opostas. Numa outra modalidade, o vetor de expressão de RNAi pode conter uma sequência de controle de promotor que dirige a transcrição de uma molécula de RNA que compreende duas regiões complementares, de tal modo que a transcrição forma um shRNA. Em geral, a sequência (s) de controle de promotor serão promotores de RNA polimerase III (Pol III), tais como os promotores U6 ou H1. Em outras modalidades, sequências de controle de promotor RNA polimerase II (pol II) podem ser utilizadas (alguns exemplos são apresentados a seguir). As construções de expressão de RNAi podem conter elementos de sequências adicionais, tais como sequências de terminação da transcrição, sequências de marcas selecionáveis, etc. A construção de expressão de RNAi pode ser introduzido na linhagem celular de interesse através de procedimentos padrão. A construção de expressão de RNAi pode ser cromossomicamente integrado na linhagem celular para expressão estável. Alternativamente, a construção de expressão pode ser RNAi extracromossômico (por exemplo, epissomal) na linhagem celular para a expressão estável.

[0042] Em ainda outras modalidades, as linhagens celulares podem ser manipuladas para expressar estavelmente formas negativas dominantes de proteínas virais envolvidas na replicação e/ou infectividade. Uma forma negativa dominante da proteína é alterada ou mutada de tal forma que ela concorre melhor que ou inibe a proteína de tipo selvagem. Os exemplos não limitativos de proteínas adequadas incluem proteínas não estruturais virais tais como NS1 ou NS2, e as proteínas do capsídeo viral, tais como VP1 ou VP2. Em modalidades específicas, a linhagem celular pode ser modificada para expressar uma forma negativa dominante de uma ou mais proteínas NS1.

[0043] Uma proteína dominante negativa pode ter uma deleção, uma inserção, e/ou uma substituição em relação à proteína do tipo selvagem (Lagna et al., 1998, Curr. Topics Dev. Biol, 36: 75-98). A deleção, inserção e/ou substituição pode ser no N-terminal, C-terminal, ou um sítio interno da proteína. Meios para gerar proteínas mutantes (por meio de mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese baseada em PCR, mutagênese aleatória, etc.) são bem conhecidos na técnica, como são os meios para identificar os que têm efeitos negativos dominantes. As linhagens celulares podem ser transfectadas com construção (ões) de expressão (ver acima) compreendendo a sequência que codifica a proteína dominante negativa (s), em que a sequência de codificação está operativamente ligada a uma sequência de controle do promotor de Pol II para expressão. A sequência de controle do promotor pode ser constitutiva, regulada ou específica de tecido.

[0044] As sequências de controle de promotor constitutivas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, o promotor de citomegalovírus precoce imediato (CMV), promotor de vírus de símio (SV40), promotor principal de adenovírus tardio, promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de fosfoglicerato-quinase (PGK), promotor do fator de alongamento (ED1)-alfa, promotores de ubiquitina, promotores de actina, promotores de tubulina, promotores de imunoglobulina, fragmentos dos mesmos, ou combinações de qualquer um dos precedentes. Exemplos de sequências de controle de promotor regulados adequadas incluem, sem limite aquelas reguladas por choque térmico, metais, esteroides, antibióticos ou álcool. Exemplos de promotores específicos de tecido não limitativos incluem o promotor B29, promotor de CD14, promotor de CD43, promotor de CD45, promotor de CD68, o promotor da desmina, promotor de elastase-1, promotor de endoglina, promotor de fibronectina, promotor de Flt-1, promotor de GFAP, promotor GPIIb, promotor de ICAM-2, promotor de INF-β, promotor de Mb, promotor de NphsI, promotor de OG-2, promotor de SP-B, promotor de SYN1, e promotor de WASP. A sequência de promotor pode ser de tipo selvagem ou pode ser modificada para uma expressão mais eficiente ou eficaz.

[0045] A construção de expressão pode compreender sequências de controle de expressão adicionais (por exemplo, sequências potencializadoras, sequências de Kozak, sequências de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, etc.), sequências de marcador selecionável (por exemplo, genes de resistência a antibióticos), origens de replicação, e semelhantes. Informação adicional pode ser encontrada em "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a edição, 2001.

(iii) Superexpressão de proteínas celulares envolvidas nas respostas antivirais

[0046] Em modalidades alternativas, as linhagens celulares de mamíferos podem ser manipuladas para superexpressarem proteínas celulares envolvidas em respostas antivirais de célula hospedeira. Exemplos não limitativos de proteínas envolvidas em respostas antivirais incluem fita dupla ativada por RNA de proteína quinase R (PKR, que é também conhecido como o fator de iniciação de tradução eucariótica 2-alfa quinase 2 ou Eif2ak2), proteína quinase 2 de interação com receptor (RIPK2), interferons (por exemplo, Tipo I e Tipo II), interleucinas (por exemplo, IL-1 e IL-6), fator de necrose tumoral alfa, fator regulador de interferon 1, STATs, p53, fator de ativação de transcrição 3, NF-kB, fator de iniciação eucariótica 2 (eIF2), inibidores de proteínas de apoptose (IAPs), e proteína antiviral dedo de zinco (ZAP). Em modalidades específicas, as linhagens celulares podem ser manipuladas para superexpressar PKR.

[0047] A superexpressão pode ser alcançada através da introdução de uma ou mais cópias exógenas de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. A sequência que codifica a proteína celular de interesse é geralmente operacionalmente ligada a uma sequência de controle do promotor de Pol II (ver acima). Múltiplas cópias da sequência de codificação podem ser ligadas em paralelo e colocadas sob o controle de uma sequência de controle do promotor único. A sequência (s) que codifica a proteína de interesse pode ser introduzida nas linhagens celulares como parte de uma construção de expressão (veja acima). Por conseguinte, a construção de expressão pode ser inserida numa localização cromossômica ou, em alternativa, a construção de expressão pode ser extracromossômica (por exemplo, epissomal) para expressão estável.

[0048] A superexpressão pode também ser conseguida por modificação da sequência de controle de promotor da sequência cromossômica endógena que codifica a proteína de interesse. Por exemplo, a sequência de controle de promotor endógena pode ser modificada através da inserção de pelo menos uma sequência de controle de promotor exógena "forte" (isto é, tendo uma elevada afinidade para a polimerase de RNA e/ou fatores associados) (exemplos dos quais são apresentados acima). Alternativamente, a sequência da sequência de controle de promotor endógena pode ser modificada para imitar as sequências de controle promotor "fortes". Sequências cromossômicas endógenas podem ser modificadas utilizando técnicas de segmentação de modificação do genoma mediadas por endonucleases detalhadas abaixo na seção (III).

(b) Tipos de células

[0049] As linhagens celulares resistentes virais aqui descritas são linhagens celulares de mamífero. Em algumas modalidades, as linhas de célula tendo resistência à infecção viral podem ser derivadas de células de ovário de hamster chinês (CHO); células de mieloma de camundongo NS0; células de rim de hamster bebê (BHK); células de fibroblastos embrionárias de camundongo 3T3 (NIH3T3); células de linfoma de camundongo B A20; células de melanoma de camundongo B16; células de mioblasto de camundongo C2C12; células de mieloma de camundongo SP2/0; células mesenquimais embrionárias de camundongo C3H 10T1/2; células de carcinoma de camundongo CT26, células de próstata de camundongo DuCuP; células de mama de camundongo EMT6; células de hepatoma de camundongo Hepa1c1c7; células de mieloma de camundongo J5582; células epiteliais de camundongo MTD-1A; células de miocárdio de camundongo MyEnd; células renais de camundongo RenCa; células pancreáticas de camundongo RIN-5F; células de melanoma de camundongo X64; células de linfoma de camundongo YAC-1; células de glioblastoma de camundongo 9L; células de linfoma de camundongo B RBL; células de neuroblastoma de camundongo B35; células de hepatoma de camundongo (HTC); células de fígado de camundongo búfalo BRL 3A; células de rim canino (MDCK); células mamárias caninas (CMT); células de osteossarcoma de camundongo D17; células de monócitos/macrófagos de camundongo DH82; células de rim de macaco SV-40 de fibroblasto transformado (COS7); células de rim de macaco CVI-76; células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células embrionárias de rim humano (HEK293, HEK293T); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); células de osteossarcoma humano U2-OS, células humanas A549, células A-431 humanas ou células K562 humanas. Uma extensa lista de linhagens celulares de mamíferos pode ser encontrada no catálogo da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Em outras modalidades, as linhagens celulares com resistência viral são não humanas, linhagens celulares de mamíferos. Noutras modalidades, as linhagens celulares com resistência viral são não humanas, não camundongo, linhagens celulares de mamíferos. Em certas modalidades, as linhagens celulares com resistência viral são as linhagens celulares de CHO. Numerosas linhagens celulares CHO estão disponíveis a partir de ATCC. Linhagens celulares de CHO adequadas incluem, mas não estão limitadas a células CHO-K1 e suas derivadas.

[0050] Em várias modalidades, as linhagens celulares podem ser deficientes em glutamina sintetase (GS), di-hidrofolato redutase (DHFR), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT), ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, as sequências cromossômicas que codificam para GS, DHFR, e/ou HPRT podem ser inativadas. Em modalidades específicas, todas as sequências cromossômicas que codificam GS são inativadas nas linhagens celulares.

(c) Vírus

[0051] As linhagens celulares de mamífero manipuladas possuindo resistência viral podem ser resistentes a uma variedade de vírus de mamíferos. O vírus pode ser um vírus de DNA ou RNA de um vírus, e o vírus pode ser envolvido em ou sem envelope ("nu"). Exemplos não limitativos de vírus que podem se ligar a e entrar nas células de mamífero através de receptores do ácido siálico incluem parvovírus, reovírus, rotavírus, vírus da gripe, vírus adenoassociado, calicivírus, vírus parainfluenza, vírus da rubéola, vírus corona, norovírus, vírus da encefalomiocardite, e poliomavírus. Em algumas modalidades, as linhagens celulares de mamífero manipuladas são resistentes à infecção por, pelo menos, um parvovírus. Exemplos não limitativos de parvovírus adequados incluem vírus minutos de camundongo (MVM) (que é também conhecido como vírus camundongo minutos (MMV) ou protoparvovírus de roedor 1), parvovírus de camundongo tipo-1 (MPV- 1), parvovírus de camundongo tipo-2 (MPV-2), parvovírus de camundongo tipo-3 (MPV-3), parvovírus suíno 1, parvovírus bovino 1, e parvovírus humano (por exemplo, parvovírus humano B19, parvovírus humano 4, parvovírus humano 5, etc). Em modalidades particulares, o parvovírus pode ser MVM. Em outras modalidades, o vírus pode ser um reovírus, tal como reovírus-3 de mamífero, ortoreovirus de mamífero, ortoreovirus aviário, e semelhantes).

[0052] Em algumas modalidades, as linhagens celulares de mamífero manipuladas com resistência à infecção viral podem também ter a resistência à infecção por organismos da ordem Mollicutes. Em particular, as linhagens celulares aqui divulgadas podem ser resistentes à infecção pelo gênero micoplasma ou spiroplasma.

(d) Ácido nucleico opcional que codifica proteína recombinante

[0053] Em algumas modalidades, as linhagens celulares de mamífero possuindo resistência à infecção viral podem ainda compreender, pelo menos, um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante. Em geral, a proteína recombinante é heteróloga, o que significa que a proteína não é nativa à célula. A proteína recombinante pode ser, sem limite, uma proteína terapêutica escolhida a partir de um anticorpo, um fragmento de um anticorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo quimérico, uma molécula de IgG, uma fita pesada de IgG, uma fita leve de IgG, uma molécula de IgA, uma molécula de IgD, uma molécula de IgE, uma molécula de IgM, uma vacina, um fator de crescimento, uma citocina, um interferon, uma interleucina, um hormônio, um fator de coagulação (ou coagulação), um componente do sangue, uma enzima, uma proteína terapêutica, uma proteína de nutracêuticos, um fragmento funcional ou variante funcional de qualquer um dos acima, ou uma proteína de fusão compreendendo qualquer uma das proteínas acima e/ou fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos.

[0054] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode estar ligada a uma sequência que codifica hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HPRT), deiidrofolato redutase (DHFR), e/ou glutamina sintase (GS), tal que HPRT, DHFR, e/ou GS podem ser utilizados como um marcador selecionável ampliável. O ácido nucleico que codifica a proteína recombinante também pode ser ligado à sequência que codifica pelo menos um gene de resistência à antibiótico e/ou sequência de codificação de proteínas marcadoras, tais como proteínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser parte de uma construção de expressão. Conforme detalhado em outra parte construções de expressão ou vetores podem incluir sequências de controle de expressão adicionais (por exemplo, sequências potenciadoras, sequências de Kozak, sequências de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição, etc.), sequências de marcadores selecionáveis, origens de replicação, e semelhantes. Informação adicional pode ser encontrada em Ausubel et al. 2003, supra, e Sambrook & Russell, 2001, supra.

[0055] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser localizado extracromossomicamente. Isto é, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser expresso de forma transiente de um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossoma artificial, um minicromossomo, ou uma outra construção extracromossômico. Em outras modalidades, o ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser cromossomicamente integrado no genoma da célula. A integração pode ser aleatória ou orientada. Assim sendo, a proteína recombinante pode ser expressa de forma estável. Em algumas iterações desta modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser operativamente ligada a uma sequência de controle da expressão heteróloga adequada (isto é, o promotor). Em outras iterações, a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser colocada sob o controle de uma sequência de controle da expressão endógena. A sequência de ácido nucleico que codifica a proteína recombinante pode ser integrada no genoma da linhagem celular utilizando recombinação homóloga, a segmentação de edição mediada por endonucleases do genoma, vetores virais, transposons, plasmídeos, e outros meios bem conhecidos. Orientações adicionais podem ser encontradas em Ausubel et al. 2003, supra e Sambrook & Russell, 2001, supra.

(e) Composições

[0056] Em certas modalidades, as linhagens celulares de mamífero manipuladas para exibir resistência viral pode ser parte de uma composição, o qual compreende também, pelo menos, um vírus. A composição, por conseguinte, compreende a linhagem celular manipuladas (que compreende ainda, opcionalmente, um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante) aqui divulgados e um vírus, em que a entrada e/ou a propagação do pelo menos um vírus é reduzido ou eliminado na linhagem celular de mamíferos manipulada. Assim, as células na composição são capazes de se propagar, mas vírus na composição é incapaz de se propagar por causa da sua entrada e/ou replicação dentro das células é reduzida ou eliminada. A composição pode ainda compreender, pelo menos, um meio de crescimento celular para suportar o crescimento das células de linhagem celular de mamífero manipulada. Em alguns casos, o meio de crescimento de células é um meio isento de componente animal.

(f) Modalidades exemplificativas

[0057] Em modalidades específicas, as linhagens celulares de mamífero possuindo resistência viral são as linhagens celulares de CHO. As linhagens celulares CHO resistentes a vírus podem ser resistentes à infecção pelo vírus minutos de camundongo (MVM) (que é também conhecido como vírus camundongo minutos (MMV) ou protoparvovirus de roedor 1) e/ou reovírus de mamífero 3. Especificamente, as linhagens celulares de CHO geneticamente modificadas aumentaram a resistência à infecção por reovírus-3 ou MVM, em comparação com as linhagens celulares CHO parentais não modificadas. Em algumas modalidades, a linhagem celular parental não modificada é uma linhagem celular CHO (GS -/-).

[0058] As linhagens celulares CHO resistentes a vírus compreendem pelo menos uma sequência cromossômica inativada que codifica COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5 e/ou St3Gal6. Em algumas modalidades, todas as cópias de sequências cromossômicas que codificam COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, e/ou St3Gal6 são inativadas ou eliminadas nas linhagens celulares CHO. Em outras modalidades, as células CHO que compreendem sequência cromossômica inativada que codifica COSMC, Slc35A1, C1GalT1, St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, e/ou St3Gal6 ainda compreende sequências cromossômicas inativadas que codificam Mgat1, Mgat2, Mgat3, Mgat4 e/ou Mgat5. Noutras modalidades, as células CHO que compreendem sequências cormossômicas inativadas que codificam St3Gal1, St3Gal2, ST3Gal3, St3Gal4, St3Gal5, e/ou St3Gal6 são ainda mais manipuladas para superexpressar St6Gal 1, St6Gal 2, St6GalNac1, St6GalNac2, St6GalNac3, ST6GalNac4, St6GalNac5 e/ou St6GalNac6.

(II) Métodos para Reduzir ou Prevenir Contaminação Viral

[0059] Outro aspecto da presente divulgação abrange métodos para reduzir ou prevenir a contaminação viral de um produto de proteína recombinante, ou reduzir o risco de contaminação viral de um sistema de produção biológico. Em geral, os métodos compreendem fornecer linhagens celulares de mamíferos manipuladas em que a entrada e/ou propagação de pelo menos um vírus é reduzida ou eliminada, e utilizando as referidas linhagens celulares para a produção da proteína recombinante. As linhagens celulares de mamífero manipuladas são detalhadas acima nas secções (I). As linhagens celulares de mamífero exibem um aumento da resistência à infecção viral, em comparação com as linhagens celulares parentais não modificadas. As linhagens celulares de mamífero manipuladas exibem resistentes a vírus descritos na secção (I)(c). Proteínas recombinantes adequadas são descritas na secção (I)(d). Meios para produzir ou fabricar proteínas recombinantes são bem conhecidos no campo (ver, por exemplo, "Biopharmaceutical Production Technology", Subramanian (ed), 2012, Wiley-VCH; ISBN: 978-3-52733029-4). Em modalidades específicas, as linhagens celulares de mamífero manipuladas são geneticamente modificadas para compreender, pelo menos, uma sequência cromossômica modificada de tal modo que a linhagem celular é resistente à infecção viral.

[0060] Em geral, a utilização de linhagens celulares de mamífero manipuladas aqui divulgadas reduz a capacidade do vírus para se replicar num fermentador ou outro vaso de bioprodução de tal modo que o nível de vírus replicável está ao nível de traços ou, idealmente, a um nível que não é detectável pelas melhores práticas padrão da indústria. Os métodos adequados incluem métodos de detecção de ácidos nucleicos (por exemplo, Southern blot para detectar ácidos nucleicos virais, PCR ou RT-PCR para detectar ácidos nucleicos virais, métodos de sequenciamento e similares), técnicas baseadas em anticorpos (por exemplo, Western immunoblotting utilizando anticorpos antivirais de proteína, métodos de ELISA, e assim por diante), e técnicas microscópicas (por exemplo, ensaios de efeito citopático, microscopia eletrônica para detectar partículas virais, etc.).

(III) Métodos para Preparação Linhagens celulares Resistentes a Vírus

[0061] Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece métodos para a preparação de células resistentes a vírus possuindo receptores de superfície celular alterada, conforme descrito acima na seção (I)(a)(i). Sequências cromossômicas que codificam enzimas ou proteínas envolvidas na síntese de fitas de glicano podem ser batidas ou abatidas utilizando uma variedade de técnicas para gerar as linhagens celulares resistentes a vírus. Em algumas modalidades, as linhagens celulares resistentes a vírus podem ser preparadas por um processo de modificação do genoma mediado por endonuclease de segmentação. Em outras modalidades, as linhagens celulares resistentes a vírus podem ser preparadas por mecanismos mediados por interferência de RNA. Em ainda outras modalidades, as linhagens celulares resistentes a vírus podem ser preparadas por sistemas de recombinação específica do local, mutagênese aleatória, ou outros métodos conhecidos na técnica.

(a) Edição genoma mediada por segmentação de endonuclease

[0062] Endonucleases de segmentação pode ser utilizada para modificar (por exemplo, inativar ou alterar) as sequências cromossômicas específicas de interesse. Uma sequência cromossômica específica pode ser inativada através da introdução numa célula de uma endonuclease de segmentação ou um ácido nucleico que codifica a endonuclease de segmentação, o que tem como alvo uma sequência cromossômica específica. Numa modalidade, a endonuclease de segmentação reconhece e se liga à sequência cromossômica específica e introduz uma quebra de fita dupla que é reparada por um processo de reparação não homólogo de junção de extremidade (NHEJ). Porque NHEJ é propenso a erros, uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo pode ocorrer, interrompendo assim a grelha de leitura da sequência cromossômica de modo a que nenhum produto de proteína é produzido. Numa outra modalidade, as endonucleases de segmentação também podem ser utilizadas para alterar uma sequência cromossômica por meio de uma reação de recombinação homóloga através de co-introdução de um polinucleotídeo possuindo identidade de sequências substancial com uma porção da sequência cromossômica segmentada. A ruptura de fita dupla introduzida pela endonuclease de segmentação é reparada por um processo de reparação dirigida por homologia de tal modo que a sequência cromossômica é trocada com o polinucleotídeo de uma maneira que resulte na sequência cromossômica a ser modificada ou alterada.

[0063] Uma variedade de endonucleases de segmentação pode ser utilizada para modificar a sequência cromossômica (s) de interesse. A endonuclease de segmentação pode ser uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína de manipulada. Endonucleases de segmentação adequadas incluem, sem limite, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), CRISPR/endonucleases Cas, nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALE) (TALENs), meganucleases, endonucleases específicas de sítio, e agentes indutores de quebra dupla de fita de DNA.

(i) Nucleases de dedos de zinco

[0064] Em modalidades específicas, a endonuclease de segmentação pode ser uma nuclease de dedo de zinco (ZFN). ZFNs liga-se a uma sequência alvo específica e introduz uma quebra de fita dupla na sequência alvo. Tipicamente, um ZFN compreende um domínio de ligação do DNA (isto é, os dedos de zinco) e um domínio de clivagem (isto é, a nuclease), cada um dos quais é descrito abaixo.

[0065] Domínio de ligação de DNA. Um domínio de ligação de DNA ou os dedos de zinco podem ser manipulados para reconhecer e ligar- se a qualquer sequência de ácido nucleico de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33.850-33.860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; e Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 105:5809-5814. Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação a uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Métodos de manipulação incluem, mas não estão limitados a design racional e vários tipos de seleção. O design racional inclui, por exemplo, utilizar bancos de dados compreendendo sequências nucleotídicas de dupleto, tripleto e/ou quadrupleto e sequências de aminoácidos de dedo de zinco individuais, em que cada sequência nucleotídica de tripleto ou de quadrupleto está associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco que ligam a sequência de tripleto ou quadrupleto específica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. US Nos. 6.453.242 e 6.534.261, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Como exemplo, o algoritmo do descrito na patente US 6.453.242 pode ser utilizado para conceber um domínio de ligação de dedo de zinco para segmentar uma sequência pré- selecionada. Métodos alternativos, tais como a concepção racional, utilizando uma tabela de códigos de reconhecimento não degenerada pode também ser utilizada para desenhar um domínio de ligação de dedo de zinco para atingir uma sequência específica (Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081). Ferramentas web-based publicamente disponíveis para a identificação de sítios alvo potenciais em sequências de DNA, bem como concepção de domínios de ligação de dedos de zinco são conhecidas na técnica. Por exemplo, as ferramentas para a identificação de sítios alvo potenciais em sequências de DNA podem ser encontradas em http://www.zincfingertools.org. Ferramentas para conceber domínios de ligação de dedo de zinco podem ser encontradas em http://zifit.partners.org/ZiFiT. (Ver também, Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605).

[0066] Um domínio de ligação de dedo de zinco pode ser concebido para reconhecer e se ligar a uma sequência de DNA que varia de cerca de 3 nucleotídeos a cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Numa modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco pode ser concebido para reconhecer e se ligar a uma sequência de DNA que varia desde cerca de 9 a cerca de 18 nucleotídeos de comprimento. Em geral, os domínios de ligação de dedo de zinco das nucleases de dedos de zinco aqui utilizadas compreendem pelo menos três regiões de reconhecimento de dedo de zinco ou dedos de zinco, em que cada dedo de zinco liga 3 nucleotídeos. Numa modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco compreende quatro regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Numa outra modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco compreende cinco regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Em ainda outra modalidade, o domínio de ligação de dedo de zinco compreende seis regiões de reconhecimento de dedo de zinco. Um domínio de ligação de dedo de zinco pode ser concebido para se ligar a qualquer sequência de DNA alvo apropriada. Ver, por exemplo, US Nos. 6.607.882; 6.534.261 e 6.453.242, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0067] Exemplos de métodos de seleção de uma região de reconhecimento de dedo de zinco incluem sistemas de apresentação de fagos e de dois híbridos, os quais são descritos nas Patentes US N° 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2338237, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Além disso, o aumento da especificidade dos domínios de ligação de dedo de zinco tem sido descrito, por exemplo, no documento WO 02/077227, a divulgação completa do qual é aqui incorporada por referência.

[0068] Domínios de ligação de dedo de zinco e métodos para a concepção e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que codificam o mesmo) são conhecidos dos versados na técnica e estão descritos em pormenor em, por exemplo, Patente US N° 7.888.121, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Regiões de reconhecimento de dedo de zinco e/ou proteínas de multi-dedos de zinco podem ser ligados em conjunto, utilizando sequências ligantes adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de cinco ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, Patentes U.S. N° 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade, para exemplos não limitativos de sequências ligantes de seis ou mais aminoácidos de comprimento. O domínio de ligação de dedo de zinco aqui descritos podem incluir uma combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0069] Em algumas modalidades, a nuclease de dedo de zinco compreende ainda um sinal de localização nuclear ou sequência (NLS). Um NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita a segmentação da proteína de nucleases de dedos de zinco no núcleo para introduzir uma ruptura de fita dupla na sequência alvo no cromossoma. Sinais de localização nuclear são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027.

[0070] Domínio de clivagem. Uma nuclease de dedo de zinco também inclui um domínio de clivagem. A porção do domínio de clivagem da nuclease de dedo de zinco pode ser obtida a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Exemplos não limitativos de endonucleases a partir das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a endonucleases de restrição e homing endonucleases. Veja, por exemplo, New England Biolabs Catalog or Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Enzimas adicionais que clivam o DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease S1; nuclease do feijão mungo; DNase I pancreática; nuclease microcócica; levedura endonuclease HO). Ver também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser utilizadas como uma fonte de domínios de clivagem.

[0071] Um domínio de clivagem também pode ser derivado a partir de uma enzima ou uma porção da mesma, como descrito acima, que requer a dimerização para a atividade de clivagem. Duas nucleases de dedos de zinco podem ser necessárias para a clivagem, como cada nuclease compreende um monômero do dímero de enzima ativa. Alternativamente, uma única nuclease de dedo de zinco pode compreender ambos os monômeros para criar um dímero de enzima ativa. Tal como aqui utilizado, um "dímero de enzima ativa" é uma enzima dímero capaz de clivar uma molécula de ácido nucleico. Os dois monômeros de clivagem podem ser derivados a partir da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais das mesmas), ou de cada monômero podem ser derivadas de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais das mesmas).

[0072] Quando dois monômeros de clivagem são utilizados para formar um dímero de enzima ativa, os locais de reconhecimento para as duas nucleases de dedos de zinco estão de preferência dispostas de tal modo que a ligação das duas nucleases de dedos de zinco para os respectivos locais de reconhecimento coloca os monômeros de clivagem na orientação espacial uns dos outros que permite que os monômeros de clivagem para formar um dímero de enzima ativa, por exemplo, por dimerização. Como resultado, as extremidades próximas dos locais de reconhecimento podem estar separadas por cerca de 5 a cerca de 18 nucleotídeos. Por exemplo, as bordas próximas podem ser separadas por cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos. Contudo, será entendido que qualquer número inteiro de nucleotídeos ou pares de nucleotídeos pode intervir entre dois locais de reconhecimento (por exemplo, desde cerca de 2 a cerca de 50 pares de nucleotídeos ou mais). As bordas próximas dos locais de reconhecimento das nucleases de dedos de zinco, tais como, por exemplo, os descritos aqui em pormenor, podem ser separadas por 6 nucleotídeos. Em geral, o sítio de clivagem situa-se entre os sítios de reconhecimento.

[0073] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de se ligar de forma de sequência específica ao DNA (num sítio de reconhecimento), e clivar o DNA no ou próximo ao sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) DNA clivam em locais removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios separáveis de ligação e de clivagem. Por exemplo, a enzima do Tipo IIS Fok I catalisa a clivagem de fita dupla do DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e em 13 nucleotídeos de seus sítios de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, a Patente U.S. US Nos. 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31.978-31.982. Assim, uma nuclease de dedo de zinco pode compreender o domínio de clivagem a partir de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedos de zinco, os quais podem ou não podem ser manipulados. Enzimas de restrição Tipo IIS exemplificativas encontram-se descritas, por exemplo, na Publicação Internacional WO 07/014.275, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade. As enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e de clivagem separáveis, e esses também são contemplados pela presente divulgação. Vide, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[0074] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplificativa, cujo domínio de clivagem é separável a partir do domínio de ligação, é FokI. Esta enzima particular é ativa como um dímero (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). Por conseguinte, para os fins da presente divulgação, a porção da enzima FokI utilizada em uma nuclease de dedo de zinco é considerada um monômero de clivagem. Assim, para a clivagem de fita dupla utilizando um domínio de clivagem alvo FokI, duas nucleases de dedos de zinco, compreendendo cada monômero uma clivagem FokI, pode ser utilizada para reconstituir um dímero de enzima ativa. Alternativamente, também podem ser utilizados uma única molécula de polipeptídeo que contém um domínio de ligação de dedo de zinco e dois monômeros de clivagem FokI.

[0075] Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreende um ou mais monômeros de clivagem manipulados que minimizam ou impedem a homodimerização. A título de exemplo não limitativo, os resíduos de aminoácidos nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de FokI são todos alvos para influenciar a dimerização dos meio-domínios de clivagem de Fok I. Exemplos de monômeros de clivagem manipulados de FokI que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par, em que um primeiro monômero de clivagem inclui mutações no resíduo posições de aminoácidos 490 e 538 de FokI e um segundo monômero de clivagem que inclui mutações no resíduo de posições de aminoácido 486 e 499.

[0076] Assim, em uma modalidade dos monômeros de clivagem manipulados, uma mutação na posição de aminoácido 490 substitui Glu (E) com Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 538 substitui Iso (I) com Lys (K); uma mutação no resíduo de aminoácido 486 substitui Gln (Q), com Glu (E); e uma mutação na posição 499 substitui Iso (I) com Lys (K). Especificamente, os monômeros de clivagem manipulado podem ser preparados por posições de mutação 490 de E a K e 538 de I a K em um monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem manipulado designado "E490K:I538K" e por posições de mutação 486 de Q para E e 499 de I a K em outro monômero de clivagem para produzir um monômero de clivagem manipulado designado "Q486E: I499K." Os monômeros de clivagem manipulado acima descritos são heterodímeros obrigatórios mutantes em que a clivagem aberrante é minimizada ou abolida. Monômeros de clivagem manipulados podem ser preparados por um método adequado, por exemplo, por mutagênese dirigida ao sítio de monômeros de clivagem de tipo selvagem (FokI) como descrito em U.S. US No. 7.888.121, que é aqui incorporada na sua totalidade.

[0077] Domínios adicionais. Em algumas modalidades, a nuclease de dedo de zinco compreende ainda, pelo menos, um sinal de localização nuclear (NLS). Um NLS é uma sequência de aminoácidos que facilita a segmentação da proteína de nucleases de dedos de zinco no núcleo para introduzir uma ruptura de fita dupla na sequência alvo no cromossoma. Sinais de localização nuclear são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:51015105). Por exemplo, numa modalidade, o NLS pode ser uma sequência monopartite, tais como PKKKRKV (SEQ ID NO: 1) ou PKKKRRV (SEQ ID NO: 2). Numa outra modalidade, o NLS pode ser uma sequência bipartida. Em ainda outra modalidade, o NLS pode ser KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 3). O NLS pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou num sítio interno da proteína.

[0078] Em modalidades adicionais, a nuclease de dedo de zinco pode também compreender pelo menos um domínio de penetração celular. Numa modalidade, o domínio de penetração celular pode ser uma sequência de peptídeo de penetração celular derivada da proteína TAT de HIV-1. Como exemplo, a sequência de penetração celular TAT pode ser GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO: 4). Numa outra modalidade, o domínio de penetração celular pode ser TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; SEQ ID NO: 5), uma sequência de peptídeo de penetração de células derivadas a partir do vírus da hepatite B humana. Em ainda outra modalidade, o domínio de penetração celular pode ser MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; SEQ ID NO: 6 ou GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 7). Numa modalidade adicional, o domínio de penetração celular pode ser Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 8), VP22, um peptídeo penetrador de células do vírus de Herpes simplex, ou uma sequência peptídica de poliarginina. O domínio de penetração celular pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou em um sítio interno da nuclease de dedo de zinco.

[0079] Em ainda outras modalidades, a nuclease de dedo de zinco pode ainda compreender pelo menos um marcador de domínio. Exemplos não limitativos de marcadores incluem domínios de proteínas fluorescentes, etiquetas de purificação, e etiquetas de epítopo. Numa modalidade, o domínio marcador pode ser uma proteína fluorescente. Os exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes adequados incluem proteínas fluorescentes verdes (por exemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Esmeralda, Azami Verde, Azami Verdes Monomérico, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarelas (por exemplo. YFP, EYFP, Citrino, Vênus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), proteínas fluorescentes azuis (por exemplo. EBFP, EBFP2, Azurita, mKalama1, GFPuv, Safira, T-safira), proteínas fluorescentes ciano (por exemplo. ECFP, Cerúleo, CyPet, AmCyan1, Midoriishi- Ciano), proteínas fluorescentes vermelhas (mKate, mKate2, mPlum, monômero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monômero, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) e proteínas fluorescentes laranja (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Kusabira-Orange Monomérico, mTangerine, tdTomato) ou qualquer outra proteína fluorescente adequada. Numa outra modalidade, o domínio marcador pode ser uma etiqueta de purificação e/ou uma etiqueta de epítopo. Marcações adequadas incluem, mas não estão limitadas a glutationa-S-transferase (GST), proteína de quitina de ligação (CBP), proteína de ligação a maltose, a tioredoxina (TRX), poli (NANP), purificação por etiqueta de afinidade em tandem (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, proteína carreadora de biotina carboxila (BCCP), e calmodulina. O domínio marcador pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou num sítio interno da nuclease de dedo de zinco.

[0080] O domínio marcador pode ser ligado à nuclease de dedo de zinco por um peptídeo 2A (Szymczak et al., 2004, Nat. Biotechnol. 589(5):589-94). O peptídeo 2A foi inicialmente caracterizado por vírus de RNA de fita positiva, que produzem uma poliproteína que é "clivada" durante a tradução em proteínas individuais maduras. Mais especificamente, a região do peptídeo 2A (~ 20 aminoácidos) media "clivagem" no seu próprio C-terminal para libertar-se da região a jusante da poliproteína. Em geral, uma sequência de peptídeo 2A termina com uma glicina e um resíduo de prolina. Durante a tradução de um peptídeo 2A, o ribossoma pausa após o resíduo de glicina, resultando na liberação da fita polipeptídica nascente. Tradução retoma, com o resíduo de prolina da sequência de 2A a tornar-se o primeiro aminoácido da proteína a jusante.

(ii) CRISPR/endonucleases Cas

[0081] Em outras modalidades, a endonuclease de segmentação pode ser uma CRISPR/endonuclease Cas. CRISPR/endonucleases Cas são endonucleases guiadas por RNA derivadas de sistemas CRISPR/Cas. As bactérias e archaea têm evoluído de um sistema imune adaptativo baseado em RNA que utiliza CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) e proteínas Cas (associada-CRISPR) para detectar e destruir vírus invasores ou plasmídeos. CRISPR/endonucleases Cas podem ser programadas para apresentar quebras de fita dupla específicas de sítio segmentadas fornecendo guia sintética de RNA segmentada específica do sítio (Jinek et al., 2012, Science, 337:816-821).

[0082] Endonuclease. A CRISPR/endonuclease Cas pode ser derivada a partir de um sistema CRISPR/Cas tipo I, tipo II ou tipo III. Exemplos não limitantes de CRISPR/proteínas Cas adequadas incluemCas3, Cas4, Cas5, Cas5e (ou CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (ou CasA), Cse2 (ou CasB), Cse3 (ou CasE), Cse4 (ou CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, e Cu1966.

[0083] Numa modalidade, o CRISPR/endonuclease Cas é derivado de um sistema CRISPR/Cas tipo II. Em modalidades exemplificativas, o CRISPR/Cas endonuclease é derivado de uma proteína Cas9. A proteína Cas9 pode ser de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, ou Acaryochloris marina. Numa modalidade específica, a proteína Cas9 é de Streptococcus pyogenes.

[0084] Em geral, as proteínas CRISPR/Cas compreendem, pelo menos, um domínio de reconhecimento e/ou de ligação ao RNA. Domínios de reconhecimento de RNA e/ou domínios de ligação a RNA interagem com o RNA guia de modo a que CRISPR/proteína Cas é dirigida a uma sequência cromossômica ou cromossômica específica (isto é, sítio alvo). CRISPR/proteínas Cas podem também compreender domínios de nuclease (por exemplo, domínios DNase ou RNase), domínios de ligação ao DNA, domínios de helicase, domínios de interação proteína-proteína, domínios de dimerização, bem como outros domínios.

[0085] A CRISPR/endonuclease Cas pode ser derivada de uma CRISPR/proteína Cas do tipo selvagem, uma CRISPR/proteína Cas modificada, ou um fragmento de uma CRISPR/proteína Cas do tipo selvagem modificada. A CRISPR/proteína Cas pode ser modificada para aumentar a afinidade e/ou especificidade de ligação do ácido nucleico, alterar uma atividade enzimática, e/ou alterar outra propriedade da proteína. Por exemplo, a nuclease (isto é, DNase, RNase) domínios de CRISPR/proteína Cas podem ser modificados, excluídos ou inativados. A CRISPR/proteína Cas pode ser truncada para remover domínios que não são essenciais para a função da proteína. A CRISPR/proteína Cas podem também ser truncadas ou modificadas para otimizar a atividade da proteína ou um domínio efetor fundido com a CRISPR/proteína Cas.

[0086] Em algumas modalidades, a CRISPR/endonuclease Cas pode ser derivada de uma proteína de tipo selvagem Cas9 ou um fragmento da mesma. Em outras modalidades, a CRISPR/endonuclease Cas pode ser derivada de uma proteína Cas9 modificada. Por exemplo, a sequência de aminoácidos da proteína Cas9 pode ser modificada para alterar uma ou mais propriedades (por exemplo, atividade de nuclease, afinidade, estabilidade, etc.) da proteína. Alternativamente, os domínios da proteína Cas9 não envolvidos na clivagem guiada por RNA podem ser eliminados a partir da proteína de tal modo que a proteína Cas9 modificada é menor do que a proteína do tipo selvagem Cas9.

[0087] Em geral, uma proteína Cas9 compreende pelo menos duas nucleases (isto é, DNase) domínios. Por exemplo, uma proteína Cas9 pode compreender um domínio de nuclease RuvC semelhante e um domínio de nuclease HNH semelhante. Os domínios RuvC e HNH trabalham em conjunto para cortar fitas simples para fazer uma ruptura de fita dupla do DNA (Jinek et al., Science, 337: 816-821). Numa modalidade, a endonuclease com base em CRISPR é derivada de uma proteína Cas9 e compreende dois domínios de função nuclease.

[0088] Os sítios alvo reconhecidos pelos sistemas de ocorrência natural CRISPR/Cas tendo tipicamente comprimentos de cerca de 1415 bp (Cong et al., Science, 339:819-823). O sítio alvo tem nenhuma limitação de sequência, exceto que a sequência complementar a extremidade da guia de RNA (isto é, uma sequência de chamada protoespaçadora) é imediatamente seguida por (3' ou a jusante) uma sequência de consenso. Esta sequência de consenso é também conhecida como um motivo adjacente protoespaçador (ou PAM). Exemplos de PAM incluem, mas não estão limitados a NGG, NGGNG e NNAGAAW (em que n é definido como qualquer nucleotídeo e W é definido como A ou T). No comprimento típico, apenas cerca de 5-7% dos sítios alvo seria única dentro de um genoma alvo, indicando que os efeitos fora do alvo podem ser significativos. O comprimento do sítio alvo pode ser expandido, exigindo dois eventos de ligação. Por exemplo, endonucleases baseadas em CRISPR podem ser modificadas de tal forma que eles só podem clivar uma fita de uma sequência de fita dupla (isto é, convertido a nickases). Assim, a utilização de uma nickase baseada em CRISPR em combinação com dois RNAs de guia diferentes seria essencialmente o dobro do comprimento do sítio alvo, enquanto continua a efetuar uma pausa de fita dupla.

[0089] Em algumas modalidades, portanto, a endonuclease derivada de Cas-9 pode ser modificada para conter apenas um domínio funcional de nuclease (quer um RuvC semelhante ou um domínio de nuclease HNH semelhante). Por exemplo, a proteína derivada de Cas9 pode ser modificada de tal modo que um dos domínios de nuclease é eliminado ou mutado de tal forma que já não é funcional (isto é, o domínio não tem atividade de nuclease). Em algumas modalidades em que um dos domínios de nuclease é inativa, a proteína derivada de Cas9 é capaz de introduzir um entalhe num ácido nucleico de fita dupla (tal proteína é denominada uma "nickase"), mas não clivam o DNA de fita dupla. Por exemplo, uma conversão de aspartato para alanina (D10A) de um domínio semelhante a RuvC converte a proteína derivada de Cas9 para uma nickase "HNH". Da mesma forma, uma conversão de histidina para alanina (H840A) (em alguns casos, a histidina está localizada na posição 839) em um domínio HNH converte a proteína derivada de Cas9 para uma nickase "RuvC". Assim, por exemplo, em uma modalidade da nickase derivada de Cas9 tem uma conversão de aspartato para alanina (D10A) de um domínio semelhante a RuvC. Numa outra modalidade, a nickase derivada de Cas9 tem uma conversão de histidina para alanina (H840A ou H839A) em um domínio HNH. Os domínios de nuclease RuvC semelhantes ou HNH semelhantes da nickase derivada de Cas9 podem ser modificados utilizando métodos bem conhecidos, tais como mutagênese dirigida ao sítio, mutagênese mediada por PCR e síntese total de genes, bem como outros métodos conhecidos na técnica.

[0090] Domínios adicionais. A CRISPR/endonuclease Cas ou nickase compreende geralmente, pelo menos, um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, numa modalidade, o NLS pode ser uma sequência monopartite, tais como PKKKRKV (SEQ ID NO: 1) ou PKKKRRV (SEQ ID NO: 2). Numa outra modalidade, o NLS pode ser uma sequência bipartida. Em ainda outra modalidade, o NLS pode ser KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 3). O NLS pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou num sítio interno da proteína.

[0091] Em algumas modalidades, a CRISPR/endonuclease Cas ou nickase pode ainda compreender pelo menos um domínio de penetração celular. O domínio de penetração celular pode ser uma sequência de peptídeo de penetração celular derivada da proteína TAT HIV-1. Como exemplo, a sequência de penetração celular TAT pode ser GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO: 4). Numa outra modalidade, o domínio de penetração celular pode ser TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; SEQ ID NO: 5), uma sequência de peptídeo de penetração de células derivadas a partir do vírus da hepatite B humana. Em ainda outra modalidade, o domínio de penetração celular pode ser MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; SEQ ID NO: 6 ou GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 7). Numa modalidade adicional, o domínio de penetração celular pode ser Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 8), VP22, um peptídeo penetrador de células do vírus de Herpes simplex, ou uma sequência peptídica de poliarginina. O domínio de penetração celular pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou num sítio interno da proteína.

[0092] Em ainda outras modalidades, a CRISPR/endonuclease Cas ou nickase pode ainda compreender pelo menos um domínio marcador. Exemplos não limitativos de marcadores incluem domínios de proteínas fluorescentes, etiquetas de purificação, e etiquetas de epítopo. Numa modalidade, o domínio marcador pode ser uma proteína fluorescente. Os exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes adequados incluem proteínas fluorescentes verdes (por exemplo, GFP,GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Esmeralda, Azami Verde, Azami Verdes Monomérico, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarelas (por exemplo. YFP, EYFP, Citrino, Vênus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), proteínas fluorescentes azuis (por exemplo. EBFP, EBFP2, Azurita, mKalama1, GFPuv, Safira, T-safira), proteínas fluorescentes ciano (por exemplo. ECFP, Cerúleo, CyPet, AmCyan1, Midoriishi- Ciano), proteínas fluorescentes vermelhas (mKate, mKate2, mPlum, monômero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monômero, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) e proteínas fluorescentes laranja (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Kusabira-Orange Monomérico, mTangerine, tdTomato) ou qualquer outra proteína fluorescente adequada. Numa outra modalidade, o domínio marcador pode ser uma etiqueta de purificação e/ou uma etiqueta de epítopo. Marcações adequadas incluem, mas não estão limitadas a glutationa-S-transferase (GST), proteína de quitina de ligação (CBP), proteína de ligação a maltose, a tioredoxina (TRX), poli (NANP), purificação por etiqueta de afinidade em tandem (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, proteína carreadora de biotina carboxila (BCCP), e calmodulina. O domínio marcador pode estar localizado na extremidade N-terminal, C-terminal ou num sítio interno da proteína. O domínio marcador pode ser ligado ao CRISPR/endonuclease Cas ou nickase por um peptídeo 2A (Szymczak et al., 2004, Nat. Biotechnol. 589(5):589- 94).

[0093] RNA guia. A CRISPR/endonuclease Cas é guiada para o sítio alvo de um RNA guia. Um guia de RNA interage tanto com a CRISPR/endonuclease Cas e o sítio alvo no cromossômico, em que o sítio CRISPR/endonuclease Cas ou nickase cliva, pelo menos, uma fita da sequência de fita dupla. O RNA guia pode ser introduzido para dentro da célula, juntamente com CRISPR/endonuclease Cas ou ácido nucleico que codifica a CRISPR/endonuclease Cas. Alternativamente, o DNA que codifica tanto a CRISPR/endonuclease Cas e o RNA guia pode ser introduzido na célula.

[0094] Um RNA guia compreende três regiões: uma primeira região na extremidade 5' que é complementar à sequência no sítio alvo, uma segunda região interna que forma uma estrutura em ansa pedunculada, e uma terceira região 3' que permanece essencialmente fita simples. A primeira região de cada RNA guia é diferente de tal modo que cada RNA guia orienta uma CRISPR/endonuclease Cas ou nickase a um sítio alvo específico. A segunda e terceira regiões (também denominada região de andaime) de cada RNA guia pode ser a mesma em todos os RNAs guia.

[0095] A primeira região do RNA guia é complementar com a sequência (isto é, sequência protoespaçadora) no sítio alvo, tal que a primeira região do RNA guia pode emparelhar com a sequência no sítio alvo. Em geral, não existem desemparelhamentos entre a sequência da primeira região de RNA guia e a sequência no sítio alvo (ou seja, a complementaridade é total). Em várias modalidades, a primeira região do RNA guia pode compreender desde cerca de 10 nucleotídeos para mais do que cerca de 25 nucleotídeos. Por exemplo, a região de emparelhamento de bases entre a primeira região do RNA guia e o local alvo na sequência cromossômica pode ser de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, ou mais de 25 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades exemplificativas, a primeira região do RNA guia é de cerca de 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento.

[0096] O RNA guia também compreende uma segunda região que forma uma estrutura secundária. Em algumas modalidades, a estrutura secundária compreende uma haste (ou grampo) e um loop. O comprimento do loop e a haste pode variar. Por exemplo, o circuito pode variar de cerca de 3 a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e a haste pode variar desde cerca de 6 a cerca de 20 pares bases de comprimento. A haste pode incluir uma ou mais protuberâncias de 1 a cerca de 10 nucleotídeos. Assim, o comprimento total da segunda zona pode variar de cerca de 16 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento. Numa modalidade exemplificativa, o circuito é de cerca de 4 nucleotídeos de comprimento e a haste compreende cerca de 12 pares bases.

[0097] O RNA guia também compreende uma terceira região na extremidade 3' que permanece essencialmente fita simples. Assim, a terceira zona tem nenhuma complementaridade com qualquer sequência cromossômica na célula de interesse e não tem nenhuma complementaridade com o resto do RNA guia. O comprimento da terceira região pode variar. Em geral, a terceira região é mais do que cerca de 4 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o comprimento da terceira zona pode variar de cerca de 5 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento.

[0098] O comprimento combinado da segunda e terceira regiões (ou andaime) do RNA guia pode variar de cerca de 30 a cerca de 120 nucleotídeos de comprimento. Num aspecto, o comprimento combinado das segunda e terceira regiões do RNA guia é da gama de cerca de 70 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.

[0099] Em algumas modalidades, o RNA guia compreende uma molécula compreendendo todas as três regiões. Em outras modalidades, o RNA pode compreender duas moléculas separadas. A primeira molécula RNA pode compreender a primeira região do RNA guia e uma metade da "haste" da segunda região do RNA guia. A segunda molécula de RNA pode compreender a outra metade da "haste" da segunda região do RNA guia e a terceira região do RNA guia. Assim, nesta modalidade, as primeira e segunda moléculas de RNA de cada um contém uma sequência de nucleotídeos que são complementares uma à outra. Por exemplo, em uma modalidade, a primeira e a segunda moléculas de RNA compreendem uma sequência (de cerca de 6 a cerca de 20 nucleotídeos) que é par de base de outra sequência de modo a formar um RNA guia funcional.

(iii) Outras endonucleases de direcionamento

[00100] Em modalidades adicionais, a endonuclease de direcionamento pode ser uma meganuclease. As meganucleases são endodesoxirribonucleases caracterizadas por sequências de reconhecimento longas, isto é, a sequência de reconhecimento varia geralmente de cerca de 12 pares de base a cerca de 40 pares de base. Como consequência desta exigência, a sequência de reconhecimento ocorre geralmente apenas uma vez em um determinado genoma. Entre as meganucleases, a família de homing endonucleases chamada LAGLIDADG tornou-se uma ferramenta valiosa para o estudo de genomas e engenharia de genoma (vide, por exemplo, Arnould et al., 2011, Protein Eng Des Sel, 24(1-2):27-31). A meganuclease pode ser direcionada para uma sequência cromossômica específica modificando sua sequência de reconhecimento usando técnicas bem conhecidas dos versados na técnica.

[00101] Em modalidades adicionais, a endonuclease de direcionamento pode ser uma nuclease efetora tipo ativadora de transcrição (TALE). TALEs são fatores de transcrição do patógeno vegetal Xanthomonas que podem ser facilmente manipulados para se ligar a novos alvos de DNA. TALEs ou suas versões truncadas podem ser ligadas ao domínio catalítico de endonucleases como FokI para criar a endonuclease de direcionamento chamada nucleases TALE ou TALENS (Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192),

[00102] Ainda em outras modalidades, a endonuclease de direcionamento pode ser uma endonuclease específica de sítio Em particular, a endonuclease específica de sítio pode ser uma endonuclease "de corte raro" cuja sequência de reconhecimento ocorre raramente em um genoma. Alternativamente, a endonuclease específica de sítio pode ser manipulada para clivar um sítio de interesse (Friedhoff et al., 2007, Methods Mol Biol 352:1110123). Geralmente, a sequência de reconhecimento da endonuclease específica de sítio ocorre apenas uma vez em um genoma. Em modalidades adicionais alternativas, a endonuclease de direcionamento pode ser um agente indutor de ruptura de fita dupla de DNA direcionado.

(iv) Polinucleotídeo opcional

[00103] O método para modificação de genoma direcionado pode compreender ainda a introdução na célula de pelo menos um polinucleotídeo que compreende uma sequência com identidade de sequência substancial para sequência em pelo menos um lado do sítio de clivagem direcionado de modo que a ruptura de fita dupla introduzida pela endonuclease de direcionamento possa ser reparada por um processo de reparo orientado por homologia e a sequência de polinucleotídeo seja trocada pela sequência cromossômica endógena modificando, assim, a sequência cromossômica endógena. Por exemplo, o polinucleotídeo compreende uma primeira sequência com identidade de sequências substancial para sequência em um lado do sítio de clivagem direcionado e uma segunda sequência com identidade de sequência substancial para sequência em outro lado do sítio de clivagem direcionado. Alternativamente, o polinucleotídeo compreende uma primeira sequência com identidade de sequência substancial para sequenciar em um lado do sítio de clivagem direcionado e uma segunda sequência com identidade de sequência substancial para uma sequência afastada do sítio de clivagem direcionado. A sequência afastada do sítio de clivagem direcionado pode ser dezenas, centenas ou milhares de nucleotídeos a montante ou a jusante do sítio de clivagem direcionado.

[00104] Os comprimentos da primeira e segunda sequências no polinucleotídeo que têm identidade de sequência substancial para sequências na sequência cromossômico alvo podem e irão variar. Em geral, cada uma das primeiras e segundas sequências no polinucleotídeo tem pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades, as sequências de polinucleotídeo que têm identidade de sequência substancial com sequências cromossômicas podem ter cerca de 15 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos ou mais do que 100 nucleotídeos de comprimento.

[00105] A frase "identidade de sequência substancial" significa que as sequências no polinucleotídeo têm pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência com as sequências cromossômicas de interesse. Em algumas modalidades, as sequências no polinucleotídeo têm pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com as sequências cromossômicas de interesse.

[00106] O comprimento do polinucleotídeo pode e irá variar. Por exemplo, o polinucleotídeo pode variar de cerca de 20 nucleotídeos de comprimento até cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento. Em várias modalidades, o polinucleotídeo varia de cerca de 20 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 100 nucleotídeos para cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 1000 nucleotídeos para cerca de 10.000 nucleotídeos de comprimento, de cerca de 10.000 nucleotídeos para cerca de 100.000 nucleotídeos de comprimento, ou de cerca de 100.000 nucleotídeos para cerca de 200.000 nucleotídeos de comprimento.

[00107] Tipicamente, o polinucleotídeo é o DNA. O DNA pode ser de fita simples ou fita dupla. O polinucleotídeo pode ser um plasmídeo de DNA, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um vetor viral, uma parte linear de DNA, um fragmento PCR, um ácido nucleico livre ou um ácido nucleico complexado com um veículo de distribuição como um lipossoma ou poloxâmero. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é de fita simples. Em modalidades exemplares, o polinucleotídeo é um oligonucleotídeo de fita simples que compreende menos de cerca de 200 nucleotídeos.

[00108] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ainda um marcador. Esse marcador pode permitir a triagem para integrações direcionadas. Em algumas modalidades, o marcador é um sítio de endonuclease de restrição. Em outras modalidades, o marcador é uma proteína fluorescente, uma marcação de purificação ou uma marcação de epítopo. Os exemplos não limitantes de proteínas fluorescentes adequadas incluem proteínas fluorescentes verdes (por exemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Esmeralda, Azami Verde, Azami Verdes Monomérico, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarelas (por exemplo. YFP, EYFP, Citrino, Vênus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), proteínas fluorescentes azuis (por exemplo. EBFP, EBFP2, Azurita, mKalama1, GFPuv, Safira, T-safira), proteínas ciano fluorescentes (por exemplo, ECFP, Cerúleo, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Ciano), proteínas fluorescentes vermelhas (mKate, mKate2, mPlum, monômero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed- Express, DsRed2, DsRed-Monômero, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) e proteínas fluorescentes laranja (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Kusabira- Orange Monomérico, mTangerine, tdTomato) ou qualquer outra proteína fluorescente adequada. Em outras modalidades, o marcador pode ter uma marcação de purificação e/ou marcação de epítopo. Marcações exemplares incluem, mas não estão limitadas a glutationa- S-transferase (GST), proteína de quitina de ligação (CBP), proteína de ligação a maltose, a tioredoxina (TRX), poli (NANP), purificação por etiqueta de afinidade em tandem (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, proteína carreadora de biotina carboxila (BCCP) e calmodulina.

(v) Distribuição para a célula

[00109] O método compreende a introdução de endonuclease de direcionamento na célula de interesse. A endonuclease de direcionamento pode ser introduzida na célula como uma proteína isolada purificada ou um ácido nucleico que codifica a endonuclease de direcionamento. O ácido nucleico pode ser DNA ou RNA. Nas modalidades em que a codificação do ácido nucleico é mRNA, o mRNA pode ser 5' capeados e/ou 3' poliadenilada. Nas modalidades em que o ácido nucleico de codificação é o DNA, o DNA pode ser linear ou circular. O DNA pode ser parte de um vetor, em que o DNA de codificação, pode ser, opcionalmente, ligado operativamente a um promotor adequado. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com vetores, promotores, outros elementos de controle apropriados e meios de introduzir o vector na célula de interesse.

[00110] As moléculas de endonuclease de direcionamento e os polinucleotídeos opcionais descritos acima podem ser introduzidos na célula de diversas maneiras. A distribuição adequada significa inclui microinjeção, eletroporação, sonoporação, biolística, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção catiônica, transfecção em lipossomas, transfecção dendrímeros, transfecção de choque do calor, transfecção de nucleofecção, magnetofecção, lipofecção, impalefecção, transfecção óptica, absorção reforçada do agente de propriedade dos ácidos nucleicos e entrega através de lipossomas, imunolipossomas, virossomas ou vírions artificiais. Em uma modalidade específica, as moléculas de endonuclease de direcionamento e polinucleotídeos opcionais são introduzidos em uma célula por nucleofecção.

[00111] Nas modalidades em que mais do que uma molécula de endonuclease alvo e mais do que um polinucleotídeo são introduzidos em uma célula, as moléculas podem ser introduzidas simultânea ou sequencialmente. Por exemplo, as moléculas de endonuclease de direcionamento, específicas para um sítio de clivagem direcionado (e polinucleotídeos opcionais) podem ser introduzidas ao mesmo tempo. Alternativamente, cada molécula de endonuclease de direcionamento, bem como de polinucleotídeos opcionais, podem ser introduzidas em sequência.

[00112] A razão entre moléculas de endonuclease de direcionamento e polinucleotídeos pode e irá variar. Em geral, a razão entre as moléculas de endonuclease de direcionamento e os polinucleotídeos varia de cerca de 1:10 a cerca de 10:1. Em várias modalidades, a razão entre as moléculas de endonuclease alvo e os polinucleotídeos pode ser de cerca de 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou 10:1. Em uma modalidade, a razão é cerca de 1:1.

(vi) Cultura da célula

[00113] O método compreende ainda a manutenção da célula em condições apropriadas de modo que a ruptura de fita dupla introduzida pela endonuclease de direcionamento pode ser reparada por (i) um processo de reparo de união de extremidade não homóloga de modo que a sequência cromossômica seja modificado pela deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo ou, opcionalmente, (ii) um processo de reparo orientado por homologia de modo que a sequência cromossômica seja trocada pela sequência do polinucleotídeo de modo que a sequência cromossômica seja modificada. Nas modalidades em que os ácidos nucleicos que codificam as endonucleases de direcionamento na célula sejam introduzidos na célula, o método compreende a manutenção da célula em condições apropriadas de modo que a célula expresse as endonucleases de direcionamento.

[00114] Em geral, a célula é mantida em condições apropriadas para o crescimento e/ou manutenção das células. As condições de cultura de células adequadas são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; e Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. Aqueles versados na técnica apreciarão que os métodos para a cultura de células são conhecidos na técnica e irão variar dependendo do tipo de célula. A otimização de rotina pode ser usada, em todos os casos, para determinar as melhores técnicas para um tipo de célula particular.

[00115] Durante esta etapa do processo, as endonucleases de direcionamento reconhecem, ligam e criam uma ruptura de fita dupla nos sítios de clivagem direcionados na sequência cromossômica e, durante o reparo das rupturas de fita dupla, uma deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo é introduzida na sequência cromossômica direcionada. Em modalidades específicas, a sequência cromossômica direcionada é inativada.

[00116] Após a confirmação de que a sequência cromossômica de interesse foi modificada, os clones de células individuais podem ser isolados e genotipados (através de sequenciamento de DNA e/ou análises de proteína). As células que compreendem uma sequência cromossômica modificada podem ser submetidas a um ou mais ciclos adicionais de modificação genômica direcionada para modificar sequências cromossômicas adicionais (por exemplo, vide Exemplo 1). (b) RNA interferente

[00117] Em outra modalidade, a linhagem de células resistentes a vírus pode ser preparada usando um agente do RNA interferente (RNAi) que inibe a expressão de um mRNA alvo ou transcrito. O agente de RNAi pode levar à clivagem do mRNA alvo ou transcrito. Alternativamente, o agente de RNAi pode impedir ou interromper a tradução do mRNA alvo na proteína.

[00118] Em algumas modalidades, o agente de RNAi pode ser um RNA interferente curto (siRNA). Em geral, um siRNA compreende uma molécula de RNA de fita dupla que varia de cerca de 15 a cerca de 29 nucleotídeos de comprimento. O siRNA pode ter cerca de 16-18, 17-19, 21 -23, 24-27 ou 27-29 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidade específica, o siRNA tem cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, o siRNA pode compreender ainda uma ou duas alças de fita simples, por exemplo, uma alça 3' em uma ou ambas as extremidades. O siRNA pode ser formado a partir de duas moléculas de RNA que hibridizam juntas ou, alternativamente, podem ser geradas a partir de um RNA hairpin curto (shRNA) (vide abaixo). Em algumas modalidades, as duas fitas do siRNA são totalmente complementares, de modo que não haja nenhuma incompatibilidade ou protuberância no duplex formado entre as duas sequências. Em outras modalidades, as duas fitas do siRNA são substancialmente complementares, de modo que uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias podem existir no duplex formado entre as duas sequências. Em determinadas modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' do siRNA têm um grupo fosfato, enquanto que em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' não têm um grupo fosfato. Em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 3' do siRNA têm um grupo hidroxila, enquanto que em outras modalidades, uma ou ambas as extremidades 5' não têm um grupo hidroxila.

[00119] Uma fita do siRNA, que é referida como "fita antissenso" ou "fita guia" inclui uma porção que hibrida com o transcrito alvo. Em determinadas modalidades, a fita antissenso do siRNA é totalmente complementar a uma região do transcrito alvo, isto é, ela se hibridiza no transcrito alvo sem uma única incompatibilidade ou protuberância em uma região alvo entre cerca de 15 e cerca de 29 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente, pelo menos 16 nucleotídeos de comprimento e, mais preferencialmente, cerca de 18-20 nucleotídeos de comprimento. Em outras modalidades, a fita antissenso é substancialmente complementar à região alvo, isto é, uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias podem existir no duplex formado pela fita antissenso e o transcrito alvo. Normalmente, os siRNAs são direcionados para as sequências exônicas dos transcritos alvo. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com programas, algoritmos e/ou serviços comerciais que concebem siRNAs para transcritos alvo. Um exemplo exemplar é o Rosetta siRNA Design Algorithm (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA) and MISSION® siRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). O siRNA pode ser sintetizado enzimaticamente in vitro usando métodos conhecidos para aqueles versados na técnica. Alternativamente, o siRNA pode ser quimicamente sintetizado usando técnicas de síntese do oligonucleotídeo que são bem conhecidas na técnica.

[00120] Em outras modalidades, o agente de RNAi pode ser um RNA hairpin curto (shRNA). Em geral, um shRNA é uma molécula de RNA que compreende pelo menos duas porções complementares que são hibridadas ou são capazes de hibridizar para formar uma estrutura de fita dupla com comprimento suficiente para mediar a interferência por RNA (conforme descrito acima) e pelo menos uma porção de fita simples que forma uma alça que liga as regiões do shRNA que formam o dúplex. A estrutura também é chamada de estrutura haste-alça sendo a haste a parte do dúplex. Em algumas modalidades, a porção do dúplex da estrutura é totalmente complementar, de modo que que não haja incompatibilidade nem protuberância na região de dúplex do shRNA. Em outras modalidades, a porção do dúplex da estrutura é substancialmente complementar, de modo que uma ou mais incompatibilidades e/ou protuberâncias existem na porção do dúplex do shRNA. A alça da estrutura pode ter cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente, cerca de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento e, mais preferencialmente, cerca de 6 a cerca de 9 nucleotídeos de comprimento. A alça pode estar localizada na extremidade 5' ou 3' da região que é complementar ao transcrito alvo (ou seja, na porção antissenso do shRNA).

[00121] O shRNA pode compreender ainda uma alça na extremidade 5' ou 3'. A alça opcional pode ter cerca de 1 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento ou, mais preferencialmente, de cerca de 2 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a alça compreende um ou mais resíduos de U, por exemplo, entre cerca de 1 e cerca de 5 resíduos de U. Em algumas modalidades, extremidade 5' do shRNA tem um grupo fosfato, enquanto que em outras modalidades ela não tem. Em outras modalidades, a extremidade 3' do shRNA tem um grupo hidroxila, enquanto que em outras modalidades ela não tem. Em geral, shRNAs são processados em siRNAs pela maquinaria celular conservada de siRNAs. Assim, shRNAs são precursores de siRNAs e são igualmente capazes de inibir a expressão de um transcrito alvo que é complementar a uma porção do shRNA (ou seja, porção antissenso do shRNA). Aqueles versados na técnica estão familiarizados com os recursos disponíveis (conforme detalhado acima) para a concepção e síntese de shRNAs.

[00122] Ainda em outras modalidades, o agente de RNAi pode ser um vetor de expressão de RNAi. Normalmente, um vetor de expressão de RNAi é usado para síntese intracelular (in vivo) dos agentes de RNAi, como siRNAs ou shRNAs. Em uma modalidade, duas fitas complementares de siRNA separadas, são transcritas usando um único vetor contendo dois promotores, cada qual direciona a transcrição de uma fita simples de siRNA (isto é, cada promotor é operativamente ligado a um modelo para o siRNA para que a transcrição possa ocorrer). Os dois promotores podem estar a mesma orientação, caso em que cada um está operativamente ligado a um modelo para uma das fitas de siRNA complementar. Alternativamente, os dois promotores podem estar em orientações opostas, flanqueando um modelo único de modo a que a transcrição dos promotores resulte na síntese de duas fitas de siRNA complementares. Em outra modalidade, o vetor de expressão de RNAi pode conter um promotor que conduz a transcrição de uma molécula única de RNA compreendendo duas regiões complementares, de modo que o transcrito forme um shRNA.

[00123] Aqueles versados na técnica apreciarão que isso é preferencial que agentes de siRNA e shRNA sejam produzidos in vivo através da transcrição de mais de uma unidade de transcrição. De um modo geral, os promotores utilizados para direcionar uma expressão in vivo direta de uma ou mais unidades de transcrição de siRNA ou shRNA podem ser promotores para RNA polimerase III (Pol III). Certos promotores Pol III, como promotores U6 ou H1, não requerem elementos reguladores de ação cis na região transcrita e, assim, são preferenciais em certas modalidades. Em outras modalidades, os promotores para Pol II podem ser usados para conduzir a expressão de uma ou mais unidades de transcrição de siRNA ou shRNA. Em algumas modalidades, podem ser usados promotores específicos de tecidos, específicos de célula ou induzíveis por Pol II.

[00124] Uma construção que fornece um modelo para a síntese de siRNA ou shRNA pode ser produzido usando métodos de DNA recombinante padrão e pode ser inserido em qualquer variedade ampla de vetores diferentes adequados para expressão em células eucarióticas. As técnicas de DNA recombinante estão descritas em Ausubel et al, 2003, supra e Sambrook & Russell, 2001, supra. Aqueles versados na técnica também apreciam que os vetores podem compreender sequências reguladoras adicionais (por exemplo, sequência de terminação, sequência de controle de tradução, etc.), bem como sequências de marcador bem selecionável. Os plasmídeos de DNA são conhecidos na técnica, incluindo os baseados em pBR322, PUC e assim por diante. Já que muitos vetores de expressão já contêm um promotor ou promotores apropriados, eles podem ser apenas necessários para inserir a sequência de ácido nucleico que codifica o agente de RNAi de interesse em um local apropriado em relação aos promotores. Os vetores virais também podem ser usados para fornecer uma expressão intracelular de agentes de RNAi. Os vetores virais adequados incluem vetores retrovirais, vetores de lentivírus, vetores de adenovírus, vetores de vírus adenoassociados, vetores do vírus de herpes e assim por diante. Em uma modalidade específica, o vetor de expressão de RNAi é um vetor com base lentiviral de shRNA ou partícula lentiviral, como o fornecido nos produtos de shRNA MISSION® TRC (Sigma-Aldrich).

[00125] Os agentes de RNAi ou os vetores de expressão de RNAi podem ser introduzidos na célula usando métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. Essas técnicas são descritas em Ausubel et al., 2003, supra ou Sambrook & Russell, 2001, supra, por exemplo. Em certas modalidades, o vetor de expressão de RNAi, por exemplo, um vetor viral, está estavelmente integrado ao genoma da célula, de modo que a expressão de Mgat1 seja interrompida ao longo das gerações de célula subsequentes.

(c) recombinação específica de sítio

[00126] Em modalidades alternativas, as linhagens de células de resistência viral podem ser preparadas usando técnicas de recombinação específicas de sítio. Por exemplo, as técnicas de recombinação específicas de sítio podem ser usadas para excluir toda ou parte de uma sequência cromossômica de interesse ou introduzir polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na sequência cromossômica de interesse. Em uma modalidade, a sequência cromossômica de interesse é direcionada usando um sistema de recombinação específico de sítio Cre-loxP, um sistema de recombinação específico de sítio Flp-FRT ou suas variantes. Esses sistemas de recombinação estão comercialmente disponíveis e o ensinamento adicional para estas técnicas é encontrado em Ausubel et al., 2003, supra, por exemplo.

DEFINIÇÕES

[00127] A não ser que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o significado que normalmente é entendido por uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta invenção. As referências seguintes fornecem a um indivíduo versado na técnica com uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como usado aqui, os seguintes termos têm o significado atribuído a eles menos que especificado de outra forma.

[00128] Quando a introdução de elementos de divulgação presente ou as modalidades preferidas dos mesmos, os artigos "um", "uma", "o" e "referido" destinam-se a dizer que existe um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais que não sejam os elementos listados.

[00129] Como usado neste documento, "deficiente" se refere a níveis reduzidos ou não detectáveis de proteínas ou enzimas direcionadas ou atividade reduzida ou não detectável de enzimas ou proteínas direcionadas.

[00130] Como usado neste documento, o termo "sequência endógena" refere-se a uma sequência cromossômica que é nativa para a célula.

[00131] O termo "sequência exógena" se refere a uma sequência cromossômica que não é nativa para a célula ou a uma sequência cromossômica que é deslocada para um local cromossômico diferente.

[00132] Uma célula "geneticamente modificada" se refere a uma célula em que o genoma foi modificado, isto é, a célula contém pelo menos uma sequência cromossômica que foi manipulada para conter uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, uma deleção de pelo menos um nucleotídeo e/ou uma substituição de pelo menos um nucleotídeo.

[00133] Os termos "modificação genômica" e "edição genômica" se refere a processos através dos quais uma sequência cromossômica específica é alterada de modo que a sequência cromossômica seja modificada. A sequência cromossômica pode ser modificada para compreender uma inserção pelo menos um nucleotídeo, uma exclusão pelo menos um nucleotídeo, e/ou a substituição de pelo menos um nucleotídeo. A sequência cromossômica modificada está inativa de modo que nenhum produto seja produzido. Alternativamente, a sequência cromossômica pode ser modificada de modo que seja produzido um produto alterado.

[00134] Um "gene", como usado neste documento, se refere a uma região de DNA (incluindo éxons e íntrons) que codifica um produto de gene, bem como todas as regiões de DNA que regulam a produção do produto do gene, sendo essas sequências reguladoras adjacentes ou não às sequências codificantes e/ou transcritas. Nesse sentido, um gene inclui, mas não está necessariamente limitado a sequências de promotor, terminadores, sequências reguladoras traducionais, tais como sítios de ligação de ribossoma e sítios de entrada interna de ribossoma, potenciadores, silenciadores, isolantes, elementos delimitantes, origens de replicação, sítios de ligação de matriz e regiões de controle de lócus.

[00135] O termo "heteróloga" refere-se a uma entidade que não é nativa para a célula ou a espécie de interesse.

[00136] Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" se referem a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular. Para efeitos da presente divulgação, estes termos não devem ser interpretados como limitantes no que diz respeito ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modificados nas frações de base, açúcar e/ou fosfato. Em geral, um análogo de nucleotídeo específico tem a mesma especificidade pareante de base; ou seja, um análogo de A será um par de base com T. Os nucleotídeos de um ácido nucleico ou polinucleotídeo podem ser ligados por ligações fosfodiéster, fosforotioato, fosforamidite, fosforodiamidato ou suas combinações.

[00137] O termo "nucleotídeo" se refere a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser nucleotídeos padrões (ou seja, adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina) ou análogos de nucleotídeo. Um análogo de nucleotídeo refere-se a um nucleotídeo tendo uma purina modificada ou base de pirimidina ou uma fração de ribose modificados. Um análogo nucleotídeo pode ser um nucleotídeo que ocorre naturalmente (por exemplo, inosina) ou um nucleotídeo que ocorre não naturalmente. Exemplos não limitantes de modificações sobre as frações de açúcar ou a base de um nucleotídeo incluem a adição (ou remoção) de grupos acetil, grupos aminoácidos, grupos carboxila, grupos carboximetil, grupos hidroxila, grupos metil, fosforilo grupos e grupos tiol, bem como a substituição dos átomos de carbono e nitrogênio das bases com outros átomos (por exemplo, purinas 7- deaza). Os análogos de nucleotídeo também incluem nucleotídeos dideoxy, 2'-O-metil nucleotídeos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) e morfolinos.

[00138] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.

[00139] Como usado neste documento, os termos "sítio alvo" ou "sequência alvo" se referem a uma sequência de ácido nucleico que define uma porção de uma sequência cromossômica a ser modificada ou editada e em relação à qual uma endonuclease de direcionamento é manipulada para reconhecer e ligar, desde que existam condições suficientes para a ligação.

[00140] Os termos "a montante" e "a jusante" referem-se aos locais em uma sequência do ácido nucleico em relação a uma posição fixa. A montante refere-se à região que é 5' (ou seja, perto da extremidade 5' da fita) para a posição e a jusante, refere-se à região que é 3' (ou seja, no final 3' da fita) para a posição.

[00141] Tal como usado neste documento, "resistência viral" se refere à capacidade de as células resistirem à infecção viral. Mais especificamente, a entrada do vírus e/ou propagação do vírus é reduzida ou eliminada nas linhagens de células manipuladas aqui divulgadas em comparação com as linhagens de células parental não modificadas.

[00142] As técnicas para a determinação de identidade da sequência dos ácidos nucleicos e aminoácidos são conhecidos na técnica. Tais técnicas incluem, tipicamente, a determinação da sequência no nucleotídeo do mRNA de um gene e/ou determinar a sequência dos aminoácidos codificados assim, e comparando estas sequências para uma segunda sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos. Sequências genômicas também podem ser determinadas e comparadas desta forma. Em geral, "identidade" refere-se a uma exata correspondência nucleotídeo-a-nucleotídeo ou aminoácido-a-aminoácido de duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídios, respectivamente. Duas ou mais sequências (polinucleotídeos ou aminoácidos) podem ser comparados pela determinação da percentagem da identidade. A identidade da porcentagem das duas sequências, se as sequências dos ácidos nucleicos ou aminoácidos, é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas divididas pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicada por 100. Um alinhamento aproximado para sequências dos ácidos nucleicos é fornecido pelo algoritmo local homologia de Smith and Waterman, Advances em Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Esse algoritmo pode ser aplicado a sequências de aminoácidos usando a matriz de Pontuação desenvolvida porDayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EUA, e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Uma implementação exemplar desse algoritmo para determinar a porcentagem da identidade de uma sequência é fornecida pelo Genetics Computer Group (Madison, Wis.) no pedido de utilidade "BestFit". Outros programas apropriados para o cálculo da porcentagem da identidade ou similaridade entre as sequências geralmente são conhecidos na técnica, por exemplo, outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser utilizados utilizando os seguintes parâmetros padrão: código genético=padrão; filtro=nenhum; fita=ambos; corte=60; esperar=10; Matriz=BLOSUM62; Descrições=50 sequências; classificar por=PONTUAÇÃO ELEVADA; Bancos de dados=não redundante, traduções do GenBank+EMBL+DDBJ+APO+GenBank CDS+SwissProtein+SPupdate+PIR. Detalhes destes programas podem ser encontrados no site do GenBank. No que diz respeito a sequências aqui descritas, o intervalo dos graus desejados da identidade de sequência é aproximadamente 80% a 100% e qualquer valor inteiro entre estes. Tipicamente as porcentagens das identidades entre as sequências são pelo menos 70-75%, de preferência 80-82%, mais de preferência 85-90%, até mais de preferência 92%, ainda mais de preferência 95% e preferencialmente mais de 98% de identidade da sequência.

[00143] Como várias alterações podem ser feitas nas células e métodos acima descritos sem partir do âmbito da invenção, pretende- se que toda a matéria contida na descrição acima e nos exemplos abaixo, devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante.

EXEMPLOS

[00144] Os exemplos a seguir ilustram alguns aspectos da invenção. Exemplo 1: Preparação de Linhagens de células CHO Modificadas por Gene Direcionado

[00145] As técnicas de modificação de gene mediada por ZFN foram empregadas para inativar (ou seja, sofrer nocaute) genes que codificam enzimas ou proteínas envolvidas em reações de N- ou O- glicosilação. Em geral, os pares dos sítios de direcionamento de ZFNs na região de codificação dos genes de interesse foram concebidos usando um algoritmo proprietário. |||UNTRANSLATED_CONTENT_START|||ZFN expression constructs were prepared using standard procedures and ZFN mRNA was produced from ZFN plasmid DNA as described in COMPOZr® Knockout Zinc Finger Nuclease (ZFN) (Sigma-Aldrich) product information using in vitro transcription, mRNA poly-adenylation, and capping methods.|||UNTRANSLATED_CONTENT_END||| Resumidamente, o DNA do plasmídeo ZFN foi linearizado e purificado usando a extração de DNA de fenol/clorofórmio. Kit MessageMax™ T7 ARCA-Capped Message Transcription (Cell Script Inc.) foi usado para revestir DNA linearizado. Um Kit de Rejeitos do Polymerase de poli(A) (epicentro) foi usado para adicionar uma cauda poli(A). O mRNA ZFN foi purificado usando o kit de MEGAclear™ (Ambion). As células parentais foram mantidas como culturas em suspensão no meio de Fusão EX-CELL® CHO CD (Sigma- Aldrich). As células foram semeadas em 0,5 x 106 células/mL em tubos de biorreator um dia antes para a transfecção. Tipicamente, cada transfecção continha 1 x 106 células em meio de crescimento de 150 μL e 5 μg de DNA ou mRNA. Transfecções foram conduzidas por eletroporação em 140 V e cubetas de 950 μg em 0,2 cm. As células eletroporadas foram colocadas em 2 ml_ meios de crescimento em uma cultura de estática de placa de 6 poços.

[00146] Nos dias 3 e 10 da pós-transfecção, as células foram retiradas de cultura e o DNA genômico foi isolado usando GeneEluteTM Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich). A clivagem induzida por ZFN foi verificada usando um ensaio de nuclease Cel-1, conforme descrito nas informações do produto ZFN Nocaute CompoZr® . Este ensaio é realizado para determinar a eficiência da mutação do gene mediada por ZFN, conforme descrito anteriormente (Miller et al., Nat. Biotechnol. 2007, 25:778-785). O ensaio detecta alelos do locus direcionado que se afastam do tipo selvagem como um resultado do reparo imperfeito mediado pela união da extremidade não homóloga (NHEJ) de rupturas de fita dupla de DNA induzido por ZFN. A amplificação por PCR da região direcionada a partir de um agrupamento de células tratadas com ZFN gera uma mistura de tipo selvagem (WT) e amplicons mutantes. A fusão e recombinação desta mistura resulta em incompatibilidades formadas entre heteroduplexes de WT e alelos mutantes. Uma "bolha" de DNA formada no sítio de desemparelhamento é clivada por nuclease Cel-1 surveyor e os produtos de clivagem podem ser resolvidos por eletroforese em gel.

[00147] Após a confirmação da atividade de ZFN, as células transfectadas por ZFN foram clonadas por célula única usando diluição limitante. Para isso, as células foram plaqueadas em uma densidade aproximada de cerca de 0,5 célula/poço usando uma mistura de 80% de meio de clonagem sem soro CHO, meios condicionados a 20%, e 4 mM de L-glutamina. A clonalidade e crescimento foram verificados microscopicamente no dia 7 e no dia 14 após plaqueamento, respectivamente. Os clones com crescimento foram expandidos e genotipados por PCR e sequenciamento de DNA.

[00148] Linhagem de células Mgati KO. Mgatl adiciona GlnNac à estrutura de glicano N-ligado de Man5GlcNAc2 como parte da síntese de N-glicano complexo. Um par de ZFNs foi concebido para direcionar 5’- AACAAGTTCAAGTTCccagcaGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3’ (SEQ ID NO: 9; sítios de ligação de ZFN no caso superior e sítio de clivagem no caso inferior) no gene CHO Mgat1. A linhagem de células parental foi CHOK1 (GS - / -) (Sigma Aldrich) na qual a glutamato sintetase foi sofreu nocaute. Esta linhagem de células parental produz tipo estruturas do tipo N- O-glicano. As linhagens de células CHOK1 (GS -/-) foram transfectada com Mgat1 ZFN DNA essencialmente como detalhado acima. Um ensaio de Cel-1 confirmou a presença de dois fragmentos de clivagem, 220 e 197 bp, nos dias 3 e 10 após transfecção, indicando atividade de ZFN. Os clones de uma célula única foram identificados com deleções que variam de 2 a 55 bp em um alelo (um segundo alelo não foi detectado). Esta linhagem de células produz estruturas ligadas a N que terminam com cinco resíduos de manose (isto é, glicoformas Man5NeuAc2) e estruturas de O glicano de tipo selvagem.

[00149] Linhagem de células COSMC KO. A segunda etapa biossintética mais comum na O-glicosilação é o alongamento da core- 1. O alongamento da core-1 é catalisado por uma enzima única C1GalT1 (também conhecida como T-sintase) que necessita uma chaperona dedicada, COSMC, para funcionar. COSMC é uma proteína ER que parece se ligar especificamente a T-sintase e garantir a sua atividade plena no Golgi. Para interromper o gene COSMC, as células CHOK1 (GS -/-) foram transfectadas com DNA ou RNA que codifica ZFNs concebidos para direcionar sequência 5’- GCCTTCTCAGTGTTCCGGA aaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3’ (SEQ ID NO: 10) no gene CHO COSMC. Um ensaio de Cel-1 nuclease confirmou a presença de três fragmentos de clivagem (isto é, 318, 184, 134 pb) nas células transfectadas por ZFN. Um clone de célula única foi isolado o qual tinha uma deleção de 4 bp em um alelo de COSMC (um segundo alelo não foi detectado). A linhagem de células produz estruturas de O-glicano truncado (ou seja, imaturo) estruturas e N- glicanos de tipo selvagem.

[00150] Linhagem de células COSMC/Mgat3 KO. Um par de ZFNs foi concebido para direcionar 5’-TTCCTGGACCACTTCCCA cccggtGGCCGGCAGGATGGC-3’ (SEQ ID NO: 11) na região de codificação de Mgat3. A linhagem de células COSMC KO, detalhada acima, foi transfectada com DNA zfn como detalhado acima. Após a confirmação de clivagem DE ZFN, os clones de células individuais foram isolados. O sequenciamento revelou que os clones mutantes tinham 9, 10, 11 ou 41 bp de deleções no gene Mgat3. Esta linhagem celular de tipo selvagem produz N-glicanos e O-glicanos truncados (isto é, é similar à linhagem de células parental).

[00151] Linhagem de células COSMC/Mgat3/Mgat5 KO. A linhagem de células COSMC/Mgat3, conforme detalhado acima, foi transfectada com DNA de plasmídeo que codifica ZFNs concebidos para direcionar 5’- TTCTGCACTTCACCATCCAgcagcgGACTCAGCCTGAGAGCAGCT-3’ (SEQ ID NO: 12) na região de codificação de Mgat5. Um clone de célula individual foi isolado o qual tinha uma deleção de 129 bp no gene Mgat5 . Esta linhagem de células produz N-glicanos com menos ramificação lateral e O-glicanos truncados.

Exemplo 2: Testes de Infecções Virais e Resistência Viral

[00152] As linhagens de células CHO descritas acima foram cultivadas e testadas quanto à sua capacidade de suportar ou resistir à infecção após o desafio com o protótipo do vírus MVM (cepa MVMp). Resumidamente, as células foram cultivadas em meios apropriados e o vírus MVMp foi adicionado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 ou 10, e células infectadas foram incubadas por um período adicional de 24, 48 ou 72 horas antes do ensaio. Como controles foram cultivadas células e incubadas sem vírus. As células não infectadas também foram tratadas com a enzima neuraminidase para remover ácidos siálicos terminais de glicanos de superfície (ambos ligados a N e O) e, subsequentemente, foram infectadas nos MOIs indicados.

[00153] As células infectadas e não infectadas foram examinadas visualmente quanto à presença de efeito citopático (CPE) e nos pontos de tempo indicados, as células foram colhidas por centrifugação. A infecciosidade do DNA viral e a produção foram triadas usando análise Southern blot no DNA genômico total e análises de Western immunoblot usando um anticorpo de proteína antiviral. Para a análise de Southern, os sedimentos celulares das amostras em duplicado tomadas a 24 horas foram colhidos e o DNA genômico total foi isolado. O DNA foi quantificado via espectroscopia de Nanodrop e as amostras foram normalizadas para assegurar o carregamento igual em gel de agarose para fracionamento do tamanho. O DNA fracionado por tamanho foi transferido para membranas carregadas (Southern blotting) e a membrana foi sondada para a síntese de DNA viral usando uma sonda de DNA viral marcada por 32P. A quantificação das bandas de DNA de fita dupla viral marcado por 32P específico foi obtida pela imagiologia de fósforo e os valores relativos são apresentados na Tabela 1.

[00154] Para a análise Western, os sedimentos celulares colhidos a 24 horas foram lisados em tampões de SDS e as proteínas foram separadas usando SDS-PAGE. Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, foram bloqueadas e foram submetidas a imunoblotting (imunoensaio Western) para a presença da proteína NS1 viral usando um anticorpo anti-NS1. O nível de proteína viral detectado via Western blotting está indicado na Tabela 2.

[00155] Quando infectada com a cepa do vírus MVMp, a linhagem de células parental CHOK1 (GS -/-) (isto é, com estruturas de glicano de tipo selvagem) mostrou infecciosidade clássico e produção de DNA viral e síntese de proteína como esperado. O DNA viral e os produtos de proteína viral ficaram evidentes 24 horas após infecção quando as células foram infectadas em cada MOI. A produção forte de produtos virais também foi observada nos últimos pontos de tempo. As células não infectadas de tipo selvagem não mostraram nenhuma evidência de infecção, como esperado, independentemente dos pontos de tempo.

[00156] Quando as células do tipo selvagem foram tratadas com a enzima neuraminidase (NA) para retirar o ácido siálico da superfície celular e as células foram subsequentemente infectadas com MVMp, foi observada também uma redução na produção de vírus (indicando a redução da infecção) (variando de 5,32 vezes no MOI=10 para 7,34 vezes no MOI=1). Enquanto as células tratadas com NA mostraram ainda ligeira sensibilidade à infecção, é sabido que as células CHO regeneram rapidamente estruturas ácido siálico (AS) após esse tratamento. Portanto, o baixo nível de infecção foi observado pode ser proveniente de células que regeneraram glicanos de AS terminal fornecendo, assim, uma entrada para o vírus.

[00157] A infecção viral de células Mgat1 KO nas quais o gene Mgat1 CHO foi inativado e nenhuma enzima Mgat1 foi produzida, resultou em apenas uma ligeira resistência (por exemplo, redução de 2,1 a 2,7 vezes, conforme medido por imagiologia de blots de fósforo) à infecção viral. Uma vez que esta linhagem de células tem N-glicanos truncados, estes resultados sugerem que os receptores de N-glicano de ordem superior que têm 2-3 ácidos siálicos ligados podem desempenhar apenas uma função secundária na ligação do capsídeo viral inicial e na entrada viral na célula.

[00158] Quando as células COSMC KO foram infectadas com vírus MVMp, esta linhagem de células apresentou uma resistência significativa à infecção viral. O aumento da resistência (em comparação à linhagem de células de tipo selvagem) variou de 5,5 vezes (MOI=10) a 190 vezes (MOI=1). O nocaute do gene adicional que direcionou o gene Mgat3 (presume-se ser um pseudogene em células CHO) e o gene Mgat5 (responsável pela ramificação ligada a N de ordem superior) teve resultados semelhantes. A análise de Western blot teve resultados semelhantes, indicando que a resistência viral ocorre quando as estruturas O-glicano foram truncadas. Estes estudos revelaram que a a ruptura dos receptores de ácido siálico reduziu drasticamente a ligação de MVM e/ou sua entrada nas células.

Exemplo 3: Geração de Linhagens de célulasCOSMC KO e Slc35A1 Linhagens celulares KO Adicionais

[00159] Novos clones da linhagem de células COSMC KO foram gerados como descrito acima no Exemplo 1 usando células CHOK1 (GS -/-) e um par de ZFNs concebidos para direcionar sequência 5’- GCCTTCTCAGTGTTCCGG AaaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3’ (SEQ ID NO: 10) no éxon 2 do gene CHO COSMC. Um ensaio de Cel- 1 nuclease confirmou a presença de três fragmentos de clivagem (isto é, 318, 184, 134 pb) nas células transfectadas por ZFN. Cinco clones celulares individuais foram isolados e a sequenciamento revelou deleções de 1 a 12 bp, como mostrado abaixo.

[00160] O clone F07 foi modificado ainda para expressar uma IgG humana, usando procedimentos padrão. Dos muitos clones identificados, dois clones produtores de IgG foram isoladas (e identificados como 71H1, 71C3) por testes adicionais (vide abaixo).

[00161] O gene Slc35A1 que codifica para um transportador de açúcar de nucleotídeo (transportador de ácido CMP-siálico) sofreu nocaute nas células CHOK1 (GS-/-) usando ZFNs concebidos para direcionar 5’-AGCTTATACCGTAGCTTT aagataCACAAGGACAACAGCTAAA-3’ (SEQ ID NO: 13) ou ZFNs concebidos para direcionar 5'- TTCAAGCTATACTGCTTGGCAGTGATGACTCTGGTGGCT-3' (SEQ ID NO: 17) no éxon 1 do gene CHO Slc35A1 gene. Um ensaio de Cel-1 nuclease confirmou a presença de dois fragmentos de clivagem nas células transfectadas por ZFN. Um clone de célula individual (B12) foi isolado e o sequenciamento revelou uma deleção 1 bp em torno do sítio de ligação de ZFN. A linhagem de células Slc35A1 KO forma estruturas de glicano N e O-ligadas sem ácido siálico terminal.

[00162] A coloração com lectina biotinilada de Maackia amurensis II (MALII; 20 μg/mL) e estreptavidina marcada com Alexa Fluor 647 (5 μg/mL) revelou coloração significativamente reduzida no clone F07 COSMC KO, clone G03 COSMC KO e linhagens de células Slc35A1 KO em comparação com a linhagem de células parental (indicando a ausência de resíduos terminais de ácido siálico terminal nas linhagens de células KO).

Exemplo 4: Resistência das Linhagens de células COSMC KO e Slc35A1 KO ao Vírus MMV

[00163] Tipo selvagem (isto é, CHOZN GS-/-), COSMC KO (geradas acima nos Exemplos 1 e 3) e Slc35A1 KO (geradas acima no Exemplo 3) foram infectadas com o vírus MVMp em um MOI de 0,3, essencialmente como descrito acima no Exemplo 2. A infecção foi avaliada pela análise de Southern (essencialmente como descrito acima) e ensaios de placas padrão.

[00164] Como mostrado na FIG. 1, as células de tipo selvagem apresentaram níveis elevados de DNA viral, enquanto que as linhagens de célulasSlc35A1 KO e COSMC KO apresentaram níveis muito baixos de DNA viral; Os clones COSMC F07 KO e COSMC G03 KO apresentaram níveis baixos de DNA viral; e o clone COSMC H05 FO, que tinha uma deleção de 12 bp, apresentou níveis elevados de DNA virai semelhantes aos da linhagem de células parental. Uma vez que a deleção em H05 foi ocorreu in-frame, não é surpreendente que as células apresentaram sensibilidade viral em níveis próximos do tipo selvagem. Os resultados do ensaio de placa são mostrados na FIG. 2. As células Slc35A1 KO, COSMC KO, COSMC F07 KO e COSMC G03 KO apresentaram níveis virais muito baixos.

[00165] O teste de resistência viral adicional foi realizado utilizando o tipo selvagem (isto é, CHOZN GS-/-, também denominado 2E3), COSMC KO clones F07 e G03, e Slc35A1 KO clone B12. As células foram cultivadas em meio suplementado com 6 mM de L-glutamina e infectados com MMVp em um MOI de 1 ou 8 e foram incubadas em condições adequadas. As amostras de células foram removidas em 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas; a viabilidade celular foi testada com coloração com azul de tripano e a quantificação de MMV foi determinada por qPCR.

[00166] A viabilidade celular é apresentada na FIG. 3. Cento e vinte 120 horas após a infecção, a viabilidade celular foi reduzida em cerca de 50% em células do tipo selvagem (isto é, 2E3) (vide painel A), enquanto que em COSMC clone F07 pelo menos 93% das células eram viáveis 120 horas após infecção (vide painel B). A FIG. 4 mostra o curso de tempo do vírus associado à células (cópia genômica do vírus (vgc) por célula) após infecção por MMV em (2E3) tipo selvagem e clone F07 COSMC em um MOI de 1 (vide painel A) ou MOI de 8 (vide painel B) (o cálculo se baseou na suposição de que cada célula infectada pode produzir 2 x 104 vgc). A fração de células infectadas em cada condição está apresentada abaixo. Tabela 3. Porcentagem de células infectadas

[00167] As células de tipo selvagem (isto é, 2E3), COSMC KO clones F07, G03 e H04 e Slc35A1 KO clone B12 foram infectadas no momento -3 horas com MMVp em um MOI de 0,3 ou 0,03. No tempo 0 hora, as células foram lavadas três vezes com meio de crescimento e, depois, foram incubadas por 21 horas (isto é, ciclo de replicação único). A replicação viral foi testada pela determinação do vírus associado à célula em 0 e 21 horas. Como mostrado na FIG. 5, a replicação viral foi reduzida nas linhagens de células COSMC KO e eliminadas na linhagem de células Slc35A1 KO.

Exemplo 5: Resistência das Linhagens de células COSMC KO e Slc35A1 KO ao Reovírus-3

[00168] As células de tipo selvagem (isto é, 2E3), COSMC KO clone F07, e Slc35A1 KO clone B12 foram infectadas no tempo de -3 horas com reovírus-3 em duas diluições (TCID50 = 5,6E+07 e 5,6E+06). No tempo 0 hora, as células foram lavadas três vezes e, depois, foram incubadas por 24 horas (isto é, ciclo de replicação único). A replicação viral foi testada pela determinação do vírus associado à célula em 0 e 24 horas. Os níveis de vírus associado à célula reduziram drasticamente em 24 horas no clone COSMC KO e foram praticamente eliminados no clone Slc35A1 KO (vide FIG. 6).

Exemplo 6: Ensaios de crescimento das Linhagens de células COSMC KO e Slc35A1 KO

[00169] As células de tipo selvagem (isto é, CHOZN GS-/-), COSMC KO clones F07 e G03, e Slc35A1 clone B12 foram cultivadas na ausência ou presença de vírus MVMp (a um MOI de 0,1) por 8 a 10 dias. O crescimento celular foi monitorado pela medição da densidade de células viáveis (via coloração azul de tripano) nos dias 0, 1, 2, 3, 6, 7, 8 e 10. Como mostrado no painel A da FIG. 7, as várias células KO tinham perfis de crescimento similares na presença ou ausência de vírus, indicando resistência à injeção viral. Em contraste, as células de tipo selvagem mostraram infecciosidade clássica, crescimento comprometido e viabilidades celulares baixas em comparação com as culturas não infectadas.

[00170] O crescimento das células de tipo selvagem e de clones produtores de IgG de clones de COSMC KO clone F07 (isto é, 71H1 e 71C3) foi monitorado na ausência ou presença de vírus, essencialmente como detalhado acima. Como mostrado no painel B da FIG. 7, as linhagens de células KO produtoras de IgG mostraram também uma resistência significativa à infecção viral. As culturas infectadas cresceram em velocidades similares e com um pico de densidade celular como das culturas não infectadas. Estes dados indicam que a secreção de IgG de superfície celular não tem impacto perceptível sobre o grau de resistência viral apresentado por COSMC KO parental. Embora as duas linhagens de células produtoras de IgG tenham crescido em velocidades mais lentas em comparação com as células de tipo selvagem, as produtoras de IgG mostraram resistência à infecção viral (isto é, sem diferença em comparação às culturas não infectadas). Exemplo 7: Geração da Linhagem de células St3Gal4 KO e Ensaios de Crescimento Celular

[00171] As célulasSt3Gal4 KO foram geradas essencialmente como descrito acima no Exemplo 1 usando ZFNs concebidos para direcionar 5’-GGCAGCCTCCAGTGTCGTC gttgtgTTGTGGTGGGGAATGGGC (SEQ ID NO: 14) no gene CHO St3Gal4. Um ensaio de Cel-1 nuclease confirmou a presença de três fragmentos de clivagem (isto é, 344 bp, 210 pb e 135 bp) nas células transfectadas por ZFN. Quatro clones de célula individual foram isolados e a sequenciamento revelou as seguintes mutações. As células St3Gal4 KO apresentaram níveis reduzidos de 2-3 estruturas de ácido siálico ligados.

[00172] As célulasSt3Gal4 KO (isto é, clones 7D10, 1B8 e 1B10) e do tipo selvagem foram cultivadas na ausência ou presença de vírus MVMp em um MOI de 0,1 e o crescimento celular foi monitorado por 9 dias. As célulasSt3Gal4 KO também mostraram resistência significativa à infecção viral como mostrado na FIG. 8. As culturas de KO infectadas cresceram em velocidades similares e com um pico de densidade celular como das culturas de KO não infectadas. Estes estudos revelaram que a ruptura da estrutura de 2-3 ácidos siálicos ligados específicos na superfície da célula parece reduzir drasticamente também a entrada de MVM nessas células.

Exemplo 8: Geração de Linhagem de células St3Gal4 e St3Gal6 KO Dupla

[00173] As linhagens de célulasSt3Gal4 KO (isto é, clones 7D10, 1B8 e 1B10) foram usadas como células de partida para gerar linhagens de células que continham também um gene St3Gal6 que sofreu nocaute. ZFNs foram concebidos para direcionar 5'-CGGTACCTCTGATTTTGCT ttgccCTATGGGACAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 15) e a edição de genes foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 1. Um ensaio de Cel-1 nuclease confirmou a presença de três fragmentos de clivagem (isto é, 308 bp, 171 bp e 137 pb) nas células transfectadas por ZFN. Seis clones de célula individual foram isolados e a sequenciamento revelou as seguintes mutações.

Exemplo 9: Geração de Linhagens de células C1GalT1 KO

[00174] O gene C1GalT1 sofreu nocaute nas células CHOK1 (GS -/- ) usando ZFNs concebidos para direcionar 5'- ACCCTCATGCTAGACatttaGATGATAACGAACCCAGTC-3' (SEQ ID NO: 16) essencialmente como descrito no Exemplo 1. Um ensaio de Cel-1 nuclease confirmou a presença de dois fragmentos de clivagem (isto é, 223 bp e 148 bp) nas células transfectadas por ZFN. Sete clones de célula individual foram isolados e a sequenciamento revelou as seguintes mutações.

[00175] A coloração com MALII biotinilad o e estreptavidina marcada com Alexa Fluor 647 revelou redução significativa da coloração em C1GalT1 KO clone 2C12 em comparação com a linhagem de células parental.

Exemplo 10: Geração de Linhagens de células de Superexpressão St6Gal1

[00176] Uma vez que existe a hipótese de que o vírus MVM não se liga a ácidos siálico ligados a alfa-2,6, foram geradas linhagens de células CHO que superexpressam St6Gal1. A sequência de codificação de St6Gal1 de hamster chinês foi obtida a partir do GenBank (AB492855) e chogenome.org AQ2 (AFTD01061789 e AFTD01061790). O quadro de leitura aberto foi comercialmente sintetizado com uma sequência de Kozak (5'-GCCGCCACCAatg-3'; SEQ ID NO: 18) adicionada a 5'-região não traduzida (UTR). O fragmento sintetizado foi clonado no vetor de expressão pJ602 (DNA2.0; Menlo Park, CA). A linhagem de células CHO (GS-/-) hospedeira e uma linhagem de células CHO que expressa IgG foram transfectadas (por eletroporação) com esta construção. Os clones de células individuais foram isolados usando um separador de células FACSAriaTM III. Para isso, as células foram coradas com lectina Sambucus conjugada com FITC (FITC-SNA) que se liga a α-2,6 e células com fluorescência de 5% na parte superior foram plaqueadas em 1 célula/poço e cultivadas. Os clones de células individuais foram submetidos a análise de FACS de duas cores num Analisador MACSQuantVR (Miltenyi Biotec, San Diego, CA) após coloração com MALII biotinilado, que se liga ácido siálico ligado em α-2,3 e estreptavidina marcada com Alexa Fluor 647. O St6Gal1 Os clones de células que superexpressam individual tinha aumentado para proporções de FITC AlexaFluor, em comparação com as linhagens celulares parentais não transfectadas.

[00177] IgG foi isolada de dois clones com superexpressão de St6Gal1 (isto é, clone 31 e clone 32) e o clone de célula parental). IgG ou extratos totais de proteína celular foram reduzidos e carboxiamidometilados de acordo com procedimentos padrão antes de tripsinização em 37°C durante a noite (12-16 h). A tripsina foi desativada por aquecimento a 100°C por 5 min. A purificação dos fragmentos foi realizada com um cartucho C18 (Waters, embalagem de 300 mg). Depois de uma lavagem com ácido acético a 5% (AcOH), os peptídeos/glicopeptídeos foram eluídos sequencialmente em isopropanol a 20%/AcOH a 5%, isopropanol a 40%/AcOH a 5% e isopropanol a 100%. O eluente secou, foi reconstituído em tampão fosfato contendo PNGase F e foi incubado a 37°C durante a noite. Os glicanos liberados foram purificados usando um cartucho C18, permetilado e diluído em 1mM de carbonato de lítio/50% de MeOH e foram infundidos diretamente em um Espectrômetro de Massa LTQ Orbitrap Discovery (Thermo Scientific) em uma vazão de 0,5 ml/min para a ionização por nanospray. Foi obtido espectro total por espectrometria de massa de transformação de Fourier (FTMS) com uma resolução de 30.000 para cada amostra para determinar quais glicanos continham ácidos siálicos. A ligação de ácido siálico dos glicanos sialilados foi determinada por análise MSn. Cada amostra foi submetida a múltiplas etapas de deleção de íon e fragmentação no interior da armadilha de íons para quebrar um glicano de tipo complexo em uma galactose única e, em seguida, observou-se um padrão de fragmentação.

[00178] Havia diferenças marcantes entre os perfis de N-glicano da linhagem de células hospedeira GS (-/-) e as duas linhagens de células co superexpressão St6Gal1 (isto é, clones 31 e 32). Em particular, não foi identificado nenhum glicano sialilado na linhagem de células hospedeira devido à sua fraca abundância. Em contraste, foram identificados N-glicanos mono-, bi-, tri- e tetrasialilados em ambas as linhagens de células com superexpressão St6Gal1. Em particular, todas menos uma população sialilada no clone 32 mostrou para conter tanto ligações α-2,3 quanto α-2,6.

Claims

1. Uso de uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) geneticamente modificada, caracterizado pelo fato de ser em um sistema de produção biológico, em que a entrada e/ou propagação do vírus minuto de camundongo (MVM) é reduzida ou eliminada em comparação a uma linhagem celular parental não modificada, em que a linhagem celular CHO geneticamente modificada compreende uma sequência cromossômica modificada compreendendo uma sequência cromossômica inativada que codifica St3 beta-galactosídeo alfa-2,3- sialiltransferase 4 (St3Gal4).

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida linhagem celular CHO geneticamente modificada compreende ainda uma sequência cromossômica inativada que codifica a manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,2-N-acetilglucosamini ltransferase 1 (Mgat1).

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência cromossômica modificada é modificada usando uma técnica de modificação de genoma mediada por endonuclease direcionada.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a endonuclease direcionada é uma nuclease dedo de zinco.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante escolhida dentre um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma vacina, um fator de crescimento, uma citocina, um hormônio ou um fator de coagulação.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma sequência cromossômica inativada que codifica a glutamina sintetase.

7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a linhagem celular CHO geneticamente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e pelo menos um vírus, em que a linhagem celular apresenta resistência à infecção viral por MVM.

8. Método para reduzir o risco de contaminação viral de um sistema de produção biológico, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento para uso, no sistema de produção biológico, da linhagem celular CHO geneticamente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

9. Método para reduzir ou prevenir a contaminação viral de um produto de proteína recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a obtenção da linhagem celular CHO geneticamente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; e b) a expressão do produto de proteína recombinante na linhagem celular CHO geneticamente modificada.