KR20210046001A - 시토졸 dna 센서 경로의 하향-조절 - Google Patents
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Abstract
시토졸 DNA 센싱 경로에 연루된 단백질들을 하향-조정암으로써 표적화된 게놈 편집을 증가시키는 방법.
Description
발명의 분야
본 명세서는 시토졸 DNA 센싱(sensing)에 연루된 단백질들을 하향-조절함으로써 표적화된 유전자 편집을 증가시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포멧으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 전술한 ASCII 사본은 2019년 8월 15일자로 생성되었으며, 화일명은 P18-165PCT_SL.txt이며, 크기는 3,665 바이트이다.
특이적 뉴클레아제 (ZFNs, TALENs, CRISPRs/Cas9)는 DNA의 원하는 위치에서 이중-가닥 브레이크(DSBs)를 생성시킴으로써 표적화된 게놈 편집을 효과적으로 실행하는데 사용된다. DSBs는 세포의 자연적인 DNA-복구 공정을 자극한다. 이런 공정중 하나인, 상동성 재조합 (HR) 복구 경로에 의해 이식유전자를 표적화된 영역 안에 삽입시킬 수 있다. HR을 이용하기 위해, 절단 부위의 어느 한 쪽에 있는 영역에 대해 상동성 서열의 측면에 상기 이식유전자를 함유하는 공여자 주형이 이용된다. 이 공여자는 이러한 절단을 복구하기 위해, 시스터(sister) 염색분체(chromatid) 대신 이 공여자 서열을 제시함으로써, 해당 세포를 속이기 위해 뉴클레아제와 함께 이 세포로 공동전달된다.
상기 공여자 DNA (또는 임의의 다른 플라스미드 DNAs)의 전달은 많은 세포주들에서 문제가 되는데, 그 이유는 이들이 형질감염 또는 핵감염이 어렵기 때문이다. 이러한 "외생성 DNA에 대한 민감성"은 표적화된 이식유전자 삽입 (또는 표적화된 통합)의 달성을 거의 불가능하게 하는데, 그 이유는 이러한 것은 해당 공여자 DNA의 효과적인 전달이 필요하기 때문이다. 부위-특이적 뉴클레아제는 mRNA 또는 단백질 형태로 세포에 추가될 수 있고, 따라서 상기 DNA 민감성 문제를 우회할 수 있다. 그러나, 상기 공여자 서열은 DNA, 일반적으로 이중-가닥으로 된 DNA로 추가되어야 한다. 따라서, 이러한 형질감염-곤란 세포주에서 표적화된 게놈 편집 및 표적화된 통합을 개선시키거나 또는 가능하게 하는 방법들이 필요하다.
표적화된 이식 유전자 통합에 저항하는 세포는 또한 외래 DNA에 대한 민감성 또는 독성 (예를 들면, 형질감염 후 세포 사멸 또는 플라스미드 DNA의 핵감염)을 나타내는 세포인 경향이 있다. 세포들은 바이러스 및 박테리아에서 유래된 DNA를 감지하고, 결과적으로 염증 반응 경로를 활성화시키는 시토졸 DNA 센서를 갖고 있다. DNA 센싱 시스템에 연루된 단백질들의 하향-조절에 의해 공여자 DNA를 이들 세포로 도입시키고, 표적화된 통합을 허용하는 것이 가능하다.
요약
본 명세서의 다양한 측면들 중에는 표적화된 게놈 편집을 증가시키는 준비 또는 방법이 있다. 이 방법은 표적 엔도뉴클레아제 또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 임의선택적으로 공여자 DNA 분자를 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖는다.
본 명세서의 또다른 측면은 표적화된 이식유전자 통합을 증가시키는 방법을 포괄한다. 이 방법은 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포에서 표적화된 이식유전자 통합을 실행하는 것을 포함하며, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 이식유전자 통합을 갖는다.
본 명세서의 추가 측면은 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포와 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자를 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자로 형질감염 후 생존률이 더 높다.
본 개시의 다른 측면들 및 서술된 것들은 아래에 더 자세하게 설명된다.
도 1A 및 1B는 액틴 유전자좌로 표적화된 ZFNs와 BFP 공여자 플라스미드로 핵감염된 THP-1 야생형과 THP-1 KO (MD21D1) 세포의 세포 분류 분석을 제시한다.
도 2A-2D는 튜불린 유전자좌로 표적화된 ZFNs와 GFP 공여자 플라스미드로 핵감염된 THP-1 KO (MD21D1) 세포의 세포 분류 분석을 제시한다.
도 2A-2D는 튜불린 유전자좌로 표적화된 ZFNs와 GFP 공여자 플라스미드로 핵감염된 THP-1 KO (MD21D1) 세포의 세포 분류 분석을 제시한다.
상세한 설명
본 명세서는 표적화된 게놈 편집 또는 표적화된 이식유전자 통합을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이 방법은 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질들을 하향-조정하여, 이들 세포들이 외생성 DNA 분자들에 덜 민감하게 되는 것을 포함한다. 그 결과, 표적화된 게놈 편집/통합이 전술한 세포들에서 실행될 수 있다.
(I)
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포
본원에 개시된 방법들은 시토졸 DNA 센싱 경로들이 하향-조절되어, 외생성 DNA (예를 들면, 공여자 DNA 또는 플라스미드 DNA)에 덜 민감하게 된 세포들을 이용한다. 그 결과, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 전술한 세포에서 표적화된 게놈 편집의 효과가 개선될 수 있다.
일반적으로, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포들은 시토졸 DNA 센싱 경로에 연루된 하나 또는 그 이상의 단백질이 결핍되도록 공작된다. 따라서, 이렇게 공작된 세포들은 이러한 공작되지 않은 부모 세포들과 비교하였을 때, 시토졸 DNA 센싱에 연루된 하나 또는 그 이상의 단백질이 결핍되거나, 또는 이들의 수준이 감소된다. 상기 시토졸 DNA 센싱에 연루된 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현은 RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR 간섭 (CRISPRi)에 의해 일시적으로 녹-다운될 수 있다. 대안적으로, 시토졸 DNA 센싱에 연루된 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현은 표적 엔도뉴클레아제에 의한 표적화된 유전자의 비활성화에 의해 영구적으로 녹-다운될 수 있다. 시토졸 DNA 센싱 경로의 결핍으로 인하여, 상기 공작된 세포주는 외생성 DNA에 대해 덜 민감하며, 이들의 공작되지 않은 부모계 세포주보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖는다.
(a)
시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질들 경로
타고난 면역 시스템은 세포 손상 및/또는 박테리아 또는 바이러스 감염의 지표인 시토졸 이중-가닥으로 된 DNA (dsDNA)을 탐지하는 시토졸 DNA 센싱 경로를 포함한다. 시토졸 dsDNA는 염증 유전자들의 활성화를 촉발시키는 신호전달 경로를 활성화시키는 DNA 센서에 의해 인지되고, 이로 인하여 항-바이러스 보호, 항-박테리아 보호, 천연 살해 세포 활성화, 또는 세포 사멸이 초래된다.
시토졸 dsDNA의 센서에는 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS; 유전자 기호는 MB21D1), 인터페론 감마 유도성 단백질 16 (IFI16; 동일한 유전자 기호), DEAD-박스 헬리카제 41 (DDX41; 동일한 유전자 기호), 류신 풍부 반복부 (flightless I에서) 상호작용 단백질 (LRRFIP1; 동일한 유전자 기호), 인터페론 (IFN)-조절 인자의 DNA-의존적 활성화제 (DAI; 유전자 기호는 ZBP1), DEAH-박스 헬리카제 8 (DHX9, 동일한 유전자 기호), DEAH-박스 헬리카제 (DHX36; 동일한 유전자 기호), 흑색종의 부재 2 (AIM2; 동일한 유전자 기호), X-ray 복구 교차-상보성 단백질 6 (Ku70; 유전자 기호는 XRCC6) 및 RNA 중합효소 III (Pol III; 유전자 기호는 POLR3A)가 내포된다. 일부 시토졸 DNA 센서에 의해 활성화된 하류 단백질 (예를 들면, cGAS)은 인터페론 유전자 (STING; 유전자 기호는 TMEM173)의 자극자이다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 cGAS가 결핍되어 있다. 다른 구체예들에서, 상기 세포는 STING가 결핍되어 있다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 세포는 cGAS와 STING 모두가 결핍되어 있다.
(b)
시토졸 DNA 센싱에서 영구적 결핍
일부 구체예들에서, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 영구적 결핍을 갖는다. 예를 들면, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 염색체 서열은 표적 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집 기술로 비활성화될 수 있는데, 이는 하기 섹션 (II)에서 기술된다.
표적 엔도뉴클레아제는 DNA-결합 도메인과 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 표적 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 프로그래밍가능하며(programmable), 이는 상이한 DNA 서열을 인지하고, 결합하도록 기획 또는 공작될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 구체예들에서, 상기 DNA 결합은 표적 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 도메인과 표적 DNA 간의 상호작용에 의해 매개된다. 따라서, 상기 DNA-결합 도메인은 단백질 공학에 의해 관심대상의 DNA 서열에 결합하도록 프로그래밍될 수 있다. 다른 구체예들에서, DNA 결합은 표적 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 도메인과 표적 DNA와 상호작용하는 가이드 RNA에 의해 매개된다. 그러한 경우들에서, 상기 DNA-결합 도메인은 적절한 가이드 RNA를 기획함으로써, 관심대상의 DNA 서열로 표적화될 수 있다.
적합한 표적 엔도뉴클레아제에는 아연 핑거 뉴클레아제, 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연합된 (Cas) (CRISPR/Cas) 뉴클레아제 시스템, CRISPR/Cas 듀얼 닉카제 시스템, 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 또는 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인과 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질이 내포된다. 상기 표적 엔도뉴클레아제는 야생형 또는 자연-발생적 DNA-결합 및/또는 뉴클레아제 도메인, 자연-발생적 DNA-결합 및/또는 뉴클레아제 도메인의 변형된 형태, 합성된 또는 인공적인 DNA-결합 및/또는 뉴클레아제 도메인, 또는 이의 조합들을 포함할 수 있다.
(i) 아연 핑거 뉴클레아제
일부 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)일 수 있다. ZFN은 DNA-결합 아연 핑거 영역과 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 상기 아연 핑거 영역은 약 2 내지 7개 아연 핑거, 예를 들면, 약 4 내지 6개 아연 핑거를 포함할 수 있고, 이때 각 아연 핑거는 3개 뉴클레오티드에 결합하고, 이때 이 아연 핑거들은 적합한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. 상기 아연 핑거 영역은 임의의 DNA 서열을 인지하고, 결합하도록 공작될 수 있다. 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 그리고 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814 참조. DNA 서열에서 잠재적인 표적 부위를 식별하고, 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 공개적으로 이용가능한 웹-기반 도구는 당업계에 공지되어 있다.
ZFN는 또한 뉴클레아제 도메인을 포함하는데, 이는 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 획득될 수 있다. 뉴클레아제 도메인이 유래될 수 있는 비-제한적 엔도뉴클레아제의 예시에는 제한 엔도뉴클레아제와 귀소(homing) 엔도뉴클레아제가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 절단 도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 요구하는 효소 또는 이의 일부분으로부터 유래될 수도 있다. 절단을 위해 두 개 아연 핑거 뉴클레아제가 필요할 수 있는데, 각 뉴클레아제가 활성 효소 이량체의 단량체를 포함하기 때문이다. 두 개 절단 단량체가 이용되어 활성 효소 이량체가 형성될 때, 당해 두 개의 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 인지 부위는 이들의 각 인지 부위에 대한 두 개의 아연 핑거 뉴클레아제의 결합이 당해 절단 단량체가 활성 효소 이량체를 형성하도록(가령, 이량체화에 의해) 당해 절단 단량체를 공간적 방향으로 배치시키도록 일반적으로 배치된다. 그 결과, 상기 인지 부위의 부근 엣지는 약 5개 내지 약 18개 뉴클레오티드 만큼 떨어져 있을 수 있다. 예로서, 상기 부근 엣지는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개 뉴클레오티드 만큼 떨어져 있을 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 도메인은 유형 II-S 제한 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 유형 II-S 엔도뉴클레아제는 인지/결합 부위로부터 전형적으로 몇 개의 염기쌍만큼 떨어져 있는 부위에서 DNA를 절단하고, 이와 같이, 분리가능한 결합 및 절단 도메인를 갖는다. 이들 효소는 일반적으로 단량체이며, 이들은 일시적으로 연합되어 이량체를 형성하고, 스태거형(staggered) 위치에서 DNA의 각 가닥을 절단한다. 적합한 유형 II-S 엔도뉴클레아제의 비-제한적 실시예는 BfiI, BpmI, BsaI, BsgI, BsmBI, BsmI, BspMI, FokI, MboII, 그리고 SapI를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 도메인은 FokI 뉴클레아제 도메인 또는 이의 유도체일 수 있다. 상기 유형 II-S 뉴클레아제 도메인은 2개의 상이한 뉴클레아제 도메인의 이량체화를 용이하게 하기 위하여 변형될 수 있다. 예로써, FokI의 절단 도메인은 특정 아미노산 잔기들을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 비-제한적 예로써, FokI의 아미노산 잔기 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에 있는 아미노산 잔기는 모두 FokI 뉴클레아제 도메인이 변형의 표적이다. 예를 들면, 하나의 변형된 FokI 도메인은 Q486E, I499L, 및/또는 N496D 돌연변이를 포함하고, 다른 변형된 FokI 도메인은 E490K, I538K, 및/또는 H537R 돌연변이를 포함할 수 있다.
상기 ZFN은 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 및/또는 마커 도메인을 더 포함할 수 있다. 핵 국소화 신호의 비-제한적 예시에는 PKKKRKV (서열 식별 번호:1), PKKKRRV (서열 식별 번호:2), 또는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 식별 번호:3)가 내포된다. 적합한 세포-침투 도메인의 예시에는 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 식별 번호:4), PLSSIFSRIGDPPKKKRKV (서열 식별 번호:5), GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV (서열 식별 번호:6), GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (서열 식별 번호: 7), 또는 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (서열 식별 번호: 8)이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 마커 도메인의 비-제한적인 예시에는 형광 단백질 (예를 들면, GFP, eGFP, RFP, BFP, 및 이와 유사한 것들), 그리고 정제 또는 에피토프 테그 (예를 들면, 6xHis, FLAG, HA, GST, 및 등등)가 내포된다. 상기 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 및/또는 마커 도메인은 해당 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부 위치에 있을 수 있다.
(ii) CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템
다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 RNA-가이드된 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템으써, 이는 DNA에 이중-가닥으로 된 브레이크를 도입시킨다. CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 CRISPR/Cas 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함한다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제는 유형 I (즉, IA, IB, IC, ID, IE, 또는 IF), 유형 II (즉, IIA, IIB, 또는 IIC), 유형 III (즉, IIIA 또는 IIIB), 또는 유형 V CRISPR 시스템으로부터 유래될 수 있고, 이들은 다양한 박테리아 및 고세균에 존재한다. CRISPR/Cas 시스템은 스트렘토코커스 종(Streptococcus sp.) (예로써, 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyogenes)), 캄필로박터 종(Campylobacter sp.) (예로써, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)), 프란시셀라 종Francisella sp.) (예로써, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)), 아카리요클로리스 종(Acaryochloris sp.), 아세토할로비윰 종(Acetohalobium sp.), 악시도아미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp.), 악시도티오바실루서 종(Acidithiobacillus sp.), 알리사이클로바실러스 종(Alicyclobacillus sp.), 알로크로마티움 종(Allochromatium sp.), 암모니펙스 종(Ammonifex sp.), 아나바에나 종(Anabaena sp.), 안트로스피라 종(Arthrospira sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.), 브루크홀데리알레스 종(Burkholderiales sp.), 칼디셀루로시루프토르 종(Caldicelulosiruptor sp.), 칸디다투스 종(Candidatus sp.), 클로스트리디움 종(Clostridium sp.), 크로코스페라 종(Crocosphaera sp.), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 엑시구오박테리움 종(Exiguobacterium sp.), 피네골디아 종(Finegoldia sp.), 크테도노박터 종(Ktedonobacter sp.), 라취노스피라세아 종(Lachnospiraceae sp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 린바야 종(Lyngbya sp.), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 메타노할로비움 종(Methanohalobium sp.), 마이크로실라 종(Microscilla sp.), 마이크로코레우스 종(Microcoleus sp.), 마이크로시스티스 종(Microcystis sp.), 나트라에어로비우스 종(Natranaerobius sp.), 나이세리아 종(Neisseria sp.), 니트로소코쿠스 종(Nitrosococcus sp.), 노카르디옵시스 종(Nocardiopsis sp.), 노두라리아 종(Nodularia sp.), 노스톡 종(Nostoc sp.), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp.), 펠로토마쿠룸 종(Pelotomaculum sp.), 슈도알레오모나스 종(Pseudoalteromonas sp.), 페트로토가 종(Petrotoga sp.), 프레보테라 종(Prevotella sp.), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp.), 스트렙토미세스 종(Streptomyces sp.), 스트렙토스포란기움 종(Streptosporangium sp.), 시네초코쿠스 종(Synechococcus sp.), 또는 테르모시포 종(Thermosipho sp.)으로부터 유래될 수 있다.
적합한 CRISPR 뉴클레아제의 비-제한적 예시에는 Cas 단백질, Cpf 단백질, Cmr 단백질, Csa 단백질, Csb 단백질, Csc 단백질, Cse 단백질, Csf 단백질, Csm 단백질, Csn 단백질, Csx 단백질, Csy 단백질, Csz 단백질, 그리고 이의 유도체 또는 변이체들이 내포된다. 특이적 구체예들에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 유형 II Cas9 단백질, 유형 V Cpf1 단백질, 또는 이의 유도체일 수 있다. 일부 구체예들에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpCas9), 또는 스트렙토코커스 테러모필루스(Streptococcus thermophilus) Cas9 (StCas9)일 수 있다. 다른 구체예들에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) Cas9 (CjCas9)일 수 있다. 대체 구체예들에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 프란시세라 노비시다(Francisella novicida) Cas9 (FnCas9)일 수 있다. 추가 구체예들에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 프란시세라 노비시다(Francisella novicida) Cpf1 (FnCpf1)일 수 있다.
일반적으로, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 RNA 인지 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함하며, 이는 가이드 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인를 또한 포함한다. 예를 들면, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있고, Cpf1 단백질은 RuvC-유사 도메인을 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인, 헬리카제 도메인, RNase 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이량체화 도메인, 뿐만 아니라 기타 도메인을 또한 포함할 수 있다.
상기 CRISPR/Cas 뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 마커 도메인, 및/또는 탐지가능한 라벨을 더 포함할 수 있으며, 섹션 (I) (b) (i)에서 기재되어 있다.
상기 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 가이드 RNA (gRNA)를 또한 포함한다. 상기 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제와 상호작용하여 이를 DNA의 표적 부위로 안내한다. 상기 표적 부위는 프로토스페이스 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM)에 의해 경계를 이루는 것을 제외하고, 서열 제한이 없다. 예를 들면, Cas9의 PAM 서열에는 3'-NGG, 3'-NGGNG, 3'-NNAGAAW, 및 3'-ACAY이 내포되며, Cpf1의 PAM 서열에는 5'-TTN (이때 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의되며, W는 A 또는 T로 정의되며, 그리고 Y는 C 또는 T로 정의됨)이 내포된다. 각 gRNA는 상기 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다 (예를 들면, Cas9 gRNA는 GN17-20GG를 포함할 수 있다). 상기 gRNA는 스템 루프 구조와 단일-가닥으로 된 영역을 형성하는 스캐폴드 서열을 또한 포함할 수 있다. 상기 스캐폴드 영역은 모든 gRNA에서 동일할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 gRNA는 단일 분자 (즉, sgRNA)일 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 gRNA는 두 개의 별도 분자일 수 있다.
(iii) CRISPR/Cas 닉카제 시스템
다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 CRISPR/Cas 닉카제 시스템일 수 있다. CRISPR/Cas 닉카제 시스템은 상기에서 기술된 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 유사하지만, CRISPR/Cas 뉴클레아제는 오직 DNA의 한 가닥만을 절단하도록 변형된 것이 차이점이다. 따라서, 단일 CRISPR/Cas 닉카제 시스템은 DNA에 단일-가닥으로 된 브레이크 또는 닉크(nick)를 만든다. 대안적으로, 한 쌍의 오프셋 gRNAs를 포함하는 쌍을 이룬 CRISPR/Cas 닉카제 시스템 (또는 듀얼 닉카제 시스템)은 DNA의 반대 가닥에 밀접하게 공간을 둔 단일-가닥으로 된 브레이크를 만듦으로써 DNA에 이중-가닥으로 된 브레이크를 생성시킬 수 있다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제는 하나 또는 그 이상의 돌연변이 및/또는 결손에 의해 닉카제로 전환될 수 있다. 예를 들면, Cas9 닉카제는 뉴클레아제 도메인중 하나에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 이때 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 RuvC-유사 도메인에서 D10A, E762A, 및/또는 D986A일 수 있거나, 상기 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 HNH-유사 도메인에서 H840A, N854A 및/또는 N863A일 수 있다.
(iv) 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제
대체 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN)일 수 있다. TALENs는 뉴클레아제 도메인에 연결된 전사 활성화제-유사 작동체 (TALEs) 로부터 유래된 매우 보존된 반복부로 구성된 DNA-결합 도메인을 포함한다. TALEs는 숙주 식물 세포에서 유전자의 전사를 변경시키기 위하여 식물 병원균 산토모나스(Xanthomonas)에 의해 분비되는 단백질이다. TALE 반복부 어레이는 관심 대상의 임의의 DNA 서열을 표적으로 하도록 모듈 단백질 설계를 통해 공작될 수 있다. TALENs의 뉴클레아제 도메인은 상기 섹션 (I)(b)(i)에서 기재된 임의의 뉴클레아제 도메인일 수 있다. 특이적 구체예들에서, 상기 뉴클레아제 도메인은 FokI로부터 유래된다 (Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192).
TALEN는 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 마커 도메인, 및/또는 탐지가능한 라벨을 더 포함할 수 있으며, 섹션 (I) (b) (i)에서 기재되어 있다.
(v) 메가뉴클레아제 또는 희귀-절단 엔도뉴클레아제
여전히 다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제 또는 이의 유도체일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인지 서열을 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이며, 즉, 당해 인지 서열은 일반적으로 약 12 개 염기쌍 내지 약 45 개 염기쌍 범위다. 이 요구 사항의 결과로, 인지 서열은 일반적으로 주어진 게놈에서 오직 한 번만 발생한다. 메가뉴클레아제 중에서 LAGLIDADG라는 이름의 귀소(homing) 엔도뉴클레아제 패밀리는 게놈 및 게놈 공학 연구에 유용한 도구가 되었다. 일부 구체예들에서, 상기 메가뉴클레아제는 I-SceI, I-TevI, 또는 이의 변이체일 수 있다. 메가뉴클레아제는 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 인지 서열을 변형함으로써 특정 염색체 서열로 표적화될 수 있다.
대체 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 희귀-절단 엔도뉴클레아제 또는 이의 유도체일 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 엔도뉴클레아제로써, 이의 인지 서열은 게놈에서 잘 발생되지 않고, 바람직하게는 게놈에서 단 한 번만 발생한다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 7개 뉴클레오티드 서열, 8개-뉴클레오티드 서열, 또는 더 긴 인지 서열을 인지할 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 비-제한적인 예시에는 NotI, AscI, PacI, AsiSI, SbfI, 및 FseI가 내포된다.
상기 메가뉴클레아제 또는 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 마커 도메인, 및/또는 탐지가능한 라벨을 또한 포함할 수 있으며, 섹션 (I) (b) (i)에서 기재되어 있다.
(vi) 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질
여전히 추가 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인과 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 뉴클레아제 도메인은 상기 섹션 (I)(b)(i)에서 기술된 임의의 것, CRISPR/Cas 뉴클레아제에서 유래된 뉴클레아제 도메인 (예를 들면, Cas9의 RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 또는 Cpf1의 뉴클레아제 도메인), 또는 메가뉴클레아제 또는 희귀-절단 엔도뉴클레아제로부터 유래된 뉴클레아제 도메인일 수 있다.
상기 융합 단백질의 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인은 모든 뉴클레아제 활성이 결핍되도록 변형된 (즉, 촉매적으로 비활성) 표적 엔도뉴클레아제 (즉, CRISPR/CAS 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제)로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 융합 단백질의 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인은 프로그래밍가능한 DNA-결합 단백질, 이를 테면, 예를 들면, 아연 핑거 단백질 또는 TALE일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인은 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 뉴클레아제일 수 있는데, 이때 뉴클레아제 활성은 돌연변이 및/또는 결손에 의해 제거되었다. 예로써, 상기 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 단백질은 촉매적으로 비활성 (사멸) Cas9 (dCas9)일 수 있으며, 이때 RuvC-유사 도메인은 D10A, E762A, 및/또는 D986A 돌연변이를 포함하고, HNH-유사 도메인은 H840A, N854A, 및/또는 N863A 돌연변이를 포함한다. 대안으로, 상기 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 단백질은 뉴클레아제 도메인에서 필적가능한 돌연변이를 포함하는 촉매적으로 비활성 (사멸) Cpf1 단백질일 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인은 촉매적으로 비활성 메가뉴클레아제일 수 있는데, 이때 뉴클레아제 활성은 돌연변이 및/또는 결손에 의해 제거되었다. 예를 들면, 상기 촉매적으로 비활성 메가뉴클레아제는 C-말단 절두를 포함할 수 있다.
뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질은 적어도 하나의 핵 국소화 신호, 세포-침투 도메인, 마커 도메인, 및/또는 탐지가능한 라벨을 또한 포함할 수 있는데, 섹션 (I) (b) (i)에서 기재되어 있다.
(c)
시토졸 DNA 센싱에서 일시적 결핍
다른 구체예들에서, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 일시적 결핍을 가질 수 있다. 예를 들면, 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질의 발현은 RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR 간섭 (CRISPRi)에 의해 일시적으로 녹-다운될 수 있다. 이러한 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질의 전사체(mRNA)를 표적으로 하는 RNAi 제제, 또는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 염색체 DNA 서열을 표적으로 하는 CRISPRi 제제를 포함할 수 있다.
(i) RNAi
RNA 간섭이란 RNAi 제제가 전사체를 절단하거나 해당 전사제가 단백질로의 해독되는 것을 방해함으로써, 표적 전사체의 발현을 억제하는 과정을 의미한다. RNAi 제제에는 짧은 간섭 RNA (siRNA)와 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)가 내포된다. 일반적으로, siRNA는 길이가 약 15개 내지 약 29개 뉴클레오티드 범위, 또는 더 일반적으로 길이가 약 19개 내지 약 23개 뉴클레오티드 범위의 이중-가닥으로 된 RNA 분자를 포함한다. 특이적 구체예들에서, 상기 siRNA의 길이는 약 21개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 siRNA는 임의선택적으로 하나 또는 두 개의 단일-가닥으로 된 오버행, 예를 들면, 한쪽 또는 양 단부 상에 3' 오버행을 더 포함할 수 있다. 상기 siRNA는 두 개의 RNA 분자가 혼성화되어 형성될 수 있거나, 또는 대안적으로, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)로부터 생성될 수 있다 (하기 참고). 일부 구체예들에서, siRNA의 2 개 가닥은 완전히 상보적일 수 있어서, 두 서열 사이에 형성된 듀플렉스에 미스매치 또는 불룩(bulges)이 존재하지 않는다. 다른 구체예들에서, siRNA의 2 개 가닥은 실질적으로 상보적일 수 있어서, 두 서열 사이에 형성된 듀플렉스에 하나 또는 그 이상의 미스매치 또는 불룩(bulges)이 존재한다. 특정 구체예들에서, siRNA의 5' 말단의 하나 또는 둘 모두는 인산기를 가질 수 있는 반면, 다른 구체예들에서 5' 말단의 하나 또는 둘 모두는 인산기가 결여될 수 있다.
"안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"으로 지칭되는 siRNA의 한 가닥에는 표적 전사체와 혼성화하는 부분이 내포된다. 일부 구체예들에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 전사체의 영역에 완전하게 상보적일 수 있으며, 즉, siRNA 길이 전체에 걸쳐 단일 미스 매치 또는 불룩없이 표적 전사체에 혼성화될 수 있다. 다른 구체예들에서, 안티센스 가닥은 표적 전사체의 영역에 완전하게 상보적일 수 있으며, 즉, 안티센스 가닥 및 표적 전사체에 의해 형성된 듀플렉스에 하나 또는 그 이상의 미스매치 및/또는 불록이 존재할 수 있다. 전형적으로, siRNAs는 상기 표적 전사체의 엑손 서열에 표적화된다. 당업자는 표적 전사체를 위한 siRNA를 설계하는 프로그램, 알고리즘 및/또는 상업적 서비스를 잘 알고 있다.
일반적으로, shRNA는 혼성화되었거나 또는 혼성화되어 RNA 간섭을 매개하기에 충분히 긴 이중-가닥으로 된 구조를 형성 할 수 있는 적어도 2 개의 상보적 부분, 그리고 듀플렉스를 형성하는 shRNA의 영역을 연결시키는 루프를 형성하는 적어도 1 개의 단일 가닥 부분을 포함하는 RNA 분자다. 이 구조는 스템-루프 구조라고도 하는데, 이때 스템이 듀플렉스 부분이다. 일부 구체예들에서, 해당 구조의 듀플렉스 부분은 완전히 상보적일 수 있어서, shRNA의 듀플렉스 영역에 미스매치 또는 불룩이 존재하지 않는다. 다른 구체예들에서, 해당 구조의 듀플렉스 부분은 실질적으로 상보적일 수 있어서, shRNA의 듀플렉스 영역에 하나 또는 그 이상의 미스매치 또는 불룩이 존재할 수 있다. 이 구조의 루프 길이는 약 1개 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 특히 약 6개 내지 약 9개 뉴클레오티드일 수 있다. 이 루프는 표적 전사체에 상보적인 영역 (즉, shRNA의 안티센스 부분)의 5' 또는 3' 단부에 위치할 수 있다.
shRNA는 5' 또는 3' 단부에 오버행을 더 포함할 수 있다. 임의선택적 오버행의 길이는 약 1 개 내지 약 20 개 뉴클레오티드, 또는 보다 구체적으로 약 2 개 내지 약 15 개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 오버행은 하나 또는 그 이상의 U 잔기, 예를 들면, 약 1개 내지 약 5개 U 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, shRNA의 5' 단부는 인산기를 가질 수 있다. 일반적으로, shRNAs는 보존된 세포 RNAi 기전에 의해 siRNA로 프로세싱된다. 따라서, shRNA는 siRNAs의 전구체이며, shRNA의 일부 (즉, shRNA의 안티센스 부분)의 상보적인 표적 전사체의 발현을 유사하게 억제시킬 수 있다. 당업자는 shRNA의 설계 및 합성에 이용가능한 자원을 잘 알고 있다. 예시적인 예로는 MISSION® shRNAs (Sigma-Aldrich)이다.
상기 siRNA 또는 shRNA는 RNA로써 상기 세포 안으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 siRNA 또는 shRNA는 생체내에서 RNAi 발현 구조체로부터 발현될 수 있다. 적합한 구조체에는 플라스미드 벡터, 파아지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 트랜스포존 및 바이러스 벡터 (예를 들면, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 등)가 내포된다. 한 구체예에서, RNAi 발현 구조체는 플라스미드 벡터 (예를 들면, pUC, pBR322, pET, pBluescript, 및 이의 변이체)일 수 있다. 상기 RNAi 발현 구조체는 2 개의 프로모터 제어 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 각각은 적절한 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어, 2 개의 별개의 상보적인 siRNA 가닥이 전사될 수 있다. 2 개의 프로모터 제어 서열은 동일한 방향 또는 반대 방향일 수 있다. 또다른 구체예에서, RNAi 발현 벡터는 전사체가 shRNA를 형성하도록 2 개의 상보적 영역을 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 유도하는 프로모터 제어 서열을 함유할 수 있다. 일반적으로, 상기 프로모터 제어 서열(들)은 RNA 중합효소 III (Pol III) 프로모터, 이를 테면 U6 또는 H1 프로모터일 수 있다. 다른 구체예들에서, RNA 중합효소 II (Pol II) 프로모터 제어 서열이 이용될 수 있다. RNAi 발현 구조체들은 추가 서열 요소들, 이를 테면, 전사 종결 서열, 선별가능한 마커 서열, 등등을 함유할 수 있다. RNAi 발현 구조체들은 표준 절차를 이용하여 관심대상의 세포주 안으로 도입될 수 있다. RNAi 제제 또는 RNAi 발현 벡터는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 해당 세포로 도입될 수 있다 (예를 들면, 하기 섹션 (II)(b) 참고).
(ii) CRISPRi
CRISPR 간섭이란 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 시스템 (CRISPRi)을 게놈 DNA의 표적 부위에 결합시킴으로써 유전자 발현이 억제되는 과정을 지칭한다. 상기 CRISPRi 제제는 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 뉴클레아제를 포함하며, 이때 모든 뉴클레아제 활성은 돌연변이 및/또는 결손에 의해 제거되었다. 예로써, 상기 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 단백질은 촉매적으로 비활성 (사멸) Cas9 (dCas9)일 수 있으며, 이때 RuvC-유사 도메인은 D10A, E762A, 및/또는 D986A 돌연변이를 포함하고, HNH-유사 도메인은 H840A, N854A, 및/또는 N863A 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 촉매적으로 비활성 (사멸) CRISPR/Cas 단백질은 전사 억제자 도메인과 융합될 수 있다. 적합한 전사 억제자 도메인에는 Kruppel-연합된 박스 A (KRAB-A) 억제자 도메인, 유도성 cAMP 조기 억제자 (ICER) 도메인, YY1 글리신 풍부 억제자 도메인, Sp1-유사 억제자, E(spl) 억제자, IκB 억제자, 및 MeCP2이 내포된다.
CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 염색체 서열에 있는 표적화된 부위로 CRISPR/Cas 시스템을 표적화시킨다. 예를 들면, 상기 가이드 RNA는 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 시스템을 프로모터 영역에 있는 표적 부위로 표적화시킬 수 있고, 이로써 전사 개시는 억제된다. 대안적으로, 상기 가이드 RNA는 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 시스템을 해당 유전자의 전사된 영역에 있는 표적 부위로 표적화시킬 수 있고, 이로써 전사 연장이 억제된다.
상기 CRISPRi 제제는 단백질-RNA 복합체로써 해당 세포 안으로 도입될 수 있다. 다른 구체예들에서, 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 (즉, RNA 또는 DNA)은 가이드 RNA와 함께 해당 세포 안으로 도입될 수 있다. 여전히 다른 구체예에서, 촉매적으로 비활성 CRISPR/Cas 단백질을 인코딩하는 DNA 발현 구조체와 가이드 RNA는 해당 세포 안으로 도입될 수 있다. 당업자는 CRISPRi 제제 또는 CRISPRi 제제를 인코딩하는 핵산을 도입하기 위한 수단을 잘 알고 있다(예를 들면, 하기 섹션 (II)(b) 참고).
(d)
세포 유형
일반적으로, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 포유류 세포 또는, 더 구체적으로 포유류 세포주이다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포주는 조혈 세포주이다. 적합한 조혈 세포주의 비-제한적 예시에는 THP-1 (인간 단핵구 세포), HL-60 (인간 전골수세포성 백혈병 세포), U-937 (인간 대식세포 세포), Ramos (인간 Burkitt's 림프종 세포), Jurkat (인간 T 림프구 세포), Daudi ( 인간 B 림프모구 세포), IM-9 (인간 B 림프모구 세포), ARH-77 (인간 B 림프모구 세포), RPMI 8226 (인간 B 림프구 세포), MC/CAR (인간 B 림프구 세포), RPMI 1788 (인간 B 림프구s), TF-1 (인간 적아세포 세포), K562 (인간 골수형성 백혈병 세포), RAW 264.7 (마우스 대식세포 세포), RBL (렛 B 림프종 세포), DH82 (렛 단핵구/대식세포 세포), NS0 (마우스 골수종 세포), 또는 SP2/0 (마우스 골수종 세포)이 내포된다. 추가 구체예들에서, 상기 세포주는 조혈 줄기 세포주일 수 있다.
다른 구체예들에서, 포유류 세포주는 HEK293 또는 HEK293T (인간 배아 신장 세포), HELA (인간 자궁경부 암종 세포), W138 (인간 폐 세포), Hep G2 (인간 간 세포), U2-OS (인간 골육종 세포),A549 (인간 폐포 기저 상피 세포), A-431 (인간 암종 세포), COS7 (원숭이 신장 SV-40 형질변환된 섬유아세포), CVI-76 (원숭이 신장 세포), VERO-76 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포), CMT (갯과 유선 세포), MDCK (갯과 신장 세포), 9L (렛 교모세포종 세포), B35 (렛 신경모세포종 세포), HTC (렛 간종양 세포), BRL 3A (버팔로 렛 간 세포), D17 (렛 골육종 세포), CHO (중국 헴스터 난소 세포), BHK (아기 햄스터 신장 세포), NIH3T3 (마우스 배아 섬유아세포), A20 (마우스 B 림프종 세포), B16 (마우스 흑색종 세포), C2C12 (마우스 근아세포 세포), C3H-10T1/2 (마우스 배아 중간엽 세포), CT26 (마우스 암종 세포), DuCuP (마우스 전립선 세포), EMT6 (마우스 유방 세포), Hepa1c1c7 (마우스 간종양 세포), J5582 (마우스 골수종 세포), MTD-1A (마우스 상피 세포), MyEnd (마우스 심근 세포), RenCa (마우스 신장 세포), RIN-5F (마우스 췌장 세포), X64 (마우스 흑색종 세포), YAC-1 (마우스 림프종 세포)일 수 있다.
특이적 구체예들에서, 상기 세포주는 THP-1, HL-60, U-937, Ramos, 또는 Jurkat 세포주다.
(e)
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포들의 속성
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포와 비교하였을 때, 외생성 DNA의 독성 효과에 덜 민감하다. 일부 구체예들에서, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 DNA 분자로 형질감염된 후, 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포보다 더 높은 생존율을 갖는다. 생존율은 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 적어도 약 400%, 또는 약 400% 그 이상으로 증가될 수 있다.
다른 구체예들에서, 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포 보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집 또는 표적화된 이식유전자 통합을 갖는다. 게놈 편집 또는 표적화된 통합율은 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 적어도 약 400%, 또는 약 400% 그 이상으로 증가될 수 있다.
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포들은 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포와 필적하는 성장율을 갖는다.
(II)
표적화된 게놈 편집 효율을 높이는 방법
본 명세서의 추가 측면은 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포에서 표적화된 게놈 편집 효율(예를 들면, 이식유전자 통합)을 증가시키는 방법을 포괄한다. 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 외생성 DNA에 덜 민감하기 때문에, 전술한 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포보다 더 높은 비율의 표적 게놈 편집을 가질 수 있다.
(a)
상기 방법을 위한 시약
이 방법은 표적 엔도뉴클레아제 또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, 그리고 임의선택적으로 공여자 DNA 분자를 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포 안으로 도입시키는 것을 포함한다. 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포들은 상기 섹션 (I)에 기술되어 있다. 상기 표적 엔도뉴클레아제는 ZFN, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템, CRISPR/Cas 듀얼 닉카제 시스템, TALEN, 메가뉴클레아제, 또는 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인과 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 이들은 상기 섹션 (I)(b)에서 기술된다. 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 임의선택적 공여자 DNA 분자는 하기에서 상술된다.
(i) 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산
상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 단백질은 DNA 또는 RNA, 선형 또는 원형의, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 상기 RNA 또는 DNA는 관심대상의 포유류 세포의 단백질로 효과적으로 해독되도록 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화 프로그램은 프리웨어(freeware) 또는 상업적 출처로부터 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA일 수 있다. mRNA는 5' 캡핑되거나 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA일 수 있다. 일반적으로, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 이중-가닥으로 된 DNA이다. 코딩 DNA는 프로모터 제어 서열, 폴리아데닐화 신호 (예로써, SV40 polyA 신호, 소 성장 호르몬(BGH) polyA 신호, 등등) 및/또는 전사 종결 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 서열은 관심 대상의 포유류 세포에서 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 상기 프로모터 제어 서열은 구성적이며, 조절된, 또는 세포-특이적이거나 또는 조직-특이적일 수 있다. 적합한 구성적 프로모터 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 즉각 초기 프로모터 (CMV), 원숭이 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 연장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜블린 프로모터, 면역글로블린 프로모터, 이의 단편들, 또는 전술한 것들중 임의의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 적합한 조절된 프로모터 조절 서열의 예로는 열쇼크, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 조절된 것을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 실시예로는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 그리고 WASP 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터 제어 서열은 야생형일 수 있거나, 또는 더욱 효과적인 또는 효율적인 발현을 위하여 변형될 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 서열은 시험관내 mRNA 합성을 위한 파아지 RNA 중합효소에 의해 인지되는 프로모터 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 이러한 구체예들에서, 시험관에서-전사된 RNA는 정제되고, 캡핑되거나(capped), 및/또는 폴리아데닐화될 수 있고, 그리고 관심대상 세포 안으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 프로모터 서열은 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열이거나, 또는 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열의 변이일 수 있다.
여전히 다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 서열은 박테리아 또는 진핵 세포에서 시험관내 발현을 위한 프로모터 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 적합한 박테리아 프로모터는 T7 프로모터, lac 오페론 프로모터, trp 프로모터, tac 프로모터 (trp 및 lac 프로모터의 하이브리드), 잔술한 것들중 임의의 변이, 그리고 전술한 것들중 임의의 조합을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 적합한 진핵 프로모터의 비-제한적 예시들은 상기에서 열거된다. 이러한 구체예들에서, 상기 발현된 단백질은 관심대상의 세포 안으로 도입시키기 위해 정제될 수 있다.
다양한 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 DNA 구조체 안에 존재할 수 있다. 적합한 구조체에는 플라스미드 벡터, 파아지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 트랜스포존 및 바이러스 벡터 (예를 들면, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 등)가 내포된다. 한 구체예에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 안에 존재할 수 있다. 적합한 플라스미드 벡터의 비-제한적 실시예는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 그리고 이의 변이체들을 포함한다. 상기 벡터는 추가 발현 조절 서열 (예로써, 인헨서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종료 서열, 등등), 선별가능한 표지 서열 (예로써, 항생제 저항성 유전자), 복제 원점, 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 추가 정보는 "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001에서 찾아볼 수 있다.
상기 표적 엔도뉴클레아제가 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이를 포함하는 구체예들에서, 이러한 CRISPR/Cas 단백질 또는 이의 변이를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 가이드 RNAs를 인코딩하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 가이드 RNA(들)을 인코딩하는 서열은 일반적으로 관심대상의 세포에서 가이드 RNA(들)의 발현을 위하여 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하도록 연결된다. 예를 들면, 가이드 RNA(들)을 인코딩하는 DNA는 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인지되는 프로모터 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 예로는 포유류 U6, U3, H1, 그리고 7SL RNA 프로모터를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
(ii) 임의선택적 공여자 DNA 분자
일부 구체예들에서, 이 방법은 공여자 DNA 분자를 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포 안으로 도입시키는 것을 더 포함한다. 일반적으로, 상기 공여자 DNA 분자는 이중-가닥으로 된 DNA이다. 상기 공여자 DNA 분자는 선형이거나, 원형일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 공여자 DNA 분자는 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터일 수 있다.
상기 공여자 DNA 분자들은 적어도 하나의 공여자 서열을 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 공여자 DNA 분자의 공여자 서열은 내생성 또는 고유 염색체 서열의 변형된 형태일 수 있다. 예를 들면, 상기 공여자 서열은 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 서열에서 또는 이 서열 부근에서 염색체 서열의 일부분과 기본적으로 동일하지만, 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 따라서, 고유 서열에 통합 또는 교환 시에, 상기 표적화된 염색체 위치의 서열은 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 예로써, 변화는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결손, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이의 조합일 수 있다. 변형된 서열의 통합 결과로써, 세포는 상기 표적화된 염색체 서열로부터 변형된 유전자 산물을 만들 수 있다.
다른 측면들에서, 상기 공여자 DNA 분자의 공여자 서열은 외생성 서열일 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, "외생성(exogenous)" 서열이란 세포에 있어서 고유한 서열이 아니거나, 또는 서열의 고유 위치가 세포의 게놈에서 상이한 위치에 있는 서열을 말한다. 예로써, 외생성 서열은 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있는데, 이 서열은 외생성 프로모터 조절 서열에 작동가능하도록 연계될 수 있어서, 게놈 안으로 통합시에 이 세포는 통합된 서열(즉, 이식유전자)에 의해 인코드된 단백질을 발현시킬 수 있다. 대안으로, 상기 외생성 서열은 염색체 서열 안으로 통합되어, 이의 발현은 내생성 프로모터 조절 서열에 의해 조절된다. 다른 반복에서, 외생성 서열은 전사 조절 서열, 또다른 발현 조절 서열, RNA 코딩 서열, 그리고 기타등등일 수 있다. 외생성 서열이 염색체 서열로 통합되는 것을 "녹-인(knock in)"이라고 한다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 공여자 서열의 길이는 가변적이며, 가변적일 것이다. 예로써, 공여자 서열은 몇 개 뉴클레오티드에서부터 수백개 뉴클레오티드 내지 수십만개 뉴클레오티드까지 길이가 가변적일 수 있다.
전형적으로, 상기 공여자 DNA 분자 폴리뉴클레오티드에서 공여자 서열은 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 부위에서 또는 그 부분에 있는 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 서열의 측면에 있다. 예를 들면, 상기 공여자 서열은 상류(upstream) 서열과 하류(downstream) 서열 양측면에 있고, 이는 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 서열의 상류와 하류 각각에 차례로 위치한 서열에 대하여 실질적 서열 동일성을 갖는다. 이러한 서열 유사성때문에, 공여자 DNA 분자의 상류 서열 및 하류 서열은 공여자 DNA 분자와 표적화된 염색체 서열 사이에 상동성 재조합을 허용하고, 이로 인하여 공여자 서열은 염색체 서열 안으로 통합될 수 있다(또는 이와 교환될 수 있다).
본원에서 이용된 상류 서열은 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 서열의 상류 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 유사하게, 하류 서열이란 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 서열의 하류 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 구절 "실질적 서열 동일성"이란 최소한 약 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 지칭한다. 따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류 서열과 하류 서열은 상기 표적 서열에 대하여 상류 서열 또는 하류 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 구체예에서, 공여자 DNA 분자에서 상류 서열 및 하류 서열은 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 서열의 상류 또는 하류 염색체 서열과 약 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 상류 서열은 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 서열의 바로 상류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예들에서, 상류 서열은 상기 표적 서열로부터 약 100개 뉴클레오티드 상류 안에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로써, 상류 서열은 상기 표적 서열로부터 약 1 내지 약 20개, 약 21 내지 약 40개, 약 41 내지 약 60개, 약 61 내지 약 80개, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 상류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 일부 구체예들에서, 하류 서열은 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 서열의 바로 하류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예들에서, 하류 서열은 상기 표적 서열로부터 약 100개 뉴클레오티드 하류 안에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로써, 하류 서열은 상기 표적 서열로부터 약 1 내지 약 20개, 약 21 내지 약 40개, 약 41 내지 약 60개, 약 61 내지 약 80개, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 하류에 위치한 염색체 서열과 실질적 서열 동일성을 공유한다.
각 상류 서열 또는 하류 서열은 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 5000개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상류 서열 및 하류 서열은 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, 또는 5000개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 상류 서열 및 하류 서열은 약 50개 내지 약 1500개 뉴클레오티드 길이 범위일 수 있다.
(b)
세포로 전달
이 방법은 상기 표적 엔도뉴클레아제 또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 임의선택적 공여자 DNA 분자를 관심대상의 세포 안으로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 단백질 또는 단백질-핵산 복합체 (즉, 상기 표적 엔도뉴클레아제가 RNA-가이드된 CRISPR/Cas 시스템인 구체예들에서)로써 이들 세포로 전달되고, 도입될 수 있다. 다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 mRNA로써 이들 세포로 전달되고, 도입될 수 있다. 여전히 다른 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제는 DNA, 예를 들면, 발현 구조체의 일부분으로써 이들 세포로 전달되고, 도입될 수 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 상기 표적 엔도뉴클레아제가 CRISPR/Cas 시스템인 구체예들에서, 이 발현 구조체는 가이드 RNA를 인코딩하는 서열을 또한 함유할 수 있다.
상기 표적 엔도뉴클레아제 분자(들) 그리고 임의선택적 공여자 DNA 분자는 다양한 수단에 의해 세포 안으로 도입될 수 있다. 적합한 전달 수단은 미세주입, 전기천공, 초음파 천공, 유전자총법(biolistics), 인산칼슘-매개된형질 감염, 양이온성 형질감염, 리포좀 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 충격 형질감염, 뉴클레오펙션 형질감염, 자장감염(magnetofection), 리포펙션, 임팔레펙션(impalefection), 광학 형질감염, 독점적 제제-향상된 핵산 취입 및 리포솜, 면역리포솜, 비로솜 또는 인공 비리온을 통한 전달이 내포된다. 특이적 구체예들에서, 상기 표적 엔도뉴클레아제 분자(들) 그리고 임의선택적 공여자 DNA 분자는 뉴클레오펙션에 의해 세포 안으로 도입될 수 있다.
하나 이상의 표적 엔도뉴클레아제 분자와 하나 이상의 공여자 DNA 분자가 세포로 도입되는 구체예들에서, 이들 분자는 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 표적화된 절단 부위 (및 임의선택적 공여자 DNA 분자)에 특이적인 각 표적 엔도뉴클레아제 분자는 동시에 도입될 수 있다. 대안적으로, 각 표적 엔도뉴클레아제 분자, 뿐만 아니라 임의선택적 공여자 DNA 분자들은 순차적으로 도입될 수 있다.
(c)
세포 배양
이 방법은 필요할 때 발현되는 상기 표적 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열에 결합하고, 이를 절단하도록 적절한 조건하에서 이들 세포를 유지시키는 것을 더 포함한다. 염색체 서열에서 이중-가닥으로 된 브레이크는 (i) 해당 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결손, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되도록 비-상동성 단부-연결 복구 공정, 또는 (ii) 상기 공여자 DNA 분자의 공여자 서열이 표적화된 염색체 서열로 통합되거나 또는 교환되어, 해당 염색체 서열이 변형되는 상동성-지향된 복구 공정에 의해 복구될 수 있다.
일반적으로, 상기 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적합한 조건하에서 유지된다. 적합한 세포 배양 조건은 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면, Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 그리고 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306에 기술된다. 당업자는 세포 배양 방법이 당업계에 공지되어 있고, 세포 유형에 따라 달라질 수 있고, 달라질 수 있음을 인식한다. 모든 경우에 일상적인 최적화를 사용하여 특정 세포 유형에 가장 적합한 기술을 결정할 수 있다.
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 (i) 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 DNA 분자로 형질감염 후 더 높은 생존율, 그리고 (ii) 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 부모계 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집 또는 표적화된 이식유전자 통합을 갖고, 이는 상기 섹션 (I)(e)에서 상술되어 있다.
(III) 조성물
시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포를 포함하는 조성물이 또한 본원에서 제공된다. 예를 들면, 조성물은 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포와 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자를 포함할 수 있고, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자로 형질감염 후 생존률이 더 높다. 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 상기 섹션 (I)에서 상술된다. 상기 조성물은 세포 배양 배지 또는 안정화 용액을 더 포함할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고 문헌은 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 여기에서 사용된 바와 같이, 다음의 용어는 달리 명시되지 않는 한 그 의미를 갖는다.
본 개시 내용의 요소 또는 그의 바람직한 구체예(들)를 소개할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "전술한"이란 하나 또는 이상의 요소가 존재함을 의미하도록 의도된다. "포함하는(comprising)", "내포하는(including)" 및 "갖는(having)"이라는 용어는 포괄적인 것으로 의도되며, 열거된 요소 이외의 추가 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 "결핍(deficient)"이란 표적 단백질의 감소되거나 또는 검출-불가능한 수준, 또는 표적 단백질의 감소되거나 또는 검출-불가능한 활성을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "내생성 서열(endogenous sequence)"은 세포에 고유한 염색체 서열을 지칭한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "외생성(exogenous) 서열"이란 세포에 고유하지 않은 염색체 서열, 또는 상이한 염색체 위치로 이동된 염색체 서열을 지칭한다.
"공작된" 또는 "유전적으로 변형된" 세포란 유전자 발현 및/또는 게놈 구조가 변형 된 세포를 의미한다.
예를 들어, 세포는 게놈에서 인코드된 단백질의 발현을 억제하거나 또는 방해하는 간섭 물질을 포함하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, 상기 세포는 변형된 게놈을 갖도록 공작될 수 있는데, 즉, 상기 세포는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결손, 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환을 함유하도록 공작된 최소한의 염색체 서열을 함유한다.
용어 "게놈 변형" 및 "게놈 편집(editing)"이란 당해 염색체 서열이 변형되도록 특이적 염색체 서열을 변형시키는 공정을 지칭한다. 상기 염색체 서열은 적어도 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 한 개의 뉴클레오티드의 결손, 및/또는 적어도 한 개의 뉴클레오티드의 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 변형된 염색체 서열은 비활성화되어, 어떠한 산물도 만들어지지 않는다. 대안으로, 상기 염색체 서열이 변형되어, 변경된 산물이 만들어질 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, "유전자"란 유전자 서열을 코딩하는 DNA 영역 (엑손 및 인트론 포함)뿐만 아니라, 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사 된 서열에 인접하는지 여부에 관계없이, 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 해독 조절 서열, 인핸서, 사일런서(silencers), 절연체(insulators), 경계 요소, 복제 원점(replication origins), 매트릭스 부착 부위 및 유전자 좌 조절 영역을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"이종성(heterologous)"이라는 용어는 관심대상 세포 또는 종에 고유하지 않은 엔터티를 의미한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"란 선형 또는 원형 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서의 목적을 위하여, 이들 용어는 중합체의 길이의 제한으로 해석되지 않아야 한다. 이들 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체들, 뿐만아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에서 변형이 있는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 갖는데; 가령, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 수 있다. 핵산 또는 폴리 뉴클레오타이드의 뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포티오에이트, 포스포라미다이트, 포스포로디아미데이트 결합, 또는 이들의 조합에 의해 연계될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드"란 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (가령, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 그리고 우리딘), 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연 발생적 뉴클레오티드 (예로써, 이노신) 또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티에 변형의 비-제한적 예로는 아세틸기, 아미노기, 카르복실기, 카르복시메틸기, 히드록실기, 메틸기, 포스포릴기 및 티올기의 첨가 (또는 제거) 및 염기의 탄소 및 질소 원자를 다른 원자로 치환하는 것 (예를 들면, 7-데자 퓨린)을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA) 및 몰폴리노를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 호환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"이란 변형되거나 또는 편집되고, 표적화 엔도뉴클레아제가 이를 인지하고, 결합이 존재할 수 있는 충분한 조건하에서 이에 결합하는 염색체 서열의 일부를 특정하는 핵산 서열이다.
용어 "상류(upstream)" 및 "하류(downstream)"란 고정된 위치를 기준으로 핵산 서열에서의 위치를 지칭한다. 상류란 고정 위치에 비교하여 5' (즉, 당해 가닥의 5' 단부 부근)에 있는 영역을 말하며, 하류란 고정 위치에 대하여 3' (즉, 당해 가닥의 3' 단부 부근)을 지칭한다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자의 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 이에 의해 인코드된 아미노산 서열을 결정하는 것과, 그리고 이들 서열을 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 이러한 방식으로 또한 결정되며, 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성이란 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에서 각각 차례로 정확한 뉴클레오티드-대 뉴클레오티드, 또는 아미노산-대-아미노산 대응성을 말한다. 2개의 또는 그 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 이들의 동일성 백분율을 결정함으로써, 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열에 관계없이, 2 개의 서열의 동일성 백분율은 2 개의 정렬된 서열 사이의 정확하게 일치하는 수를 더 짧은 서열의 길이로 나눈 후, 100을 곱한 것이다. 예를 들면, 핵산 서열들을 위한 적절한 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763(1986)에의해 정상화된 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 이용하여 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 구현은 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공되는 "BestFit" 유틸리티 응용으로 제공된다. 서열 간의 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수로 사용되는 BLAST이다. 예로써, BLASTN 및 BLASTP는 다음의 디폴트 매개변수를 이용할 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양쪽 두 가닥; 컷오프=60; 예상=10; Matrix=BLOSUM62; 설명=50 서열; 소트 바이=HIGH SCORE; 데이터베이스=비-리던단트, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이러한 프로그램에 대한 자세한 내용은 GenBank 웹 사이트에서 찾을 수 있다. 본원에 기재된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 그 사이의 임의의 정수 값이다. 전형적으로 서열 간의 동일성 백분율은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더 바람직하게는 85-90%, 훨씬 더 바람직하게는 92%, 더더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 전술한 세포 및 방법에서 다양한 변경이 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명 및 하기 주어진 실시예에 포함된 모든 물질은 예시적인 것으로 해석되어야 되며, 이에 한정시키는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 측면을 예시한다.
실시예 1: THP-1 KO (MB21D1) 세포의 핵감염
THP-1 야생형 (wt) 또는 THP-1 KO (MB21D1)는 Amaxa 용액 V (GFP 발현 벡터를 포함) 또는 1-5μg의 DNA를 함유하는 용액 SG로 핵감염되었다. 상기 세포는 30℃에서 24 hrs, 그리고 37℃에서 24 hrs 동안 항온처리되었다. 세포 생존력은 살아있는/죽은 세포 형광 염료 (즉, DRAQ7)를 사용하여 결정되었고, 형질 감염은 GFP 형광으로 모니터링되었다. 표 1에 그 결과를 제시한다.
1μg의 DNA로 핵감염된 야생형 THP-1 세포의 생존력은 28%인 반면, 기능성 MB21D1이 없는 THP-1 세포는 동일한 핵감염 조건하에 68%의 생존력을 가졌다. 5μg의 DNA 핵감염으로 THP-1 wt 세포의 92%가 사멸되었지만, KO (MB21D1) THP-1 세포는 단지 47%만 사열되었다.
실시예 2: 다른 조혈 세포주의 핵감염
3가지 다른 조혈 세포주 (HL-60, U-937, 및 Ramos)에서 유사한 형질감염을 실행하였다. 세포에게 24 시간 냉각 충격을 가한 후, 37℃에서 24 시간 동안 처리되었다. 세포 생존력은 살아있는/죽은 세포 형광 염료 (즉, DRAQ7)를 사용하여 결정되었고, 형질 감염은 GFP 형광으로 모니터링되었다. 결과는 표 2에 제공된다.
실시예 3: THP-1 KO (MB21D1) 세포의 액틴 유전자좌로의 표적화된 통합
액틴 유전자좌를 표적으로 하는 ZFNs과 상동 서열의 측면에 형광 단백질을 포함하는 공여자 플라스미드 (2μg)를 이용하여, 이 형광 단백질의 표적화된 통합은 야생형 THP-1 세포의 액틴 유전자좌 안에서 일어날 수 있다. 그러나, 통합 속도는 매우 낮았고 (약 0.012%), 통합 성분들을 분리하기 위해 여러 번의 농축이 필요했다. THP-1 KO (MB21D1) 세포에게 액틴 ZFNs 및 형광 단백질(BFP)를 포함하는 공여자 플라스미드 (5μg)를 핵감염시켰다. MB21D1 녹-아웃 세포에서 액틴 유전자좌로의 표적화된 통합 비율은 2.23%로 급격히 증가했다. 도 1 참고.
실시예 4: THP-1 KO (MB21D1) 세포의 튜불린 유전자좌로의 표적화된 통합
반복적인 시도에도 불구하고, THP-1 세포의 튜불린 유전자좌로의 표적화된 통합은 성공하지 못했다. 그러나, THP-1 KO (MB21D1) 세포를 이용하면, 튜불린 유전자좌에서 GFP의 통합은 첫 번째 시도에서 높은 비율로 일어났다. 도 2 참고.
SEQUENCE LISTING
<110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC
<120> DOWN-REGULATION OF THE CYTOSOLIC DNA SENSOR PATHWAY
<130> P18-165PCT
<140>
<141>
<150> 62/720,726
<151> 2018-08-21
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (34)
- 표적화된 게놈 편집을 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 표적 엔도뉴클레아제 또는 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 임의선택적으로 공여자 DNA 분자를 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포로 도입시키는 것을 포함하며, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질이 결핍되거나, 또는 그 수준이 감소되도록 공작된, 방법.
- 청구항 2에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질은 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS), 인터페론 유전자 (STING)의 자극자, 인터페론 감마 유도성 단백질 16 (IFI16), DEAD-박스 헬리카제 41 (DDX41), 류신 풍부 반복부 (flightless I에서) 상호작용 단백질 (LRRFIP1), 또는 이의 조합들에서 선택되는, 방법.
- 청구항 2 또는 3에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 비활성화된 염색체 서열은 표적 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집 기술에 의해 비활성화된, 방법.
- 청구항 2 또는 3에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR 간섭 (CRISPRi) 제제를 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 클러스터된 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드롬성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연합된 (Cas) (CRISPR/Cas) 뉴클레아제 시스템, CRISPR/Cas 듀얼 닉카제 시스템, 전사 활성화제-유사 작동체 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 또는 프로그래밍가능한 DNA-결합 도메인과 뉴클레아제 도메인을 포함하는 융합 단백질에서 선택되는, 방법.
- 청구항 1 내지 7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA 또는 DNA인, 방법.
- 청구항 1 내지 8중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 공여자 DNA 분자는 상기 표적 엔도뉴클레아제에 의해 표적화된 부위에서 또는 그 부분에 있는 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 서열의 측면에 있는 공여자 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 포유류 세포인, 방법.
- 청구항 10에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 조혈 세포주인, 방법.
- 청구항 11에 있어서, 이때 상기 조혈 세포주는 THP-1, HL-60, U-937, Ramos, 또는 Jurkat에서 선택되는, 방법.
- 청구항 1 내지 12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA와 접촉되며, 그리고 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖고, 더 높은 생존율을 갖는, 방법.
- 청구항 1 내지 12중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 상기 표적 엔도뉴클레아제 또는 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA와 상기 공여자 DNA 분자에 접촉되며, 그리고 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖고, 더 높은 생존율을 갖는, 방법.
- 청구항 14 내지 17중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA와 상기 공여자 DNA 분자에 접촉되며, 그리고 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 게놈 편집을 갖고, 더 높은 생존율을 갖는, 방법.
- 청구항 13 내지 15중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 이중 가닥이며, 공여자 DNA 분자가 이중 가닥인, 방법.
- 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포에서 표적화된 이식유전자 통합을 실행하는 것을 포함하는 표적화된 이식유전자 통합을 증가시키는 방법에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 더 높은 비율의 표적화된 이식유전자 통합을 갖는, 방법.
- 청구항 17에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질이 결핍되거나, 또는 그 수준이 감소되도록 공작된, 방법.
- 청구항 18에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질은 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS), 인터페론 유전자 (STING)의 자극자, 인터페론 감마 유도성 단백질 16 (IFI16), DEAD-박스 헬리카제 41 (DDX41), 류신 풍부 반복부 (flightless I에서) 상호작용 단백질 (LRRFIP1), 또는 이의 조합들에서 선택되는, 방법.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함하는, 방법.
- 청구항 20에 있어서, 이때 상기 비활성화된 염색체 서열은 표적 엔도뉴클레아제에 의해 비활성화된, 방법.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR 간섭 (CRISPRi) 제제를 포함하는, 방법.
- 청구항 17 내지 22중 임의의 한 항에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 포유류 세포인, 방법.
- 청구항 23에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 조혈 세포주인, 방법.
- 청구항 24에 있어서, 이때 상기 조혈 세포주는 THP-1, HL-60, U-937, Ramos, 또는 Jurkat에서 선택되는, 방법.
- 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포와 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자를 포함하는 조성물에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱이 결핍되지 않은 이의 부모 세포보다 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자로 형질감염 후 생존률이 더 높은, 조성물.
- 청구항 26에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질이 결핍되거나, 또는 그 수준이 감소되도록 공작된, 조성물.
- 청구항 27에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질은 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS), 인터페론 유전자 (STING)의 자극자, 인터페론 감마 유도성 단백질 16 (IFI16), DEAD-박스 헬리카제 41 (DDX41), 류신 풍부 반복부 (flightless I에서) 상호작용 단백질 (LRRFIP1), 또는 이의 조합들에서 선택되는, 조성물.
- 청구항 27 또는 28에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 시토졸 DNA 센싱에 연루된 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 29에 있어서, 이때 상기 비활성화된 염색체 서열은 표적 엔도뉴클레아제에 의해 비활성화된, 조성물.
- 청구항 27 또는 28에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR 간섭 (CRISPRi) 제제를 포함하는, 조성물.
- 청구항 26 내지 31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 이중-가닥으로 된 외생성 DNA 분자는 표적 엔도뉴클레아제를 인코드하고, 및/또는 표적화된 통합을 위한 공여자 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 26 내지 32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 시토졸 DNA 센싱이 결핍된 세포는 포유류 세포인, 조성물.
- 청구항 33에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 조혈 세포주인, 조성물.
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