JP2023100662A - 細胞質ｄｎａセンサー経路の下方制御 - Google Patents

Abstract

【課題】標的ゲノム編集を増加させるための方法を提供する。【解決手段】標的ゲノム編集を増加させるための方法であって、一態様として、標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸および任意にドナーＤＮＡ分子を細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞に導入する工程を含み、ここで、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも標的ゲノム編集の割合が高い、方法である。【選択図】図１

Description

本開示は、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を下方制御することにより標的遺伝子編集を増加させるための方法および組成物に関する。
［０００１．１］
［配列表］
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照により組み込まれる。２０１９年８月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１８－１６５ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは３，６６５バイトである。

特定のヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲｓ／Ｃａｓ９）は、ＤＮＡの任意の位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することにより、効率的な標的ゲノム編集を促進するために使用される。ＤＳＢは、細胞の自然のＤＮＡ修復プロセスを刺激する。そのうちの一つである相同組換え（ＨＲ）修復経路は、標的領域への導入遺伝子の挿入を可能にする。ＨＲを利用するには、切断部位の両側の領域と相同な配列に隣接する導入遺伝子を含有するドナーテンプレートを使用する。このドナーは、ヌクレアーゼとともに細胞内に共に送達され（ｃｏｄｅｌｉｖｅｒ）され、切断部を修復するために姉妹染色体の代わりにドナー配列を提示して細胞を欺く。

ドナーＤＮＡ（またはその他のプラスミドＤＮＡ）の送達は、トランスフェクションやヌクレオフェクションが困難なため、多くの細胞株で問題となっている。ドナーＤＮＡの効率的な送達を必要とする場合、この「外来ＤＮＡに対する感受性」は、標的とする導入遺伝子の挿入（または標的インテグレーション）をほとんど不可能にする。部位特異的ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形で細胞に添加されてもよいため、ＤＮＡ感受性の問題を回避することができる。しかし、ドナー配列はＤＮＡ、伝統的には二本鎖ＤＮＡとして添加する必要がある。したがって、これらのトランスフェクションが困難な細胞系統において、標的ゲノム編集および標的インテグレーションを改善または可能にする方法が必要とされている。

また、標的遺伝子インテグレーションに抵抗性を示す細胞は、外来ＤＮＡに対する感受性や毒性（例えば、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションまたはヌクレオフェクション後の細胞死）を示す細胞である傾向がある。細胞は、ウイルスや細菌に由来するＤＮＡを検出する細胞質ＤＮＡセンサーを有しており、その結果、炎症反応経路が活性化される。ＤＮＡセンシングシステムに関連するタンパク質を下方制御することで、ドナーＤＮＡの導入が可能になり、これらの細胞に標的化インテグレーションできるようになると考えられる。

標的ゲノム編集を増加させるための提供または方法は、本開示の様々な態様の中のものである。この方法は、標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および任意にドナーＤＮＡ分子を細胞質ＤＮＡセンシングを欠いている細胞に導入することを含み、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞と比較して、標的ゲノム編集の割合が高い。

本開示の別の態様は、標的導入遺伝子のインテグレーションを増加させるための方法を包含する。当該方法は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞で標的導入遺伝子インテグレーションを行うことを含み、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも標的導入遺伝子のインテグレーションの割合が高い。

本開示のさらなる態様は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞と、少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子とを含む組成物であって、ここで、
前記細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞と比較して、少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子によるトランスフェクション後に高い生存率を有する組成物を提供することである。

本開示の他の態様および反復は、以下でより詳細に説明される。

図１Ａおよび１Ｂは、アクチン遺伝子座を標的としたＺＦＮとＢＦＰドナープラスミドを用いてヌクレオフェクションしたＴＨＰ－１野生型およびＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＤ２１Ｄ１）細胞のセルソーター分析を示す。

図２Ａ－２Ｄは、チューブリン遺伝子座を標的としたＺＦＮとＧＦＰドナープラスミドを用いてヌクレオフェクションしたＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＤ２１Ｄ１）細胞のセルソーター分析を示す。

本開示は、標的ゲノム編集または標的導入遺伝子のインテグレーションを増加するための方法および組成物を提供する。当該方法は、細胞が外来ＤＮＡ分子に対する感受性が低くなるように細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を下方制御することを含む。結果として、標的ゲノム編集／インテグレーションを前記細胞で行ってもよい。

（Ｉ）細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞
本明細書で開示されている方法は、外来ＤＮＡ（例えば、ドナーＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ）に対する細胞の感受性が低くなるように、細胞質ＤＮＡセンシング経路が下方制御された細胞を利用する。その結果、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞において、標的ゲノム編集の効率を向上し得る。

一般的に、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシング経路に関連する１以上のタンパク質を欠くように遺伝子工学操作されている。したがって、遺伝子工学操作された細胞は、非遺伝子工学操作親細胞と比較して、１以上の細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を欠くか、または減少したレベルを有する。１以上の細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）によって一過性にノックダウンされ得る。あるいは、標的化エンドヌクレアーゼを用いた標的遺伝子の不活性化により、１以上の細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質の発現を永続的にノックアウトすることができる。細胞質ＤＮＡセンシング経路の欠損の結果、遺伝子工学操作細胞系統は、非遺伝子工学操作親細胞系統に比べて、外来ＤＮＡに対する感受性が低く、標的ゲノム編集の割合が高い。

（ａ）細胞質ＤＮＡセンシング経路に関連するタンパク質
自然免疫系は、細胞の損傷および／または細菌もしくはウイルスの感染を示す細胞質二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を検出する細胞質ＤＮＡセンシング経路を含む。細胞質ｄｓＤＮＡは、ＤＮＡセンサーによって認識され、炎症遺伝子の活性化を引き起こすシグナル伝達経路を活性化し、それにより抗ウイルス保護、抗細菌保護、ナチュラルキラー細胞の活性化、または細胞死をもたらす。

細胞質ｄｓＤＮＡのセンサーは、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ；遺伝子シンボルはＭＢ２１Ｄ１である）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６；同遺伝子シンボル）、ＤＥＡＤ－ボックスヘリカーゼ４１（ＤＤＸ４１；同遺伝子シンボル）、ロイシンリッチリピート（フライトレスＩ中）相互作用タンパク質（ＬＲＲＦＩＰ１；同遺伝子シンボル）、ＤＮＡ依存性インターフェロン（ＩＦＮ）調節因子活性化分子（ＤＡＩ；遺伝子シンボルはＺＢＰ１である）、ＤＥＡＨ－ボックスヘリカーゼ８（ＤＨＸ９、同遺伝子シンボル）、ＤＥＡＨ－ボックスヘリカーゼ（ＤＨＸ３６；同遺伝子シンボル）、ａｂｓｅｎｔ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ２（ＡＩＭ２；同遺伝子シンボル）、Ｘ線修復交差補完タンパク質６（Ｋｕ７０；遺伝子シンボルはＸＲＣＣ６である）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ；遺伝子シンボルはＰＯＬＲ３Ａである）を含む。いくつかの細胞質ＤＮＡセンサー（例えば、ｃＧＡＳ）により活性化される下流タンパク質は、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ；遺伝子シンボルはＴＭＥＭ１７３である）である。いくつかの実施形態では、当該細胞はｃＧＡＳを欠く。他の実施形態では、当該細胞はＳＴＩＮＧを欠く。さらに他の実施形態では、当該細胞はｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧの両方を欠く。

（ｂ）細胞質ＤＮＡセンシングにおける永続的な欠損
いくつかの実施形態では、当該細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は永続的な欠損を有し得る。例えば、当該細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする少なくとも１つの不活性化染色体配列を含む。細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする前記染色体配列は、標的化エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術で不活性化され得、以下セクション（ＩＩ）で記載される。

標的化エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインはプログラム制御可能であり、異なるＤＮＡ配列を認識し結合するよう設計または遺伝子工学操作され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合は標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡ間の相互作用により媒介される。したがって、ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質遺伝子工学操作により目的のＤＮＡ配列に結合するようプログラムされ得る。他の実施形態では、ＤＮＡ結合は標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインおよび標的ＤＮＡと相互作用するガイドＲＮＡにより媒介される。かかる場合、ＤＮＡ結合ドメインは、適したガイドＲＮＡを設計することにより目的のＤＮＡ配列に標的化され得る。

適切な標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデュアルニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質を含む。標的化エンドヌクレアーゼは野生型または天然のＤＮＡ結合および／またはヌクレアーゼドメイン、天然のＤＮＡ結合および／またはヌクレアーゼドメインの改変型、合成もしくは人工ＤＮＡ結合および／またはヌクレアーゼドメイン、またはそれらの組み合わせを含み得る。

（ｉ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり得る。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域およびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー領域は約２－７ジンクフィンガー、例えば、約４－６ジンクフィンガーを含むことができ、ここで、各ジンクフィンガーは３ヌクレオチドに結合し、ジンクフィンガーは、適切なリンカー配列を使用して共に結合し得る。ジンクフィンガー領域が、任意のＤＮＡ配列を認識し結合するよう遺伝子工学操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら．（２００２） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０：１３５－１４１； Ｐａｂｏら．（２００１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：３１３－３４０； Ｉｓａｌａｎら．（２００１） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：６５６－６６０； Ｓｅｇａｌら．（２００１） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：６３２－６３７； Ｃｈｏｏら．（２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １０：４１１－４１６； Ｚｈａｎｇら．（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（４３）：３３８５０－３３８６０； Ｄｏｙｏｎら．（２００８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：７０２－７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏら．（２００８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０５：５８０９－５８１４を参照されたい。ＤＮＡ配列における可能性のある標的部位を識別するための、並びにジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、公的に入手可能なウェブ系ツールは、当該技術分野で公知である。

ＺＦＮはまた、ヌクレアーゼドメインを含み、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。ヌクレアーゼドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むがこれらに限られない。切断ドメインは、切断活性に二量体化を必要とする酵素またはその部分に由来してもよい。各ヌクレアーゼは、活性酵素二量体のモノマーを含むため、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが切断に必要とされてもよい。２つの切断モノマーが使用され活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位は一般的に、２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼの個々の認識部位への当該２つのＺｎフィンガーヌクレアーゼの結合により、当該切断モノマーが活性酵素二量体を例えば二量体化によって当該切断モノマーに形成させるできるような空間的な向きとなるよう配置される。結果として、認識部位の近縁部は、約５－約１８ヌクレオチド離れていてもよい。例えば、近縁部は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチド離れていてもよい。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩ－Ｓ型制限エンドヌクレアーゼに由来し得る。ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼは、認識／結合部位から典型的には数塩基対離れた部位のＤＮＡを切断し、そのため、分離可能な結合および切断ドメインを有する。これらの酵素は概して一時的に会合して二量体を形成し、ねじれた位置でＤＮＡの各鎖を切断するモノマーである。適切なＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼの非限定例はＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であり得る。ＩＩ－Ｓ型ヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促進するよう改変され得る。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、特定のアミノ酸残基を変異させることにより改変され得る。非限定例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミン酸残基が改変についての標的である。例えば、１の改変ＦｏｋＩドメインはＱ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ変異を含み得、その他の改変ＦｏｋＩドメインはＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ変異を含み得る。

ＺＦＮは、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含むことができる。核移行シグナルの非限定例はＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）、ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号２）、またはＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３）を含む。適切な細胞透過ドメインの例は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４）、ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）、ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７）、またはＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号８）を含むがこれらに限定されない。マーカードメインの非限定例は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ等）、および精製またはエピトープタグ（例えば、６ｘＨｉｓ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＧＳＴなど）を含む。核移行シグナル、細胞透過ドメイン、および／またはマーカードメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはタンパク質の内部位置に位置し得る。

（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム
他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ－ガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムであり得、ＤＮＡに二本鎖切断を導入する。当該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型（すなわち、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、またはＩＦ）、ＩＩ型（すなわち、ＩＩＡ、ＩＩＢ、またはＩＩＣ）、ＩＩＩ型（すなわち、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、種々の細菌およびアーキアに存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｓｐ．、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｓｐ．、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｓｐ．、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐ．、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｓｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、またはＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｓｐ由来であり得る。

適切なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの非限定例は、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆタンパク質、Ｃｍｒタンパク質、Ｃｓａタンパク質、Ｃｓｂタンパク質、Ｃｓｃタンパク質、Ｃｓｅタンパク質、Ｃｓｆタンパク質、Ｃｓｍタンパク質、Ｃｓｎタンパク質、Ｃｓｘタンパク質、Ｃｓｙタンパク質、Ｃｓｚタンパク質、およびそれらの誘導体もしくはバリアントを含む。具体的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型Ｃｐｆ１タンパク質、またはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であり得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であり得る。代替的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）であり得る。さらに他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）であり得る。

概して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含み、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼはまた、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得、かつＣｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣ様ドメインを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼまた、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、並びに他のドメインを含むことができる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過ドメイン、マーカードメイン、および／または検出可能なラベルをさらに含むことができ、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムはまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼと相互作用してＤＮＡの標的部位に誘導する。当該標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に隣接することを除いて制限はない配列を有する。例えば、Ｃａｓ９のＰＡＭ配列は、３’－ＮＧＧ、３’－ＮＧＧＮＧ、３’－ＮＮＡＧＡＡＷ、および３’－ＡＣＡＹを含み、かつＣｐｆ１のＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＮを含む（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＹはＣまたはＴのいずれかとして定義される）。各ｇＲＮＡは、標的配列に相補的な配列を含む（例えば、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡはＧＮ１７－２０ＧＧを含み得る）。ｇＲＮＡはまた、ステムループ構造および一本鎖領域を形成するスキャフォールド配列を含むことができる。スキャフォールド領域は、全ｇＲＮＡにおいて同じであり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一分子（すなわち、ｓｇＲＮＡ）であり得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡは２つの別個の分子であり得る。

（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム
他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓニッカーゼシステムはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼがＤＮＡの一本鎖だけを切断するよう改変されていることを除いて上記で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと同様である。したがって、単一ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓニッカーゼシステムはＤＮＡに一本鎖切断またはニックを作成する。あるいは、一対のオフセットｇＲＮＡを含む対のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼシステム（またはデュアルニッカーゼシステム）はＤＮＡの反対側の鎖に密接に間隔をあけた鎖の一本鎖切断を生成することによりＤＮＡに二本鎖切断を作成できる。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、１以上の変異および／または欠失によりニッカーゼに変換され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼはヌクレアーゼドメインの１つにおいて１以上の変異を含み得る、ここで、１以上の変異は、ＲｕｖＣ様ドメインのＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａであり得、または１以上の変異は、ＨＮＨ様ドメインのＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａおよび／またはＮ８６３Ａであり得る。

（ｉｖ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ
代替的な実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり得る。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに結合している転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥｓ）に由来する高度に保存された繰り返しから構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥｓは植物病原体であるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）により分泌されるタンパク質で、宿主植物細胞内の遺伝子の転写を変化させる。ＴＡＬＥのリピート配列は、目的の任意のＤＮＡ配列を標的化するようモジュール化タンパク質設計を介して遺伝子工学操作され得る。ＴＡＬＥＮｓのヌクレアーゼドメインは、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述されるように任意のヌクレアーゼドメインであり得る。具体的な実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩに由来する（Ｓａｎｊａｎａら．， ２０１２， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ７（１）：１７１－１９２）。

ＴＡＬＥＮはまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過ドメイン、マーカードメイン、および／または検出可能なラベルを含むことができ、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述される。

（ｖ）メガヌクレアーゼまたはレアカッティングエンドヌクレアーゼ
さらに他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。メガヌクレアーゼは、長い認識配列、すなわち概して約１２塩基対から約４５塩基対に及ぶ認識配列、を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。この要件の結果として、認識配列は概して、任意の所与のゲノム中にたった１回生じる。メガヌクレアーゼのうち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧという名のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムおよびゲノム操作の研究のための価値のあるツールとなってきた。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、またはそのバリアントであり得る。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技術を用いてその認識配列を改変することによって具体的な染色体配列を標的とすることができる。

代替的な実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはその誘導体であり得る。レアカッティングエンドヌクレアーゼは部位特異的エンドヌクレアーゼであり、その認識配列はゲノムにおいてめったに生じず、好ましくはゲノムに一度だけ生じる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、７－ヌクレオチド配列、８－ヌクレオチド配列、またはそれより長い認識配列を認識してもよい。レアカッティングエンドヌクレアーゼの非限定例は、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｂｆＩ、およびＦｓｅＩを含む。

メガヌクレアーゼまたはレアカッティングエンドヌクレアーゼはまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過ドメイン、マーカードメイン、および／または検出可能なラベルを含むことができ、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述される。

（ｖｉ）ヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質
さらに追加的な実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインおよびプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質であり得る。ヌクレアーゼドメインは、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述される任意のもの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ様もしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインまたはＣｐｆ１のヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼまたはレアカッティングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインであり得る。

融合タンパク質のプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインは、全ヌクレアーゼ活性を欠くよう改変されている（すなわち、触媒作用的に不活性である）標的化エンドヌクレアーゼ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ）に由来し得る。あるいは、融合タンパク質のプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥなどのプログラム制御可能なＤＮＡ結合タンパク質であり得る。

いくつかの実施形態では、プログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失により除去された触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼであり得る。例えば、触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインがＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、かつＨＮＨ様ドメインがＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａおよび／またはＮ８６３Ａ変異を含む触媒作用的に不活性な（死）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。あるいは、触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、当該ヌクレアーゼドメインにおいて同等な変異を含む触媒作用的に不活性な（死）Ｃｐｆ１タンパク質であり得る。他の実施形態では、プログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失により除去された触媒作用的に不活性なメガヌクレアーゼであり得、例えば、当該触媒作用的に不活性なメガヌクレアーゼがＣ末端トランケーションを含み得る。

ヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質はまた、少なくとも１つの核移行シグナル、細胞透過ドメイン、マーカードメイン、および／または検出可能なラベルを含むことができ、セクション（Ｉ）（ｂ）（ｉ）で上述される。

（ｃ）細胞質ＤＮＡセンシングにおける一時的な欠損
他の実施形態では、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は一時的な欠損を有し得る。例えば、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質の発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）により一時的にノックダウンされ得る。そのため細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質の転写産物（ｍＲＮＡ）に標的化されたＲＮＡｉ剤または細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする染色体ＤＮＡ配列に標的化されたＣＲＩＳＰＲｉ剤を含み得る。

（ｉ）ＲＮＡｉ
ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡｉ剤が、転写産物の切断により、または転写産物からタンパク質への翻訳を中断させることにより、標的転写産物の発現を阻害するプロセスを指す。ＲＮＡｉ剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。概して、ｓｉＲＮＡは、約１５－約２９ヌクレオチド長に及ぶ二本鎖ＲＮＡ分子、またはより一般的には約１９－約２３ヌクレオチド長に及ぶ二本鎖ＲＮＡ分子を含む。具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは長さ約２１ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは任意に、１つまたは２つの一本鎖オーバーハング、例えば３’オーバーハングを片側または両方の末端にさらに含むことができる。ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成することができ、あるいは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から生成することができる（下記参照）。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は完全に相補的であり得、それによりミスマッチもバルジもこの２つの配列間に形成される二重鎖において存在しない。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの２つの鎖は実質的に相補的であり得、それにより１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジが、この２つの配列間に形成される二重鎖において存在する。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡの５’末端の片側または両方はリン酸基を有しているのに対し、他の実施形態において、５’末端の片側または両方はリン酸基を欠失している。

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と呼ばれる当該ｓｉＲＮＡの１つの鎖には、標的転写産物とハイブリダイズする部分を含む。いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は標的転写産物の領域と完全に相補的であることができ、すなわち、当該アンチセンス鎖は、当該ｓｉＲＮＡの長さに渡って単一のミスマッチまたはバルジがなく標的転写産物へハイブリダイズする。他の実施形態において、当該アンチセンス鎖は、標的領域と実質的に相補的であることができ、すなわち、１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジは、当該アンチセンス鎖および標的転写産物によって形成される二重鎖において存在することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは、標的転写産物のエキソン配列を標的としている。当業者は、標的転写産物についてのｓｉＲＮＡを設計するプログラム、アルゴリズム、および／または市販のサービスに精通している。

概して、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を媒介するのに十分な長さの二本鎖構造を形成するようハイブリダイズしたまたはハイブリダイズすることのできる少なくとも２つの相補的な部分と、当該二重鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分とを含むＲＮＡ分子である。当該構造は、ステムループ構造とも呼ぶことができ、当該ステムは二重鎖部分である。いくつかの実施形態において、当該構造の二重鎖部分は完全に相補的であることができ、それにより当該ｓｈＲＮＡの二重鎖領域にミスマッチまたはバルジがない。他の実施形態において、当該構造の二重鎖部分は実質的に相補的であることができ、それにより１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジは当該ｓｈＲＮＡの二重鎖部分において存在することができる。当該構造のループは、長さ約１～約２０ヌクレオチド、具体的には長さ約６～約９ヌクレオチドであり得る。当該ループは、当該標的転写産物（すなわち、当該ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）に相補的な領域の５’末端または３’末端のいずれかに存在することができる。

ｓｈＲＮＡは、５’または３’末端にオーバーハングをさらに含むことができる。任意のオーバーハングは、約１－約２０ヌクレオチド長、またはより具体的には約２－約１５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、オーバーハングは１以上のＵ残基、例えば、約１－約５Ｕ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡの５’末端はリン酸基を有することができる。概して、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉマシナリーによってｓｉＲＮＡへとプロセシングされる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、ｓｈＲＮＡの部分と相補的な標的転写産物（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の発現を同様に阻害することができる。当業者は、ｓｈＲＮＡの設計および合成のための利用可能な資源に精通している。例示的な例は、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＲＮＡとして細胞に導入され得る。あるいは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、発現コンストラクトからインビボで発現させることができる。適切なコンストラクトは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を含む。一実施形態において、当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらのバリアント）であることができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、２つのプロモーター制御配列を含むことができ、ここで、各々は、２つの別個の相補的ｓｉＲＮＡ鎖が転写可能となるよう作動可能に連結された適切なコード配列である。当該２つのプロモーター制御配列は、同じ向きにまた逆向きであり得る。別の実施形態において、当該ＲＮＡｉ発現ベクターは、転写産物がｓｈＲＮＡを形成するように２つの相補的領域を含む単一ＲＮＡ分子の転写を駆動するプロモーター制御配列を含有することができる。概して、当該プロモーター制御配列は、Ｕ６またはＨ１プロモーターのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモーターであるだろう。他の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター制御配列が使用され得る。ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、転写終結配列、選択可能なマーカー配列などのような、追加的な配列エレメントを含有することができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、標準的な手順を用いて、目的の細胞系統へと導入することができる。当該ＲＮＡｉ発現コンストラクトは、安定した発現のために当該細胞株において染色体に組み込むことができる。ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ発現ベクターは、当業者に周知の方法を使用して前記細胞に導入され得る（例えば、以下のセクション（ＩＩ）（ｂ）を参照されたい）。

（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲｉ
ＣＲＩＳＰＲ干渉は、遺伝子発現がゲノムＤＮＡの標的部位への触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの結合により阻害されるプロセスを指す（ＣＲＩＳＰＲｉ）。ＣＲＩＳＰＲｉ剤は、全ヌクレアーゼ活性が変異および／または欠失により除去された触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼを含む。例えば、触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ様ドメインが、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ変異を含み、かつＨＮＨ様ドメインが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａおよび／またはＮ８６３Ａ変異を含む触媒作用的に不活性な（死）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり得る。いくつかの実施形態では、触媒作用的に不活性な（死）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、転写リプレッサードメインと融合され得る。適切な転写リプレッサードメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ－関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサー、およびＭｅＣＰ２を含む。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのガイドＲＮＡは細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする染色体配列における標的化された部位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的化する。例えば、ガイドＲＮＡは触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは転写開始が抑制されるようにプロモーター領域における標的部位に触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的化できる。あるいは、ガイドＲＮＡは転写伸長が抑制されるように遺伝子の転写領域の標的化部位に触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的化できる。

ＣＲＩＳＰＲｉ剤は、タンパク質－ＲＮＡ複合体として細胞に導入され得る。他の実施形態では、触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質をコードする核酸（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、ガイドＲＮＡと共に細胞に導入され得る。さらに他の実施形態では、触媒作用的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ発現コンストラクトが、細胞に導入され得る。当業者はＣＲＩＳＰＲｉ剤またはＣＲＩＳＰＲｉ剤をコードする核酸を導入する手段に精通している（例えば、以下のセクション（ＩＩ）（ｂ）を参照されたい）。

（ｄ）細胞タイプ
概して、当該細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、哺乳動物細胞であり、または、より具体的には哺乳動物細胞系統である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞系統は、造血細胞系統である。適切な造血細胞系統の非限定例は、ＴＨＰ－１（ヒト単球細胞）、ＨＬ－６０（ヒト前骨髄球性白血病細胞）、Ｕ－９３７（ヒトマクロファージ細胞）、Ｒａｍｏｓ（ヒトバーキットリンパ腫細胞）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴリンパ球細胞）、Ｄａｕｄｉ（ヒトＢリンパ芽球細胞）、ＩＭ－９（ヒトＢリンパ芽球細胞）、ＡＲＨ－７７（ヒトＢリンパ芽球細胞）、ＲＰＭＩ８２２６（ヒトＢリンパ球細胞）、ＭＣ／ＣＡＲ（ヒトＢリンパ球細胞）、ＲＰＭＩ １７８８（ヒトＢリンパ球）、ＴＦ－１（ヒト赤芽球細胞）、Ｋ５６２（ヒト骨髄性白血病細胞）、ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ細胞）、ＲＢＬ（ラットＢリンパ腫細胞）、ＤＨ８２（ラット単球／マクロファージ細胞）、ＮＳ０（マウス骨髄腫細胞）、またはＳＰ２／０（マウス骨髄腫細胞）を含む。追加的な実施形態では、当該細胞系統は、造血幹細胞系統であり得る。

他の実施形態では、哺乳動物細胞系統は、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚部癌細胞）、Ｗ１３８（ヒト肺細胞）、Ｈｅｐ Ｇ２（ヒト肝細胞）、Ｕ２－ＯＳ（ヒト骨肉腫細胞），Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮細胞）、Ａ－４３１（ヒト癌腫細胞）、ＣＯＳ７（サル腎臓ＳＶ－４０トランスフォームド線維芽細胞）、ＣＶＩ－７６（サル腎細胞）、ＶＥＲＯ－７６（アフリカミドリザル腎細胞）、ＣＭＴ（イヌ乳腺細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎細胞）、９Ｌ（ラット神経膠芽腫細胞）、Ｂ３５（ラット神経芽腫細胞）、ＨＴＣ（ラット肝細胞癌細胞）、ＢＲＬ ３Ａ（バッファローラット肝細胞）、Ｄ１７（ラット骨肉腫細胞）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞）、Ａ２０（マウスＢリンパ腫細胞）、Ｂ１６（マウスメラノーマ細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞）、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２（マウス胚性間葉系細胞）、ＣＴ２６（マウス癌細胞）、ＤｕＣｕＰ（マウス前立腺細胞）、ＥＭＴ６（マウス胸細胞）、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７（マウス肝細胞癌細胞）、Ｊ５５８２（マウス骨髄腫細胞）、ＭＴＤ－１Ａ（マウス上皮細胞）、ＭｙＥｎｄ（マウス心筋細胞）、ＲｅｎＣａ（マウス腎細胞）、ＲＩＮ－５Ｆ（マウス膵臓細胞）、Ｘ６４（マウスメラノーマ細胞）、ＹＡＣ－１（マウスリンパ腫細胞）であり得る。

具体的な実施形態では、当該細胞系統は、ＴＨＰ－１、ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、Ｒａｍｏｓ、またはＪｕｒｋａｔ細胞系統である。

（ｅ）細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞の特性
細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞と比較して外来ＤＮＡの毒性効果への感受性が低い。いくつかの実施形態では、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子でのトランスフェクション後に高い生存率を有する。生存率は、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約４００％、または約４００％より多く増加し得る。

他の実施形態では、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも標的ゲノム編集または標的導入遺伝子インテグレーションを高い割合で有する。ゲノム編集または標的化インテグレーションの割合は、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約４００％、または約４００％より多く増加し得る。

細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞と同等の増殖割合を有する。

（ＩＩ）標的ゲノム編集の効率を増加させる方法
本開示のさらなる態様は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞で標的ゲノム編集を行うことにより標的ゲノム編集（例えば、導入遺伝子インテグレーション）の効率を増加させる方法を包含する。細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は外来ＤＮＡへの感受性が低いため、当該細胞は細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも標的ゲノム編集の割合が高い。

（ａ）方法のための試薬
当該方法は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞に標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸ならびに任意にドナーＤＮＡ分子を導入することを含む。細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は上記でセクション（Ｉ）に記載される。標的化エンドヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデュアルニッカーゼシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質であり得、上記でセクション（Ｉ）（ｂ）で詳述される。標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸および任意のドナーＤＮＡ分子は以下で詳述される。

（ｉ）標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸
標的化エンドヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡまたはＤＮＡは、目的の哺乳動物細胞におけるタンパク質への効率的な翻訳に最適化されたコドンであり得る。コドン最適化プログラムは、フリーウェアとして、または商用ソースから入手可能である。いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡは、５’キャップのおよび／または３’ポリアデニル化されたものであり得る。他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡであり得る。概して、標的エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは二本鎖ＤＮＡである。コーディングＤＮＡは、プロモーター制御配列、ポリアデニレーションシグナル（例えば、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡシグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ｐｏｌｙＡシグナル等）、および／または転写終結配列に作動可能に結合され得る。

いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、目的の哺乳動物細胞における発現のプロモーター制御配列に作動可能に結合され得る。プロモーター制御配列は、恒常的な、制御された、または細胞－もしくは組織特異的なものであり得る。適切な恒常的プロモーター制御配列には、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子（ＥＤ１）－アルファプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらのフラグメント、または上述のいずれかの組み合わせを含むが、それらに限定されない。適切な調節型プロモーター制御配列の例としては、熱ショック、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって調節されるものが含まれるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターの非限定例としては、Ｂ２９プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター、デスミンプロモーター、エラスターゼ１プロモーター、エンドグリンプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＮｐｈｓＩプロモーター、ＯＧ－２プロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、およびＷＡＳＰプロモーターが挙げられる。当該プロモーター制御配列は、野生型であることができ、または当該プロモーター配列はより効率的または効果的な発現のために改変することができる。

他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、インビトロｍＲＮＡ合成のファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に作動可能に結合され得る。かかる実施形態では、インビトロ－転写ＲＮＡは、精製され、キャップされ、および／またはポリアデニル化され、目的の細胞に導入され得る。例えば、プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列またはＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列の変種であり得る。

さらに他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列は、細菌または真核細胞におけるインビトロ発現のプロモーター配列に作動可能に結合され得る。適切な細菌プロモーターは、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターのハイブリッドである）、前述のいずれかの変種、および前述のいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定されない。適切な真核生物プロモーターの非限定例は、上記で列挙されている。かかる実施形態では、発現したタンパク質は、目的の細胞への導入のために精製され得る。

様々な実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、ＤＮＡコンストラクトに存在し得る。適切なコンストラクトは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ－染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）を含む。一実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡはプラスミドベクターに存在する。適切なプラスミドベクターの非限定例は、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、およびそれらのバリアントを含む。当該ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能なマーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点、およびこれらに類するものを含むことができる。追加の情報は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３または「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，第３版、２００１において認めることができる。

標的化エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはそれらのバリアントを含む実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質またはそれらのバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターは、１以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をさらに含むことができる。ガイドＲＮＡをコードする配列は概して、目的の細胞におけるガイドＲＮＡの発現についての少なくとも１つの転写制御配列に作動可能に結合される。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に作動可能に結合され得る。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、および７ＳＬ ＲＮＡプロモーターを含むがこれらに限られない。

（ｉｉ）任意のドナーＤＮＡ分子
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞にドナーＤＮＡ分子を導入することをさらに含む。概して、ドナーＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡである。ドナーＤＮＡ分子は、線状または環状であり得る。いくつかの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、ベクター、例えば、プラスミドベクターであり得る。

ドナーＤＮＡ分子は、少なくとも１つのドナー配列を含む。いくつかの態様では、ドナーＤＮＡ分子のドナー配列は、内因性または天然の染色体配列の改変された型であり得る。例えば、ドナー配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列で、または標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列の近くで染色体配列の部分に本質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。したがって、インテグレーションまたは天然配列との交換の際に、標的化された染色体位置の配列は、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。例えば、変化は、１以上のヌクレオチドの挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１以上のヌクレオチドの置換、またはそれらの組み合わせであり得る。改変配列のインテグレーションの結果として、当該細胞は標的染色体配列から改変遺伝子産物を産生し得る。

他の態様では、ドナーＤＮＡ分子のドナー配列は、外来配列であり得る。本明細書で使用する場合、「外来」配列は、当該細胞に天然ではない配列、または天然の位置が当該細胞のゲノムの異なる位置の配列を指す。例えば、外来配列はタンパク質コーディング配列を含み得、ゲノムへのインテグレーションの際に、当該細胞がインテグレートされた配列（すなわち、導入遺伝子）によりコードされたタンパク質を発現できるように外来プロモーター制御配列に作動可能に結合され得る。あるいは、外来配列は、その発現が内因性プロモーター制御配列により制御されるように染色体配列にインテグレートされ得る。他の反復では、外来配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコーディング配列等であり得る。染色体配列への外来配列のインテグレーションは、ノックインと呼ばれる。

当業者が理解できるように、ドナー配列の長さは変化することができ、また変化するであろう。例えば、ドナー配列は、数個のヌクレオチドから数百個のヌクレオチド、数十万個のヌクレオチドまで、長さが変化し得る。

典型的には、ドナーＤＮＡ分子ポリヌクレオチド中のドナー配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化されている部位または標的化エンドヌクレアーゼにより標的化されている部位の近くの配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列に隣接する。例えば、ドナー配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列の上流および下流にそれぞれ位置する配列と実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に隣接し得る。これらの配列の類似性のために、ドナーＤＮＡ分子の上流および下流配列は、ドナー配列が染色体配列にインテグレーション（または染色体配列と交換）され得るように、ドナーＤＮＡ分子と標的染色体配列との間の相同組換えを可能にする。

本明細書で使用される上流配列とは、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流配列とは、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で使用する場合、「実質的な配列同一性」という表現は、少なくとも約７５％配列同一性を有する配列を指す。したがって、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は標的配列の上流または下流の配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有し得る。例示的な実施形態では、ドナーＤＮＡ分子における上流および下流配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列の上流または下流の染色体配列と約９５％または１００％配列同一性を有し得る。

いくつかの実施形態では、上流配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド上流以内に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、上流配列は標的配列から約１－約２０、約２１－約４０、約４１－約６０、約６１－約８０、または約８１－約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形態では、下流配列は、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化された配列のすぐ下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流配列は、標的配列から約百（１００）ヌクレオチド下流以内に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。したがって、例えば、下流配列は標的配列から約１－約２０、約２１－約４０、約４１－約６０、約６１－約８０、または約８１－約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。

各上流または下流配列は約２０ヌクレオチド－約５０００ヌクレオチド長に及び得る。いくつかの実施形態では、上流および下流配列は約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。具体的な実施形態では、上流および下流配列は約５０－約１５００ヌクレオチド長に及び得る。

（ｂ）細胞への送達
当該方法は、目的の細胞への標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸ならびに任意のドナーＤＮＡ分子を導入することを含む。いくつかの実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼはタンパク質として、またはタンパク質－核酸複合体（すなわち、標的化エンドヌクレアーゼがＲＮＡ－ガイドＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである実施形態）として、細胞に送達および導入され得る。他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼはｍＲＮＡとして細胞に送達および導入され得る。さらに他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼはＤＮＡとして、例えば、発現コンストラクトの一部として、細胞に送達および導入され得る。上述のように、標的化エンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである実施形態では、発現コンストラクトはまた、ガイドＲＮＡをコードする配列を含有し得る。

標的化エンドヌクレアーゼ分子および任意のドナーＤＮＡ分子は、様々な手段により細胞に導入され得る。適切な送達手段には、微量注入法、電気穿孔法、超音波穿孔法（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション、光トランスフェクション、独自の薬剤により増強した核酸の取り込み、ならびにリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、もしくは人工ビリオンを介した送達を含む。具体的な実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼ分子および任意のドナーＤＮＡ分子は、ヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。

２以上の標的化エンドヌクレアーゼ分子および２以上のドナーＤＮＡ分子が細胞に導入される実施形態では、当該分子は、同時にまたは連続して導入され得る。例えば、それぞれが標的化された切断部位に特異的な標的化エンドヌクレアーゼ分子（および任意のドナーＤＮＡ分子）は、同時に導入され得る。あるいは、各標的化エンドヌクレアーゼ分子、並びに任意のドナーＤＮＡ分子は、連続して導入され得る。

（ｃ）細胞培養
当該方法は、必要であれば発現する標的化エンドヌクレアーゼが標的染色体配列に結合し、切断するような適した条件下で細胞を維持することをさらに含む。染色体配列における二本鎖切断は、（ｉ）染色体配列が少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換により改変されるように非相同的末端結合修復過程により修復され得、または（ｉｉ）ドナーＤＮＡ分子のドナー配列が、染色体配列が改変されるように標的染色体配列にインテグレートされ得るか、または標的染色体配列と交換され得るように、相同組換修復過程により修復され得る。

概して、当該細胞は、細胞増殖および／または維持に適した条件下で維持される。適切な細胞培養条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏら（２００８）ＰＮＡＳ １０５：５８０９～５８１４、Ｍｏｅｈｌｅら（２００７）ＰＮＡＳ １０４：３０５５～３０６０、Ｕｒｎｏｖら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６～６５１、およびＬｏｍｂａｒｄｏら（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９８～１３０６において説明されている。当業者は、細胞培養方法が当該技術分野で公知でありかつ細胞タイプに応じて種々であろうことを認識している。所定の最適化は、すべての場合において、特定の細胞タイプについての最良の技術を判断するために使用してもよい。

上記でセクション（Ｉ）（ｅ）で詳述されるように、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子でのトランスフェクション後に高い生存率、および（ｉｉ）標的ゲノム編集または標的導入遺伝子インテグレーションの高い割合を有する。

（ＩＩＩ）組成物
細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞を含む組成物もまた、本明細書中で提供される。例えば、組成物は細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞および少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子を含み得、ここで細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は、少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子でのトランスフェクション後に、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも高い生存率を有する。細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞は上記でセクション（Ｉ）で詳述される。当該組成物は、細胞培養培地または安定化剤をさらに含むことができる。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野における当業者によって通常理解される意味を有している。以下の参考文献、すなわち、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、１９９４）、Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）、Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）は、本発明において使用する用語の多くの一般的な定義を当業者に提供している。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、当該用語に帰する意味を有している。

本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、当該要素のうちの１つ以上があることを意味するよう企図している。用語「ｃｏｍｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」および「ｈａｖｉｎｇ」は、包括的であるよう企図されており、列挙した要素以外の追加の要素があるかもしれないことを意味している。

本明細書で使用する場合、「欠く」は、標的となるタンパク質の低下したもしくは検出不可能なレベル、または標的となるタンパク質の低下したもしくは検出不可能な活性を指す。

本明細書で使用する場合、「内因性配列」という用語は、その細胞特有の染色体配列を指す。

「外来配列」という用語は、その細胞特有ではない染色体配列、または異なる染色体位置へ移動した染色体配列を指す

「遺伝子工学操作された」または「遺伝的に改変された」細胞とは、遺伝子発現および／またはゲノム構造が、改変されている細胞を指す。例えば、当該細胞は、ゲノムにおいてコードされたタンパク質の発現を抑制または破壊する干渉剤を含むよう遺伝子工学操作され得る。あるいは、当該細胞は、改変されたゲノムを有するよう遺伝子工学操作され得る。すなわち、当該細胞は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含有するよう遺伝子工学操作された少なくとも１つの染色体配列を含有する。

「ゲノム改変」および「ゲノム編集」という用語は、染色体配列が改変されるよう具体的な染色体配列が変化する方法を指す。染色体配列は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、および／または少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含むよう改変されてもよい。改変された染色体配列は、生成物が作られないよう不活性化されている。あるいは、染色体配列は、変化した生成物が生成されるよう改変されてもよい。

「遺伝子」は、本明細書で使用する場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エキソンおよびイントロンを含む）、並びに遺伝子産物の生成を、調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわらず、調節するすべてのＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、終結因子、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域のような翻訳調節配列を含むが、これらに必ずしも限定されない。

「異種性の」という用語は、目的の細胞または種に特有ではない実体を指す。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、線状または環状の構造のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されることにはなっていない。当該用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分および／またはリン酸部分において改変されたヌクレオチドを包含できる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有しており、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対形成するであろう。核酸またはポリヌクレオチドのヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホチオエート、ホスホラミダイト、ホスホロジアミダート結合、またはこれらの組み合わせによって連結され得る。

「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジン）またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体は、改変されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基または改変されたリボース部分を有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド（例えば、イノシン）または非天然ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖部分または塩基部分に関する改変の非限定例としては、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、並びに当該塩基の炭素原子および窒素原子と他の原子（例えば、７－デアザプリン）との置換が挙げられる。ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含む。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために相互交換可能に使用する。

本明細書で使用する場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、改変または編集されることになっている染色体配列の一部を定義する核酸配列を指し、結合のための十分な条件が存在することを条件として当該配列に対して標的化エンドヌクレアーゼが認識し、結合するよう操作されている。

「上流」および「下流」という用語は、固定した位置に対する核酸配列における位置を指す。上流は、当該位置に対して５’（すなわち、鎖の５’末端近く）である領域を指し、下流は、当該位置に対して３’（すなわち、鎖の３’末端近く）である領域を指す。

核酸およびアミノ酸配列同一性の判定技術は、当該技術分野で公知である。典型的には、このような技術には、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を判定し、および／またはコードしたアミノ酸配列を判定し、それによりこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこの様式で判定および比較することができる。概して、同一性は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれの実際のヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、これらの％同一性を判定することによって比較することができる。２つの配列の％同一性は、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、短い方の配列の長さによって除して１００を乗じた２つの整列した配列間の実際のマッチの数である。核酸配列についての適切な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２～４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ 付録３：３５３～３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５～６７６３（１９８６）によって標準化されたスコア化マトリックスを用いることによってアミノ酸配列へ適用することができる。配列の％同一性を判定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおける遺伝学コンピュータグループ（ウィスコンシン州マディソン市）によって提供される。配列間の％同一性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは概して、当該技術分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムはＢＬＡＳＴであり、既定パラメータを用いて使用する。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の既定パラメータ、すなわち、遺伝暗号＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ値＝６０、予測値＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０配列、選択基準＝ハイスコア、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用することができる。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋウェブサイトにおいて認めることができる。本明細書に説明する配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％～１００％およびこの間の任意の整数値である。典型的には、配列間の％同一性は少なくとも７０～７５％、好ましくは８０～８２％、より好ましくは８５～９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

種々の変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、上記の細胞および方法においてなされ得るので、先の説明および以下に付与する実施例に含まれる事項はすべて、実例と居て解釈すべきであり、限定的な意味において解釈すべきではないことは企図されている。

以下の実施例は、本発明のある特定の態様を説明する。

実施例１：ＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）細胞のヌクレオフェクション
ＴＨＰ－１野生型（ｗｔ）またはＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）をＡｍａｘａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（ＧＦＰ発現ベクターを含む）または１－５μｇのＤＮＡを含有するｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＧでヌクレオフェクションした。当該細胞を２４時間３０℃および２４時間３７℃でインキュベートした。細胞生存は生／死細胞蛍光色素（すなわち、ＤＲＡＱ７）を使用して決定し、トランスフェクションはＧＦＰ蛍光によりモニターした。結果は以下の表１に示される。

１μｇのＤＮＡでヌクレオフェクションした野生型ＴＨＰ－１細胞は２８％の生存を有していたが、ＭＢ２１Ｄ１の機能がないＴＨＰ－１細胞は同じヌクレオフェクション条件下で６８％の生存を有していた。５μｇのＤＮＡのヌクレオフェクションは９２％のＴＨＰ－１ ｗｔ細胞を殺滅したが、ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）ＴＨＰ－１細胞では４７％だけであった。

実施例２：他の造血細胞系統のヌクレオフェクション
同様のトランスフェクションを３つの他の造血細胞系統（ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、およびＲａｍｏｓ）で行った。当該細胞を２４時間コールドショックに供し、その後２４時間３７℃に供した。細胞生存は生／死細胞蛍光色素（すなわち、ＤＲＡＱ７）を使用して決定し、トランスフェクションはＧＦＰ蛍光によりモニターした。結果は以下表２に示される。

実施例３：ＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）細胞のアクチン遺伝子座への標的化インテグレーション
アクチン遺伝子座に標的化されたＺＦＮおよび相同配列に隣接する蛍光タンパク質を含むドナープラスミド（２μｇ）を使用することで、蛍光タンパク質の標的化インテグレーションは野生型ＴＨＰ－１細胞のアクチン遺伝子座内に起こり得る。しかしながら、インテグレーションの割合は極めて低く（約０．０１２％）、インテグラントを単離するには複数の濃縮が必要であった。ＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）細胞をアクチンＺＦＮおよび青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含むドナープラスミド（５μｇ）でヌクレオフェクションした。アクチン遺伝子座への標的化インテグレーションの割合はＭＢ２１Ｄ１ノックアウト細胞で２．２３％に大幅に増加した。図１を参照されたい。

実施例４：ＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）細胞のチューブリン遺伝子座への標的化インテグレーション
何度も試みたが、ＴＨＰ－１細胞のチューブリン遺伝子座への標的化インテグレーションは成功しなかった。しかしながら、ＴＨＰ－１ ＫＯ（ＭＢ２１Ｄ１）細胞することで、チューブリン遺伝子座におけるＧＦＰのインテグレーションが１回の試みで高い割合で生じた。図２を参照されたい。

Claims (34)

1. 標的ゲノム編集を増加させるための方法であって、標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸および任意にドナーＤＮＡ分子を細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞に導入する工程を含み、ここで、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも標的ゲノム編集の割合が高い、方法。
2. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を欠くか、または減少したレベルを有するよう遺伝子工学操作されている、請求項１に記載の方法。
3. 細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質が、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、ＤＥＡＤ－ボックスヘリカーゼ４１（ＤＤＸ４１）、ロイシンリッチリピート（フライトレスＩ中）相互作用タンパク質（ＬＲＲＦＩＰ１）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載の方法。
4. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする少なくとも１つの不活性化染色体配列を含む、請求項２または３に記載の方法。
5. 不活性化染色体配列が標的化エンドヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術で不活性化された、請求項４に記載の方法。
6. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）剤を含む、請求項２または３に記載の方法。
7. 標的化エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓデュアルニッカーゼシステム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはプログラム制御可能なＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む融合タンパク質から選択される、請求項１－６のいずれか一項に記載の方法。
8. 標的化エンドヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１－７のいずれか一項に記載の方法。
9. ドナーＤＮＡ分子が、標的化エンドヌクレアーゼにより標的化されているゲノム部位または標的化エンドヌクレアーゼにより標的化されているゲノム部位の近くの配列と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列に隣接するドナー配列を含む、請求項１－８のいずれか一項に記載の方法。
10. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が哺乳動物細胞である、請求項１－９のいずれか一項に記載の方法。
11. 哺乳動物細胞が造血細胞系統である、請求項１０に記載の方法。
12. 造血細胞系統がＴＨＰ－１、ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、Ｒａｍｏｓ、またはＪｕｒｋａｔから選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 細胞が標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡと接触され、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも高い生存率および高い割合の標的ゲノム編集を有する、請求項１－１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 細胞が標的化エンドヌクレアーゼもしくは標的化エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびドナーＤＮＡ分子と接触され、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも高い生存率および高い割合の標的ゲノム編集を有する、請求項１－１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 細胞が標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡおよびドナーＤＮＡ分子と接触され、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも高い生存率および高い割合の標的ゲノム編集を有する、請求項１４－１７のいずれか一項に記載の方法。
16. 標的化エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡが二本鎖であり、かつドナーＤＮＡ分子が二本鎖である、請求項１３－１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞において標的導入遺伝子インテグレーションを行うことを含む標的導入遺伝子インテグレーションを増加させるための方法であって、ここで、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも高い割合の標的導入遺伝子インテグレーションを有する、方法。
18. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を欠くか、または減少したレベルを有するよう遺伝子工学操作されている、請求項１７に記載の方法。
19. 細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質が、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、ＤＥＡＤ－ボックスヘリカーゼ４１（ＤＤＸ４１）、ロイシンリッチリピート（フライトレスＩ中）相互作用タンパク質（ＬＲＲＦＩＰ１）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする少なくとも１つの不活性化染色体配列を含む、請求項１８または１９に記載の方法
21. 不活性化染色体配列が標的化エンドヌクレアーゼで不活性化された、請求項２０に記載の方法。
22. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）剤を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
23. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７－２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 哺乳動物細胞が造血細胞系統である、請求項２３に記載の方法。
25. 造血細胞系統がＴＨＰ－１、ＨＬ－６０、Ｕ－９３７、Ｒａｍｏｓ、またはＪｕｒｋａｔから選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞および少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子を含む組成物であって、ここで、細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングを欠いていない親細胞よりも少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子でのトランスフェクション後に高い生存率を有する、組成物。
27. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質を欠くか、または減少したレベルを有するよう遺伝子工学操作されている、請求項２６に記載の組成物。
28. 細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質が、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１６（ＩＦＩ１６）、ＤＥＡＤ－ボックスヘリカーゼ４１（ＤＤＸ４１）、ロイシンリッチリピート（フライトレスＩ中）相互作用タンパク質（ＬＲＲＦＩＰ１）、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２７に記載の組成物。
29. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、細胞質ＤＮＡセンシングに関連するタンパク質をコードする少なくとも１つの不活性化染色体配列を含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
30. 不活性化染色体配列が標的化エンドヌクレアーゼで不活性化された、請求項２９に記載の組成物。
31. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）剤を含む、請求項２７または２８に記載の組成物。
32. 少なくとも１つの二本鎖外来ＤＮＡ分子が標的化エンドヌクレアーゼをコードする、および／または標的化インテグレーションについてのドナー配列を含む、請求項２６－３１のいずれか一項に記載の組成物。
33. 細胞質ＤＮＡセンシングを欠く細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６－３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 哺乳動物細胞が造血細胞系統である、請求項３３に記載の組成物。