KR102243092B1 - Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 - Google Patents

Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 Download PDF

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시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
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Abstract

요약
본 발명은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 제공하고, 이것은 진핵 세포 또는 배아에서 발현을 위해 가공되고, 그리고 진핵 세포 또는 배아에서 표적화된 유전체 변형을 위해 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법을 제공한다. 융합 단백질 역시 제공되고, 여기서 각 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함한다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 융합 단백질을 이용하여 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법 역시 제공된다.

Description

CRISPR-기초된 유전체 변형과 조절{CRISPR-BASED GENOME MODIFICATION AND REGULATION}
발명의 분야
본 발명은 표적화된 유전체 변형에 관계한다. 특히, 본 발명은 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질 및 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 조절하기 위해 상기 단백질을 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
표적화된 유전체 변형은 진핵 세포, 배아, 그리고 동물의 유전자 조작을 위한 강력한 도구이다. 가령, 외인성 서열이 표적화된 유전체학 위치에서 통합될 수 있고 및/또는 특정한 내인성 염색체 서열이 결실되거나, 불활성화되거나, 또는 변형될 수 있다. 현재 방법은 가공된 뉴클레아제 효소, 예를 들면, 예로서, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs) 또는 전사 활성제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALENs)의 이용에 의존한다. 이들 키메라 뉴클레아제는 비특이적 DNA 개열 도메인에 연결된 프로그램가능, 서열-특정한 DNA-결합 모듈을 내포한다. 각 새로운 유전체학 표적은 하지만, 신규한 서열-특이적 DNA-결합 모듈을 포함하는 새로운 ZFN 또는 TALEN의 설계를 필요로 한다. 따라서, 이들 맞춤 설계된 뉴클레아제는 준비하는데 값비싸고 시간 소모적인 경향이 있다. 게다가, ZFNs와 TALENS의 특이성은 그들이 부정확한 개열을 매개할 수 있는 정도이다.
따라서, 각 새로운 표적화된 유전체학 위치에 대한 새로운 뉴클레아제의 설계를 필요로 하지 않는 표적화된 유전체 변형 기술이 필요하다. 부가적으로, 부정확한 효과가 거의 또는 전혀 없는 증가된 특이성을 갖는 기술이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 다양한 양상에는 단리된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 제공이 포함되고, 여기서 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인, 그리고 엔도뉴클레아제를 개열을 위한 특정한 뉴클레오티드 서열로 표적화하기 위한 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 세포-투과성 도메인, 마커 도메인, 또는 둘 모두를 더욱 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 일부 경우에, 유도 RNA는 표적 부위에 상보적인 5' 영역을 포함하는 단일 분자일 수 있다. 본원에서 개시된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산 역시 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산은 포유류 세포, 예를 들면, 예로서, 인간 세포에서 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 임의선택적으로, 벡터의 부분일 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터는 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는, 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 진핵 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 (i) 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 본원에서 규정된 바와 같은 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, (ii) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 그리고, 임의선택적으로, (iii) 공여자 서열을 포함하는 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 각 유도 RNA가 염색체 서열 내에 표적화된 부위에 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 향하게 하도록 상기 세포 또는 배아를 배양하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위 내에 이중 가닥 절단을 도입하고, 그리고 상기 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 변형되도록 DNA 복구 과정에 의해 복구된다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 또는 배아 내로 도입된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA일 수 있다. 추가의 구체예에서, 세포 또는 배아 내로 도입된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA일 수 있다. 추가의 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함하는 벡터의 부분일 수 있다. 일정한 구체예에서, 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 줄기 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일정한 다른 구체예에서, 배아는 비-인간 단세포 동물 배아일 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일반적으로, 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함한다. 융합 단백질의 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 가지 반복에서, Cas9 단백질은 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 교체 반복에서, Cas9 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 작동체 도메인은 개열 도메인, 예를 들면, 예로서, FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인일 수 있다. 다른 구체예에서, 한 융합 단백질은 다른 융합 단백질과 이합체를 형성할 수 있다. 이합체는 동종이합체 또는 이형이합체일 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 아연 핑거 뉴클레아제와 이형이합체를 형성할 수 있고, 여기서 융합 단백질과 아연 핑거 뉴클레아제 둘 모두의 개열 도메인은 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질로부터 유래된 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하고, 그리고 작동체 도메인은 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질로부터 유래된 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하고, 그리고 작동체 도메인은 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인일 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에서 개시된 융합 단백질 중에서 한 가지는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 그리고 마커 도메인에서 선택된 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 융합 단백질 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산 역시 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상은 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 다음을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다: (a) 최소한 하나의 융합 단백질 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 여기서 상기 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하고, 그리고 (b) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 여기서 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질을 염색체 서열 내에 표적화된 부위로 유도하고, 그리고 융합 단백질의 작동체 도메인은 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형될 수 있다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 한 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 2개의 유도 RNA 또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 1개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내에 도입된다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 융합 단백질 또는 2개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 2개의 유도 RNA 또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 2개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내에 도입된다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 1개의 유도 RNA 또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 핵산, 그리고 1개의 아연 핑거 뉴클레아제 또는 1개의 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 상기 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 1개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내로 도입된다. 융합 단백질이 개열 도메인을 포함하는 일정한 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함할 수 있다. 융합 단백질이 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인에서 선택되는 작동체 도메인을 포함하는 구체예에서, 상기 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질을 포함할 수 있고, 그리고 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 그리고 1개의 유도 RNA 또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 표적화된 염색체 서열의 구조 또는 발현이 변형된다. 일정한 구체예에서, 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 줄기 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일정한 다른 구체예에서, 배아는 비-인간 단세포 동물 배아이다.
본 발명의 다른 양상과 반복이 아래에서 상술된다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 단백질 이합체를 이용한 유전체 변형을 도해한다. (A)는 DNA 결합을 위한 Cas-유사 단백질 및 FokI 개열 도메인을 각각 포함하는 2개의 융합 단백질로 구성된 이합체에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다. (B)는 Cas-유사 단백질과 FokI 개열 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 아연 핑거 (ZF) DNA-결합 도메인과 FokI 개열 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제로 구성된 이합체에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다.
도면 2는 유전자 조절 도메인을 포함하는 RNA-유도된 융합 단백질을 이용한 유전자 발현의 조절을 예증한다. (A)는 DNA 결합에 이용된 Cas-유사 단백질 및 유전자 발현을 활성화시키거나 또는 억제하는 "A/R" 도메인을 포함하는 융합 단백질을 묘사한다. (B)는 DNA 결합을 위한 Cas-유사 단백질 및 근위 DNA 또는 단백질의 공유 변형에 의해 후성 상태에 영향을 주는 후성 변형 도메인 ("Epi-mod')을 포함하는 융합 단백질을 도해한다.
도면 3은 2개 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용한 유전체 변형을 도해한다. (A)는 틈내기효소로 전환된 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다. (B)는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 창출된 2개의 이중 가닥 절단을 묘사한다.
도면 4는 Cas9 핵산, Cas9 가이드용 RNA, 그리고 AAVS1-GFP DNA 공여자로 형질감염된 인간 K562 세포의 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 제시한다. y축은 적색 통로에서 자동 형광 강도를 나타내고, 그리고 x축은 녹색 형광 강도를 나타낸다. (A) 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; (B) 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; (C) 전사후 캡핑 반응에 의해 캡핑된 10 μg의 Cas9 mRNA, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (D) 10 μg의 Cas9 플라스미드 DNA, 5 μg의 U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (E) 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (F) 형질감염 시약 단독으로 형질감염된 K562 세포.
도면 5는 인간 세포 내에 AAVS1 좌위 내로 GFP의 표적화된 통합을 문서화하는 접합부 PCR 분석을 제시한다. 레인 M: 1 kb DNA 분자 마커; 레인 A: 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 B: 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 C: 전사후 캡핑 반응에 의해 캡핑된 10 μg의 Cas9 mRNA, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 D: 10 μg의 Cas9 플라스미드 DNA, 5 μg의 U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 E: 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 F: 형질감염 시약 단독으로 형질감염된 K562 세포.
발명의 상세한 설명
RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 본원에서 제공되는데, 이것은 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인, 그리고 엔도뉴클레아제를 개열을 위한 특정한 뉴클레오티드 서열로 표적화하는 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하여 진핵 세포 또는 배아의 염색체 서열을 변경하는 방법 역시 제공된다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 특정한 유도 RNA와 상호작용하고, 이들은 각각 상기 엔도뉴클레아제를 특정한 표적화된 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열이 변형되도록, DNA 복구 과정에 의해 복구될 수 있는 이중 가닥 절단을 도입한다. 특이성이 유도 RNA에 의해 제공되기 때문에, RNA-기초된 엔도뉴클레아제가 보편적이고 상이한 유전체학 서열을 표적으로 하는 상이한 유도 RNA에서 이용될 수 있다. 본원에서 개시된 방법은 특정한 염색체 서열을 표적으로 하고 변경하고 및/또는 세포 또는 배아의 유전체 내에 표적화된 위치에서 외인성 서열을 도입하는데 이용될 수 있다. 게다가, 표적화는 특정하고 부정확한 효과가 제한된다.
본 발명은 융합 단백질을 제공하는데, 여기서 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함한다. 적합한 작동체 도메인은 제한 없이, 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 그리고 전사 억제인자 도메인을 포함한다. 각 융합 단백질은 특정한 유도 RNA에 의해 특정한 염색체 서열로 유도되고, 여기서 작동체 도메인은 표적화된 유전체 변형 또는 유전자 조절을 매개한다. 한 양상에서, 융합 단백질은 이합체로서 기능하고, 따라서 표적 부위의 길이를 증가시키고 유전체 내에 이의 독특성의 가능성을 증가시킬 수 있다 (따라서, 부정확한 효과를 감소시킬 수 있다). 가령, 내인성 CRISPR 시스템은 대략 13-20 bp의 DNA 결합 단어 길이에 기초하여 유전체학 위치를 변경한다 (Cong et al., Science, 339:819-823). 이러한 단어 크기에서, 표적 부위의 단지 5-7%만 유전체 내에서 독특하다 (Iseli et al, PLos One 2(6):e579). 대조적으로, 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 DNA 결합 단어 크기는 전형적으로, 30-36 bp 범위에서 변하고, 인간 유전체 내에서 대략 85-87% 독특한 표적 부위를 유발한다. CRISPR-기초된 시스템에 의해 활용되는 더욱 작은 크기산정된 DNA 결합 부위는 원하는 위치, 예를 들면, 질환 SNP, 작은 엑손, 출발 코돈, 그리고 종결 코돈뿐만 아니라 복잡한 유전체 내에 다른 위치 인근에서 표적화된 CRISP-기초된 뉴클레아제의 설계를 제한하고 복잡하게 만든다. 본 발명은 CRISPR DNA 결합 단어 길이를 확장하기 위한 수단 (즉, 부정확한 활성을 제한하기 위해)을 제공할 뿐만 아니라, 변형된 기능성을 갖는 CRISPR 융합 단백질을 더욱 제공한다. 따라서, 개시된 CRISPR 융합 단백질은 증가된 표적 특이성과 독특한 기능성(들)을 갖는다. 표적화된 염색체 서열의 발현을 변경하거나 또는 조절하기 위해 융합 단백질을 이용하는 방법 역시 본원에서 제공된다.
(I) RNA-유도된 엔도뉴클레아제
본 발명의 한 가지 양상은 진핵 세포와 배아, 예를 들면, 예로서, 비-인간 단세포 배아의 핵 내로 엔도뉴클레아제의 진입을 허용하는, 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 제공한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 또한, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인 및 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유도 RNA에 의해 특정한 핵산 서열 (또는 표적 부위)에 지향된다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 표적 부위와 상호작용하고, 따라서 일단 표적 부위에 지향되면, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 절단을 표적 부위 핵산 서열 내로 도입할 수 있다. 유도 RNA가 표적화된 개열에 대한 특이성을 제공하기 때문에, RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제가 보편적이고 상이한 표적 핵산 서열을 개열하는 상이한 유도 RNA에서 이용될 수 있다. 단리된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산 (즉, RNA 또는 DNA), RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 그리고 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 + 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체가 본원에서 제공된다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 군집된 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템으로부터 유래될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 적합한 CRISPR/Cas 단백질의 무제한적 실례는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (또는 CasA), Cse2 (또는 CasB), Cse3 (또는 CasE), Cse4 (또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그리고 Cu1966을 포함한다.
한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 특정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래된다. Cas9 단백질은 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (스트렙토콕쿠스 피오게네스), 스트렙토콕쿠스 써모필루스 (스트렙토콕쿠스 thermophilus), 스트렙토콕쿠스 (스트렙토콕쿠스) 종, 노카르디오프시스 라스손빌레이 (Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토미세스 프리스티네스피랄리스 (Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움 (Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움 (Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스 (Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰 (Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나 (Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움 (Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 (Polaromonas) 종, 크로코스파에라 왓소니 (Crocosphaera watsonii), 시아노테세 (Cyanothece) 종, 마이크로시스티스 아에루기노사 (Microcystis aeruginosa), 시네코콕쿠스 (Synechococcus) 종, 아세토할로비움 아라바티쿰 (Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐씨 (Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스 (Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile), 피네골디아 마그나 (Finegoldia magna), 나트라나이로비우스 써모필루스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰 (Pelotomaculum thermopropionicum), 아시치오바실루스 칼두스 (Acidithiobacillus caldus), 아시치오바실루스 페록시단스 (Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨 (Allochromatium vinosum), 마리노박터 (Marinobacter) 종, 니트로소콕쿠스 할로필루스 (Nitrosococcus halophilus), 니트로소콕쿠스 왓소니 (Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랭크티스 (Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르 (Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나 (Nodularia spumigena), 노스톡 (Nostoc) 종, 아르트로스피라 맥시마 (Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스 (Arthrospira platensis), 아트로스피라 (Arthrospira) 종, 링비아 (Lyngbya) 종, 미크로콜레우스 크토노플라스테스 (Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 (Oscillatoria) 종, 페트로토가 모빌리스 (Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스 (Thermosipho africanus), 또는 아카리오클로리스 마리나 (Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, CRISPR/Cas 단백질은 최소한 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 유도 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한, 뉴클레아제 도메인 (즉, DNA분해효소 또는 RNA분해효소 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카아제 도메인, RNA분해효소 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이합체화 도메인뿐만 아니라 다른 도메인을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 CRISPR/Cas 단백질, 변형된 CRISPR/Cas 단백질, 또는 야생형 또는 변형된 CRISPR/Cas 단백질의 단편일 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 핵산 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소적 활성을 변경하고, 및/또는 단백질의 다른 성질을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 가령, CRISPR/Cas-유사 단백질의 뉴클레아제 (즉, DNA분해효소, RNA분해효소) 도메인은 변형되거나, 결실되거나, 또는 불활성화될 수 있다. 대안으로, CRISPR/Cas-유사 단백질은 융합 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 절두될 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 또한, 융합 단백질의 작동체 도메인의 활성을 최적화하기 위해 절두되거나 또는 변형될 수 있다.
일부 구체예에서, CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, CRISPR/Cas-유사 단백질은 변형된 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 가령, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 또는 그 이상의 성질 (가령, 뉴클레아제 활성, 친화성, 안정성 등)을 변경하기 위해 변형될 수 있다. 대안으로, RNA-유도된 개열에 관련되지 않는 Cas9 단백질의 도메인이 단백질로부터 제거될 수 있고, 따라서 변형된 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질보다 작다.
일반적으로, Cas9 단백질은 최소한 2개의 뉴클레아제 (즉, DNA분해효소) 도메인을 포함한다. 가령, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC와 HNH 도메인은 단일 가닥을 절단하여 DNA에서 이중 가닥 절단을 만들기 위해 함께 작동한다 (Jinek et al., Science, 337: 816-821). 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 단지 한 가지 기능적 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중에서 어느 한쪽)만을 내포하도록 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 결실되거나 또는 돌연변이되고, 따라서 이것이 더 이상 기능하지 않도록 (즉, 뉴클레아제 활성이 부재하도록) 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 비활성인 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 이중 가닥 핵산 내로 틈을 도입할 수 있지만 (이런 단백질은 "틈내기효소"로 명명된다), 이중 가닥 DNA를 개열하지 않는다. 가령, RuvC-유사 도메인에서 아스파르트산염에서 알라닌 (D10A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 유사하게, HNH 도메인에서 히스티딘에서 알라닌 (H840A 또는 H839A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 각 뉴클레아제 도메인은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 부위-지향된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 그리고 전체 유전자 합성뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 방법을 이용하여 변형될 수 있다.
본원에서 개시된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함한다. 일반적으로, NLS은 염기성 아미노산의 스트레치를 포함한다. 핵 국지화 신호는 당분야에서 공지된다 (가령, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105를 참조한다). 가령, 한 구체예에서, NLS는 단립형 서열, 예를 들면, PKKKRKV (서열 번호:1) 또는 PKKKRRV (서열 번호:2)일 수 있다. 다른 구체예에서, NLS는 이분 서열일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:3)일 수 있다. NLS는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 제1형 사람 면역결핍바이러스 TAT 단백질로부터 유래된 세포-투과성 펩티드 서열일 수 있다. 실례로서, TAT 세포-투과성 서열은 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호:4)일 수 있다. 다른 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 인간 B형 간염 바이러스로부터 유래된 세포-투과성 펩티드 서열인 TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; 서열 번호:5)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; 서열 번호:6 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열 번호:7)일 수 있다. 추가의 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 서열 번호:8), VP22, 단순 헤르페스 바이러스로부터 세포 투과성 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-투과성 도메인은 상기 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
또 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 또한, 최소한 하나의 마커 도메인을 포함할 수 있다. 마커 도메인의 무제한적 실례는 형광 단백질, 정제 태그, 그리고 에피토프 태그를 포함한다. 일부 구체예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 무제한적인 실례는 녹색 형광 단백질 (가령, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (가령, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (가령, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire,), 시안색 형광 단백질 (가령, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단위체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단위체, HcRed-탠덤, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 그리고 오렌지색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 예시적인 태그에는 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카르복실 운반 단백질 (BCCP), 그리고 칼모듈린이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
일정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 유도 RNA의 5' 단부는 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
(II) 융합 단백질
본 발명의 다른 양상은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 유도 RNA에 의해 표적 부위에 지향되고, 상기 부위에서 작동체 도메인은 표적화된 핵산 서열을 변경하거나 또는 산출할 수 있다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 융합 단백질은 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 또는 마커 도메인에서 선택된 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함할 수 있다.
(a) CRISPR/Cas-유사 단백질
융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 상기 섹션 (I)에서 상술된다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 융합 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
일부 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. Cas9-유래된 단백질은 야생형, 변형된, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 단지 한 가지 기능적 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중에서 어느 한쪽)을 내포하도록 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 결실되거나 또는 돌연변이되고, 따라서 이것이 더 이상 기능하지 않도록 (즉, 뉴클레아제 활성이 부재하도록) 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 비활성인 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 이중 가닥 핵산 내로 틈을 도입할 수 있지만 (이런 단백질은 "틈내기효소"로 명명된다), 이중 가닥 DNA를 개열하지 않는다. 가령, RuvC-유사 도메인에서 아스파르트산염에서 알라닌 (D10A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 유사하게, HNH 도메인에서 히스티딘에서 알라닌 (H840A 또는 H839A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 다른 구체예에서, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 둘 모두 Cas9-유래된 단백질이 이중 가닥 핵산을 틈내기하거나 또는 개열할 수 없도록 변형되거나 또는 제거될 수 있다. 또 다른 구체예에서, Cas9-유래된 단백질의 모든 뉴클레아제 도메인은 Cas9-유래된 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형되거나 또는 제거될 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 임의의 또는 모든 뉴클레아제 도메인은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 부위-지향된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 그리고 전체 유전자 합성뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 방법을 이용하여 하나 또는 그 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 모든 뉴클레아제 도메인이 비활성화되거나 또는 결실된 Cas9 단백질로부터 유래된다.
(b) 작동체 도메인
융합 단백질은 또한, 작동체 도메인을 포함한다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 작동체 도메인은 융합 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
(i) 개열 도메인
일부 구체예에서, 작동체 도메인은 개열 도메인이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "개열 도메인"은 DNA를 개열하는 도메인을 지칭한다. 개열 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 획득될 수 있다. 개열 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 무제한적 실례에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, New England Biolabs Catalog 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참조한다. DNA를 개열하는 추가 효소가 알려져 있다 (가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNA분해효소 I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 또한 참조한다. 이들 효소 중에서 하나 또는 그 이상 (또는 이의 기능적 단편)이 개열 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개열 도메인은 유형 II-S 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 유형 II-S 엔도뉴클레아제는 전형적으로, 인식 부위로부터 여러 염기쌍 떨어진 부위에서 DNA를 개열하고, 그리고 따라서, 분리가능한 인식과 개열 도메인을 갖는다. 이들 효소는 일반적으로, 엇갈린 위치에서 DNA의 각 가닥을 개열하기 위해, 일시적으로 결합하여 이합체를 형성하는 단위체이다. 적합한 유형 II-S 엔도뉴클레아제의 무제한적 실례는 BfiI, BpmI, BsaI, BsgI, BsmBI, BsmI, BspMI, FokI, MboII, 그리고 SapI을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 이의 유도체이다.
일정한 구체예에서, 유형 II-S 개열은 2개의 상이한 개열 도메인 (이들은 각각, CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편에 부착된다)의 이합체화를 조장하도록 변형될 수 있다. 가령, FokI의 개열 도메인은 일정한 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 무제한적 실례에 의하여, FokI 개열 도메인의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 그리고 538에서 아미노산 잔기가 변형에 대한 표적이다. 가령, 절대 이형이합체를 형성하는 FokI의 변형된 개열 도메인은 첫 번째 변형된 개열 도메인이 아미노산 위치 490과 538에서 돌연변이를 포함하고, 그리고 두 번째 변형된 개열 도메인이 아미노산 위치 486과 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다 (Miller et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:778-785; Szczpek et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:786-793). 가령, 한 도메인에서 위치 490에서 Glu (E)가 Lys (K)로 변화될 수 있고 위치 538에서 Ile (I)가 K로 변화될 수 있고 (E490K, I538K), 그리고 다른 개열 도메인에서 위치 486에서 Gln (Q)이 E로 변화될 수 있고 위치 499에서 I가 Leu (L)로 변화될 수 있다 (Q486E, I499L). 다른 구체예에서, 변형된 FokI 개열 도메인은 3가지 아미노산 변화를 포함할 수 있다 (Doyon et al. 2011, Nat. Methods, 8:74-81). 가령, 한 변형된 FokI 도메인 (ELD로 명명된다)은 Q486E, I499L, N496D 돌연변이를 포함할 수 있고, 그리고 다른 변형된 FokI 도메인 (KKR로 명명된다)은 E490K, I538K, H537R 돌연변이를 포함할 수 있다.
예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다.
작동체 도메인이 개열 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 이들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(ii) 후성 변형 도메인
다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 후성 변형 도메인일 수 있다. 일반적으로, 후성 변형 도메인은 DNA 서열을 변화시키지 않으면서 히스톤 구조 및/또는 염색체 구조를 변경한다. 히스톤 및/또는 염색질 구조에서 변화는 유전자 발현에서 변화를 야기할 수 있다. 후성 변형의 실례는 제한 없이, 히스톤 단백질에서 리신 잔기의 아세틸화 또는 메틸화, 그리고 DNA에서 시토신 잔기의 메틸화를 포함한다. 적합한 후성 변형 도메인의 무제한적 실례는 히스톤 아세틸전달효소 도메인, 히스톤 탈아세틸화효소 도메인, 히스톤 메틸전달효소 도메인, 히스톤 탈메틸효소 도메인, DNA 메틸전달효소 도메인, 그리고 DNA 탈메틸효소 도메인을 포함한다.
작동체 도메인이 히스톤 아세틸전달효소 (HAT) 도메인인 구체예에서, HAT 도메인은 EP300 (즉, E1A 결합 단백질 p300), CREBBP (즉, CREB-결합 단백질), CDY1, CDY2, CDYL1, CLOCK, ELP3, ESA1, GCN5 (KAT2A), HAT1, KAT2B, KAT5, MYST1, MYST2, MYST3, MYST4, NCOA1, NCOA2, NCOA3, NCOAT, P/CAF, Tip60, TAFII250, 또는 TF3C4로부터 유래될 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, HAT 도메인은 p300이다.
작동체 도메인이 후성 변형 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(iii) 전사 활성화 도메인
다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 전사 활성화 도메인일 수 있다. 일반적으로, 전사 활성화 도메인은 유전자의 전사를 증가 및/또는 활성화시키기 위해 전사 제어 원소 및/또는 전사 조절 단백질 (즉, 전사 인자, RNA 중합효소 등)과 상호작용한다. 일부 구체예에서, 전사 활성화 도메인은 제한 없이, 단순 헤르페스 바이러스 VP16 활성화 도메인, VP64 (이것은 VP16의 사합체성 유도체이다), NFκB p65 활성화 도메인, p53 활성화 도메인 1과 2, CREB (cAMP 반응 원소 결합 단백질) 활성화 도메인, E2A 활성화 도메인, 그리고 NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 활성화 도메인일 수 있다. 다른 구체예에서, 전사 활성화 도메인은 Gal4, Gcn4, MLL, Rtg3, Gln3, Oaf1, Pip2, Pdr1, Pdr3, Pho4, 그리고 Leu3일 수 있다. 전사 활성화 도메인은 야생형이거나, 또는 본래 전사 활성화 도메인의 변형된 이형일 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 VP16 또는 VP64 전사 활성화 도메인이다.
작동체 도메인이 전사 활성화 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(iv) 전사 억제인자 도메인
또 다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 일반적으로, 전사 억제인자 도메인은 유전자의 전사를 감소시키고 및/또는 종결하기 위해 전사 제어 원소 및/또는 전사 조절 단백질 (즉, 전사 인자, RNA 중합효소 등)과 상호작용한다. 적합한 전사 억제인자 도메인의 무제한적 실례는 유도성 cAMP 초기 억제인자 (ICER) 도메인, Kruppel-연관된 상자 A (KRAB-A) 억제인자 도메인, YY1 글리신 풍부한 억제인자 도메인, Sp1-유사 억제인자, E(spl) 억제인자, IκB 억제인자, 그리고 MeCP2를 포함한다.
작동체 도메인이 전사 억제인자 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, cas9는 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(c) 추가 도메인
일부 구체예에서, 융합 단백질은 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함한다. 적합한 추가 도메인의 무제한적 실례는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 또는 전위 도메인, 그리고 마커 도메인을 포함한다. 적합한 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 그리고 마커 도메인의 무제한적 실례는 상기 섹션 (I)에서 제공된다.
(d) 융합 단백질 이합체
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인인 구체예에서, 최소한 하나의 융합 단백질을 포함하는 이합체가 형성될 수 있다. 이합체는 동종이합체 또는 이형이합체일 수 있다. 일부 구체예에서, 이형이합체는 2개의 상이한 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체는 1개의 융합 단백질 및 추가 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 이합체는 2개의 융합 단백질 단위체가 일차성 아미노산 서열에 대하여 동일한 동종이합체이다. 이합체가 동종이합체인 한 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 다시 말하면, 그들이 기능적 뉴클레아제 도메인을 갖지 않도록 변형된다. Cas9-유래된 단백질이 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형되는 일정한 구체예에서, 각 융합 단백질 단위체는 동일한 Cas9 유사 단백질 및 동일한 개열 도메인을 포함한다. 개열 도메인은 임의의 개열 도메인, 예를 들면, 본원에서 제공된 예시적인 개열 도메인 중에서 한 가지일 수 있다. 특정한 구체예에서, 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다. 이런 구체예에서, 특정한 유도 RNA는 융합 단백질 단위체를 상이하지만 가깝게 인접한 부위로 향하게 할 것이고, 따라서 이합체 형성 시에, 이들 두 단위체의 뉴클레아제 도메인은 표적 DNA 내에 이중 가닥 절단을 창출할 것이다.
다른 구체예에서, 이합체는 2개의 상이한 융합 단백질의 이형이합체이다. 가령, 각 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 상이한 CRISPR/Cas 단백질로부터 또는 상이한 세균 종의 이종상동성 CRISPR/Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 가령, 각 융합 단백질은 Cas9-유사 단백질을 포함할 수 있고, 상기 Cas9-유사 단백질은 상이한 세균 종으로부터 유래된다. 이들 구체예에서, 각 융합 단백질은 상이한 표적 부위 (즉, 프로토스페이서 및/또는 PAM 서열에 의해 특정됨)를 인식할 것이다. 가령, 유도 RNA는 이형이합체를 상이하지만 가깝게 인접한 부위에 위치시킬 수 있고, 따라서 그들의 뉴클레아제 도메인은 표적 DNA 내에 효과적인 이중 가닥 절단을 유발한다. 이형이합체는 또한, 틈내는 위치가 상이하도록, 틈내기 활성을 갖는 변형된 Cas9 단백질을 가질 수 있다.
대안으로, 이형이합체의 두 융합 단백질은 상이한 작동체 도메인을 가질 수 있다. 작동체 도메인이 개열 도메인인 구체예에서, 각 융합 단백질은 상이한 변형된 개열 도메인을 내포할 수 있다. 가령, 각 융합 단백질은 상기 섹션 (II)(b)(i)에서 상술된 바와 같이, 상이한 변형된 FokI 개열 도메인을 내포할 수 있다. 이들 구체예에서, Cas-9 단백질은 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형될 수 있다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이형이합체를 형성하는 이들 두 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 도메인 및 작동체 도메인 둘 모두에서 상이할 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 동종이합체 또는 이형이합체는 상기 상술된 바와 같이, 핵 국지화 신호 (NLSs), 세포-투과성, 전위 도메인 및 마커 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, Cas9-유래된 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽이 엔도뉴클레아제 활성이 제거되거나 또는 변형되도록 변형될 수 있다.
다른 대안적 구체예에서, 이형이합체는 1개의 융합 단백질 및 추가 단백질을 포함한다. 가령, 추가 단백질은 뉴클레아제일 수 있다. 한 구체예에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 개열 도메인을 포함한다. 아연 핑거는 3개의 뉴클레오티드를 인식하고 이들에 결합한다. 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 약 3개 아연 핑거 내지 약 7개 아연 핑거를 포함할 수 있다. 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 단백질로부터 유래되거나 또는 가공될 수 있다. 가령, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 그리고 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814를 참조한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인은 상기 섹션 (II)(b)(i)에서 상술된 임의의 개열 도메인일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다. 이런 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 융합 단백질과 이합체화할 것이다.
일부 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 또는 전위 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 상기 상술된다.
일정한 구체예에서, 상기 상술된 융합 단백질 중에서 한 가지 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 포함하는 이합체는 최소한 하나의 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR-Cas0 유사 단백질과 상호작용하여 상기 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 유도 RNA의 5' 단부는 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
(III) RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산
본 발명의 다른 양상은 각각, 상기 섹션 (I)과 (II)에서 설명된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질 중에서 한 가지를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 mRNA이다. mRNA는 5' 캡핑되고 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 DNA이다. DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다 (아래 참조).
RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 관심되는 진핵 세포 또는 동물에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 가령, 인간, 생쥐, 쥐, 햄스터, 소, 돼지, 고양이, 개, 어류, 양서류, 식물, 효모, 곤충, 기타 등등에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다 (참조: www.kazusa.or.jp/codon/에서 Codon Usage Database). 코돈 최적화를 위한 프로그램은 프리웨어로서 가용하다 (가령, genomes.urv.es/OPTIMIZER에서 OPTIMIZER; www.genscript.com/codon_opt.html에서 GenScript로부터 OptimumGene™). 상업적인 코돈 최적화 프로그램 역시 가용하다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 최소한 하나의 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 반복에서, DNA 코딩 서열은 관심되는 진핵 세포 또는 동물에서 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 제어 서열은 구조성, 조절된, 또는 조직 특이적일 수 있다. 적합한 구조성 프로모터 제어 서열에는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스(SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세린산 키나아제 (PGK) 프로모터, 연장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이들의 단편, 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 적합한 조절된 프로모터 제어 서열의 실례는 제한 없이, 열 쇼크, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 조절된 것들을 포함한다. 조직 특이적 프로모터의 무제한적 실례는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 섬유결합소 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 그리고 WASP 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 야생형이거나 또는 더욱 효율적인 또는 유효한 발현을 위해 변형될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 인코딩 DNA는 포유류 세포에서 구조성 발현을 위해 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 시험관내 mRNA 합성을 위한 파지 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이런 구체예에서, 시험관내-전사된 RNA는 아래 섹션 (IV)와 (V)에서 상술된 방법에서 이용을 위해 정제될 수 있다. 가령, 프로모터 서열은 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열 또는 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열의 변이일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 mRNA 합성을 위해 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
대안적 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 세균 또는 진핵 세포에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질의 시험관내 발현을 위해 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이런 구체예에서, 발현된 단백질은 아래 섹션 (IV)와 (V)에서 상술된 방법에서 이용을 위해 정제될 수 있다. 적합한 세균 프로모터는 제한 없이, T7 프로모터, lac 오페론 프로모터, trp 프로모터, 이들의 변이, 그리고 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 세균 프로모터는 trp와 lac 프로모터의 하이브리드인 tac이다. 적합한 진핵 프로모터의 무제한적 실례는 상기에서 열거된다.
추가의 양상에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 또한, 폴리아데닐화 신호 (가령, SV40 polyA 신호, 소 성장 호르몬 (BGH) polyA 신호 등) 및/또는 최소한 하나의 전사 종결 서열에 연결될 수 있다. 부가적으로, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 또한, 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 세포-투과성 도메인, 및/또는 최소한 하나의 마커 도메인을 인코딩하는 서열에 연결될 수 있고, 이들은 상기 섹션 (I)에서 상술된다.
다양한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/꼬마염색체, 트랜스포손, 그리고 바이러스 벡터 (가령, 렌티바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터 등)를 포함한다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에 존재한다. 적합한 플라스미드 벡터의 무제한적 실례는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 그리고 이들의 변이체를 포함한다. 상기 벡터는 추가 발현 제어 서열 (가령, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선별가능 마커 서열 (가령, 항생제 내성 유전자), 복제 기점, 기타 등등을 포함할 수 있다. 추가 정보는 "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001에서 발견될 수 있다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함할 수 있다. 유도 RNA를 인코딩하는 서열은 일반적으로, 관심되는 세포 또는 배아에서 유도 RNA의 발현을 위해 최소한 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 가령, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 실례에는 포유류 U6, U3, H1, 그리고 7SL RNA 프로모터가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
(IV) RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하여 염색체 서열을 변경하기 위한 방 법
본 발명의 다른 양상은 진핵 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 (i) 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, (ii) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 그리고, 임의선택적으로, (iii) 공여자 서열을 포함하는 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 각 유도 RNA가 염색체 서열 내에 표적화된 부위에 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 향하게 하도록 상기 세포 또는 배아를 배양하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위 내에 이중 가닥 절단을 도입하고, 그리고 상기 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 변형되도록 DNA 복구 과정에 의해 복구된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 1개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열 내에 1개의 이중 가닥 절단을 도입한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있다. 따라서, 표적화된 염색체 서열은 변형되거나 또는 비활성화될 수 있다. 가령, 단일 뉴클레오티드 변화 (SNP)가 변경된 단백질 산물을 발생시킬 수 있거나, 또는 코딩 서열의 해독틀에서 이동이 단백질 산물이 만들어지지 않도록 상기 서열을 비활성화시키거나 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 복구 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열의 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서, 공여자 서열은 상동 재조합 과정에 의해 매개된 복구 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 대안으로, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 (또는 양립성 오버행이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 원지에서 산출되는) 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 복구 동안 비상동성 복구 과정에 의해 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 염색체 서열 내로 공여자 서열의 교환 또는 통합은 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 외인성 서열을 세포 또는 배아의 염색체 서열 내로 도입한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에 2개의 이중 가닥 절단을 도입한다. 도면 3B를 참조한다. 이들 두 절단은 여러 염기쌍 내에 있거나, 수십 개의 염기쌍 내에 있거나, 또는 수천 여 개의 염기쌍에 의해 분리될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 두 개열 부위 사이에 서열이 상실되고 및/또는 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단(들)의 복구 동안 일어날 수 있도록 비상동성 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 복구 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 이중 가닥 서열 (또는 인코딩 핵산)의 한쪽 가닥을 개열하기 위해 변형된 1개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 2개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 각 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 변형된 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 염색체 서열의 한쪽 가닥을 개열하고 (즉, 틈내기하고), 그리고 여기서 2개의 틈은 마주보는 가닥 내에 있고 이중 가닥 절단을 구성할 만큼 충분히 근접하게 위치한다. 도면 3A를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있도록 비상동성 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 복구 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
(a) RNA-유도된 엔도뉴클레아제
상기 방법은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 이런 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 각각, 상기 섹션 (I)과 (III)에서 설명된다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 단리된 단백질로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 단백질의 세포 흡수를 용이하게 하는 최소한 하나의 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 mRNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 관심되는 세포 또는 배아에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. DNA 서열은 선형일 수 있거나, 또는 DNA 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 상기 융합 단백질 및 유도 RNA를 포함하는 RNA-단백질 복합체로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다.
대안적 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일반적으로, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 각 서열은 각각, 세포 또는 배아에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA의 발현을 허용하는 적절한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 추가 발현 제어, 조절, 및/또는 처리 서열(들)을 더욱 포함할 수 있다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 선형이거나 또는 벡터의 부분일 수 있다
(b) 유도 RNA
상기 방법은 또한, 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 유도 RNA의 5' 단부는 염색체 서열 내에 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
각 유도 RNA는 3가지 영역을 포함한다: 염색체 서열 내에 표적 부위에 상보적인 5' 단부에서 첫 번째 영역, 줄기 루프 구조를 형성하는 두 번째 내부 영역, 그리고 본질적으로 단일 가닥으로 남아있는 세 번째 3' 영역. 각 유도 RNA의 첫 번째 영역은 각 유도 RNA가 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 유도하도록 상이하다. 각 유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역은 모든 유도 RNA에서 동일할 수 있다.
유도 RNA의 첫 번째 영역은 유도 RNA의 첫 번째 영역이 표적 부위와 염기쌍을 이룰 수 있도록, 염색체 서열 내에 표적 부위에서 서열 (즉, 프로토스페이서 서열)에 상보적이다. 다양한 구체예에서, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 25개 보다 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가령, 유도 RNA의 첫 번째 영역 및 염색체 서열 내에 표적 부위 사이에 염기 대합의 영역은 길이에서 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개, 또는 25개 보다 많은 뉴클레오티드 일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 길이에서 약 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드이다.
유도 RNA는 또한, 이차 구조를 형성하는 두 번째 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 이차 구조는 줄기 (또는 헤어핀) 및 루프를 포함한다. 루프와 줄기의 길이는 변할 수 있다. 가령, 루프는 길이에서 약 3 내지 약 10개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있고, 그리고 줄기는 길이에서 약 6 내지 약 20개 염기쌍 범위에서 변할 수 있다. 줄기는 1 내지 약 10개 뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 돌출을 포함할 수 있다. 따라서, 두 번째 영역의 전반적인 길이는 길이에서 약 16 내지 약 60개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 루프는 길이에서 약 4개 뉴클레오티드이고, 그리고 줄기는 약 12개 염기쌍을 포함한다.
유도 RNA는 또한, 본질적으로 단일 가닥으로 남아있는 3' 단부에서 세 번째 영역을 포함한다. 따라서, 세 번째 영역은 관심되는 세포 내에 임의의 염색체 서열에 대한 상보성을 갖지 않고, 그리고 유도 RNA의 나머지 부분에 상보성을 갖지 않는다. 세 번째 영역의 길이는 변할 수 있다. 일반적으로, 세 번째 영역은 길이에서 약 4개 보다 많은 뉴클레오티드이다. 가령, 세 번째 영역의 길이는 길이에서 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다.
유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역 (또한, 보편적인 또는 골격 영역으로 불린다)의 합동된 길이는 길이에서 약 30 내지 약 120개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 한 양상에서, 유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역의 합동된 길이는 길이에서 약 70 내지 약 100개 뉴클레오티드 범위에서 변한다.
일부 구체예에서, 유도 RNA는 3가지 영역 모두를 포함하는 단일 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 유도 RNA는 2개의 별개의 분자를 포함할 수 있다. 첫 번째 RNA 분자는 유도 RNA의 첫 번째 영역 및 유도 RNA의 두 번째 영역의 "줄기"의 한쪽 절반을 포함할 수 있다. 두 번째 RNA 분자는 유도 RNA의 두 번째 영역의 "줄기"의 다른 절반 및 유도 RNA의 세 번째 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 서로에 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 내포한다. 가령, 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 다른 서열에 염기쌍을 이루고 기능적 유도 RNA를 형성하는 서열 (약 6 내지 약 20개 뉴클레오티드의)을 포함한다.
일부 구체예에서, 유도 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. RNA 분자는 시험관내에서 전사될 수 있다. 대안으로, RNA 분자는 화학적으로 합성될 수 있다.
다른 구체예에서, 유도 RNA는 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 사례에서, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 관심되는 세포 또는 배아에서 유도 RNA의 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 가령, RNA 코딩 서열은 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 실례에는 포유류 U6 또는 H1 프로모터가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 구체예에서, RNA 코딩 서열은 생쥐 또는 인간 U6 프로모터에 연결된다. 다른 예시적인 구체예에서, RNA 코딩 서열은 생쥐 또는 인간 H1 프로모터에 연결된다.
유도 RNA를 인코딩하는 DNA 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 일부 구체예에서, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/꼬마염색체, 트랜스포손, 그리고 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에 존재한다. 적합한 플라스미드 벡터의 무제한적 실례는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 그리고 이들의 변이체를 포함한다. 벡터는 추가 발현 제어 서열 (가령, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선별가능 마커 서열 (가령, 항생제 내성 유전자), 복제 기점, 기타 등등을 포함할 수 있다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 유도 RNA 둘 모두 DNA 분자로서 세포 내로 도입되는 구체예에서, 각각은 별개의 분자의 부분 (가령, 융합 단백질 코딩 서열을 내포하는 하나의 벡터 및 유도 RNA 코딩 서열을 내포하는 두 번째 벡터)일 수 있거나 또는 둘 모두 동일한 분자의 부분 (가령, 융합 단백질과 유도 RNA 둘 모두에 대한 코딩 (및 조절) 서열을 내포하는 하나의 벡터)일 수 있다.
표적 부위
유도 RNA와 함께 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에서 표적 부위에 지향되고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단을 도입한다. 표적 부위는 상기 서열 바로 뒤에 (하류) 공통 서열이 뒤따른다는 점을 제외하고, 서열 제한을 갖지 않는다. 이러한 공통 서열은 또한, 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)로서 알려져 있다. PAM의 실례에는 NGG, NGGNG, 그리고 NNAGAAW (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드로서 규정되고, 그리고 W는 A 또는 T로서 규정된다)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 섹션 (IV)(b)에서 상술된 바와 같이, 유도 RNA의 첫 번째 영역 (5' 단부에서)은 표적 서열의 프로토스페이서에 상보적이다. 전형적으로, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 길이에서 약 19 내지 21개 뉴클레오티드이다. 따라서, 일정한 양상에서, 염색체 서열 내에 표적 부위의 서열은 5'-N19-21-NGG-3'이다. PAM은 이탤릭체로 표시된다.
표적 부위는 유전자의 코딩 영역, 유전자의 인트론, 유전자의 제어 영역, 유전자 사이에 비코딩 영역 등에 있을 수 있다. 유전자는 단백질 코딩 유전자 또는 RNA 코딩 유전자일 수 있다. 유전자는 관심되는 임의의 유전자일 수 있다.
임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드
일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여자 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 공여자 서열은 내인성 또는 선천적 염색체 서열에 상응한다. 가령, 공여자 서열은 표적화된 부위에서 또는 이와 가까운 염색체 서열의 부분과 본질적으로 동일할 수 있지만, 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 따라서, 공여자 서열은 선천적 서열과의 통합 또는 교환 시에, 표적화된 염색체 위치에서 서열이 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함하도록, 표적화된 부위에서 야생형 서열의 변형된 이형을 포함할 수 있다. 가령, 변화는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다. 변형된 서열의 통합의 결과로서, 세포 또는 배아/동물은 표적화된 염색체 서열로부터 변형된 유전자 산물을 생산할 수 있다.
다른 양상에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 공여자 서열은 외인성 서열에 상응한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "외인성" 서열은 세포 또는 배아에 선천적이지 않은 서열, 또는 세포 또는 배아의 유전체에서 선천적 위치가 상이한 위치에 있는 서열을 지칭한다. 가령, 외인성 서열은 유전체 내로 통합 시에, 세포 또는 배아/동물이 통합된 서열에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있도록, 외인성 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 외인성 서열은 이의 발현이 내인성 프로모터 제어 서열에 의해 조절되도록 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 다른 반복에서, 외인성 서열은 전사 제어 서열, 다른 발현 제어 서열, RNA 코딩 서열, 기타 등등일 수 있다. 염색체 서열 내로 외인성 서열의 통합은 "녹인"으로 명명된다.
당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 공여자 서열의 길이는 변할 수 있고 변할 것이다. 가령, 공여자 서열은 길이에서 여러 뉴클레오티드에서부터 수백 개의 뉴클레오티드 내지 수십만 개의 뉴클레오티드까지 변할 수 있다.
상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 일부 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류에 위치된 서열에 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류 서열 및 하류 서열과 측면에서 접한다. 이들 서열 유사성 때문에, 공여자 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 서열은 공여자 서열이 염색체 서열 내로 통합 (또는 이것과 교환)될 수 있도록, 공여자 폴리뉴클레오티드와 표적화된 염색체 서열 사이에 상동성 재조합을 허용한다.
상류 서열은 본원에서 이용된 바와 같이, 표적화된 부위의 상류에 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 유사하게, 하류 서열은 표적화된 부위의 하류에 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "실제적인 서열 동일성"은 최소한 약 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 지칭한다. 따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류와 하류 서열은 표적화된 부위의 상류 또는 하류에 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류와 하류 서열은 표적화된 부위의 상류 또는 하류에 염색체 서열과 약 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 한 구체예에서, 상류 서열은 표적화된 부위의 즉시 상류에 위치된 (즉, 표적화된 부위에 인접한) 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 상류 서열은 표적화된 부위로부터 상류에 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로서, 상류 서열은 표적화된 부위로부터 상류에 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유할 수 있다. 한 구체예에서, 하류 서열은 표적화된 부위의 즉시 하류에 위치된 (즉, 표적화된 부위에 인접한) 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 하류 서열은 표적화된 부위로부터 하류에 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로서, 하류 서열은 표적화된 부위로부터 하류에 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유할 수 있다.
각 상류 또는 하류 서열은 길이에서 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 5000개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 상류와 하류 서열은 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, 또는 5000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 상류와 하류 서열은 길이에서 약 50 내지 약 1500개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다.
표적화된 염색체 서열에 서열 유사성을 갖는 상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 환상일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드가 환상인 구체예에서, 이것은 벡터의 부분일 수 있다. 가령, 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.
표적화된 개열 부위(들)을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 다른 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 최소한 하나의 표적화된 개열 부위를 부가적으로 포함할 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드에 부가된 표적화된 개열 부위는 공여자 서열의 상류 또는 하류 또는 상류와 하류 둘 모두에 배치될 수 있다. 가령, 공여자 서열은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의한 개열 시에, 공여자 서열이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의한 개열 시에 산출된 염색체 서열 내에 것들과 양립하는 오버행과 측면에서 접하도록, 표적화된 개열 부위와 측면에서 접할 수 있다. 따라서, 공여자 서열은 비상동성 복구 과정에 의한 이중 가닥 절단의 복구 동안 개열된 염색체 서열과 결찰될 수 있다. 일반적으로, 표적화된 개열 부위(들)를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 환상일 것이다 (가령, 플라스미드 벡터의 부분일 수 있다).
임의선택적 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 다른 대안적 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 산출된 오버행과 양립하는 임의선택적 짧은 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 이런 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 복구 동안 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 일부 경우에, 공여자 서열은 약 1,000개보다 적거나, 약 500개보다 적거나, 약 250개보다 적거나, 또는 약 100개 보다 적은 뉴클레오티드일 수 있다. 일정한 경우에, 공여자 폴리뉴클레오티드는 평활 말단을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 다른 반복에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 5' 및/또는 3' 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 오버행은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
전형적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA일 것이다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 및/또는 선형 또는 환상일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 플라스미드, 세균 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 바이러스 벡터, DNA의 선형 조각, PCR 단편, 나신 핵산, 또는 전달 운반제, 예를 들면, 리포솜 또는 폴록사머로 복합화된 핵산일 수 있다. 일정한 구체예에서, 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터의 부분일 수 있다. 이들 환경 중에서 한 가지에서, 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 추가 서열을 더욱 포함할 수 있다.
(e) 세포 또는 배아 내로 도입
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(들) (또는 인코딩 핵산), 유도 RNA(들) (또는 인코딩 DNA), 그리고 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 다양한 수단에 의해 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 또는 배아는 형질감염된다. 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘-매개된 형질감염, 뉴클레오펙션 (또는 전기천공), 양이온성 중합체 형질감염 (가령, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 바이러스 형질도입, 비로솜 형질감염, 비리온 형질감염, 리포솜 형질감염, 양이온성 리포솜 형질감염, 면역리포솜 형질감염, 비리포솜 지질 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션, 리포펙션, 유전자 총 전달, 임팔레펙션, 소노포레이션, 광학적 형질감염, 그리고 핵산의 소유 작용제-증강된 흡수를 포함한다. 형질감염 방법은 당분야에서 널리 공지된다 (가령, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001을 참조한다). 다른 구체예에서, 이들 분자는 현미주입에 의해 세포 또는 배아 내로 도입된다. 전형적으로, 배아는 관심되는 종의 수태된 단세포 단계 배아이다. 가령, 이들 분자는 단세포 배아의 전핵 내로 주입될 수 있다.
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 (들) (또는 인코딩 핵산), 유도 RNA(들) (또는 유도 RNA를 인코딩하는 DNA), 그리고 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 동시에 또는 순차적으로 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 (들) (또는 인코딩 핵산) 내지 유도 RNA(들) (또는 인코딩 DNA)의 비율은 일반적으로, 이들이 RNA-단백질 복합체를 형성할 수 있도록 대략 화학양론적일 것이다. 한 구체예에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에서 함께 전달된다.
(f) 세포 또는 배아 배양
상기 방법은 유도 RNA(들)가 RNA-유도된 엔도뉴클레아제(들)를 염색체 서열 내에 표적화된 부위(들)로 향하게 하고, 그리고 RNA-유도된 엔도뉴클레아제(들)가 염색체 서열 내에 최소한 하나의 이중 가닥 절단을 도입하도록, 세포 또는 배아를 적절한 조건 하에 유지하는 것을 더욱 포함한다. 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합에 의해 변형되도록 DNA 복구 과정에 의해 복구될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있다. 따라서, 염색체 서열에서 서열이 코딩 영역의 해독틀이 이동될 수 있고, 그리고 염색체 서열이 비활성화되거나 또는 "적중"되도록 변형될 수 있다. 비활성화된 단백질-코딩 염색체 서열은 야생형 염색체 서열에 의해 코딩된 단백질을 발생시키지 못한다.
상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 이중 가닥 절단은 공여자 서열이 염색체 서열 내로 통합되도록 상동 재조합 (HDR) 과정에 의해 복구될 수 있다. 따라서, 외인성 서열이 세포 또는 배아의 유전체 내로 통합될 수 있거나, 또는 표적화된 염색체 서열이 야생형 염색체 서열에 대한 변형된 서열의 교환에 의해 변형될 수 있다.
표적화된 개열 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열과 공여자 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 개열할 수 있다. 선형 공여자 폴리뉴클레오티드는 NHEJ 과정을 통해, 공여자 폴리뉴클레오티드 및 개열된 염색체 서열 사이에 결찰에 의해 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다.
짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 짧은 공여자 서열은 NHEJ 과정을 통해, 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 통합은 짧은 공여자 서열 및 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 사이에 평활 말단의 결찰을 통해 진행할 수 있다. 대안으로, 통합은 개열된 염색체 서열에서 RNA-표적화 엔도뉴클레아제에 의해 산출된 것들과 양립하는 오버행과 측면에서 접하는 짧은 공여자 서열 사이에 점착 말단 (즉, 5' 또는 3' 오버행을 갖는)의 결찰을 통해 진행할 수 있다.
일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적절한 조건 하에 유지된다. 적합한 세포 배양 조건은 당분야에서 널리 공지되고 예로서, Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 그리고 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306에서 설명된다. 당업자는 세포를 배양하기 위한 방법이 당분야에서 공지되고 세포 유형에 따라 변할 수 있고 변할 것이라는 것을 인지한다. 모든 사례에서, 특정 세포 유형에 대한 최선의 기술을 결정하기 위해 일과적인 최적화가 이용될 수 있다.
배아는 시험관내에서 배양될 수 있다 (가령, 세포 배양에서). 전형적으로, 배아는 적절한 온도에서, 그리고 필요하면, RNA 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA의 발현을 허용하는데 필요한 O2/CO2 비율을 갖는 적절한 배지에서 배양된다. 배지의 적합한 무제한적 실례는 M2, M16, KSOM, BMOC, 그리고 HTF 배지를 포함한다. 당업자는 배양 조건이 배아의 종류에 따라 변할 수 있고 변할 것이라는 것을 인지할 것이다. 모든 사례에서, 특정 종류의 배아에 대한 최선의 배양 조건을 결정하기 위해 일과적인 최적화가 이용될 수 있다. 일부 경우에, 세포주는 시험관내-배양된 배아 (가령, 배아 줄기 세포주)로부터 유래될 수 있다.
대안으로, 배아는 배아를 암컷 숙주의 자궁 내로 이전함으로써 생체내에서 배양될 수 있다. 대체로 말하면, 암컷 숙주는 배아와 동일한 또는 유사한 종으로부터 유래된다. 바람직하게는, 암컷 숙주는 상상 임신이다. 상상 임신 암컷 숙주를 준비하는 방법은 당분야에서 공지된다. 부가적으로, 배아를 암컷 숙주 내로 이전하는 방법은 알려져 있다. 배아를 생체내에서 배양하는 것은 배아가 발달하도록 허용하고, 그리고 배아로부터 유래된 동물의 생존 출생을 유발할 수 있다. 이런 동물은 신체의 모든 세포에서 변형된 염색체 서열을 포함할 것이다.
(g) 세포와 배아 유형
다양한 진핵 세포와 배아가 상기 방법에서 이용하기에 적합하다. 가령, 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일반적으로, 배아는 비-인간 포유류 배아이다. 특정한 구체예에서, 배아는 단세포 비-인간 포유류 배아이다. 단세포 배아를 비롯한 예시적인 포유류 배아는 제한 없이, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 그리고 영장류 배아를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포는 제한 없이, 배아 줄기 세포, ES-유사 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 만능성 줄기 세포, 유도된 만능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 소기능성 줄기 세포, 단분화능 줄기 세포 등을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 세포는 포유류 세포이다.
적합한 포유류 세포의 무제한적 실례는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포; 생쥐 골수종 NS0 세포, 생쥐 배아 섬유모세포 3T3 세포 (NIH3T3), 생쥐 B 림프종 A20 세포; 생쥐 흑색종 B16 세포; 생쥐 근모세포 C2C12 세포; 생쥐 골수종 SP2/0 세포; 생쥐 배아 중간엽 C3H-10T1/2 세포; 생쥐 암종 CT26 세포, 생쥐 전립선 DuCuP 세포; 생쥐 유방 EMT6 세포; 생쥐 간암 Hepa1c1c7 세포; 생쥐 골수종 J5582 세포; 생쥐 상피 MTD-1A 세포; 생쥐 심근 MyEnd 세포; 생쥐 신장 RenCa 세포; 생쥐 췌장 RIN-5F 세포; 생쥐 흑색종 X64 세포; 생쥐 림프종 YAC-1 세포; 쥐 교모세포종 9L 세포; 쥐 B 림프종 RBL 세포; 쥐 신경모세포종 B35 세포; 쥐 간암 세포 (HTC); 버팔로 쥐 간 BRL 3A 세포; 개 신장 세포 (MDCK); 개 유방 (CMT) 세포; 쥐 골육종 D17 세포; 쥐 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환된 섬유모세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO-76) 세포; 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 A-431 세포, 그리고 인간 K562 세포를 포함한다. 포유류 세포주의 광범위한 목록은 American Type Culture Collection 카탈로그 (ATCC, Mamassas, VA)에서 발견될 수 있다.
(V) 융합 단백질을 이용하여 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법
본 발명의 다른 양상은 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 다음을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다: (a) 최소한 하나의 융합 단백질 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 여기서 상기 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하고, 그리고 (b) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 여기서 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질을 염색체 서열 내에 표적화된 부위로 유도하고, 그리고 융합 단백질의 작동체 도메인은 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절한다.
CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질은 상기 섹션 (II)에서 상술된다. 일반적으로, 본원에서 개시된 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 더욱 포함한다. 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 섹션 (III)에서 설명된다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 단리된 단백질로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다 (이것은 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다). 게다가, 단리된 융합 단백질은 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다 (이것은 캡핑되고 및/또는 폴리아데닐화될 수 있다). 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 가령, 융합 단백질 및 유도 RNA는 구별된 DNA 분자로서 또는 동일한 DNA 분자의 일부로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 DNA 분자는 플라스미드 벡터일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 아연 핑거 뉴클레아제를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제는 섹션 (II)(d)에서 전술된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된다. 분자를 세포 또는 배아 내로 도입하기 위한 수단뿐만 아니라 세포 또는 배아를 배양하기 위한 수단은 각각, 섹션 (IV)(e)와 (IV)(f)에서 전술된다. 적합한 세포와 배아는 섹션 (IV)(g)에서 전술된다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 일정한 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이들 2개의 유도 RNA는 융합 단백질을 염색체 서열 내에 2개의 상이한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 상기 융합 단백질은 2개의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내에 도입할 수 있도록 이합체화한다 (가령, 동종이합체를 형성한다). 도면 1A를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있다. 따라서, 표적화된 염색체 서열은 변형되거나 또는 비활성화될 수 있다. 가령, 단일 뉴클레오티드 변화 (SNP)가 변경된 단백질 산물을 발생시킬 수 있거나, 또는 코딩 서열의 해독틀에서 이동이 단백질 산물이 만들어지지 않도록 상기 서열을 비활성화시키거나 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 복구 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열의 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서, 공여자 서열은 상동 재조합 과정에 의해 매개된 복구 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 대안으로, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 (또는 양립성 오버행이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 원지에서 산출되는) 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 복구 동안 비상동성 복구 과정에 의해 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 염색체 서열 내로 공여자 서열의 교환 또는 통합은 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 외인성 서열을 세포 또는 배아의 염색체 서열 내로 도입한다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 상이한 융합 단백질 (또는 2개의 상이한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이들 융합 단백질은 상기 섹션 (II)에서 상술된 바와 같이 상이할 수 있다. 각 유도 RNA는 융합 단백질을 염색체 서열 내에 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 이들 융합 단백질은 2개의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내로 도입할 수 있도록 이합체화한다 (가령, 이형이합체를 형성한다). 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있도록, 비상동성 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 복구 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산), 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA), 그리고 1개의 아연 핑거 뉴클레아제 (또는 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함한다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 그리고 아연 핑거 뉴클레아제는 다른 염색체 서열에 지향되고, 여기서 융합 단백질 및 아연 핑거 뉴클레아제는 융합 단백질의 개열 도메인 및 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내로 도입할 수 있도록 이합체화한다. 도면 1B를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있도록, 비상동성 복구 과정에 의해 복구될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 복구 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 복구 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인인 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 여기서 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인은 각각, 표적화된 염색체 서열의 발현을 활성화시키거나 또는 억제한다. 도면 2A를 참조한다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 후성 변형 도메인인 대안적 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 여기서 후성 변형 도메인은 표적화된 염색체 서열의 구조를 변경한다. 도면 2A를 참조한다. 후성 변형은 아세틸화, 히스톤 단백질의 메틸화 및/또는 뉴클레오티드 메틸화를 포함한다. 일부 경우에, 염색체 서열의 구조적 변형은 염색체 서열의 발현에서 변화를 야기한다.
(VI) 유전적으로 변형된 세포와 동물
본 발명은 예로서, 본원에서 설명된 방법을 이용하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제-매개된 또는 융합 단백질-매개된 과정을 이용하여 변형된 최소한 하나의 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 비-인간 배아, 그리고 비-인간 동물을 포괄한다. 본 발명은 관심되는 염색체 서열에 표적화된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 DNA 또는 RNA 분자 또는 융합 단백질, 최소한 하나의 유도 RNA, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 관심되는 염색체 서열에 표적화된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 DNA 또는 RNA 분자, 최소한 하나의 유도 RNA, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 비-인간 배아를 제공한다.
본 발명은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 비-인간 배아, 또는 동물 세포를 제공한다. 변형된 염색체 서열은 (1) 비활성화되고, (2) 변경된 발현을 갖거나 또는 변경된 단백질 산물을 생산하고, 또는 (3) 통합된 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, RNA 유도된 엔도뉴클레아제-매개된 또는 융합 단백질-매개된 과정으로 변형된다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 한 가지 양상은 최소한 하나의 염색체 서열이 변형된 유전적으로 변형된 동물을 제공한다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 최소한 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 변형된 염색체 서열은 상기 서열이 전사되지 않고 및/또는 기능적 단백질 산물이 생산되지 않도록 비활성화될 수 있다. 따라서, 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 "녹아웃" 또는 "조건적 녹아웃"으로 명명될 수 있다. 비활성화된 염색체 서열은 결실 돌연변이 (즉, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실), 삽입 돌연변이 (즉, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입), 또는 넌센스 돌연변이 (즉, 종결 코돈이 도입되도록 다른 뉴클레오티드에 대한 단일 뉴클레오티드의 치환)를 포함할 수 있다. 돌연변이의 결과로서, 표적화된 염색체 서열이 비활성화되고 기능적 단백질이 생산되지 않는다. 비활성화된 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는다. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 염색체 서열이 비활성화되는 유전적으로 변형된 동물 역시 본원에서 포함된다.
다른 구체예에서, 변형된 염색체 서열은 변이체 단백질 산물을 코딩하도록 변경될 수 있다. 가령, 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 변경된 단백질 산물이 생산되도록, 표적화된 점 돌연변이(들) 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 염색체 서열은 최소한 하나의 뉴클레오티드가 변화되고, 그리고 발현된 단백질이 하나의 변화된 아미노산 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다 (미스센스 돌연변이). 다른 구체예에서, 염색체 서열은 하나 이상의 아미노산이 변화되도록, 하나 이상의 미스센스 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 부가적으로, 염색체 서열은 발현된 단백질이 단일 아미노산 결실 또는 삽입을 포함하도록, 3개의 뉴클레오티드 결실 또는 삽입을 갖도록 변형될 수 있다. 변경된 또는 변이체 단백질은 야생형 단백질과 비교하여 변경된 성질 또는 활성, 예를 들면, 변경된 기질 특이성, 변경된 효소 활성, 변경된 운동성 비율 등을 가질 수 있다.
다른 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함할 수 있다. 통합된 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 "녹인" 또는 "조건적 녹인"으로 명명될 수 있다. 염색체로 통합된 서열은 예로서, 이종상동성 단백질, 내인성 단백질, 또는 둘 모두의 조합을 인코딩할 수 있다. 한 구체예에서, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 염색체 서열이 비활성화되지만 외인성 서열이 발현되도록, 단백질을 인코딩하는 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 이런 경우에, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 염색체 서열의 발현에 영향을 주지 않으면서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 가령, 단백질을 인코딩하는 서열은 "안전한 항구" 좌위, 예를 들면, Rosa26 좌위, HPRT 좌위, 또는 AAV 좌위 내로 통합될 수 있다. 본 발명은 또한, 단백질(들)을 인코딩하는 서열을 비롯하여, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상 서열이 유전체 내로 통합되는 유전적으로 변형된 동물을 포괄한다.
단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 관심되는 단백질의 야생형 형태를 인코딩할 수 있거나 또는 단백질의 변경된 이형이 생산되도록 최소한 하나의 변형을 포함하는 단백질을 인코딩할 수 있다. 가령, 질환 또는 장애에 관련된 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 생산된 단백질의 변경된 이형이 연관된 장애를 유발하거나 또는 강력하게 하도록 최소한 하나의 변형을 포함할 수 있다. 대안으로, 질환 또는 장애에 관련된 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 단백질의 변경된 이형이 연관된 장애의 발달에 대항하여 보호하도록 최소한 하나의 변형을 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 기능적 인간 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함하는 "인간화" 동물일 수 있다. 기능적 인간 단백질은 유전적으로 변형된 동물에서 상응하는 오르소로그 없음을 가질 수 있다. 대안으로, 유전적으로 변형된 동물이 유래되는 야생형 동물은 기능적 인간 단백질에 상응하는 오르소로그를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, "인간화" 동물 내에 이종상동성 서열은 기능적 단백질이 만들어지지 않도록 비활성화되고, 그리고 "인간화" 동물은 인간 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 단백질의 발현 패턴이 변경되도록, 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있다. 가령, 단백질의 발현을 제어하는 조절 영역, 예를 들면, 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위는 단백질이 과다생산되거나, 또는 단백질의 조직 특이적 또는 일시적 발현이 변경되거나, 또는 이들의 조합이 되도록 변경될 수 있다. 대안으로, 단백질의 발현 패턴은 조건적 녹아웃 시스템을 이용하여 변경될 수 있다. 조건적 녹아웃 시스템의 무제한적 실례는 Cre-lox 재조합 시스템을 포함한다. Cre-lox 재조합 시스템은 핵산 분자 내에 특정한 부위 (lox 부위) 사이에 핵산 서열의 재조합을 촉매작용할 수 있는 부위 특이적 DNA 재조합효소인 Cre 재조합효소 효소를 포함한다. 일시적인 조직 특이적 발현을 산출하기 위해 이러한 시스템을 이용하는 방법은 당분야에서 공지된다. 일반적으로, 유전적으로 변형된 동물은 염색체 서열에 접하는 lox 부위에서 산출된다. lox-접하는 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 이후, Cre 재조합효소를 발현하는 다른 유전적으로 변형된 동물과 교차될 수 있다. lox-접하는 염색체 서열을 포함하는 자손 동물 및 Cre 재조합효소가 이후 생산되고, 그리고 lox-접하는 염색체 서열이 재조합되어, 단백질을 인코딩하는 염색체 서열의 결실 또는 역전을 야기한다. Cre 재조합효소의 발현은 염색체 서열의 일시적으로 및 조건적으로 조절된 재조합을 산출하기 위해 일시적으로 및 조건적으로 조절될 수 있다.
이들 구체예 중에서 한 가지에서, 본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물은 변형된 염색체 서열에 대해 이형접합성일 수 있다. 대안으로, 유전적으로 변형된 동물은 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성일 수 있다.
본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물을 창출하기 위해 또는 하나 또는 그 이상의 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성인 동물을 창출하기 위해 교배될 수 있다. 가령, 동일한 변형된 염색체 서열을 포함하는 2마리 동물이 교배되어 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성 동물을 창출할 수 있다. 대안으로, 상이한 변형된 염색체 서열을 갖는 동물이 교배되어 양쪽 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물을 창출할 수 있다.
가령, 비활성화된 염색체 서열 유전자 "x"를 포함하는 첫 번째 동물은 인간 유전자 "X" 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열을 포함하는 두 번째 동물과 교차되어, 비활성화된 유전자 "x" 염색체 서열 및 염색체로 통합된 인간 유전자 "X" 서열 둘 모두를 포함하는 "인간화" 유전자 "X" 자손을 발생시킬 수 있다. 또한, 인간화 유전자 "X" 동물은 인간화 유전자 "Y" 동물과 교차되어 인간화 유전자 X/유전자 Y 자손을 창출할 수 있다. 당업자는 많은 조합이 가능하다는 것을 인지할 것이다.
다른 구체예에서, 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물은 변형된 염색체 서열을 다른 유전자 배경과 합동하기 위해 교배될 수 있다. 무제한적 실례에 의하여, 다른 유전자 배경은 야생형 유전자 배경, 결실 돌연변이를 갖는 유전자 배경, 다른 표적화된 통합을 갖는 유전자 배경, 그리고 비표적화된 통합을 갖는 유전자 배경을 포함할 수 있다.
용어 "동물"은 본원에서 이용된 바와 같이, 비-인간 동물을 지칭한다. 동물은 배아, 소아, 또는 성체일 수 있다. 적합한 동물은 척추동물, 예를 들면, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 조개류, 그리고 어류를 포함한다. 적합한 포유동물의 실례는 제한 없이, 설치류, 반려 동물, 가축, 그리고 영장류를 포함한다. 설치류의 무제한적 실례는 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스쥐, 그리고 기니 피그를 포함한다. 적합한 반려 동물에는 고양이, 개, 토끼, 헤지호그, 그리고 흰담비가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 가축의 무제한적 실례는 말, 염소, 양, 돼지, 소, 라마, 그리고 알파카를 포함한다. 적합한 영장류에는 카푸친 원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋, 타마린, 거미 원숭이, 다람쥐 원숭이, 그리고 버빗 원숭이가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 조류의 무제한적 실례는 닭, 칠면조, 오리, 그리고 거위를 포함한다. 대안으로, 동물은 무척추동물, 예를 들면, 곤충, 선충, 기타 등등일 수 있다. 곤충의 무제한적 실례는 초파리 (Drosophila) 및 모기를 포함한다. 예시적인 동물은 쥐이다. 적합한 쥐 혈통의 무제한적 실례는 Dahl Salt-Sensitive, Fischer 344, Lewis, Long Evans Hooded, Sprague-Dawley, 그리고 Wistar를 포함한다. 한 구체예에서, 동물은 유전적으로 변형된 생쥐가 아니다. 본 발명을 위한 적합한 동물의 각 전술한 반복에서, 동물은 외인성으로 도입된, 무작위로 통합된 트랜스포손 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가 양상은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주를 제공한다. 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주는 본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물 중에서 한 가지로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, 상기 본원에서 (동물에서 염색체 서열 변형을 설명하는 단락에서) 설명된 바와 같이 세포에서 변형될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 세포 또는 세포주의 용해물을 포괄한다.
일반적으로, 이들 세포는 진핵 세포이다. 적합한 숙주 세포는 곰팡이류 또는 효모, 예를 들면, 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 또는 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces); 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)로부터 SF9 세포 또는 노랑초파리 (Drosophila melanogaster)로부터 S2 세포; 그리고 동물 세포, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 비-인간 영장류, 또는 인간 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 포유류이다. 포유류 세포는 일차 세포일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 절단에 민감한 임의의 일차 세포가 이용될 수 있다. 이들 세포는 다양한 세포 유형, 예를 들면, 섬유모세포, 근모세포, T 또는 B 세포, 대식세포, 상피 세포, 기타 등등일 수 있다.
포유류 세포주가 이용될 때, 상기 세포주는 아직 설명되지 않은 임의의 확립 세포주 또는 일차 세포주일 수 있다. 세포주는 유착성 또는 비유착성이거나, 또는 세포주는 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여, 유착성, 비유착성 또는 기관형적 성장을 고무하는 조건 하에 성장될 수 있다. 적합한 포유류 세포와 세포주의 무제한적 실례는 본원에서 섹션 (IV)(g)에서 제공된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포의 무제한적 실례는 섹션 (IV)(g)에서 제공된다.
본 발명은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 배아 역시 제공한다. 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, 상기 본원에서 (동물에서 염색체 서열 변형을 설명하는 단락에서) 설명된 바와 같이 배아에서 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 배아는 관심되는 동물 종의 비-인간 수태된 단세포 단계 배아이다. 단세포 배아를 비롯하여, 예시적인 포유류 배아는 제한 없이, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 그리고 영장류 배아를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용된 바와 같이, 다음 용어는 달리 특정되지 않으면, 그들에 생득된 의미를 갖는다.
본 발명의 원소 또는 이의 바람직한 구체예(들)를 소개할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 이들 원소 중에서 하나 또는 그 이상이 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "포함하는" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되고, 그리고 열거된 원소 이외에 추가 원소가 있을 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "내인성 서열"은 세포에 선천적인 염색체 서열을 지칭한다.
용어 "외인성"은 본원에서 이용된 바와 같이, 세포에 선천적이지 않은 서열, 또는 세포의 유전체 내에 선천적 위치가 상이한 염색체 위치에 있는 염색체 서열을 지칭한다.
"유전자"는 본원에서 이용된 바와 같이, 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역 (엑손과 인트론 포함)뿐만 아니라 이런 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는 지에 상관없이 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예를 들면, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 원소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위, 그리고 좌위 제어 영역을 포함하지만, 이들에 반드시 한정되지는 않는다.
용어 "이종유래"는 관심되는 세포에 내인성이거나 또는 선천적이지 않은 실체를 지칭한다. 가령, 이종단백질은 외인성 공급원, 예를 들면, 외인성으로 도입된 핵산 서열로부터 유래되거나 또는 이것으로부터 최초 유래되었던 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 이종 단백질은 관심되는 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는다.
용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 환상 입체형태에서, 그리고 단일- 또는 이중 가닥 형태에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적으로, 이들 용어는 중합체의 길이에 대하여 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 이들 용어는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티 (가령, 포스포로티오에이트 중추)에서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-짝짓기 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 그리고 우리딘) 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 (가령, 이노신) 또는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티 상에서 변형의 무제한적 실례는 아세틸 기, 아미노 기, 카르복실 기, 카르복시메틸 기, 히드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기, 그리고 티올 기의 부가 (또는 제거)뿐만 아니라 염기의 탄소와 질소 원자의 다른 원자 (가령, 7-데아자 퓨린)로 치환을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금된 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 그리고 모르폴리노를 포함한다.
용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다.
핵산과 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당분야에서 공지된다. 전형적으로, 이런 기술은 유전자의 경우에 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 이에 따른 인코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 그리고 이들 서열을 두 번째 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 유전체학 서열 역시 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응을 지칭한다. 2개 또는 그 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열인지에 상관없이, 두 서열의 퍼센트 동일성은 더욱 짧은 서열의 길이에 의해 나눗셈되고 100에 의해 곱셈된, 두 정렬된 서열 사이에 정확한 매치의 숫자이다. 핵산 서열에 대한 근사 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of 단백질 서열s and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, 그리고 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화된 채점 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행은 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 "BestFit" 유용성 애플리케이션에서 제공된다. 서열 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당분야에서 전반적으로 공지되어 있다, 예로서, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터에서 이용된 BLAST이다. 가령, BLASTN과 BLASTP는 다음 디폴트 파라미터를 이용하여 이용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 모두; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비다중, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss 단백질+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세는 GenBank 웹사이트 상에서 발견될 수 있다.
다양한 변화가 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 설명된 세포와 방법에서 만들어질 수 있었기 때문에, 상기 설명에서 및 아래 제공된 실시예에서 내포된 모든 물질은 예시적인 것으로 해석되고 제한하는 의미로 해석되지 않는 것으로 의도된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 일정한 양상을 예증한다.
실례 1: 포유류 발현을 위한 Cas9 유전자의 변형
스트렙토콕쿠스 피오게네스 (스트렙토콕쿠스 피오게네스) 균주 MGAS15252 (수탁 번호 YP_005388840.1)로부터 Cas9 유전자는 포유류 세포에서 이의 번역을 증강하기 위해 호모사피엔스 코돈 선호로 최적화되었다. Cas9 유전자는 또한, 상기 단백질을 포유류 세포의 핵 내로 표적화하기 위해 C 말단에서 핵 국지화 신호 PKKKRKV (서열 번호:1)를 부가함으로써 변형되었다. 표 1은 변형된 Cas9 아미노산 서열을 제공하는데, 핵 국지화 서열은 밑줄 그어진다. 표 2는 코돈 최적화된, 변형된 Cas9 DNA 서열을 제공한다.
변형된 Cas9 아미노산 서열
QEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDPKKKRKV (서열 번호:9)
최적화된 Cas9 DNA 서열 (5'-3')
CCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTG (서열 번호:10)
변형된 Cas9 DNA 서열은 포유류 세포에서 구성적 발현을 위해 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 변형된 Cas9 DNA 서열은 또한, T7 RNA 중합효소로 시험관내 mRNA 합성을 위해 T7 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 시험관내 RNA 전사는 MessageMAX T7 ARCA-캡핑된 Message 전사 키트 및 T7 mScript 표준 mRNA 생산 시스템 (Cellscript)을 이용함으로써 수행되었다. 실시예 2: Cas9 표적화
아데노 연관된 바이러스 통합 부위 1 (AAVS1) 좌위가 Cas9-매개된 인간 유전체 변형을 위한 표적으로서 이용되었다. 인간 AAVS1 좌위는 단백질 포스파타아제 1, 조절 아단위 12C (PPP1R12C)의 인트론 1 (4427 bp)에서 위치된다. 표 3은 PPP1R12C의 첫 번째 엑손 (음영된 회색) 및 첫 번째 인트론을 제공한다. 인트론 내에 밑줄 그어진 서열은 표적화된 변형 부위 (즉, AAVS1 좌위)이다.
Figure 112020084583510-pat00001
Figure 112020084583510-pat00002
Cas9 유도 RNA는 인간 AAVS1 좌위를 표적으로 하도록 설계되었다. 표적 인식 서열 (즉, 표적 서열의 비코딩 가닥에 상보적인 서열) 및 프로토스페이서 서열을 포함하는 42개 뉴클레오티드 RNA (본원에서 "crRNA" 서열로 지칭됨) (5'에서 3'); crRNA의 3' 서열에 상보성을 갖는 5' 서열 및 추가 헤어핀 서열을 포함하는 85개 뉴클레오티드 RNA (본원에서 "tracrRNA" 서열로 지칭됨); 그리고 crRNA의 뉴클레오티드 1-32, GAAA 루프 및 tracrRNA의 뉴클레오티드 19-45를 포함하는 키메라 RNA가 제조되었다. crRNA는 Sigma-Aldrich에 의해 화학적으로 합성되었다. tracrRNA 및 키메라 RNA는 T7-Scribe 표준 RNA IVT 키트 (Cellscript)를 이용하여, T7 RNA 중합효소로 시험관내 전사에 의해 합성되었다. 키메라 RNA 코딩 서열 역시 인간 세포에서 생체내 전사를 위해 인간 U6 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 표 4는 유도 RNA의 서열을 제공한다.
유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
AAVS1-crRNA ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 12
tracrRNA GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU 13
키메라 RNA ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG 14
실시예 3: 유전체 변형을 모니터링하기 위한 공여자 폴리뉴클레오티드의 제조 PPP1R12C의 N 말단 내로 GFP 단백질의 표적화된 통합이 Cas9-매개된 유전체 변형을 모니터링하는데 이용되었다. 상동성 재조합에 의한 통합을 매개하기 위해, 공여자 폴리뉴클레오티드가 제조되었다. AAVS1-GFP DNA 공여자는 5' (1185 bp) AAVS1 좌위 상동성 팔, RNA 스플라이싱 수용체, 터보 GFP 코딩 서열, 3' 전사 종결인자, 그리고 3' (1217 bp) AAVS1 좌위 상동성 팔을 내포하였다. 표 5는 RNA 스플라이싱 수용체 및 GFP 코딩 서열, 그 이후에 3' 전사 종결인자의 서열을 제공한다. 플라스미드 DNA는 GenElute 내독소-없는 플라스미드 Maxiprep 키트 (Sigma)를 이용함으로써 제조되었다.
AAVS1-GFP DNA 공여자 서열에서 서열
5'-3' 서열 서열 번호:
RNA 스플라이싱 수용체 CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG 15
GFP 코딩 서열과 전사 종결인자 GCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGTCGACTCTAGAGCTGCAGAGAGCGACGAGAGCGGCCTGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCGAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGATGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCGTCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGATCTGGATGGCAGCTTCACCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTCCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGGATCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCGGATGCAGATGCCGGTGAAGAATGAAGATCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGACTCGAGGTTTAAACGTCGACGCGGCCGCGT 16
표적화된 유전자 통합은 PPP1R12C의 첫 107개 아미노산 및 터보 GFP 사이에 융합 단백질을 유발할 것이다. 예상된 융합 단백질은 PPP1R12C의 첫 번째 엑손 및 가공된 스플라이스 수용체 사이에 RNA 스플라이싱으로부터 PPP1R12C의 첫 107개 아미노산 잔기 (회색으로 강조됨)를 내포한다 (표 6 참조).
PPP1R12C-GFP 융합 단백질의 예측된 아미노산 서열.
MSGEDGPAAGPGAAAAAARERRREQLRQWGARAGAEPGPGERRARTVRFERAAEFLAACAGGDLDEARLMLRAADPGPGAELDPAAPPPARAVLDSTNADGISALHQATMDYKDDDDKVDSRAAESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMGTGFPEDSVIFTDKIVRSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEE (서열 번호:17)
실시예 4: Cas9-매개된 표적화된 통합 형질감염이 인간 K562 세포에서 수행되었다. K562 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 획득되고, 그리고 10% FBS와 2 mM L-글루타민으로 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지에서 성장되었다. 모든 배지와 보충물은 Sigma-Aldrich로부터 획득되었다. 배양액은 형질감염 하루 전에 분할되었다 (형질감염 이전 mL당 대략 0.5 백만 세포에서). 세포는 T-016 프로그램에 따라 뉴클레오펙터 (Lonza) 상에서 뉴클레오펙터 용액 V (Lonza)로 형질감염되었다. 각 뉴클레오펙션은 대략 0.6 백만 세포를 내포하였다. 형질감염 처리는 표 7에서 상술된다. 세포는 뉴클레오펙션 직후에 37 ℃ 및 5% CO2에서 성장되었다.
형질감염 처리.
처리 변형된 Cas9 유도 RNA 공여자 서열
A
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된 Cas9 mRNA (10 μg)		 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선 (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
B
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된 Cas9 mRNA (10 μg)		 키메라 RNA (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
C
전사후 캡핑 반응을 통해 캡핑된 Cas9 mRNA (10 μg)		 키메라 RNA (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
D Cas9 플라스미드 DNA (10 μg) U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA (5 μg) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
E 없음 없음 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
F 없음 없음 없음
형광-활성화된 세포 분류 (FACS)가 형질감염 후 4 일에 수행되었다. FACS 데이터는 도면 4에서 제공된다. 4가지 실험적 처리 (A-D) 각각에서 검출된 퍼센트 GFP는 대조 처리 (E, F)에서보다 보다 컸는데, 이것은 공여자 서열의 통합 및 융합 단백질의 발현을 확증한다. 실시예 5: 표적화된 통합의 PCR 확증
유전체학 DNA는 형질감염 후 12 일에 GenElute 포유류 유전체학 DNA Miniprep 키트 (Sigma)로, 형질감염된 세포로부터 추출되었다. 유전체학 DNA는 이후, AAVS1-GFP 플라스미드 공여자의 5' 상동성 팔 외측에 위치된 전방 프라이머 및 GFP의 5' 영역에서 위치된 후방 프라이머로 PCR 증폭되었다. 전방 프라이머는 5'- CCACTCTGTGCTGACCACTCT-3' (서열 번호:18)이고, 그리고 후방 프라이머는 5'- GCGGCACTCGATCTCCA-3' (서열 번호:19)이었다. 접합부 PCR로부터 예상된 단편 크기는 1388 bp이었다. 증폭은 다음 순환 조건을 이용하여, JumpStart Taq ReadyMix (Sigma)로 수행되었다: 초기 변성을 위한 98℃에서 2 분; 98℃에서 15 초, 62℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 1분 30 초의 35회 주기; 그리고 72℃에서 5 분 동안 최종 신장. PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 상에서 분해되었다.
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된Cas9 mRNA 10 μg, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 세포는 예상된 크기의 PCR 산물을 전시하였다 (참조: 레인 A, 도면 5).
실시예 6: 생쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 편집
생쥐 Rosa26 좌위가 유전체 변형을 위해 표적화될 수 있다. 표 8은 잠재적 표적 부위가 굵은 글씨체로 표시되는 생쥐 Rosa26 서열의 부분을 제공한다. 각 표적 부위는 프로토스페이서를 포함한다.
생쥐 Rosa26 서열
GAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAAGGAAAATGGGAGGATAGGTAGTCATCTGGGGTTTTATGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCTCGGAGTATTTTCCATCGAGGTAGATTAAAGACATGCTCACCCGAGTTTTATACTCTCCTGCTTGAGATCCTTACTACAGTATGAAATTACAGTGTCGCGAGTTAGACTATGTAAGCAGAATTTTA (서열 번호:20)
유도 RNA는 생쥐 Rosa26 좌위에서 각 표적 부위를 표적으로 하도록 설계되었다. 서열은 표 9에서 도시되는데, 각각 길이에서 42개 뉴클레오티드이고, 그리고 5' 영역이 표 8에서 제공되지 않은 가닥 (즉, 표 8에서 도시된 가닥에 상보적인 가닥)에 상보적이다.
생쥐 Rosa26 유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
mRosa26-crRNA-1 CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 21
mRosa26-crRNA-2 UGAACAGGUGUAAAAUUGGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 22
mRosa26-crRNA-3 UGUCGGGAAGUUUUUUAAUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 23
crRNA가 화학적으로 합성되고 tracrRNA에 미리 어닐링되었다 (서열 번호:13; 실시예 2 참조). 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9 단백질을 인코딩하는 시험관내 전사된 mRNA (서열 번호. 9; 실시예 1 참조)는 수태된 생쥐 배아의 전핵 내로 미량주사될 수 있다. crRNA에 의한 표적 세트로 유도 시에, Cas9 단백질은 표적 부위를 개열하고, 그리고 결과의 이중 가닥 절단이 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정을 통해 복구될 수 있다. 주사된 배아는 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 또는 최대 4 일 동안 배양되고, 그 이후에 유전형자분석될 수 있거나, 또는 주사된 배아는 생존 출산 동물이 유전자형분석될 수 있도록 수용자 암컷 생쥐 내로 이식될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직은 표준 방법을 이용하여, Rosa 좌위에서 Cas9-유발 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 가령, 태아 또는 생존 출산 동물로부터 배아 또는 조직은 DNA 추출과 분석을 위해 수확될 수 있다. DNA는 표준 절차를 이용하여 단리될 수 있다. Rosa26 좌위의 표적화된 영역은 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있다. 돌연변이는 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, Cel-I 불일치 검정 및 DNA 염기서열결정을 이용하여 검출될 수 있다. 실시예 7: 생쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 변형
Rosa26 좌위는 상기 실시예 6에서 설명된 바와 같은 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9를 인코딩하는 mRNA와 함께, 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된 바와 같이, 공여자 폴리뉴클레오티드를 공동 주사함으로써 생쥐 배아에서 변형될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직 (실시예 6에서 설명된 바와 같이)은 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, RFLP 검정, 접합부 PCR, 그리고 DNA 염기서열결정을 이용하여, 변형된 Rosa26 좌위에 대해 스크리닝될 수 있다.
실시예 8: 쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 편집
쥐 Rosa26 좌위가 유전체 변형을 위해 표적화될 수 있다. 표 10은 잠재적 표적 부위가 굵은 글씨체로 표시되는 쥐 서열의 부분을 제공한다. 각 표적 부위는 프로토스페이서를 포함한다.
쥐 Rosa26 서열
GGGATTCCTCCTTGAGTTGTGGCACTGAGGAACGTGCTGAACAAGACCTACATTGCACTCCAGGGAGTGGATGAAGGAGTTGGGGCTCAGTCGGGTTGTATTGGAGACAAGAAGCACTTGCTCTCCAAAAGTCGGTTTGAGTTATCATTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGAGAAAAGGCCGCACCCTTCTCAGGACGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGTCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGAAGATTCCCTTCCCCCTTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTGGAGTCTTTCTGGAAGATAGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGCGTGGGGCGTTGTCCTGCAGAGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGGCAAGACTTCCCACAGATTTTCGATTGTGTTGTTAAGTATTGTAATAGGGGCAAATAAGGGAAATAGACTAGGCACTCACCTGGGGTTTTATGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCCTGGAGAATTTTTCACCGAGGTAGATTGAAGACATGCCCACCCAAATTTTAATATTCTTCCACTTGCGATCCTTGCTACAGTATGAAA (서열 번호:24)
유도 RNA는 쥐 Rosa26 좌위에서 각 표적 부위를 표적으로 하도록 설계되었다. 서열은 표 11에서 도시되는데, 각각 길이에서 42개 뉴클레오티드이고, 그리고 5' 영역이 표 10에서 제공되지 않은 가닥 (즉, 표 10에서 도시된 가닥에 상보적인 가닥)에 상보적이다.
쥐 Rosa26 유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
rRosa26-crRNA-1 AGGGGGAAGGGAAUCUUCCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 25
rRosa26-crRNA-2 UCUGCAACUGGAGUCUUUCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 26
rRosa26-crRNA-3 AGGCGGGAGUCUUCUGGGCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 27
crRNA가 화학적으로 합성되고 tracrRNA에 미리 어닐링되었다 (서열 번호:13; 실시예 2 참조). 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9 단백질을 인코딩하는 시험관내 전사된 mRNA (서열 번호. 9; 실시예 1 참조)는 수태된 쥐 배아의 전핵 내로 미량주사될 수 있다. crRNA에 의한 표적 세트로 유도 시에, Cas9 단백질은 표적 부위를 개열하고, 그리고 결과의 이중 가닥 절단이 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정을 통해 복구될 수 있다. 주사된 배아는 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 또는 최대 4 일 동안 배양되고, 그 이후에 유전형자분석될 수 있거나, 또는 주사된 배아는 생존 출산 동물이 유전자형분석될 수 있도록 수용자 암컷 생쥐 내로 이식될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직은 표준 방법을 이용하여, Rosa 좌위에서 Cas9-유발 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 가령, 태아 또는 생존 출산 동물로부터 배아 또는 조직은 DNA 추출과 분석을 위해 수확될 수 있다. DNA는 표준 절차를 이용하여 단리될 수 있다. Rosa26 좌위의 표적화된 영역은 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 복구 동안 일어날 수 있다. 돌연변이는 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, Cel-I 불일치 검정 및 DNA 염기서열결정을 이용하여 검출될 수 있다. 실시예 9: 쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 변형
Rosa26 좌위는 상기 실시예 8에서 설명된 바와 같은 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9를 인코딩하는 mRNA와 함께, 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된 바와 같이, 공여자 폴리뉴클레오티드를 공동 주사함으로써 쥐 배아에서 변형될 수 있다. 생존 출산 쥐로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직 (실시예 8에서 설명된 바와 같이)은 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, RFLP 검정, 접합부 PCR, 그리고 DNA 염기서열결정을 이용하여, 변형된 Rosa26 좌위에 대해 스크리닝될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC CHEN, Fuqiang DAVIS, Gregory D. KANG, Qiaohua KNIGHT, Scott W. <120> CRISPR-BASED GENOME MODIFICATION AND REGULATION <130> 047497-465606 <150> US 61/734,256 <151> 2012-12-06 <150> US 61/758,624 <151> 2013-01-30 <150> US 61/761,046 <151> 2013-02-05 <150> US 61/794,422 <151> 2013-03-15 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val 20 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 5 Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Pro Lys 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ccgcttcaac 540 tggccctggg cttagccact ctgtgctgac cactctgccc caggcctcct taccattccc 600 cttcgaccta ctctcttccg cattggagtc gctttaactg gccctggctt tggcagcctg 660 tgctgaccca tgcagtcctc cttaccatcc ctccctcgac ttcccctctt ccgatgttga 720 gcccctccag ccggtcctgg actttgtctc cttccctgcc ctgccctctc ctgaacctga 780 gccagctccc atagctcagt ctggtctatc tgcctggccc tggccattgt cactttgcgc 840 tgccctcctc tcgcccccga gtgcccttgc tgtgccgccg gaactctgcc ctctaacgct 900 gccgtctctc tcctgagtcc ggaccacttt gagctctact ggcttctgcg ccgcctctgg 960 cccactgttt ccccttccca ggcaggtcct gctttctctg acctgcattc tctcccctgg 1020 gcctgtgccg ctttctgtct gcagcttgtg gcctgggtca cctctacggc tggcccagat 1080 ccttccctgc cgcctccttc aggttccgtc ttcctccact ccctcttccc cttgctctct 1140 gctgtgttgc tgcccaagga tgctctttcc ggagcacttc cttctcggcg ctgcaccacg 1200 tgatgtcctc tgagcggatc ctccccgtgt ctgggtcctc tccgggcatc tctcctccct 1260 cacccaaccc catgccgtct tcactcgctg ggttcccttt tccttctcct tctggggcct 1320 gtgccatctc tcgtttctta ggatggcctt ctccgacgga tgtctccctt gcgtcccgcc 1380 tccccttctt gtaggcctgc atcatcaccg tttttctgga caaccccaaa gtaccccgtc 1440 tccctggctt tagccacctc tccatcctct tgctttcttt gcctggacac cccgttctcc 1500 tgtggattcg ggtcacctct cactcctttc atttgggcag ctcccctacc ccccttacct 1560 ctctagtctg tgctagctct tccagccccc tgtcatggca tcttccaggg gtccgagagc 1620 tcagctagtc ttcttcctcc aacccgggcc cctatgtcca cttcaggaca gcatgtttgc 1680 tgcctccagg gatcctgtgt ccccgagctg ggaccacctt atattcccag ggccggttaa 1740 tgtggctctg gttctgggta cttttatctg tcccctccac cccacagtgg ggccactagg 1800 gacaggattg gtgacagaaa agccccatcc ttaggcctcc tccttcctag tctcctgata 1860 ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca gattccttat ctggtgacac acccccattt 1920 cctggagcca tctctctcct tgccagaacc tctaaggttt gcttacgatg gagccagaga 1980 ggatcctggg agggagagct tggcaggggg tgggagggaa gggggggatg cgtgacctgc 2040 ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc tctcccagaa cctgagctgc tctgacgcgg 2100 ccgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc tgcagcttcc ttacacttcc caagaggaga 2160 agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag ttggtcctga gttctaactt tggctcttca 2220 cctttctagt ccccaattta tattgttcct ccgtgcgtca gttttacctg tgagataagg 2280 ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg tggtgaggag gggggtgtcc gtgtggaaaa 2340 ctccctttgt gagaatggtg cgtcctaggt gttcaccagg tcgtggccgc ctctactccc 2400 tttctctttc tccatccttc tttccttaaa gagtccccag tgctatctgg gacatattcc 2460 tccgcccaga gcagggtccc gcttccctaa ggccctgctc tgggcttctg ggtttgagtc 2520 cttggcaagc ccaggagagg cgctcaggct tccctgtccc ccttcctcgt ccaccatctc 2580 atgcccctgg ctctcctgcc ccttccctac aggggttcct ggctctgctc ttcagactga 2640 gccccgttcc cctgcatccc cgttcccctg catccccctt cccctgcatc ccccagaggc 2700 cccaggccac ctacttggcc tggaccccac gagaggccac cccagccctg tctaccaggc 2760 tgccttttgg gtggattctc ctccaactgt ggggtgactg cttggcaaac tcactcttcg 2820 gggtatccca ggaggcctgg agcattgggg tgggctgggg ttcagagagg agggattccc 2880 ttctcaggtt acgtggccaa gaagcagggg agctgggttt gggtcaggtc tgggtgtggg 2940 gtgaccagct tatgctgttt gcccaggaca gcctagtttt agcactgaaa ccctcagtcc 3000 taggaaaaca gggatggttg gtcactgtct ctgggtgact cttgattccc ggccagtttc 3060 tccacctggg gctgtgtttc tcgtcctgca tccttctcca ggcaggtccc caagcatcgc 3120 ccccctgctg tggctgttcc caagttctta gggtacccca cgtgggttta tcaaccactt 3180 ggtgaggctg gtaccctgcc cccattcctg caccccaatt gccttagtgg ctagggggtt 3240 gggggctaga gtaggagggg ctggagccag gattcttagg gctgaacaga gaagagctgg 3300 gggcctgggc tcctgggttt gagagaggag gggctggggc ctggactcct gggtccgagg 3360 gaggaggggc tggggcctgg actcctgggt ctgagggtgg agggactggg ggcctggact 3420 cctgggtccg agggaggagg ggctggggcc tggactcgtg ggtctgaggg aggaggggct 3480 gggggcctgg acttctgggt cttagggagg cggggctggg cctggacccc tgggtctgaa 3540 tggggagagg ctgggggcct ggactccttc atctgagggc ggaagggctg gggcctggcc 3600 tcctgggttg aatggggagg ggttgggcct ggactctgga gtccctggtg cccaggcctc 3660 aggcatcttt cacagggatg cctgtactgg gcaggtcctt gaaagggaaa ggcccattgc 3720 tctccttgcc cccctcccct atcgccatga caactgggtg gaaataaacg agccgagttc 3780 atcccgttcc cagggcacgt gcggcccctt cacagcccga gtttccatga cctcatgctc 3840 ttggccctcg tagctccctc ccgcctcctc cagatgggca gctttggaga ggtgagggac 3900 ttggggggta atttatcccg tggatctagg agtttagctt cactccttcc tcagctccag 3960 ttcaggtccc ggagcccacc cagtgtccac aaggcctggg gcaagtccct cctccgaccc 4020 cctggacttc ggcttttgtc cccccaagtt ttggacccct aagggaagaa tgagaaacgg 4080 tggcccgtgt cagcccctgg ctgcagggcc ccgtgcagag ggggcctcag tgaactggag 4140 tgtgacagcc tggggcccag gcacacaggt gtgcagctgt ctcacccctc tgggagtccc 4200 gcccaggccc ctgagtctgt cccagcacag ggtggccttc ctccaccctg catagccctg 4260 ggcccacggc ttcgttcctg cagagtatct gctggggtgg tttccgagct tgacccttgg 4320 aaggacctgg ctgggtttaa ggcaggaggg gctgggggcc aggactcctg gctctgaagg 4380 aggaggggct ggaacctctt ccctagtctg agcactggaa gcgccacctg tgggtggtga 4440 cgggggtttt gccgtgtcta acaggtacca tgtggggttc ccgcacccag atgagaagcc 4500 ccctcccttc cccgttcact tcctgtttgc agatagccag gagtcctttc gtggtttcca 4560 ctgagcactg aaggcctggc cggcctgacc actgggcaac caggcgtatc ttaaacagcc 4620 agtggccaga ggctgttggg tcattttccc cactgtccta gcaccgtgtc cctggatctg 4680 ttttcgtggc tccctctgga gtcccgactt gctgggacac cgtggctggg gtaggtgcgg 4740 ctgacggctg tttcccaccc ccag 4764 <210> 12 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 12 accccacagu ggggccacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 13 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 13 ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60 aguggcaccg agucggugcu uuuuuu 86 <210> 14 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 14 accccacagu ggggccacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cg 62 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 15 ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25 <210> 16 <211> 1009 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 16 gccaccatgg actacaaaga cgatgacgac aaggtcgact ctagagctgc agagagcgac 60 gagagcggcc tgcccgccat ggagatcgag tgccgcatca ccggcaccct gaacggcgtg 120 gagttcgagc tggtgggcgg cggagagggc acccccgagc agggccgcat gaccaacaag 180 atgaagagca ccaaaggcgc cctgaccttc agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc 240 tacggcttct accacttcgg cacctacccc agcggctacg agaacccctt cctgcacgcc 300 atcaacaacg gcggctacac caacacccgc atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg 360 cacgtgagct tcagctaccg ctacgaggcc ggccgcgtga tcggcgactt caaggtgatg 420 ggcaccggct tccccgagga cagcgtgatc ttcaccgaca agatcgtccg cagcaacgcc 480 accgtggagc acctgcaccc catgggcgat aacgatctgg atggcagctt cacccgcacc 540 ttcagcctgc gcgacggcgg ctactacagc tccgtggtgg acagccacat gcacttcaag 600 agcgccatcc accccagcat cctgcagaac gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg 660 gaggaggatc acagcaacac cgagctgggc atcgtggagt accagcacgc cttcaagacc 720 ccggatgcag atgccggtga agaatgaaga tctctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 780 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 840 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 900 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 960 atgcggtggg ctctatggac tcgaggttta aacgtcgacg cggccgcgt 1009 <210> 17 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 17 Met Ser Gly Glu Asp Gly Pro Ala Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Arg Glu Arg Arg Arg Glu Gln Leu Arg Gln Trp Gly Ala Arg 20 25 30 Ala Gly Ala Glu Pro Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ala Arg Thr Val Arg 35 40 45 Phe Glu Arg Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ala Cys Ala Gly Gly Asp Leu 50 55 60 Asp Glu Ala Arg Leu Met Leu Arg Ala Ala Asp Pro Gly Pro Gly Ala 65 70 75 80 Glu Leu Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser 85 90 95 Thr Asn Ala Asp Gly Ile Ser Ala Leu His Gln Ala Thr Met Asp Tyr 100 105 110 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val Asp Ser Arg Ala Ala Glu Ser Asp Glu 115 120 125 Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly Thr Leu 130 135 140 Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr Pro Glu 145 150 155 160 Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His 180 185 190 Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His Ala Ile 195 200 205 Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Arg Ile Glu Lys Tyr Glu Asp Gly 210 215 220 Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Arg Val 225 230 235 240 Ile Gly Asp Phe Lys Val Met Gly Thr Gly Phe Pro Glu Asp Ser Val 245 250 255 Ile Phe Thr Asp Lys Ile Val Arg Ser Asn Ala Thr Val Glu His Leu 260 265 270 His Pro Met Gly Asp Asn Asp Leu Asp Gly Ser Phe Thr Arg Thr Phe 275 280 285 Ser Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Val Val Asp Ser His Met 290 295 300 His Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile Leu Gln Asn Gly Gly Pro 305 310 315 320 Met Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Asp His Ser Asn Thr Glu Leu 325 330 335 Gly Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr Pro Asp Ala Asp Ala 340 345 350 Gly Glu Glu 355 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 18 ccactctgtg ctgaccactc t 21 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 19 gcggcactcg atctcca 17 <210> 20 <211> 711 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 gagcggctgc ggggcgggtg caagcacgtt tccgacttga gttgcctcaa gaggggcgtg 60 ctgagccaga cctccatcgc gcactccggg gagtggaggg aaggagcgag ggctcagttg 120 ggctgttttg gaggcaggaa gcacttgctc tcccaaagtc gctctgagtt gttatcagta 180 agggagctgc agtggagtag gcggggagaa ggccgcaccc ttctccggag gggggagggg 240 agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct gctgcctcct ggcttctgag gaccgccctg 300 ggcctgggag aatcccttcc ccctcttccc tcgtgatctg caactccagt ctttctagaa 360 gatgggcggg agtcttctgg gcaggcttaa aggctaacct ggtgtgtggg cgttgtcctg 420 caggggaatt gaacaggtgt aaaattggag ggacaagact tcccacagat tttcggtttt 480 gtcgggaagt tttttaatag gggcaaataa ggaaaatggg aggataggta gtcatctggg 540 gttttatgca gcaaaactac aggttattat tgcttgtgat ccgcctcgga gtattttcca 600 tcgaggtaga ttaaagacat gctcacccga gttttatact ctcctgcttg agatccttac 660 tacagtatga aattacagtg tcgcgagtta gactatgtaa gcagaatttt a 711 <210> 21 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 21 cuccagucuu ucuagaagau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 22 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 22 ugaacaggug uaaaauugga guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 23 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 23 ugucgggaag uuuuuuaaua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 24 <211> 642 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 24 gggattcctc cttgagttgt ggcactgagg aacgtgctga acaagaccta cattgcactc 60 cagggagtgg atgaaggagt tggggctcag tcgggttgta ttggagacaa gaagcacttg 120 ctctccaaaa gtcggtttga gttatcatta agggagctgc agtggagtag gcggagaaaa 180 ggccgcaccc ttctcaggac gggggagggg agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct 240 gctgcctcct gtcttctgag gaccgccctg ggcctggaag attcccttcc cccttcttcc 300 ctcgtgatct gcaactggag tctttctgga agataggcgg gagtcttctg ggcaggctta 360 aaggctaacc tggtgcgtgg ggcgttgtcc tgcagaggaa ttgaacaggt gtaaaattgg 420 aggggcaaga cttcccacag attttcgatt gtgttgttaa gtattgtaat aggggcaaat 480 aagggaaata gactaggcac tcacctgggg ttttatgcag caaaactaca ggttattatt 540 gcttgtgatc cgccctggag aatttttcac cgaggtagat tgaagacatg cccacccaaa 600 ttttaatatt cttccacttg cgatccttgc tacagtatga aa 642 <210> 25 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 25 agggggaagg gaaucuucca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 26 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 26 ucugcaacug gagucuuucu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 27 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 27 aggcgggagu cuucugggca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

Claims (31)

  1. 다음을 포함하는 벡터:
    (a) 진핵 세포에서 최소한 하나의 유도 RNA의 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결된 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 코딩 서열, 이 때 각 유도 RNA는
    (i) 표적 부위와 염기쌍을 이룰 수 있는 진핵세포 염색체 서열 내 표적 부위에 상보적인 첫 번째 영역,
    (ii) 줄기 및 루프 구조를 형성하는 두 번째 영역, 및
    (iii) 실질적으로 단일 가닥인 세 번째 영역
    을 포함하고,
    이 때, 상기 (i), (ii), 및 (iii)은 5' 에서 3' 방향으로 배열되고, 그리고
    (b) 진핵 세포에서의 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동적으로 연결된 조작된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 코딩 서열, 이 때 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 유형 II CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제이고,
    이 때 (a) 및 (b)는 동일 또는 상이한 벡터에 위치하고,
    이에 의해, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 유도 RNA에 의해 특정 핵산 서열에 지향되고 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 상기 특정 핵산 서열을 절단함으로써, 상기 핵산 서열은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환 또는 이의 조합에 의해 변형되는, 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유도 RNA는 2개의 별개의 분자들을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유도 RNA의 첫 번째 분자는 유도 RNA의 첫 번째 영역 및 유도 RNA의 두 번째 영역의 줄기의 한 쪽 절반을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 유도 RNA의 두 번째 분자는 유도 RNA의 두 번째 영역의 줄기의 다른 쪽 절반 및 유도 RNA의 세 번째 영역을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  5. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 RNA의 첫 번째 영역은 약 10 뉴클레오티드 내지 약 25개 보다 많은 뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  6. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 RNA의 두 번째 영역은 약 16 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는, 벡터.
  7. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 RNA의 세 번째 영역은 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는, 벡터.
  8. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 단 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 비기능적 RuvC-유사 도메인을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 비기능적 HNH-유사 도메인을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  11. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 스트렙토콕쿠스 종에서 유래함을 특징으로 하는, 벡터.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 스트렙토콕쿠스 피오게네스에서 유래함을 특징으로 하는, 벡터.
  13. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, NLS는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 C-말단에 위치함을 특징으로 하는, 벡터.
  14. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 진핵세포 발현에 최적화된 DNA에 의해 인코드됨을 특징으로 하는, 벡터.
  15. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 벡터들은 추가 발현 제어 서열들을 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  16. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도 RNA 및 유형 II CRISPR/Cas9 단백질은 동일한 벡터에서 인코드됨을 특징으로 하는, 벡터.
  17. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 상류에 존재함을 특징으로 하는, 벡터.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 PAM은 표적 부위의 바로 하류에 존재함을 특징으로 하는, 벡터.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 PAM은 NGG 또는 NGGNG이고, 이 때 N은 임의의 뉴클레오티드로 정의됨을 특징으로 하는, 벡터.
  20. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터들은 플라스미드 벡터들임을 특징으로 하는, 벡터.
  21. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터들은 바이러스 벡터임을 특징으로 하는, 벡터.
  22. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 진핵세포 염색체 서열 내 표적 부위에 이중 가닥 절단을 도입하고, 이러한 절단은 DNA 복구 과정에 의해 복구됨으로써 상기 서열을 변형시킴을 특징으로 하는, 벡터.
  23. 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 벡터.
  24. 진핵 세포의 염색체 서열을 변형하는 방법으로서, 청구항 1-4 중 어느 한 항의 벡터, 및 선택적으로, 공여자 서열을 포함하는 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포와 함께 배양하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 방법은 인간의 생식 계열 유전자 동일성을 변형하기 위한 과정을 포함하지 않고 수술 또는 치료에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료를 포함하지 않는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 염색체 서열은 DNA 복구 과정에 의해 복구되어, 염색체 서열이 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이의 조합에 의해 변형됨을 특징으로 하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 DNA 복구 과정은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 복구 과정임을 특징으로 하는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상류 및 하류 서열들을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 이 때 상기 DNA 복구 과정은 상동 재조합 (HDR)이고, 공여자 서열은 염색체 서열내 통합됨을 특징으로 하는, 방법.
  28. 청구항 24에 있어서, 상기 염색체 서열은 진핵 세포에 존재하고, 이 때 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 또는 비포유류 척추동물 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  29. 청구항 24에 있어서, 상기 염색체 서열은 진핵 세포에 존재하고, 이 때 진핵 세포는 무척추동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 또는 단일 세포 진핵 생물체임을 특징으로 하는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  31. 청구항 24에 있어서, 상기 염색체 서열은 비-인간 포유류 배아에 존재함을 특징으로 하는, 방법.
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Families Citing this family (379)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
EP2638157B1 (en) 2010-11-12 2015-07-22 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
EP4039363A1 (en) 2010-11-12 2022-08-10 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) * 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
EP4001427A1 (en) 2012-04-24 2022-05-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
ES2683071T3 (es) 2012-04-25 2018-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
CN104685116A (zh) 2012-06-25 2015-06-03 Gen9股份有限公司 用于核酸组装和高通量测序的方法
JP2015527889A (ja) * 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
SG11201503059XA (en) * 2012-10-23 2015-06-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
SG11201504523UA (en) * 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105633A (ko) * 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
CN105121641A (zh) * 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
EP2971184B1 (en) 2013-03-12 2019-04-17 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
JP2016512048A (ja) * 2013-03-15 2016-04-25 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した植物ゲノム操作
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using tru-grnas to increase the specificity of RNA-guided genome editing
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20160186208A1 (en) * 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
CN116083487A (zh) * 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
CA2913865C (en) * 2013-05-29 2022-07-19 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP3603679B1 (en) * 2013-06-04 2022-08-10 President and Fellows of Harvard College Rna-guided transcriptional regulation
EP3004370B1 (en) * 2013-06-05 2024-08-21 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
US20160145631A1 (en) 2013-06-14 2016-05-26 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
CA2915845A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
MX2016002306A (es) 2013-08-22 2016-07-08 Du Pont Promotor u6 de polimerasa iii de soja y metodos de uso.
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
DE202014010413U1 (de) * 2013-09-18 2015-12-08 Kymab Limited Zellen und Organismen
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
EP3460063B1 (en) 2013-12-11 2024-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
CA2932472A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
KR20160097327A (ko) 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법
WO2015089462A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for genome editing
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
US10787654B2 (en) * 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
EP4063503A1 (en) 2014-02-11 2022-09-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
BR112016019068A2 (pt) 2014-02-18 2017-10-10 Univ Duke construto, vetor recombinante, composição farmacêutica, método de inibição de replicação viral ou expressão de uma sequência alvo em uma célula infectada com um vírus, polipeptídeo de sau cas9 recombinante, construto de sau cas9 recombinante, construto recombinante para expressão de um rna guia individual e kit
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
WO2015138510A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Editas Medicine., Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
AU2015236128A1 (en) * 2014-03-25 2016-11-10 Editas Medicine Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CA2944978C (en) 2014-04-08 2024-02-13 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
CN111647627A (zh) 2014-04-28 2020-09-11 重组股份有限公司 多重基因编辑
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
EP3708671A1 (en) 2014-06-06 2020-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modifying a targeted locus
AU2015277369B2 (en) * 2014-06-16 2021-08-19 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the expression of CRISPR guide RNAs using the H1 promoter
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
CA2953499C (en) 2014-06-23 2023-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated dna assembly
US9902971B2 (en) 2014-06-26 2018-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing a mouse XY embryonic (ES) cell line capable of producing a fertile XY female mouse in an F0 generation
US20170198268A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
EP3169776A4 (en) * 2014-07-14 2018-07-04 The Regents of The University of California Crispr/cas transcriptional modulation
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN113789317B (zh) * 2014-08-06 2024-02-23 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
US10450584B2 (en) 2014-08-28 2019-10-22 North Carolina State University Cas9 proteins and guiding features for DNA targeting and genome editing
EP3188763B1 (en) 2014-09-02 2020-05-13 The Regents of The University of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
MX2017002930A (es) 2014-09-12 2017-06-06 Du Pont Generacion de sitios de integracion especifica de sitio para loci de rasgos complejos en maiz y soja, y metodos de uso.
CA2963840A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
CN113930455A (zh) * 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
ES2741387T3 (es) 2014-10-15 2020-02-10 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para generar o mantener células pluripotentes
US20170306306A1 (en) * 2014-10-24 2017-10-26 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination
EP3708155A1 (en) * 2014-10-31 2020-09-16 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
US10208298B2 (en) 2014-11-06 2019-02-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Peptide-mediated delivery of RNA-guided endonuclease into cells
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
CN107532142A (zh) * 2014-11-11 2018-01-02 应用干细胞有限公司 使用同源重组改造间充质干细胞
KR20160059994A (ko) 2014-11-19 2016-05-27 기초과학연구원 두 개의 벡터로부터 발현된 Cas9 단백질을 이용한 유전자 발현 조절 방법
SI3221457T1 (sl) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljno genetsko modifikacijo z uporabo vodilnih RNK v parih
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
AU2015355546B2 (en) 2014-12-03 2021-10-14 Agilent Technologies, Inc. Guide RNA with chemical modifications
EP3229586A4 (en) 2014-12-10 2018-10-24 Regents of the University of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016100819A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
EP3250688B1 (fr) 2015-01-29 2021-07-28 Meiogenix Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees
EP3280803B1 (en) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
JP2018522249A (ja) 2015-04-24 2018-08-09 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド Ｃａｓ９分子／ガイドｒｎａ分子複合体の評価
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
US11845928B2 (en) 2015-05-04 2023-12-19 Tsinghua University Methods and kits for fragmenting DNA
EP3294896A1 (en) 2015-05-11 2018-03-21 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
EP4039816A1 (en) 2015-05-29 2022-08-10 North Carolina State University Methods for screening bacteria, archaea, algae, and yeast using crispr nucleic acids
WO2016196887A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
JP7396783B2 (ja) 2015-06-09 2023-12-12 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 移植を改善するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連方法および組成物
JP7051438B2 (ja) 2015-06-15 2022-04-11 ノース カロライナ ステート ユニバーシティ 核酸およびｒｎａに基づく抗菌剤の効率的な送達のための方法および組成物
JP2018521689A (ja) * 2015-06-17 2018-08-09 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法
CN109536474A (zh) 2015-06-18 2019-03-29 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US20160376610A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Sigma-Aldrich Co. Llc Cell cycle dependent genome regulation and modification
EP3328399B1 (en) 2015-07-31 2023-12-27 Regents of the University of Minnesota Modified cells and methods of therapy
EP3334746B1 (en) 2015-08-14 2021-11-24 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
EP3341727B1 (en) 2015-08-25 2022-08-10 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CA2996888A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US11667911B2 (en) 2015-09-24 2023-06-06 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve CRISPR/CAS-mediated genome editing
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
WO2017066497A2 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
PL3846375T3 (pl) 2015-10-22 2023-04-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Sposoby i aparat związane z selektywnym wzmacnianiem sygnałów
IL294014B2 (en) * 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2017079406A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
US10240145B2 (en) * 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
KR20180095719A (ko) 2016-01-11 2018-08-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 면역요법 방법
IL260532B2 (en) 2016-01-11 2023-12-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chaperone proteins and their uses for controlling gene expression
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
EP4047092A1 (en) 2016-04-13 2022-08-24 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
AU2017250683A1 (en) * 2016-04-14 2018-11-01 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
CN109715803B (zh) * 2016-04-25 2023-07-07 巴塞尔大学 等位基因编辑及其应用
AU2017268458B2 (en) 2016-05-20 2022-07-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAS
EP3907286A1 (en) * 2016-06-02 2021-11-10 Sigma-Aldrich Co., LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
BR112018074930A2 (pt) * 2016-06-03 2019-03-12 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, partícula de entrega, composição farmacêutica, célula hospedeira, método para edição do genoma e método e kit para prevenção e/ou tratamento de uma doença
WO2017213896A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of hiv-1 by gene editing strategy
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
US10253316B2 (en) 2017-06-30 2019-04-09 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
JP2019518478A (ja) 2016-06-24 2019-07-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ バーコードを付けたコンビナトリアルライブラリーを生成する方法
US11603533B2 (en) 2016-07-12 2023-03-14 Washington University Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells
EP4230648A3 (en) 2016-07-28 2023-10-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gpr156 variants and uses thereof
AU2017302657A1 (en) 2016-07-29 2019-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice comprising mutations resulting in expression of c-truncated fibrillin-1
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
JP2019524149A (ja) * 2016-08-20 2019-09-05 アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
WO2018048827A1 (en) * 2016-09-07 2018-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Rna-guided endonuclease-based dna assembly
CN106636197B (zh) * 2016-09-22 2019-09-03 南京市妇幼保健院 一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
JP2019532644A (ja) * 2016-09-30 2019-11-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
JP2019534890A (ja) * 2016-10-11 2019-12-05 ステムジェニクス， インコーポレイテッド 遺伝子編集ツールによって機能化されたナノ粒子および関連する方法
KR20190067209A (ko) 2016-10-14 2019-06-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 후성적으로 조절되는 부위-특이적 뉴클레아제
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2604416B (en) 2016-10-18 2023-03-15 Univ Minnesota Tumor infiltating lymphocytes and methods of therapy
KR20240043810A (ko) * 2016-11-02 2024-04-03 유니버시타트 바셀 세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체
EP3561059B1 (en) * 2016-12-23 2024-10-09 Institute for Basic Science Composition for base editing for animal embryo and base editing method
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP4095263A1 (en) 2017-01-06 2022-11-30 Editas Medicine, Inc. Methods of assessing nuclease cleavage
KR102619197B1 (ko) 2017-01-23 2024-01-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Hsd17b13 변종 및 이것의 용도
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
CN106978438B (zh) * 2017-02-27 2020-08-28 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
US12058986B2 (en) 2017-04-20 2024-08-13 Egenesis, Inc. Method for generating a genetically modified pig with inactivated porcine endogenous retrovirus (PERV) elements
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018201086A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
AU2018273968A1 (en) 2017-05-25 2019-11-28 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
CA3065938A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
MX2019015188A (es) 2017-06-15 2020-08-03 Univ California Inserciones de adn no virales orientadas.
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
SG11201911886PA (en) 2017-06-27 2020-01-30 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
IL309801B1 (en) 2017-07-11 2024-08-01 Sigma Aldrich Co Llc Use of protein domains interacting with the nucleosome to enhance targeted genome modification
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
BR112019027673A2 (pt) 2017-07-31 2020-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. animal não humano, e, métodos para testar a recombinação induzida por crispr/cas e para otimizar a capacidade de crispr/cas
US11021719B2 (en) 2017-07-31 2021-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing CRISPER/Cas-mediated disruption or excision and CRISPR/Cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
KR20200017479A (ko) * 2017-07-31 2020-02-18 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr/cas 활성제 시스템용 합성 유도 rna
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
KR102631985B1 (ko) * 2017-08-09 2024-02-01 라이스텍, 인크. 게놈을 변형시키기 위한 조성물 및 방법
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3678680A4 (en) * 2017-09-05 2021-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITING SYSTEM CONTAINING A SINGLE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATION AND USE
WO2019050899A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. SINGLE IMMUNOGLOBULIN INTERLEUKIN 1 (SIGIRR) RELATED INTERCEPTOR-RELATED VARIANTS AND USES THEREOF
AU2018330458A1 (en) 2017-09-07 2020-03-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Solute Carrier Family 14 Member 1 (SLC14A1) variants and uses thereof
BR112020003609A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. sistema e método para formar uma emulsão
US10435713B2 (en) 2017-09-30 2019-10-08 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
US11634716B2 (en) 2017-10-16 2023-04-25 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Genetically modified mesenchymal stem cells for use in cardiovascular prosthetics
KR20200065045A (ko) 2017-10-16 2020-06-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 코눌린(crnn) 변이체 및 이의 용도
IL274179B2 (en) 2017-10-27 2024-02-01 Univ California Targeted replacement of endogenous T cell receptors
WO2019089808A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Class 2 crispr/cas compositions and methods of use
US20190141966A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising SLC30A8 Mutation And Methods Of Use
EP3710583A1 (en) * 2017-11-16 2020-09-23 Astrazeneca AB Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
KR102709884B1 (ko) 2017-11-30 2024-09-26 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 trkb 유전자좌를 포함하는 비인간 동물
WO2019126578A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
US11293019B2 (en) 2017-12-22 2022-04-05 Gflas Life Sciences, Inc. Chimeric genome engineering molecules and methods
CN111566121A (zh) 2018-01-12 2020-08-21 巴斯夫欧洲公司 小麦7a染色体上决定每穗小穗数QTL的基因
WO2019147302A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Bauer Daniel E Targeting bcl11a distal regulatory elements with a cas9-cas9 fusion for fetal hemoglobin reinduction
KR102465067B1 (ko) 2018-02-15 2022-11-10 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
WO2019165168A1 (en) 2018-02-23 2019-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 orthologs
SG11202008956XA (en) 2018-03-14 2020-10-29 Editas Medicine Inc Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP7334178B2 (ja) 2018-03-19 2023-08-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した動物での転写モジュレーション
AU2019241967A1 (en) 2018-03-29 2020-11-19 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
JP7555822B2 (ja) 2018-04-19 2024-09-25 ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア ゲノム編集のための組成物および方法
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US20210324381A1 (en) * 2018-04-27 2021-10-21 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Therapeutic genome editing in x-linked hyper igm syndrome
WO2019213430A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for nicking target dna sequences
SG11202010837XA (en) 2018-05-10 2020-11-27 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
CN108624622A (zh) * 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
KR20210045360A (ko) 2018-05-16 2021-04-26 신테고 코포레이션 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
CN112384063A (zh) 2018-06-07 2021-02-19 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 再生及转殖大麻的方法
US11827892B2 (en) 2018-06-07 2023-11-28 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Nucleic acid constructs and methods of using same
CN112469834A (zh) * 2018-06-25 2021-03-09 生物纳米基因公司 Dna的标记
CA3108767A1 (en) 2018-06-30 2020-01-02 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
BR112021001904A2 (pt) * 2018-08-03 2021-05-04 Beam Therapeutics Inc. editores de nucleobase multiefetores e métodos de usar os mesmos para modificar uma sequência alvo de ácido nucleico
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
KR102103103B1 (ko) 2018-08-16 2020-04-21 (주)라트바이오 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아
WO2020041313A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Down-regulation of the cytosolic dna sensor pathway
WO2020081149A2 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
CN109055379B (zh) * 2018-09-10 2022-04-15 石铭 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法
KR102121817B1 (ko) * 2018-09-12 2020-06-26 한국화학연구원 Crispr 편집 기술을 이용한 재조합 항원을 발현시키는 벡터 및 이를 동시에 다중 삽입시키는 방법
CA3112612C (en) 2018-09-13 2024-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Complement factor h gene knockout rat as a model of c3 glomerulopathy
EP3861120A4 (en) 2018-10-01 2023-08-16 North Carolina State University RECOMBINANT TYPE I CRISPR-CAS SYSTEM
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
JP7460643B2 (ja) 2018-10-16 2024-04-02 ブルーアレル， エルエルシー 遺伝子へのｄｎａの標的化挿入のための方法
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. MODIFIED ENZYMES
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
US20220380740A1 (en) * 2018-10-24 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
CN113166744A (zh) 2018-12-14 2021-07-23 先锋国际良种公司 用于基因组编辑的新颖crispr-cas系统
JP2022515124A (ja) 2018-12-19 2022-02-17 キングス カレッジ ロンドン 免疫療法および組成物
CA3120799A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
AU2020204917A1 (en) * 2019-01-04 2021-08-19 The University Of Chicago Systems and methods for modulating RNA
US20220136004A1 (en) * 2019-01-11 2022-05-05 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Targeted In Vivo Genome Modification
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
US10982200B2 (en) 2019-02-14 2021-04-20 Metagenomi Ip Technologies, Llc Enzymes with RuvC domains
EP3924477A4 (en) * 2019-02-14 2023-03-29 Metagenomi, Inc. ENZYMES WITH RUVC DOMAINS
KR20210139271A (ko) 2019-02-15 2021-11-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr/cas 융합 단백질 및 시스템
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
CA3130789A1 (en) 2019-03-07 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
IL286357B2 (en) 2019-03-18 2024-10-01 Regeneron Pharmaceuticals Inc A CRISPR/CAS screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
WO2020190927A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
WO2020191243A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020206162A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
SG11202108454RA (en) 2019-04-04 2021-09-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
CA3133359C (en) 2019-04-04 2023-04-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
US20220220495A1 (en) 2019-05-10 2022-07-14 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
JP2022534867A (ja) 2019-06-04 2022-08-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ベータスリップ変異を有するヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物と使用方法
AU2020288623A1 (en) 2019-06-06 2022-01-06 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
CN113939595A (zh) 2019-06-07 2022-01-14 瑞泽恩制药公司 包括人源化白蛋白基因座的非人动物
WO2020252340A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
EP3986909A4 (en) 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021050398A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 The Regents Of The University Of California Synthetic lethality screening platform for cells undergoing alt
US20230203515A1 (en) 2019-09-12 2023-06-29 Basf Se Regulatory Nucleic Acid Molecules for Enhancing Gene Expression in Plants
EP4028063A1 (en) 2019-09-13 2022-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CN110628825A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 上海捷易生物科技有限公司 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法
CN114746125A (zh) 2019-11-08 2022-07-12 瑞泽恩制药公司 用于x连锁青少年型视网膜劈裂症疗法的crispr和aav策略
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
EP4069852A1 (en) 2019-12-03 2022-10-12 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
EP4069837A4 (en) 2019-12-10 2024-03-13 Inscripta, Inc. NEW MAD NUCLEASES
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US20230042273A1 (en) 2019-12-16 2023-02-09 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Improved genome editing using paired nickases
US11008557B1 (en) 2019-12-18 2021-05-18 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US20230059309A1 (en) * 2020-01-09 2023-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Two-step gene swap
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
CA3157061A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Christian SILTANEN Electroporation modules and instrumentation
EP4096396A1 (en) 2020-01-28 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
WO2021158883A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
KR20230004456A (ko) 2020-03-04 2023-01-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 면역 요법에 대한 종양 세포의 감작화를 위한 방법 및 조성물
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
CN116096877A (zh) 2020-03-31 2023-05-09 宏基因组学公司 Ii类ii型crispr系统
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
EP4171215A2 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
CN111849986A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用
EP4214314A4 (en) 2020-09-15 2024-10-16 Inscripta Inc CRISPR EDITING TO EMBED NUCLEIC ACID LANDING PADS INTO LIVING CELL GENOMES
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240058390A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-22 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Wnt+ adipocytes, exosomes from wnt+ adipocytes, and methods of making and using them
EP4271802A1 (en) 2021-01-04 2023-11-08 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
AU2022210762A1 (en) * 2021-01-22 2023-08-24 Metagenomi, Inc. Novel engineered and chimeric nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
US20240247285A1 (en) 2021-05-10 2024-07-25 Sqz Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
EP4347826A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
JP2024534945A (ja) 2021-09-10 2024-09-26 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
KR20240082391A (ko) 2021-10-14 2024-06-10 론자 세일즈 아게 세포외 소포 생산을 위한 변형된 생산자 세포
CN118251491A (zh) 2021-10-28 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 用于敲除C5的CRISPR/Cas相关方法及组合物
CA3237300A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023081847A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023122506A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
IL313765A (en) 2021-12-22 2024-08-01 Tome Biosciences Inc Joint provision of a gene editor structure and a donor template
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023250384A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024083579A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024107670A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers
WO2024138194A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Tome Biosciences, Inc. Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion
WO2024159071A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA

Family Cites Families (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
FR2763797B1 (fr) * 1997-05-30 1999-07-16 Tabacs & Allumettes Ind Cigarette a tres faible taux de goudron presentant un gout de tabac comparable a celui d'une cigarette classique a plus fort taux de goudron
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
JP2002535995A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復
US8183339B1 (en) * 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2002026967A2 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Thomas Jefferson University Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
EP1328543B1 (en) 2000-10-27 2009-08-12 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
CA2921821A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
AU2003251286B2 (en) 2002-01-23 2007-08-16 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
WO2003087993A2 (en) 2002-04-09 2003-10-23 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
AU2003233719A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Modifying the dna recombination potential in eukaryotes
WO2004037977A2 (en) 2002-09-05 2004-05-06 California Institute Of Thechnology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
DE10260805A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
US20070134796A1 (en) * 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
CA2534296C (en) * 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
JP2008525029A (ja) * 2004-12-22 2008-07-17 ニュークレオニクス・インコーポレイテッド 遺伝子サイレンシングに有用なｈｂｖおよびｈｃｖ保存配列
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US20060282289A1 (en) 2005-06-14 2006-12-14 Healthmatch Solutions, Llc System and method for health care financing
WO2007014181A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-01 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
US10066233B2 (en) 2005-08-26 2018-09-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of modulating cell resistance
KR100877824B1 (ko) * 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
ES2448491T3 (es) * 2006-03-02 2014-03-14 The Ohio State University Research Foundation Perfil de expresión de microARN asociado con cáncer de páncreas
EP1994182B1 (en) 2006-03-15 2019-05-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
US20080300385A1 (en) * 2006-03-28 2008-12-04 Victoria Sharma Covalently-linked complexes of HIV Tat and Env proteins
US9193974B2 (en) 2006-05-10 2015-11-24 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
ES2590925T3 (es) 2006-05-19 2016-11-24 Dupont Nutrition Biosciences Aps Microorganismos marcados y métodos de marcado
WO2007139982A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
AU2007258872A1 (en) 2006-06-16 2007-12-21 Danisco A/S Bacterium
EP2518155B1 (en) * 2006-08-04 2014-07-23 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
TR201905633T4 (tr) 2007-03-02 2019-05-21 Dupont Nutrition Biosci Aps İyileştirilmiş faj direnci olan kültürler.
GB0806086D0 (en) 2008-04-04 2008-05-14 Ulive Entpr Ltd Dendrimer polymer hybrids
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
KR20160015400A (ko) 2008-08-22 2016-02-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
WO2010030963A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies
WO2010054108A2 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
RU2570562C2 (ru) 2008-11-07 2015-12-10 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Последовательности crispr бифидобактерий
EP2367938B1 (en) 2008-12-12 2014-06-11 DuPont Nutrition Biosciences ApS Genetic cluster of strains of streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
US8392349B2 (en) 2009-02-23 2013-03-05 Shalini Vajjhala Global adaptation atlas and method of creating same
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
SG175839A1 (en) 2009-04-30 2011-12-29 San Raffaele Centro Fond Gene vector
CA2767377A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Llc Method for genome editing
US20120192298A1 (en) * 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
AU2010281705B2 (en) 2009-07-28 2015-02-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders
KR101418355B1 (ko) 2009-10-23 2014-07-11 (주)바이오니아 고밀도 유전자 합성기
DE102009052674B4 (de) 2009-11-12 2012-10-18 Karl Weinhold Verfahren und Vorrichtung zum Verbinden von Doppelmantelrohren
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
US8586363B2 (en) 2009-12-10 2013-11-19 Regents Of The University Of Minnesota TAL effector-mediated DNA modification
JP2013518602A (ja) 2010-02-09 2013-05-23 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 部分的に一本鎖のドナー分子による標的化ゲノム改変
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
BR112012028805A2 (pt) 2010-05-10 2019-09-24 The Regents Of The Univ Of California E Nereus Pharmaceuticals Inc composições de endorribonuclease e métodos de uso das mesmas.
EP3156062A1 (en) * 2010-05-17 2017-04-19 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
EP2392208B1 (en) * 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
US20110201118A1 (en) 2010-06-14 2011-08-18 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
KR20180121665A (ko) * 2010-07-23 2018-11-07 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 표적화 엔도뉴클레아제 및 단일-가닥 핵산을 사용하는 게놈 편집
DK2601611T3 (da) 2010-08-02 2021-02-01 Integrated Dna Tech Inc Fremgangsmåder til forudsigelse af stabilitet og smeltetemperaturer for nukleinsyreduplekser
DK2630156T3 (en) 2010-10-20 2018-12-17 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR-CAS SEQUENCES OF LACTOCOCCUS
US9403880B2 (en) * 2010-11-26 2016-08-02 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications
US20120214241A1 (en) 2010-12-22 2012-08-23 Josee Laganiere Zinc finger nuclease modification of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2) mutant fibroblasts and ipscs
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
CN103917644A (zh) 2011-09-21 2014-07-09 桑格摩生物科学股份有限公司 调控转基因表达的方法和组合物
EP2780460B1 (en) 2011-11-16 2018-07-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Modified dna-binding proteins and uses thereof
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
ES2641840T3 (es) 2012-02-24 2017-11-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composiciones y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías
AU2013225950B2 (en) 2012-02-29 2018-02-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
CN104245940A (zh) 2012-04-23 2014-12-24 拜尔作物科学公司 植物中的靶向基因组工程
ES2683071T3 (es) 2012-04-25 2018-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento
AU2013256240B2 (en) 2012-05-02 2018-09-20 Corteva Agriscience Llc Targeted modification of malate dehydrogenase
CN104471067B (zh) 2012-05-07 2020-08-14 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的转基因靶向整合的方法和组合物
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
DK2800811T3 (en) * 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
IN2014DN10996A (ko) 2012-05-30 2015-09-25 Baylor College Medicine
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
BR112014031080A2 (pt) 2012-06-12 2018-05-08 Genentech Inc métodos e composições de geração de alelos knock-out condicionais.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
EP3196301B1 (en) 2012-07-11 2018-10-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of monogenic diseases
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
DK2890780T3 (da) 2012-08-29 2020-09-21 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af en genetisk tilstand
JP6775953B2 (ja) 2012-09-07 2020-10-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US20150267176A1 (en) 2012-10-12 2015-09-24 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
SG11201503059XA (en) * 2012-10-23 2015-06-29 Toolgen Inc Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
WO2014070887A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Recombinetics, Inc. Control of sexual maturation in animals
US20150291967A1 (en) 2012-10-31 2015-10-15 Luc Mathis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK3064585T3 (da) 2012-12-12 2020-04-27 Broad Inst Inc Konstruering og optimering af forbedrede systemer, fremgangsmåder og enzymsammensætninger til sekvensmanipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
WO2014093709A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014093655A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
JP6473419B2 (ja) 2012-12-13 2019-02-20 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 部位特異的ヌクレアーゼ活性のｄｎａ検出方法
CN105121641A (zh) * 2012-12-17 2015-12-02 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-引导的人类基因组工程化
FI3491915T3 (fi) 2012-12-27 2023-08-29 Keygene Nv Menetelmä kohdistetun translokaation indusointiin kasvissa
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
JP6475172B2 (ja) 2013-02-20 2019-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ラットの遺伝子組換え
US10227610B2 (en) 2013-02-25 2019-03-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
EP2971167B1 (en) 2013-03-14 2019-07-31 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
JP2016512048A (ja) 2013-03-15 2016-04-25 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した植物ゲノム操作
IL289396B2 (en) 2013-03-15 2023-12-01 The General Hospital Coporation Using tru-grnas to increase the specificity of RNA-guided genome editing
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
WO2014165825A2 (en) 2013-04-04 2014-10-09 President And Fellows Of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
RS62263B1 (sr) 2013-04-16 2021-09-30 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
AU2014262867B2 (en) 2013-05-10 2019-12-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2014190181A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20140356956A1 (en) 2013-06-04 2014-12-04 President And Fellows Of Harvard College RNA-Guided Transcriptional Regulation
EP4245853A3 (en) 2013-06-17 2023-10-18 The Broad Institute, Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
KR20160056869A (ko) 2013-06-17 2016-05-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용
CA2915842C (en) 2013-06-17 2022-11-29 The Broad Institute, Inc. Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
CA2915845A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468B (zh) * 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN105517579B (zh) 2013-07-10 2019-11-15 哈佛大学校长及研究员协会 用于RNA向导的基因调节和编辑的正交Cas9蛋白
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
NZ746567A (en) 2013-11-04 2019-09-27 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
EP3066109A4 (en) 2013-11-04 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
KR102269769B1 (ko) 2013-11-04 2021-06-28 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 최적 메이즈 유전자좌
CA2930015A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
WO2015117041A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Nair Ramesh B Gene modification-mediated methods and compositions for generating dominant traits in eukaryotic systems
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA

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EP3138912B1 (en) 2018-12-05
US20160298133A1 (en) 2016-10-13
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WO2014089290A1 (en) 2014-06-12
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ES2769310T3 (es) 2020-06-25
US10731181B2 (en) 2020-08-04
IL238856A0 (en) 2015-06-30
EP3617309A2 (en) 2020-03-04
EP3138911B1 (en) 2018-12-05
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AU2019201344A1 (en) 2019-03-21
AU2018229489A1 (en) 2018-10-04
CA2891347A1 (en) 2014-06-12
JP2017192392A (ja) 2017-10-26
BR112015012375A2 (pt) 2017-09-26
IL291129A (en) 2022-05-01

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