KR20180011351A - Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 - Google Patents

Crispr-기초된 유전체 변형과 조절 Download PDF

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Abstract

요약
본 발명은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 제공하고, 이것은 진핵 세포 또는 배아에서 발현을 위해 가공되고, 그리고 진핵 세포 또는 배아에서 표적화된 유전체 변형을 위해 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법을 제공한다. 융합 단백질 역시 제공되고, 여기서 각 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함한다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 융합 단백질을 이용하여 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법 역시 제공된다.

Description

CRISPR-기초된 유전체 변형과 조절{CRISPR-BASED GENOME MODIFICATION AND REGULATION}
발명의 분야
본 발명은 표적화된 유전체 변형에 관계한다. 특히, 본 발명은 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질 및 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 조절하기 위해 상기 단백질을 이용하는 방법에 관계한다.
발명의 배경
표적화된 유전체 변형은 진핵 세포, 배아, 그리고 동물의 유전자 조작을 위한 강력한 도구이다. 가령, 외인성 서열이 표적화된 유전체학 위치에서 통합될 수 있고 및/또는 특정한 내인성 염색체 서열이 결실되거나, 불활성화되거나, 또는 변형될 수 있다. 현재 방법은 가공된 뉴클레아제 효소, 예를 들면, 예로서, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs) 또는 전사 활성제-유사 작동체 뉴클레아제 (TALENs)의 이용에 의존한다. 이들 키메라 뉴클레아제는 비특이적 DNA 개열 도메인에 연결된 프로그램가능, 서열-특정한 DNA-결합 모듈을 내포한다. 각 새로운 유전체학 표적은 하지만, 신규한 서열-특이적 DNA-결합 모듈을 포함하는 새로운 ZFN 또는 TALEN의 설계를 필요로 한다. 따라서, 이들 맞춤 설계된 뉴클레아제는 준비하는데 값비싸고 시간 소모적인 경향이 있다. 게다가, ZFNs와 TALENS의 특이성은 그들이 부정확한 개열을 매개할 수 있는 정도이다.
따라서, 각 새로운 표적화된 유전체학 위치에 대한 새로운 뉴클레아제의 설계를 필요로 하지 않는 표적화된 유전체 변형 기술이 필요하다. 부가적으로, 부정확한 효과가 거의 또는 전혀 없는 증가된 특이성을 갖는 기술이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 다양한 양상에는 단리된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 제공이 포함되고, 여기서 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인, 그리고 엔도뉴클레아제를 개열을 위한 특정한 뉴클레오티드 서열로 표적화하기 위한 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 세포-투과성 도메인, 마커 도메인, 또는 둘 모두를 더욱 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 엔도뉴클레아제는 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 일부 경우에, 유도 RNA는 표적 부위에 상보적인 5' 영역을 포함하는 단일 분자일 수 있다. 본원에서 개시된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산 역시 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산은 포유류 세포, 예를 들면, 예로서, 인간 세포에서 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 임의선택적으로, 벡터의 부분일 수 있다. 다른 구체예에서, 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터는 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는, 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 진핵 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 (i) 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 본원에서 규정된 바와 같은 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, (ii) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 그리고, 임의선택적으로, (iii) 공여자 서열을 포함하는 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 각 유도 RNA가 염색체 서열 내에 표적화된 부위에 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 향하게 하도록 상기 세포 또는 배아를 배양하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위 내에 이중 가닥 절단을 도입하고, 그리고 상기 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 변형되도록 DNA 수복 과정에 의해 수복된다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 또는 배아 내로 도입된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA일 수 있다. 추가의 구체예에서, 세포 또는 배아 내로 도입된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA일 수 있다. 추가의 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함하는 벡터의 부분일 수 있다. 일정한 구체예에서, 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 줄기 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일정한 다른 구체예에서, 배아는 비-인간 단세포 동물 배아일 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일반적으로, 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함한다. 융합 단백질의 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 가지 반복에서, Cas9 단백질은 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 교체 반복에서, Cas9 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 작동체 도메인은 개열 도메인, 예를 들면, 예로서, FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인일 수 있다. 다른 구체예에서, 한 융합 단백질은 다른 융합 단백질과 이합체를 형성할 수 있다. 이합체는 동종이합체 또는 이형이합체일 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 아연 핑거 뉴클레아제와 이형이합체를 형성할 수 있고, 여기서 융합 단백질과 아연 핑거 뉴클레아제 둘 모두의 개열 도메인은 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질로부터 유래된 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하고, 그리고 작동체 도메인은 FokI 엔도뉴클레아제 도메인 또는 변형된 FokI 엔도뉴클레아제 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질로부터 유래된 CRISPR/Cas-유사 단백질을 포함하고, 그리고 작동체 도메인은 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인일 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에서 개시된 융합 단백질 중에서 한 가지는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 그리고 마커 도메인에서 선택된 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 제공된 융합 단백질 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 핵산 역시 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상은 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 다음을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다: (a) 최소한 하나의 융합 단백질 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 여기서 상기 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하고, 그리고 (b) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 여기서 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질을 염색체 서열 내에 표적화된 부위로 유도하고, 그리고 융합 단백질의 작동체 도메인은 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 최소한 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 결여하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형될 수 있다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 한 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 2개의 유도 RNA 또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 1개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내에 도입된다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 융합 단백질 또는 2개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 2개의 유도 RNA 또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 2개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내에 도입된다. 융합 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질 및 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 1개의 유도 RNA 또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 핵산, 그리고 1개의 아연 핑거 뉴클레아제 또는 1개의 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 상기 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 1개의 이중 가닥 절단이 염색체 서열 내로 도입된다. 융합 단백질이 개열 도메인을 포함하는 일정한 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함할 수 있다. 융합 단백질이 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제물질 도메인에서 선택되는 작동체 도메인을 포함하는 구체예에서, 상기 융합 단백질은 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형된 Cas9 단백질을 포함할 수 있고, 그리고 상기 방법은 1개의 융합 단백질 또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 그리고 1개의 유도 RNA 또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 그리고 여기서 표적화된 염색체 서열의 구조 또는 발현이 변형된다. 일정한 구체예에서, 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 줄기 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일정한 다른 구체예에서, 배아는 비-인간 단세포 동물 배아이다.
본 발명의 다른 양상과 반복이 아래에서 상술된다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 단백질 이합체를 이용한 유전체 변형을 도해한다. (A)는 DNA 결합을 위한 Cas-유사 단백질 및 FokI 개열 도메인을 각각 포함하는 2개의 융합 단백질로 구성된 이합체에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다. (B)는 Cas-유사 단백질과 FokI 개열 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 아연 핑거 (ZF) DNA-결합 도메인과 FokI 개열 도메인을 포함하는 아연 핑거 뉴클레아제로 구성된 이합체에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다.
도면 2는 유전자 조절 도메인을 포함하는 RNA-유도된 융합 단백질을 이용한 유전자 발현의 조절을 예증한다. (A)는 DNA 결합에 이용된 Cas-유사 단백질 및 유전자 발현을 활성화시키거나 또는 억제하는 "A/R" 도메인을 포함하는 융합 단백질을 묘사한다. (B)는 DNA 결합을 위한 Cas-유사 단백질 및 근위 DNA 또는 단백질의 공유 변형에 의해 후성 상태에 영향을 주는 후성 변형 도메인 ("Epi-mod')을 포함하는 융합 단백질을 도해한다.
도면 3은 2개 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용한 유전체 변형을 도해한다. (A)는 틈내기효소로 전환된 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 창출된 이중 가닥 절단을 묘사한다. (B)는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 창출된 2개의 이중 가닥 절단을 묘사한다.
도면 4는 Cas9 핵산, Cas9 가이드용 RNA, 그리고 AAVS1-GFP DNA 공여자로 형질감염된 인간 K562 세포의 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 제시한다. y축은 적색 통로에서 자동 형광 강도를 나타내고, 그리고 x축은 녹색 형광 강도를 나타낸다. (A) 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; (B) 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; (C) 전사후 캡핑 반응에 의해 캡핑된 10 μg의 Cas9 mRNA, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (D) 10 μg의 Cas9 플라스미드 DNA, 5 μg의 U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (E) 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; (F) 형질감염 시약 단독으로 형질감염된 K562 세포.
도면 5는 인간 세포 내에 AAVS1 좌위 내로 GFP의 표적화된 통합을 문서화하는 접합부 PCR 분석을 제시한다. 레인 M: 1 kb DNA 분자 마커; 레인 A: 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 B: 안티 리버스 Cap 유사체, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA와 함께 전사된 10 μg의 Cas9 mRNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 C: 전사후 캡핑 반응에 의해 캡핑된 10 μg의 Cas9 mRNA, 0.3 nmol의 키메라 RNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 D: 10 μg의 Cas9 플라스미드 DNA, 5 μg의 U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 E: 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 K562 세포; 레인 F: 형질감염 시약 단독으로 형질감염된 K562 세포.
발명의 상세한 설명
RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 본원에서 제공되는데, 이것은 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인, 그리고 엔도뉴클레아제를 개열을 위한 특정한 뉴클레오티드 서열로 표적화하는 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산뿐만 아니라 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하여 진핵 세포 또는 배아의 염색체 서열을 변경하는 방법 역시 제공된다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 특정한 유도 RNA와 상호작용하고, 이들은 각각 상기 엔도뉴클레아제를 특정한 표적화된 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열이 변형되도록, DNA 수복 과정에 의해 수복될 수 있는 이중 가닥 절단을 도입한다. 특이성이 유도 RNA에 의해 제공되기 때문에, RNA-기초된 엔도뉴클레아제가 보편적이고 상이한 유전체학 서열을 표적으로 하는 상이한 유도 RNA에서 이용될 수 있다. 본원에서 개시된 방법은 특정한 염색체 서열을 표적으로 하고 변경하고 및/또는 세포 또는 배아의 유전체 내에 표적화된 위치에서 외인성 서열을 도입하는데 이용될 수 있다. 게다가, 표적화는 특정하고 부정확한 효과가 제한된다.
본 발명은 융합 단백질을 제공하는데, 여기서 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함한다. 적합한 작동체 도메인은 제한 없이, 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 그리고 전사 억제인자 도메인을 포함한다. 각 융합 단백질은 특정한 유도 RNA에 의해 특정한 염색체 서열로 유도되고, 여기서 작동체 도메인은 표적화된 유전체 변형 또는 유전자 조절을 매개한다. 한 양상에서, 융합 단백질은 이합체로서 기능하고, 따라서 표적 부위의 길이를 증가시키고 유전체 내에 이의 독특성의 가능성을 증가시킬 수 있다 (따라서, 부정확한 효과를 감소시킬 수 있다). 가령, 내인성 CRISPR 시스템은 대략 13-20 bp의 DNA 결합 단어 길이에 기초하여 유전체학 위치를 변경한다 (Cong et al., Science, 339:819-823). 이러한 단어 크기에서, 표적 부위의 단지 5-7%만 유전체 내에서 독특하다 (Iseli et al, PLos One 2(6):e579). 대조적으로, 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 DNA 결합 단어 크기는 전형적으로, 30-36 bp 범위에서 변하고, 인간 유전체 내에서 대략 85-87% 독특한 표적 부위를 유발한다. CRISPR-기초된 시스템에 의해 활용되는 더욱 작은 크기산정된 DNA 결합 부위는 원하는 위치, 예를 들면, 질환 SNP, 작은 엑손, 출발 코돈, 그리고 종결 코돈뿐만 아니라 복잡한 유전체 내에 다른 위치 인근에서 표적화된 CRISP-기초된 뉴클레아제의 설계를 제한하고 복잡하게 만든다. 본 발명은 CRISPR DNA 결합 단어 길이를 확장하기 위한 수단 (즉, 부정확한 활성을 제한하기 위해)을 제공할 뿐만 아니라, 변형된 기능성을 갖는 CRISPR 융합 단백질을 더욱 제공한다. 따라서, 개시된 CRISPR 융합 단백질은 증가된 표적 특이성과 독특한 기능성(들)을 갖는다. 표적화된 염색체 서열의 발현을 변경하거나 또는 조절하기 위해 융합 단백질을 이용하는 방법 역시 본원에서 제공된다.
(I) RNA-유도된 엔도뉴클레아제
본 발명의 한 가지 양상은 진핵 세포와 배아, 예를 들면, 예로서, 비-인간 단세포 배아의 핵 내로 엔도뉴클레아제의 진입을 허용하는, 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 제공한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 또한, 최소한 하나의 뉴클레아제 도메인 및 유도 RNA와 상호작용하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유도 RNA에 의해 특정한 핵산 서열 (또는 표적 부위)에 지향된다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제뿐만 아니라 표적 부위와 상호작용하고, 따라서 일단 표적 부위에 지향되면, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 절단을 표적 부위 핵산 서열 내로 도입할 수 있다. 유도 RNA가 표적화된 개열에 대한 특이성을 제공하기 때문에, RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 엔도뉴클레아제가 보편적이고 상이한 표적 핵산 서열을 개열하는 상이한 유도 RNA에서 이용될 수 있다. 단리된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단리된 핵산 (즉, RNA 또는 DNA), RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 그리고 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 + 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체가 본원에서 제공된다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 군집된 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템으로부터 유래될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III 시스템일 수 있다. 적합한 CRISPR/Cas 단백질의 무제한적 실례는 Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (또는 CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (또는 CasA), Cse2 (또는 CasB), Cse3 (또는 CasE), Cse4 (또는 CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그리고 Cu1966을 포함한다.
한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 특정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 Cas9 단백질로부터 유래된다. Cas9 단백질은 스트렙토콕쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토콕쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 스트렙토콕쿠스 (Streptococcus) 종, 노카르디오프시스 라스손빌레이 (Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토미세스 프리스티네스피랄리스 (Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움 (Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움 (Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실루스 아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실루스 슈도마이코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실루스 셀레니티레두센스 (Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰 (Exiguobacterium sibiricum), 락토바실루스 델브루키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 미크로스킬라 마리나 (Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움 (Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 (Polaromonas) 종, 크로코스파에라 왓소니 (Crocosphaera watsonii), 시아노테세 (Cyanothece) 종, 마이크로시스티스 아에루기노사 (Microcystis aeruginosa), 시네코콕쿠스 (Synechococcus) 종, 아세토할로비움 아라바티쿰 (Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐씨 (Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시 (Caldicellulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스 (Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile), 피네골디아 마그나 (Finegoldia magna), 나트라나이로비우스 써모필루스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰 (Pelotomaculum thermopropionicum), 아시치오바실루스 칼두스 (Acidithiobacillus caldus), 아시치오바실루스 페록시단스 (Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨 (Allochromatium vinosum), 마리노박터 (Marinobacter) 종, 니트로소콕쿠스 할로필루스 (Nitrosococcus halophilus), 니트로소콕쿠스 왓소니 (Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랭크티스 (Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르 (Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나 (Nodularia spumigena), 노스톡 (Nostoc) 종, 아르트로스피라 맥시마 (Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스 (Arthrospira platensis), 아트로스피라 (Arthrospira) 종, 링비아 (Lyngbya) 종, 미크로콜레우스 크토노플라스테스 (Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 (Oscillatoria) 종, 페트로토가 모빌리스 (Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스 (Thermosipho africanus), 또는 아카리오클로리스 마리나 (Acaryochloris marina)로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, CRISPR/Cas 단백질은 최소한 하나의 RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인을 포함한다. RNA 인식 및/또는 RNA 결합 도메인은 유도 RNA와 상호작용한다. CRISPR/Cas 단백질은 또한, 뉴클레아제 도메인 (즉, DNA분해효소 또는 RNA분해효소 도메인), DNA 결합 도메인, 헬리카아제 도메인, RNA분해효소 도메인, 단백질-단백질 상호작용 도메인, 이합체화 도메인뿐만 아니라 다른 도메인을 포함할 수 있다.
CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 CRISPR/Cas 단백질, 변형된 CRISPR/Cas 단백질, 또는 야생형 또는 변형된 CRISPR/Cas 단백질의 단편일 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 핵산 결합 친화성 및/또는 특이성을 증가시키고, 효소적 활성을 변경하고, 및/또는 단백질의 다른 성질을 변화시키기 위해 변형될 수 있다. 가령, CRISPR/Cas-유사 단백질의 뉴클레아제 (즉, DNA분해효소, RNA분해효소) 도메인은 변형되거나, 결실되거나, 또는 불활성화될 수 있다. 대안으로, CRISPR/Cas-유사 단백질은 융합 단백질의 기능에 필수적이지 않은 도메인을 제거하기 위해 절두될 수 있다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 또한, 융합 단백질의 작동체 도메인의 활성을 최적화하기 위해 절두되거나 또는 변형될 수 있다.
일부 구체예에서, CRISPR/Cas-유사 단백질은 야생형 Cas9 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, CRISPR/Cas-유사 단백질은 변형된 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. 가령, Cas9 단백질의 아미노산 서열은 단백질의 하나 또는 그 이상의 성질 (가령, 뉴클레아제 활성, 친화성, 안정성 등)을 변경하기 위해 변형될 수 있다. 대안으로, RNA-유도된 개열에 관련되지 않는 Cas9 단백질의 도메인이 단백질로부터 제거될 수 있고, 따라서 변형된 Cas9 단백질은 야생형 Cas9 단백질보다 작다.
일반적으로, Cas9 단백질은 최소한 2개의 뉴클레아제 (즉, DNA분해효소) 도메인을 포함한다. 가령, Cas9 단백질은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 및 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. RuvC와 HNH 도메인은 단일 가닥을 절단하여 DNA에서 이중 가닥 절단을 만들기 위해 함께 작동한다 (Jinek et al., Science, 337: 816-821). 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 단지 한 가지 기능적 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중에서 어느 한쪽)만을 내포하도록 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 결실되거나 또는 돌연변이되고, 따라서 이것이 더 이상 기능하지 않도록 (즉, 뉴클레아제 활성이 부재하도록) 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 비활성인 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 이중 가닥 핵산 내로 틈을 도입할 수 있지만 (이런 단백질은 "틈내기효소"로 명명된다), 이중 가닥 DNA를 개열하지 않는다. 가령, RuvC-유사 도메인에서 아스파르트산염에서 알라닌 (D10A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 유사하게, HNH 도메인에서 히스티딘에서 알라닌 (H840A 또는 H839A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 각 뉴클레아제 도메인은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 부위-지향된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 그리고 전체 유전자 합성뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 방법을 이용하여 변형될 수 있다.
본원에서 개시된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함한다. 일반적으로, NLS은 염기성 아미노산의 스트레치를 포함한다. 핵 국지화 신호는 당분야에서 공지된다 (가령, Lange et al., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105를 참조한다). 가령, 한 구체예에서, NLS는 단립형 서열, 예를 들면, PKKKRKV (서열 번호:1) 또는 PKKKRRV (서열 번호:2)일 수 있다. 다른 구체예에서, NLS는 이분 서열일 수 있다. 또 다른 구체예에서, NLS는 KRPAATKKAGQAKKKK (서열 번호:3)일 수 있다. NLS는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 제1형 사람 면역결핍바이러스 TAT 단백질로부터 유래된 세포-투과성 펩티드 서열일 수 있다. 실례로서, TAT 세포-투과성 서열은 GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (서열 번호:4)일 수 있다. 다른 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 인간 B형 간염 바이러스로부터 유래된 세포-투과성 펩티드 서열인 TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; 서열 번호:5)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; 서열 번호:6 또는 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열 번호:7)일 수 있다. 추가의 구체예에서, 세포-투과성 도메인은 Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; 서열 번호:8), VP22, 단순 헤르페스 바이러스로부터 세포 투과성 펩티드, 또는 폴리아르기닌 펩티드 서열일 수 있다. 세포-투과성 도메인은 상기 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
또 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 또한, 최소한 하나의 마커 도메인을 포함할 수 있다. 마커 도메인의 무제한적 실례는 형광 단백질, 정제 태그, 그리고 에피토프 태그를 포함한다. 일부 구체예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 무제한적인 실례는 녹색 형광 단백질 (가령, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (가령, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (가령, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire,), 시안색 형광 단백질 (가령, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단위체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단위체, HcRed-탠덤, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 그리고 오렌지색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 예시적인 태그에는 글루타티온-S-전달효소 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질, 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 비오틴 카르복실 운반 단백질 (BCCP), 그리고 칼모듈린이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
일정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 유도 RNA의 5' 단부는 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
(II) 융합 단백질
본 발명의 다른 양상은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 유도 RNA에 의해 표적 부위에 지향되고, 상기 부위에서 작동체 도메인은 표적화된 핵산 서열을 변경하거나 또는 산출할 수 있다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 융합 단백질은 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 또는 마커 도메인에서 선택된 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함할 수 있다.
(a) CRISPR/Cas-유사 단백질
융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 상기 섹션 (I)에서 상술된다. CRISPR/Cas-유사 단백질은 융합 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
일부 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 Cas9 단백질로부터 유래될 수 있다. Cas9-유래된 단백질은 야생형, 변형된, 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 단지 한 가지 기능적 뉴클레아제 도메인 (RuvC-유사 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 중에서 어느 한쪽)을 내포하도록 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 결실되거나 또는 돌연변이되고, 따라서 이것이 더 이상 기능하지 않도록 (즉, 뉴클레아제 활성이 부재하도록) 변형될 수 있다. 뉴클레아제 도메인 중에서 한 가지가 비활성인 일부 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 이중 가닥 핵산 내로 틈을 도입할 수 있지만 (이런 단백질은 "틈내기효소"로 명명된다), 이중 가닥 DNA를 개열하지 않는다. 가령, RuvC-유사 도메인에서 아스파르트산염에서 알라닌 (D10A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 유사하게, HNH 도메인에서 히스티딘에서 알라닌 (H840A 또는 H839A) 전환은 Cas9-유래된 단백질을 틈내기효소로 전환한다. 다른 구체예에서, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인과 HNH-유사 뉴클레아제 도메인 둘 모두 Cas9-유래된 단백질이 이중 가닥 핵산을 틈내기하거나 또는 개열할 수 없도록 변형되거나 또는 제거될 수 있다. 또 다른 구체예에서, Cas9-유래된 단백질의 모든 뉴클레아제 도메인은 Cas9-유래된 단백질이 모든 뉴클레아제 활성을 결여하도록 변형되거나 또는 제거될 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 임의의 또는 모든 뉴클레아제 도메인은 널리 공지된 방법, 예를 들면, 부위-지향된 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 그리고 전체 유전자 합성뿐만 아니라 당분야에서 공지된 다른 방법을 이용하여 하나 또는 그 이상의 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및/또는 치환 돌연변이에 의해 비활성화될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 모든 뉴클레아제 도메인이 비활성화되거나 또는 결실된 Cas9 단백질로부터 유래된다.
(b) 작동체 도메인
융합 단백질은 또한, 작동체 도메인을 포함한다. 작동체 도메인은 개열 도메인, 후성 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 작동체 도메인은 융합 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 내부 위치에서 위치될 수 있다.
(i) 개열 도메인
일부 구체예에서, 작동체 도메인은 개열 도메인이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "개열 도메인"은 DNA를 개열하는 도메인을 지칭한다. 개열 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 획득될 수 있다. 개열 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 무제한적 실례에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, New England Biolabs Catalog 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참조한다. DNA를 개열하는 추가 효소가 알려져 있다 (가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNA분해효소 I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 또한 참조한다. 이들 효소 중에서 하나 또는 그 이상 (또는 이의 기능적 단편)이 개열 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개열 도메인은 유형 II-S 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 유형 II-S 엔도뉴클레아제는 전형적으로, 인식 부위로부터 여러 염기쌍 떨어진 부위에서 DNA를 개열하고, 그리고 따라서, 분리가능한 인식과 개열 도메인을 갖는다. 이들 효소는 일반적으로, 엇갈린 위치에서 DNA의 각 가닥을 개열하기 위해, 일시적으로 결합하여 이합체를 형성하는 단위체이다. 적합한 유형 II-S 엔도뉴클레아제의 무제한적 실례는 BfiI, BpmI, BsaI, BsgI, BsmBI, BsmI, BspMI, FokI, MboII, 그리고 SapI을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 이의 유도체이다.
일정한 구체예에서, 유형 II-S 개열은 2개의 상이한 개열 도메인 (이들은 각각, CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편에 부착된다)의 이합체화를 조장하도록 변형될 수 있다. 가령, FokI의 개열 도메인은 일정한 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다. 무제한적 실례에 의하여, FokI 개열 도메인의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 그리고 538에서 아미노산 잔기가 변형에 대한 표적이다. 가령, 절대 이형이합체를 형성하는 FokI의 변형된 개열 도메인은 첫 번째 변형된 개열 도메인이 아미노산 위치 490과 538에서 돌연변이를 포함하고, 그리고 두 번째 변형된 개열 도메인이 아미노산 위치 486과 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다 (Miller et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:778-785; Szczpek et al., 2007, Nat. Biotechnol, 25:786-793). 가령, 한 도메인에서 위치 490에서 Glu (E)가 Lys (K)로 변화될 수 있고 위치 538에서 Ile (I)가 K로 변화될 수 있고 (E490K, I538K), 그리고 다른 개열 도메인에서 위치 486에서 Gln (Q)이 E로 변화될 수 있고 위치 499에서 I가 Leu (L)로 변화될 수 있다 (Q486E, I499L). 다른 구체예에서, 변형된 FokI 개열 도메인은 3가지 아미노산 변화를 포함할 수 있다 (Doyon et al. 2011, Nat. Methods, 8:74-81). 가령, 한 변형된 FokI 도메인 (ELD로 명명된다)은 Q486E, I499L, N496D 돌연변이를 포함할 수 있고, 그리고 다른 변형된 FokI 도메인 (KKR로 명명된다)은 E490K, I538K, H537R 돌연변이를 포함할 수 있다.
예시적인 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다.
작동체 도메인이 개열 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 이들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(ii) 후성 변형 도메인
다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 후성 변형 도메인일 수 있다. 일반적으로, 후성 변형 도메인은 DNA 서열을 변화시키지 않으면서 히스톤 구조 및/또는 염색체 구조를 변경한다. 히스톤 및/또는 염색질 구조에서 변화는 유전자 발현에서 변화를 야기할 수 있다. 후성 변형의 실례는 제한 없이, 히스톤 단백질에서 리신 잔기의 아세틸화 또는 메틸화, 그리고 DNA에서 시토신 잔기의 메틸화를 포함한다. 적합한 후성 변형 도메인의 무제한적 실례는 히스톤 아세틸전달효소 도메인, 히스톤 탈아세틸화효소 도메인, 히스톤 메틸전달효소 도메인, 히스톤 탈메틸효소 도메인, DNA 메틸전달효소 도메인, 그리고 DNA 탈메틸효소 도메인을 포함한다.
작동체 도메인이 히스톤 아세틸전달효소 (HAT) 도메인인 구체예에서, HAT 도메인은 EP300 (즉, E1A 결합 단백질 p300), CREBBP (즉, CREB-결합 단백질), CDY1, CDY2, CDYL1, CLOCK, ELP3, ESA1, GCN5 (KAT2A), HAT1, KAT2B, KAT5, MYST1, MYST2, MYST3, MYST4, NCOA1, NCOA2, NCOA3, NCOAT, P/CAF, Tip60, TAFII250, 또는 TF3C4로부터 유래될 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, HAT 도메인은 p300이다.
작동체 도메인이 후성 변형 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(iii) 전사 활성화 도메인
다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 전사 활성화 도메인일 수 있다. 일반적으로, 전사 활성화 도메인은 유전자의 전사를 증가 및/또는 활성화시키기 위해 전사 제어 원소 및/또는 전사 조절 단백질 (즉, 전사 인자, RNA 중합효소 등)과 상호작용한다. 일부 구체예에서, 전사 활성화 도메인은 제한 없이, 단순 헤르페스 바이러스 VP16 활성화 도메인, VP64 (이것은 VP16의 사합체성 유도체이다), NFκB p65 활성화 도메인, p53 활성화 도메인 1과 2, CREB (cAMP 반응 원소 결합 단백질) 활성화 도메인, E2A 활성화 도메인, 그리고 NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 활성화 도메인일 수 있다. 다른 구체예에서, 전사 활성화 도메인은 Gal4, Gcn4, MLL, Rtg3, Gln3, Oaf1, Pip2, Pdr1, Pdr3, Pho4, 그리고 Leu3일 수 있다. 전사 활성화 도메인은 야생형이거나, 또는 본래 전사 활성화 도메인의 변형된 이형일 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 VP16 또는 VP64 전사 활성화 도메인이다.
작동체 도메인이 전사 활성화 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, Cas9-유래된 단백질은 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(iv) 전사 억제인자 도메인
또 다른 구체예에서, 융합 단백질의 작동체 도메인은 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 일반적으로, 전사 억제인자 도메인은 유전자의 전사를 감소시키고 및/또는 종결하기 위해 전사 제어 원소 및/또는 전사 조절 단백질 (즉, 전사 인자, RNA 중합효소 등)과 상호작용한다. 적합한 전사 억제인자 도메인의 무제한적 실례는 유도성 cAMP 초기 억제인자 (ICER) 도메인, Kruppel-연관된 상자 A (KRAB-A) 억제인자 도메인, YY1 글리신 풍부한 억제인자 도메인, Sp1-유사 억제인자, E(spl) 억제인자, IκB 억제인자, 그리고 MeCP2를 포함한다.
작동체 도메인이 전사 억제인자 도메인이고 CRISPR/Cas-유사 단백질이 Cas9 단백질로부터 유래되는 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 본원에서 논의된 바와 같이 변형될 수 있다. 가령, cas9는 그들이 뉴클레아제 활성을 더 이상 소유하지 않도록, RuvC와 HNH 도메인을 돌연변이시킴으로써 변형될 수 있다.
(c) 추가 도메인
일부 구체예에서, 융합 단백질은 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함한다. 적합한 추가 도메인의 무제한적 실례는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 또는 전위 도메인, 그리고 마커 도메인을 포함한다. 적합한 핵 국지화 신호, 세포-투과성 도메인, 그리고 마커 도메인의 무제한적 실례는 상기 섹션 (I)에서 제공된다.
(d) 융합 단백질 이합체
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인인 구체예에서, 최소한 하나의 융합 단백질을 포함하는 이합체가 형성될 수 있다. 이합체는 동종이합체 또는 이형이합체일 수 있다. 일부 구체예에서, 이형이합체는 2개의 상이한 융합 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체는 1개의 융합 단백질 및 추가 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 이합체는 2개의 융합 단백질 단위체가 일차성 아미노산 서열에 대하여 동일한 동종이합체이다. 이합체가 동종이합체인 한 구체예에서, Cas9-유래된 단백질은 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록, 다시 말하면, 그들이 기능적 뉴클레아제 도메인을 갖지 않도록 변형된다. Cas9-유래된 단백질이 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형되는 일정한 구체예에서, 각 융합 단백질 단위체는 동일한 Cas9 유사 단백질 및 동일한 개열 도메인을 포함한다. 개열 도메인은 임의의 개열 도메인, 예를 들면, 본원에서 제공된 예시적인 개열 도메인 중에서 한 가지일 수 있다. 특정한 구체예에서, 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다. 이런 구체예에서, 특정한 유도 RNA는 융합 단백질 단위체를 상이하지만 가깝게 인접한 부위로 향하게 할 것이고, 따라서 이합체 형성 시에, 이들 두 단위체의 뉴클레아제 도메인은 표적 DNA 내에 이중 가닥 절단을 창출할 것이다.
다른 구체예에서, 이합체는 2개의 상이한 융합 단백질의 이형이합체이다. 가령, 각 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질은 상이한 CRISPR/Cas 단백질로부터 또는 상이한 세균 종의 이종상동성 CRISPR/Cas 단백질로부터 유래될 수 있다. 가령, 각 융합 단백질은 Cas9-유사 단백질을 포함할 수 있고, 상기 Cas9-유사 단백질은 상이한 세균 종으로부터 유래된다. 이들 구체예에서, 각 융합 단백질은 상이한 표적 부위 (즉, 프로토스페이서 및/또는 PAM 서열에 의해 특정됨)를 인식할 것이다. 가령, 유도 RNA는 이형이합체를 상이하지만 가깝게 인접한 부위에 위치시킬 수 있고, 따라서 그들의 뉴클레아제 도메인은 표적 DNA 내에 효과적인 이중 가닥 절단을 유발한다. 이형이합체는 또한, 틈내는 위치가 상이하도록, 틈내기 활성을 갖는 변형된 Cas9 단백질을 가질 수 있다.
대안으로, 이형이합체의 두 융합 단백질은 상이한 작동체 도메인을 가질 수 있다. 작동체 도메인이 개열 도메인인 구체예에서, 각 융합 단백질은 상이한 변형된 개열 도메인을 내포할 수 있다. 가령, 각 융합 단백질은 상기 섹션 (II)(b)(i)에서 상술된 바와 같이, 상이한 변형된 FokI 개열 도메인을 내포할 수 있다. 이들 구체예에서, Cas-9 단백질은 그들의 엔도뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형될 수 있다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이형이합체를 형성하는 이들 두 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 도메인 및 작동체 도메인 둘 모두에서 상이할 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 동종이합체 또는 이형이합체는 상기 상술된 바와 같이, 핵 국지화 신호 (NLSs), 세포-투과성, 전위 도메인 및 마커 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있다.
상기-설명된 구체예 중에서 한 가지에서, Cas9-유래된 단백질 중에서 한쪽 또는 양쪽이 엔도뉴클레아제 활성이 제거되거나 또는 변형되도록 변형될 수 있다.
다른 대안적 구체예에서, 이형이합체는 1개의 융합 단백질 및 추가 단백질을 포함한다. 가령, 추가 단백질은 뉴클레아제일 수 있다. 한 구체예에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 개열 도메인을 포함한다. 아연 핑거는 3개의 뉴클레오티드를 인식하고 이들에 결합한다. 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 약 3개 아연 핑거 내지 약 7개 아연 핑거를 포함할 수 있다. 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 단백질로부터 유래되거나 또는 가공될 수 있다. 가령, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 그리고 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814를 참조한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인은 상기 섹션 (II)(b)(i)에서 상술된 임의의 개열 도메인일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인은 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인이다. 이런 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함하는 융합 단백질과 이합체화할 것이다.
일부 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국지화 신호, 세포-투과성 또는 전위 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 상기 상술된다.
일정한 구체예에서, 상기 상술된 융합 단백질 중에서 한 가지 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 포함하는 이합체는 최소한 하나의 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR-Cas0 유사 단백질과 상호작용하여 상기 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 유도 RNA의 5' 단부는 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
(III) RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산
본 발명의 다른 양상은 각각, 상기 섹션 (I)과 (II)에서 설명된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질 중에서 한 가지를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 mRNA이다. mRNA는 5' 캡핑되고 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 DNA이다. DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다 (아래 참조).
RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 관심되는 진핵 세포 또는 동물에서 단백질로의 효율적인 번역을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 가령, 인간, 생쥐, 쥐, 햄스터, 소, 돼지, 고양이, 개, 어류, 양서류, 식물, 효모, 곤충, 기타 등등에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다 (참조: www.kazusa.or.jp/codon/에서 Codon Usage Database). 코돈 최적화를 위한 프로그램은 프리웨어로서 가용하다 (가령, genomes.urv.es/OPTIMIZER에서 OPTIMIZER; www.genscript.com/codon_opt.html에서 GenScript로부터 OptimumGene™). 상업적인 코돈 최적화 프로그램 역시 가용하다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 최소한 하나의 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 반복에서, DNA 코딩 서열은 관심되는 진핵 세포 또는 동물에서 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터 제어 서열은 구조성, 조절된, 또는 조직 특이적일 수 있다. 적합한 구조성 프로모터 제어 서열에는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스(SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 생쥐 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세린산 키나아제 (PGK) 프로모터, 연장 인자 (ED1)-알파 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이들의 단편, 또는 전술한 것들의 임의의 조합이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 적합한 조절된 프로모터 제어 서열의 실례는 제한 없이, 열 쇼크, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 조절된 것들을 포함한다. 조직 특이적 프로모터의 무제한적 실례는 B29 프로모터, CD14 프로모터, CD43 프로모터, CD45 프로모터, CD68 프로모터, 데스민 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 엔도글린 프로모터, 섬유결합소 프로모터, Flt-1 프로모터, GFAP 프로모터, GPIIb 프로모터, ICAM-2 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, NphsI 프로모터, OG-2 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, 그리고 WASP 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 야생형이거나 또는 더욱 효율적인 또는 유효한 발현을 위해 변형될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 인코딩 DNA는 포유류 세포에서 구조성 발현을 위해 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일정한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 시험관내 mRNA 합성을 위한 파지 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이런 구체예에서, 시험관내-전사된 RNA는 아래 섹션 (IV)와 (V)에서 상술된 방법에서 이용을 위해 정제될 수 있다. 가령, 프로모터 서열은 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열 또는 T7, T3, 또는 SP6 프로모터 서열의 변이일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 mRNA 합성을 위해 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
대안적 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 세균 또는 진핵 세포에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질의 시험관내 발현을 위해 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이런 구체예에서, 발현된 단백질은 아래 섹션 (IV)와 (V)에서 상술된 방법에서 이용을 위해 정제될 수 있다. 적합한 세균 프로모터는 제한 없이, T7 프로모터, lac 오페론 프로모터, trp 프로모터, 이들의 변이, 그리고 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 세균 프로모터는 trp와 lac 프로모터의 하이브리드인 tac이다. 적합한 진핵 프로모터의 무제한적 실례는 상기에서 열거된다.
추가의 양상에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 또한, 폴리아데닐화 신호 (가령, SV40 polyA 신호, 소 성장 호르몬 (BGH) polyA 신호 등) 및/또는 최소한 하나의 전사 종결 서열에 연결될 수 있다. 부가적으로, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 또한, 최소한 하나의 핵 국지화 신호, 최소한 하나의 세포-투과성 도메인, 및/또는 최소한 하나의 마커 도메인을 인코딩하는 서열에 연결될 수 있고, 이들은 상기 섹션 (I)에서 상술된다.
다양한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/꼬마염색체, 트랜스포손, 그리고 바이러스 벡터 (가령, 렌티바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터 등)를 포함한다. 한 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에 존재한다. 적합한 플라스미드 벡터의 무제한적 실례는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 그리고 이들의 변이체를 포함한다. 상기 벡터는 추가 발현 제어 서열 (가령, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선별가능 마커 서열 (가령, 항생제 내성 유전자), 복제 기점, 기타 등등을 포함할 수 있다. 추가 정보는 "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001에서 발견될 수 있다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함할 수 있다. 유도 RNA를 인코딩하는 서열은 일반적으로, 관심되는 세포 또는 배아에서 유도 RNA의 발현을 위해 최소한 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 가령, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 실례에는 포유류 U6, U3, H1, 그리고 7SL RNA 프로모터가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
(IV) RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 이용하여 염색체 서열을 변경하기 위한 방 법
본 발명의 다른 양상은 진핵 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 (i) 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, (ii) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 그리고, 임의선택적으로, (iii) 공여자 서열을 포함하는 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 각 유도 RNA가 염색체 서열 내에 표적화된 부위에 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 향하게 하도록 상기 세포 또는 배아를 배양하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 상기 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 부위 내에 이중 가닥 절단을 도입하고, 그리고 상기 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 변형되도록 DNA 수복 과정에 의해 수복된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 1개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열 내에 1개의 이중 가닥 절단을 도입한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있다. 따라서, 표적화된 염색체 서열은 변형되거나 또는 비활성화될 수 있다. 가령, 단일 뉴클레오티드 변화 (SNP)가 변경된 단백질 산물을 발생시킬 수 있거나, 또는 코딩 서열의 해독틀에서 이동이 단백질 산물이 만들어지지 않도록 상기 서열을 비활성화시키거나 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 수복 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열의 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서, 공여자 서열은 상동성-지향된 수복 과정에 의해 매개된 수복 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 대안으로, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 (또는 양립성 오버행이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 원지에서 산출되는) 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 수복 동안 비상동성 수복 과정에 의해 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 염색체 서열 내로 공여자 서열의 교환 또는 통합은 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 외인성 서열을 세포 또는 배아의 염색체 서열 내로 도입한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에 2개의 이중 가닥 절단을 도입한다. 도면 3B를 참조한다. 이들 두 절단은 여러 염기쌍 내에 있거나, 수십 개의 염기쌍 내에 있거나, 또는 수천 여 개의 염기쌍에 의해 분리될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 두 개열 부위 사이에 서열이 상실되고 및/또는 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단(들)의 수복 동안 일어날 수 있도록 비상동성 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 수복 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 이중 가닥 서열 (또는 인코딩 핵산)의 한쪽 가닥을 개열하기 위해 변형된 1개의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 2개의 유도 RNA (또는 인코딩 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 각 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 변형된 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 염색체 서열의 한쪽 가닥을 개열하고 (즉, 틈내기하고), 그리고 여기서 2개의 틈은 마주보는 가닥 내에 있고 이중 가닥 절단을 구성할 만큼 충분히 근접하게 위치한다. 도면 3A를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있도록 비상동성 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 수복 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
(a) RNA-유도된 엔도뉴클레아제
상기 방법은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하는 최소한 하나의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 이런 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 각각, 상기 섹션 (I)과 (III)에서 설명된다.
일부 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 단리된 단백질로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 단백질의 세포 흡수를 용이하게 하는 최소한 하나의 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 mRNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은 관심되는 세포 또는 배아에서 기능하는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. DNA 서열은 선형일 수 있거나, 또는 DNA 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 상기 융합 단백질 및 유도 RNA를 포함하는 RNA-단백질 복합체로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다.
대안적 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 유도 RNA를 인코딩하는 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일반적으로, RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 각 서열은 각각, 세포 또는 배아에서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA의 발현을 허용하는 적절한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 추가 발현 제어, 조절, 및/또는 처리 서열(들)을 더욱 포함할 수 있다. RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 선형이거나 또는 벡터의 부분일 수 있다
(b) 유도 RNA
상기 방법은 또한, 최소한 하나의 유도 RNA 또는 최소한 하나의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다. 유도 RNA는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하여 엔도뉴클레아제를 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 상기 부위에서 유도 RNA의 5' 단부는 염색체 서열 내에 특정한 프로토스페이서 서열과 염기쌍을 이룬다.
각 유도 RNA는 3가지 영역을 포함한다: 염색체 서열 내에 표적 부위에 상보적인 5' 단부에서 첫 번째 영역, 줄기 루프 구조를 형성하는 두 번째 내부 영역, 그리고 본질적으로 단일 가닥으로 남아있는 세 번째 3' 영역. 각 유도 RNA의 첫 번째 영역은 각 유도 RNA가 융합 단백질을 특정한 표적 부위로 유도하도록 상이하다. 각 유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역은 모든 유도 RNA에서 동일할 수 있다.
유도 RNA의 첫 번째 영역은 유도 RNA의 첫 번째 영역이 표적 부위와 염기쌍을 이룰 수 있도록, 염색체 서열 내에 표적 부위에서 서열 (즉, 프로토스페이서 서열)에 상보적이다. 다양한 구체예에서, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 약 10개 뉴클레오티드 내지 약 25개 보다 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가령, 유도 RNA의 첫 번째 영역 및 염색체 서열 내에 표적 부위 사이에 염기 대합의 영역은 길이에서 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25개, 또는 25개 보다 많은 뉴클레오티드 일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 길이에서 약 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드이다.
유도 RNA는 또한, 이차 구조를 형성하는 두 번째 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 이차 구조는 줄기 (또는 헤어핀) 및 루프를 포함한다. 루프와 줄기의 길이는 변할 수 있다. 가령, 루프는 길이에서 약 3 내지 약 10개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있고, 그리고 줄기는 길이에서 약 6 내지 약 20개 염기쌍 범위에서 변할 수 있다. 줄기는 1 내지 약 10개 뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 돌출을 포함할 수 있다. 따라서, 두 번째 영역의 전반적인 길이는 길이에서 약 16 내지 약 60개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 루프는 길이에서 약 4개 뉴클레오티드이고, 그리고 줄기는 약 12개 염기쌍을 포함한다.
유도 RNA는 또한, 본질적으로 단일 가닥으로 남아있는 3' 단부에서 세 번째 영역을 포함한다. 따라서, 세 번째 영역은 관심되는 세포 내에 임의의 염색체 서열에 대한 상보성을 갖지 않고, 그리고 유도 RNA의 나머지 부분에 상보성을 갖지 않는다. 세 번째 영역의 길이는 변할 수 있다. 일반적으로, 세 번째 영역은 길이에서 약 4개 보다 많은 뉴클레오티드이다. 가령, 세 번째 영역의 길이는 길이에서 약 5 내지 약 60개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다.
유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역 (또한, 보편적인 또는 골격 영역으로 불린다)의 합동된 길이는 길이에서 약 30 내지 약 120개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 한 양상에서, 유도 RNA의 두 번째와 세 번째 영역의 합동된 길이는 길이에서 약 70 내지 약 100개 뉴클레오티드 범위에서 변한다.
일부 구체예에서, 유도 RNA는 3가지 영역 모두를 포함하는 단일 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 유도 RNA는 2개의 별개의 분자를 포함할 수 있다. 첫 번째 RNA 분자는 유도 RNA의 첫 번째 영역 및 유도 RNA의 두 번째 영역의 "줄기"의 한쪽 절반을 포함할 수 있다. 두 번째 RNA 분자는 유도 RNA의 두 번째 영역의 "줄기"의 다른 절반 및 유도 RNA의 세 번째 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 서로에 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 내포한다. 가령, 한 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 다른 서열에 염기쌍을 이루고 기능적 유도 RNA를 형성하는 서열 (약 6 내지 약 20개 뉴클레오티드의)을 포함한다.
일부 구체예에서, 유도 RNA는 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. RNA 분자는 시험관내에서 전사될 수 있다. 대안으로, RNA 분자는 화학적으로 합성될 수 있다.
다른 구체예에서, 유도 RNA는 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 사례에서, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 관심되는 세포 또는 배아에서 유도 RNA의 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 가령, RNA 코딩 서열은 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인식되는 프로모터 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 Pol III 프로모터의 실례에는 포유류 U6 또는 H1 프로모터가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 구체예에서, RNA 코딩 서열은 생쥐 또는 인간 U6 프로모터에 연결된다. 다른 예시적인 구체예에서, RNA 코딩 서열은 생쥐 또는 인간 H1 프로모터에 연결된다.
유도 RNA를 인코딩하는 DNA 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 일부 구체예에서, 유도 RNA를 인코딩하는 DNA 서열은 벡터의 부분일 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/꼬마염색체, 트랜스포손, 그리고 바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에 존재한다. 적합한 플라스미드 벡터의 무제한적 실례는 pUC, pBR322, pET, pBluescript, 그리고 이들의 변이체를 포함한다. 벡터는 추가 발현 제어 서열 (가령, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선별가능 마커 서열 (가령, 항생제 내성 유전자), 복제 기점, 기타 등등을 포함할 수 있다.
RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 유도 RNA 둘 모두 DNA 분자로서 세포 내로 도입되는 구체예에서, 각각은 별개의 분자의 부분 (가령, 융합 단백질 코딩 서열을 내포하는 하나의 벡터 및 유도 RNA 코딩 서열을 내포하는 두 번째 벡터)일 수 있거나 또는 둘 모두 동일한 분자의 부분 (가령, 융합 단백질과 유도 RNA 둘 모두에 대한 코딩 (및 조절) 서열을 내포하는 하나의 벡터)일 수 있다.
표적 부위
유도 RNA와 함께 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에서 표적 부위에 지향되고, 여기서 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단을 도입한다. 표적 부위는 상기 서열 바로 뒤에 (하류) 공통 서열이 뒤따른다는 점을 제외하고, 서열 제한을 갖지 않는다. 이러한 공통 서열은 또한, 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)로서 알려져 있다. PAM의 실례에는 NGG, NGGNG, 그리고 NNAGAAW (여기서 N은 임의의 뉴클레오티드로서 규정되고, 그리고 W는 A 또는 T로서 규정된다)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 상기 섹션 (IV)(b)에서 상술된 바와 같이, 유도 RNA의 첫 번째 영역 (5' 단부에서)은 표적 서열의 프로토스페이서에 상보적이다. 전형적으로, 유도 RNA의 첫 번째 영역은 길이에서 약 19 내지 21개 뉴클레오티드이다. 따라서, 일정한 양상에서, 염색체 서열 내에 표적 부위의 서열은 5'-N19-21-NGG-3'이다. PAM은 이탤릭체로 표시된다.
표적 부위는 유전자의 코딩 영역, 유전자의 인트론, 유전자의 제어 영역, 유전자 사이에 비코딩 영역 등에 있을 수 있다. 유전자는 단백질 코딩 유전자 또는 RNA 코딩 유전자일 수 있다. 유전자는 관심되는 임의의 유전자일 수 있다.
임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드
일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 공여자 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 공여자 서열은 내인성 또는 선천적 염색체 서열에 상응한다. 가령, 공여자 서열은 표적화된 부위에서 또는 이와 가까운 염색체 서열의 부분과 본질적으로 동일할 수 있지만, 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 따라서, 공여자 서열은 선천적 서열과의 통합 또는 교환 시에, 표적화된 염색체 위치에서 서열이 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 포함하도록, 표적화된 부위에서 야생형 서열의 변형된 이형을 포함할 수 있다. 가령, 변화는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합일 수 있다. 변형된 서열의 통합의 결과로서, 세포 또는 배아/동물은 표적화된 염색체 서열로부터 변형된 유전자 산물을 생산할 수 있다.
다른 양상에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 공여자 서열은 외인성 서열에 상응한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "외인성" 서열은 세포 또는 배아에 선천적이지 않은 서열, 또는 세포 또는 배아의 유전체에서 선천적 위치가 상이한 위치에 있는 서열을 지칭한다. 가령, 외인성 서열은 유전체 내로 통합 시에, 세포 또는 배아/동물이 통합된 서열에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있도록, 외인성 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 외인성 서열은 이의 발현이 내인성 프로모터 제어 서열에 의해 조절되도록 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 다른 반복에서, 외인성 서열은 전사 제어 서열, 다른 발현 제어 서열, RNA 코딩 서열, 기타 등등일 수 있다. 염색체 서열 내로 외인성 서열의 통합은 "녹인"으로 명명된다.
당업자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 공여자 서열의 길이는 변할 수 있고 변할 것이다. 가령, 공여자 서열은 길이에서 여러 뉴클레오티드에서부터 수백 개의 뉴클레오티드 내지 수십만 개의 뉴클레오티드까지 변할 수 있다.
상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 일부 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류에 위치된 서열에 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류 서열 및 하류 서열과 측면에서 접한다. 이들 서열 유사성 때문에, 공여자 폴리뉴클레오티드의 상류와 하류 서열은 공여자 서열이 염색체 서열 내로 통합 (또는 이것과 교환)될 수 있도록, 공여자 폴리뉴클레오티드와 표적화된 염색체 서열 사이에 상동성 재조합을 허용한다.
상류 서열은 본원에서 이용된 바와 같이, 표적화된 부위의 상류에 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 유사하게, 하류 서열은 표적화된 부위의 하류에 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유하는 핵산 서열을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "실제적인 서열 동일성"은 최소한 약 75% 서열 동일성을 갖는 서열을 지칭한다. 따라서, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류와 하류 서열은 표적화된 부위의 상류 또는 하류에 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드에서 상류와 하류 서열은 표적화된 부위의 상류 또는 하류에 염색체 서열과 약 95% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 한 구체예에서, 상류 서열은 표적화된 부위의 즉시 상류에 위치된 (즉, 표적화된 부위에 인접한) 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 상류 서열은 표적화된 부위로부터 상류에 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로서, 상류 서열은 표적화된 부위로부터 상류에 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유할 수 있다. 한 구체예에서, 하류 서열은 표적화된 부위의 즉시 하류에 위치된 (즉, 표적화된 부위에 인접한) 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 다른 구체예에서, 하류 서열은 표적화된 부위로부터 하류에 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 예로서, 하류 서열은 표적화된 부위로부터 하류에 약 1 내지 약 20, 약 21 내지 약 40, 약 41 내지 약 60, 약 61 내지 약 80, 또는 약 81 내지 약 100개 뉴클레오티드 내에 위치되는 염색체 서열과 실제적인 서열 동일성을 공유할 수 있다.
각 상류 또는 하류 서열은 길이에서 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 5000개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 일부 구체예에서, 상류와 하류 서열은 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, 또는 5000개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 상류와 하류 서열은 길이에서 약 50 내지 약 1500개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다.
표적화된 염색체 서열에 서열 유사성을 갖는 상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 환상일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드가 환상인 구체예에서, 이것은 벡터의 부분일 수 있다. 가령, 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.
표적화된 개열 부위(들)을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 다른 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 최소한 하나의 표적화된 개열 부위를 부가적으로 포함할 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드에 부가된 표적화된 개열 부위는 공여자 서열의 상류 또는 하류 또는 상류와 하류 둘 모두에 배치될 수 있다. 가령, 공여자 서열은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의한 개열 시에, 공여자 서열이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의한 개열 시에 산출된 염색체 서열 내에 것들과 양립하는 오버행과 측면에서 접하도록, 표적화된 개열 부위와 측면에서 접할 수 있다. 따라서, 공여자 서열은 비상동성 수복 과정에 의한 이중 가닥 절단의 수복 동안 개열된 염색체 서열과 결찰될 수 있다. 일반적으로, 표적화된 개열 부위(들)를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 환상일 것이다 (가령, 플라스미드 벡터의 부분일 수 있다).
임의선택적 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드. 다른 대안적 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 산출된 오버행과 양립하는 임의선택적 짧은 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 이런 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 수복 동안 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 일부 경우에, 공여자 서열은 약 1,000개보다 적거나, 약 500개보다 적거나, 약 250개보다 적거나, 또는 약 100개 보다 적은 뉴클레오티드일 수 있다. 일정한 경우에, 공여자 폴리뉴클레오티드는 평활 말단을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 다른 반복에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 5' 및/또는 3' 오버행을 갖는 짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 분자일 수 있다. 오버행은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
전형적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA일 것이다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥 및/또는 선형 또는 환상일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 플라스미드, 세균 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 바이러스 벡터, DNA의 선형 조각, PCR 단편, 나신 핵산, 또는 전달 운반제, 예를 들면, 리포솜 또는 폴록사머로 복합화된 핵산일 수 있다. 일정한 구체예에서, 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터의 부분일 수 있다. 이들 환경 중에서 한 가지에서, 공여자 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드는 최소한 하나의 추가 서열을 더욱 포함할 수 있다.
(e) 세포 또는 배아 내로 도입
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제(들) (또는 인코딩 핵산), 유도 RNA(들) (또는 인코딩 DNA), 그리고 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 다양한 수단에 의해 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 또는 배아는 형질감염된다. 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘-매개된 형질감염, 뉴클레오펙션 (또는 전기천공), 양이온성 중합체 형질감염 (가령, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민), 바이러스 형질도입, 비로솜 형질감염, 비리온 형질감염, 리포솜 형질감염, 양이온성 리포솜 형질감염, 면역리포솜 형질감염, 비리포솜 지질 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 마그네토펙션, 리포펙션, 유전자 총 전달, 임팔레펙션, 소노포레이션, 광학적 형질감염, 그리고 핵산의 소유 작용제-증강된 흡수를 포함한다. 형질감염 방법은 당분야에서 널리 공지된다 (가령, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001을 참조한다). 다른 구체예에서, 이들 분자는 현미주입에 의해 세포 또는 배아 내로 도입된다. 전형적으로, 배아는 관심되는 종의 수태된 단세포 단계 배아이다. 가령, 이들 분자는 단세포 배아의 전핵 내로 주입될 수 있다.
RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 (들) (또는 인코딩 핵산), 유도 RNA(들) (또는 유도 RNA를 인코딩하는 DNA), 그리고 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드(들)는 동시에 또는 순차적으로 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. RNA-표적화된 엔도뉴클레아제 (들) (또는 인코딩 핵산) 내지 유도 RNA(들) (또는 인코딩 DNA)의 비율은 일반적으로, 이들이 RNA-단백질 복합체를 형성할 수 있도록 대략 화학양론적일 것이다. 한 구체예에서, RNA-표적화된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 DNA 및 유도 RNA를 인코딩하는 DNA는 플라스미드 벡터 내에서 함께 전달된다.
(f) 세포 또는 배아 배양
상기 방법은 유도 RNA(들)가 RNA-유도된 엔도뉴클레아제(들)를 염색체 서열 내에 표적화된 부위(들)로 향하게 하고, 그리고 RNA-유도된 엔도뉴클레아제(들)가 염색체 서열 내에 최소한 하나의 이중 가닥 절단을 도입하도록, 세포 또는 배아를 적절한 조건 하에 유지하는 것을 더욱 포함한다. 이중 가닥 절단은 염색체 서열이 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합에 의해 변형되도록 DNA 수복 과정에 의해 수복될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있다. 따라서, 염색체 서열에서 서열이 코딩 영역의 해독틀이 이동될 수 있고, 그리고 염색체 서열이 비활성화되거나 또는 "적중"되도록 변형될 수 있다. 비활성화된 단백질-코딩 염색체 서열은 야생형 염색체 서열에 의해 코딩된 단백질을 발생시키지 못한다.
상류와 하류 서열을 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 이중 가닥 절단은 공여자 서열이 염색체 서열 내로 통합되도록 상동성-지향된 수복 (HDR) 과정에 의해 수복될 수 있다. 따라서, 외인성 서열이 세포 또는 배아의 유전체 내로 통합될 수 있거나, 또는 표적화된 염색체 서열이 야생형 염색체 서열에 대한 변형된 서열의 교환에 의해 변형될 수 있다.
표적화된 개열 부위를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 표적화된 염색체 서열과 공여자 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 개열할 수 있다. 선형 공여자 폴리뉴클레오티드는 NHEJ 과정을 통해, 공여자 폴리뉴클레오티드 및 개열된 염색체 서열 사이에 결찰에 의해 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다.
짧은 공여자 서열을 포함하는 선형 공여자 폴리뉴클레오티드가 세포 또는 배아 내로 도입되는 구체예에서, 짧은 공여자 서열은 NHEJ 과정을 통해, 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 통합은 짧은 공여자 서열 및 이중 가닥 절단의 부위에서 염색체 서열 사이에 평활 말단의 결찰을 통해 진행할 수 있다. 대안으로, 통합은 개열된 염색체 서열에서 RNA-표적화 엔도뉴클레아제에 의해 산출된 것들과 양립하는 오버행과 측면에서 접하는 짧은 공여자 서열 사이에 점착 말단 (즉, 5' 또는 3' 오버행을 갖는)의 결찰을 통해 진행할 수 있다.
일반적으로, 세포는 세포 성장 및/또는 유지에 적절한 조건 하에 유지된다. 적합한 세포 배양 조건은 당분야에서 널리 공지되고 예로서, Santiago et al. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle et al. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651; 그리고 Lombardo et al (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306에서 설명된다. 당업자는 세포를 배양하기 위한 방법이 당분야에서 공지되고 세포 유형에 따라 변할 수 있고 변할 것이라는 것을 인지한다. 모든 사례에서, 특정 세포 유형에 대한 최선의 기술을 결정하기 위해 일과적인 최적화가 이용될 수 있다.
배아는 시험관내에서 배양될 수 있다 (가령, 세포 배양에서). 전형적으로, 배아는 적절한 온도에서, 그리고 필요하면, RNA 엔도뉴클레아제 및 유도 RNA의 발현을 허용하는데 필요한 O2/CO2 비율을 갖는 적절한 배지에서 배양된다. 배지의 적합한 무제한적 실례는 M2, M16, KSOM, BMOC, 그리고 HTF 배지를 포함한다. 당업자는 배양 조건이 배아의 종류에 따라 변할 수 있고 변할 것이라는 것을 인지할 것이다. 모든 사례에서, 특정 종류의 배아에 대한 최선의 배양 조건을 결정하기 위해 일과적인 최적화가 이용될 수 있다. 일부 경우에, 세포주는 시험관내-배양된 배아 (가령, 배아 줄기 세포주)로부터 유래될 수 있다.
대안으로, 배아는 배아를 암컷 숙주의 자궁 내로 이전함으로써 생체내에서 배양될 수 있다. 대체로 말하면, 암컷 숙주는 배아와 동일한 또는 유사한 종으로부터 유래된다. 바람직하게는, 암컷 숙주는 상상 임신이다. 상상 임신 암컷 숙주를 준비하는 방법은 당분야에서 공지된다. 부가적으로, 배아를 암컷 숙주 내로 이전하는 방법은 알려져 있다. 배아를 생체내에서 배양하는 것은 배아가 발달하도록 허용하고, 그리고 배아로부터 유래된 동물의 생존 출생을 유발할 수 있다. 이런 동물은 신체의 모든 세포에서 변형된 염색체 서열을 포함할 것이다.
(g) 세포와 배아 유형
다양한 진핵 세포와 배아가 상기 방법에서 이용하기에 적합하다. 가령, 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체일 수 있다. 일반적으로, 배아는 비-인간 포유류 배아이다. 특정한 구체예에서, 배아는 단세포 비-인간 포유류 배아이다. 단세포 배아를 비롯한 예시적인 포유류 배아는 제한 없이, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 그리고 영장류 배아를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포는 제한 없이, 배아 줄기 세포, ES-유사 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 만능성 줄기 세포, 유도된 만능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 소기능성 줄기 세포, 단분화능 줄기 세포 등을 포함한다. 예시적인 구체예에서, 세포는 포유류 세포이다.
적합한 포유류 세포의 무제한적 실례는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포; 생쥐 골수종 NS0 세포, 생쥐 배아 섬유모세포 3T3 세포 (NIH3T3), 생쥐 B 림프종 A20 세포; 생쥐 흑색종 B16 세포; 생쥐 근모세포 C2C12 세포; 생쥐 골수종 SP2/0 세포; 생쥐 배아 중간엽 C3H-10T1/2 세포; 생쥐 암종 CT26 세포, 생쥐 전립선 DuCuP 세포; 생쥐 유방 EMT6 세포; 생쥐 간암 Hepa1c1c7 세포; 생쥐 골수종 J5582 세포; 생쥐 상피 MTD-1A 세포; 생쥐 심근 MyEnd 세포; 생쥐 신장 RenCa 세포; 생쥐 췌장 RIN-5F 세포; 생쥐 흑색종 X64 세포; 생쥐 림프종 YAC-1 세포; 쥐 교모세포종 9L 세포; 쥐 B 림프종 RBL 세포; 쥐 신경모세포종 B35 세포; 쥐 간암 세포 (HTC); 버팔로 쥐 간 BRL 3A 세포; 개 신장 세포 (MDCK); 개 유방 (CMT) 세포; 쥐 골육종 D17 세포; 쥐 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환된 섬유모세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO-76) 세포; 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 A-431 세포, 그리고 인간 K562 세포를 포함한다. 포유류 세포주의 광범위한 목록은 American Type Culture Collection 카탈로그 (ATCC, Mamassas, VA)에서 발견될 수 있다.
(V) 융합 단백질을 이용하여 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법
본 발명의 다른 양상은 세포 또는 배아에서 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절하기 위한 방법을 포괄한다. 상기 방법은 다음을 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함한다: (a) 최소한 하나의 융합 단백질 또는 최소한 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 여기서 상기 융합 단백질은 CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하고, 그리고 (b) 최소한 하나의 유도 RNA 또는 상기 유도 RNA를 인코딩하는 DNA, 여기서 유도 RNA는 융합 단백질의 CRISPR/Cas-유사 단백질을 염색체 서열 내에 표적화된 부위로 유도하고, 그리고 융합 단백질의 작동체 도메인은 염색체 서열을 변경하거나 또는 염색체 서열의 발현을 조절한다.
CRISPR/Cas-유사 단백질 또는 이의 단편 및 작동체 도메인을 포함하는 융합 단백질은 상기 섹션 (II)에서 상술된다. 일반적으로, 본원에서 개시된 융합 단백질은 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 더욱 포함한다. 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 섹션 (III)에서 설명된다. 일부 구체예에서, 융합 단백질은 단리된 단백질로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다 (이것은 세포-투과성 도메인을 더욱 포함할 수 있다). 게다가, 단리된 융합 단백질은 유도 RNA를 포함하는 단백질-RNA 복합체의 부분일 수 있다. 다른 구체예에서, 융합 단백질은 RNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다 (이것은 캡핑되고 및/또는 폴리아데닐화될 수 있다). 또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 DNA 분자로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 가령, 융합 단백질 및 유도 RNA는 구별된 DNA 분자로서 또는 동일한 DNA 분자의 일부로서 세포 또는 배아 내로 도입될 수 있다. 이런 DNA 분자는 플라스미드 벡터일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 아연 핑거 뉴클레아제를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제는 섹션 (II)(d)에서 전술된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 최소한 하나의 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된다. 분자를 세포 또는 배아 내로 도입하기 위한 수단뿐만 아니라 세포 또는 배아를 배양하기 위한 수단은 각각, 섹션 (IV)(e)와 (IV)(f)에서 전술된다. 적합한 세포와 배아는 섹션 (IV)(g)에서 전술된다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 일정한 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이들 2개의 유도 RNA는 융합 단백질을 염색체 서열 내에 2개의 상이한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 상기 융합 단백질은 2개의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내에 도입할 수 있도록 이합체화한다 (가령, 동종이합체를 형성한다). 도면 1A를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 염색체 서열 내에 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있다. 따라서, 표적화된 염색체 서열은 변형되거나 또는 비활성화될 수 있다. 가령, 단일 뉴클레오티드 변화 (SNP)가 변경된 단백질 산물을 발생시킬 수 있거나, 또는 코딩 서열의 해독틀에서 이동이 단백질 산물이 만들어지지 않도록 상기 서열을 비활성화시키거나 또는 "녹아웃"시킬 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 수복 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열의 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서, 공여자 서열은 상동성-지향된 수복 과정에 의해 매개된 수복 동안 표적화된 부위에서 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다. 대안으로, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 (또는 양립성 오버행이 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 원지에서 산출되는) 구체예에서, 공여자 서열은 이중 가닥 절단의 수복 동안 비상동성 수복 과정에 의해 개열된 염색체 서열과 직접적으로 결찰될 수 있다. 염색체 서열 내로 공여자 서열의 교환 또는 통합은 표적화된 염색체 서열을 변경하거나 또는 외인성 서열을 세포 또는 배아의 염색체 서열 내로 도입한다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 다른 구체예에서, 상기 방법은 2개의 상이한 융합 단백질 (또는 2개의 상이한 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 2개의 유도 RNA (또는 2개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 이들 융합 단백질은 상기 섹션 (II)에서 상술된 바와 같이 상이할 수 있다. 각 유도 RNA는 융합 단백질을 염색체 서열 내에 특정한 표적 부위로 향하게 하고, 여기서 이들 융합 단백질은 2개의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내로 도입할 수 있도록 이합체화한다 (가령, 이형이합체를 형성한다). 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있도록, 비상동성 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 수복 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 개열 도메인 (가령, FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인)인 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산), 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA), 그리고 1개의 아연 핑거 뉴클레아제 (또는 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 아연 핑거 뉴클레아제는 FokI 개열 도메인 또는 변형된 FokI 개열 도메인을 포함한다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 그리고 아연 핑거 뉴클레아제는 다른 염색체 서열에 지향되고, 여기서 융합 단백질 및 아연 핑거 뉴클레아제는 융합 단백질의 개열 도메인 및 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인이 이중 가닥 절단을 염색체 서열 내로 도입할 수 있도록 이합체화한다. 도면 1B를 참조한다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하지 않는 구체예에서, 결과의 이중 가닥 절단은 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있도록, 비상동성 수복 과정에 의해 수복될 수 있다. 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드가 존재하는 구체예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 내에 공여자 서열은 상동성-기초된 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 각각, 염색체 서열 내에 표적화된 부위의 상류와 하류 서열과 실제적인 서열 동일성을 갖는 상류와 하류 서열과 측면에서 접하는 구체예에서) 또는 비상동성 수복 과정에 의해 (가령, 공여자 서열이 양립성 오버행과 측면에서 접하는 구체예에서), 이중 가닥 절단의 수복 동안 염색체 서열과 교환되거나 또는 이것 내로 통합될 수 있다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인인 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 여기서 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인은 각각, 표적화된 염색체 서열의 발현을 활성화시키거나 또는 억제한다. 도면 2A를 참조한다.
융합 단백질의 작동체 도메인이 후성 변형 도메인인 대안적 구체예에서, 상기 방법은 1개의 융합 단백질 (또는 1개의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산) 및 1개의 유도 RNA (또는 1개의 유도 RNA를 인코딩하는 DNA)를 세포 또는 배아 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 유도 RNA는 융합 단백질을 특정한 염색체 서열로 향하게 하고, 여기서 후성 변형 도메인은 표적화된 염색체 서열의 구조를 변경한다. 도면 2A를 참조한다. 후성 변형은 아세틸화, 히스톤 단백질의 메틸화 및/또는 뉴클레오티드 메틸화를 포함한다. 일부 경우에, 염색체 서열의 구조적 변형은 염색체 서열의 발현에서 변화를 야기한다.
(VI) 유전적으로 변형된 세포와 동물
본 발명은 예로서, 본원에서 설명된 방법을 이용하여, RNA-유도된 엔도뉴클레아제-매개된 또는 융합 단백질-매개된 과정을 이용하여 변형된 최소한 하나의 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 세포, 비-인간 배아, 그리고 비-인간 동물을 포괄한다. 본 발명은 관심되는 염색체 서열에 표적화된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 DNA 또는 RNA 분자 또는 융합 단백질, 최소한 하나의 유도 RNA, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 관심되는 염색체 서열에 표적화된 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 또는 융합 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 DNA 또는 RNA 분자, 최소한 하나의 유도 RNA, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 비-인간 배아를 제공한다.
본 발명은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 비-인간 배아, 또는 동물 세포를 제공한다. 변형된 염색체 서열은 (1) 비활성화되고, (2) 변경된 발현을 갖거나 또는 변경된 단백질 산물을 생산하고, 또는 (3) 통합된 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, RNA 유도된 엔도뉴클레아제-매개된 또는 융합 단백질-매개된 과정으로 변형된다.
논의된 바와 같이, 본 발명의 한 가지 양상은 최소한 하나의 염색체 서열이 변형된 유전적으로 변형된 동물을 제공한다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 최소한 하나의 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 변형된 염색체 서열은 상기 서열이 전사되지 않고 및/또는 기능적 단백질 산물이 생산되지 않도록 비활성화될 수 있다. 따라서, 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 "녹아웃" 또는 "조건적 녹아웃"으로 명명될 수 있다. 비활성화된 염색체 서열은 결실 돌연변이 (즉, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실), 삽입 돌연변이 (즉, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입), 또는 넌센스 돌연변이 (즉, 종결 코돈이 도입되도록 다른 뉴클레오티드에 대한 단일 뉴클레오티드의 치환)를 포함할 수 있다. 돌연변이의 결과로서, 표적화된 염색체 서열이 비활성화되고 기능적 단백질이 생산되지 않는다. 비활성화된 염색체 서열은 외인성으로 도입된 서열을 포함하지 않는다. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 염색체 서열이 비활성화되는 유전적으로 변형된 동물 역시 본원에서 포함된다.
다른 구체예에서, 변형된 염색체 서열은 변이체 단백질 산물을 코딩하도록 변경될 수 있다. 가령, 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 변경된 단백질 산물이 생산되도록, 표적화된 점 돌연변이(들) 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 염색체 서열은 최소한 하나의 뉴클레오티드가 변화되고, 그리고 발현된 단백질이 하나의 변화된 아미노산 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다 (미스센스 돌연변이). 다른 구체예에서, 염색체 서열은 하나 이상의 아미노산이 변화되도록, 하나 이상의 미스센스 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 부가적으로, 염색체 서열은 발현된 단백질이 단일 아미노산 결실 또는 삽입을 포함하도록, 3개의 뉴클레오티드 결실 또는 삽입을 갖도록 변형될 수 있다. 변경된 또는 변이체 단백질은 야생형 단백질과 비교하여 변경된 성질 또는 활성, 예를 들면, 변경된 기질 특이성, 변경된 효소 활성, 변경된 운동성 비율 등을 가질 수 있다.
다른 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함할 수 있다. 통합된 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 "녹인" 또는 "조건적 녹인"으로 명명될 수 있다. 염색체로 통합된 서열은 예로서, 이종상동성 단백질, 내인성 단백질, 또는 둘 모두의 조합을 인코딩할 수 있다. 한 구체예에서, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 염색체 서열이 비활성화되지만 외인성 서열이 발현되도록, 단백질을 인코딩하는 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 이런 경우에, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 이종상동성 단백질 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 서열은 염색체 서열의 발현에 영향을 주지 않으면서 염색체 서열 내로 통합될 수 있다. 가령, 단백질을 인코딩하는 서열은 "안전한 항구" 좌위, 예를 들면, Rosa26 좌위, HPRT 좌위, 또는 AAV 좌위 내로 통합될 수 있다. 본 발명은 또한, 단백질(들)을 인코딩하는 서열을 비롯하여, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상 서열이 유전체 내로 통합되는 유전적으로 변형된 동물을 포괄한다.
단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 관심되는 단백질의 야생형 형태를 인코딩할 수 있거나 또는 단백질의 변경된 이형이 생산되도록 최소한 하나의 변형을 포함하는 단백질을 인코딩할 수 있다. 가령, 질환 또는 장애에 관련된 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 생산된 단백질의 변경된 이형이 연관된 장애를 유발하거나 또는 강력하게 하도록 최소한 하나의 변형을 포함할 수 있다. 대안으로, 질환 또는 장애에 관련된 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열은 단백질의 변경된 이형이 연관된 장애의 발달에 대항하여 보호하도록 최소한 하나의 변형을 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 기능적 인간 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함하는 "인간화" 동물일 수 있다. 기능적 인간 단백질은 유전적으로 변형된 동물에서 상응하는 오르소로그 없음을 가질 수 있다. 대안으로, 유전적으로 변형된 동물이 유래되는 야생형 동물은 기능적 인간 단백질에 상응하는 오르소로그를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, "인간화" 동물 내에 이종상동성 서열은 기능적 단백질이 만들어지지 않도록 비활성화되고, 그리고 "인간화" 동물은 인간 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 염색체로 통합된 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 단백질의 발현 패턴이 변경되도록, 단백질을 인코딩하는 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함할 수 있다. 가령, 단백질의 발현을 제어하는 조절 영역, 예를 들면, 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위는 단백질이 과다생산되거나, 또는 단백질의 조직 특이적 또는 일시적 발현이 변경되거나, 또는 이들의 조합이 되도록 변경될 수 있다. 대안으로, 단백질의 발현 패턴은 조건적 녹아웃 시스템을 이용하여 변경될 수 있다. 조건적 녹아웃 시스템의 무제한적 실례는 Cre-lox 재조합 시스템을 포함한다. Cre-lox 재조합 시스템은 핵산 분자 내에 특정한 부위 (lox 부위) 사이에 핵산 서열의 재조합을 촉매작용할 수 있는 부위 특이적 DNA 재조합효소인 Cre 재조합효소 효소를 포함한다. 일시적인 조직 특이적 발현을 산출하기 위해 이러한 시스템을 이용하는 방법은 당분야에서 공지된다. 일반적으로, 유전적으로 변형된 동물은 염색체 서열에 접하는 lox 부위에서 산출된다. lox-접하는 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 동물은 이후, Cre 재조합효소를 발현하는 다른 유전적으로 변형된 동물과 교차될 수 있다. lox-접하는 염색체 서열을 포함하는 자손 동물 및 Cre 재조합효소가 이후 생산되고, 그리고 lox-접하는 염색체 서열이 재조합되어, 단백질을 인코딩하는 염색체 서열의 결실 또는 역전을 야기한다. Cre 재조합효소의 발현은 염색체 서열의 일시적으로 및 조건적으로 조절된 재조합을 산출하기 위해 일시적으로 및 조건적으로 조절될 수 있다.
이들 구체예 중에서 한 가지에서, 본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물은 변형된 염색체 서열에 대해 이형접합성일 수 있다. 대안으로, 유전적으로 변형된 동물은 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성일 수 있다.
본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물은 하나 이상의 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물을 창출하기 위해 또는 하나 또는 그 이상의 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성인 동물을 창출하기 위해 교배될 수 있다. 가령, 동일한 변형된 염색체 서열을 포함하는 2마리 동물이 교배되어 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성 동물을 창출할 수 있다. 대안으로, 상이한 변형된 염색체 서열을 갖는 동물이 교배되어 양쪽 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물을 창출할 수 있다.
가령, 비활성화된 염색체 서열 유전자 "x"를 포함하는 첫 번째 동물은 인간 유전자 "X" 단백질을 인코딩하는 염색체로 통합된 서열을 포함하는 두 번째 동물과 교차되어, 비활성화된 유전자 "x" 염색체 서열 및 염색체로 통합된 인간 유전자 "X" 서열 둘 모두를 포함하는 "인간화" 유전자 "X" 자손을 발생시킬 수 있다. 또한, 인간화 유전자 "X" 동물은 인간화 유전자 "Y" 동물과 교차되어 인간화 유전자 X/유전자 Y 자손을 창출할 수 있다. 당업자는 많은 조합이 가능하다는 것을 인지할 것이다.
다른 구체예에서, 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물은 변형된 염색체 서열을 다른 유전자 배경과 합동하기 위해 교배될 수 있다. 무제한적 실례에 의하여, 다른 유전자 배경은 야생형 유전자 배경, 결실 돌연변이를 갖는 유전자 배경, 다른 표적화된 통합을 갖는 유전자 배경, 그리고 비표적화된 통합을 갖는 유전자 배경을 포함할 수 있다.
용어 "동물"은 본원에서 이용된 바와 같이, 비-인간 동물을 지칭한다. 동물은 배아, 소아, 또는 성체일 수 있다. 적합한 동물은 척추동물, 예를 들면, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 조개류, 그리고 어류를 포함한다. 적합한 포유동물의 실례는 제한 없이, 설치류, 반려 동물, 가축, 그리고 영장류를 포함한다. 설치류의 무제한적 실례는 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스쥐, 그리고 기니 피그를 포함한다. 적합한 반려 동물에는 고양이, 개, 토끼, 헤지호그, 그리고 흰담비가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 가축의 무제한적 실례는 말, 염소, 양, 돼지, 소, 라마, 그리고 알파카를 포함한다. 적합한 영장류에는 카푸친 원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋, 타마린, 거미 원숭이, 다람쥐 원숭이, 그리고 버빗 원숭이가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 조류의 무제한적 실례는 닭, 칠면조, 오리, 그리고 거위를 포함한다. 대안으로, 동물은 무척추동물, 예를 들면, 곤충, 선충, 기타 등등일 수 있다. 곤충의 무제한적 실례는 초파리 (Drosophila) 및 모기를 포함한다. 예시적인 동물은 쥐이다. 적합한 쥐 혈통의 무제한적 실례는 Dahl Salt-Sensitive, Fischer 344, Lewis, Long Evans Hooded, Sprague-Dawley, 그리고 Wistar를 포함한다. 한 구체예에서, 동물은 유전적으로 변형된 생쥐가 아니다. 본 발명을 위한 적합한 동물의 각 전술한 반복에서, 동물은 외인성으로 도입된, 무작위로 통합된 트랜스포손 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 추가 양상은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주를 제공한다. 유전적으로 변형된 세포 또는 세포주는 본원에서 개시된 유전적으로 변형된 동물 중에서 한 가지로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, 상기 본원에서 (동물에서 염색체 서열 변형을 설명하는 단락에서) 설명된 바와 같이 세포에서 변형될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 세포 또는 세포주의 용해물을 포괄한다.
일반적으로, 이들 세포는 진핵 세포이다. 적합한 숙주 세포는 곰팡이류 또는 효모, 예를 들면, 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 또는 쉬조사카로미세스 (Schizosaccharomyces); 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda)로부터 SF9 세포 또는 노랑초파리 (Drosophila melanogaster)로부터 S2 세포; 그리고 동물 세포, 예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 비-인간 영장류, 또는 인간 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 포유류이다. 포유류 세포는 일차 세포일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 절단에 민감한 임의의 일차 세포가 이용될 수 있다. 이들 세포는 다양한 세포 유형, 예를 들면, 섬유모세포, 근모세포, T 또는 B 세포, 대식세포, 상피 세포, 기타 등등일 수 있다.
포유류 세포주가 이용될 때, 상기 세포주는 아직 설명되지 않은 임의의 확립 세포주 또는 일차 세포주일 수 있다. 세포주는 유착성 또는 비유착성이거나, 또는 세포주는 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여, 유착성, 비유착성 또는 기관형적 성장을 고무하는 조건 하에 성장될 수 있다. 적합한 포유류 세포와 세포주의 무제한적 실례는 본원에서 섹션 (IV)(g)에서 제공된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 줄기 세포일 수 있다. 적합한 줄기 세포의 무제한적 실례는 섹션 (IV)(g)에서 제공된다.
본 발명은 최소한 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 배아 역시 제공한다. 염색체 서열은 본원에서 설명된 방법을 이용하여, 상기 본원에서 (동물에서 염색체 서열 변형을 설명하는 단락에서) 설명된 바와 같이 배아에서 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 배아는 관심되는 동물 종의 비-인간 수태된 단세포 단계 배아이다. 단세포 배아를 비롯하여, 예시적인 포유류 배아는 제한 없이, 생쥐, 쥐, 햄스터, 설치류, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 그리고 영장류 배아를 포함한다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용된 바와 같이, 다음 용어는 달리 특정되지 않으면, 그들에 생득된 의미를 갖는다.
본 발명의 원소 또는 이의 바람직한 구체예(들)를 소개할 때, 관사 "a", "an", "the" 및 "상기"는 이들 원소 중에서 하나 또는 그 이상이 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "포함하는" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되고, 그리고 열거된 원소 이외에 추가 원소가 있을 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "내인성 서열"은 세포에 선천적인 염색체 서열을 지칭한다.
용어 "외인성"은 본원에서 이용된 바와 같이, 세포에 선천적이지 않은 서열, 또는 세포의 유전체 내에 선천적 위치가 상이한 염색체 위치에 있는 염색체 서열을 지칭한다.
"유전자"는 본원에서 이용된 바와 같이, 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역 (엑손과 인트론 포함)뿐만 아니라 이런 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는 지에 상관없이 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예를 들면, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 유입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 원소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위, 그리고 좌위 제어 영역을 포함하지만, 이들에 반드시 한정되지는 않는다.
용어 "이종유래"는 관심되는 세포에 내인성이거나 또는 선천적이지 않은 실체를 지칭한다. 가령, 이종단백질은 외인성 공급원, 예를 들면, 외인성으로 도입된 핵산 서열로부터 유래되거나 또는 이것으로부터 최초 유래되었던 단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 이종 단백질은 관심되는 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않는다.
용어 "핵산"과 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 환상 입체형태에서, 그리고 단일- 또는 이중 가닥 형태에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적으로, 이들 용어는 중합체의 길이에 대하여 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 이들 용어는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티 (가령, 포스포로티오에이트 중추)에서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-짝짓기 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 그리고 우리딘) 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 (가령, 이노신) 또는 비자연적으로 발생하는 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티 상에서 변형의 무제한적 실례는 아세틸 기, 아미노 기, 카르복실 기, 카르복시메틸 기, 히드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기, 그리고 티올 기의 부가 (또는 제거)뿐만 아니라 염기의 탄소와 질소 원자의 다른 원자 (가령, 7-데아자 퓨린)로 치환을 포함한다. 뉴클레오티드 유사체는 또한, 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금된 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 그리고 모르폴리노를 포함한다.
용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다.
핵산과 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당분야에서 공지된다. 전형적으로, 이런 기술은 유전자의 경우에 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 이에 따른 인코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 그리고 이들 서열을 두 번째 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 유전체학 서열 역시 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응을 지칭한다. 2개 또는 그 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열인지에 상관없이, 두 서열의 퍼센트 동일성은 더욱 짧은 서열의 길이에 의해 나눗셈되고 100에 의해 곱셈된, 두 정렬된 서열 사이에 정확한 매치의 숫자이다. 핵산 서열에 대한 근사 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, 그리고 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화된 채점 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행은 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 "BestFit" 유용성 애플리케이션에서 제공된다. 서열 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당분야에서 전반적으로 공지되어 있다, 예로서, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터에서 이용된 BLAST이다. 가령, BLASTN과 BLASTP는 다음 디폴트 파라미터를 이용하여 이용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 모두; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 = 높은 점수; 데이터베이스 = 비다중, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세는 GenBank 웹사이트 상에서 발견될 수 있다.
다양한 변화가 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 설명된 세포와 방법에서 만들어질 수 있었기 때문에, 상기 설명에서 및 아래 제공된 실시예에서 내포된 모든 물질은 예시적인 것으로 해석되고 제한하는 의미로 해석되지 않는 것으로 의도된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 일정한 양상을 예증한다.
실례 1: 포유류 발현을 위한 Cas9 유전자의 변형
스트렙토콕쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 균주 MGAS15252 (수탁 번호 YP_005388840.1)로부터 Cas9 유전자는 포유류 세포에서 이의 번역을 증강하기 위해 호모사피엔스 코돈 선호로 최적화되었다. Cas9 유전자는 또한, 상기 단백질을 포유류 세포의 핵 내로 표적화하기 위해 C 말단에서 핵 국지화 신호 PKKKRKV (서열 번호:1)를 부가함으로써 변형되었다. 표 1은 변형된 Cas9 아미노산 서열을 제공하는데, 핵 국지화 서열은 밑줄 그어진다. 표 2는 코돈 최적화된, 변형된 Cas9 DNA 서열을 제공한다.
변형된 Cas9 아미노산 서열
QEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDPKKKRKV (서열 번호:9)
최적화된 Cas9 DNA 서열 (5'-3')
CCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTG (서열 번호:10)
변형된 Cas9 DNA 서열은 포유류 세포에서 구성적 발현을 위해 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 변형된 Cas9 DNA 서열은 또한, T7 RNA 중합효소로 시험관내 mRNA 합성을 위해 T7 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 시험관내 RNA 전사는 MessageMAX T7 ARCA-캡핑된 Message 전사 키트 및 T7 mScript 표준 mRNA 생산 시스템 (Cellscript)을 이용함으로써 수행되었다.
실시예 2: Cas9 표적화
아데노 연관된 바이러스 통합 부위 1 (AAVS1) 좌위가 Cas9-매개된 인간 유전체 변형을 위한 표적으로서 이용되었다. 인간 AAVS1 좌위는 단백질 포스파타아제 1, 조절 아단위 12C (PPP1R12C)의 인트론 1 (4427 bp)에서 위치된다. 표 3은 PPP1R12C의 첫 번째 엑손 (음영된 회색) 및 첫 번째 인트론을 제공한다. 인트론 내에 밑줄 그어진 서열은 표적화된 변형 부위 (즉, AAVS1 좌위)이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Cas9 유도 RNA는 인간 AAVS1 좌위를 표적으로 하도록 설계되었다. 표적 인식 서열 (즉, 표적 서열의 비코딩 가닥에 상보적인 서열) 및 프로토스페이서 서열을 포함하는 42개 뉴클레오티드 RNA (본원에서 "crRNA" 서열로 지칭됨) (5'에서 3'); crRNA의 3' 서열에 상보성을 갖는 5' 서열 및 추가 헤어핀 서열을 포함하는 85개 뉴클레오티드 RNA (본원에서 "tracrRNA" 서열로 지칭됨); 그리고 crRNA의 뉴클레오티드 1-32, GAAA 루프 및 tracrRNA의 뉴클레오티드 19-45를 포함하는 키메라 RNA가 제조되었다. crRNA는 Sigma-Aldrich에 의해 화학적으로 합성되었다. tracrRNA 및 키메라 RNA는 T7-Scribe 표준 RNA IVT 키트 (Cellscript)를 이용하여, T7 RNA 중합효소로 시험관내 전사에 의해 합성되었다. 키메라 RNA 코딩 서열 역시 인간 세포에서 생체내 전사를 위해 인간 U6 프로모터의 제어 하에 배치되었다. 표 4는 유도 RNA의 서열을 제공한다.
유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
AAVS1-crRNA ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 12
tracrRNA GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU 13
키메라 RNA ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG 14
실시예 3: 유전체 변형을 모니터링하기 위한 공여자 폴리뉴클레오티드의 제조
PPP1R12C의 N 말단 내로 GFP 단백질의 표적화된 통합이 Cas9-매개된 유전체 변형을 모니터링하는데 이용되었다. 상동성 재조합에 의한 통합을 매개하기 위해, 공여자 폴리뉴클레오티드가 제조되었다. AAVS1-GFP DNA 공여자는 5' (1185 bp) AAVS1 좌위 상동성 팔, RNA 스플라이싱 수용체, 터보 GFP 코딩 서열, 3' 전사 종결인자, 그리고 3' (1217 bp) AAVS1 좌위 상동성 팔을 내포하였다. 표 5는 RNA 스플라이싱 수용체 및 GFP 코딩 서열, 그 이후에 3' 전사 종결인자의 서열을 제공한다. 플라스미드 DNA는 GenElute 내독소-없는 플라스미드 Maxiprep 키트 (Sigma)를 이용함으로써 제조되었다.
AAVS1-GFP DNA 공여자 서열에서 서열
5'-3' 서열 서열 번호:
RNA 스플라이싱 수용체 CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG 15
GFP 코딩 서열과 전사 종결인자 GCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGTCGACTCTAGAGCTGCAGAGAGCGACGAGAGCGGCCTGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCGAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGATGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCGTCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGATCTGGATGGCAGCTTCACCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTCCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGGATCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCGGATGCAGATGCCGGTGAAGAATGAAGATCTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGACTCGAGGTTTAAACGTCGACGCGGCCGCGT 16
표적화된 유전자 통합은 PPP1R12C의 첫 107개 아미노산 및 터보 GFP 사이에 융합 단백질을 유발할 것이다. 예상된 융합 단백질은 PPP1R12C의 첫 번째 엑손 및 가공된 스플라이스 수용체 사이에 RNA 스플라이싱으로부터 PPP1R12C의 첫 107개 아미노산 잔기 (회색으로 강조됨)를 내포한다 (표 6 참조).
PPP1R12C-GFP 융합 단백질의 예측된 아미노산 서열.
MSGEDGPAAGPGAAAAAARERRREQLRQWGARAGAEPGPGERRARTVRFERAAEFLAACAGGDLDEARLMLRAADPGPGAELDPAAPPPARAVLDSTNADGISALHQATMDYKDDDDKVDSRAAESDESGLPAMEIECRITGTLNGVEFELVGGGEGTPEQGRMTNKMKSTKGALTFSPYLLSHVMGYGFYHFGTYPSGYENPFLHAINNGGYTNTRIEKYEDGGVLHVSFSYRYEAGRVIGDFKVMGTGFPEDSVIFTDKIVRSNATVEHLHPMGDNDLDGSFTRTFSLRDGGYYSSVVDSHMHFKSAIHPSILQNGGPMFAFRRVEEDHSNTELGIVEYQHAFKTPDADAGEE (서열 번호:17)
실시예 4: Cas9-매개된 표적화된 통합
형질감염이 인간 K562 세포에서 수행되었다. K562 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 획득되고, 그리고 10% FBS와 2 mM L-글루타민으로 보충된 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지에서 성장되었다. 모든 배지와 보충물은 Sigma-Aldrich로부터 획득되었다. 배양액은 형질감염 하루 전에 분할되었다 (형질감염 이전 mL당 대략 0.5 백만 세포에서). 세포는 T-016 프로그램에 따라 뉴클레오펙터 (Lonza) 상에서 뉴클레오펙터 용액 V (Lonza)로 형질감염되었다. 각 뉴클레오펙션은 대략 0.6 백만 세포를 내포하였다. 형질감염 처리는 표 7에서 상술된다. 세포는 뉴클레오펙션 직후에 37 ℃ 및 5% CO2에서 성장되었다.
형질감염 처리.
처리 변형된 Cas9 유도 RNA 공여자 서열
A
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된 Cas9 mRNA (10 μg)		 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선 (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
B
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된 Cas9 mRNA (10 μg)		 키메라 RNA (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
C
전사후 캡핑 반응을 통해 캡핑된 Cas9 mRNA (10 μg)		 키메라 RNA (0.3 nmol) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
D Cas9 플라스미드 DNA (10 μg) U6-키메라 RNA 플라스미드 DNA (5 μg) AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
E 없음 없음 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA (10 μg)
F 없음 없음 없음
형광-활성화된 세포 분류 (FACS)가 형질감염 후 4 일에 수행되었다. FACS 데이터는 도면 4에서 제공된다. 4가지 실험적 처리 (A-D) 각각에서 검출된 퍼센트 GFP는 대조 처리 (E, F)에서보다 보다 컸는데, 이것은 공여자 서열의 통합 및 융합 단백질의 발현을 확증한다.
실시예 5: 표적화된 통합의 PCR 확증
유전체학 DNA는 형질감염 후 12 일에 GenElute 포유류 유전체학 DNA Miniprep 키트 (Sigma)로, 형질감염된 세포로부터 추출되었다. 유전체학 DNA는 이후, AAVS1-GFP 플라스미드 공여자의 5' 상동성 팔 외측에 위치된 전방 프라이머 및 GFP의 5' 영역에서 위치된 후방 프라이머로 PCR 증폭되었다. 전방 프라이머는 5'- CCACTCTGTGCTGACCACTCT-3' (서열 번호:18)이고, 그리고 후방 프라이머는 5'- GCGGCACTCGATCTCCA-3' (서열 번호:19)이었다. 접합부 PCR로부터 예상된 단편 크기는 1388 bp이었다. 증폭은 다음 순환 조건을 이용하여, JumpStart Taq ReadyMix (Sigma)로 수행되었다: 초기 변성을 위한 98℃에서 2 분; 98℃에서 15 초, 62℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 1분 30 초의 35회 주기; 그리고 72℃에서 5 분 동안 최종 신장. PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 상에서 분해되었다.
안티 리버스 Cap 유사체와 함께 전사된Cas9 mRNA 10 μg, 0.3 nmol의 미리 어닐링된 crRNA-tracrRNA 이중나선, 그리고 10 μg의 AAVS1-GFP 플라스미드 DNA로 형질감염된 세포는 예상된 크기의 PCR 산물을 전시하였다 (참조: 레인 A, 도면 5).
실시예 6: 생쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 편집
생쥐 Rosa26 좌위가 유전체 변형을 위해 표적화될 수 있다. 표 8은 잠재적 표적 부위가 굵은 글씨체로 표시되는 생쥐 Rosa26 서열의 부분을 제공한다. 각 표적 부위는 프로토스페이서를 포함한다.
생쥐 Rosa26 서열
GAGCGGCTGCGGGGCGGGTGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAGGGGCGTGCTGAGCCAGACCTCCATCGCGCACTCCGGGGAGTGGAGGGAAGGAGCGAGGGCTCAGTTGGGCTGTTTTGGAGGCAGGAAGCACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCAGTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGGAGAATCCCTTCCCCCTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGTGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGACAAGACTTCCCACAGATTTTCGGTTTTGTCGGGAAGTTTTTTAATAGGGGCAAATAAGGAAAATGGGAGGATAGGTAGTCATCTGGGGTTTTATGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCTCGGAGTATTTTCCATCGAGGTAGATTAAAGACATGCTCACCCGAGTTTTATACTCTCCTGCTTGAGATCCTTACTACAGTATGAAATTACAGTGTCGCGAGTTAGACTATGTAAGCAGAATTTTA (서열 번호:20)
유도 RNA는 생쥐 Rosa26 좌위에서 각 표적 부위를 표적으로 하도록 설계되었다. 서열은 표 9에서 도시되는데, 각각 길이에서 42개 뉴클레오티드이고, 그리고 5' 영역이 표 8에서 제공되지 않은 가닥 (즉, 표 8에서 도시된 가닥에 상보적인 가닥)에 상보적이다.
생쥐 Rosa26 유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
mRosa26-crRNA-1 CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 21
mRosa26-crRNA-2 UGAACAGGUGUAAAAUUGGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 22
mRosa26-crRNA-3 UGUCGGGAAGUUUUUUAAUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 23
crRNA가 화학적으로 합성되고 tracrRNA에 미리 어닐링되었다 (서열 번호:13; 실시예 2 참조). 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9 단백질을 인코딩하는 시험관내 전사된 mRNA (서열 번호. 9; 실시예 1 참조)는 수태된 생쥐 배아의 전핵 내로 미량주사될 수 있다. crRNA에 의한 표적 세트로 유도 시에, Cas9 단백질은 표적 부위를 개열하고, 그리고 결과의 이중 가닥 절단이 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 수복 과정을 통해 수복될 수 있다. 주사된 배아는 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 또는 최대 4 일 동안 배양되고, 그 이후에 유전형자분석될 수 있거나, 또는 주사된 배아는 생존 출산 동물이 유전자형분석될 수 있도록 수용자 암컷 생쥐 내로 이식될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직은 표준 방법을 이용하여, Rosa 좌위에서 Cas9-유발 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 가령, 태아 또는 생존 출산 동물로부터 배아 또는 조직은 DNA 추출과 분석을 위해 수확될 수 있다. DNA는 표준 절차를 이용하여 단리될 수 있다. Rosa26 좌위의 표적화된 영역은 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있다. 돌연변이는 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, Cel-I 불일치 검정 및 DNA 염기서열결정을 이용하여 검출될 수 있다.
실시예 7: 생쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 변형
Rosa26 좌위는 상기 실시예 6에서 설명된 바와 같은 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9를 인코딩하는 mRNA와 함께, 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된 바와 같이, 공여자 폴리뉴클레오티드를 공동 주사함으로써 생쥐 배아에서 변형될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직 (실시예 6에서 설명된 바와 같이)은 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, RFLP 검정, 접합부 PCR, 그리고 DNA 염기서열결정을 이용하여, 변형된 Rosa26 좌위에 대해 스크리닝될 수 있다.
실시예 8: 쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 편집
쥐 Rosa26 좌위가 유전체 변형을 위해 표적화될 수 있다. 표 10은 잠재적 표적 부위가 굵은 글씨체로 표시되는 쥐 서열의 부분을 제공한다. 각 표적 부위는 프로토스페이서를 포함한다.
쥐 Rosa26 서열
GGGATTCCTCCTTGAGTTGTGGCACTGAGGAACGTGCTGAACAAGACCTACATTGCACTCCAGGGAGTGGATGAAGGAGTTGGGGCTCAGTCGGGTTGTATTGGAGACAAGAAGCACTTGCTCTCCAAAAGTCGGTTTGAGTTATCATTAAGGGAGCTGCAGTGGAGTAGGCGGAGAAAAGGCCGCACCCTTCTCAGGACGGGGGAGGGGAGTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTGTCTTCTGAGGACCGCCCTGGGCCTGGAAGATTCCCTTCCCCCTTCTTCCCTCGTGATCTGCAACTGGAGTCTTTCTGGAAGATAGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAACCTGGTGCGTGGGGCGTTGTCCTGCAGAGGAATTGAACAGGTGTAAAATTGGAGGGGCAAGACTTCCCACAGATTTTCGATTGTGTTGTTAAGTATTGTAATAGGGGCAAATAAGGGAAATAGACTAGGCACTCACCTGGGGTTTTATGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTGCTTGTGATCCGCCCTGGAGAATTTTTCACCGAGGTAGATTGAAGACATGCCCACCCAAATTTTAATATTCTTCCACTTGCGATCCTTGCTACAGTATGAAA (서열 번호:24)
유도 RNA는 쥐 Rosa26 좌위에서 각 표적 부위를 표적으로 하도록 설계되었다. 서열은 표 11에서 도시되는데, 각각 길이에서 42개 뉴클레오티드이고, 그리고 5' 영역이 표 10에서 제공되지 않은 가닥 (즉, 표 10에서 도시된 가닥에 상보적인 가닥)에 상보적이다.
쥐 Rosa26 유도 RNA
RNA 5'-3' 서열 서열 번호:
rRosa26-crRNA-1 AGGGGGAAGGGAAUCUUCCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 25
rRosa26-crRNA-2 UCUGCAACUGGAGUCUUUCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 26
rRosa26-crRNA-3 AGGCGGGAGUCUUCUGGGCAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 27
crRNA가 화학적으로 합성되고 tracrRNA에 미리 어닐링되었다 (서열 번호:13; 실시예 2 참조). 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9 단백질을 인코딩하는 시험관내 전사된 mRNA (서열 번호. 9; 실시예 1 참조)는 수태된 쥐 배아의 전핵 내로 미량주사될 수 있다. crRNA에 의한 표적 세트로 유도 시에, Cas9 단백질은 표적 부위를 개열하고, 그리고 결과의 이중 가닥 절단이 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 수복 과정을 통해 수복될 수 있다. 주사된 배아는 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 또는 최대 4 일 동안 배양되고, 그 이후에 유전형자분석될 수 있거나, 또는 주사된 배아는 생존 출산 동물이 유전자형분석될 수 있도록 수용자 암컷 생쥐 내로 이식될 수 있다. 생존 출산 동물로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직은 표준 방법을 이용하여, Rosa 좌위에서 Cas9-유발 돌연변이의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 가령, 태아 또는 생존 출산 동물로부터 배아 또는 조직은 DNA 추출과 분석을 위해 수확될 수 있다. DNA는 표준 절차를 이용하여 단리될 수 있다. Rosa26 좌위의 표적화된 영역은 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 증폭될 수 있다. NHEJ가 오류 가능하기 때문에, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 최소한 하나의 뉴클레오티드의 치환, 또는 이들의 조합이 상기 절단의 수복 동안 일어날 수 있다. 돌연변이는 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, Cel-I 불일치 검정 및 DNA 염기서열결정을 이용하여 검출될 수 있다.
실시예 9: 쥐 배아에서 Cas9-기초된 유전체 변형
Rosa26 좌위는 상기 실시예 8에서 설명된 바와 같은 미리 어닐링된 crRNA / tracrRNA 및 변형된 Cas9를 인코딩하는 mRNA와 함께, 상기 섹션 (IV)(d)에서 상술된 바와 같이, 공여자 폴리뉴클레오티드를 공동 주사함으로써 쥐 배아에서 변형될 수 있다. 생존 출산 쥐로부터 시험관내-배양된 배아 또는 조직 (실시예 8에서 설명된 바와 같이)은 PCR-기초된 유전자형분석 방법, 예를 들면, RFLP 검정, 접합부 PCR, 그리고 DNA 염기서열결정을 이용하여, 변형된 Rosa26 좌위에 대해 스크리닝될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC CHEN, Fuqiang DAVIS, Gregory D. KANG, Qiaohua KNIGHT, Scott W. <120> CRISPR-BASED GENOME MODIFICATION AND REGULATION <130> 047497-465606 <150> US 61/734,256 <151> 2012-12-06 <150> US 61/758,624 <151> 2013-01-30 <150> US 61/761,046 <151> 2013-02-05 <150> US 61/794,422 <151> 2013-03-15 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 3 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 4 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val 20 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 5 Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Pro Lys 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cctttctagt ccccaattta tattgttcct ccgtgcgtca gttttacctg tgagataagg 2280 ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg tggtgaggag gggggtgtcc gtgtggaaaa 2340 ctccctttgt gagaatggtg cgtcctaggt gttcaccagg tcgtggccgc ctctactccc 2400 tttctctttc tccatccttc tttccttaaa gagtccccag tgctatctgg gacatattcc 2460 tccgcccaga gcagggtccc gcttccctaa ggccctgctc tgggcttctg ggtttgagtc 2520 cttggcaagc ccaggagagg cgctcaggct tccctgtccc ccttcctcgt ccaccatctc 2580 atgcccctgg ctctcctgcc ccttccctac aggggttcct ggctctgctc ttcagactga 2640 gccccgttcc cctgcatccc cgttcccctg catccccctt cccctgcatc ccccagaggc 2700 cccaggccac ctacttggcc tggaccccac gagaggccac cccagccctg tctaccaggc 2760 tgccttttgg gtggattctc ctccaactgt ggggtgactg cttggcaaac tcactcttcg 2820 gggtatccca ggaggcctgg agcattgggg tgggctgggg ttcagagagg agggattccc 2880 ttctcaggtt acgtggccaa gaagcagggg agctgggttt gggtcaggtc tgggtgtggg 2940 gtgaccagct tatgctgttt gcccaggaca gcctagtttt agcactgaaa ccctcagtcc 3000 taggaaaaca gggatggttg gtcactgtct ctgggtgact cttgattccc ggccagtttc 3060 tccacctggg gctgtgtttc tcgtcctgca tccttctcca ggcaggtccc caagcatcgc 3120 ccccctgctg tggctgttcc caagttctta gggtacccca cgtgggttta tcaaccactt 3180 ggtgaggctg gtaccctgcc cccattcctg caccccaatt gccttagtgg ctagggggtt 3240 gggggctaga gtaggagggg ctggagccag gattcttagg gctgaacaga gaagagctgg 3300 gggcctgggc tcctgggttt gagagaggag gggctggggc ctggactcct gggtccgagg 3360 gaggaggggc tggggcctgg actcctgggt ctgagggtgg agggactggg ggcctggact 3420 cctgggtccg agggaggagg ggctggggcc tggactcgtg ggtctgaggg aggaggggct 3480 gggggcctgg acttctgggt cttagggagg cggggctggg cctggacccc tgggtctgaa 3540 tggggagagg ctgggggcct ggactccttc atctgagggc ggaagggctg gggcctggcc 3600 tcctgggttg aatggggagg ggttgggcct ggactctgga gtccctggtg cccaggcctc 3660 aggcatcttt cacagggatg cctgtactgg gcaggtcctt gaaagggaaa ggcccattgc 3720 tctccttgcc cccctcccct atcgccatga caactgggtg gaaataaacg agccgagttc 3780 atcccgttcc cagggcacgt gcggcccctt cacagcccga gtttccatga cctcatgctc 3840 ttggccctcg tagctccctc ccgcctcctc cagatgggca gctttggaga ggtgagggac 3900 ttggggggta atttatcccg tggatctagg agtttagctt cactccttcc tcagctccag 3960 ttcaggtccc ggagcccacc cagtgtccac aaggcctggg gcaagtccct cctccgaccc 4020 cctggacttc ggcttttgtc cccccaagtt ttggacccct aagggaagaa tgagaaacgg 4080 tggcccgtgt cagcccctgg ctgcagggcc ccgtgcagag ggggcctcag tgaactggag 4140 tgtgacagcc tggggcccag gcacacaggt gtgcagctgt ctcacccctc tgggagtccc 4200 gcccaggccc ctgagtctgt cccagcacag ggtggccttc ctccaccctg catagccctg 4260 ggcccacggc ttcgttcctg cagagtatct gctggggtgg tttccgagct tgacccttgg 4320 aaggacctgg ctgggtttaa ggcaggaggg gctgggggcc aggactcctg gctctgaagg 4380 aggaggggct ggaacctctt ccctagtctg agcactggaa gcgccacctg tgggtggtga 4440 cgggggtttt gccgtgtcta acaggtacca tgtggggttc ccgcacccag atgagaagcc 4500 ccctcccttc cccgttcact tcctgtttgc agatagccag gagtcctttc gtggtttcca 4560 ctgagcactg aaggcctggc cggcctgacc actgggcaac caggcgtatc ttaaacagcc 4620 agtggccaga ggctgttggg tcattttccc cactgtccta gcaccgtgtc cctggatctg 4680 ttttcgtggc tccctctgga gtcccgactt gctgggacac cgtggctggg gtaggtgcgg 4740 ctgacggctg tttcccaccc ccag 4764 <210> 12 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 12 accccacagu ggggccacua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 13 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 13 ggaaccauuc aaaacagcau agcaaguuaa aauaaggcua guccguuauc aacuugaaaa 60 aguggcaccg agucggugcu uuuuuu 86 <210> 14 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 14 accccacagu ggggccacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cg 62 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 15 ctgacctctt ctcttcctcc cacag 25 <210> 16 <211> 1009 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 16 gccaccatgg actacaaaga cgatgacgac aaggtcgact ctagagctgc agagagcgac 60 gagagcggcc tgcccgccat ggagatcgag tgccgcatca ccggcaccct gaacggcgtg 120 gagttcgagc tggtgggcgg cggagagggc acccccgagc agggccgcat gaccaacaag 180 atgaagagca ccaaaggcgc cctgaccttc agcccctacc tgctgagcca cgtgatgggc 240 tacggcttct accacttcgg cacctacccc agcggctacg agaacccctt cctgcacgcc 300 atcaacaacg gcggctacac caacacccgc atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg 360 cacgtgagct tcagctaccg ctacgaggcc ggccgcgtga tcggcgactt caaggtgatg 420 ggcaccggct tccccgagga cagcgtgatc ttcaccgaca agatcgtccg cagcaacgcc 480 accgtggagc acctgcaccc catgggcgat aacgatctgg atggcagctt cacccgcacc 540 ttcagcctgc gcgacggcgg ctactacagc tccgtggtgg acagccacat gcacttcaag 600 agcgccatcc accccagcat cctgcagaac gggggcccca tgttcgcctt ccgccgcgtg 660 gaggaggatc acagcaacac cgagctgggc atcgtggagt accagcacgc cttcaagacc 720 ccggatgcag atgccggtga agaatgaaga tctctgtgcc ttctagttgc cagccatctg 780 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 840 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 900 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 960 atgcggtggg ctctatggac tcgaggttta aacgtcgacg cggccgcgt 1009 <210> 17 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 17 Met Ser Gly Glu Asp Gly Pro Ala Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Arg Glu Arg Arg Arg Glu Gln Leu Arg Gln Trp Gly Ala Arg 20 25 30 Ala Gly Ala Glu Pro Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ala Arg Thr Val Arg 35 40 45 Phe Glu Arg Ala Ala Glu Phe Leu Ala Ala Cys Ala Gly Gly Asp Leu 50 55 60 Asp Glu Ala Arg Leu Met Leu Arg Ala Ala Asp Pro Gly Pro Gly Ala 65 70 75 80 Glu Leu Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Arg Ala Val Leu Asp Ser 85 90 95 Thr Asn Ala Asp Gly Ile Ser Ala Leu His Gln Ala Thr Met Asp Tyr 100 105 110 Lys Asp Asp Asp Asp Lys Val Asp Ser Arg Ala Ala Glu Ser Asp Glu 115 120 125 Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly Thr Leu 130 135 140 Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr Pro Glu 145 150 155 160 Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Thr 165 170 175 Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His 180 185 190 Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His Ala Ile 195 200 205 Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Thr Arg Ile Glu Lys Tyr Glu Asp Gly 210 215 220 Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Arg Val 225 230 235 240 Ile Gly Asp Phe Lys Val Met Gly Thr Gly Phe Pro Glu Asp Ser Val 245 250 255 Ile Phe Thr Asp Lys Ile Val Arg Ser Asn Ala Thr Val Glu His Leu 260 265 270 His Pro Met Gly Asp Asn Asp Leu Asp Gly Ser Phe Thr Arg Thr Phe 275 280 285 Ser Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Val Val Asp Ser His Met 290 295 300 His Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile Leu Gln Asn Gly Gly Pro 305 310 315 320 Met Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Asp His Ser Asn Thr Glu Leu 325 330 335 Gly Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr Pro Asp Ala Asp Ala 340 345 350 Gly Glu Glu 355 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 18 ccactctgtg ctgaccactc t 21 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 19 gcggcactcg atctcca 17 <210> 20 <211> 711 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 gagcggctgc ggggcgggtg caagcacgtt tccgacttga gttgcctcaa gaggggcgtg 60 ctgagccaga cctccatcgc gcactccggg gagtggaggg aaggagcgag ggctcagttg 120 ggctgttttg gaggcaggaa gcacttgctc tcccaaagtc gctctgagtt gttatcagta 180 agggagctgc agtggagtag gcggggagaa ggccgcaccc ttctccggag gggggagggg 240 agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct gctgcctcct ggcttctgag gaccgccctg 300 ggcctgggag aatcccttcc ccctcttccc tcgtgatctg caactccagt ctttctagaa 360 gatgggcggg agtcttctgg gcaggcttaa aggctaacct ggtgtgtggg cgttgtcctg 420 caggggaatt gaacaggtgt aaaattggag ggacaagact tcccacagat tttcggtttt 480 gtcgggaagt tttttaatag gggcaaataa ggaaaatggg aggataggta gtcatctggg 540 gttttatgca gcaaaactac aggttattat tgcttgtgat ccgcctcgga gtattttcca 600 tcgaggtaga ttaaagacat gctcacccga gttttatact ctcctgcttg agatccttac 660 tacagtatga aattacagtg tcgcgagtta gactatgtaa gcagaatttt a 711 <210> 21 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 21 cuccagucuu ucuagaagau guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 22 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 22 ugaacaggug uaaaauugga guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 23 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 23 ugucgggaag uuuuuuaaua guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 24 <211> 642 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 24 gggattcctc cttgagttgt ggcactgagg aacgtgctga acaagaccta cattgcactc 60 cagggagtgg atgaaggagt tggggctcag tcgggttgta ttggagacaa gaagcacttg 120 ctctccaaaa gtcggtttga gttatcatta agggagctgc agtggagtag gcggagaaaa 180 ggccgcaccc ttctcaggac gggggagggg agtgttgcaa tacctttctg ggagttctct 240 gctgcctcct gtcttctgag gaccgccctg ggcctggaag attcccttcc cccttcttcc 300 ctcgtgatct gcaactggag tctttctgga agataggcgg gagtcttctg ggcaggctta 360 aaggctaacc tggtgcgtgg ggcgttgtcc tgcagaggaa ttgaacaggt gtaaaattgg 420 aggggcaaga cttcccacag attttcgatt gtgttgttaa gtattgtaat aggggcaaat 480 aagggaaata gactaggcac tcacctgggg ttttatgcag caaaactaca ggttattatt 540 gcttgtgatc cgccctggag aatttttcac cgaggtagat tgaagacatg cccacccaaa 600 ttttaatatt cttccacttg cgatccttgc tacagtatga aa 642 <210> 25 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 25 agggggaagg gaaucuucca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 26 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 26 ucugcaacug gagucuuucu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 27 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 27 aggcgggagu cuucugggca guuuuagagc uaugcuguuu ug 42

Claims (25)

  1. 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템을 포함하는 조성물, 여기서 각 RNA-유도된 틈내기효소 시스템은
    (i) RNA-유도된 엔도뉴클레아제, 상기 엔도뉴클레아제는 군집된 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)/CRISPR 연관된 (Cas) (CRISPR/Cas) 유형 II 시스템 단백질이고, 그리고 상기 CRISPR/Cas 유형 II 시스템 단백질은 Cas9 단백질이고, 여기서 상기 RNA 유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하고, 그리고 이중 가닥 서열의 한쪽 가닥을 개열할 수 있도록 하는 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 갖도록 변형되고, 그리고
    (ii) 이중 가닥 서열의 한쪽 가닥 내에 표적 부위에 상보성을 갖는 첫 번째 영역 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하는 두 번째 영역을 포함하는 유도 RNA를 포함하고,
    여기서 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 표적 부위는 이중 가닥 서열의 마주보는 가닥 내에 있고, 각 표적 부위는 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)가 직후에 이어지고, 그리고 이들 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 서열의 마주보는 가닥을 독립적으로 개열함으로써 이중 가닥 절단을 함께 도입할 수 있음.
  2. 청구항 1에 있어서, 각 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 Cas9 단백질은 RuvC 또는 HNH 도메인 내에 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 세포-투과성 도메인 또는 마커 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 각 유도 RNA는 최소한 부분적으로 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항의 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 각 유도 RNA를 인코딩하는 복수의 핵산.
  6. 청구항 5에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA이고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 DNA인 것을 특징으로 하는 복수의 핵산.
  7. 청구항 5에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA이고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 DNA인 것을 특징으로 하는 복수의 핵산.
  8. 청구항 5에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 복수의 핵산.
  9. 청구항 5의 복수의 핵산을 포함하는 최소한 하나의 벡터, 여기서 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결되고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위한 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결됨.
  10. 청구항 9에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 진핵 세포에서 염색체 서열을 변형하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템 또는 이들 시스템을 인코딩하는 핵산, 그리고 임의선택적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 진핵 세포 내로 도입하는 단계, 여기서 각 RNA-유도된 틈내기효소 시스템은
    (i) RNA-유도된 엔도뉴클레아제, 상기 엔도뉴클레아제는 군집된 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부 (CRISPR)/CRISPR 연관된 (Cas) (CRISPR/Cas) 유형 II 시스템 단백질이고, 그리고 상기 CRISPR/Cas 유형 II 시스템 단백질은 Cas9 단백질이고, 여기서 상기 RNA 유도된 엔도뉴클레아제는 최소한 하나의 핵 국지화 신호를 포함하고, 그리고 이중 가닥 서열의 한쪽 가닥을 개열할 수 있도록 하는 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 갖도록 변형되고, 그리고
    (ii) 염색체 서열의 한쪽 가닥 내에 표적 부위에 상보성을 갖는 첫 번째 영역 및 RNA-유도된 엔도뉴클레아제와 상호작용하는 두 번째 영역을 포함하는 유도 RNA를 포함하고,
    여기서 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 표적 부위는 염색체 서열의 마주보는 가닥 내에 있고, 그리고 각 표적 부위는 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)가 직후에 이어지고; 그리고
    b) 2개의 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 RNA-유도된 엔도뉴클레아제가 염색체 서열의 마주보는 가닥을 독립적으로 개열함으로써 이중 가닥 절단을 함께 도입하도록, 상기 진핵 세포를 배양하는 단계, 여기서 DNA 수복 과정에 의한 이중 가닥 절단의 수복은 염색체 서열의 변형을 야기함.
  12. 청구항 11에 있어서, 각 RNA-유도된 틈내기효소 시스템의 Cas9 단백질은 RuvC 또는 HNH 도메인 내에 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제는 세포-투과성 도메인 또는 마커 도메인에서 선택되는 최소한 하나의 추가 도메인을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 각 유도 RNA는 최소한 부분적으로 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드는 염색체 서열에서 표적 부위에 인접한 염색체 서열에 비하여 최소한 하나의 뉴클레오티드 변화를 갖는 공여자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드는 외인성 서열에 상응하는 공여자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 15 또는 16에 있어서, 공여자 서열은 염색체 서열 내에 표적 부위의 어느 한쪽에서 서열에 실제적인 서열 동일성을 갖는 서열과 측면에서 접하거나, 또는 공여자 서열은 RNA-유도된 엔도뉴클레아제에 의해 산출된 오버행과 양립하는 짧은 오버행과 측면에서 접하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 mRNA이고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA이고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 및 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 벡터의 일부이고, 여기서 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결되고, 그리고 각 유도 RNA를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위해 프로모터 제어 서열에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 18 내지 20 중에서 어느 한 항에 있어서, 각 RNA-유도된 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 진핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 11에 있어서, 진핵 세포는 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 비포유류 척추동물 세포, 무척추동물 세포, 식물 세포, 또는 단일 세포 진핵 생물체인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 11에 있어서, 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포 내로 도입되지 않고, 그리고 비상동성 말단 연결 수복 과정에 의한 이중 가닥 절단의 수복은 염색체 서열의 비활성화를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 11에 있어서, 임의선택적 공여자 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포 내로 도입되고, 그리고 이중 가닥 절단의 수복은 염색체 서열에서 최소한 하나의 뉴클레오티드의 변화를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 변화는 최소한 하나의 외인성 서열의 통합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR1020197022305A KR102145760B1 (ko) 2012-12-06 2013-12-05 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절

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WO (1) WO2014089290A1 (ko)

Families Citing this family (355)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008027558A2 (en) 2006-08-31 2008-03-06 Codon Devices, Inc. Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
CA3132011A1 (en) 2010-11-12 2012-06-14 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acids synthesis
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
JP2014526899A (ja) 2011-08-26 2014-10-09 ジェン９・インコーポレイテッド 核酸の高忠実度アセンブリのための組成物および方法
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
US10081807B2 (en) 2012-04-24 2018-09-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
SG10201702445TA (en) 2012-04-25 2017-04-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2023-10-31 Univ California Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
WO2014004393A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing
ES2757623T3 (es) 2012-07-25 2020-04-29 Broad Inst Inc Proteínas de unión a ADN inducibles y herramientas de perturbación genómica y aplicaciones de las mismas
JP6517143B2 (ja) 2012-10-23 2019-05-22 ツールゲン インコーポレイテッド 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用
BR112015010911A2 (pt) 2012-11-16 2022-10-25 Transposagen Biopharmaceuticals Inc Enzimas específicas de sítio e métodos de uso
KR102006880B1 (ko) 2012-12-06 2019-08-02 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PT2896697E (pt) * 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
IL239317B (en) * 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
EP4286402A3 (en) * 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
WO2014093718A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
SG11201504621RA (en) * 2012-12-17 2015-07-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US10119133B2 (en) * 2013-03-15 2018-11-06 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
RS58255B1 (sr) 2013-04-16 2019-03-29 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
WO2014172470A2 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
EP2997146A4 (en) 2013-05-15 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
DK3004349T3 (en) * 2013-05-29 2018-06-06 Cellectis Sa A method for producing precise DNA cleavage using CAS9 nickase activity
WO2014197568A2 (en) * 2013-06-04 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Rna-guideded transcriptional regulation
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
AU2014274840B2 (en) * 2013-06-05 2020-03-12 Duke University RNA-guided gene editing and gene regulation
AU2014279694B2 (en) 2013-06-14 2020-07-23 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
RU2716420C2 (ru) * 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
AU2014281027A1 (en) * 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG10201710487VA (en) * 2013-06-17 2018-01-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Targeting Disorders and Diseases Using Viral Components
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
EP3011032B1 (en) * 2013-06-17 2019-10-16 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
US11306328B2 (en) * 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
CN105916989A (zh) 2013-08-22 2016-08-31 纳幕尔杜邦公司 大豆u6聚合酶iii启动子及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
EP3418379B1 (en) * 2013-09-18 2020-12-09 Kymab Limited Methods, cells & organisms
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
EP4349980A2 (en) 2013-12-11 2024-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
AU2014361834B2 (en) 2013-12-12 2020-10-22 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
SG10201804976YA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Genome Editing
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
AU2014362248A1 (en) 2013-12-12 2016-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders
US10787654B2 (en) * 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
KR102496984B1 (ko) 2014-02-11 2023-02-06 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코퍼레이트 Crispr 이용의 다중화된 게놈 조작
WO2015126927A2 (en) 2014-02-18 2015-08-27 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US9938521B2 (en) 2014-03-10 2018-04-10 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
AU2015236128A1 (en) * 2014-03-25 2016-11-10 Editas Medicine Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
WO2015188056A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
RU2704283C9 (ru) 2014-06-06 2020-02-07 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модификации целевого локуса
CN106852157B (zh) * 2014-06-16 2022-04-12 约翰斯·霍普金斯大学 用于使用h1启动子表达crispr向导rna的组合物和方法
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
BR112016030145A8 (pt) 2014-06-23 2018-12-11 Regeneron Pharma métodos para a montagem de ao menos dois ácidos nucleicos e de dois ou mais ácidos nucleicos
ES2694629T3 (es) 2014-06-26 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso
US20170198268A1 (en) * 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
WO2016011080A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
KR101817482B1 (ko) 2014-08-06 2018-02-22 주식회사 툴젠 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
EP3186375A4 (en) 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University NEW CAS9 PROTEINS AND GUIDING ELEMENTS FOR DNA TARGETING AND THE GENOME EDITION
WO2016036754A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
CA2956487A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
EP3998344A1 (en) * 2014-10-09 2022-05-18 Life Technologies Corporation Crispr oligonucleotides and gene editing
WO2016057850A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children' S Hospital (Dba Seattle Children' S Research Institute) Long poly (a) plasmids and methods for introduction of long poly (a) sequences into the plasmid
ES2741387T3 (es) 2014-10-15 2020-02-10 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para generar o mantener células pluripotentes
WO2016065364A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for enhancing homologous recombination
US20190100769A1 (en) * 2014-10-31 2019-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
CA2966731C (en) * 2014-11-06 2023-01-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Peptide-mediated delivery of rna-guided endonuclease into cells
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
US20170369848A1 (en) * 2014-11-11 2017-12-28 Q Therapeutics, Inc. Engineering mesenchymal stem cells using homologous recombination
JP2017534294A (ja) * 2014-11-19 2017-11-24 インスティチュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ 二つのベクターから発現されたｃａｓ９タンパク質を利用した遺伝子発現調節方法
PT3221457T (pt) 2014-11-21 2019-06-27 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificação genética visada através da utilização de arn guia emparelhados
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089433A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
US9888673B2 (en) 2014-12-10 2018-02-13 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
KR102530821B1 (ko) 2014-12-19 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 단계 다중 표적화를 통한 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
WO2016120480A1 (fr) 2015-01-29 2016-08-04 Meiogenix Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees
CN107787367B (zh) 2015-04-06 2021-10-26 里兰斯坦福初级大学理事会 用于crispr/cas介导的基因调控的化学修饰的引导rna
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
WO2016178207A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods and kits for fragmenting dna
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
JP2018516563A (ja) 2015-05-29 2018-06-28 ノース カロライナ ステート ユニバーシティＮｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｒｉｓｐｒ核酸を用いて、細菌、古細菌、藻類、および、酵母をスクリーニングする方法
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
CN116334142A (zh) 2015-06-09 2023-06-27 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
CA2983874C (en) 2015-06-15 2022-06-21 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
EP3310909B1 (en) * 2015-06-17 2021-06-09 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
KR102575342B1 (ko) 2015-06-18 2023-09-05 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적외 효과를 감소시키는 crispr 효소 돌연변이
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US20160376610A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Sigma-Aldrich Co. Llc Cell cycle dependent genome regulation and modification
IL295616A (en) 2015-07-31 2022-10-01 Us Health Adapted cells and treatment methods
EP3334746B1 (en) 2015-08-14 2021-11-24 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
IL288662B2 (en) 2015-08-25 2023-09-01 Univ Duke Preparations and methods for improving specificity in genomic engineering using RNA-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN108350449B (zh) 2015-08-28 2022-05-31 通用医疗公司 工程化的CRISPR-Cas9核酸酶
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CA2999500A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
EP3356533A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
EP3365997B1 (en) 2015-10-22 2021-03-24 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Methods and apparatus relating to selective enhancement of radio signals
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
CA3004285A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US11905521B2 (en) 2015-11-17 2024-02-20 The Chinese University Of Hong Kong Methods and systems for targeted gene manipulation
US10240145B2 (en) * 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
EA201891619A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы регулирования экспрессии генов
EA201891614A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы иммунотерапии
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CA3020181A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Boco Silicon Valley, Inc. Genome editing of human neural stem cells using nucleases
WO2017189525A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
EP3448995A1 (en) * 2016-04-25 2019-03-06 Universität Basel Allele editing and applications thereof
NZ747857A (en) 2016-05-20 2023-01-27 Regeneron Pharma Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
KR20220147710A (ko) * 2016-06-02 2022-11-03 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 사용한, 표적화된 게놈 변형의 개선
BR112018074930A2 (pt) * 2016-06-03 2019-03-12 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, partícula de entrega, composição farmacêutica, célula hospedeira, método para edição do genoma e método e kit para prevenção e/ou tratamento de uma doença
CA3026332A1 (en) * 2016-06-03 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Negative feedback regulation of hiv-1 by gene editing strategy
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10337051B2 (en) 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
CA3029254A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for generating barcoded combinatorial libraries
WO2018013720A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 Washington University Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells
DK3491014T3 (da) 2016-07-28 2023-05-30 Regeneron Pharma Allel-specifik primer eller sonde, som er hybridiseret til et nucleinsyremolekyle, som koder for en GPR156 variant
AU2017302657A1 (en) 2016-07-29 2019-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice comprising mutations resulting in expression of c-truncated fibrillin-1
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US20190185850A1 (en) * 2016-08-20 2019-06-20 Avellino Lab Usa, Inc. Single guide rna/crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
US20180105806A1 (en) * 2016-09-07 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly
CN106636197B (zh) * 2016-09-22 2019-09-03 南京市妇幼保健院 一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
GB2569733B (en) 2016-09-30 2022-09-14 Univ California RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
US20190233820A1 (en) * 2016-10-11 2019-08-01 Stemgenics, Inc. Nanoparticles functionalized with gene editing tools and related methods
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2605883B (en) 2016-10-18 2023-03-15 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
KR20240043810A (ko) * 2016-11-02 2024-04-03 유니버시타트 바셀 세포 치료에 사용하기 위한 면역학적으로 식별 가능한 세포 표면 변이체
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
KR102151065B1 (ko) * 2016-12-23 2020-09-02 기초과학연구원 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
EP3571321A1 (en) 2017-01-23 2019-11-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 13 (hsd17b13) variants and uses thereof
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
CN106978438B (zh) * 2017-02-27 2020-08-28 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
US11834670B2 (en) 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
AU2018254619B2 (en) 2017-04-21 2022-07-21 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (CAS12a) with altered PAM specificity
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11326157B2 (en) 2017-05-25 2022-05-10 The General Hospital Corporation Base editors with improved precision and specificity
EP3635102A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. B4galt1 variants and uses thereof
US10428319B2 (en) 2017-06-09 2019-10-01 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US11696572B2 (en) 2017-06-27 2023-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus
ES2913457T3 (es) 2017-06-30 2022-06-02 Inscripta Inc Métodos, módulos, instrumentos y sistemas de procesamiento celular automatizados
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
CA3068072A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
CN110891419A (zh) 2017-07-31 2020-03-17 瑞泽恩制药公司 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组
CA3066798A1 (en) * 2017-07-31 2019-02-07 Sigma Aldrich Co. Llc Synthetic guide rna for crispr/cas activator systems
IL310452A (en) * 2017-08-09 2024-03-01 Ricetec Inc Preparations and methods for genome modification
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019050948A1 (en) * 2017-09-05 2019-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADMINISTRATION OF A GENE EDITION SYSTEM HAVING ONLY ONE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATING AND USING
IL272940B1 (en) 2017-09-06 2024-02-01 Regeneron Pharma Variants linked to the interleukin-1 immunoglobulin-single receptor and their uses
SG11202001792UA (en) 2017-09-07 2020-03-30 Regeneron Pharma Solute carrier family 14 member 1 (slc14a1) variants and uses thereof
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
CN111372650A (zh) 2017-09-30 2020-07-03 因思科瑞普特公司 流通式电穿孔仪器
JP2021501601A (ja) 2017-10-16 2021-01-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． コルヌリン（ｃｒｎｎ）バリアント及びその使用
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
US11634716B2 (en) 2017-10-16 2023-04-25 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Genetically modified mesenchymal stem cells for use in cardiovascular prosthetics
SG11202003798TA (en) 2017-10-27 2020-05-28 Univ California Targeted replacement of endogenous t cell receptors
EP3585163B1 (en) 2017-11-10 2022-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising slc30a8 mutation and methods of use
JP7423520B2 (ja) * 2017-11-16 2024-01-29 アストラゼネカ・アクチエボラーグ Ｃａｓ９ベースノックイン方針の効力を改善するための組成物及び方法
AU2018375796A1 (en) 2017-11-30 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TRKB locus
WO2019126578A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2018389594B2 (en) * 2017-12-22 2021-03-04 G+Flas Life Sciences Chimeric genome engineering molecules and methods
WO2019138083A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
EP3743516A4 (en) * 2018-01-26 2021-10-13 The Children's Medical Center Corporation TARGETING OF DISTAL BCL11A REGULATORY ELEMENTS WITH A CAS9-CAS9 FUSION TO REDUCE FETAL HEMOGLOBIN
KR20230022258A (ko) 2018-02-15 2023-02-14 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 진핵 게놈 변형을 위한 조작된 cas9 시스템
KR20240038811A (ko) 2018-03-19 2024-03-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
AU2019255789A1 (en) 2018-04-19 2020-10-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene editing
US10501738B2 (en) 2018-04-24 2019-12-10 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
JP2021521850A (ja) * 2018-04-27 2021-08-30 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群のゲノム編集治療
CN112105732A (zh) * 2018-05-10 2020-12-18 先正达参股股份有限公司 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物
EP3790974A1 (en) 2018-05-10 2021-03-17 Auxolytic Ltd Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells
GB2589246A (en) 2018-05-16 2021-05-26 Synthego Corp Methods and systems for guide RNA design and use
CN108624622A (zh) * 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
EP3575402A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-04 Algentech SAS Gene targeting
CN112424365A (zh) 2018-06-07 2021-02-26 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 核酸构建体及其使用方法
CN112384063A (zh) 2018-06-07 2021-02-19 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 再生及转殖大麻的方法
US20210230664A1 (en) * 2018-06-25 2021-07-29 Bionano Genomics, Inc. Labeling of dna
EP4070802A1 (en) 2018-06-30 2022-10-12 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
KR20210041008A (ko) * 2018-08-03 2021-04-14 빔 테라퓨틱스, 인크. 핵산 표적 서열을 변형시키기 위한 다중-이펙터 핵염기 편집기 및 이를 이용하는 방법
GB201813011D0 (en) 2018-08-10 2018-09-26 Vib Vzw Means and methods for drought tolerance in crops
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
KR102103104B1 (ko) 2018-08-16 2020-04-22 (주)라트바이오 유전자 편집된 형질전환 동물 및 형질전환 배아
JP2021533797A (ja) * 2018-08-21 2021-12-09 シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーSigma−Aldrich Co. LLC 細胞質ｄｎａセンサー経路の下方制御
CN109055379B (zh) * 2018-09-10 2022-04-15 石铭 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法
KR102121817B1 (ko) * 2018-09-12 2020-06-26 한국화학연구원 Crispr 편집 기술을 이용한 재조합 항원을 발현시키는 벡터 및 이를 동시에 다중 삽입시키는 방법
KR102545031B1 (ko) 2018-09-13 2023-06-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C3 사구체병증 모델로서의 보체 인자 h 유전자 녹아웃 래트
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
CA3116553A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Blueallele, Llc Methods for targeted insertion of dna in genes
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
CN113227368B (zh) 2018-10-22 2023-07-07 因思科瑞普特公司 工程化酶
US20220380740A1 (en) * 2018-10-24 2022-12-01 The Broad Institute, Inc. Constructs for improved hdr-dependent genomic editing
KR20200071198A (ko) 2018-12-10 2020-06-19 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법
AU2019398351A1 (en) 2018-12-14 2021-06-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel CRISPR-Cas systems for genome editing
WO2020128478A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 King's College London Immunotherapeutic methods and compositions
JP7449291B2 (ja) 2018-12-20 2024-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介リピート伸長
CN113543797A (zh) * 2019-01-04 2021-10-22 芝加哥大学 用于调节rna的系统和方法
WO2020146899A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Targeted in vivo genome modification
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
CN113728097A (zh) * 2019-02-14 2021-11-30 宏基因组学知识产权技术有限责任公司 具有ruvc结构域的酶
JP2022520104A (ja) 2019-02-15 2022-03-28 シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ融合タンパク質およびシステム
GB201902277D0 (en) 2019-02-19 2019-04-03 King S College London Therapeutic agents
AU2020231380A1 (en) * 2019-03-07 2021-09-23 The Regents Of The University Of California CRISPR-Cas effector polypeptides and methods of use thereof
IL286359B1 (en) 2019-03-18 2024-02-01 Regeneron Pharma A CRISPR/CAS knock-out screening platform for uncovering genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
EP4317950A3 (en) 2019-03-18 2024-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
WO2020191239A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
BR112021019512A2 (pt) 2019-04-03 2022-02-15 Regeneron Pharma Métodos para inserir uma sequência de codificação de proteína de ligação ao antígeno e para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença em um animal, animal, célula, genoma, ácido nucleico doador exógeno, gene de porto seguro, e, agente de nuclease ou um ou mais ácidos nucleicos
US11737435B2 (en) 2019-04-04 2023-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
WO2020206134A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
GB201905360D0 (en) 2019-04-16 2019-05-29 Univ Nottingham Fungal strains, production and uses thereof
WO2020229241A1 (en) 2019-05-10 2020-11-19 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
WO2020247587A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CA3137765A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
CN114008070A (zh) 2019-06-21 2022-02-01 因思科瑞普特公司 导致大肠杆菌赖氨酸产量增加的全基因组合理设计的突变
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
WO2021050398A1 (en) * 2019-09-10 2021-03-18 The Regents Of The University Of California Synthetic lethality screening platform for cells undergoing alt
CN114729382A (zh) 2019-09-12 2022-07-08 巴斯夫欧洲公司 增强植物中基因表达的调节性核酸分子
US20210079394A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CN110628825A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 上海捷易生物科技有限公司 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法
EP4054651A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
CN114787365A (zh) 2019-12-03 2022-07-22 巴斯夫欧洲公司 用于在植物中增强基因表达的调节性核酸分子
US10883095B1 (en) 2019-12-10 2021-01-05 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
IL292895A (en) 2019-12-18 2022-07-01 Inscripta Inc Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-directed nuclease-edited cells
CN115243711A (zh) * 2020-01-09 2022-10-25 先锋国际良种公司 两步基因交换
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
US11225674B2 (en) 2020-01-27 2022-01-18 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
CA3169272A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
EP4099821A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use
CN115485385A (zh) 2020-03-04 2022-12-16 瑞泽恩制药公司 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
CA3177051A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 Metagenomi, Inc. Class ii, type ii crispr systems
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US20230232796A1 (en) 2020-06-26 2023-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
CN111849986A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240058390A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-22 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Wnt+ adipocytes, exosomes from wnt+ adipocytes, and methods of making and using them
AU2021415461A1 (en) 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
GB202103131D0 (en) 2021-03-05 2021-04-21 Biosystems Tech Limited Method for preparation of research organisms
EP4337769A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 SQZ Biotechnologies Company Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof
WO2022251644A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof
US20230052243A1 (en) 2021-06-02 2023-02-16 Lyell Immunopharma, Inc. Nr4a-deficient cells expressing c-jun and uses thereof
CA3230927A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023064924A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Codiak Biosciences, Inc. Modified producer cells for extracellular vesicle production
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
AU2022381205A1 (en) 2021-11-04 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023122506A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023129974A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Generation of landing pad cell lines
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023225665A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023250384A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 The Regents Of The University Of California Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024031053A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aggregation-resistant variants of tdp-43
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH119249A (ja) * 1997-05-30 1999-01-19 Natl Exploit Ind De Tabacs & Allumettes:Soc 高タール含有量の従来のシガレットの風味と匹敵するタバコの風味を備えた低タール含有量のシガレット
US20110217739A1 (en) * 2008-11-06 2011-09-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2013142578A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX

Family Cites Families (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
WO1988008450A1 (en) 1987-05-01 1988-11-03 Birdwell Finlayson Gene therapy for metabolite disorders
US5350689A (en) 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5767367A (en) 1990-06-23 1998-06-16 Hoechst Aktiengesellschaft Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
JP2002535995A (ja) 1999-02-03 2002-10-29 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレイション 染色体標的部位での二本鎖ｄｎａ切断の誘導を含む遺伝子修復
US8183339B1 (en) * 1999-10-12 2012-05-22 Xigen S.A. Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
US20020119570A1 (en) 2000-09-25 2002-08-29 Kyonggeun Yoon Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides
AU2002214127B2 (en) 2000-10-27 2007-06-07 J. Craig Venter Institute, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A and B
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
CA2453183C (en) 2001-07-12 2016-05-10 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
CN100575485C (zh) 2002-01-23 2009-12-30 犹他大学研究基金会 使用锌指核酸酶的定向染色体诱变
CA2479858A1 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
WO2003087993A2 (en) 2002-04-09 2003-10-23 Beattie Kenneth L Oligonucleotide probes for genosensor chips
WO2003104451A2 (en) * 2002-06-06 2003-12-18 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Modifying dna recombination and repair
EP2806025B1 (en) 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
DE10260805A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
EP2927318B1 (en) 2003-08-08 2020-05-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
DE602005027747D1 (de) * 2004-12-22 2011-06-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc Zum gen-silencing geeignete konservierte hbv- und hcv-sequenzen
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
US7534819B2 (en) 2005-06-10 2009-05-19 University Of Washington Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo
US20060282289A1 (en) 2005-06-14 2006-12-14 Healthmatch Solutions, Llc System and method for health care financing
US20100055793A1 (en) * 2005-07-25 2010-03-04 Johns Hopkins University Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases
CA2615532C (en) 2005-07-26 2016-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
EP2325332B1 (en) 2005-08-26 2012-10-31 DuPont Nutrition Biosciences ApS Use of CRISPR associated genes (CAS)
KR100877824B1 (ko) * 2005-11-11 2009-01-12 한국생명공학연구원 Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도
EP2522749A1 (en) * 2006-03-02 2012-11-14 The Ohio State University MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
EP1994182B1 (en) 2006-03-15 2019-05-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
SG170784A1 (en) * 2006-03-28 2011-05-30 Novartis Ag Covalently-linked complexes of hiv tat and env proteins
EP2016183B1 (en) 2006-05-10 2011-06-15 Deinove Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system
ATE530669T1 (de) 2006-05-19 2011-11-15 Danisco Markierte mikroorganismen und entsprechende markierungsverfahren
AU2007267874B2 (en) 2006-05-25 2012-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
PL2034848T3 (pl) 2006-06-16 2017-08-31 Dupont Nutrition Bioscences Aps Bakteria Streptococcus thermophilus
EP2518155B1 (en) * 2006-08-04 2014-07-23 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
NZ592231A (en) 2007-03-02 2012-07-27 Danisco Methods to generate bacteriophage resistant bacterial strains and produce bacteriophage CRISPR loci phage mutants
GB0806086D0 (en) 2008-04-04 2008-05-14 Ulive Entpr Ltd Dendrimer polymer hybrids
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
JP5908725B2 (ja) 2008-08-22 2016-04-26 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的一本鎖開裂および標的組込みのための方法、並びに組成物
WO2010030963A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
DK2362915T3 (en) 2008-11-07 2017-03-27 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR SEQUENCES OF BIFIDOBACTERIA
US8771766B2 (en) 2008-12-12 2014-07-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Genetic cluster of strains of Streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB0823658D0 (en) 2008-12-30 2009-02-04 Angiomed Ag Stent delivery device
US8392349B2 (en) 2009-02-23 2013-03-05 Shalini Vajjhala Global adaptation atlas and method of creating same
WO2010117464A1 (en) 2009-04-09 2010-10-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into stem cells
SI2424571T1 (sl) 2009-04-30 2020-10-30 Ospedale San Raffaele S.R.L. Genski vektor
US20120192298A1 (en) * 2009-07-24 2012-07-26 Sigma Aldrich Co. Llc Method for genome editing
KR20120097483A (ko) 2009-07-24 2012-09-04 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 게놈 편집을 위한 방법
EP2727600B1 (en) 2009-07-28 2019-03-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Zinc finger fusion proteins for repressing a huntington gene
KR101418355B1 (ko) 2009-10-23 2014-07-11 (주)바이오니아 고밀도 유전자 합성기
DE102009052674B4 (de) 2009-11-12 2012-10-18 Karl Weinhold Verfahren und Vorrichtung zum Verbinden von Doppelmantelrohren
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
PL2816112T3 (pl) 2009-12-10 2019-03-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA za pośrednictwem efektorów TAL
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
KR101867359B1 (ko) 2010-05-10 2018-07-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 엔도리보뉴클레아제 조성물들 및 이들의 사용 방법들
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
EP2392208B1 (en) * 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
US20140148361A1 (en) 2010-06-07 2014-05-29 Barry L. Stoddard Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof
CA2802360A1 (en) 2010-06-14 2011-12-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
EP3489359A1 (en) * 2010-07-23 2019-05-29 Sigma Aldrich Co. LLC Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids
US9081737B2 (en) 2010-08-02 2015-07-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes
CN103261213A (zh) 2010-10-20 2013-08-21 杜邦营养生物科学有限公司 乳球菌CRISPR-Cas序列
EP2643343A1 (en) * 2010-11-26 2013-10-02 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications.
US20120214241A1 (en) 2010-12-22 2012-08-23 Josee Laganiere Zinc finger nuclease modification of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2) mutant fibroblasts and ipscs
KR20120096395A (ko) 2011-02-22 2012-08-30 주식회사 툴젠 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
US9394545B2 (en) 2011-09-21 2016-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
CA2854819C (en) * 2011-11-16 2022-07-19 Sangamo Biosciences, Inc. Modified dna-binding proteins and uses thereof
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
BR112014020625A2 (pt) 2012-02-24 2017-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res polinucleotídeo, polipeptídeo, composição, célula e célula tronco editada por genoma
US8841260B2 (en) 2012-02-29 2014-09-23 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating Huntington's Disease
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
BR112014026203A2 (pt) 2012-04-23 2017-07-18 Bayer Cropscience Nv engenharia do genoma direcionado nas plantas
SG10201702445TA (en) 2012-04-25 2017-04-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
CA2872124C (en) 2012-05-02 2022-05-03 Dow Agrosciences Llc Plant with targeted modification of the endogenous malate dehydrogenase gene
CA2871524C (en) 2012-05-07 2021-07-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
WO2013169398A2 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Georgia Tech Research Corporation Systems and methods for improving nuclease specificity and activity
RS64622B1 (sr) * 2012-05-25 2023-10-31 Univ California Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
US20150376645A1 (en) 2012-05-30 2015-12-31 Baylor College Of Medicine Supercoiled minivectors as a tool for dna repair, alteration and replacement
WO2013188037A2 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Agilent Technologies, Inc Method of adaptor-dimer subtraction using a crispr cas6 protein
MX2014015204A (es) 2012-06-12 2015-08-07 Genentech Inc Metodos y composiciones para generar alelos con inactivacion condicional.
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
JP6329537B2 (ja) 2012-07-11 2018-05-23 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 生物学的薬剤の送達のための方法および組成物
AU2013289206B2 (en) 2012-07-11 2018-08-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
ES2757623T3 (es) 2012-07-25 2020-04-29 Broad Inst Inc Proteínas de unión a ADN inducibles y herramientas de perturbación genómica y aplicaciones de las mismas
WO2014022702A2 (en) 2012-08-03 2014-02-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
RS60838B1 (sr) 2012-08-29 2020-10-30 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja
AU2013312538B2 (en) 2012-09-07 2019-01-24 Corteva Agriscience Llc FAD3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
US20150267176A1 (en) 2012-10-12 2015-09-24 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
JP6517143B2 (ja) * 2012-10-23 2019-05-22 ツールゲン インコーポレイテッド 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用
JP2015533284A (ja) 2012-10-30 2015-11-24 リコンビネティクス・インコーポレイテッドＲｅｃｏｍｂｉｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 動物における性成熟の制御
US20150291967A1 (en) 2012-10-31 2015-10-15 Luc Mathis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
KR102006880B1 (ko) 2012-12-06 2019-08-02 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
WO2014093718A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
PT2896697E (pt) 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
KR102240135B1 (ko) 2012-12-13 2021-04-14 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 부위 특이적 뉴클레아제 활성에 대한 dna 검출 방법
SG11201504621RA (en) 2012-12-17 2015-07-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
FI3491915T3 (fi) 2012-12-27 2023-08-29 Keygene Nv Menetelmä kohdistetun translokaation indusointiin kasvissa
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
ES2904803T3 (es) 2013-02-20 2022-04-06 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
US20140273235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US10119133B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US20140364333A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Methods for Live Imaging of Cells
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
EP3679785A3 (en) 2013-04-05 2020-09-16 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
RS58255B1 (sr) 2013-04-16 2019-03-29 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
WO2014182700A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3778899A1 (en) 2013-05-22 2021-02-17 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011032B1 (en) 2013-06-17 2019-10-16 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
SG10201710487VA (en) 2013-06-17 2018-01-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Targeting Disorders and Diseases Using Viral Components
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN103382468B (zh) * 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
EP3666892A1 (en) 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
EP3066109A4 (en) 2013-11-04 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Optimal soybean loci
UA120502C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-26 Дау Агросайєнсиз Елелсі Спосіб отримання трансгенної рослини маїсу
WO2015066643A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc Optimal soybean loci
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
US9850525B2 (en) 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
US20150225801A1 (en) 2014-02-11 2015-08-13 California Institute Of Technology Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
ES2879373T3 (es) 2014-03-18 2021-11-22 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para la regulación de la expresión de proteínas de dedo de zinc

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH119249A (ja) * 1997-05-30 1999-01-19 Natl Exploit Ind De Tabacs & Allumettes:Soc 高タール含有量の従来のシガレットの風味と匹敵するタバコの風味を備えた低タール含有量のシガレット
US20110217739A1 (en) * 2008-11-06 2011-09-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cas6 polypeptides and methods of use
WO2013142578A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX

Also Published As

Publication number Publication date
CA2891347C (en) 2018-02-27
AU2017204031B2 (en) 2018-06-14
US20210079427A1 (en) 2021-03-18
EP3141604A1 (en) 2017-03-15
US10745716B2 (en) 2020-08-18
PL3360964T3 (pl) 2020-03-31
DK3138911T3 (en) 2019-01-21
LT3138912T (lt) 2019-02-25
US20160298133A1 (en) 2016-10-13
US10731181B2 (en) 2020-08-04
LT3138910T (lt) 2017-11-10
EP3611263A1 (en) 2020-02-19
EP3138912A1 (en) 2017-03-08
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EP2928496A1 (en) 2015-10-14
IL267598A (en) 2019-08-29
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PL3138911T3 (pl) 2019-04-30
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