RS60838B1 - Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja - Google Patents

Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja

Info

Publication number
RS60838B1
RS60838B1 RS20201082A RSP20201082A RS60838B1 RS 60838 B1 RS60838 B1 RS 60838B1 RS 20201082 A RS20201082 A RS 20201082A RS P20201082 A RSP20201082 A RS P20201082A RS 60838 B1 RS60838 B1 RS 60838B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sbs
gene
globin
cell
proteins
Prior art date
Application number
RS20201082A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory J Cost
Philip D Gregory
Dmitry Guschin
Michael C Holmes
Jeffrey C Miller
David Paschon
Edward J Rebar
Andreas Reik
Fyodor Urnov
Lei Zhang
Original Assignee
Sangamo Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangamo Therapeutics Inc filed Critical Sangamo Therapeutics Inc
Publication of RS60838B1 publication Critical patent/RS60838B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast genomskog inženjeringa hematopoetskih matičnih ćelija, posebno u tretmanu hemoglobinopatije.
POZADINA
[0002] Genska terapija donosi ogroman potencijal za početak nove ere humane medicine. Ove metodologije će omogućiti tretman stanja koja se pre nisu mogla da napadnu uz pomoć standardne medicinske prakse. Jedno područje koje je posebno obećavajuće je sposobnost da se genetički promeni neka ćelija kako bi pomenuta eksprimirala produkt koji se pre toga nije proizvodio u pomenutoj ćeliji. Primeri za primenu ove tehnologija uključuju inserciju nekog gena koji kodira neku novu terapeutsku belančevinu, inserciju kodirajuće sekvence koja kodira neku belančevinu koja nije pre toga bila prisutna u toj ćeliji ili u nekoj individui, inserciju gena divljeg-tipa u neku ćeliju koja sadrži mutiranu sekvencu tog gena, i inserciju sekvence koja kodira neku strukturnu nukleinsku-kiselinu poput mikroRNA ili siRNA.
[0003] Transgeni mogu da se dostave u neku ćeliju na razne načine, na primer tako da se pomenuti transgen integrira u ćelijski genom i ostaje ugrađen u njemu. Nedavno je bila razvijena strategija za ugradnju transgena koja primenjuje cepanje sa mesto-specifičnim nukleazama kako bi se ugradnja ciljala u odabrani genomski lokus (vidi, na primer, zajednički U.S. patent 7,888,121). Nukleaze specifične za ciljane gene mogu da se koriste tako da se transgeni konstrukt ugradi uz pomoć popravka usmerenog homologijom (homology directed repair, HDR) ili uz pomoć zarobljavanja krajeva tokom ne-homolognog spajanja krajeva (nonhomologous end joining, NHEJ). Ciljani lokusi uključuju "safe-harbor" lokuse poput na primer gena CCR5, gena CXCR4, gena PPP1R12C (takođe poznat kao AAVS1), gena za albumin ili gena Rosa. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije br. 20080299580, 20080159996, 201000218264, 20110301073, 20130177983 i 20130177960 i U.S. provizornu prijavu br.
61/823,689. Ugradnja posredovana nukleazom nudi mogućnost poboljšane ekspresije transgena, povećane bezbednosti i ekspresijske trajnosti, ako se uporedi sa pristupima klasične ugradnje koji se oslanjaju na nasumičnu integraciju transgena, upravo zbog toga šta omogućava tačno pozicioniranje transgena uz minimalan rizik od utišavanja gena ili aktivisanja obližnjih onkogena.
[0004] Crvene krvne ćelije (RBC), ili eritrociti, su glavna ćelijska komponenta krvi. U stvari, RBC čine jednu četvrtinu svih ćelija u ljudskom telu. Ljudski zreli RBC izgube jezgro i mnoge druge organele, a pune su sa hemoglobinom, metaloprotein iz RBC koji funkcionira tako da prenosi kiseonik u tkiva i odnosi ugljenik dioksid iz tkiva u pluća kako bi se izbacio iz tela. Ova belančevina čini približno 97% suve mase RBC i povećava sposobnost prenosa kiseonika za oko sedamdeset puta. Hemoglobin je heterotetramer koji sadrži dva globinska α-lanca i dva globinska β-lanca i 4 hem-grupe. Kod odraslih, α2β2-tetramer se naziva Hemoglobin A (HbA) ili odrasli hemoglobin. Tipično, alfa- i beta-globinski lanci se sintetizuju u približnom omeru od 1:1, a čini se da je ovaj kritičan za hemoglobin i RBC-stabilizaciju. U stvari, u nekim slučajevima kada je jedan tip globinskog gena neadekvatno eksprimiran (vidi ispod), reduciranje eksprimiranja (na primer, uz pomoć specifične siRNA) drugog tipa globina obnavlja pomenuti omer od 1:1 koje ublažava neke aspekte mutiranog ćelijskog fenotipa (vidi Voon et al (2008) Haematologica 93(8):1288). U fetusu koji se razvija se proizvodi drugačija forma hemoglobina, fetalni hemoglobin (HbF), koja ima veći vezni afinitet za kiseonik u uporedbi sa Hemoglobinom A tako da kiseonik može da se dostavlja u sistem bebe preko majčinog krvotoka. Fetalni hemoglobin takođe sadrži dva α-globinska lanca, ali umesto odraslih β-globinskih lanaca, sadrži dva fetalna γ-globinska lanaca (tj., fetalni hemoglobin je α2γ2). Kod približno 30. sedmice gastacije, sinteza γ-globina u fetusu počinje opadati dok istovremeno raste proizvodnja β-globina. Kod približno 10 meseci starosti, hemoglobin novorođenčeta je približno sav α2β2 mada nešto HbF preostaje i u zrelosti (približno 1-3% od ukupnog hemoglobina). Regulacija prelaska iz proizvodnje γ u proizvodnju β je veoma kompleksna, a primarno uključuje ekspresionu negativnu regulaciju γ-globina uz pomoć pozitivne regulacije ekspresije β-globina.
[0005] Genetički defekti u sekvencama koje kodiraju hemoglobinske lance mogu da budu odgovorni za brojne bolesti koje su poznate kao hemoglobinopatije, uključujući srpastu anemiju i razne talasemije. U najvećem broju pacijenata sa hemoglobinopatijama, geni koji kodiraju γglobin su prisutni, ali je njihova ekspresija relativno niska zbog toga šta represija normalnog gena nastupa oko porođaja kao šta je opisano iznad.
[0006] Procenjeno je da 1 u 5000 ljudi u SAD-u ima srpastu anemiju (SCD), najčešće kod ljudi poreklom iz pod-Saharske Afrike. Tamo postoji korist od heterozigotnih srpastih ćelija zbog obrane od malarije, tako da ovo svojstvo je možda bilo selekcionirano tokom vremena, pri čemu je procenjeno da u pod-Saharskoj Africi, jedna trećina od populacije poseduje svojstvo srpastih ćelija. Bolest srpastih ćelija je uzrokovana mutacijom u β-globinskom genu u kojem je valin zamenjen sa glutaminskom kiselinom i mestu #6 (GAG u GTG na nivou DNA), a nastao hemoglobin se naziva "hemoglobin S" ili "HbS." U uslovima niskog nivoa kiseonika, konformacioni prelaz od deoksi formu HbS izlaže hidrofobnu zakrpu u belančevini između E-i F-heliksa. Hidrofobni ostaci valina na poziciji 6 iz beta-lanca hemoglobina mogu da se spoje sa hidrofobnom zakrpom, koje uzrokuje da HbS molekuli agregiraju i formiraju fibrozne precipitate. Ovi agregati sa svoje strane uzrokuju abnormalnost ili 'uvijanje' RBC, koje dovodi do pojave manje fleksibilnih ćelija. Srpasti RBC više nisu sposobne da se provuku u kapilarne podloge šta dovodi do vazo-okluzivne krize kod pacijenata sa takvim ćelijama. Osim toga, srpasti RBC su krhkiji od normalnih RBC, i imaju tendenciju hemolize, koje konačno dovodi do anemije kod pacijenta.
[0007] Tretman i upravljanje sa pacijentima sa srpastim ćelijama je životna propozicija koja uključuje antibiotski tretman, upravljanje sa boli i transfuzije tokom akutnih epizoda. Jedan pristup je upotreba hidroksiuree, koja svoje delovanje uspostavlja delomično preko povećanja proizvodnje γ-globina. Dugotrajne posledice hronične terapije sa hidroksiureom su međutim još uvek nepoznati, a tretman uzrokuje neželjene nus-pojave i može da ima varijabilnu efikasnost od pacijenta do pacijenta. Unatoč porastu efikasnosti tretmana srpaste anemije, očekivano trajanje života pacijenata još uvek je sredina ili kasne 50-te, a povezano je sa morbiditetima bolesti koje imaju snažan uticaj na kvalitetu života pacijenta.
[0008] Talasemije su takođe bolesti povezane sa hemoglobinom i tipično uključuju smanjenu ekspresiju globinskih lanaca. Ovo može da se očituje preko mutacija u regulacionim regionima gena ili preko mutacija u sekvencama koje kodiraju globin koje rezultuje smanjenom ekspresijom. Alfa-talasemije su povezane sa ljudima poreklom iz Zapadne Afrike i Južne Azije, a mogu da donose otpornost na malariju. Beta-talasemije su povezane sa ljudima poreklom iz Mediterana, tipično iz Grčke i obalnih područja Turske i Italije. Tretman talasemija uobičajeno uključuje krvne transfuzije i terapije helacije gvožđa. Transplantacije koštane srži se takođe koriste za tretman ljudi sa snažnim talasemijama ako može da se identifikuje odgovarajući donor, ali ova procedura donosi ozbiljne rizike.
[0009] Jedan predloženi pristup za tretman SCD i beta-talasemija je povećanje ekspresije γglobina sa ciljem da se HbF funkcionalno zameni sa aberantnim odraslim hemoglobinom. Kao šta je pomenuto iznad, tretman SCD-pacijenata sa hidroksiureom se smatra da je koristan delomično zbog efekta na povećanje ekspresije γ-globina. Prva grupa jedinjenja za koja se zna da utiču na re-aktivisanje HbF su citotoksični lekovi. Sposobnost uzrokovanja de novo sinteze gama-globina uz pomoć farmakološke manipulacije je najpre pokazana uz pomoć 5-azacitidina u eksperimentalnim životinjama (DeSimone (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79(14):4428-31). Naknadne studije su potvrdile sposobnost 5-azacitidina da poveća HbF kod pacijenata sa βtalasemijom i bolesti srpastih ćelija (Ley, et al., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475, i Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380). Osim toga, masne-kiseline kratkog lanca (na primer, butirat i derivati) u eksperimentalnim sistemima povećavaju HbF (Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961-1967). Takođe, postoji segment humane populacije sa stanjem poznatim kao „nasledna perzistencija fetalnog hemoglobina“ (hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH) gde povećane količine HbF perzistiraju i u zrelosti (10-40% kod HPFH-heterozigota (vidi Thein et al (2009) Hum. Mol. Gent 18 (R2): R216-R223). To je retko stanje, ali u odsutnosti bilo kakvih abnormalnosti povezanih sa beta-globinom, nije povezan sa bilo kakvim značajnim kliničkim manifestacijama, čak i kada je 100% hemoglobina u pacijenta HbF. Kada individue koje boluju od talasemije takođe imaju i ko-incidentni HPFH, ekspresija HbF može da smanji ozbiljnost bolesti. Dalje, ozbiljnost naturalnog kursa bolesti srpastih ćelija može značajno da varira od pacijenta do pacijenta, a ova varijabilnost, delimično, može da se pripiše faktu da neke individue sa blagom bolesti eksprimiraju veće nivoe HbF.
[0010] Jedan pristup za povećanje ekspresije HbF uključuje identifikaciju gena čiji produkti igraju ulogu u regulaciji ekspresije γ-globina. Jedan takav gen je BCL11A, najpre identifikovan zbog svoje uloge u razvoju limfocit. BCL11A kodira zinc-finger belančevinu za koju se smatra da je uključena u fazno-specifičnoj regulaciji ekspresije γ-globina. BCL11A je eksprimiran kod odraslih u eritroidnim prekursorskim ćelijama, a negativna regulacija njegove ekspresije dovodi do povećanja ekspresije γ-globina. Osim toga, čini se da je splajsovanje mRNA od BCL11A regulisano razvojem. U embrionskim ćelijama se čini da se primarno eksprimiraju kraće varijante BCL11A-mRNA, poznate kao BCL11A-S i BCL11A-XS, dok se u odraslim ćelijama predominantno eksprimiraju duže varijante mRNA, BCL11A-L i BCL11A-XL. Vidi, Sankaran et al (2008) Science 322 str. 1839. Belančevina BCL11A se čini da reaguje sa β-globinskim lokusom kako bi promenila konformaciju, a tako i njegovu ekspresiju u različitim fazama razvoja. Osim toga, čini se da je u regulaciju ekspresije γ-globina uključena i druga regulatorna belančevina, KLF1. Pronađeno je da su nivoi KLF1 direktno proporcionalni sa nivoima BCL11A, a oba su obrnuto-proporcionalni sa nivoima γ-globina. Na primer, u jednoj porodici sa Malte, sa perzistentnom ekspresijom HbF, je pronađeno da imaju heterozigotnu mutacija gena KLF1 (Borg et al (2010) Nat Gent, 42(9):801-805). Produkt gena KLF1 se veže direktno na gen BCL11A u uslovima in vivo, pa može da bude odgovoran za njegovu pozitivnu regulaciju (vidi Borg et al. ibid; Bieker (2010) Nat Gent 42(9): 733-734; Zhou et al. (2010) Nat Gent 42(9):742-744). Tako, ako KLF1 stimuliše ekspresiju BCL11A, delovanje tako indukovanog BCL11A će rezultovati supresijom γ-globina i proizvodnjom HbF. Upotreba inhibitorne RNA koja cilja gen BCL11A je predložena ranije (vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju 20110182867), ali ova tehnologija ima nekoliko potencijalni nedostataka, naime to da potpun knock-down možda ne može da se ostvari, dostava takvih RNA može da bude problematična i RNA molekuli mora da se unose u telo kontinuirano, koje zahteva višestruke tretmane tokom života.
[0011] Alfa-talasemije su takođe prevalentne u ljudskoj populaciji, posebno u Azija, a za jedan tip aberacije alfa-globina se smatra da je najčešći genski poremećaj kod ljudi. U nekim tropskim i suptropskim područjima sveta, alfa-globinski poremećaj je pronađen kod 80-90% populacije (vidi Harteveld & Higgs (2010) Orphanet Journal of Rare Diseases 5:13).
[0012] Ljudi nose 2 kopije gena za alfa-globin u tandemu (α1 i α2) na hromosomu 16, tako da u normalnoj diploidnoj ćeliji postoje 4 kopije sveukupno. α2-gen normalno doprinosi za 2-3 puta više α-globinske mRNA u odnosu na α1-gen. Tandemska organizacija ova dva gena može biti povezana sa prisutnosti velikih delecija u alfa-globinskim genima kod pacijenata sa alfatalasemijom, pri čemu generalno broj alfa-globinskih gena koji nisu funkcionalni direktno utiče na ozbiljnost bilo koje alfa-talasemije (vidi Chui et al (2003) Blood 101(3):791). Delecija jedne kopija se čini da je dosta česta (30% kod Amerikanaca i 60-80% ljudi koji žive u Saudijskoj Arabiji, Indiji, i Tajlandu), a generalno nije vidljiva kod individua osim u slučaju kada je obavljeno genetičko testiranje. Delecija dve kopije, bez obzira da li se nalaze na istom hromosomu (cis) ili na različitim hromosomima (trans), može kod zahvaćene osobe da uzrokuje blagu anemiju. Kada su deletirana tri α-globinska gena, tako da individua poseduje samo jedan funkcionalni α-globinski gen, prisutna je blaga anemija, ali šta je važnije, narušen je kritični omer α-globina u odnosu na β-globin. β4-tetrameri, koji sadrže četiri beta-globinska lanca, se često primećuju kod pacijenata sa samo jednim funkcionalnim alfa-globinskim genom, stanje koje je poznato kao HbH. β4-tetrameri mogu da vežu kiseonik, ali ga ne oslobađaju na periferiji, koje uzrokuje stanje koje je poznato kao HbH-bolest. Individue koje pate od HbH-bolesti imaju RBC sa kraćim polu-životima koji lako ulaze u hemolizu, koje dovodi do povećane anemije. Gubitak sva četiri α-globinska gena je uobičajeno fatalno in utero.
Bauer et al. ((2012) Blood 120(15):2945-2953) diskutuju perspektive za nove terapije za betaglobinske poremećaje.
Sebastiano et al. ((2011) Stem Cells 29(11):1717-1726) razmatraju genetičku korekciju mutacija srpastih ćelija uz korišćenje nukleaza koje ciljaju ljudski beta-globinski gen.
[0013] Tako, preostaje potreba za dodatnim postupcima i kompozicijama koji mogu da se koriste za editirenje genoma, za korekciju nekog aberantnog gena ili menjanje ekspresije ostalih, na primer, za tretman hemoglobinopatija poput bolesti srpastih ćelija i talasemije.
SAŽETAK
[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje genetički modifikovane crvene krvne prekursorske ćelije koje su naznačene time šta sadrže genomsku modifikaciju u egzonu 2 ili egzonu 4 gena BCL11A ili unutar BCL11A-XL načinjenu nakon cepanja u genu BCL11A uz pomoć zinc-finger nukleaze (ZFN), TALE-nukleaze (TALEN) ili CRISPR/Cas-sistema koji se vežu na ciljano mesto u bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NO: 56, 63, 66, 71, 160, 170, 179, 183, 189, 193, 197, 200, 203, 207, 211 i 213 tako da je gen BCL11A inaktivisan, a ekspresija gama-globina povećana.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje zinc-finger belančevinu koji sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena koji sadrže region sa heliksom za prepoznavanje (recognition helix region), pri čemu pomenuta zinc-finger belančevina sadrži regione sa heliksom za prepoznavanje u redosledu koji je prikazan u jednom redu u Tabeli 1A belančevina SBS#39172, SBS#43490, SBS#44642, SBS#45148, SBS#45147, SBS#39145, SBS#44490, SBS#44489, SBS#45081, SBS#44493, SBS#29527, SBS#29528, SBS#29525, SBS#29526, SBS#34678, SBS#34642, SBS#44889, SBS#44888, SBS#44905, SBS#44904, SBS#44911, SBS#44910, SBS#44945, SBS#44944, SBS#44947 ili SBS#44946.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži zinc-finger belančevinu iz ovoga pronalaska i domen za cepanje koji je divlji-tip ili je konstruiran ili pilu-domen za cepanje koji je divlji-tip ili je konstruiran.
Ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira jednu ili više belančevina iz ovoga pronalaska.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu ćeliju koji sadrži jednu ili više fuzionih belančevina iz ovoga pronalaska ili jedan ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplet hemikalija koji sadrži belančevinu iz ovoga pronalaska, fuzionu belančevinu iz ovoga pronalaska ili polinukleotid iz ovoga pronalaska. Ovaj pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za menjanje ekspresije globinskog gena u nekoj ćeliji, pri čemu pomenuti postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više belančevina iz ovoga pronalaska ili jednog ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska, u uslovima u kojima je pomenuta jedna ili više belančevina eksprimirano, a ekspresija pomenutog globinskog gena je promenjena. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jednu ili više belančevina iz ovoga pronalaska ili jedan ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska namenjenih za primenu u postupku za tretiranje hemoglobinopatije, pri čemu pomenuti postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više belančevina iz ovoga pronalaska ili jednog ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska, u uslovima u kojima je pomenuta jedna ili više belančevina eksprimirano, a ekspresija pomenutog globinskog gena je promenjena. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje jednu ili više belančevina iz ovoga pronalaska ili jednog ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska namenjenih za primenu u postupku za tretiranje bolesti srpastih ćelija, pri čemu pomenuti postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više belančevina iz ovoga pronalaska ili jednog ili više polinukleotida iz ovoga pronalaska, u uslovima u kojima pomenuta jedna ili više belančevina se eksprimira, a ekspresija globinskog gena je promenjena.
[0015] Ovde su opisani postupci i kompozicije za menjanje ekspresije ili za korekciju jednog ili više gena koji kodiraju belančevine uključene u nekoj genskoj bolesti (na primer, proizvodnja belančevina koje nedostaju, dificijentne su ili aberantne kod neke bolesti i/ili belančevine koje regulišu pomenute belančevine) poput bolesti srpastih ćelija ili talasemije. Menjanje takvih belančevina može da omogući tretman pomenutih genskih bolesti. Na primer, editiranje genoma se koristi za korigovanje nekog aberantnog gena, ugradnju gena divljeg-tipa, ili promenu ekspresije endogenog gena. Uz pomoć primera koji ne ograničava, gen divljeg-tipa koji kodira β-globin može da se ugradi u ćeliju sa ciljem proizvodnje belančevine koja nedostaje i/ili sa ciljem da se tretira hemoglobinopatija uzrokovana oštećenim β-globinom. U nekim slučajevima, gen divljeg-tipa može da se ugradi u safe-harbor lokus ili u lokus za kojeg se zna da je visoko eksprimiran u nekom tkivu od interesa poput β-globinskog lokusa u eritroidnim ćelijama. Editiranje genoma može na sličan način da se koristi sa ciljem da se proizvede belančevina koja nedostaje (i time tretira) alfa-talasemija uz pomoć insercije alfa-globinskog gena divljeg-tipa u neki safe-harbor lokus. Drugi pristup uključuje primenu genetičke korekcije pri čemu je ciljan oštećeni endogeni α- ili β-globinski gen, a mutirana sekvenca je zamenjena. Alternativno, regulacioni gen uključen u represiji γ-globina može da se promeni ili nokautira (na primer, sa ciljem da se poveća ekspresija γ-globina uz pomoć inaktivisanja i/ili redukovanja količine represivne belančevine) i/ili uzvodno regulaciono vezno mesto γ-globinskog gena ili druga područja beta-globinskog lokusa mogu da se promene tako da regulatori ne mogu da reaguju pravilno u γ-globinskom lokusu pa se proizvodi HbF koje poništava stanja (tj. SCD ili β-talasemiju) koja su uzrokovana aberantnim β-globinskim genom. Jedan pristup dalje uključuje primenu modifikacije matičnih ćelija (na primer, hematopoetska matična ćelija ili RBC-prekursor), pri čemu pomenute matične ćelije tada mogu da se uvedu u pacijenta kako bi se tretirala neka hemoglobinopatija.
[0016] U jednom aspektu, ovde je opisana zinc-finger belančevina (ZFP) koja se veže na metu u regionu od interesa (na primer, β-globin, α-globin ili safe-harbor gen, ili neki regulacioni gen ili njegova DNA-meta poput BCL11A, γ-globin ili KLF1) u genomu, pri čemu ZFP sadrži jedan ili više konstruiranih zinc-finger veznih domena. U jednom aspektu, pomenuta ZFP je neka zinc-finger nukleaza (ZFN) koja cepa ciljani genomski region od interesa, pri čemu pomenuta ZFN sadrži jedan ili više konstruiranih zinc-finger veznih domena i domen ili polu-domen za cepanje. Domeni ili polu-domeni za cepanje mogu da se dobiju, na primer, iz raznih restrikcionih endonukleaza i/ili homing-endonukleaza. U jednoj izvedba, polu-domeni za cepanje su izvedeni iz IIS-restrikcionih endonukleaza (na primer, Fok I). U nekim aspektima, pomenuti zinc-finger domen prepoznaje metu u globinskom genu ili u safe-harbor genu. U nekim aspektima, pomenuti zinc-finger domen sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena i prepoznaje metu u globinskom genu (na primer, zinc-finger belančevina koja sadrži 5 ili 6 prsta u regionu sa heliksom za prepoznavanje, prikazana u Tabeli 1A). U drugom aspektu, pomenuti zinc-finger domen prepoznaje metu u BCL11A, KLF1, α-, β- ili γ-globinskom genu ili njihove regulacione elemente. U nekim aspektima, pomenuti zinc-finger domen sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena i prepoznaje metu u BCL11A, KLF1, α-, β- ili γ-globinskom genu ili njihove regulacione elemente (na primer, zinc-finger belančevina koja sadrži 5 ili 6 prstiju sa regionima sa heliksom za prepoznavanje, prikazani u Tabeli 1A).
[0017] U drugom aspektu, ovde je opisana TALE-belančevina (transcription activator like) koja veže metu u regionu od interesa (na primer, α- ili β-globinski ili safe-harbor gen, ili neki regulacioni gen ili njegova DNA-meta poput BCL11A, γ-globina ili KLF1) u genomu, pri čemu pomenuti TALE sadrži jedan ili više konstruiranih TALE-veznih domena. U drugim aspektima, pomenuta TALE je nukleaza (TALEN) koja cepa ciljani genomski region od interesa, pri čemu pomenuti TALEN sadrži jedan ili više konstruiranih TALE DNA-veznih domena i domen i polu-domen za cepanje. Domeni i polu-domeni za cepanje mogu da se dobiju, na primer, iz raznih restrikcionih endonukleaza i/ili homing-endonukleaza. U jednoj izvedbi, polu-domeni za cepanje su izvedeni iz IIS-restrikcionih endonukleaza (na primer, Fok I). U nekim aspektima, TALE DNA-vezni domen prepoznaje metu u globinskom ili safe-harbor genu. U drugim aspektima, TALE DNA-vezni domen prepoznaje metu u BCL11A, KLF1, α-, β- ili γglobinskom genu ili u njihovim regulacionim elementima (na primer, TALEN-belančevina prikazana u Tabeli 3).
[0018] U drugom aspektu, ovde je opisan CRISPR/Cas-sistem koji veže metu u nekom regionu od interesa (na primer, neki visoko-eksprimiran gen, gen povezan sa nekom bolesti ili safeharbor gen) u genomu, pri čemu pomenuti CRISPR/Cas-sistem sadrži CRIPSR/Cas-nukleazu i konstruirane crRNA/tracrRNA (ili single-guide RNA). U nekim aspektima, pomenuti CRISPR/Cas-sistem prepoznaje metu u visoko-eksprimiranom genu, genu povezanom sa nekom bolesti, ili u safe-harbor genu. U nekim aspektima, pomenuti CRISPR/Cas-sistem prepoznaje metu u globinskom genu, albuminskom genu, CCR5, CXCR4, AAVS1, Rosa, ili HPRT genu.
[0019] Pomenuti ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas-sistem, kao šta je ovde opisano, mogu da vežu i/ili pocepaju region od interesa u kodirajućem ili ne-kodirajućem regionu u nekom ili
1
blizu nekog gena, poput, na primer, vodeće sekvence, prateće sekvence ili introna, ili u nekom ne-transkribovanom regionu, uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. U nekim aspektima, pomenuti ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas-sistem vežu i/ili cepaju neki globinski gen. U drugim aspektima, pomenuti ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas-sistem vežu i/ili cepaju neki safe-harbor gen, na primer CCR5 gen, CXCR4 gen, PPP1R12C (takođe poznat kao AAVS1) gen, albuminski gen ili Rosa gen. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije br. 20080299580, 20080159996, 201000218264, 20110301073, 20130177983, i 20130177960 i U.S. provizornu prijavu br.
61/823,689. Osim toga, kako bi se poboljšala selektivnost, može da se koristi pomenuti HPRT lokus (vidi U.S. patentnu publikaciju br. 20130122591). U drugom aspektu, ovde su opisane kompozicije koje sadrže jednu ili više zinc-finger i/ili TALE-nukleaza ili CRISPR/Cas-sistem kao šta je ovde opisano. U nekim aspektima, pomenuti ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas-sistem vežu i cepaju BCL11A, KLF1, α-, β- ili γ-globinski gen ili cepaju njihove regulacione elemente. U drugom aspektu, ovde su opisane kompozicije koje sadrže jednu ili više zinc-finger, TALE-ili Cas-nukleaza kao šta je ovde opisano.
[0020] U drugom aspektu, ovde je opisan polinukleotid koji kodira jedan ili više ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas-sistem kao šta je ovde opisano. Pomenuti polinukleotid može da bude, na primer, mRNA. U nekim aspektima, pomenuta mRNA može da bude hemijski modifikovana (vidi, na primer, Kormann et al, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157).
[0021] U drugom aspektu, ovde je opisan ekspresioni vektor za ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistem koji sadrži polinukleotid koji kodira jedan ili više ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistema ovde opisanih, koji je operativno spojen na neki promotor. U jednoj izvedbi, pomenuti ekspresioni vektor je neki viralni vektor.
[0022] U jednom aspektu, ovde je opisana belančevina ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cassistema koja se koristi sa ciljem da pocepa ciljanu DNA.
[0023] U drugim aspektima, genetički modifikovani RBC-prekursori (hematopoetske matične ćelija poznate kao "HSC") se unose u transplantat koštane srži, a pomenute RBC se diferenciraju i sazrevaju in vivo. U nekim izvedbama, pomenuti HSC su izolovani nakon G-CSF-indukovane mobilizacije, a u nekim drugim, pomenute ćelije su izolovane iz ljudske koštane srži ili iz pupčane vrpce. U nekim aspektima, pomenute HSC su editirane uz pomoć tretmana sa nekom nukleazom koja je dizajnirana da nokautira neki globinski ekspresioni regulator (na primer, BCL11A ili KLF1). U drugim aspektima, pomenute HSC su modifikovane sa nekom konstruiranom nukleazom, a donor nukleinska-kiselina poput nekog gena divljeg-tipa (na primer, globinski gen) je ugrađena i eksprimirana i/ili je korigiran neki endogeni aberantni gen. U nekim slučajevima, pomenuta sekvenca gena divljeg-tipa namenjena ugradnji kodira neki β-globin divljeg-tipa ili neki α-globin divljeg-tipa. U drugim slučajevima, pomenuti endogeni aberantni gen je neki β-globinski ili α-globinski gen. U nekim izvedbama, pomenute modifikovane HSC se administriraju u pacijenta nakon blagog mijeloablativnog pre-stanja. U drugim aspektima, pomenute HSC se administriraju nakon pune mijeloablacije, na primer, nakon presađivanja, pri čemu 100% od hematopoetskih ćelija je dobiveno iz modifikovanih HSC.
[0024] U drugom aspektu, ovde je opisan postupak za cepanje nekog endogenog gena (na primer, gena čija inaktivacija rezultuje povećanom ekspresijom globina poput BCL11A ili KLF1) u RBC-prekursorskim ćelijama, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva: uvođenje, u ćeliju, jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistema koji vežu neku metu u jednom ili više endogenih gena u uslovima kada pomenuti ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistemi je/su eksprimiran/i pri čemu je pocepan jedan ili više gena. U drugom aspektu, ovde je opisan postupak za cepanje gena BCL11A ili KLF1 u nekoj ćeliji, pri čemu pomenuti postupak podrazumeva: uvođenje, u ćeliju, jednog ili više polinukleotida koja kodiraju jedan ili više ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistema koja vežu metu u jednom ili više gena BCL11A ili KLF1 u uslovima kada se pomenuti ZFN-, TALEN- i/ili CRISPR/Cas-sistem(i) eksprimira(ju) pri čemu su pocepani jedan ili više gena BCL11A ili KLF1. U nekim aspektima, pomenuti zinc-finger domen sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena i prepoznaje metu u nekom globinskom genu (na primer, zinc-finger belančevina koja sadrži 5 do 6 prstiju u regionima sa heliksom za prepoznavanje koji su prikazani u Tabeli 1A). U drugim aspektima, pomenuti TALEN prepoznaje metu u sekvenci nekog β-globina, αglobina, gama-globina, KLF ili BCL11A (prikazano u Tabeli 3). U nekim dodatnim aspektima, pomenuti CRIPSR/Cas-sistem prepoznaje metu u sekvenci nekog β-globina, α-globina, gamaglobina, KLF ili BCL11A pri čemu pomenuta single-guide RNA je konstruirana tako da prepoznaje željenu metu u pomenutom ciljnom genu od interesa. Pocepani gen(i) mogu da se inaktivišu (nokautiranju), na primer, da se nokautira jedan ili više gena čiji produkt(i) mogu da inhibiraju ekspresiju nekog gena (na primer, globinskog gena), ili može sa se uništi ciljno regulaciono mesto u DNA odgovarajuće(ih) belančevine(a). U nekim aspektima, pomenuti inaktivisani gen(i) ili ciljane sekvence su one koje su uključene u inhibiranju ekspresije fetalnog hemoglobina. Diferencirana ćelija (na primer, matične ćelije) sadrži fetalni hemoglobin i može da se primeni na pacijenta u potrebi. U nekim aspektima je nokautiran neki globinski gen. Na primer, alfa-globinski gen može da bude nokautiran sa ciljem sa se obnovi omer alfa-globin : beta-globin kada je beta-globin slabo eksprimiran, ili HbS koji kodira beta-globinski gen može da se nokautira istovremeno sa ugradnjom geta-globinskog gena divljeg-tipa. Pomenute ćelije (na primer, matične ćelije) kada su diferencirane sadrže HbA-hemoglobin i mogu da se primenjuju na pacijente u potrebi.
[0025] U drugom aspektu, ovde je opisan postupak za ugradnju neke sekvence u neki endogeni gen (na primer, beta-globin, alfa-globin i/ili safe-harbor gen) u nekoj ćeliji (na primer, matična ćelija), pri čemu pomenuti postupak podrazumeva cepanje pomenutog endogenog gena primenom jedne ili više nukleaza i ugradnju neke sekvenca u mestu cepanja. U nekim aspektima, neka genomska sekvenca u bilo kojem ciljnom genu je zamenjena, na primer, primenom ZFN- ili TALEN-para, ili CRIPSR/Cas-sistema (ili vektora koji kodira pomenuti ZFN-, TALEN-par i/ili CRIPSR/Cas-sistem) kao šta je ovde opisano, sa "donor" sekvencom (takođe poznata kao "transgen") koja je ugrađena u pomenuti gen nakon ciljanog cepanja sa pomenutim ZFN-, TALEN-parom i/ili CRIPSR/Cas-sistemom. Pomenuta donor-sekvenca može da bude prisutna u pomenutom ZFN- ili TALEN-vektoru, koji je prisutan na odvojenom vektoru (na primer, Ad-, AAV- ili LV-vektor) ili, alternativno, može da bude uvedena u ćeliju primenom nekog drugačijeg sistema za dostavu nukleinske-kiseline. Takva insercija donorske nukleotidne sekvence u ciljni lokus (na primer, globinski gen, drugi safe-harbor gen, itd.) rezultuje ekspresijom pomenutog transgena pod kontrolom genetičkih kontrolnih elemenata ciljnog lokusa (na primer, globinskog gena). U nekim izvedbama, pomenuti transgen kodira ne-kodirajuću RNA (na primer, shRNA). Ekspresija transgena pre sazrevanja RBC proizvodi RBC koji sadrže ne-kodirajuću RNA od interesa.
[0026] U drugim izvedbama, pomenuti transgen sadrži neku funkcionalnu belančevinu, na primer neku globinsku belančevinu (na primer, divlji-tip beta i/ili divlji-tip gama). U nekim izvedbama, ugradnja transgena od interesa u neki endogeni gen (na primer, globinski gen) rezultuje ekspresijom intaktne sekvence egzogene belančevine bez da poseduje bilo kakve sekvence kodirane od strane endogenog gena. U drugim izvedbama, eksprimirana egzogena
1
belančevina je neka fuziona belančevina koja sadrži amino-kiseline koje kodira transgen i neki globinski gen (na primer, iz endogenog ciljnog lokusa ili, alternativno iz sekvenca na transgenu koje kodiraju globin). U nekim instancama, pomenuti globinski gen je beta-globin, dok u drugim instancama, pomenuti globinski gen je alfa-globin. U drugim instancama, pomenuti globinski gen je gama-globinski gen. Kada su prisutne, endogene globinske sekvence mogu da se nalaze na amino (N)-terminalnom delu egzogene belančevine i/ili na karboksi (C)-terminalnom delu egzogene belančevine. Pomenute globinske sekvence mogu da uključuju divlji-tip pune dužine ili mutirane globinske sekvence ili, alternativno, mogu da uključuju parcijalne globinske sekvence. U nekim izvedbama, pomenuti fuzioni globinski-transgen se nalazi na endogenom lokusu u ćeliji dok u drugim izvedbama, pomenute kodirajuće sekvence globinskog-transgena su ugrađene u safe-harbor unutar genoma. U nekim aspektima, pomenuti safe-harbor je izabran iz CCR5-gena, CXCR4-gena, PPP1R12C-gena (takođe poznat kao AAVS1), albuminskog gena ili Rosa-gena. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije br.
20080299580, 20080159996, 201000218264, 20110301073, 20130177983, i 20130177960 i U.S. provizornu prijavu br. 61/823,689. Osim toga, kao pomoć u selekciji može da se primenjuje i HPRT-lokus (vidi U.S. patentnu publikaciju br.20130122591).
[0027] U još jednom aspektu, ovde su opisane ćelijske linije i/ili modeli transgenih životinja (sistemi). U nekim aspektima, pomenuta transgena ćelija i/ili životinja uključuju transgen koji kodira neki ljudski gen. U nekim instancama, pomenuta transgena životinja podrazumeva nokaut endogenog lokusa koji odgovara egzogenom transgenu (na primer, mišji globinski gen je nokautiran, a ljudski globinski gen je ugrađen u miša), koje omogućava razvoj u in vivo sistemu gde ljudska belančevina može da se proučava izolovano. Takvi transgeni modeli mogu da se koriste za pretraživanje sa ciljem da se identifikuju mali molekuli ili veliki bio-molekuli ili drugi entiteti koji mogu da reaguju sa ili da modifikuju ljudsku belančevinu od interesa. U nekim aspektima, pomenuti transgen je ugrađen u neki selektirani lokus (na primer, globin ili safe-harbor) u nekoj matičnoj ćeliji (na primer, embrionska matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, hematopoetska matična ćelija, itd.) ili u životinjskom embrionu koji je dobiven bilo kojim ovde opisanim postupkom, pri čemu je pomenuti embrion implantiran tako da se rodi živa životinja. U drugim aspektima, pomenute matične ćelije sadrže genomske izmene u endogenim lokusima poput BCL11A, KLF1 ili γ-globinskih gena, ili njihovih kombinacija, tako da je ekspresija γ-globina povećana. U nekim izvedbama, pomenuto povećanje ekspresije γ-globina menja omer γ-globin : β-globin u ćeliji ako se uporedi sa needitiranom matičnom ćelijom. Životinja je tada uzgojena do seksualne zrelosti pa joj je omogućeno da proizvede potomstvo pri čemu barem deo potomaka sadrži editiranu endogenu gensku sekvenca ili ugrađeni transgen.
[0028] U još jednom aspektu, ovde je opisan postupak za mesto-specifičnu ugradnju sekvence neke nukleinska-kiseline u neki endogeni lokus (na primer, globinski ili safe-harbor gen) na nekom hromosomu, na primer u hromosomu nekog embriona. U određenim aspektima ovoga pronalaska, pomenuti postupak podrazumeva: (a) injektiranje embriona sa (i) barem jednim DNA-vektorom, pri čemu pomenuti DNA-vektor sadrži uzvodnu sekvenca i nizvodnu sekvencu koje okružuju pomenutu sekvencu nukleinske-kiseline koja treba da se ugradi, i (ii) barem jedan RNA molekul koji kodira zinc-finger, TALE- ili Cas9-nukleazu. U slučaju primene Cas9-belančevine, takođe se uvodi i konstruirana sgRNA. Pomenuta nukleaza ili nukleazni sistem prepoznaje metu u ciljnom lokusu (na primer, globinski ili safe-harbor lokus), a tada (b) embrion je uzgojen sa ciljem da se omogući eksprimiranje zinc-finger ili TALE-nukleaze i/ili CRISPR/Cas-sistema, pri čemu se uvodi dvolančani lom u metu uz pomoć pomenute zincfinger nukleaze, TALEN-para ili CRISPR/Cas-sistema, a lom je popravljen uz pomoć homologne rekombinacije sa DNA-vektorom, pri čemu se ugrađuje sekvenca nukleinskekiseline u hromosom.
[0029] U bilo kojem od ovde opisanih postupaka, pomenuti polinukleotid koji kodira zincfinger nukleazu(e), TALEN-par i/ili CRIPSR/Cas-sistem može da sadrži DNA, RNA ili njihove kombinacije. U nekim izvedbama, pomenuti polinukleotid obuhvata plazmid. U drugim izvedbama, pomenuti polinukleotid koji kodira nukleazu obuhvata mRNA.
[0030] Ovde je takođe opisan komplet hemikalija, koji sadrži ZFP, TALEN i/ili CRIPSR/Cassistem iz ovoga pronalaska. Ovaj komplet hemikalija može da sadrži nukleinske-kiseline koje kodiraju ZFP, TALEN ili CRISPR/Cas-sistem (na primer, RNA molekuli ili ZFP, TALEN ili Cas9 koji se nalaze u prikladnom ekspresionom vektoru) i konstruirana sgRNA ako je potrebna, ili alikvote nukleaznih belančevina, donor-molekula, prikladne ćelijske linije domaćine, instrukcije za provođenje postupaka iz ovoga pronalaska, i sl.
[0031] Ovi i drugi aspekti su razumljivi stručnjacima u svetlu ovog pronalaska kao celine.
1
KRATKI OPIS SLIKA
[0032]
Slika 1 prikazuje poravnanje sekvenca β-sličnog globinskog gena u regionu koji okružuje mutaciju bolesti srpastih ćelija (označeno u slici). Prikazane su (gornja i donja linija) hemoglobinske beta-sekvence sa mutacijom srpastih ćelija (HBB-srpasta, SEQ ID NO: 1); hemoglobin-beta (HBB, SEQ ID NO: 2); hemoglobin-delta (HBD, SEQ ID NO: 3); betahemoglobinski pseudo-gen (HBBP1, SEQ ID NO: 4); hemoglobin-epsilon (HBE1, SEQ ID NO: 5), hemoglobin-gama 1 (HBG1, SEQ ID NO: 6) i hemoglobin-gama 2 (HBG2, SEQ ID NO: 7). Rezultati analize aktivnosti Cel I su prikazani ispod poravnanja pet navedenih ZFN-parova.
Slika 2, paneli A i B, su gelovi koji prikazuju ugradnju sekvence specifikovane sa β-globinskim donorom u CD34+ ćelijama. Slika 2A (RFLP) prikazuje inserciju sekvence specifikovane sa βglobinskim donorom dok je insercija verifikovana prisustvom novog restrikcionog mesta prisutnog u donorskoj DNA. Slika 2B prikazuje rezultate ogleda pogrešno-sparenih baza sa Cel I (Cel I mismatch assay; Surveyor™, Transgenomic) koji demonstriraju prisutnost novih sekvenca koji stvaraju pogrešno-sparene baze. Procenat alela koji sadrže mutaciju (% NHEJ) je naveden u tekst sa desne strane gelova (prva kolona odgovara linijskom broju u gelovima). Brojevi se odnose na ZFN-kombinacije; unt: ne-transfektovana kontrola.
Slika 3 je grafički prikaz uloga koje KLF1 i BCL11A igraju u regulaciji ekspresije β- i gamaglobinskog gena. Ekspresija KLF1 stimuliše ekspresiju oba gena, BCL11a i β-globina. BCL11A-belančevina suprimira ekspresiju gama-globina.
Slika 4, paneli A – E, prikazuju gelove koji prikazuju rezultate Cel I ogleda kao šta je ovde opisan nakon tretmana HSC sa indiciranim BCL11A- (Slika 4A), KLF1- (Slike 4C i 4D) ili HPRT- (Slika 4B) specifičnih ZFN i tretiranje transdukovanih ćelija sa kratkim hipotermičkim šokom (30° C) ili u standardnim uslovima (37° C). DNA je sakupljena 3 dana nakon transfekcije. Slika 4E prikazuje isti tip Cel I analize koja je provedena sa primercima koji su sakupljeni 3 dana nakon transfekcije HSC ili nakon 17 dana eritroidne diferencijacije. Procenat alela koji nose mutaciju (% NHEJ) je naveden na dnu linija, a identitet korištenih ZFN-parova je naveden u svakoj slici.
Slika 5, paneli A i B, prikazuju ekspresiju gama-globina upoređeno sa beta-globinom (Slika 5A) ili gama-globinske mRNA korigovane sa 18s RNA-standardom (Slika 5B) 7 ili 17 dana nakon diferencijacije kao šta je analizovano primenom Taqman<®>-procedure. Procenat gama-
1
globinske mRNA u odnosu na gama+beta-globinsku mRNA je prikazan iznad svakog stupca na Slici 5A. Na Slici 5B, relativan nivo gama-globina normalizovan uz pomoć 18s RNA je prikazan iznad stupaca i pokazuje da je nivo gama-globinske mRNA u odnosu na 18S veći u ćelijama koje su bile tretirane sa BCL11A-specifičnim ZFN.
Slika 6 prikazuje količinu gama-globinske mRNA u metilceluloznim kolonijama izvedenim iz HSC u zavisnosti o genotipu ćelija. Ćelije u kojima su BCL11A-geni divljeg-tipa ("BB") proizvode najnižu količinu gama-globinske mRNA upoređeno sa ćelijama koje sadrže pojedinačni BCL11A-alel koji je nokautiran ("Bb") ili su im oba alela nokautirana ("nokaut"). Brojevi iznad stupaca označavaju procenat gama-globina proizvedenog u ukupnom betaglobinu.
Slika 7 prikazuje serije DNA-sekvenca (SEQ ID NO: 140-148) regiona uzvodno od gamaglobinskog gena nakon tretmana sa gama-globin-specifičnim ZFN u K562-ćelijama. Pomenute sekvence sadrže brojne insercije i delecije uključujući i deleciju od 13 pb ("Δ13 pb") koja je identična sa onom povezanom sa ljudskim genotipima povezanim sa HPFH. 'Referentna' sekvenca na vrhu je sekvenca 5'-regulatornog regiona gama-globina divljeg-tipa. Vezna mesta ZFN-para su označena crvenim, a prirodna delecija od 13 pb je podcrtana.
Slika 8, paneli A - C, prikazuje Taqman-analizu eritroidnih kolonija izvedenih iz HSC tretiranih sa ZFN koji ciljaju gama-globinski promotor nakon uzgajanja na metilceluloznim kolonijama. Brojevi kolonija su navedeni na dnu svakog stupca kao šta je i genotip. Slika 8A prikazuje relativne omere gama/beta-globinske mRNA; Slika 8B prikazuje nivoe gamaglobinske mRNA korigovane za nivoe 18s RNA, a Slika 8C prikazuje odgovarajuću analizu beta-globinskih nivoa korigovanih za 18s. Uporedba proseka pomenutih omera za divlji-tip i za mutirane kolonije pokazuje da su gama-globinski nivoi u kolonijama sa ZFN-indukovanim mutacijama u gama-globinskom promotoru povećani.
Slika 9 prikazuje promotorski region gama-globinskog gena (SEQ ID NO: 149-152). Dva gama-globinska alela su poravnata (HBG1 i HBG2). Razlike u sekvencama između oba alela su označene sa sivim kutijama. Osim toga, mutacije koje su povezane sa HPFH su označene sa crnim crtama. Naveden su početni ATG i granice egzona 1. Porast nivoa fetalnog globina povezan sa svakom mutacijom je naveden sa brojem iznad.
Slika 10, paneli A i B, označava količinu NHEJ (tj., razaranje ciljanog lokusa koje rezultuje nakon popravka nukleazom-ciljanog loma nakon NHEJ-reakcije) i gensku korekciju koja je otkrivena kod beta-globinskog gena u CD34<+>-ćelijama uz pomoć navedene zinc-finger nukleaze i oligonukleotidnih donora.
1
Slika 11 prikazuje količinu NHEJ i ciljanu ugradnju donorskog nukleotida u CD34<+>-ćelijama pri čemu dužina homolognih ruku donora varira.
Slika 12 prikazuje perzistenciju genskog editiranja u eritroidnim derivatima matičnih ćelija koje su bile tretirane sa ZFN i oligonukleotidnim donorom. Genska modifikacija je analizovana u četiri tipa ćelijskih populacija izraslih nakon diferencijacije, jedinice koje formiraju kolonije, eritroidne ("CFU-E") jedinice, burst-forming jedinice, eritroidne ("BFU-E") jedinice, jedinice koje formiraju kolonije, granulociti/makrofagi ("CFU-GM") i jedinice koje formiraju kolonije, granulociti/eritrociti/monociti/makrofagi ("CFU-GEMM").
Slika 13 prikazuje stabilnost genske modifikacije beta-globinskog gena tokom vremena.
DETALJAN OPIS
[0033] Ovde su opisani postupci i kompozicije za studiranje i tretiranje neke genske bolesti poput hemoglobinopatije. Ovaj pronalazak opisuje genomsko editiranje ciljane ćelije tako da se ostvari korisna promena u ekspresiji jednog ili više globinskih gena, koje sa svoje strane rezultuje tretmanom hemoglobinopatije poput bolesti srpastih ćelija ili neke talasemije u nekom subjektu u potrebi. Korisne promene u ekspresiji globinskog gena uključuju, ali bez ograničenja, obezbeđivanje γ-globinskog gena nekom subjektu sa aberantnim β-globinom; i/ili korekciju sekvence aberantnog α- ili β-globinskog gena. Osim toga, dostava izmenjenih hematopoetskih matičnih ćelija u transplantu koji je izmenjen tako da eksprimirala željenu belančevinu može da bude takođe korisna kod tretiranja neke hemoglobinopatije poput anemije usled bolesti srpastih ćelija ili talasemije. Takođe, ovde su opisane ćelijske linije i životinje sa izmenjenom ekspresijom globina.
[0034] Tako, ovde opisani postupci i kompozicije mogu da se primenjuju sa ciljem da se menja ekspresija jednog ili više globinskih gena (na primer, γ, α i/ili β) u ćeliji (na primer, eritroidna prekursorska ćelija). Ovi postupci i kompozicije mogu da se koriste za razaranje gena uključenih u represiji γ-globina (na primer, BCL11A ili KLF1), tako da nakon editiranja pomenute ćelije mogu da eksprimiraju γ-globin na višim nivoima, a HbF može da se proizvodi. Alternativno, editiranje može da se koristi za razaranje veznog mesta u nekom genu (na primer, onemogućavanje vezanja BCL11A u beta-globinskom lokusu, onemogućavanje vezanja represora gama-globinske transkripcije na gama-globinskom promotoru) sa ciljem da se onemogući represija nekog gena. Alternativno ili kao dodatak ovim izmenama, ovi postupci i
1
kompozicije mogu da se koriste za korekciju aberantnog endogenog α- i/ili β-globinskog gena ili za ugrađivanje gena divljeg-tipa u željenu lokaciju u genomu ćelije (na primer, u HSC). Prekursorske ćelije mogu da se izvedu iz subjekata u potrebi, modifikuju ex vivo, a tada vrate u pomenuti subjekt kao kalem koštane srži.
Opšti opis
[0035] Praktikovanje ovih postupaka, kao i priprema i primena ovde opisanih kompozicija podrazumevaju korišćenje, osim ako je drugačije navedeno, konvencionalnih tehnika molekularne biologija, biohemije, analize hromatinske strukture, kompjuterske hemije, ćelijske kulture, tehnike rekombinantne DNA i slična područja koja su poznata stručnjaku. Ove tehnike su objašnjene u literaturi. Vidi, na primer, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i treće izdanje, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 i periodina izdanja; serije METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, treće izdanje, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman & A. P. Wolffe, ur.), Academic Press, San Diego, 1999; i METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol.119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ur.) Humana Press, Totowa, 1999.
Definicije
[0036] Termini "nukleinska-kiselina", "polinukleotid", i "oligonukleotid" se koriste kao sinonimi, a odnose se na deoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili cirkularnoj konformaciji, u jedno- ili dvo-lančanoj formi. Za potrebe ovoga pronalaska, ovi termini nisu zamišljeni da ograničavaju dužinu polimera. Pomenuti termini mogu da obuhvataju poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u bazi, šećeru i/ili fosfatu (na primer, okosnice fosforotioata). Opšte uzeto, neki analog nekog određenog nukleotida ima istu baznu-specifičnost; tj., neki analog A će se sparivati sa T.
[0037] Termini "polipeptid", "peptid" i "belančevina" su sinonimi i odnose se na polimer amino-kiselinskih ostataka. Pomenuti termin takođe vredi i za amino-kiselinske polimere u
1
kojima jedna ili više amino-kiselina predstavljaju hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajućih prirodnih amino-kiselina.
[0038] "Vezanje" se odnosi na sekvenca-specifičnu, ne-kovalentnu interakciju između makromolekula (na primer, između neke belančevine i neke nukleinske-kiseline). Ne moraju sve komponente veznih interakcija da budu sekvenca-specifične (na primer, kontakti sa fosfatnim ostacima u DNA okosnici), sve dok je pomenuta interakcija kao celina sekvencaspecifična. Takve interakcije su generalno karakterizovane uz pomoć disocijacijske konstante (Kd) od 10<-6>M<-1>ili niže. "Afinitet" se odnosi na snaga vezanja: povećani vezni afinitet u korelaciji je sa nižim Kd.
[0039] "Vezna belančevina" je belančevina koja je sposobna da se ne-kovalentno veže na neki drugi molekul. Vezna belančevina može da se veže na, na primer, DNA-molekul (DNA-vezna belančevina), RNA-molekul (RNA-vezna belančevina) i/ili na drugu belančevinu (proteinvezna belančevina). U slučaj protein-vezne belančevine, pomenuta može da se veže na samu sebe (tada se formiraju homodimeri, homotrimeri, itd.) i/ili može da se veže na jedan ili više molekula različite/ih belančevine/belančevina. Vezna belančevina može da poseduje više od jednog tipa vezne aktivnosti. Na primer, zinc-finger belančevine imaju DNA-veznu, RNA-veznu i protein-veznu aktivnost.
[0040] "Zinc-finger DNA-vezna belančevina" (ili vezni domen) je belančevina, ili domen unutar veće belančevine, koji veže DNA na sekvenca-specifičan način preko jednog ili više zink-prstiju, koji su regioni amino-kiselinske sekvence unutar veznog domena čija se struktura stabilizuje preko koordinacije sa cinkovim jonom. Termin zinc-finger DNA-vezna belančevina se često skraćuje kao zinc-finger belančevina ili ZFP.
[0041] "TALE DNA-vezni domen" ili "TALE" je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE-ponovljenih domena/jedinica. Pomenuti ponovljeni domeni su uključeni u vezanju TALE na svoju prirodnu ciljnu DNA-sekvencu (metu). Pojedinačna "ponovljena jedinica" (takođe poznata kao "ponavljanje") tipično je duga 33-35 amino-kiselina i poseduje barem određenu sekvencijsku homologiju sa drugim TALE-ponovljenim sekvencama u prirodnoj TALE-belančevini. Vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju br.20110301073.
2
[0042] Zinc-finger i TALE-vezni domeni mogu da se "konstruiraju" tako da vežu pre-određenu nukleotidnu sekvencu, na primer primenom inženjeringa (menjanjem jedne ili više aminokiselina) regiona sa heliksom za prepoznavanje iz prirodnih zinc-finger ili TALE-belančevina. Prema tome, konstruirane DNA-vezne belančevine (zinc-finger ili TALE) su belančevine koje nisu prirodne. Ne-ograničavajući primeri za postupke za inženjering DNA-veznih belančevina su dizajn i selekcija. Dizajnirana DNA-vezna belančevina je belančevina koja nije prirodna i čiji dizajn/kompozicija rezultuju uglavnom iz primene racionalnih kriterijuma. Racionalni kriterijumi za dizajn uključuju primenu i supstituciju pravila i kompujuterizovane algoritme za procesiranje informacija u bazi podataka koja čuva informacije o postojećim ZFP i/ili TALE-dizajnima i veznim podacima. Vidi, na primer, US patente 6,140,081; 6,453,242; i 6,534,261; vidi takođe dokumente WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496 i U.S. publikaciju br.20110301073.
[0043] "Selektirana" zinc-finger belančevina ili TALE je belančevina koja nije prirodna i čija konstrukcija rezultuje primarno iz empirijskog procesa poput fag-display, interaction-trap ili selekcije hibrida. Vidi, na primer, dokumente US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084 i U.S. publikaciju br.20110301073.
[0044] "Rekombinacija" se odnosi na proces izmene genetičke informacije između dva polinukleotida. Za potrebe ovoga pronalaska, "homologna rekombinacija" (HR) se odnosi na specijalizovanu formu takve izmene koja nastupa, na primer, tokom popravka dvolančanog loma u ćelijama preko mehanizmima popravka koji su usmereni homologijom. Ovaj proces zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi "donor"-molekul kao matricu za popravak "ciljanog"-molekula (tj., onaj lanac koji sadrži dvolančani lom), a ponekad je poznat kao "genska konverzija bez krosingovera" ili "genska konverzija kratkih isečaka" zato jer dovodi do prenosa genetičke informacije sa donora na metu (kalup). Bez da se vezujemo na bilo koju teoriju, takav prenos može da podrazumeva korekciju pogrešno sparenih-baza u heterodupleksu (DNA) koji nastaje između slomljene mete i donora, i/ili "slepljivanje lanaca zavisno o sintezi" gde se donor koristi sa ciljem da se re-sintetizuje genetička informacija koja će postati deo mete, i/ili neke slične procese. Takva specijalizovana HR često rezultuje promenom sekvence ciljnog molekula (mete) tako da se deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida ugrađuje u ciljani polinukleotid.
[0045] U nekim postupcima iz ovoga pronalaska, jedna ili više ciljanih nukleaza, kao šta je ovde opisano, uvode dvolančani lom u ciljnu sekvencu (na primer, ćelijski hromatin) u predodređenom mestu, a "donorski" polinukleotid, koji poseduje homologiju prema nukleotidnoj sekvenci iz regiona loma, može da se ugradi u ćeliju. Pokazano je da prisutnost dvolančanog lom ubrzava ugradnju donorske sekvence. Pomenuta donorska sekvenca može da bude fizički ugrađena ili, alternativno, pomenuti donorski polinukleotid se koristi kao matrica za popravak loma uz pomoć homologne rekombinacije, koje rezultuje uvođenjem cele ili dela nukleotidne sekvence iz donora u ćelijski hromatin. Tako, prva sekvenca u ćelijskom hromatinu može da se promeni i, u nekim izvedbama, može da se konvertuje u sekvencu koja je prisutna u donorskom polinukleotidu. Tako, upotreba termina "zameni" ili "zamena" treba da se tumači kao zamena jedne nukleotidne sekvence sa drugom, (tj., zamena neke sekvence u smislu prenosa informacije) i ne zahteva obaveznu fizičku ili hemijsku zamenu jednog polinukleotida sa drugim.
[0046] U bilo kojem od ovde opisanih postupaka, dodatni parovi zinc-finger ili TALEN-belančevina mogu da se koriste za dodatno uvođenje dvolančanih lomova u dodatnim metama u ćeliji. Osim toga, CRISPR/Cas-sistem može na sličan način da se primeni za uvođenje dodatnih dvolančanih lomova.
[0047] U postupcima za ciljanu rekombinaciju i/ili zamenu i/ili promenu neke sekvence u regionu od interesa u ćelijskom hromatinu, neka hromosomska sekvenca je promenjena uz pomoć homologne rekombinacije sa nekom egzogenom "donorskom" nukleotidnom sekvencom. Takva homologna rekombinacija je stimulisana prisutnošću dvolančanog loma u ćelijskom hromatinu, ako su prisutne sekvence koje su homologne sa pomenutim regionom loma.
[0048] U bilo kojem od ovde opisanih postupaka, pomenuta egzogena nukleotidna sekvenca ("donor-sekvenca" ili "transgen") može da sadrži sekvence koje su homologne, ali nisu identične, genomskim sekvencama iz regiona od interesa, pri čemu dolazi do stimulisanja homologne rekombinacije sa ciljem ugrađivanja ne-identične sekvence u region od interesa. Tako, u nekim izvedbama, delovi donorske sekvence koji su homologni sa sekvencama u pomenutom regionu od interesa poseduju između oko 80 do 99% (ili bilo koji celi broj između navedenih vrednosti) sekvencne identičnosti u odnosu na genomsku sekvencu koja se menja. U drugim izvedbama, pomenuta homologija između donorske i genomske sekvence je veća od 99%, na primer ako se razlikuje samo 1 nukleotid između donorske i genomske sekvence od preko 100 kontinuiranih baznih parova. U nekim slučajevima, ne-homologni deo donorske sekvence može da sadrži sekvence koje nisu prisutne u regionu od interesa, tako da se nove sekvence uvode u region od interesa. U nekim instancama, pomenuta ne-homologna sekvenca je generalno obrubljena sa sekvencama od 50-1000 baznih parova (ili bilo koja integralna vrednost između njih) ili bilo koji broj baznih parova koji je veći od 1000, koji su homologni ili identični sa sekvencama u regionu od interesa. U drugim izvedbama, donorska sekvenca je ne-homologna u odnosu na prvu sekvencu, a ugrađuje se u genom uz pomoć mehanizama nehomologne rekombinacije.
[0049] Bilo koji postupci, koji su ovde opisani, mogu da se koriste za delomičnu ili kompletnu inaktivaciju jedne ili više ciljanih sekvenca u nekoj ćeliji uz pomoć ciljane ugradnje donorske sekvence koja prekida ekspresiju nekog gena (ili više njih) od interesa. Ovde su takođe opisane ćelijske linije sa delomično ili kompletno inaktivisanim genima.
[0050] Nadalje, postupci ciljane integracije, kao šta su ovde opisani, mogu takođe da se koriste za ugradnju jedne ili više egzogenih sekvenca. Pomenute egzogene sekvence nukleinskekiseline mogu da nose, na primer, jedan ili više gena ili cDNA-molekula, ili bilo koji tip kodirajuće ili ne-kodirajuće sekvence, kao i jedan ili više kontrolnih elemenata (na primer, promotori). Osim toga, pomenute egzogene sekvence nukleinske-kiseline mogu da proizvode jedan ili više RNA-molekula (na primer, small-hairpin RNA (shRNA), inhibitorne RNA (RNAis), mikroRNA (miRNA), itd.).
[0051] "Cepanje" se odnosi na lom (pucanje) kovalentne okosnice DNA molekula. Cepanje može da se inicira uz pomoć brojnih postupaka uključujući, ali bez ograničenja, encimsku ili hemijsku hidroliza fosfodiesterske veze. Mogući su jednolančani i dvolančani lomovi (cepanja), a dvolančani lom može da nastupi kao rezultat odvojenih jednolančanih lomova. DNA-cepanje može da rezultuje pojavom tupih krajeva ili produženih krajeva. U nekim izvedbama, fuzioni polipeptidi se koriste za ciljano uvođenje dvolančanih lomova u DNA.
[0052] "Polu-domen za cepanje" je polipeptidna sekvenca koja, zajedno sa nekim drugim
2
polipeptidom (identičan ili različit) formira kompleks koji poseduje aktivnost cepanja (preferirano, aktivnost uvođenja dvolančanog loma). Termini "prvi i drugi polu-domeni za cepanje", "+ i - polu-domeni za cepanje" i "desni i levi polu-domeni za cepanje" se koriste kao sinonimi, a odnose se na parove polu-domena za cepanje koji mogu da stvaraju dimere.
[0053] "Konstruiran polu-domen za cepanje" je polu-domen za cepanje koji je modifikovan tako da formira obligatne heterodimere sa drugim polu-domenom za cepanje (na primer, drugi konstruirani polu-domen za cepanje). Vidi, takođe, U.S. patentne publikacije br.2005/0064474, 2007/0218528, 2008/0131962 i 2011/0201055.
[0054] Termin "sekvenca" se odnosi na neku nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može da bude DNA ili RNA; može da bude linearna, cirkularna ili razgranata i može da bude jednolančana ili dvolančana. Termin "donorska sekvenca" se odnosi na neku nukleotidnu sekvencu koja je ugrađena u genom. Donorska sekvenca može da bude bilo koje dužine, na primer između 2 i 10000 nukleotida dužine (ili bilo koji celi broj između ili iznad pomenutih vrednosti), preferirano između oko 100 i 1000 nukleotida dužine (ili bilo koji celi broj između njih), bolje između oko 200 i 500 nukleotida dužine.
[0055] "Gen povezan sa bolešću" je onaj gen koji je oštećen na neki način uzrokujući monogensku bolesti. Ne-ograničavajući primeri za monogenske bolesti uključuju tešku kombinovanu imunodificijenciju, cističnu fibrozu, lizosomalne bolesti nakupljanja (na primer, Gaucher-ova, Hurler-ova, Hunter-ova, Fabry-eva, Neimann-Pick-ova, Tay-Sach-ova bolest, itd.), anemiju srpastih ćelija, i talasemiju.
[0056] "Hromatin" je nukleoproteinska struktura koji sadrži ćelijski genom. Ćelijski hromatin sadrži nukleinsku-kiselinu, primarno DNA, i belančevine, uključujući histonske i ne-histonske hromosomske belančevine. Većina eukariotskog ćelijskog hromatina postoji u formi nukleosoma, dok nukleosomsko jezgro prekriva približno 150 pb DNA omotanih oko oktamera koji sadrži po dve molekule od svakog histona H2A, H2B, H3 i H4; a linkerska DNA (čija dužina varira u zavisnosti o organizmu) se proteže između nukleosomskih jezgara. Molekul histona H1 je generalno povezan sa linkerskom DNA. Za potrebe ovoga pronalaska, termin "hromatin" obuhvata sve tipove ćelijskih nukleobelančevina, prokariotskih i eukariotskih. Ćelijski hromatin uključuje hromosomski i episomalni hromatin.
[0057] "Hromosom" je hromatinski kompleks koji sadrži sve ili delove genoma u ćeliji. Genom ćelije je često okarakterizovan sa svojim kariotipom, koji je kolekcija svih hromosoma koji čine genom ćelije. Genom ćelija može da sadrži jedan ili više hromosoma.
[0058] "Episom" je replicirajuća nukleinska-kiselina, kompleks nukleobelančevina ili drugih struktura koji sadrži nukleinsku kiselina koja nije deo hromosomskog kariotipa ćelije. Primeri episoma uključuju plazmide i određene viralne genome.
[0059] "Ciljano mesto (meta)" ili "ciljana sekvenca" je sekvenca nukleinske-kiseline koja definiše neki deo neke nukleinske-kiseline za koji se veže vezni molekul, pod uslovom da su obezbeđena odgovarajuća stanja potrebna za vezanje.
[0060] "Egzogen" je molekul koji nije prirodno prisutan u ćeliji, ali može da se uvede u neku ćeliju primenom jednog ili više genetičkih, biohemijskih ili drugih postupaka. "Prirodno prisutan u ćeliji" se definiše uzimajući u obzir tačno određenu razvojnu fazu i okolišne uslove ćelije. Tako, na primer, neki molekul koji je prisutan samo tokom embrionskog razvoja mišića je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju odraslog mišića. Slično, molekul koji je indukovan toplotnim šokom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije pod toplotnim šokom. Egzogeni molekul može da obuhvata, na primer, funkcionalnu verziju ne-funkcionalnog endogenog molekula ili ne-funkcionalnu verziju normalno-funkcionirajućeg endogenog molekula.
[0061] Neki egzogeni molekul može da bude, između ostalog, mali molekul, poput takvog koji je generisan primenom kombinovanog hemijskog procesa, ili makromolekul poput neke belančevine, nukleinske-kiseline, karbohidrata, lipida, glikoproteina, lipoproteina, polisaharida, bilo kojeg modifikovanog derivata iznad pomenutih molekula, ili bilo kojeg kompleksa koji sadrži jedan ili više od iznad pomenutih molekula. Nukleinske-kiseline uključuju DNA i RNA, mogu da budu jedno- ili dvolančane; mogu da budu linearne, razgranate ili cirkularne; i bilo koje dužine. Nukleinske-kiseline uključuju one koje su sposobne da formiraju duplekse, kao i takve koje mogu da formiraju triplekse. Vidi, na primer, U.S. patente br. 5,176,996 i 5,422,251. Belančevine uključuju, ali bez ograničenja, DNA-vezne belančevine, transkripcijske faktore, hromatin-remodelirajuće faktore, metilovane DNA-vezne belančevine,
2
polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, rekombinaze, ligaze, topoizomeraze, giraze i helikaze.
[0062] Egzogeni molekul može da bude isti tip molekula kao i endogeni molekul, na primer, neka egzogena belančevina ili nukleinska-kiselina. Na primer, egzogena nukleinska-kiselina može da sadrži inficirajući viralni genom, plazmid ili episom koji je uveden u ćeliju, ili hromosom koji nije prirodno prisutan u ćeliji. Postupci za uvođenje egzogenih molekula u ćelije su poznati stručnjacima i uključuju, ali bez ograničenja, lipid-posredovani transfer (tj., liposomi, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktno injektiranje, ćelijsku fuziju, bombardiranje česticama, ko-precipitaciju sa kalcijum fosfatom, DEAE-dekstran-posredovani transfer i transfer posredovan viralnim vektorom. Egzogeni molekul može takođe da bude istog tipa kao i endogeni molekul, ali izveden iz različite vrste. Na primer, sekvenca ljudske nukleinske-kiseline može da se uvede u ćelijsku liniji koja je početno izvedena iz miša ili hrčka.
[0063] Suprotno, "endogeni" molekul je takav da je prirodno prisutan u nekoj ćeliji u određenom razvojnom stadijumu u određenim okolišnim uslovima. Na primer, neka endogena nukleinska-kiselina može da bude neki hromosom, genom mitohondrija, hloroplasta ili drugih organela, ili prirodna episomalna nukleinska-kiselina. Dodatni endogeni molekuli uključuju belančevine, na primer, transkripcijske faktore i encime.
[0064] "Fuzioni" molekul je molekul u kojem su spojene dve ili više molekulskih pod-jedinica, preferirano kovalentno. Pomenuti molekuli pod-jedinica mogu da budu istog hemijskog tipa, ili različitog hemijskog tipa. Primeri za prvi tip fuzionog molekula uključuju, ali bez ograničenja, fuzione belančevine (na primer, fuziju između ZFP ili TALE DNA-veznog domena i jednog ili više aktivacionih domena) i fuzione nukleinske-kiseline (na primer, nukleinska-kiselina koji kodira fuzionu belančevinu ovde je opisana supra). Primeri za drugi tip fuzionog molekula uključuju, ali bez ograničenja, fuziju nukleinske-kiseline koja formira tripleks i nekog polipeptida, i fuziju između veznika malog utora i nukleinske-kiseline.
[0065] Ekspresija fuzione belančevina u ćeliji rezultuje pojavom fuzione belančevine u ćeliji ili pojavom polinukleotida koji kodira pomenutu fuzionu belančevinu u ćeliji, pri čemu pomenuti polinukleotid je transkribiran, a transkript je translatiran koje dovodi do proizvodnje
2
fuzione belančevine. Trans-splajsovanje, cepanje polipeptida i ligacija polipeptida mogu takođe da budu deo ekspresije pomenute belančevine u ćeliji. Postupci za dostavu polinukleotida i polipeptida u ćeliju su predstavljeni na drugom mestu u ovom pronalasku.
[0066] "Gen", za potrebe ovoga pronalaska, uključuje DNA-region koji kodira neki genski produkt (vidi infra), kao i sve DNA-regione koji regulišu proizvodnju genskog produkta, bez obzira na to da li su pomenute regulacione sekvence susedne kodirajućim i/ili transkribirajućim sekvencama. Prema tome, gen uključuje, ali bez ograničenja, promotorske sekvence, terminatore, sekvence koje regulišu translaciju poput ribosomskih veznih mesta i internnih ribosomskih ulaznih mesta, pojačivače, utišavaće, izolatore, vezne elemente, mesta početka replikacije, mesta za vezanje na matricu i kontrolni regioni lokusa.
[0067] "Genska ekspresija" se odnosi na konverziju informacije, koja se nalazi u genu, u neki genski produkt. Genski produkt može da bude direktni produkt transkripcije gena (na primer, mRNA, tRNA, rRNA, antisense-RNA, ribozim, strukturna RNA ili bilo koji drugi tip RNA) ili belančevina koja je proizvedena translacijom neke mRNA. Genski produkti takođe uključuju RNA koje su modifikovane uz pomoć procesa poput kapiranja (capping), poliadenilacije, metilacije, i editiranja, i belančevine modifikovane uz pomoć, na primer, metilacije, acetilacije, fosforilacije, ubikvitinacije, ADP-ribozilacije, miristilacije, i glikozilacije.
[0068] "Modulacija (posredovanje)" genske ekspresije se odnosi na promenu aktivnosti nekog gena. Modulacija ekspresije može da uključuje, ali bez ograničenja, gensku aktivaciju i gensku represiju. Genomsko editiranje (na primer, cepanje, izmena, inaktivacija, nasumična mutacija) mogu da se koriste sa ciljem moduliranja ekspresije. Genska inaktivacija se odnosi na bilo koju redukciju genske ekspresije upoređeno sa ćelijom u kojoj nema delovanja ZFP ili TALEN kao šta je ovde opisano. Tako, genska inaktivacija može da bude delomična ili kompletna.
[0069] "Region od interesa" je bilo koji region ćelijskog hromatina, poput, na primer, neki gen ili ne-kodirajuća sekvenca unutar ili blizu nekog gena, za koju je poželjno vezati neki egzogeni molekul. Vezanje može da ima za namenu ciljano cepanje DNA i/ili ciljanu rekombinaciju. Region od interesa može da bude prisutan u hromosomu, episomu, genomu organela (na primer, mitohondrij, hloroplast), ili neki inficirajući viralni genom, na primer. Region od interesa može da se nalazi unutar kodirajućeg dela nekog gena, unutar transkribiranih ne-
2
kodirajućih regiona poput, na primer, vodećih (leader)-sekvenca, trailer-sekvenca ili introna, ili unutar ne-transkribiranih regiona, uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. Region od interes može da bude malen poput jednog nukleotidnog para ili do 2000 nukleotidnih parova dužine, ili bilo koja integralna vrednost nukleotidnih parova.
[0070] "Eukariotske" ćelije uključuju, ali bez ograničenja, ćelije gljiva (poput kvasca), biljne ćelije, životinjske ćelije, ćelije sisara i ljudske ćelije (na primer, T-ćelije).
[0071] "Crvene krvne ćelije" (RBC), ili eritrociti, su terminalno diferencirane ćelije izvedene iz hematopoetskih matičnih ćelija. Nemaju jezgro i većinu ćelijskih organela. RBC sadrže hemoglobin za prenos kiseonika iz pluća u periferna tkiva. U stvari, 33% od volumena jedne RBC otpada na hemoglobin. Ove ćelije takođe iznose CO2, koji se proizvodi u ćelijama tokom metabolizma, iz tkiva i prenose nazad u pluća kako bi se oslobodio tokom izdisaja. RBC se proizvode u koštanoj srži kao odgovor na hipoksiju u krvi koje je posredovano oslobađanjem eritropoietina (EPO) iz bubrega. EPO uzrokuje povećanje broja pro-eritroblasta i skraćuje vreme potrebno za puno sazrevanje RBC. Nakon približno 120 dana, kada RBC ne sadrže jezgro ili bilo kakvu regenerativnu sposobnost, pomenute ćelije se odstranjuju iz cirkulacije ili fagocitnim delovanjem makrofaga u jetri, slezini i limfnim čvorovima (∼90%) ili hemolizom u plazmi (∼10%). Nakon delovanja makrofaga, hemijske komponente RBC se rastavljaju unutar vakuola makrofaga zbog delovanja lizosomalnih encima.
[0072] "Tkiva koja izlučuju" su ona tkiva u životinjama koja izlučuju produkte iz pojedinačnih ćelija u neki lumen koji je tipično izveden iz epitelskog tkiva. Primeri za tkiva koja izlučuju i koja su lokalizovana u gastrointestinalnom trakt uključuju ćelije koje obrubljuju crevo, pankreas, i žičnu kesu. Druga sekretorna tkiva uključuju jetru, tkiva povezana sa okom i mukozne membrane poput pljuvačne žlezde, mlečne žlezde, prostate, hipofize i druge članove endokrinog sistema. Osim toga, sekretorna tkiva uključuju pojedinačne ćelije nekog tkiva koje su sposobne za sekreciju.
[0073] Termini "operativno spajanje" i "operativno povezani" (ili "funkcionalno povezani") su sinonimi i označavaju neposrednu spojenost dve ili više komponenta (poput elemenata sekvence), pri čemu su komponente raspoređene tako da obe komponente funkcionišu normalno i ostavljaju mogućnost da barem jedna od komponenti posreduje funkciju koja je
2
uspostavljena u berem jednoj od drugih komponenti. Kao ilustracija, transkripciona regulaciona sekvenca, poput nekog promotora, je operativno spojena na kodirajuću sekvencu ako pomenuta transkripciona regulaciona sekvenca kontroliše nivo transkripcije same kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više transkripcijskih regulacionih faktora. Neka transkripciona regulaciona sekvenca je generalno operativno spojena u položaju cis sa kodirajućom sekvencom, ali ne mora da bude direktno pripojena na nju. Na primer, neki pojačivač je transkripciona regulaciona sekvenca koja je operativno spojena na kodirajuću sekvencu, čak i ako obe ne ostvaruju kontinuirani redosledu.
[0074] Šta se tiče fuzionih polipeptida, termin "operativno spojena" može da se odnosi na to da svaka od komponenti izvodi istu funkciju u spoju sa drugom komponentom kao i kada da bi bile tako spojene. Na primer, kada se govori o fuzionom polipeptidu u kojem je ZFP, TALE ili Cas DNA-vezni domen fuzionisan na domen za aktivaciju, pomenuti ZFP, TALE ili Cas DNA-vezni domen i domen za aktivaciju su operativno spojeni ako, u fuzionom polipeptidu, deo sa pomenutom ZFP, TALE ili Cas DNA-veznom domenu je sposoban da se veže na svoju metu i/ili svoje vezno mesto, dok je domen za aktivaciju sposoban da pozitivno reguliše gensku ekspresiju. Kada neki fuzioni polipeptid u kojem je ZFP ili TALE DNA-vezni domen fuzionisan na domen za cepanje, pomenuti ZFP ili TALE DNA-vezni domen i domen za cepanje su operativno spojeni ako je, u fuzionom polipeptidu, deo sa pomenutom ZFP ili TALE DNA-veznom domenu sposoban da veže svoju metu i/ili svoje vezno mesto, dok je domen za cepanje sposoban da pocepa DNA u blizini ciljnog mesta.
[0075] "Funkcionalni fragment" neke belančevine, polipeptida ili nukleinske-kiselina je neka belančevina, polipeptid ili nukleinska-kiselina čija sekvenca nije identična sa sekvencom belančevine, polipeptida ili nukleinske-kiseline pune dužine, ali ipak zadržava istu funkciju kao i pomenuta belančevina, polipeptid ili nukleinska-kiselina pune dužine. Funkcionalni fragment može da sadrži više, manje, ili isti broj ostataka kao i odgovarajući nativni molekul, i/ili može da sadrži jednu ili više amino-kiselinskih ili nukleotidnih supstitucija. Postupci za određivanje funkcije neke nukleinske-kiseline (na primer, kodirajuća funkcija, sposobnost da hibridizuje sa drugom nukleinskom-kiselinom) su dobro poznati stanju tehnike. Slično, postupci za određivanje funkcije belančevina su takođe dobro poznati. Na primer, DNA-vezna funkcija nekog polipeptida može da se odredi, na primer, primenom vezanja na filteru (filter-binding), pomaka elektroforetske mobilnosti, ili ogleda imunoprecipitacije. Cepanje DNA može da se
2
testira primenom gel-elektroforeze. Vidi Ausubel et al., supra. Sposobnost neke belančevine da reaguje sa drugom belančevinom može da se odredi, na primer, primenom koimunoprecipitacije, testovima ili komplementacijom two-hybrid, genetički i biohemijski. Vidi, na primer, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; U.S. patentni br.5,585,245 i dokument PCT WO 98/44350.
[0076] "Vektor" je sposoban za prenos genskih sekvenca u ciljne ćelije. Tipično, "vektorski konstrukt" "vektor za ekspresiju", i "vektor za genski transfer", označava bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji je sposoban za usmeravanje ekspresije nekog gena od interesa i koji može da prenese genske sekvence u ciljane ćelije. Tako, pomenuti termin uključuje prenosnike za kloniranje, i ekspresiju, kao i vektore za integraciju.
[0077] "Reporter gen" ili "reporterska sekvenca" se odnosi na bilo koju sekvencu koja proizvodi proteinski produkt koji može da se meri, preferirano, ali ne i neophodno, primenom rutinskog testa. Prikladni reporter-geni uključuju, ali bez ograničenja, sekvence koje kodiraju belančevine koje omogućavaju rezistenciju na neki antibiotik (na primer, ampicilin, neomicin, G418, puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminiscentne belančevine (na primer, zelena fluorescentna belančevina, pojačana zelena fluorescentna belančevina, crvena fluorescentna belančevina, luciferaza), i belančevine koje posreduju pojačani ćelijski rast i/ili gensku amplifikaciju (na primer, dihidrofolat reduktaza). Epitop-privesci uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG, His, myc, Tap, HA ili bilo koje detektibilne amino-kiselinske sekvence. "Privesci za ekspresiju" uključuju sekvence koje kodiraju reportere koji mogu da budu operativno spojeni na željenu gensku sekvencu sa ciljem da se prati ekspresija gena od interesa.
[0078] Termini "subjekt" i "pacijent" su sinonimi, a odnose se na sisare poput ljudskih pacijenata i ne-ljudskih primata, kao i eksperimentalnih životinja poput zečeva, pasa, mačaka, pacova, miševa, i drugih životinja. Prema tome, termin "subjekt" ili "pacijent", kao šta se ovde koristi, označava bilo kojeg sisara (pacijenta ili subjekta) kome će se administrirati izmenjene RBC (ili matične ćelije) iz ovoga pronalaska. Subjekti iz ovoga pronalaska uključuju one koji su bili izloženi jednom ili više hemijskih toksina, uključujući, na primer, nervne toksine.
Nukleaze
[0079] Ovde su opisane kompozicije, naročito nukleaze, koje su korisne kod ciljanja nekog gena i koje su namenjene za upotrebu protiv hemoglobinopatija. U određenim izvedbama, pomenuta nukleaza je prirodni molekul. U drugim izvedbama, pomenuta nukleaza nije prirodan molekul, tj., njegov DNA-vezni domen i/ili domen za cepanje je konstruiran. Na primer, pomenuti DNA-vezni domen iz prirodne nukleaze može da se promeni kako bi mogao da veže izabrano ciljano mesto (na primer, meganukleaza koja je konstruirana da veže mesto koje je različito od njenog prirodnog veznog mesta). U drugim izvedbama, pomenuta nukleaza sadrži heterologne DNA-vezni domen i domen za cepanje (na primer, zinc-finger nukleaze; TAL-efektorske nukleaze; DNA-vezni domeni iz meganukleaze sa heterolognim domenima za cepanje), ili generička nukleaza koja je navođena uz pomoć specifične guide-RNA (na primer, CRPISR/Cas).
A. DNA-vezni domeni
[0080] U nekim aspektima iz ovoga pronalaska, pomenuta nukleaza je meganukleaza (homingendonukleaza). Prirodne meganukleaze prepoznaju mesta za cepanje od 15-40 pb, a uobičajeno su grupisane u četiri porodice: LAGLIDADG-porodica, GIY-YIG-porodica, His-Cyst-boxporodica i HNH-porodica. Primeri za homing-endonukleaze uključuju I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII. Njihove sekvence za prepoznavanje su poznate. Vidi takođe U.S. patent br. 5,420,032; U.S. patent br.6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 i katalog New England Biolabs.
[0081] U nekim aspektima ovoga pronalaska, pomenuta nukleaza sadrži konstruiranu (koja nije prirodna) homing-endonukleazu (meganukleaza). Sekvence prepoznavanja homingendonukleaza i meganukleaza poput I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SeeII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII i I-TevIII su poznate. Vidi takođe U.S. patent br.
5,420,032; U.S. patent br. 6,833,252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gen 82:115-118; Perler et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Gent.12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol.263:163-180; Argast
1
et al. (1998) J. Mol. Biol.280:345-353 i katalog New England Biolabs. Osim toga, DNA-vezna specifičnost homing-endonukleaza i meganukleaza može da bude tako konstruirana da veže neprirodna mesta. Vidi, na primer, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al.(2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; U.S. patentnu publikaciju br.
20070117128. DNA-vezni domeni homing-endonukleaza i meganukleaza mogu da se promene u kontekstu cele nukleaze (tj., tako da pomenuta nukleaza sadrži prirodni domen za cepanje) ili mogu da budu fuzionisani na heterologni domen za cepanje.
[0082] U drugim izvedbama, pomenuti DNA-vezni domen sadrži prirodni ili konstruirani (koji nije prirodan) DNA-vezni domen za TAL-efektor. Vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju br. 20110301073. Za biljne patogene bakterije iz rod Xanthomonas se zna da uzrokuju mnoge bolesti na važnim usevima. Patogenost Xanthomonas zavisi o konzerviranom sistemu sekrecije tip III (T3S) koji injektira više od 25 različitih efektorskih belančevina u biljnu ćeliju. Među ovim injektiranim belančevinama se nalaze i transkripcionom aktivatoru-slični efektori (TALE) koji oponašaju biljne transkripcione aktivatore i manipulišu biljni transkriptom (vidi Kay et al (2007) Science 318:648-651). Ove belančevine sadrže DNA-vezni domen i transkripcionoaktivacioni domen. Jedna od dobro karakterizovanih TALE je AvrBs3 iz Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (vidi Bonas et al (1989) Mol Gen Gent 218: 127-136 i dokument WO2010079430). TALE sadrži centralizovani domen tandemskih ponavljanja, od kojih svako sadrži približno 34 amino-kiselina koje su ključ za DNA-veznu specifičnost pomenutih belančevina. Osim toga, pomenute sadrže sekvencu za nuklearno lokalizovanje i kiseli transkripciono-aktivacioni domen (kao pregledni rad vidi Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Osim toga, u fitopatogenoj bakteriji Ralstonia solanacearum dva gena, označena kao brg11 i hpx17, su homologna sa AvrBs3-porodicom iz Xanthomonas u R. solanacearum biovaru 1 soja GMI1000 i u biovaru 4 soja RS1000 (Vidi Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Ovi geni su međusobno 98.9% identični u nukleotidnoj sekvenci, ali se razlikuju u deleciji od 1,575 pb u ponovljenom domenu iz hpx17. Međutim, oba genska produkta imaju manje od 40% sekvencne-identičnosti sa AvrBs3-porodicom belančevina iz Xanthomonas.
[0083] Tako, u nekim izvedbama, pomenuti DNA-vezni domen koji veže ciljno mesto u ciljnom lokusu (na primere, globin ili safe-harbor) je neki konstruirani domen iz TAL-efektora
2
koji je sličan sa onima koji su izvedeni iz biljnih patogena Xanthomonas (vidi Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 i Moscou & Bogdanove, (2009) Science 326: 1501) i Ralstonia (vidi Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384); U.S. patente br. 8,420,782 i 8,440,431 i U.S. patentnu publikaciju br.20110301073.
[0084] U nekim izvedbama, pomenuti DNA-vezni domen sadrži zinc-finger belančevinu (na primer, zinc-finger belančevinu koja veže metu u globinu ili safe-harbor genu). Preferirano, zinc-finger belančevina nije prirodna zbog toga šta je konstruirana tako da veže metu po izboru inženjera. Vidi, na primer, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.
10:411-416; U.S. patente br. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i U.S. patentne publikacije br.2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
[0085] Konstruirani zinc-finger vezni ili TALE-domen može da sadrži novu veznu specifičnost, ako se uporedi sa prirodnom zinc-finger belančevinom. Postupci inženjeringa uključuju, ali bez ograničenja, racionalni dizajn i brojne tipove selekcije. Racionalni dizajn uključuje, na primer, korišćenje baze podataka koje sadrže triplet- (ili kvadriplet-) nukleotidne sekvence i pojedinačne zinc-finger amino-kiselinske sekvence, u kojima svaka triplet- ili kvadripletnukleotidna sekvenca je povezana sa jednom ili više amino-kiselinskih zinc-finger-sekvenca koje vežu tačno određenu triplet- ili kvadriplet-sekvencu. Vidi, na primer, zajedničke U.S. patente 6,453,242 i 6,534,261.
[0086] Primeri za selekcijske postupke, uključujući fag-display i two-hybrid sisteme, ovde su opisani u US patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i u dokumentima WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Osim toga, pojačavanje vezne specifičnosti za zinc-finger vezne domene je ovde opisano, na primer, u zajedničkom dokumentu WO 02/077227.
[0087] Osim toga, kao šta je opisano u ovim i drugim referencama, DNA-domeni (na primer, zinc-finger belančevine sa više prstiju ili TALE-domeni) mogu da budu spojeni međusobno uz pomoć bilo koje prikladne linkerske sekvence, uključujući na primer, linkere od 5 ili više amino-kiselina u dužini. Vidi, takođe, U.S. patente br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 kao primere za linker-sekvence sa 6 ili više amino-kiselina u dužini. Pomenute DNA-vezne belančevine koje su ovde opisane mogu da uključuju bilo koju kombinacija prikladnih linkera između pojedinačnih zinc-prstiju iz same belančevine. Osim toga, ovde je opisano pojačavanje vezne specifičnosti za zinc-finger vezne domene, na primer, u zajedničkom dokumentu WO 02/077227.
[0088] Selekcija ciljnih mesta (meta); DNA-vezni domeni i postupci za dizajniranje i konstrukciju fuzionih belančevina (i polinukleotida koji kodiraju pomenute) su poznati stručnjacima, a ovde su opisani detaljno u U.S. patentima br.6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; dokumentima WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496 i u U.S. publikaciji br.20110301073.
[0089] Osim toga, kao šta je opisano u ovim i drugim referencama, DNA-vezni domeni (na primer, zinc-finger belančevine sa više prstiju) mogu da budu međusobno spojeni preko bilo koje prikladne linkerske sekvence, uključujući na primer, linkere od 5 ili više amino-kiselina u dužini. Vidi, takođe, U.S. patentne br.6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 kao primere za linkersekvence sa 6 ili više amino-kiselina u dužini. Pomenute belančevine koje su ovde opisane mogu da uključuju bilo koju kombinaciju prikladnih linkera između pojedinačnih zinc-prstiju iz belančevine.
B. Domeni za cepanje
[0090] Bilo koji prikladan domen za cepanje može da bude operativno spojen na DNA-vezni domen sa ciljem da se formira neka nukleaza. Na primer, ZFP DNA-vezni domeni su fuzionisani na nukleazne domene kako bi se kreirao ZFN-funkcionalan entitet koji je sposoban da prepozna ciljanu nukleinsku-kiselinu uz pomoć konstruiranog (ZFP) DNA-veznog domena i da uzrokuje da DNA bude pocepana blizu ZFP-veznog mesta uz pomoć nukleazne aktivnosti. Vidi, na primer, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160. Noviji podatak je da su ZFN bili korišćeni za modifikovanje genoma u brojnim organizmima. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474;
4
20060188987; 20060063231; i Internacionalnu publikaciju WO 07/014275. Isto tako, TALE DNA-vezni domeni su bili fuzionisani na nukleazne domene sa ciljem da se kreiraju TALEN. Vidi, na primer, U.S. publikaciju br.20110301073.
[0091] Kao šta je navedeno iznad, pomenuti domen za cepanje može da bude heterologan u odnosu na DNA-vezni domen, na primer zinc-finger DNA-vezni domen i neki domen za cepanje iz neke nukleaze ili neki TALEN DNA-vezni domen i neki domen za cepanje, ili meganukleaza DNA-vezni domen i domen za cepanje iz neke različite nukleaze. Heterologni domeni za cepanje mogu da potiču iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih domen za cepanje može da se izvede uključuju, ali bez ograničenja, restrikcione endonukleaze i homing-endonukleaze. Vidi, na primer, 2002-2003 Catalogue New England Biolabs, Beverly, MA; i Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388. Postoji još dodatnih encima koji cepaju DNA (na primer, S1-nukleaza; nukleaza iz zlatnog mungo pasulja (mung bean nuclease); DNaza I iz pankresa; mikrokokalna nukleaza; HO-endonukleaza iz kvasca; vidi takođe Linn et al. (ur.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Jedan ili više ovih encima (ili njihovih funkcionalnih fragmenata) mogu da se koriste kao izvor domena i polu-domena za cepanje.
[0092] Slično, polu-domen za cepanje može da se izvede iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kao šta je opisano iznad, koja zahteva dimerizaciju za aktivnost cepanja. Opšte uzeto, dve fuzione belančevine su potrebne za cepanje ako fuzione belančevine sadrže polu-domene za cepanje. Alternativno, može da se koristi jedna belančevina koji sadrži dva polu-domena za cepanje. Pomenuta dva polu-domena za cepanje mogu da se izvedu iz iste endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata), ili svaki polu-domen za cepanje može da se izvede iz različite endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata). Osim toga, mesta za ciljanje za dve fuzione belančevine su preferirano postavljena, jedno prema drugome, tako da vezanje dve pomenute fuzione belančevine na njihove odgovarajuće mete postavlja polu-domene za cepanje u prostornu orijentaciji koja im omogućava da budu okrenute jedna prema drugoj koje pak omogućava polu-domenima za cepanje da formiraju funkcionalni domen za cepanje, na primer, uz pomoć dimerizacije. Tako, u određenim izvedbama, bliski krajevi mete su odvojeni sa 5-8 nukleotida ili sa 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji integralni broj nukleotida ili nukleotidnih parova može da interveniše između dve mete (na primer, od 2 do 50 nukleotidnih parova ili više). Opšte uzeto, mesto za cepanje leži između meta.
[0093] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni encimi) su prisutan u mnogim vrstama, a sposobne su za sekvenca-specifično vezanje na DNA (na mestu prepoznavanja), nakon čega cepaju DNA u ili blizu veznog mesta. Određeni restrikcioni encimi (na primer, encimi tipa IIS) cepaju DNA u mestima koja su udaljena od mesta prepoznavanja i poseduju odvojene vezne domene i domene za cepanje. Na primer, encim tipa IIS Fok I katalizuje uvođenje dvolančanog loma u DNA i to 9 nukleotida od mesta prepoznavanje na jednom lancu i 13 nukleotida od mesta prepoznavanja na drugom lancu. Vidi, na primer, US patente 5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Tako, u jednoj izvedbi, fuzione belančevine sadrže domen za cepanje (ili polu-domen za cepanje) iz barem jednog restrikcionog encima tipa IIS i jedan ili više zinc-finger veznih domena, koji mogu, ali ne mora da budu konstruirani.
[0094] Primeri za restrikcione encime tipa IIS, čiji je domen za cepanje odvojen od veznog domena, je Fok I. Ovaj encim je aktivan kao dimer. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 10,570-10,575. Prema tome, za potrebe ovoga pronalaska, deo encima Fok I koji se koristi u ovde opisanim fuzionim belančevinama se smatra da je polu-domen za cepanje. Tako, za ciljano uvođenje dvolančanog loma i/ili ciljanu zamenu ćelijskih sekvenca uz pomoć fuzija zinc-finger-Fok I, mogu da se koriste dve fuzione belančevine, od kojih svaka sadrži poludomen za cepanje iz Fok I, sa ciljem da se dobije katalitički aktivan domena za cepanje. Alternativno, mogu da se koristi jedan polipeptidni molekul koji sadrži DNA-vezni domen i dva polu-domen za cepanje iz Fok I.
[0095] Domen ili polu-domen za cepanje može da bude bilo koji deo neke belančevine koji zadržava svoju aktivnost cepanja, ili koji zadržava svoju sposobnost da stvara multimere (na primer, dimere) sa ciljem da se formira funkcionalni domen za cepanje.
[0096] Primeri za restrikcione encime tipa IIS ovde su opisani u Internacionalnoj publikaciji WO 07/014275. Dodatni restrikcioni encimi takođe sadrže odvojene vezne domene i domene za cepanje, a pomenuti su obuhvaćeni sa ovim pronalaskom. Vidi, na primer, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
[0097] U nekim izvedbama, pomenuti domen za cepanje sadrži jedan ili više konstruiranih polu-domena za cepanje (takođe označeni kao mutirani domeni za dimerizaciju) koji minimizuju ili sprečavaju homodimerizaciju, kao šta je ovde opisano, na primer, u U.S. patentnim publikacijama br. 20050064474; 20060188987 i 20080131962. Amino-kiselinski ostaci na pozicijama 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, i 538 iz Fok I su svi mete za poticanje dimerizacije polu-domena za cepanje iz Fok I.
[0098] Primeri za konstruirane polu-domene za cepanje iz Fok I koji formiraju obligatne heterodimere uključuju par u kojem prvi polu-domen za cepanje sadrži mutacije u aminokiselinskim ostacima na pozicijama 490 i 538 iz Fok I, a drugi polu-domen za cepanje sadrži mutacije na amino-kiselinskim ostacima 486 i 499.
[0099] Tako, u jednoj izvedbi, mutacija na poziciji 490 menja Glu (E) sa Lys (K); mutacija u 538 menja Iso (I) sa Lys (K); mutacija u 486 menja Gln (Q) sa Glu (E); a mutacija na poziciji 499 menja Iso (I) sa Lys (K). Specifično, pomenuti ovde opisani konstruirani polu-domeni za cepanje su pripremljeni uz pomoć mutiranja pozicija 490 (E→K) i 538 (I→K) u jednom poludomenu za cepanje sa ciljem da se proizvede konstruirani polu-domen za cepanje koji je označen kao "E490K:I538K" i uz pomoć mutiranja pozicija 486 (Q→E) i 499 (I→L) u drugom polu-domenu za cepanje sa ciljem da se proizvede konstruirani polu-domen za cepanje označen kao "Q486E:I499L". Pomenuti konstruirani polu-domeni za cepanje, ovde opisani, su obligatni heterodimerni mutanti u kojima je aberantno cepanje minimizovano ili uklonjeno. Vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju br.2008/0131962.
[0100] U nekim izvedbama, pomenuti konstruirani polu-domen za cepanje sadrži mutacije na pozicijama 486, 499 i 496 (numerisanje u odnosu na Fok I divljeg-tipa), na primer mutacije koje menjanju Gln (Q) ostatak na poziciji 486 iz divljeg-tipa sa Glu (E) ostatkom, Iso (I) ostatak na poziciji 499 iz divljeg-tipa sa Leu (L) ostatkom, a Asn (N) ostatak na poziciji 496 iz divljegtipa sa Asp (D) ili Glu (E) ostatkom (takođe označeni kao "ELD" i "ELE" domeni). U drugim izvedbama, pomenuti konstruirani polu-domen za cepanje sadrži mutacije na pozicijama 490, 538 i 537 (numerisanje u odnosu na Fok I divljeg-tipa), na primer mutacije koje menjaju Glu (E) ostatak na poziciji 490 iz divljeg-tipa sa Lys (K) ostatkom, Iso (I) ostatak na poziciji 538 iz divljeg-tipa sa Lys (K) ostatkom, a His (H) ostatak na poziciji 537 iz divljeg-tipa sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe označeni kao "KKK" i "KKR" domeni). U drugim izvedbama, pomenuti konstruirani polu-domen za cepanje sadrži mutacije na pozicijama 490 i 537 (numerisanje u odnosu na Fok I divljeg-tipa), na primer mutacije koje menjaju Glu (E) ostatak na poziciji 490 iz divljeg-tipa sa Lys (K) ostatkom, a His (H) ostatak na poziciji 537 iz divljeg-tipa sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe označeni kao "KIK" i "KIR" domeni) (vidi US patentnu publikaciju br. 20110201055). Ovde opisani konstruirani poludomeni za cepanje mogu da se pripreme primenom bilo kojeg prikladnog postupka, na primer, uz pomoć mesto-usmerene mutageneze polu-domena za cepanje divljeg-tipa (Fok I) kao šta je opisano u U.S. patentnim publikacijama br.20050064474; 20080131962; i 20110201055.
[0101] Alternativno, nukleaze mogu da budu sklopljene in vivo na ciljnom mestu nukleinskekiseline primenom takozvane "split-enzyme" tehnologije (vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju br.20090068164). Komponente takvih split-encima (razdvojenih enzima) mogu da se eksprimiraju u odvojenim ekspresionim konstruktima, ili mogu da budu spojeni u jednom otvorenom okviru čitanja gde su pojedinačne komponente razdvojene, na primer, uz pomoć samo-cepanja 2A peptida ili IRES-sekvence. Komponente mogu da budu individualni zincfinger vezni domeni ili domeni meganukleaze koji vežu nukleinsku-kiselinu.
[0102] Aktivnost nukleaza može da se ispita pre primene, na primer uz pomoć kvašćevog hromosomskog sistema kao šta je opisano u dokumentima WO 2009/042163 i 20090068164. Konstrukti za ekspresiju nukleaze mogu lako da se dizajniraju uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; i Internacionalnu publikaciju WO 07/014275. Ekspresija pomenute nukleaze može da bude pod kontrolom nekog konstitutivnog ili inducibilnog promotora, na primer promotora galaktokinaze koji se aktivira (de-reprimira) u prisutnosti rafunoze i/ili galaktoze, a reprimira u prisutnosti glikoze.
CRISPR/Cas-sistem
[0103] Zanimljivi dokazi su se nedavno pojavili i govore o postojanju RNA-posredovanog puta genomske odbrane u arhebakterija i mnogih bakterija za kojeg se pretpostavlja da je paralelan eukariotskom RNAi-putu (vidi pregledne članke Godde & Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62: 718-729; Lillestol et al., 2006. Archaea 2: 59-72; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7.; Sorek et al., 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186). Poznat kao CRISPR-Cas-sistem ili prokariotska RNAi (pRNAi), za ovaj put se pretpostavlja da potiče od dva evolucijski i često fizički spojena genska lokusa: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) lokusa, koji kodira RNA-komponente sistema, i cas (CRISPR-povezan) lokusa, which kodira belančevine (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol.1: e60). CRISPR lokusi iz mikroorganizama sadrže kombinaciju CRISPR-povezanih (Cas) gena kao i ne-kodirajuće RNA-elemente sposobne da programiraju specifičnost CRISPR-posredovanog cepanja nukleinske-kiseline. Pojedinačne Cas-belančevine ne dele značajnu sekvencijsku-sličnost sa proteinskim komponentama eukariotske RNAimašinerije, ali imaju analogno predviđene funkcije (na primer, RNA-vezanje, nukleaza, helikaza, itd.) (Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7). CRISPR-povezani (cas) geni su često povezani sa CRISPR područjima ponovljenih spejsera (repeat-spacer arrays). Opisano je više od četrdeset različitih Cas-proteinskih porodica. Od pomenutih proteinskih-porodica, Cas1 se čini da je sveprisutna u različitim CRISPR/Cas-sistemima. Naročite kombinacije cas-gena i ponovljenih struktura se koriste za definisanje 8 CRISPR-podtipa (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, i Mtube), od kojih su neki povezani sa nekim dodatnim genskim modulom koji kodira misteriozne belančevine povezane sa ponavljanjem (repeat-associated mysterious proteins, RAMP). U jednom genomu može da postoji više CRISPR-podtipova. Sporadična distribucija CRISPR/Cas-podtipova sugeriše da je sistem bio podložan horizontalnom prenosu gena tokom evolucije mikroorganizama.
[0104] Tip II CRISPR (primer je Cas9) je najbolje karakterizovan sistem koji uvodi ciljani dvolančani lom u DNA tokom četiri uzastopna koraka. Prvo, dve ne-kodirajuće RNA, precrRNA-array i tracrRNA, su transkribovane iz CRISPR lokusa. Drugo, tracrRNA hibridizuje sa regionima ponavljanja u pre-crRNA i posreduje procesiranje pre-crRNA u zrele crRNA koje sadrže pojedinačne spacer-sekvence. Treće, zreli crRNA:tracrRNA kompleks usmerava Cas9 na ciljanu DNA uz pomoć Watson-Crick sparivanja baza između spacer-a u crRNA i protospacer-a u ciljanoj DNA blizu do susednog motiva protospacer-u (PAM), koji je dodatni uslov za prepoznavanje mete. Konačno, Cas9-posreduje cepanje ciljane DNA sa ciljem da se uvede dvolančani lom u protospacer-u. Aktivnost CRISPR/Cas-sistema obuhvata tri koraka: (i) insercija stranih DNA-sekvenca u CRISPR-array sa ciljem da se zaustave daljni napadi, u procesu koji je poznat kao 'adaptacija', (ii) ekspresija relevantnih belančevina, kao i ekspresija i procesiranje array, nakon čega sledi (iii) RNA-posredovana interferencija sa stranom nukleinskom-kiselinom. Tako, u bakterijskoj ćeliji, nekoliko takozvanih 'Cas'-belančevina je uključeno u prirodnom funkcionisanju CRISPR/Cas-sistema.
[0105] Primarni produkti CRISPR lokusa se čini da su kratki RNA molekuli koji sadrže invazione sekvence za ciljanje (invader metaing sequences), a nazivaju se vodeće RNA ili prokariotske RNA za utišavanje (psiRNA) na bazi njihove pretpostavljene uloge u putu (Makarova et al. (2006) Biol. Direct 1:7; Hale et al. (2008) RNA14: 2572-2579). RNA-analiza pokazuje da su transkripti CRISPR lokusa pocepani unutar ponovljenih sekvenca kako bi otpustile intermedijare od ~60- do 70-nt RNA koji sadrže pojedinačne invazione sekvence za ciljanje i bočne ponovljene fragmente (Tang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.99: 7536-7541; Tang et al. (2005) Mol. Microbiol.55:469-481; Lillestol et al. (2006) Archaea 2:59-72; Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964; Hale et al. (2008) RNA 14:2572-2579). U arhebakteriji Pyrococcusfuriosus, ove intermedijarne RNA se dalje procesiraju do obilnih, stabilnih zrelih psiRNA od ~35- do 45-nt (Hale et al. (2008) RNA 14: 2572-2579).
Cas-belančevine
[0106] "Cas1"-polipeptid se odnosi na CRISPR-povezanu (Cas) belančevinu 1. Cas1 (COG1518 u klasifikacionom sistemu belančevina Clusters of orthologous group) je najbolji marker za CRISPR-povezane sisteme (CASS). Na bazi filogenetičkih uporedba je identifikovano sedam posebnih verzija CRISPR-povezanog imuno-sistema (CASS1-7).
[0107] Cas1-polipeptid koji se koristi u ovde opisanim postupcima može da bude bilo koji Cas1-polipeptid prisutan u bilo kojem prokariotu. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz arhebakterija. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz Euryarchaeota. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz Crenarchaeota. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz bakterije. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz gram-negativne ili grampozitivne bakterije. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz Pseudomonas aeruginosa. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid iz Aquifexaeolicus. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid koji je član jednog od CASS1-7. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid koji je član
4
CASS3. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid koji je član CASS7. U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je neki Cas1-polipeptid koji je član CASS3 ili CASS7.
[0108] U nekim izvedbama, Cas1-polipeptid je kodiran sa nukleotidnom sekvencom koja je obezbeđena u GenBank preko, na primer, GenID broja: 2781520, 1006874, 9001811, 947228, 3169280, 2650014, 1175302, 3993120, 4380485, 906625, 3165126, 905808, 1454460, 1445886, 1485099, 4274010, 888506, 3169526, 997745, 897836, ili 1193018 i/ili sa aminokiselinskom sekvencom koja je homologna (na primer, više od 80%, 90 do 99% uključujući 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) sa amino-kiselinama kodiranim u ovim polinukleotidima, a koji polipeptidi funkcionišu kao Cas1-polipeptidi.
[0109] Cas6 je drugi Cas-polipeptid, a endoribonukleazna aktivnost ovde je označena kao Cas6-endoribonukleazna aktivnost. Ne-ograničavajući primeri za prikladne Cas6-polipeptide su prikazani u Genbank pristupnom br. AAL81255. Cas6-polipeptid može da se obogati, izoluje, ili prečisti iz mikroba koji ima CRISPR-lokus i cas (CRISPR-povezani) lokus, poput, ali bez ograničenja, Pyrococcusfuriosus, ili može da se proizvede primenom rekombinantnih tehnika, ili može da se sintetizuje hemijski ili encimski primenom rutinskih postupaka. U nekim aspektima, Cas6-polipeptid može da se obogati, izoluje, ili prečisti iz mikroba koji ne sadrži CRISPR lokuse. Cas6-polipeptid sadrži najmanje jedan ostatak koji može da igra ulogu u katalizi, ili neku njegovu konzervativnu supstituciju. Cas6-polipeptid može da sadrži druge ostatke koji mogu takođe da igraju ulogu u katalizi, ili njihove konzervativne supstitucije. Pomenuti ostatak/ostaci za koje se očekuje da igraju ulogu u katalizi mogu da budu locirani blizu G-bogate omče koja sadrži motiv Cas6-potpisa u 3D-strukturi belančevine. Cas6-polipeptidi uključuju domene prisutne u bazi podataka TIGRFAM pod pristupnim brojevima TIGR01877 i PF01881. TIGRFAM-baza podataka sadrži porodice polipeptida čija je funkcija konzervisana (Haft et al. (2003) Nucl. Nucleic Acids. 31:371-373, Bateman & Haft (2002) Briefings Bioinformatics, 3:236-245, i Haft et al. (2005) PLoS Computational Biol.1(6):e60).
[0110] Drugi primeri Cas6-polipeptida, ovde opisani, uključuju one koji su prisutni u prokariotskim mikroorganizama koji sadrže CRISPR-lokus i cas-lokus. Cas6-polipeptidi mogu da se lako identifikuju u bilo kojem mikroorganizmu koji sadrži CRISPR-lokus. Kodirajući region koji kodira Cas6-polipeptid je tipično u nekom cas-lokusu lociran blizu CRISPR-lokusa. Autori Haft et al. (2005) PLoS Computational Biol. 1(6):e60) opširno opisuju porodicu Casbelančevina, i kreirane uloge za identifikaciju specifičnih podtipova CRISPR/Cas-sistema. Haft et al. opisuju kodirajući region koji kodira Cas6-polipeptide povezane sa najmanje četiri odvojena CRISPR/Cas podtipa (Tneap, Hmari, Apern, i Mtube), a tipično cas-kodirajući region je locirani krajnje distalno od CRISPR lokusa. Cas6-polipeptidi mogu da se identifikuju primenom alata koji su dostupni u JCVI Comprehensive Microbial Resource. Tako, Cas6-polipeptidi koji su korisni u ovde opisanim postupcima mogu da se identifikuju od strane stručnjaka primenom rutinskih postupaka.
[0111] Primeri za prokariotske mikroorganizme kojima je poznata celokupna genomska sekvenca i koji sadrže kodirajuće regione koji kodiraju Cas6-polipeptid uključuju Thermotogamaritima MSB8, Campylobacter fetus subsp. fetus 82-40, Fusobacteriumnucleatum ATCC 25586, Streptococcus thermophilus LMG 18311, Thermoanaerobactertengcongensis MB4(T), Moorellathermoacetica ATCC 39073, Desulfitobacteriumhafniense Y51, Clostridium tetani E88, Clostridium perfringens SM101, Clostridium difficile QCD-32g58, Clostridium botulinum Hall A Sanger, Clostridium botulinum F Langeland, Clostridium botulinum B1 soj Okra, Clostridium botulinum A3 soj Loch Maree, Clostridium botulinum A Hall, Clostridium botulinum A ATCC 19397, Carboxydothermushydrogenoformans Z-2901, Stafilococcus epidermidis RP62A, Thermusthermophilus HB8, Thermusthermophilus HB27, Nostoc sp. PCC 7120, Anabaena variabilis ATCC 29413, Synechococccus sp. OS Tip B prime, Synechococccus sp. OS Tip A, Porphyromonasgingivalis W83, BacteroidesfragilisYCR46, Bacteroidesfragilis NCTC9343, Aquifexaeolicus VF5, Rubrobacterxylanophilus DSM 9941, Mycobacterium tuberculosis H37Rv (laboratorijski soj), Mycobacterium tuberculosis CDC1551, Mycobacterium bovis subsp. bovis AF2122/97, Frankiaalni ACN14a, Thermoplazmavolcanium GSS1, Picrophilustorridus DSM 9790, Thermococcuskodakarensis KOD1, Pyrococcushorikoshiishinkaj OT3, Pyrococcusfuriosus DSM 3638, Pyrococcusabyssi GE5, Methanosarcinabarkerifusaro, Methanosarcinaacetivorans C2A, Methanococcoidesburtonii DSM 6242, Methanococcusjannaschii DSM2661, Methanobacteriumthermoautotrophicum delta H, Haloarculamarismortui ATCC 43049, Archaeoglobusfulgidus DSM4304, Pyrobaculumaerophilum 1M2, Sulfolobustokodaii soj 7, Sulfolobussolfataricus P2, Sulfolobusacidocaldarius DSM 639, Aeropyrumpernix K1. Stručnjacima su takođe poznati i drugi primeri za Cas6-polipeptid; vidi, na primer, članove COG1583-grupe polipeptida (dostupni Internet-stranici Clusters of Orthologous Groups of Proteins (COG) preko Internetstranice National Center for Biotechnology Information; vidi takođe Tatusov et al. (1997) Science 278:631-637 i Tatusov et al. (2003) BMC Bioinformatics 4(1):41), članove InterProporodice sa pristupnim brojem IPRO10156, Makarova et al. (2002) Nuc. Acids Res. 30:482-496 i Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol.1(6):e60, 474-483).
[0112] Postoje tri tipa CRISPR/Cas-sistema koji ugrađuju RNA i Cas-belančevine. Tipovi I i III oba imaju Cas-endonukleaze koje procesiraju pre-crRNA, koje se, kada su potpuno procesirane u crRNA, sklapaju u kompleks multi-Cas-belančevine koji je sposoban da pocepa nukleinske-kiseline koje su komplementarne sa crRNA.
[0113] Kod CRISPR/Cas-sistema tipa II, crRNA se proizvode uz pomoć različitih mehanizama gde trans-aktivisana RNA (tracrRNA), koja je komplementarna sa ponovljenim sekvencama u pre-crRNA, pokreće procesiranje uz pomoć dvolančano-specifične RNaze III u prisutnosti Cas9-belančevine. Cas9 tada može da pocepa ciljanu DNA koja je komplementarna sa zrelom crRNA mada je cepanje sa Cas 9 zavisno o sparivanju baza između pomenute crRNA i ciljane DNA, ali i o prisutnosti kratkog motiva u crRNA koji se naziva PAM-sekvenca (protospacer adjacent motif) (vidi Qi et al. (2013) Cell 152:1173). Osim toga, pomenuta tracrRNA takođe mora da bude prisutna jer se sparuje sa pomenutom crRNA na svojem 3'-kraju, a ovo povezivanje pokreće delovanje Cas9.
[0114] Pomenuta Cas9-belančevina ima barem dva nukleazna domena: jedan nukleazni domen je sličan sa HNH-endonukleazom, dok je drugi sličan sa domenom Ruv-endonukleaze. Pomenuti domen HNH-tipa se čini da je odgovoran za cepanje DNA-lanca koji je komplementaran sa crRNA dok Ruv-domen cepa ne-komplementarni lanac.
[0115] Potreba za pomenutim crRNA-tracrRNA kompleksom može da se izbegne primenom konstruirane "single-guide RNA" (sgRNA) koja sadrži ukosnicu koja normalno nastaje slepljivanjem crRNA i tracrRNA (vidi, Jinek et al. (2012) Science 337:816 i Cong et al. (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143). Kod S. pyrogens, konstruirana fuzija tracrRNA:crRNA, ili sgRNA, navodi Cas9 da cepa ciljanu DNA kada se formira dvolančani RNA:DNA heterodimer između Cas-spojenih RNA i ciljane DNA. Ovaj sistem sadrži Cas9-belančevinu i konstruiranu sgRNA koja takođe sadrži PAM-sekvencu koja je bila korišćena za RNA-navođeno genomsko editiranje (vidi Ramalingam, ibid) i još je bila korisna kod
4
genomskog editiranja embriona zebrice (Danio rerio) in vivo (vidi Hwang et al. (2013) Nature Biotechnology 31(3):227) uz efikasnost editiranja koja je slična omom od ZFN i TALEN.
[0116] U nekim izvedbama, Cas-belančevina može da bude neki "funkcionalni derivat" neke prirodne Cas-belančevine. "Funkcionalni derivat" neke nativne polipeptidne sekvence je jedinjenje koje ima kvantitativne biološke karakteristike koje su zajedničke sa nekom nativnom polipeptidnom sekvencom. "Funkcionalni derivati" uključuju, ali bez ograničenja, fragmente neke nativne sekvence, a derivati nativne polipeptidne sekvence i njihovi fragmenti, pod uslovom da imaju biološku aktivnost koja je zajednička sa odgovarajućom nativnom polipeptidnom sekvencom. Biološka aktivnost koja je ovde predviđena je sposobnost pomenutog funkcionalnog derivata da hidrolizuje DNA-supstrat u fragmente. Termin "derivat" obuhvata varijante amino-kiselinske sekvence polipeptida, njene kovalentne modifikacije, i fuzije.
[0117] "Cas-polipeptid" obuhvata Cas-polipeptid pune-dužine, encimski-aktivan fragment nekog Cas-polipeptida, i encimski aktivne derivate Cas-polipeptida ili njegovog fragmenta. Prikladni derivati Cas-polipeptida ili njegovog fragmenta uključuju, ali bez ograničenja, mutante, fuzije, kovalentne modifikacije Cas-belančevine ili njenih fragmenata.
[0118] Cas-belančevine i Cas-polipeptidi mogu da se dobiju iz ćelije ili mogu da se sintetizuju hemijski ili kombinovanjem obe pomenute procedure. Pomenuta ćelija može da bude ćelija koja prirodno proizvodi Cas-belančevinu, ili ćelija koja prirodno proizvodi Cas-belančevinu i je genetički konstruirana da proizvodi endogenu Cas-belančevinu kod višeg nivoa ekspresije ili koja proizvodi Cas-belančevinu iz egzogeno uvedene nukleinske-kiseline, a koja nukleinskakiselina kodira Cas koji je isti ili različit od endogenog Cas. U nekim slučajevima, pomenuta ćelija ne proizvodi prirodno Cas-belančevinu i je genetički konstruirana da proizvodi Casbelančevinu.
[0119] Pomenuti CRISPR/Cas-sistem može takođe da se koristi sa ciljem inhibiranja genske ekspresije. Lei et al. (2013) Cell 152(5):1173-1183) su pokazali da katalitički mrtav Cas9 kojemu nedostaje endonukleazna aktivnost, kada je ko-eksprimiran sa guide-RNA, generiše kompleks za DNA-prepoznavanje koji može specifično da interferiše sa elongacijom transkripcije, vezanjem RNA-polimeraze, ili vezanjem transkripcionog faktora. Ovaj sistem, nazvan CRISPR-interferencija (CRISPRi), može da efikasno reprimira ekspresiju ciljanih gena.
[0120] Osim toga, razvijene su Cas-belančevine koje sadrže mutacije u svojim domenima za cepanje sa ciljem da ih se onesposobi da indukuju DSB, a umesto toga uvode urez (pukotinu) u ciljnu DNA ("Cas9 nicking enzyme", vidi Cong et al., ibid).
[0121] Cas-belančevine iz ovog pronalaska mogu da budu mutirane sa ciljem da se promeni njihova funkcionalnost. Primeri za selekcijske postupke, uključujući fag-display i two-hybrid sisteme, su opisani u U.S. patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i u dokumentima WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237.
RNA-komponente u CRISPR/Cas
[0122] CRISPR/Cas-sistemi povezani sa Cas9 obuhvataju dve RNA ne-kodirajuće komponente: tracrRNA i pre-crRNA-array koje sadrži sekvence za navođenje nukleaze (spacer-i) koje su isprekidane sa identičnim direktnim ponavljanima (DR). Za upotrebu CRISPR/Cas-sistema sa ciljem ostvarivanja genomskog inženjeringa, obe funkcije pomenutih RNA mora da budu prisutne (vidi Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). U nekim izvedbama, pomenute tracrRNA i pre-crRNA su obezbeđene primenom odvojenih ekspresionih konstrukata ili kao odvojene RNA. U drugim izvedbama, himerna RNA je konstruisana tako da je konstruirana zrela crRNA (koja donosi ciljnu specifičnost) fuzionisana na tracrRNA (koja obezbeđuje interakciju sa Cas9) sa ciljem da se kreira himerni hibrid crRNA-tracrRNA (takođe označen kao single-guide RNA). (vidi Jinek, ibid i Cong, ibid).
Himerne ili sgRNA mogu da budu konstruirane tako da obuhvataju sekvencu koja je komplementarna sa bilo kojom željenom metom. Pomenute RNA sadrže 22 baze koje su komplementarne sa metom i u formi G[n19], nakon čega sledi motiv koji je susedan protospacer-u (protospacer-adjacent motif, PAM) u formi NGG. Tako, u jednom postupku, sgRNA mogu da budu dizajnirane za korišćenje poznate ZFN-mete u nekom genu od interesa uz pomoć (i) slepljivanja sekvence za prepoznavanje iz ZFN-heterodimera sa referentnom sekvencom iz relevantnog genoma (ljudskog, mišjeg, ili bilo koje biljne vrste); (ii) identifikovanja spacer-regiona između ZFN polu-mesta; (iii) identifikovanje lokacije motiva
4
G[N20]GG koji je najbliži pomenutom spacer-regionu (gde više takvih motiva prekriva spacer, pri čemu je pomenuti motiv centriran u odnosu na izabrani spacer); (iv) korišćenje ovog motiva kao jezgro iz sgRNA. Ovaj postupak se oslanja na dokazanim metama nukleaze. Alternativno, sgRNA mogu da budu dizajnirane da ciljaju bilo koji region od interesa uz pomoć identifikovanja prikladne ciljne sekvence koja je u skladu sa formulom G[n20]GG.
Ciljna mesta
[0123] Kao šta je opisano detaljno iznad, DNA-vezni domeni mogu da se konstruišu tako da vežu bilo koju izabranu sekvencu u nekom lokusu, na primer globinski ili safe-harbor gen. Konstruirani DNA-vezni domen može da ima novu veznu specifičnost, upoređeno sa prirodnima DNA-veznim domenom. Postupci za inženjering uključuju, ali bez ograničenja, racionalni dizajn i brojne tipove selekcije. Racionalni dizajn uključuje, na primer, upotrebu baza podataka koje sadrže triplet- (ili kvadriplet-) nukleotidne sekvence i pojedinačne (na primer, zinc-finger) amino-kiselinske sekvence, u kojima svaka triplet- ili kvadriplet-nukleotidna sekvenca je povezana sa jednom ili više amino-kiselinskih sekvenca DNA-veznog domena koji veže određenu triplet- ili kvadriplet-sekvencu. Vidi, na primer, zajedničke U.S. patente 6,453,242 i 6,534,261. Takođe može da se provede racionalni dizajn TAL-efektorskih domena. Vidi, na primer, U.S. patentnu publikaciju br.20110301073.
[0124] Primeri za postupke selekcije koji vrede za DNA-vezne domene, uključujući fag-display i two-hybrid sisteme, a opisani su u US patentima 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i u dokumentima WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237.
[0125] Selekcija ciljnih mesta (meta); nukleaza i postupaka za dizajn i konstrukciju fuzionih belančevina (i polinukleotida koji ih kodiraju) su poznati stručnjacima, a u stanju tehnike su opisani detaljno u U.S. patentne prijave, publikacije br.20050064474 i 20060188987.
[0126] Osim toga, kao šta je opisano u pomenutim i drugom referencama, DNA-vezni domeni (na primer, zinc-finger belančevine sa više prstiju) mogu da budu međusobno spojeni uz pomoć bilo koje prikladne linker-sekvence, uključujući na primer, linkere od 5 ili više amino-kiselina. Vidi, na primer, U.S. patente br. 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949 za primere o linker-
4
sekvencama od 6 ili više amino-kiselina u dužini. Pomenute ovde opisane belančevine mogu da uključuju bilo koju kombinaciju prikladnih linkera između pojedinačnih DNA-veznih domena iz belančevine. Vidi, takođe, U.S. patentnu publikaciju br.20110287512.
Donori
[0127] Kao šta je napomenuto iznad, insercija neke egzogene sekvence (takođe nazvane "donorska sekvenca" ili "donor" ili "transgen"), na primer sa ciljem korekcije nekog mutiranog gena ili za povećanje ekspresije gena divljeg-tipa. Podrazumeva se da pomenuta donorska sekvenca tipično nije identična sa genomskom sekvencom u koju se ugrađuje. Donorska sekvenca može da sadrži neku ne-homolognu sekvencu koja je obrubljena sa dva regiona homologije koji omogućavaju efikasan HDR u lokaciji od interesa. Osim toga, donorske sekvence mogu da obuhvataju vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne sa regionom od interesa u ćelijskom hromatinu. Donorski molekul može da sadrži nekoliko, diskontinuiranih regiona homologije prema ćelijskom hromatinu. Na primer, za ciljanu ugradnju sekvenca koje nisu prirodno prisutne u regionu od interesa, pomenute sekvence mogu da budu prisutne u molekulu donorske nukleinske-kiseline i obrubljeni sa regionima koji su homologni sa sekvencom u regionu od interesa.
[0128] Ovde su opisani postupci za ciljanu inserciju bilo kojeg polinukleotida za ugradnju u neku izabranu lokaciju. Polinukleotidi za ugradnju mogu takođe da se nazivaju terminima "egzogeni" polinukleotidi, "donorski" polinukleotidi ili molekuli ili "transgeni". Pomenuti donorski polinukleotid može da bude DNA ili RNA, jednolančana i/ili dvolančana i može da bude uveden u neku ćeliju u linearnoj ili cirkularnoj formi. Vidi, na primer, U.S. patentne publikacije br. 20100047805, 20110281361, 20110207221 i U.S. prijavu br. 13/889,162. Pomenute donorske sekvence mogu da se nalaze u nekom DNA MC, koji može da se uvede u ćeliju u cirkularnoj ili linearnoj formi. Ako se uvede u linearnoj formi, krajevi donorske sekvence mogu da budu zaštićeni (na primer, od egzonukleolitičke degradacije) primenom postupaka koji su poznati stručnjacima. Na primer, jedan ili više dideoksinukleotidnih ostataka se dodaje na 3'-terminus linearnog molekula i/ili samo-komplementarni oligonukleoti su ligirani na jednom ili oba kraja. Vidi, na primer, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Dodatni postupci za zaštitu egzogenih polinukleotida od degradacije uključuju, ali bez ograničenja, dodavanje terminalnih amino-
4
grupa i upotrebu modifikovanih internukleotidnih spojeva poput, na primer, ostataka fosforotioata, fosforamidata, i O-metil riboze ili deoksiriboze.
[0129] Polinukleotid može da bude uveden u ćeliju kao deo nekog vektorskog molekula koji sadrži dodatne sekvence poput, na primer, početaka replikacije, promotora i gena koji donose otpornost na antibiotike. Štaviše, donorski polinukleotidi mogu da budu uvedeni u formi gole nukleinske-kiseline, na primer nukleinska-kiselina u kompleksu sa nekim agensom poput liposoma ili poloksamera, ili mogu da budu dostavljeni uz pomoć virusa (na primer, adenovirusi, AAV, herpesvirusi, retrovirusi, lentivirusi i lentivirusi kojima nedostaje integraza (IDLV)).
[0130] U nekim izvedbama, pomenuti dvolančani donor uključuje sekvence (na primer, kodirajuće sekvence, takođe označene kao transgeni) duže od 1 kb, na primer između 2 i 200 kb, između 2 i 10 kb (ili bilo koja vrednost između pomenutih). Pomenuti dvolančani donor takođe uključuje najmanje jedno ciljno mesto za nukleazu, na primer. U nekim izvedbama, pomenuti donor uključuje barem 1 ciljno mesto, na primer, za potrebe CRISPR/Cas, ili 2 ciljna mesta, na primer za par ZFN ili TALEN. Tipično, pomenuta ciljna mesta za nukleazu se nalaze izvan transgenih sekvenca, na primer, 5' i/ili 3' u odnosu na transgene sekvence, sa ciljem cepanja transgena. Pomenuta ciljna mesta za nukleazu mogu da budu za bilo koju nukleazu. U nekim izvedbama, pomenuta ciljna mesta za nukleazu koja se nalaze u dvolančanom donoru su namenjena za istu nukleazu(e) koja se koristi za cepanje endogene mete u koju se ugrađuje pocepani donor uz pomoć postupaka koji ne zavise o homologiji.
[0131] Donor se generalno ugrađuje tako da je ekspresija omogućena preko endogenog promotora u mestu integracije tj. promotora koji pokreće ekspresiju endogenog gena u kojem je donor ugrađen (na primer, globin, AAVS1, itd.). Međutim, podrazumeva se da pomenuti može da sadrži promotor i/ili pojačivač, na primer neki konstitutivni promotor ili inducibilni ili tkivno-specifični promotor.
[0132] Molekul donora može da se ugradi u neki endogeni gen tako da se sav, jedan deo ili ništa od endogenog gena ne eksprimira. Na primer, transgen kao šta je ovde opisan može da bude ugrađen u neki globinski lokus tako da se jedan ili nijedan deo sekvence endogenog globinskog gena ne eksprimiraju, na primer kao fuzija sa pomenutim transgenom. U drugim
4
izvedbama, pomenuti transgen (na primer, sa ili bez sekvenca koje kodiraju globin) je integrisan u bilo koji endogeni lokus, na primer neki safe-harbor lokus. Vidi, na primer, US patentne publikacije 20080299580; 20080159996 i 201000218264.
[0133] Kada se dodatne sekvence (na primer, globinske sekvence, endogene ili delovi transgena) eksprimiraju zajedno sa transgenom, pomenute dodatne (na primer, globinske) sekvence mogu da budu sekvence pune-dužine (divlji-tip ili mutanti) ili delomične sekvence. Preferirano, pomenute dodatne sekvence su funkcionalne. Ne-ograničavajući primeri za funkcije ovih dodatnih sekvenci, pune-dužine ili delomične, na primer globin-kodirajuće sekvence, uključuju povećavanje serumskog polu-života pomenutom polipeptidu koji se eksprimira od strane transgena (na primer, terapeutski gen) i/ili delovanje kao nosilac.
[0134] Nadalje, mada nisu potrebne za ekspresiju, egzogene sekvence mogu takođe da uključuju transkripciono- ili translaciono-regulacione sekvence, na primer, promotore, pojačivače, izolatore, interna mesta ukaza u ribosom, sekvence koje kodiraju 2A-peptide i/ili poliadenilacijske signale.
[0135] Transgeni koji se nalaze u donorskim sekvencama, ovde opisanim, mogu da budu izolovani iz plazmida, ćelija ili drugih izvora uz pomoć standardnih tehnika poznatih stanju tehnike kao PCR. Donori za primenu mogu da uključuju različite tipove topologije, uključujući cirkularno-superklupko, cirkularno-opušteno, linearno i sl. Alternativno, pomenuti mogu da se hemijski sintetizuju primenom standardnih tehnika oligonukleotidne sinteze. Osim toga, donori mogu da budu metilirani ili bez metilacije. Donori mogu da budu u formi bakterijskih ili kvašćevih veštačkih hromosoma (BAC ili YAC).
[0136] Dvolančani donor-polinukleotidi, ovde opisani, mogu da sadrže jednu ili više neprirodnih baza i/ili okosnica. Naročito, ugradnja donorskog molekula sa metilovanim citozinima može da se provede primenom ovde opisanih postupaka sa ciljem da se ostvari stanje transkripcione utišanosti u regionu od interesa.
[0137] Egzogeni (donor) polinukleotid može da sadrži bilo koju sekvencu od interesa (egzogena sekvenca). Primeri za egzogene sekvence uključuju, ali bez ograničenja, bilo koju sekvencu koja kodira neki polipeptid (na primer, cDNA), promotorsku sekvencu, sekvencu
4
pojačivača, epitope-priveske, marker-gene, mesta za cepanje encimom i razne tipove ekspresionih konstrukata. Marker-geni uključuju, ali bez ograničenja, sekvence koje kodiraju belančevine koje donose rezistenciju na antibiotike (na primer, rezistenciju na ampicilin, neomicin, G418, puromicin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminiscentne belančevine (na primer, zelena-fluorescentna belančevina, pojačana zelena-fluorescentna belančevina, crvena-fluorescentna belančevina, luciferaza), i belančevine koje omogućavaju pojačani ćelijski rast i/ili gensku amplifikaciju (na primer, dihidrofolat reduktaza). Epitopprivesci uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG, His, myc, Tap, HA ili bilo koje amino-kiselinske sekvence koja može da se otkrije.
[0138] U jednoj preferiranoj izvedbi, pomenuta egzogena sekvenca (transgen) sadrži polinukleotid koji kodira bilo kojeg polipeptida čija je ekspresija u ćeliji poželjna, uključujući, ali bez ograničenja, antigene, encime, receptore (površinske ili nuklearne), hormone, limfokine, citokine, reporter-polipeptide, faktore rasta, i funkcionalne fragmente bilo kojeg iznad pomenutog. Kodirajuće sekvenca mogu da budu, na primer, cDNA.
[0139] U nekim izvedbama, pomenute egzogene sekvence mogu da sadrže neki marker-gen (opisan iznad), koji dozvoljava selekciju ćelija u kojima se dogodila ciljana integracija, i spojenu sekvencu koji kodira neku dodatnu funkcionalnost. Ne-ograničavajući primeri za marker-gene uključuju GFP, marker(e) za selekciju leka i sl.
[0140] Dodatne genske sekvence koje mogu da se ugrade mogu da uključuju, na primer, gene divljeg-tipa koje će zameniti mutirane sekvence. Na primer, sekvenca divljeg-tipa gena betaglobin može da se ugradi u genom neke matične ćelija u kojoj je endogena kopija istog gena mutirana. Kopija divljeg-tipa može da bude ugrađena u endogeni lokus, ili može alternativno da bude ciljana u neki safe-harbor lokus.
[0141] Konstrukcija takvih kaseta za ekspresiju, uz pomoć saznanja ove specifikacije, podrazumeva korišćenje metodologije koja je poznata stanju tehnike u području molekularne biologije (vidi, na primer, Ausubel ili Maniatis). Pre upotrebe pomenutih kaseta za ekspresiju sa ciljem generisanja transgeničnih životinja, prijemčivost pomenute kasete za ekspresiju na stres-induktor povezan sa izabranim kontrolnim elementima može da se testira uz pomoć uvođenja pomenute kasete za ekspresiju u neku prikladnu ćelijsku liniju (na primer, primarne ćelije, transformirane ćelije, ili imortalizovane ćelijske linije).
[0142] Nadalje, mada nisu potrebne za ekspresiju, egzogene sekvence mogu takođe da budu transkripcione ili translacione regulacione sekvence, na primer, promotori, pojačivači, izolatori, interna ribosomska ulazna mesta, sekvence koje kodiraju 2A peptide i/ili poliadenilacijski signali. Dalje, pomenuti kontrolni elementi gena od interesa mogu operativno da budu spojeni na reporter-gene koje formira himerne-gene (na primer, reporter-ekspresione kasete).
[0143] Takođe može da se ostvari ciljana insercija ne-kodirajuće sekvence nukleinske-kiseline. Sekvence koje kodiraju antisense-RNA, RNAi, shRNA i mikro RNA (miRNA) mogu takođe da se koriste za ciljane ugradnje.
[0144] U dodatnim izvedbama, donorska nukleinska-kiselina može da sadrži ne-kodirajuće sekvence koje su specifična ciljna mesta za dodatne nukleazne dizajne. Naknadno, dodatne nukleaze mogu da se eksprimiraju u ćelijama tako da je originalni donor-molekul pocepan i modifikovan uz pomoć insercije drugog donor-molekula od interesa. Na ovaj način, mogu da se generišu ponovljene integracije donorskih molekula koje dozvoljava slaganje osobina (trait stacking) u određenom lokusu od interesa ili u nekom safe-harbor lokusu.
Dostava
[0145] Nukleaze, polinukleotidi koji kodiraju ove nukleaze, donorski polinukleotidi i kompozicije koje sadrže pomenute belančevine i/ili polinukleotide, ovde opisane, mogu da budu dostavljeni in vivo ili ex vivo uz pomoć bilo kojeg prikladnog načina.
[0146] Postupci za dostavu nukleaza, kao šta je ovde opisano, su opisani u, na primer, U.S. patentnima br. 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824.
[0147] Nukleaze i/ili donor-konstrukti, kao šta je ovde opisano, takođe mogu da budu dostavljeni primenom vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jednu ili više zinc-finger ili TALEN-belančevina. Bilo koji vektorski sistem može da se primenjuje, uključujući, ali bez ograničenja, plazmidne vektore, retroviralne vektore, lentiviralne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore; herpesvirusne vektore i adeno-povezane virusne vektore, itd.
1
Vidi, takođe, U.S. patente br. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824. Nadalje, podrazumeva se da bilo koji od pomenutih vektora može da sadrži jednu ili više sekvenca koje su potrebne za tretman. Tako, kada je jedna ili više nukleaza i donorski konstrukt uvedeno u ćeliju, pomenute nukleaze i/ili donorski polinukleotid mogu da se nalaze na istom vektoru ili na različitim vektorima. Kada se primenjuju višestruki vektori, svaki vektor može da sadrži sekvenca koja kodira jednu ili više nukleaza i/ili donorskih konstrukata.
[0148] Konvencionalni postupci za transfer gena na bazi virusa ili ne, mogu da se koriste da se uvodu nukleinske-kiseline koje kodiraju nukleaze i donorske konstrukte u ćelije (na primer, ćelije sisara) i ciljna tkiva. Sistemi za ne-viralnu dostavu vektora uključuju DNA-plazmide, gole nukleinske-kiseline, u nukleinske-kiseline u kompleksu sa nekim prenosnikom za dostavu poput liposoma ili poloksamera. Sistemi za viralnu dostavu vektora uključuju DNA- i RNA-viruse, koji formiraju episomalne ili integrisane genome nakon dostave u ćeliju. Preglednu literaturu za procedure genske terapije vidi kod Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Imunology, Doerfler and Böhm (ur.) (1995); i Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
[0149] Postupci za ne-viralnu dostava nukleinskih-kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistic-u, virosome, liposome, imunoliposome, polikatjone ili konjugate lipid:nukleinska-kiselina, golu DNA, veštačke virione, i unos DNA ubrzan agensom. Sonoporacija koja koristi, na primer, sistem Sonitron 2000 (Bogata-Mar) takođe može da se koristi za dostavu nukleinskih-kiselina.
[0150] Dodatni primeri za sisteme za dostavu nukleinskih-kiselina uključuju one koji su obezbeđeni kod Amaxa Biosistems (Cologne, Nemačka), Maxcit, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) i Copernicus Therapeutics Inc, (vidi na primer dokument US6008336). Lipofekcija je opisana u na primer, U.S. patentnim br.
5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355, a reagensi za lipofekciju su komercijalno dostupni (na
2
primer, Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su prikladani za efikasanu lipofekciju polinukleotida na bazi prepoznavanja receptora uključuju one od Felgner, dokumenti WO 91/17424, WO 91/16024.
[0151] Priprema kompleksa lipid:nukleinska-kiselina, uključujući ciljane liposome poput imunolipidnih komplekasa, kao šta je poznato stručnjacima (vidi, na primer, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gen Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.52:4817-4820 (1992); U.S. pat. br. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787).
[0152] Dodatni postupci za dostavu uključuju primenu pakovanja nukleinskih-kiselina sa ciljem dostave uz pomoć EnGenIC-prenosnika za dostavu (EDV). Pomenuti EDV se specifično dostavljaju u ciljana tkiva uz pomoć bispecifičnih antitela gde jedna ruka antitela ima specifičnost za ciljano tkivo, a druga ima specifičnost za EDV. Pomenuto antitelo donosi EDV na površinu ciljane ćelije, a tada EDV ulazi u ćeliju putem endocitoze. Jednom u ćeliji, sadržaj se realizuje (vidi MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
[0153] Upotreba sistema za dostavu nukleinskih-kiselina, koje kodiraju konstruirane ZFP, na bazi viralne RNA ili DNA iskorištava visoko evoluirane procese za ciljanje nekog virusa u specifične ćelije u telu i prenos viralnog tereta u jezgro. Viralni vektori mogu da se administriraju direktno u subjekte (in vivo) ili mogu da se koriste za tretman ćelija in vitro, a ove modifikovane ćelije se sada administriraju subjektima (ex vivo). Konvencionalni viralni sistemi za dostavu ZFP uključuju, ali bez ograničenja, retroviralne, lentivirusne, adenoviralne, adeno-povezane sisteme, vaccinia- i herpes simplex virusne-vektore za genski transfer. Integracije u genom domaćina su moguće kod postupaka na bazi retrovirusa, lentivirusa, i adeno-povezanih virusa, koje često rezultuje dugotrajnom ekspresijom ugrađenog transgena. Osim toga, visoke efikasnosti transdukcije su primećene u mnogim različitim tipovima ćelija i ciljnih tkiva.
[0154] Tropizam retrovirusa može da se izmeni uz pomoć ugradnje stranih površinskih belančevina (belančevine omota), koje proširuje potencijalnu ciljnu populacija ciljnih ćelija.
Lentiviralni vektori su retroviralni vektori koji su sposobni da transdukuju ili inficitraju ćelije koje se ne dele i tipično proizvedu visoke viralne titre. Selekcija sistema za transfer gena na bazi retrovirusa zavisi o ciljnom tkivu. Retroviralni vektori se sastoje od cis-delujućih dugih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja od 6-10 kb strane sekvence. Minimum cisdelujući LTR su dovoljni za replikaciju i pakovanje pomenutih vektora, koji se tada koriste za ugradnju terapeutskog gena u ciljanu ćeliju koje obezbeđuje permanentnu ekspresiju transgena. Široko-korišćeni retroviralni vektori uključuju mišji virus leukemije (MuLV), virus leukemije gibona (GaLV), virus imunodificijencije viših primata (simian immunodeficiency virus, SIV), virus ljudske imunodificijencije (HIV), i njihove kombinacije (vidi, na primer, Buchscher et al., J. Virol.66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol.
65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
[0155] Kod prijava u kojima je preferirana tranzijentna (prolazna) ekspresija, mogu da se koriste sistemi na bazi adenovirusa. Vektori na bazi adenovirusa su sposobni da ostvare veoma visoku efikasnost transdukcije u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju ćelijsku deobu. Sa takvim vektorima su bili ostvareni visoki titari i visoki nivoi ekspresije. Ovakav tip vektora može da se proizvede u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Adeno-povezani virusi (adeno-associated virus, "AAV"), vektori, se takođe koriste za transdukovanje ćelija sa ciljnim nukleinskim-kiselinama, na primer, tokom in vitro proizvodnje nukleinskih-kiselina i peptida, i kod in vivo i ex vivo procedura genske terapije (vidi, na primer, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. patent br. 4,797,368; dokument WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Konstrukcija rekombinantnih AAV-vektora je opisana u brojnim publikacijama, uključujući U.S. pat. br.
5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); i Samulski et al., J. Virol.63:03822-3828 (1989).
[0156] Barem šest pristupa sa viralnim vektorom je trenutno dostupno za genski transfer u kliničkim pokušajima, a koji primenjuju pristupe koji uključuju komplementaciju defektnih vektora sa genima ugrađenim u linijama helper-ćelija sa ciljem da se generiše agens za transdukciju.
4
[0157] pLASN i MFG-S su primeri retroviralnih vektora koji se koriste u kliničkim pokušajima (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN je prvi terapeutski vektor koji se koristi za pokušaje genske terapije (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Efikasnosti transdukcije od 50% ili više su primećeni kod MFG-S vektora za pakiranje (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther.1:111-2 (1997).
[0158] Rekombinantni adeno-povezani virusni vektori (rAAV) su obećavajući alternativni sistemi za gensku dostavu na bazi defektnog i ne-patogenog parvovirus adeno-povezanog virusa tipa 2. Svi vektori su dobiveni iz plazmida koji zadržava samo invertna terminalna ponavljanja AAV 145 pb koja omeđuju kasetu za ekspresiju transgena. Efikasan genski transfer i stabilna dostava transgena zbog integracije u genome transdukovanih ćelija su ključne karakteristike ovoga tipa vektorskog sistema (Wagner et al., Lancet 351:91171702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther.9:748-55 (1996)). Drugi AAV-serotipovi, uključujući AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6,AAV8, AAV9 i AAVrh10, i sve njihove varijante, takođe mogu da se koriste zajedno sa ovim pronalaskom.
[0159] Replikacija-dificijentni rekombinantni adenoviralni vektori (Ad) mogu da se proizvedu u visokom titru i spremni za inficiranje velikog broja različitih tipova ćelija. Najveći broj adenovirusnih vektora je konstruirano tako da transgen menja Ad E1a, E1b, i/ili E3 gene; nakon čega je replikacija-defektni vektor umnožen u ljudskim 293-ćelijama koje ostvaruju funkciju deletiranog gena in trans. Ad-vektori mogu da transdukuju više tipova tkiva in vivo, uključujući ćelije koje se ne dele tj. koje su diferencirane poput onih u jetri, bubregu i mišiću. Konvencionalni Ad-vektori imaju veliki prenosni kapacitet. Primer za upotrebu Ad-vektora u kliničkom pokušaju uključuje terapiju sa polinukleotidom za anti-tumorsku imunizaciju uz pomoć intra-mišićne injekcije (Sterminan et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Dodatni primeri primene adenovirusnih vektora za genski transfer u kliničkim pokušajima uključuju Rosenecker et al., Infection 24:15-10 (1996); Sterminan et al., Hum. Gene Ther.9:71083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther.5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterminan et al., Hum. Gene Ther.
7:1083-1089 (1998).
[0160] Ćelije za pakovanje se koriste za proizvodnju virusnih čestica koje su sposobne da inficiraju ćeliju domaćina. Takve ćelije obuhvataju 293-ćelije, koje pakuju adenovirus, i ψ2-ćelije ili PA317-ćelije, koje pakuju retrovirus. Viralni vektori koji se koriste u genskoj terapiji se uobičajeno generišu u proizvodnoj ćelijskoj liniji koja pakuje vektorsku nukleinsku-kiselinu u viralnu česticu. Pomenuti vektori tipično sadrže minimalne viralne sekvence koje su potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćinu (ako je moguće), pri čemu su druge sekvence zamenjene sa kasetom za ekspresiju koja kodira belančevinu koja se eksprimira. Nestale viralne funkcije su nadopunjene in trans od strane ćelijske linije za pakovanje. Na primer, AAV-vektori koji se koriste u genskoj terapiji tipično poseduju samo invertne terminalne ponovljene (ITR) sekvence iz AAV-genoma koje su neophodne za pakovanje i ugradnju u genom domaćima. Viralna DNA je spakovana u nekoj ćelijskoj liniji, koja sadrži helper-plazmid koji kodira druge AAV-gene, naime rep i cap, ali ne sadrži ITR-sekvence. Ova ćelijska linija je takođe inficirana sa helper-adenovirusom. Pomenuti helper-virus promoviše replikaciju AAV-vektora i ekspresiju AAV-gena iz helper-plazmida. Pomenuti helper-plazmid nije spakovan u značajnim količinama zbog nedostatka ITR-sekvenca. Kontaminacija sa adenovirusom može da se smanji uz pomoć, na primer, toplotnog tretmana na koji je sam adenovirus osetljiviji od AAV.
[0161] U mnogim prijavama genske terapije je poželjno da vektor za gensku terapiju bude dostavljen sa visokim stepenom specifičnosti u određenom tipu tkiva. Prema tome, neki viralni vektor može da bude modifikovan tako da poseduje specifičnost za određeni tip ćelija tako da se ligand eksprimira kao fuziona belančevina sa belančevinom viralnog omotača na spoljnoj površini samog virusa. Pomenuti ligand je izabran tako da poseduje afinitet za neki receptor za kojeg se zna da je prisutan na ćelijama od interesa. Na primer, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) su objavili da Moloney-ev virus mišje leukemije može da bude modifikovan tako da eksprimira ljudski heregulin fuzionisan na gp70, a rekombinantni virus inficira određene ćelije tumora dojke kod ljudi eksprimirajući ljudski epidermalni faktor rasta. Ovaj princip može da se proširi na druge parove virus-ciljna ćelija, pri čemu pomenuta ciljna ćelija eksprimira receptor, a sam virus eksprimira fuzionu belančevinu koji sadrži ligand za receptor na površini ćelije. Na primer, filamentozni fag more da se konstruira tako da prezentira fragmente antitela (na primer, FAB ili Fv) koji poseduju specifičan vezni afinitet za gotovo svaki izabrani ćelijski receptor. Mada gornji opis primarno vredi za viralne vektore, isti principi mogu da se primene na ne-viralne vektore. Takvi vektori mogu da budu konstruirani tako da sadrže specifične ulazne sekvence koje favorizuju unos u specifične ciljne ćelije.
[0162] Vektori za gensku terapiju mogu da se dostave in vivo uz pomoć administriranja u nekog pojedinačnog subjekta, tipično preko sistemskog administriranja (na primer, intravenozno, intraperitonealno, intramišićno, potkožno, ili intrakranijalnom infuzijom) ili preko topikalne aplikacije, kao šta je opisano ispod. Alternativno, vektori mogu da budu dostavljeni u ćelije ex vivo, poput ćelija izolovanih iz nekog pojedinačnog pacijenta (na primer, limfociti, aspirati koštane srži, tkivne biopsije) ili univerzalnih donorskih hematopoetskih matičnih ćelija, nakon čega sledi re-implantacija istih ćelija u pacijenta, uobičajeno nakon selekcije ćelija koje su ugradile vektor.
[0163] Vektori (na primer, retrovirusi, adenovirusi, liposomi, itd.) koji sadrže nukleaze i/ili donorske konstrukte takođe mogu da se administriraju direktno u organizam sa ciljem transdukcije ćelija in vivo. Alternativno, može da se administrira gola DNA. Administriranje nastupa uz pomoć bilo koje rute koja se uobičajeno koristi za dovođenje nekog molekula u ultimativni kontakt sa krvlju ili tkivnim ćelijama uključujući, ali bez ograničenja, injekciju, infuziju, topikalnu aplikaciju i elektroporaciju. Prikladni postupci za administriranje takvih nukleinskih-kiselina su dostupni i dobro poznati stručnjacima, i, mada može da se koristi više od jedne ruta za administriranje neke određene kompozicije, neka tačno određena ruta često može da obezbedi bržu i efektivniju reakciju nego neka druga ruta.
[0164] Vektori koji su prikladni za uvođenje polinukleotida, ovde opisani, uključuju neintegrativni lentivirusne vektore (IDLV). Vidi, na primer, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferyet al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; U.S. patentnu publikaciju br.2009/054985.
[0165] Farmaceutski prihvatljivi nosioci delomično zavise o naročitoj kompoziciji koja se administrira, kao i o naročitom postupku koji se koristi za administriranje pomenute kompozicije. Prema tome, postoji veliki raspon dostupnih prikladnih formulacija farmaceutskih kompozicija, kao šta je opisano ispod (vidi, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. iz., 1989).
[0166] Podrazumeva se da sekvence koje kodiraju nukleazu i donorski konstrukti mogu da budu dostavljeni primenom istog ili različitih sistema. Na primer, donorski polinukleotid može da se prenosi uz pomoć nekog plazmida, dok jedna ili više nukleaza mogu da se prenose primenom nekog AAV-vektora. Nadalje, različiti vektori mogu da se administriraju preko iste ili različitih ruta (intramišićna injekcija, injekcija u repnu venu, druga intravenozna injekcija, intraperitonealno administriranje i/ili intramišićna injekcija. Pomenuti vektori mogu da se dostave simultano ili uz pomoć bilo kojeg uzastopnog redosleda.
[0167] Tako, ovaj instant pronalazak podrazumeva in vivo ili ex vivo tretman bolesti i stanja koja mogu da se tretiraju sa ugradnjom transgena koji kodiraju neku terapeutsku belančevinu, na primer tretman neke hemoglobinopatije uz pomoć nukleaza-posredovane integracije nekog gena koji kodira neku globinsku belančevinu. Pomenute kompozicije se administriraju ljudskom pacijentu u količini koja je dovoljna da ostvari željenu koncentraciju pomenutog terapeutskog polipeptida u serumu ili ciljnom organu ili u ćelijama. Administriranje može da se provede uz pomoć bilo kojeg načina gde se polinukleotidi dostavljaju u željene ciljane ćelije. Na primer, predviđeni su in vivo i ex vivo postupci. Intravenozna injekcija u portalnu venu je preferirani postupak za administriranje. Drugi modeli in vivo administriranja uključuju, na primer, direktnu injekciju u režnje jetra ili u žučnu kesu i intravenoznu injekciju distalno od jetra, recimo preko jetrine arterije, direktnu injekciju u parenhim jetra, injekciju preko jetrine arterije, i/ili retrogradnu injekciju kroz bilijarni trakt. Ex vivo modeli administriranja uključuju in vitro transdukciju mirujućih hepatocita ili drugih jetrinih ćelija, nakon čega sledi infuzija transdukovanih, mirujućih hepatocita nazad u portalnu vaskulaturu, jetrini parenhim ili bilijarni trakt ljudskog pacijenta, vidi na primer, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.
[0168] Efektivna količina nukleaza i donora koja treba da se administrira varira od pacijenta do pacijenta i u skladu sa terapeutskim polipeptidom od interesa. Prema tome, efektivne količine najlakše se određuju od strane lekara koji administrira pomenute kompozicije, ali takođe odgovarajuće doze može lako da odredi bilo koji stručnjak u području. Nakon predviđenog dovoljno dugog razdoblja za zadovoljavajuću integraciju i ekspresiju (tipično 4-15 dana, na primer), analiza serumskih nivoa, ili nivoa u nekom drugom tkivo, terapeutskog polipeptida i uporedba sa početnim nivoom pre administriranja govori da li je količina koja je bila administrirana preniska, u potrebnim granicama ili previsoka. Prikladni režimi za inicijalno i naknadna administriranja takođe variraju, ali su određeni sa inicijalnim administriranjem nakon čega slede naknadna administriranja ako je potrebno. Naknadna administriranja mogu da se obave u različitim intervalima, rasponima od dnevnih do godišnjih pa sve do svakih nekoliko godina. Stručnjak razume da odgovarajuće imunosupresivne tehnike mogu da se preporuče sa ciljem izbegavanja inhibicije ili blokade transdukcije preko imunosupresije proces dostave vektora, vidi na primer, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther.6:1391-1401.
[0169] Formulacije ex vivo i in vivo administriranja obuhvataju tečne suspenzije i emulzije. Aktivni sastojci su često pomešani sa ekscipijentima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Prikladani ekscipijenti uključuju, na primer, vodu, slani rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol i slično, i njihove kombinacije. Osim toga, pomenuta kompozicija može da sadrži manje količine pomoćnih supstancija, poput, agenasa za vlaženje i za emulziju, pH-pufere, stabilizatore ili druge reagense koji pojačavaju efikasnost same farmaceutske kompozicije.
Aplikacije
[0170] Pomenuti postupci i kompozicije, ovde opisani, su namenjeni za modifikovanje ekspresije belančevina, ili za korigovanje sekvence aberantnog gena koja kodira belančevinu koja uzrokuje neku gensku bolesti, poput bolesti srpastih ćelija ili neke talasemije. Tako, pomenuti postupci i kompozicije su namenjene za tretman i/ili sprečavanje takvih genskih bolesti. Genomsko editiranje, na primer matičnih ćelija, se koristi za korigovanje nekog aberantnog gena, ugradnju gena divljeg-tipa, ili promene ekspresije nekog endogenog gena. Uz pomoć ne-ograničavajućeg primera, neki gen divljeg-tipa, na primer koji kodira barem jedan globin (na primer, α- i/ili β-globin), može da se ugradi u ćeliju sa ciljem obezbeđivanja globinskih belančevina koje su nefunkcionalne i/ili nedostaju u ćeliji pa se time tretira neka genska bolesti, na primer, neka hemoglobinopatija, koja je uzrokovana neispravnom ekspresijom globina. Alternativno tj. osim toga, genomsko editiranje sa ili bez administriranja nekog odgovarajućeg donora, može da koriguje pomenuti neispravan endogeni gen, na primer, uz pomoć ispravljanja tačkaste mutacija u α- ili β-hemoglobinu, koje obnavlja ekspresiju pomenutog gena i/ili tretira neku gensku bolest, na primer, bolest srpastih ćelija i/ili nokautira ili menja (prekomerna ekspresija ili represija) neki regulacioni gen koji direktno ili indirektno reguliše globinski gen (na primer, inaktivacija γ-globin-regulacionog gena BCL11A ili BCL11A-regulatora KLF1).
[0171] Postupci i kompozicije iz ovoga pronalaska mogu takođe da se primenjuju u bilo kojim okolnostima kada je poželjno da se dostavi neki transgen koji kodira jedan ili više terapeutika tako da se pomenuti terapeutik(ci) proizvodi u RBC i/ili u hematopoetskoj matičnoj ćeliji tako da zreli RBC, koji proizlaze iz pomenutih ćelija, sadrže pomenuti terapeutik.
[0172] Sledeći Primeri opisuju aspekte ovoga pronalaska gde nukleaza podrazumeva zincfinger nukleazu (ZFN) ili TALEN.
PRIMERI
Primer 1: Dizajn, konstrukcija i opšta karakterizacija zinc-finger proteinskih nukleaza (ZFN)
[0173] Zinc-finger belančevine su bile dizajnirane i ugrađene u plazmide, AAV ili adenoviralne vektore posebice kao šta je opisano od strane Urnov et al. (2005) Nature 435(7042): 646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816, i kao šta je opisano u U.S. patentu br.
6,534,261. Za ZFN i TALEN koji su specifični za ljudski beta-globinski lokus i za ljudski HPRT lokus, vidi zajednički dokument, U.S. patent br. 7,888,121 i U.S. patentne publikacije br.
20130137104 i 20130122591. Za nukleaze koje su specifične za ljudski AAVS1, vidi zajednički U.S. patent br.8,110,379. Za nukleaze koje su specifične za CCR5, vidi zajednički U.S. patent br. 7,951,925. Za nukleaze koje su specifične za albumin, vidi U.S. patentne publikacije br.
20130177983 i 20139177968.
Primer 2: Aktivnost ZFN specifičnih za globin
[0174] ZFN-parovi koji ciljaju ljudski globinski lokus ili regulatore ekspresije beta-sličnog globinskog gena su korišćeni sa ciljem testiranja sposobnosti pomenutih ZFN da indukuju DSB u specifičnom ciljnom mestu. Amino-kiselinske sekvence iz regiona heliksa za prepoznavanje na svakom prstu navedenih ZFN su prikazani u Tabeli 1A zajedno sa celim ciljnim mestima (DNA-ciljna mesta su označena velikim slovima; ne-kontaktni nukleotidi su označeni malim slovima).
Tabela 1A: Zinc-finger nukleaze
SBS #,Meta Dizajn
1
2
4
Egzon4
1
[0175] Test sa Cel I (Surveyor™, Transgenomics) kao šta je opisano u Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 i Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol.649:247-56) je korišćen sa ciljem da se otkriju ZFN-indukovane modifikacije ciljnog gena u K562-ćelijama ili HSC. U ovom ogledu, PCR-amplifikacija ciljnog mesta je praćena kvantifikovanjem insercija i delecija (indels) uz pomoć encima Cel I koji otkriva pogrešno-sparane baze (Yang et al. (2000) Biochemistry 39: 3533-3541) koje obezbeđuje nisko-limitiranu procenu frekvencije DSB. Tri dana nakon transfekcije ZFN-ekspresionog vektora u standardnim uslovima (37° C) ili uz pomoć hipotermičkog šoka (30° C, vidi zajedničku US patentnu publikaciju br.20110041195), genomska DNA je izolovana iz K562-ćelija primenom kompleta hemikalija DNeasy (Qiagen).
[0176] Rezultati Cel I ogleda su pokazali da su ZFN bili sposobni da indukuju cepanje u njihovim odgovarajućim ciljnim mestima (vidi, takođe, zajednički U.S. provizornu prijavu br.
61/556,691). Rezultati su prikazanu na Slici 1, a pokazuju da su aktivne belančevine bile pronađene kod najvećeg dela ciljanih lokusa u beta-globinskom genu.
Primer 3: Editiranje beta-globinskih lokusa
[0177] ZFN specifični za ljudski beta-globinski gen (HBB) (Tabela 1) su korišćeni za uvođenje donorske DNA u beta-globinski lokus na sledeći način. Donorske DNA su dizajnirane tako da sekvenca koja kodira gen HBB je obrubljena sa sekvencama koje su homologne (homologne ruke) sa regionom koji okružuje mesto cepanja ZFN u beta-globinskom genu. Pomenute homologne ruke su duge približno 500-600 pb. HBB-donorska sekvenca ne sadrži nekodirajuće sekvenca tako da kada se ugradi u beta-globinsko ciljno mesto, ekspresija samog donora je regulisana sa beta-globinskim promotorom i sa bilo kojim drugim beta-globinskim regulacionim sekvencama. Kada se ugradi, HBB-donor se uklopi u okvir čitanja endogenih globinskih sekvenci koje rezultuje pojavom fuzione belančevine. Osim toga, HBB-donorke oligo-sekvence su dizajnirane za uklapanje u pocepani HBB-gen nakon ZFN-tretmana. Pomenute oligo-sekvence sadrže restrikciono mesto tako da se nakon ugradnje pomenutih oligo-sekvenca uvodi novo restrikciono mesto u HBB-genu koje može naknadno da se pocepa.
2
[0178] Kao šta je pokazano na Slici 2A, β-globinski oligo-donor je ugrađen u odgovarajući lokus, kao šta je verifikovano prisutnošću novog restrikcionog mesta u samoj donorskoj DNA. Nadalje, kao šta je prikazano na Slici 2B, analiza sa Cel I pokazuje da je nekoliko pomenutih ZFN-parova bilo sposobno da cepa DNA mada je sama oligo-sekvenca bila prisutna samo u primerku u liniji 8.
[0179] Za potrebe diferenciranja transgenih CD34<+>-ćelija u zrele RBC bili su primenjeni postupci koji su poznati stanju tehnike. Na primer, SCD CD34<+>-ćelije su bile prečišćene primenom Ficoll-Paque (GE Healthcare) i CD34<+>-mikrokuglica (Miltenyi Biotec) u skladu sa uputama proizvođača. CD34<+>-ćelije su kultivirane u medijumu MDM (Iscove) sa BIT 95000 (StemCell Technologies) u prisutnosti faktora rasta. Ćelije su diferencirane u smeru eritroidne linije primenom 2-faznog tečnog modela kulture. Tokom prvih 6 dana (prva faza), CD34<+>-ćelije su namnožene uz pomoć SCF (100 ng/ml), Flt3-L (100 ng/ml), i IL-3 (20 ng/ml). Namnožene ćelije su tada zavetovane i diferencirane u smeru eritroidne linije (druga faza) uz pomoć Epo (2 U/ml) i SCF (50 ng/ml). Vidi, Giarratana et al. (2011) Blood 118(19):5071-9.
Primer 4: korekcija mutacija u beta-globinskom genu
[0180] Sa ciljem da se koriguju mutacije u beta-globinskom genu iz ljudske srpaste ćelije (srpasta anemija), dvolančani lom je uveden u beta-globinskom lokusu uz pomoć ZFN nakon DNA-popravka primenom egzogenog korektivnog oligonukleotida kao kalupa ("donorska oligo-sekvenca"). Sa ciljem izbegavanja mogućnosti nukleaznog cepanja korigovanog globinskog gena (onog kod kojeg je donorska oligo-sekvenca uzrokovala korekciju srpastemutacije u endogenom HBB-genu), bila je dizajnirana druga donorska oligo-sekvenca koja istovremeno uvodi translaciono-tihe mutacije u kodirajuću sekvencu HBB tako da korigovanim alelima nedostaje jedna od ZFN-ciljnih sekvenca. Na taj način se postiže povećanje frekvencije korigovanog alela sa željenom genskom korekcijom. Sa ciljem dizajniranja optimalnog oligonukleotidnog donora ispitano je nekoliko mutacija u ZFN-ciljnoj sekvenci kao i dužina homolognih ruku.
[0181] Ispod je prikazana sekvenca koja okružuje srpastu-mutaciju, a brojne mutacije su navedene sa brojevima. Tako, mutacija 1 = promena G u A, mutacija 2 = promena G u A, mutacija 3 = promena TCT u AGC, mutacija 4 = promena C u T, a mutacija 5 = promena T u G. Generisani su oligonukleotidi koji sadrže brojne kombinacije mutacija. Sekvenca divljegtipa ("wt") je navedena na vrhu (SEQ ID NO: 231), a sekvenca sa mutacijama ("mut") ispod (SEQ ID NO: 232).
[0182] Ciljna mesta za nukleaze ("meta") su označena masnim linijama, a mesta sa srpastimmutacijama su uokvirena. Oligonukleotidi su označeni u skladu sa mutacijama, tako, na primer, oligonukleotid SMS1 poseduje samo mesto tihe mutacije 1, dok SMS 124 sadrži mesta tihih mutacija 1, 2 i 4.
[0183] Razne oligo-sekvence su dostavljene u CD34<+>-ćelije u formi jednolančanih molekula kao 'sense' tj. 'forward' lanci (označenih kao 'F') ili 'antisense' tj. 'reverse' lanci (označenih kao 'R'). Pomenute oligo-sekvence su bile dostavljene primenom transfekcije sa uređajem BTX ECM 830 Square Wave sa ili bez nukleaza. Osim ako je drugačije navedeno, dostavljeno je 3 µg nukleaze. Gensko editiranje je izmereno primenom high-throughput DNA-sekvenciranja PCR-amplikona HBB-gena. Procenat genske modifikacije uz pomoć ne-homolognog spajanja krajeva ("NHEJ", uzrokovanog popravljanjem dvolančanog loma u DNA nakon ZFN-indukovanog cepanja) ili ciljane integracije oligo-sekvenca nakon ZFN-cepanja ("genska korekcija") je naveden u Slici 9. Rezultati pokazuju da su neke kombinacije mutacija sposobne da pojačaju gensku korekciju u ćelijama tako da čak 20% pomenutih ćelija prikazuje gensku korekciju u srpastom-lokusu.
[0184] Sa ciljem da se ispita efekt dužine homolognih ruku na procenat genske korekcije, korišćeni su SMS12- i SMS124-oligo sa 41 i 46 nukleotida (donorski oligo od 88 pb) ili 50 i 50 nukleotida homologije (donorski oligo od 101 pb) na svakoj strani mesta sa srpastommutacijom. Rezultati (vidi Sliku 10) pokazuju da su ruke sa dužom homologijom bile uspešnije u genskoj korekciji gde je čak 40% alela ugrađivalo promene specifikovane preko same oligosekvence. Pomenute oligo-sekvence su prikazane ispod:
SMS124, 88 pb, R (SEQ ID NO: 233):
SMS12, 88 pb, R (SEQ ID NO: 234):
4
[0185] Sa ciljem da se ispita kapacitet diferencijacije u izdržljivost genske korekcije tokom diferencijacije CD34<+>-ćelija, nakupine ZFN-modifikovanih CD34<+>-ćelija su potaknute da diferenciraju uz pomoć MethoCult-metilcelulozog medijuma od StemCell Technologies u skladu sa instrukcijama proizvođača. Diferencijacija je analizirana pomoću testa off-colony tipova koji nastaju nakon MethoCult-indukovane diferencijacije: jedinice koje formiraju kolonije, eritroidne ("CFU-E"); burst-forming jedinice, eritroidne ("BFU-E"); jedinice koje formiraju kolonije, granulocit/makrofag ("CFU-GM") i jedinice koje formiraju kolonije; granulocit/eritrocit/monocit/makrofag ("CFU-GEMM"). Rezultati pokazuju da ZFN-tretirane ćelije zadržavaju isti kapacitet diferencijacije kao i lažno-transfektovane ćelije. Individualne BFU-E kolonije su izabrane iz ploče i genotipizirane za HBB. Rezultati pokazuju da ZFN-indukovane modifikacije ostaju tokom diferencijacije kolonija (vidi Sliku 11). Dalje, frekvencija modifikacije BFU-E kolonija je slična kao i frekvencija modifikovanih alela u početnoj nakupini, koje isključuje bajas protiv editiranih ćelija tokom formiranja BFU-E. Osim toga, ćelijska populacija kao celina je testirana na gensku modifikaciju tokom trajanja ćelijske diferencijacije crvenih krvnih ćelija u tečnoj kulturi in vitro. Modifikacije su stabilne kroz barem 18 dana procesa ćelijske diferencijacije crvenih krvnih ćelija (vidi Sliku 12).
[0186] Druga uobičajena mutacija u beta-globinskom genu koja je povezana sa betatalasemijom je poznata kao IVS1.1. Ova mutacija tipa G->A je locirana u prvom baznom paru iz introna 1 u beta-globinskom genu, a njena prisutnost u genu rezultuje pogrešnim splajsovanjem beta-globinske pre-mRNA. Tako, konstruiran je par ZFN da prepoznaje i cepa pomenuti region, a tipično rekapitulitajući ovu mutaciju kao model. Testiranje pomenutih ZFN je pokazalo da iste mogu da cepaju pomenuto mesto u beta-globinskom genu koje uzrokuje 52.63% NHEJ u CD34<+>-ćelijama.
Primer 5: ugradnja beta-globinskog donora u safe-harbor lokus
[0187] Sa ciljem da se ugradi beta-globinski gen divljeg-tipa u neki safe-harbor lokus, tako da ekspresija pomenutog transgena koriguje beta-globinski deficit u HSC, u ćeliju su uvedene nukleaze specifične za pomenuti safe-harbor lokus zajedno sa donorskom nukleinskomkiselinom. Nukleaze specifične za HPRT (vidi zajedničke U.S. patentne publikacije br.
20130137104 i 20130122591), AAVS1 (vidi U.S. patent 8,110,379), CCR5 (vidi U.S. patent 7,951,925) ili beta-globin (vidi Tabelu 1A) su uvedene u CD34<+>-matične ćelije derivirane iz pacijenta. Uvođenje može da se provede primenom bilo kojeg postupka koji je poznat stanju tehnike poput mRNA-elektroporacije. Donorska DNA je dizajnirana da sadrži pomenuti transgen, beta-globin divljeg-tipa i homologne regione koji okružuju pomenuti transgen sa dovoljnom količinom homologije prema regionu koji okružuje safe-harbor metu kako bi se omogućio HDR (tipično 500 pb na svakoj strani). Alternativno, može da se obezbedi donorski konstrukt, koji ne sadrži ili sadrži homologne regione, koji je integrisan u ZFN ili TALEN-ciljani lokus uz pomoć zarobljavanja krajeva (vidi US aplikaciju br. 13/889,162). Pomenuti donor je uveden u CD34<+>-ćelije pre, tokom ili nakon uvođenja ZFN. Modifikovane CD34<+>-ćelije su ponovo vraćene u pacijenta, a nakon presađivanja su proizvodile beta-hemoglobin u zadovoljavajućim nivoima koji su omogućavali proizvodnju terapeutski relevantne količine hemoglobina.
Primer 6: inaktivacija BCL11A i KLF1
[0188] Nukleaze specifične za BCL11A i KLF1 (na primer, ZFN kao šta je prikazano u Tabeli 1A) su uvedeni u HSC kao šta je opisano iznad sa ciljem da uzrokuju pozitivnu regulaciju ekspresije gama-globina (vidi Slika 3), a genom ćelija je analiziran uz pomoć ogleda Cel I kao šta je opisano iznad (Perez et al (2008), ibid).
[0189] Kao šta je prikazano na Slici 4, nakon tretmana HSC sa navedenim ZFN specifičnim za KLF1, pomenuti ZFN su uspešno modifikovali KLF1-lokus (Slike 4C i 4D). Isto tako, ZFN specifični za BCL11A su modifikovali BCL11A-lokus (Slika 4A). Par ZFN koji cilja HPRT-lokus (vidi zajedničku U.S. provizornu prijavu 61/552,309) je korišćen kao kontrola koja je takođe pokazala uspešno cepanje (Slika 4B). Uporedba signala tokom dana 3 nakon transdukcije CD34<+>-ćelija sa onim od dana 17 tokom kulture za diferencijaciju (Slika 4E) je pokazala da je procenat genskog editiranja (%NHEJ) stabilan tokom vremena. U svakom gelu koji je prikazan na Slici 4E, linije bez identifikacije su negativne kontrole.
[0190] Korišćeni su i dodatni parovi ZFN, koji ciljaju egzon 2 ili egzon 4 iz BCL11A. Za ove studije, ZFN-parovi kandidati su uvedeni u K562-ćelije (Amaxa) kao šta je ranije opisano ili su uvedeni u CD34<+>-ćelije. Za transdukciju CD34<+>-ćelija je korišćena naprava BTX ECM830 uz pomoć kivete za procepom od 2 mm. mRNA iz ćelija su pripremljene uz pomoć kompleta hemikalija mMessageMachine T7 Ultra (#AM1345, Ambion). Ljudske CD34<+>-ćelije su uzgajane u medijumu x-vivo10 (Lonza) na pločicama za ne-tkivne kulture tretirane sa 1x CC110 (StemCell Technology). Ćelije su izbrojane i sakupljene uz pomoć centrifugovanja na 1200 rpm tokom 10 min na sobnoj temperatura. Ćelije su isprane 1-2x sa PBS na sobnoj temperaturi.
200000 ćelija je korišćeno za svaku transfekciju, a bile su resuspendovane u 100 µL BTexpressrastvora. Po transfekciji je dodano 2-4 µg mRNA, a smeša je prenesena u kivetu. Odmah nakon prenosa, smeša je elektroporirana na 250V tokom 5 ms. U kivetu je dodan pre-ugrejan medijum, a medijum i ćelije su preneseni u pločice sa 48 komorica za ne-tkivnu kulturu i sve je inkubirano na 37° C.
[0191] Nakon specifikovanog broja dana, ćelije su tada bile podvrgnute genomskoj analizi uz pomoć MiSeq (Illumina). Sa ciljem da se kvantifikuje procenat editiranih alela, genomski region od interesa je PCR-amplifikovan uz pomoć prajmera koji dodaju standardne adapter-sekvence za sekvenciranje od Illumina.13 rundi PCR je provedeno sa ciljem da se doda barkod i premoste adapter-sekvence na oba kraja. Sekvenciranje je provedeno na MiSeq (Illumina) prema instrukcijama proizvođača koristeći protokole za sekvenciranje amplikona. MiSeq generiše paired-end nalaze, koji su spojeni, a adapter je otklonjen primenom standardnog softvera za poravnanje. Nalazi su tada demultiplikovani po primerku uz pomoć parova barkod-sekvenca uz primenu prilagođenih skripta (custom scripts). Sekvence amplikona su tada globalno poravnane sa referentnom sekvencom implementiranjem algoritma Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B.; & Wunsch, Christian D. (1970). Jour Mol Bio 48 (3): 443-53). Praznine ili insercije u poravnanju su izbrojane kao % NHEJ-događaja i upoređene sa netretiranom sekvencom kontrolnog primerka sa ciljem da se odrede stope pozadina koje su specifične za sekvencu.
[0192] Za računanje ciljane integracije, amplikon-sekvence su bile globalno poravnane u odnosu na referentnu sekvencu pomoću biopython-implementacije preko algoritma Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B.; & Wunsch, Christian D. ibid). Promene u sekvencama generisane uz pomoć eksperimentalnih tretmana su ispitane, izbrojane, i upoređene sa istim u kontrolnim primercima. Poznati pojedinačni polimorfizmi (single feature polymorphisms, SFP) mogu da budu maskirani tokom ovog procesa i izuzeti iz daljnjeg brojanja (na primer, SFP-delecija od 1 pb blizu do ZFN ciljnog mesta). Procenat NHEJ (takođe označen kao indels) je izračunat uz pomoć određivanja procenta sekvenci koje sadrže insercije i delecije. Primerci koji su bili tretirani samo sa GFP-vektorom su korišćeni za procenu pozadinske frekvencije insercija i delecija na bazi greške PCR i sekvenciranja. Primećeno je manje od 1% pozadinske frekvencije.
[0193] Reprezentativan set podataka je predstavljen ispod u Tabeli 1B, a pokazuje da su pomenute proteinske nukleaze aktivne u cepanju svojih meta. Osim toga, ekspresija gamaglobinskog gena je praćena u nekim ćelijama koje su bile tretirane sa nukleazom. Sa ciljem da se provede ova analiza, real-time-RT-qPCR ("Taqman") je bio korišćen kao standardna procedura (vidi ispod). Rezultati iz reprezentativnog seta podataka su prikazani kao količina (puta) povećanja ekspresije gama-globinskog gena upoređeno sa kontrolnim ćelijama tretiranim sa GFP. Gama-vrednosti su izračunate kao omer gama-globina u odnosu na alfa-globin, tako da svako primećeno povećanje prikazano ispod predstavlja povećanje u omeru gama naspram alfa u ćelijama tretiranim sa nukleazom upoređeno sa omerom gama naspram alfa u ćelijama tretiranim sa GFP-vektorom.
Tabela 1B: aktivnost ZFN parova specifičnih za egzon 2 i egzon 4 iz BCL11A
[0194] Za regione egzona 2 i egzona 4 iz BCL11A takođe su konstruirani i TALEN-parovi. Pomenuti TALEN su konstruirani kao šta je opisano prethodno, uz primenu kanonskog TALE-koda i '+17' TALEN-okosnice (vidi zajedničku U.S. patentnu publikacija 20110301073). Tabela 1C prikazuje ciljne sekvence za TALEN kao i RVD-sekvencu u DNA-veznom domenu.
Tabela 1C: TALEN-parovi protiv BCL11A
[0195] Pomenuti TALEN-parovi pokazani iznad su uvedeni u ćelije gde su pokazale aktivnost cepanja. Par 101291/101292 je ostvario vrednost od 0.8% indels kao šta je izmereno uz pomoć Cel I ogleda u K562-ćelijama. TALEN par 101301/101304 je ostvario vrednost od 35.7% indels u CD34<+>-ćelijama, a uz pomoć RT-PCR iznad opisanog ogleda je bilo pronađeno da indukuju povećanje ekspresije gama-globinske mRNA za oko 2.31 puta.
[0196] Takođe su konstruirani ZFN-parovi za ciljanje 'XL' dela iz BCL11A-XL varijante splajsovanja. Ove belančevine su bile testirane u K562-ćelijama, a reprezentativni podaci su prikazani ispod u Tabeli 1D. Pomenuta 'XL'-izoforma BCL11A sadrži 3 dodatna prirodna zincprsta (prsti 4-6), tako da je primenjen pristup uključivao disrupciju gena BCL11A gen u tom regionu sa ciljem uzrokovanja otvaranja potencijalnih zinc-prstiju 4, 5, i/ili 6 i njihovih kombinacija (brojevi 1 do 3 u XL-regionu). Pomenuti ZFN su takođe konstruirani za izbegavanje cepanja sekvence BCL11B-sličnog gena. Jedan ZFN-par, 44888/44889, je ciljao četvrti zinc-prst iz BCL11A, dva para, 44904/44905 i 44910/44911, su ciljali uzvodno od pomenutog četvrtog prsta (broj 1 u XL-regionu) dok su dva druga para, 44946/44947 i 44945/44944, ciljali peti prst (broj 2 u XL-regionu). Pomenute belančevine su testirane u K562-ćelijama, a reprezentativan set podataka je prikazan ispod u Tabeli 1D. Dva od pomenutih ZFN-parova su sadržavala nove linker-sekvence između ZFP DNA-veznog domena i domena Fok1-nukleaze. Pomenuti 44904/44905-par sadrži L7a linker-sekvencu (vidi U.S. patentnu aplikaciju br. 20090305419) i 44946/44947-par sadrži L8p linker-sekvencu, a obe su prikazane ispod. Vidi takođe U.S. provizornu prijavu br.61/871,219:
L7a: HTKIHLRGSQLVKSKSEAAAR (SEQ ID NO: 244)
L8p: HTKIHLRGSYAPMPPLALASP (SEQ ID NO: 245).
Tabela 1D: aktivnost ZFN-parova specifičnih za BCL11A XL
[0197] Parovi protiv BCL11A XL su tada testirani u CD34<+>-ćelijama i pokazalo se da su aktivni. Merenja ekspresije gama-globinskog gena pokazuju da modifikacija BCL11A XL rezultuje povećanjem ekspresije gama-globinskog gena u odnosu na alfa-globinski.
[0198] Dodatni parovi KLF1-specifičnih ZFN su testirani na aktivnost u CD34<+>-ćelijama, a pomenute ćelije su analizovane sa ciljem provere promene ekspresije gama-globinskog gena. Reprezentativan set podataka je prikazan ispod u Tabeli 1E.
Tabela 1E: aktivnost KLF-specifičnih ZFN-parova
[0199] Pomenuti omeri mRNA koje kodiraju γ-globin i β-globin nakon tretmana sa BCL11A-ili KLF1-specifičnim nukleazama u HSC su određene u raznim vremenskim tačkama tokom 17 dana nakon uvođenja ZFN primenom Taqman-analize, a nivoi beta-globinske mRNA su takođe normalizovani prema nivoa 18S rRNA. Nivoi ekspresije gama-globinskog gena su se povećali u ćelijama koje su bile tretirane sa BCL11A- ili KLF1-specifičnim nukleazama (Slika 5). Analiza je provedena primenom standardne Taqman-analize, nakon protokola uz korišćenje genski-specifičnih ogleda obezbeđenih od strane proizvođača (Applied Biosistems).
[0200] Ćelije sa ZFN-modifikovanim genom BCL11A su takođe analizovane sa ciljem da se odrede omeri γ/β-mRNA između ćelijskih populacija u kojima je jedan alel bio modifikovan sa pomenutim ZFN ("Bb"), ćelija u kojima su oba alela bila modifikovana sa ZFN ("nokaut") i ćelija divljeg-tipa ("BB").
[0201] Kao šta je prikazano na Slici 6, pomenuti omeri γ/β-mRNA se razlikuju između ćelija u kojima se BCL11A-nokaut pojavljuje u samo jednom alelu (Bb, stupci 6-10 sa leve strane) i tamo gde su oba alela nokautirana (nokaut, desno 5 stupaca, stupci 11-15 sa leve strane), a obe grupe ćelija se razlikuju od ćelija divljeg-tipa (BB, prvih 5 stupaca).
Primer 7: modifikacija regulacionog regiona gama-globinskog gena
[0202] U drugom pristupu povećanja ekspresije gama-globina, mutacije su uvedene u regulacioni region gama-globinskog gena sa ciljem da oponašaju HPFH-mutacije (vidi Sliku 9). Ispod je prikazan region od -202 do -102 u odnosu na ATG u gama-globinskom genu. Na ovoj sekvenci, sive kutije označavaju delove za koje se zna da su povezani sa HPFH, a prikazana je i podcrtana sekvenca koja se, kada je deletirana, takođe povezuje sa HPFH (vidi A Syllabus of Thalassemia Mutations (1997) od Titus H.J. Huisman, Marianne F.H. Carver, & Erol Baysal, izdan od The Sickle Cell Anemia Foundation in Augusta, GA, SAD. Copyright<©>1997 od Titus H.J. Huisman):
-202
1
[0203] Nukleaze su dizajnirane kao šta je opisano u Primeru 1, prikazane su u Tabeli 1A, a vežu se na region sa pomenutim HPFH-povezanim mutacijama kako bi indukovale mutacije u regionu divljeg-tipa. Procenat otkrivenih editiranih alela (%NHEJ) u K562-ćelijama uz pomoć Cel I analize (vidi Perez et al (2008), ibid) je prikazan ispod u Tabeli 2. Osim toga, neki parovi su testirani u CD34<+>-ćelijama kao šta je opisano iznad i analizovani uz pomoć MiSeqsekvenciranja kao šta je opisano iznad. Za neke parove, ćelije su analizovane sa ciljem da se primeti bilo kakva promena u ekspresiji gama-globina. Tabela 2 ispod prikazuje reprezentativne setove podataka:
Tabela 2: editiranje uz pomoć ZFN-parova specifičnih za gama-globin
[0204] Prva tri testirana para u ovom ogledu ciljaju region oko -175 u gama-promotorskom regionu dok poslednja dva ciljaju -110 region u gama-globinskom promotoru.
[0205] Region gama-promotora u K562-ćelijama koji je editiran je sekvenciran sa ciljem analizovanja kreiranih mutacija. Pomenuti region je najpre PCR-amplifikovan, tada su PCR-produkti sekvencirani, nakon čega je određen broj različitih mutacija, uključujući delecije i insercije (Slika 8). U ovom eksperimentu, 42% od alela je bilo mutirano, a 20% su imali deleciju od 13 pb od -114 do -102 koja je bila povezana sa HPFH.
[0206] Dva para ZFN koja su ciljala gama-globinski promotor su takođe korišćena da se ćelije tretiraju zajedno sa oligonukleotidnim donorom koji je bio dizajniran da obnovi najčešće mutacije u subjektu koji ima HPFH. Isti protokol, opisan iznad za upotrebu sa BTX-napravom, je proveden uz pomoć dodavanja 3 µL 100 µM rastvora donor-oligonukleotida. Sekvence oligonukleotida-donora su prikazane ispod. Tipično, u ovim eksperimentima je korišćen
2
forward-oligonukleotidni donor, ali i reverse-donor je takođe funkcionisao:
[0207] Za ZFN-par 34539/34574 u prisutnosti donora, mRNA-proizvodnja sa gama-globinskog gena se povećala 6.38-puta ako se uporedi sa ćelijama koje su tretirane sa GFP-vektorom dok za ZFN-par 31160/34365, količina gama-mRNA se povećala za 6.13-puta ako se uporedi sa ćelijama koje su bile tretirane sa GFP-vektorom.
[0208] HSC tretirane sa nukleazom su bile uzgajane na metilcelulozi. Nakon genotipiziranja pojedinačnih kolonija uz pomoć PCR-sekvenciranja, izmerili smo nivoe mRNA za gamaglobin, beta-globin i 18s rRNA (kontrola) u kolonijama divljeg-tipa i u mutiranim kolonijama primenom RT-PCR. (Slika 8). U proseku, mutanti u gama-globinskom promotoru su pokazivali viši omer gama-globina u odnosu na beta-globin u odnosu na ćelije divljeg-tipa, a korekcija uz pomoć signala od 18s rRNA pokazuje da je pomenuto povećanje u omeru gama-globin/betaglobin u mutiranim kolonijama uzrokovano povećanjem nivoa gama-globinske mRNA u pomenutim kolonijama umesto preko smanjivanja nivoa beta-globinske mRNA.
Primer 8: TALE-nukleaze koje ciljaju gama-globinski promotor
[0209] Takođe su pripremljene TALE-nukleaze za ciljanje regiona -200 ili regiona -110 (kao šta je opisan iznad) iz regiona gama-globinskog promotora. Pomenuti TALEN su konstruirani kao šta je prethodno opisano uz primenu kanonskog TALE-koda i '+17' TALEN-okosnice (vidi zajedničku U.S. patentnu publikaciju 20110301073).
Tabela 3: TALEN specifični za gama-globinski promotor
[0210] Pomenuti TALEN su tada korišćeni u parovima kako bi se testiralo cepanje u K562-ćelijama i isto procenilo uz pomoć ogleda Cel I kao šta je opisano prethodno, a rezultati pomenutih parova su prikazani ispod u Tabeli 4. Osim toga, TALEN-par 102566/102568 je testiran protiv CD34<+>-ćelija gde je pronađeno da uzrokuje 51.39% NHEJ koje je izmereno uz
4
pomoć MiSeq-analize.
[0211] Dva para pomenutih TALEN su takođe testirana u slučaju ekspresije gama-globinske mRNA koja je izmerena preko omera gama-globinske naspram alfa-globinske mRNA. Par 102566/102568 je uzrokovao povećanje gama-globinske ekspresije za 6.25 puta ako se uporedi sa CD34<+>-ćelijama koje su tretirane sa GFP-vektorom, a par 102318/102314 je povećano gamaglobinsku ekspresiju za 2.14 puta ako se uporedi sa CD34<+>-ćelijama koje su bile tretirane sa GFP-vektorom. Takođe je testiran par 102566/102568 sa donorskom oligo-sekvencom opisanom iznad, a u nastalim ćelijama je bilo otkriveno povećanje gama-globinske ekspresije za 9.13 puta ako se uporedi sa CD34<+>-ćelijama koje su bile tretirane sa GFP-vektorom.
Tabela 4: editiranje regiona gama-globinskog promotora uz pomoć TALEN
Primer 9: editiranje gama-globinskog gena u CD34<+>-matičnim ćelijama
[0212] Nukleaze koje su specifične za promotorski region gama-globinskog gena su tada korišćene u CD34<+>-ćelijama dobivenih iz pacijenta. Pomenute ćelije su tretirane sa nukleazama, a tada su analizovane sa ciljem da se proceni uspešno editiranje primenom Cel I analize. Ćelije su dalje analizovane sa ciljem da se ispitaju omeri gama-globina naspram beta-globina i da se pokaže povećana ekspresija gama-globinskog gena. Reprezentativni podaci su koji ukazuju na povećanu ekspresiju gama-globinskog gena se nalaze u eksperimentalnim delovima različitih pristupa opisnih iznad.
Primer 10: presađivanje editiranih CD34<+>-ćelija nazad u miševe
[0213] Ćelije CD34<+>-tretirane sa nukleazom (ljudske matične progenitor-ćelije HSPC) su zadržale sposobnost da budu presađene nazad u miševe NOD/SCID/IL2rgama(null) i proizvode poliklonske multi-linijske potomke u kojima su geni uključeni u regulaciji gama-globinskog gena permanentno razoreni (vidi Holt et al, (2010) Nat Biotechnol. Aug; 28(8):839-47). Slično, CD34<+>-ćelije ili HSPC editirane u beta-globinskom lokusu u kojem je korigovana mutacija, ili je donorski beta-globinski gen ugrađen u neki safe-harbor lokus, ili su tretirane sa nukleazama sa ciljem menjanja ekspresije gama-globinskog gena mogu da se presade nakon čega proizvode multi-linijske potomke koje sadrže željeno genomsko editiranje. Demonstracija da manji deo editiranih HSPC može da proizvede populaciju ćelija u životinjama sa editranim potomstvom podupire primenu autolognih hematopoetskih matičnih ćelija modifikovanih nukleazom kao klinički pristup za tretiranje neke hemoglobinopatije.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Genetički modifikovana crvena krvna prekursorska ćelija, naznačena time, što sadrži genomsku modifikaciju unutar egzona 2 ili egzona 4 iz gena BCL11A ili unutar BCL11A-XL proizvedena nakon cepanja unutar gena BCL11A sa zinc-finger nukleazom (ZFN), TALE-nukleazom (TALEN) ili CRISPR/Cas-sistemom koji se vežu na ciljno mesto unutar jedne od SEQ ID NO: 56, 63, 66, 71, 160, 170, 179, 183, 189, 193, 197, 200, 203, 207, 211 i 213 tako da je pomenuti gen BCL11A inaktivisan, a ekspresija gama-globina povećana.
2. Genetički modifikovana crvena krvna prekursorska ćelija iz zahteva 1, naznačena time, što je pomenuta ćelija neka hematopoetska matična ćelija.
3. Genetički modifikovana crvena krvna prekursorska ćelija iz zahteva 1, naznačena time, što je:
(a) pomenuti gen BCL11A je pocepan uz pomoć neke zinc-finger nukleaze; (b) pomenuta nukleaza je uvedena u pomenutu ćeliju kao polinukleotid; ili (c) pomenuta genomska modifikacija obuhvata integraciju donorskog polinukleotida koji kodira neki transgen.
4. Genetički modifikovana crvena krvna prekursorska ćelija iz zahteva 1, naznačena time, što pomenuta zinc-finger nukleaza obuhvata zinc-finger belančevinu koji sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena koji sadrže heliks za prepoznavanje i dodatno pomenuta zinc-finger belančevina sadrži regione sa heliksom za prepoznavanje u redosledu koji je prikazan u jednom redu u Tabeli 1A sa belančevinama označenih kao SBS#39172, SBS#43490, SBS#44642, SBS#45148, SBS#45147, SBS#39145, SBS#44490, SBS#44489, SBS#45081, SBS#44493, SBS#29527, SBS#29528, SBS#29525, SBS#29526, SBS#34678, SBS#34642, SBS#44889, SBS#44888, SBS#44905, SBS#44904, SBS#44911, SBS#44910, SBS#44945, SBS#44944, SBS#44947 ili SBS#44946.
5. Zinc-finger belančevina koji sadrži 5 ili 6 zinc-finger domena koji sadrže region sa heliksom za prepoznavanje, naznačena time, što pomenuta sadrži regione sa heliksom za prepoznavanje u redosledu koji je prikazan u jednom redu u Tabeli 1A sa belančevinama označenih kao SBS#39172, SBS#43490, SBS#44642, SBS#45148, SBS#45147, SBS#39145, SBS#44490, SBS#44489, SBS#45081, SBS#44493, SBS#29527, SBS#29528, SBS#29525, SBS#29526, SBS#34678, SBS#34642, SBS#44889, SBS#44888, SBS#44905, SBS#44904, SBS#44911, SBS#44910, SBS#44945, SBS#44944, SBS#44947 ili SBS#44946.
6. Fuziona belančevina, naznačena time, što sadrži zinc-finger belančevinu iz zahteva 5 i domen za cepanje koji je divljeg-tipa ili je konstruiran ili polu-domen za cepanje koji je divljeg-tipa ili je konstruiran.
7. Polinukleotid, naznačen time, što kodira jednu ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6.
8. Izolovana ćelija, naznačena time, što sadrži jednu ili više fuzionih belančevina iz zahteva 6 ili jedan ili više polinukleotida iz zahteva 7.
9. Ćelija iz zahteva 8, naznačena time, što je pomenuta selektirana iz grupe koja obuhvata crvenu krvnu ćeliju (RBC) ili neku prekursorsku ćeliju, poput CD34<+>-hematopoetske matične ćelije.
10. Komplet hemikalija, naznačen time, što sadrži belančevinu iz zahteva 5, fuzionu belančevinu iz zahteva 6 ili polinukleotid iz zahteva 7.
11. In vitro postupak za promenu ekspresije globinskog gena u nekoj ćelija, naznačen time, što pomenuti postupak podrazumeva: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6 ili jednog ili više polinukleotida iz zahteva 7, u uslovima u kojima pomenuta jedna ili više belančevina se eksprimiraju, a ekspresija globinskog gena je promenjena.
12. Pomenuti jedna ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6 ili jedan ili više polinukleotida iz zahteva 7, naznačeni time, što se primenjuju u postupku za tretiranje neke hemoglobinopatije, pri čemu pomenuti postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6 ili jednog ili više polinukleotida iz zahteva 7, u uslovima u kojima pomenuta jedna ili više belančevina se eksprimiraju, a ekspresija globinskog gena je promenjena.
13. Postupak iz zahteva 11, naznačeni time, što:
(a) pomenute belančevine povećavaju ekspresiju globinskog gena, poput nekog gama-globinskog ili beta-globinskog gena;
(b) pomenuti postupak dalje podrazumeva integriranje neke donorske sekvence u genom ćelije, na primer, uz pomoć uvođenja donorske sekvence u pomenutu ćeliju putem nekog viralnog vektora, oligonukleotida ili plazmida; (c) pomenuta ćelija je crvena krvna (RBC) prekursorska ćelija, poput CD34<+>-hematopoetske matične ćelije; i/ili
(d) pomenuta donorska sekvenca sadrži neki transgen pod kontrolom nekog endogenog promotora ili nekog egzogenog promotora.
14. Pomenuti jedna ili više belančevina i jedan ili više polinukleotida koji se primenjuju u skladu sa zahtevom 12, naznačeni time, što pomenuta hemoglobinopatija je neka talasemija.
15. Pomenuti jedna ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6 i jedan ili više polinukleotida iz zahteva 7, naznačeni time, što se primenjuju u nekom postupku za tretman bolesti srpastih ćelija, pri čemu pomenuti postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, pomenute jedne ili više belančevina iz zahteva 5 ili zahteva 6 ili jednog ili više polinukleotida iz zahteva 7, u uslovima u kojima pomenuta jedna ili više belančevina se eksprimiraju, a ekspresija globinskog gena je promenjena.
RS20201082A 2012-08-29 2013-08-29 Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja RS60838B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261694693P 2012-08-29 2012-08-29
EP13833658.1A EP2890780B8 (en) 2012-08-29 2013-08-29 Methods and compositions for treatment of a genetic condition
PCT/US2013/057214 WO2014036219A2 (en) 2012-08-29 2013-08-29 Methods and compositions for treatment of a genetic condition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60838B1 true RS60838B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=50184630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201082A RS60838B1 (sr) 2012-08-29 2013-08-29 Postupci i kompozicije za tretman genskog stanja

Country Status (26)

Country Link
US (4) US9650648B2 (sr)
EP (1) EP2890780B8 (sr)
JP (4) JP2015533786A (sr)
KR (3) KR20220164090A (sr)
CN (1) CN104704110B (sr)
AU (1) AU2013308770B2 (sr)
CA (2) CA3171494A1 (sr)
CL (1) CL2015000450A1 (sr)
DK (1) DK2890780T3 (sr)
EA (1) EA039384B1 (sr)
ES (1) ES2812599T3 (sr)
HR (1) HRP20201443T1 (sr)
HU (1) HUE050516T2 (sr)
IL (1) IL237050B (sr)
IN (1) IN2015DN01480A (sr)
LT (1) LT2890780T (sr)
MX (1) MX367081B (sr)
PH (3) PH12021551661A1 (sr)
PL (1) PL2890780T3 (sr)
PT (1) PT2890780T (sr)
RS (1) RS60838B1 (sr)
SG (2) SG11201500852WA (sr)
SI (1) SI2890780T1 (sr)
UA (1) UA118957C2 (sr)
WO (1) WO2014036219A2 (sr)
ZA (1) ZA201500900B (sr)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
NZ630900A (en) * 2012-02-24 2016-10-28 Hutchinson Fred Cancer Res Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
US20160046961A1 (en) 2012-05-25 2016-02-18 Emmanuelle Charpentier Methods and Compositions for RNA-Directed Target DNA Modification and For RNA-Directed Modulation of Transcription
KR101706085B1 (ko) * 2012-10-23 2017-02-14 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
EP2928496B1 (en) 2012-12-06 2019-10-09 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
EP4286517A3 (en) 2013-04-04 2024-03-13 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CA2914519A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
AU2014312295C1 (en) * 2013-08-28 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
EP3492593B1 (en) 2013-11-13 2021-08-18 Children's Medical Center Corporation Nuclease-mediated regulation of gene expression
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
PL3102673T3 (pl) * 2014-02-03 2020-11-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do leczenia talasemii beta
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US9938521B2 (en) 2014-03-10 2018-04-10 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3929279A1 (en) 2014-03-18 2021-12-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
US11242525B2 (en) 2014-03-26 2022-02-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
WO2015148716A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for ex vivo expansion of human hematopoietic stem/progenitor cells
EP3540061A1 (en) 2014-04-02 2019-09-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
ES2730378T3 (es) 2014-08-27 2019-11-11 Caribou Biosciences Inc Procedimientos para incrementar la eficiencia de la modificación mediada por Cas9
HUE055583T2 (hu) * 2014-09-16 2021-12-28 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények nukleáz által közvetített genommódosításhoz és -javításhoz hematopoetikus õssejtekben
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
CN107429231A (zh) * 2014-11-24 2017-12-01 儿童医学中心公司 调节sh2b3以改善来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生
WO2016094880A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
EP3262172A2 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2016135559A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
US10395760B2 (en) 2015-04-13 2019-08-27 Invitae Corporation Methods, systems and processes of identifying genetic variation in highly similar genes
CA2982966C (en) 2015-04-24 2024-02-20 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
JP2018515139A (ja) 2015-05-08 2018-06-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 万能ドナー幹細胞および関連する方法
CA2984013A1 (en) * 2015-05-12 2016-11-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2017015637A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
MX391052B (es) * 2015-09-23 2025-03-21 Sangamo Therapeutics Inc Represores de htt y usos de estos.
CN108138156A (zh) * 2015-10-20 2018-06-08 先锋国际良种公司 用于无标记基因组修饰的方法和组合物
CA3002827A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
KR102766526B1 (ko) 2015-10-28 2025-02-13 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 간-특이적 작제물인, 인자 viii 발현 카세트 및 이의 사용 방법
EP3371306B8 (en) 2015-11-04 2023-02-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
JP6929865B2 (ja) 2015-11-13 2021-09-01 タラ ムーア 角膜ジストロフィーの治療方法
EA201891212A1 (ru) 2015-12-18 2019-01-31 Сангамо Терапьютикс, Инк. Адресная дезорганизация клеточного рецептора гкгс
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
CN117821458A (zh) * 2016-03-14 2024-04-05 爱迪塔斯医药公司 用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物
WO2017165862A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
CA3032822A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
KR102827276B1 (ko) 2016-08-03 2025-07-01 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
JP7201153B2 (ja) 2016-08-09 2023-01-10 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ プログラム可能ｃａｓ９－リコンビナーゼ融合タンパク質およびその使用
KR20230155013A (ko) 2016-08-20 2023-11-09 아벨리노 랩 유에스에이, 인크. 단일 가이드 RNA, CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 사용방법
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG10202007392SA (en) 2016-08-24 2020-09-29 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
CR20190098A (es) 2016-08-24 2019-04-30 Sangamo Therapeutics Inc Regulación de la expresión génica usando nucleasas modificadas
CA3035534A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
WO2018071663A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
TWI829101B (zh) * 2017-01-09 2024-01-11 美商聖加莫治療股份有限公司 使用經工程改造之核酸酶調控基因表現
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US12390514B2 (en) 2017-03-09 2025-08-19 President And Fellows Of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
BR112019019655A2 (pt) 2017-03-23 2020-04-22 Harvard College editores de nucleobase que compreendem proteínas de ligação a dna programáveis por ácido nucleico
US12110499B2 (en) 2017-04-24 2024-10-08 Seattle Children's Hospital Homology directed repair compositions for the treatment of hemoglobinopathies
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019018383A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Calimmune, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING BETA-HEMOGLOBINOPATHIES
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
US20210180091A1 (en) 2017-10-26 2021-06-17 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CA3079748A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene
EP3724214A4 (en) 2017-12-15 2021-09-01 The Broad Institute Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PREDICTING REPAIR RESULTS IN GENETIC ENGINEERING
EP3511412A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-17 Genethon Genetically engineered hematopoietic stem cell as a platform for systemic protein expression
EP3749768A1 (en) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019157324A1 (en) * 2018-02-08 2019-08-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
CN111954548A (zh) 2018-02-21 2020-11-17 亚克安娜生命科学有限公司 流体递送系统和方法
MX2020009487A (es) 2018-03-14 2020-12-10 Editas Medicine Inc Sistemas y metodos para el tratamiento de hemoglobinopatias.
US12133884B2 (en) 2018-05-11 2024-11-05 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
WO2019226953A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
WO2020046791A1 (en) 2018-08-27 2020-03-05 Alcyone Lifesciences, Inc. Fluid delivery systems and methods
US12281338B2 (en) 2018-10-29 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising GeoCas9 and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
GB2601617B (en) 2019-03-19 2024-02-21 Broad Inst Inc Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US20200316116A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of beta-thalassemia
EP3952921A1 (en) * 2019-04-12 2022-02-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Correction of beta-thalassemia phenotype by genetically engineered hematopoietic stem cell
EP3956349A1 (en) 2019-04-17 2022-02-23 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CN112391410B (zh) * 2020-02-17 2024-04-02 华东师范大学 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用
US20220280571A1 (en) * 2019-08-01 2022-09-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating alpha thalassemia
WO2021026336A2 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 I Altius Institute For Biomedical Sciences Compositions and methods for modulation of gene expression
AU2020352552A1 (en) * 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
EP4045649A4 (en) * 2019-10-15 2023-11-22 Altius Institute For Biomedical Sciences DNA-BINDING PROTEINS FOR DISPLACING ENDOGENOUS TRANSCRIPTION FACTORS LINKED TO REGULATORY REGIONS OF GENES
WO2021216623A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
US20250263752A1 (en) 2020-04-21 2025-08-21 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
EP4146804A1 (en) 2020-05-08 2023-03-15 The Broad Institute Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
TW202342498A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
US20250144235A1 (en) 2022-02-02 2025-05-08 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
EP4590688A1 (en) 2022-09-21 2025-07-30 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
EP4602174A1 (en) 2022-10-13 2025-08-20 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220574A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
AU2024274792A1 (en) 2023-05-23 2025-10-23 Sana Biotechnology, Inc. Tandem fusogens and related lipid particles
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025151838A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Safety switches to control in vitro and in vivo proliferation of cell therapy products
WO2025153530A1 (en) 2024-01-16 2025-07-24 Novo Nordisk A/S Albumin-targeted endonucleases, compositions, and methods of use
WO2025184529A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles with fusogen display and related compositions and methods

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
DE69534629D1 (de) 1994-01-18 2005-12-29 Scripps Research Inst Derivate von zinkfingerproteinen und methoden
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0752005B1 (en) 1994-03-23 2008-10-08 Ohio University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
ATE524545T1 (de) 1994-08-20 2011-09-15 Gendaq Ltd Verbesserungen bei oder im zusammenhang mit bindeproteinen zur erkennung von dna
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
ES2341926T3 (es) 1998-03-02 2010-06-29 Massachusetts Institute Of Technology Poliproteinas con dedos de cinc que tienen enlazadores mejorados.
CO5070700A1 (es) 1998-06-05 2001-08-28 Basf Ag Genes novedosos de (adp-ribosa) polimerasa
US6140815A (en) 1998-06-17 2000-10-31 Dover Instrument Corporation High stability spin stand platform
US6532231B1 (en) 1998-08-29 2003-03-11 Lucent Technologies Inc. Arrangement for changing the destination of single link, single destination data messages
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
WO2000046386A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
EP2207032A1 (en) 2000-02-08 2010-07-14 Sangamo BioSciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
AU2001263155A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
AU2002336373A1 (en) 2001-08-20 2003-03-03 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for cnn
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
WO2003087341A2 (en) 2002-01-23 2003-10-23 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
US9447434B2 (en) 2002-09-05 2016-09-20 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
JP4555292B2 (ja) * 2003-08-08 2010-09-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005100392A2 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
ATE418346T1 (de) 2004-04-08 2009-01-15 Sangamo Biosciences Inc Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
US7358085B2 (en) 2005-02-28 2008-04-15 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
EP1877583A2 (en) 2005-05-05 2008-01-16 Arizona Board of Regents on behalf of the Unversity of Arizona Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
AU2006272634B2 (en) 2005-07-26 2013-01-24 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
EP2662442B1 (en) 2005-10-18 2015-03-25 Precision Biosciences Rationally designed meganuclease with altered dimer formation affinity.
DE602007005634D1 (de) 2006-05-25 2010-05-12 Sangamo Biosciences Inc Variante foki-spaltungshälften-domänen
ATE536371T1 (de) 2006-05-25 2011-12-15 Sangamo Biosciences Inc Verfahren und zusammensetzungen zur gendeaktivierung
ATE489465T1 (de) 2007-04-26 2010-12-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
US8790345B2 (en) 2007-08-21 2014-07-29 Zimmer, Inc. Titanium alloy with oxidized zirconium for a prosthetic implant
WO2009042163A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
CA2703045C (en) 2007-10-25 2017-02-14 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
BE1018531A4 (nl) 2007-10-31 2011-03-01 Gielen Cornelis Het gebruik van niet-pathogene bacterien in sporenvorm of in slapende vorm voor het verwijderen van huismijtuitwerpselen en organische allergieverwekkende materialen van alle soorten textiel.
DE102007056956B4 (de) 2007-11-27 2009-10-29 Moosbauer, Peter, Dipl.-Ing.(FH) Schaltung zur Regelung der Stromversorgung eines Verbrauchers und Verfahren zum Betrieb einer Schaltung
AU2009238629C1 (en) 2008-04-14 2015-04-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Linear donor constructs for targeted integration
WO2009154686A1 (en) 2008-05-28 2009-12-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
WO2010021692A1 (en) 2008-08-22 2010-02-25 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
US8383604B2 (en) * 2008-09-15 2013-02-26 Children's Medical Center Corporation Modulation of BCL11A for treatment of hemoglobinopathies
SG172760A1 (en) 2008-12-04 2011-08-29 Sangamo Biosciences Inc Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
EP2464750A4 (en) 2009-08-11 2013-10-02 Sangamo Biosciences Inc HOMOZYGOT ORGANIZATIONS INTENDED FOR TARGETED CHANGES
WO2011072246A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
EA031322B1 (ru) 2010-01-22 2018-12-28 Дау Агросайенсиз Ллс Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии
EP2534173B1 (en) 2010-02-08 2019-09-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered cleavage half-domains
CA2788850C (en) 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
CA2797189C (en) 2010-05-03 2020-05-26 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
AU2011256838B2 (en) 2010-05-17 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel DNA-binding proteins and uses thereof
WO2012021632A2 (en) 2010-08-10 2012-02-16 The Johns Hopkins University Generation and use of pluripotent stem cells
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
WO2012073047A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Genome Research Limited Compositions and methods
IL293650B2 (en) 2011-09-21 2024-10-01 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for regulation of transgene expression
US8895264B2 (en) 2011-10-27 2014-11-25 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the HPRT locus
NZ630900A (en) 2012-02-24 2016-10-28 Hutchinson Fred Cancer Res Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
HK1208051A1 (en) 2012-05-07 2016-02-19 桑格摩生物科学股份有限公司 Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
EP3730615A3 (en) * 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition

Also Published As

Publication number Publication date
PT2890780T (pt) 2020-08-03
US9963715B2 (en) 2018-05-08
HRP20201443T1 (hr) 2020-12-11
JP2022001072A (ja) 2022-01-06
CA2882499C (en) 2023-09-26
IN2015DN01480A (sr) 2015-07-03
CA2882499A1 (en) 2014-03-06
SG11201500852WA (en) 2015-04-29
PH12015500433A1 (en) 2015-04-20
ES2812599T3 (es) 2021-03-17
KR20150047498A (ko) 2015-05-04
US11492643B2 (en) 2022-11-08
IL237050A0 (en) 2015-03-31
KR20210020174A (ko) 2021-02-23
WO2014036219A3 (en) 2014-05-30
JP2018121661A (ja) 2018-08-09
SI2890780T1 (sl) 2020-11-30
MX2015002409A (es) 2015-10-05
LT2890780T (lt) 2020-11-10
BR112015003815A2 (pt) 2017-08-08
KR20220164090A (ko) 2022-12-12
US20140093913A1 (en) 2014-04-03
US20230416775A1 (en) 2023-12-28
CL2015000450A1 (es) 2015-07-10
IL237050B (en) 2020-04-30
US20180223311A1 (en) 2018-08-09
HK1210502A1 (en) 2016-04-22
EP2890780B8 (en) 2020-08-19
EA039384B1 (ru) 2022-01-20
PH12021551661A1 (en) 2022-07-18
EP2890780B1 (en) 2020-06-24
JP6629917B2 (ja) 2020-01-15
CN104704110A (zh) 2015-06-10
PH12015500433B1 (en) 2021-10-27
HUE050516T2 (hu) 2020-12-28
CA3171494A1 (en) 2014-03-06
JP2017217012A (ja) 2017-12-14
CN104704110B (zh) 2018-06-01
EP2890780A4 (en) 2016-08-31
DK2890780T3 (da) 2020-09-21
SG10201701601WA (en) 2017-04-27
EA201590167A1 (ru) 2015-11-30
KR102218562B1 (ko) 2021-02-19
AU2013308770B2 (en) 2019-01-17
WO2014036219A2 (en) 2014-03-06
PH12019502292A1 (en) 2021-03-15
JP2015533786A (ja) 2015-11-26
AU2013308770A1 (en) 2015-03-05
US20140080216A1 (en) 2014-03-20
MX367081B (es) 2019-08-05
ZA201500900B (en) 2017-09-27
KR102474010B1 (ko) 2022-12-02
UA118957C2 (uk) 2019-04-10
EP2890780A2 (en) 2015-07-08
US9650648B2 (en) 2017-05-16
PL2890780T3 (pl) 2021-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230416775A1 (en) Methods and compositions for treatment of a genetic condition
JP6875362B2 (ja) ヌクレアーゼ媒介ゲノム遺伝子操作のための送達方法および組成物
US20210348143A1 (en) Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10619154B2 (en) Nuclease-mediated regulation of gene expression
EP3102673B1 (en) Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia
HK1210502B (en) Methods and compositions for treatment of a genetic condition
BR112015003815B1 (pt) Proteína de dedo de zinco, proteína de fusão, usos das mesmas, e kit