UA118957C2 - Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання - Google Patents

Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання Download PDF

Info

Publication number
UA118957C2
UA118957C2 UAA201501169A UAA201501169A UA118957C2 UA 118957 C2 UA118957 C2 UA 118957C2 UA A201501169 A UAA201501169 A UA A201501169A UA A201501169 A UAA201501169 A UA A201501169A UA 118957 C2 UA118957 C2 UA 118957C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
artificial sequence
cell
globin
gene
sequence
Prior art date
Application number
UAA201501169A
Other languages
English (en)
Inventor
Грегорі Дж. Кост
Філіп Д. Грегорі
Дмітрій Гущин
Майкл С. Холмс
Джеффрі С. Міллер
Девід Пащон
Едвард Дж. Ребар
Андреас Рейк
Фьодор Урнов
Лей ЧЖАН
Original Assignee
Сангамо Біосайєнсиз, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сангамо Біосайєнсиз, Інк. filed Critical Сангамо Біосайєнсиз, Інк.
Publication of UA118957C2 publication Critical patent/UA118957C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Винахід стосується генетично модифікованої клітини-попередник червоних клітин крові, яка характеризується геномною модифікацією у межах екзону 2 або екзону 4 BCL11A або у межах BCL11A-XL, виконаною після розщеплення у межах гену BCL11a нуклеазою "цинкові пальці" (ZFN), нуклеазою TALE (TALEN) або системою CRISPR/Cas. А також стосується способу зміни експресії глобінових генів у клітині in vitro.

Description

ВСІ 11А-ХІ,, виконаною після розщеплення у межах гену ВСІ 11а нуклеазою "цинкові пальці" (2ЕМ), нуклеазою ТАГЕ (ТАГЕМ) або системою СКІЗБРЕ/Сав.
А також стосується способу зміни експресії глобінових генів у клітині іп міїго.
Перехресні посилання на споріднені заявки
ІО001) У цій заявці заявлено пріоритет за попередньою заявкою США Мо 61/694693, поданою 29 серпня 2012 року, опис якої включено до даного документу шляхом посилання в повному обсязі.
Галузь техніки
І0002| Даний винахід належить до галузі геномної інженерії гемопоетичних стовбурових клітин, особливо для лікування гемоглобінопатії.
Рівень техніки 0003) Генна терапія має величезний потенціал для нової ери в медицині. Ці методики дозволяють лікувати захворювання, які до цього часу залишались невиліковними в межах стандартної медичної практики. Особливо перспективним напрямом є можливість генетично конструювати клітину таким чином, щоб у цій клітині експресувався продукт, який раніше не продукувався в цій клітині. Приклади використання цієї технології включають введення гена, що кодує новий терапевтичний білок, вставку кодуючої послідовності, яка кодує білок, відсутній в клітині або у індивідуума, введення гена дикого типу в клітину, що містить мутантну генну послідовність, і вставку послідовності, яка кодує структурну нуклеїнову кислоту, таку як мікроРНК або мігРНК.
ІЇ0004| Трансгени можуть доставлятись в клітину різними способами, за яких трансген інтегрується у власний геном клітини і підтримується там. В останні роки була розроблена стратегія інтеграції трансгена, яка використовує розщеплення сайт-специфічними нуклеазами для спрямованого введення у обраний геномний локус (див., наприклад, патент США Мо 7888121 того самого заявника). Нуклеази, специфічні до генів-мішеней, можуть використовуватись таким чином, що трансгенний конструкт вставляється шляхом гомологічно спрямованої репарації (НОК) або шляхом об'єднання кінців в процесі негомологічного з'єднання кінців (МНЕ). Локуси-мішені включають локуси "затишної гавані", наприклад, ген ССК5, ген
СХСН4, ген РРРІК12С (також відомий як ААМ5І), ген альбуміну або ген Коза. Див., наприклад, патентні публікації США 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 і 20130177960 і попередню заявку на патент США Мо 61/823689. Інтеграція, опосередкована нуклеазами, відкриває перспективу покращення експресії трансгенів, підвищення безпеки і
Зо тривалості експресії у порівнянні з класичними підходами до інтеграції, які спираються на випадкову інтеграцію трансгена, оскільки вона робить можливим точне позиціювання трансгена з мінімальним ризиком сайленсингу гена або активації сусідніх онкогенів. 0005) Червоні клітини крові (ЧКК), або еритроцити, є основними клітинними компонентами крові. Насправді, ЧКК складають четверту частину клітин у людини. Зрілі ЧКК людини не мають ядра і багатьох інших органел у людей та заповнені гемоглобіном - металопротеїном ЧКК, що переносить кисень до тканин, а також переносить двоокис вуглецю з тканин назад до легень для видалення. Білок складає приблизно 97 95 від сухої ваги еритроцитів і підвищує здатність крові переносити кисень приблизно у сімдесят разів. Гемоглобін є гетеротетрамером, що складається з двох а-подібних глобінових ланцюгів і двох В-подібних глобінових ланцюгів та 4 гемових груп. У дорослих а282 тетрамер називається гемоглобіном А (НБА) або дорослим гемоглобіном. Як правило, альфа- і бета- глобінові ланцюги синтезуються в приблизному співвідношенні 1:1, і це співвідношення, здається, має вирішальне значення в плані стабілізації гемоглобіну та ЧКК. Насправді, в деяких випадках, коли неадекватно експресується один тип гена глобіну (див. нижче), знижуючи експресію (наприклад, з використанням певної міРНК) іншого типу глобіну, відновлення цього співвідношення 1: 1 зменшує деякі аспекти мутантного клітинного фенотипу (див. Мооп еї а! (2008) Наетайю/Іодіса 93(8):1288). У плоду, що розвивається, продукується інша форма гемоглобіну, фетальний гемоглобін (НЬЕ), який має більш високу афінність зв'язування кисню, ніж гемоглобін А, так що кисень може доставлятись в систему дитини через кровоток матері. Фетальний гемоглобін також містить два а-ланцюги глобіну, але замість дорослих ВД-глобінових ланцюгів він має два фетальних у-ланцюги глобіну (тобто, фетальний гемоглобін а2уг2). Приблизно на 30 тижні вагітності, синтез у-глобіну у плоду починає падати, а продукування р-глобіну підвищується. По досягненні приблизно 10-місячного віку, гемоглобін новонародженого майже повністю являє собою а28р2, хоча певна кількість НЬЕ зберігаються і в дорослому віці (приблизно 1-3 95 від загальної кількості гемоглобіну).
Регулювання переходу від продукування у до В є доволі складним, і в першу чергу включає інгібування експресії у-глобіну з одночасною активацією експресії Д-глобіну.
І0006)| Генетичні дефекти в послідовностях, що кодують гемоглобінові ланцюги, можуть бути відповідальними за цілий ряд захворювань, відомих як гемоглобінопатії, включаючи серпоподібно-клітинну анемію та таласемії. У більшості пацієнтів з гемоглобінопатіями, гени, які бо кодують у-глобін, залишаються в наявності, але експресія є відносно низькою через нормальну генну репресію, яка відбувається напередодні пологів, як описано вище.
І0007| Вважається, що 1 на 5000 людей в США має серпоподібно-клітинну хворобу (СКХ), в основному це люди, які походять з Африки на південь від Сахари. Схоже, що там серпоподібно- клітинна гетерозиготність корисна для захисту від малярії а відтак ця аномалія була селектована з часом, так що за оцінками в Африці на південь від Сахари одна третина населення має серпоподібно-клітинну аномалію еритроцитів. Серпоподібно-клітинна анемія спричинена мутацією в гені В-глобіну, в якому валін замінений на глутамінову кислоту в амінокислотному положенні 6 (САС на СТО на рівні ДНК), де одержаний гемоглобін називають "гемоглобіном 5" або "НЬ5". В умовах пониженого рівня кисню конформаційний зсув в бік дезокси-форми НЬЗ приводить до експонування гідрофобної ділянки білка між спіралями Е та РЕ.
Гідрофобні залишки валіну в положенні б бета-ланцюга гемоглобіну здатні зв'язуватись із гідрофобною ділянкою, спричиняючи агрегацію молекул НЬЗ та утворення волокнистих преципітатів. Ці агрегати, в свою чергу, спричиняють аномалії або зміну форми ЧКК на серпоподібну, що призводить до втрати гнучкості клітинами. Утворені серпоподібні ЧКК більше не в змозі протиснутись в капілярне русло і можуть призвести до вазооклюзійної кризи у пацієнтів із серпоподібними клітинами. Крім того, серпоподібні ЧКК є менш стійкими до механічних впливів, ніж нормальні ЧКК, і, як правило, схильні до гемолізу, що, в свою чергу, призводить до анемії у пацієнта.
І0008| Лікування та ведення хворих із серпоподібно-клітинною анемією є пожиттєвою проблемою, що включає лікування антибіотиками, усунення болю і переливання під час гострих епізодів. Один з підходів полягає у застосуванні гідроксисечовини, один з механізмів впливу якої полягає у підвищенні продукування у-глобіну. Довгострокові побічні ефекти хронічної терапії гідроксисечовиною на сьогодні невідомі, проте, лікування дає небажані побічні ефекти і може мати змінну ефективність в залежності від пацієнта. Незважаючи на підвищення ефективності лікування серпоподібних клітин, тривалість життя хворих, як і раніше, залишається на рівні середини-кінця 50-х років, і клінічні прояви хвороби мають глибокий вплив на якість життя пацієнта.
ЇО009| Таласемії також є захворюваннями, пов'язаними з гемоглобіном, і зазвичай включають знижену експресію ланцюгів глобіну. Це може відбуватись за рахунок мутацій в
Зо регуляторних ділянках генів або через мутації в кодуючій послідовності глобіну, що призводить до зниження експресії. Альфа-таласемії асоціюються з людьми, що походять із Західної Африки та Південної Азії, і можуть надавати резистентність до малярії. Бета-таласемія пов'язана з людьми середземноморського походження, як правило, з Греції та прибережних районів Турції та Ігалії. Лікування таласемій зазвичай включає переливання крові та хелатну терапію.
Пересадка кісткового мозку також використовується для лікування людей з тяжкими таласеміями, якщо можна виявити придатного донора, але ця процедура може мати значні ризики. 0010 Одним із запропонованих підходів для лікування СКХ та бета-таласемій, є підвищення експресії у-глобіну з метою НЬЕ-функціональної заміни аберантного дорослого гемоглобіну. Як згадувалось вище, лікування пацієнтів з СКХ гідроксисечовиною вважається успішним зокрема через її вплив на підвищення експресії у-глобіну. Першою виявленою групою сполук, що впливають на реактивацію активності НЬЕ, були цитотоксичні лікарські препарати.
Здатність спричиняти синтез гама-глобіну де помо шляхом фармакологічних маніпуляцій вперше була показана з використанням 5-азацитидину у експериментальних тварин (Оезбітопе (1982) Ргос Маї! Асай 5сі ОА 79(14):4428-31). Подальші дослідження підтвердили здатність 5- азацитидину підвищувати НЬЕ у пацієнтів з ВД-таласемією і серпоподібно-клітинною анемією (І єу, еї аї., (1982) М. Еподі. 9. Медісіпе, 307: 1469-1475, і І еу, еї аї., (1983) Віоса 62: 370-380). Крім того, в експериментальних системах було показано, що коротколанцюгові жирні кислоти (наприклад, бутират і його похідні) підвищують рівень НЬЕ (Сопвзіапіоціаків еї аї., (1988) Віоса 72(6):1961-1967). Також існує сегмент людської популяції з станом, відомим як «спадкова персистенція фетального гемоглобіну» (СПФГ), за якого підвищена кількість НЬЕ зберігається у зрілому віці (10-40 95 у гетерозиготних носіїв СПФГ (див. ТПеїп еї а! (2009) Нит. Мої. Сепеї 18 (82): В216-К223). Це рідкісний стан, але за відсутності будь-яких бета-глобінових аномалій, він призводить до значних клінічних проявів, навіть якщо 100 95 гемоглобіну людини являє собою
НЬРЕ. У людей, які мають бета-таласемію одночасно з СПФГ, експресія НОЕ може зменшити тяжкість захворювання. Крім того, тяжкість природного перебігу серпоподібно-клітинної анемії у різних пацієнтів може значно відрізнятись, і цю мінливість, зокрема, можна пов'язувати з тим, що деякі люди з легшою формою хвороби експресують більш високі рівні НЬЕ. 0011) Один з підходів до підвищення експресії НЬЕ включає ідентифікацію генів, продукти бо яких відіграють важливу роль в регуляції експресії у-глобіну. Одним з таких генів є ВСІ 11А,
вперше виявлений через його роль в розвитку лімфоцитів. ВСІ 11А кодує білок "цинкові пальці", який, як вважають, бере участь в регулюванні експресії у-глобіну, залежному від стадії розвитку.
ВСІЛ11А експресується в дорослих еритроїдних клітинах-попередниках, а інгібування його експресії приводить до підвищення експресії у-глобіну. Крім того, було виявлено, що регуляція сплайсингу мРНК ВСІ11ТА здійснюється в залежності від стадії розвитку. Схоже, що в ембріональних клітинах експресуються переважно короткі варіанти мРНК ВСІ 114А, відомі як
ВСІТ1ТА-5 і ВСІ 11А-Х5, тоді як у зрілих клітинах експресуються переважно довші варіанти
МРНК - ВСІ 11А-Ї і ВСІ 11А-ХІ.. Див., ЗапкКагап еї а! (2008) Зсіепсе 322 р. 1839. Імовірно, білок
ВСІ 11А взаємодіє з ВД-глобіновим локусом, що приводить до зміни його конформації і тим самим - його експресії на різних стадіях розвитку. Крім того, інший регуляторний білок КІ Е1, очевидно, бере участь в регуляції експресії у-глобіну. Було виявлено, що рівень КІ Е1 прямо пропорційні рівню ВСІ 114А, і обидва обернено пропорційний рівню у-глобіну. Наприклад, мальтійська родина з постійною експресією НЬЕ сімейство несе також гетерозиготну мутацію гена КІ Е1 (Вого еї аї (2010) Маї Сепеї, 42(9):801-805). Очевидно, продукт гена КІ ЕТ зв'язується безпосередньо з геном ВСІ1А іп мімо, і, таким чином, може бути відповідальним за його активацію (див. Вогод еї аІ. там же; ВіеКег (2010) Маї Сепеї 42(9): 733-734; 7пои єї аї. (2010) Маї Сепеї 42(9):742-744).
Таким чином, якщо КІГЕЇ стимулює експресію ВСІ 11А, то дія цього індукованого ВСІ 11ТА приводить до пригнічення продукування у-глобіну і НЬЕ. Було запропоновано використання інгібуючої РНК, націленої на ген ВСІ1Т1ТА (див., наприклад, патентну публікацію США Мо 20110182867), але ця технологія має декілька потенційних недоліків, а саме: повний нокдаун гена може бути не досягнутий,, доставка таких РНК може бути проблематичною, і РНК повинні бути наявні безперервно, що потребує численних процедур протягом життя. 0012) Альфа-таласемії також широко розповсюджені у людській популяції, особливо в Азії, а один з типів аберацій альфа-глобіну, як вважається, є найбільш поширеним генетичним захворюваннямлюдини. В тропічних і субтропічних районах світу альфа-глобінове порушення зустрічається у 80-90 95 населення (див. Нагіємеїай апа Нідд5 (2010) Огрпапеї ЧОиРНКІ ої Каге рівеазев 5:13). 0013) Люди несуть дві копії гена альфа-глобіну в тандемі (си і а«2) на хромосомі 16, а відтак в нормальній диплоїдній клітині загалом присутні 4 копії. Зазвичай на ген а2 припадає в 2-3 рази
Зо більше мРНК а-глобіну, ніж на ген а1. Тандемна організація цих двох генів може бути пов'язана з високою поширеністю великих делецій в альфа-глобінових генах у хворих на альфа- таласемію, при чому, як правило, кількість альфа-глобінових генів, які є нефункціональними, безпосередньо пов'язана з тяжкістю будь-якої альфа-таласемії (див. СпПиі еї а! (2003) Віоса 101(3):791). Делеція однієї копії, очевидно, є досить поширеною (30 956 афроамериканців і 60-80 до людей, які проживають в Саудівській Аравії, Індії та Таїланді), і, як правило, не виявляється у людини без проведення генетичного дослідження. Делеція двох копій, чи на одній хромосомі (сі) чи по одній копії на кожній з двох хромосом (їІгап5), може призвести до легкої форми анемії у пацієнта. Коли видаляються три са-глобінових гени, так що індивід має лише один функціональний а-глобіновий ген, то спостерігається помірна анемія, але, що ще більш важливо, порушується вкрай важливе співвідношення а-глобіну і ВД-глобіну. Тетрамери ВА, які містять чотири бета-глобінових ланцюги, часто спостерігаються у пацієнтів, що мають тільки один функціональний альфа-глобіновий ген, стан, відомий як НЬН. Тетрамери В4 здатні зв'язувати кисень, але не вивільняють його на периферії, спричиняючи так звану хворобу НЬН.
Люди з хворобою НЬН мають ЧКК із вкороченим періодом напіврозпаду, які легко піддаються гемолізу, що призводить до погіршення симптомів анемії. Втрата всіх чотирьох а-глобінових генів зазвичай призводить до смерті іп шего. 0014) Таким чином, існує потреба в додаткових способах і композиціях, які можуть бути використані для редагування геному з метою коригування аберантного гена або зміни експресії інших генів, зокрема, для лікування гемоглобінопатій, таких як серпоподібно-клітинна хвороба і таласемія.
Суть винаходу 0015) В даному документі описані способи і композиції для зміни експресії або коригування одного або більше генів, що кодують білки, які беруть участь в генетичному захворюванні (наприклад, білкові продукти відсутні, наявні в недостатній кількості або аберантні при хворобі та/або білки, які регулюють ці білки), такому як серпоподібно-клітинна хвороба або таласемія.
Зміна таких білків може привести до вилікування цих генетичних захворювань. Зокрема, геномне редагування використовують для коригування аберантного гена, вставки гена дикого типу або зміни експресії ендогенного гена. В якості необмежуючого прикладу ген дикого типу, що кодує Д-глобін, може бути вставлений в клітину для продукування дефіцитного білка та/або 60 лікування гемоглобінопатії, спричиненої пошкодженим р-глобіном. В деяких випадках ген дикого типу може бути вставлений в локус "затишної гавані" або в локус, який, як відомо, інтенсивно експресується в цільовій тканині, як, наприклад, В-глобіновий локус в еритроїдних клітинах.
Геномне редагування може бути використане також для продукування білка, дефіцитного при альфа-таласемії (і тим самим - лікування) шляхом вставки альфа-глобінового гена дикого типу в локус "затишної гавані". Інший підхід передбачає використання коригування гена, за якого здійснюється заміна мутантної послідовності пошкодженого а- або р-глобінового гена. За іншого підходу, регуляторний ген, який бере участь в інгібуванні у-глобіну, може бути змінений або «нокаутований» (наприклад, для збільшення експресії у-глобіну шляхом інактивації та/або зниження кількості інгібіторного білка) та/(або регуляторний сайт зв'язування, розміщений ирзігеат від гена у-глобіну або в інших ділянках бета-глобінового локусу, може бути змінений таким чином, що регулятори не можуть ефективно взаємодіяти в у-глобіновому локусі, і продукується НЬЕ, тим самим відміняючи ефекти (тобто, СКХ або р-таласемію), спричинені аберантним В-глобіновим геном. Один з підходів додатково передбачає використання модифікації стовбурових клітин (наприклад, гемопоетичних стовбурових клітин або попередників ЧКК), після чого такі стовбурові клітини можуть бути використані для щеплення пацієнта з метою лікування гемоглобінопатії. 0016) В одному аспекті в даному документі описаний білок «цинкові пальці» (2ЕР), який зв'язується з сайтом-мішенню в цільовій ділянці (наприклад, В-глобіновий, а-глобіновий ген або ген «затишної гавані», або регуляторний ген або його ДНК-мішень, такі як ВСІ-11А, у-глобін або
КІ Е1) в геномі, де 2ЕР містить один або більше сконструйованих зв'язуючих доменів «цинкових пальців». В одному варіанті реалізації винаходу ЕР є нуклеазою «цинкові пальці» (2ЕМ), яка розщеплює цільову геномну ділянку-мішень, де 2ЕМ містить один або більше сконструйованих зв'язуючих доменів «цинкових пальців» і нуклеазний домен розщеплення або напівдомен розщеплення. Домени розщеплення або напівдомени розщеплення можуть бути одержані, наприклад, від різних рестрикційних ендонуклеаз та/або «хомінг»-ендонуклеаз. В одному варіанті реалізації винаходу напівдомени розщеплення одержують із рестрикційної ендонуклеази Типу ІЗ (наприклад, БоК І). В певних варіантах реалізації винаходу домен «цинкових пальців» розпізнає сайт-мішень в глобіновому гені або гені «затишної гавані». В певних варіантах реалізації винаходу домен «цинкових пальців» містить 5 або б доменів
Зо «цинкових пальців» і розпізнає сайт-мішень на глобіновому гені (наприклад, білок «цинкові пальці», що має 5 або 6 пальців з розпізнаючими спіральними ділянками, показаний в Табл. 1А).
В іншому варіанті реалізації домен «цинкових пальців» розпізнає сайт-мішень в ВСІ 11А, КІ Р1, а, В або у-глобіновому гені або в їхрегуляторних елементах. В певних варіантах реалізації винаходу домен «цинкових пальців» містить 5 або 6 доменів «цинкових пальців» і розпізнає сайт-мішень в ВСІ 11А, КІЕ1, с, В ї у-глобіновому гені або в їх регуляторних елементах (наприклад, білок «цинкові пальці», що має 5 або 6 пальців з розпізнаючими спіральними ділянками, показаний в Табл. 1А). 0017) В іншому аспекті в даному документі описаний білок ТАГЕ (подібний до активатора транскрипції), який зв'язує сайт-мішень в цільовій ділянці (наприклад, « або р-глобіновий ген або ген «затишної гавані», або регуляторний ген або його ДНК-мішень, таку як ВСІ 11А, у-глобін або КІР1) в геномі, де ТАГЕ містить один або більше сконструйованих зв'язуючих доменів
ТАГЕ. В одному варіанті реалізації винаходу ТАЇЕ є нуклеазою (ТАГЕМ), яка розщеплює цільову геномну ділянку-мішень, де ТА ЕМ містить один або більше сконструйованих ТАЇ Е
ДНК-зв'язуючих доменів і нуклеазний домен розщеплення або напівдомен розщеплення.
Домени розщеплення і напівдомени розщеплення можуть бути одержані, наприклад, від різних рестрикційних ендонуклеаз та/або «хомінг»-ендонуклеаз. В одному варіанті реалізації винаходу напівдомени розщеплення одержані від рестрикційної ендонуклеази Типу ІІ5 (наприклад, Рок 1).
В певних варіантах реалізації винаходу ТАГЕ ДНК-зв'язуючий домен розпізнає сайт-мішень в глобіновому гені або гені «затишної гавані». В інших варіантах реалізації ТА Е ДНК-зв'язуючий домен розпізнає сайт-мішень в ВСІ 11А, КІЕ1, а, ВД або у-глобіновому гені або в їх регуляторних елементах (наприклад, білок ТАГ ЕМ, показаний в Табл. 3). 0018) В іншому аспекті в даному документі описана система СКІЗ5БРЕ/Сав, яка зв'язує сайт- мішень в цільовій ділянці (наприклад, ген з високим рівнем експресії, пов'язаний з хворобою ген або ген «затишної гавані») в геномі, де система СКІЗРЕК/Са5 містить нуклеазу СКІРЗК/Саз і сконструйовану сгРНКЯгастРНК (або одиничну гідову РНК). В певних варіантах реалізації винаходу система СКІЗРК/Са5 розпізнає сайт-мішень в гені з високим рівнем експресії, зв'язаному з хворобою гені і гені «затишної гавані». В певних варіантах реалізації винаходу система СКІ5БРА/Са5 розпізнає сайт-мішень в глобіновому, альбуміновому, ССК5, СХСНА4,
ААМУ5ЗІ1, Коза або НРЕТ гені. 60 0019) 2ЕМ, ТАГЕМ та/або система СКІЗРЕК/Сав5, як описано в даному документі, можуть зв'язуватись з та/або розщеплювати цільову ділянку в кодуючій або некодуючій ділянці в межах гена або суміжних з ним ділянках, таку як, наприклад, лідерна послідовність, трейлерна послідовність або інтрон, або в межах ділянки, що не транскрибується, ирбзігеат або дом/пзігеат від кодуючої ділянки. В певних варіантах реалізації винаходу 2ЕМ, ТАГЕМ та/або система СКІЗРЕ/Са5 зв'язується з та/або розщеплює глобіновий ген. В інших варіантах реалізації 2ЕМ, ТАГЕМ та/або система СКІ5РІА/Са5з зв'язується з та/або розщеплює ген «затишної гавані», наприклад, ген ССК5, ген СХСКА, ген РРРІ1К12С (також відомий як ААМ51), альбуміновий ген або ген Коза. Див., наприклад, патентні публікації США Мо 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 і 20130177960 і попередню заявку на патент США Мо 61/823689. Крім того, з метою селекції може бути використаний локус НРЕТ (див. патентну публікацію США Мо 20130122591). В іншому аспекті в даному документі описані композиції, що містять одну або більше нуклеаз «цинкові пальці» та/"або ТАГЕ або систему
СКІЗ5РК/Са5, як описано в даному документі. В деяких варіантах реалізації винаходу 2ЕМ,
ТАГЕМ та/або система СКІ5БРЕ/Са5 зв'язується з і розщеплює ВСІТ1А, КІЕ1, а, В або у- глобіновий ген або розщеплює їх регуляторні елементи. В іншому аспекті в даному документі описані композиції, що містять одну або більше нуклеаз «цинкові пальці», ТАГЕ або Сав, як описано в даній заявці. 0020) В іншому аспекті в даному документі описаний полінуклеотид, що кодує одну або більше 2ЕМ, ТАГЕМ та/або систему СКІЗБРК/Са5, як описано в даному документі. В деяких аспектах, мРНК може бути хімічно модифікованою (див., наприклад, Когтапгп еї аї, (2011) Маїиге
ВіоїесппоІоду 29(2):1154-157). 0021) В іншому аспекті в даному документі описаний вектор експресії 2ЕМ, ТАГЕМ та/або системи СЕІБРЕ/Сав, що містить полінуклеотид, що кодує одну або більше 2ЕМ, ТАГЕМ та/або систему СКІБРЕ/Сав, описані в даному документі, функціонально зв'язаний з промотором. В одному варіанті реалізації винаходу вектором експресії є вірусний вектор. (0022) В одному аспекті в даному документі описаний білок ЕМ, ТАГЕМ та/або системи
СКІБРЕ/Сав», який використовується для розщеплення ДНК-мішені. 0023) В інших аспектах, генетично модифіковані попередники ЧКК (гемопоетичні стовбурові клітини, відомі як "НЗС") надаються в трансплантаті кісткового мозку, а ЧКК диференціюють і
Зо дозрівають іп мімо. В деяких варіантах реалізації винаходу НЗС виділяють після 5-С5БЕ- індукованої мобілізації, а в інших, клітини виділяють з кісткового мозку людини або пуповини. В деяких аспектах, НЗС редагують за допомогою обробки нуклеазою, розробленою для «нокаутування» регулятора експресії глобіну (наприклад, ВСІ 11А або КІ Е1). В інших аспектах,
НЗС модифікують з сконструйованою нуклеазою, а донорську нуклеїнову кислоту, таку як ген дикого типу (наприклад, глобіновий ген), вставляють і експресують та/або коригують ендогенний аберантний ген. В деяких випадках, генна послідовність дикого типу для вставки кодує В-глобін дикого типу або а-глобін дикого типу. В інших випадках, ендогенний аберантний ген є рД- глобіновим або а-глобіновим геном. В деяких варіантах реалізації винаходу модифіковані НІС вводять пацієнту після м'якого мієлоабляційного попереднього кондиціювання. В інших аспектах НС вводять після повної мієлоабляції, так що після приживлення 100 95 гемопоетичних клітин отримують від модифікованих НЗС. (0024) В іншому аспекті в даному документі описаний спосіб розщеплення ендогенного гена (наприклад, гена, інактивація якого приводить до підвищення експресії гама-глобіну, такого як
ВСІ11А або КІ Е1) в клітині-попередниці ЧКК, спосіб, який включає: введення в клітину одного або більше полінуклеотидів, що кодують 2ЕМ, ТАГЕМ та/або систему СКІЗРЕ/Сав, які зв'язують сайт-мішень в одному або більше ендогенних генах таким чином, що експресується 2ЕМ(И),
ТАГЕМ(и) та/або система СКІ5БРЕ/Са5, а один або більше генів розщеплюються. В іншому аспекті в даному документі описаний спосіб розщеплення гена ВСІ 11А або КІ Г1 в клітині, спосіб, який включає: введення в клітину одного або більше полінуклеотидів, що кодують 2ЕМ,
ТАГЕМ та/або систему СКІЗРЕ/Са5, які зв'язують сайт-мішень в одному або більше генах
ВСІЛТ1А або КІР1 таким чином, що експресується 2ЕМ(и), ТАГЕМ(и) та/або система
СКІБРЕ/Сав5, а один або більше генів ВСІ 11А або КІ ЕТ розщеплюються. В певних варіантах реалізації винаходу домен «цинкових пальців» містить 5 або б «цинкових пальців» і розпізнає сайт-мішень в глобіновому гені (наприклад, білок «цинкові пальці», що має 5-6 пальців з розпізнаючими спіральними ділянками, показаний в Табл. 1А). В інших варіантах реалізації винаходу ТАГЕМ розпізнає сайт-мішень в В-глобіновій, са-глобіновій, у-глобіновій, КЕ або
ВСІ11А послідовності (показані в Табл. 3). В ще інших варіантах реалізації винаходу система
СКІРБЗЕ/Са5 розпізнає сайт-мішень в ВДВ-глобіновій, а-глобіновій, у-глобіновій, КІ Є або ВСІ 11А послідовності, в якій одинична гідова РНК сконструйована для розпізнавання цільового сайту- бо мішені в гені-мішені, що становить інтерес. Розщеплений ген(и) може бути інактивованим
(«нокаутованим»), наприклад, «нокаутований» один або більше генів, чиї продукти можуть інгібувати експресію гена (наприклад, глобінового гена), або порушеним в регуляторному сайті- мішені на ДНК таких білків. В деяких варіантах реалізації винаходу інактивований ген(и) або його послідовності-мішені є тими, що беруть участь в інгібуванні експресії фетального гемоглобіну. Диференційовані клітини (наприклад, стовбурові клітини) містять фетальний гемоглобін і можуть бути корисними для пацієнтів, які його потребують. В деяких варіантах реалізації винаходу глобіновий ген є «нокаутованим». Наприклад, альфа-глобіновий ген може бути «нокаутованим» для відновлення співвідношення альфа-глобіну і бета-глобіну, коли бета- глобін слабко експресується, або НЬ5, що кодує бета-глобіновий ген, може «нокаутуватись» одночасно з введенням бета-глобіну дикого типу. Клітини (наприклад, стовбурові клітини), коли диференційовані, будуть містити НЬА гемоглобін НЬБА і можуть даватись пацієнтам, які того потребують.
І0025| В іншому аспекті в даному документі описаний спосіб вставки послідовності в ендогенний ген (наприклад, бета-глобіновий, альфа-глобіновий ген та/або ген «затишної гавані») в клітині (наприклад, стовбуровій клітині), спосіб, який включає розщеплення ендогенного гена з використанням однієї або більше нуклеаз і вставку послідовності в сайт розщеплення. В певних варіантах реалізації винаходу геномна послідовність в будь-якому гені- мішені заміщується, наприклад, з використанням пари 2ЕМ або ТАЇЕМ або системи
СКІРБЗК/Са5 (або вектора, що кодує вказані ЕМ, ТАГЕМ та/або систему СКІРЗК/Сав5), як описано в даному документі, "донорською" послідовністю (також відомою як "трансген"), яка вставляється в ген після наміченого розщеплення 2ЕМ, ТАГ ЕМ та/або системою СВІРЗЕ/Сав.
Донорська послідовність може бути присутньою у векторі 2ЕМ або ТАГЕМ, присутньою в окремому векторі (наприклад, векторі Ай, ААМ або ІМ) або, як альтернатива, може вводитись в клітину з використанням різних механізмів доставки нуклеїнових кислот. Така вставка донорської нуклеотидної послідовності в локус-мішень (наприклад, глобіновий ген, інший ген «затишної гавані» і т. п.) приводить до експресії трансгена під контролем генетичних контрольних елементів локуса-мішені (наприклад, глобіну). В деяких варіантах реалізації винаходу трансген кодує некодуючу РНК (наприклад, кшРНК). Експресія трансгена перед дозріванням ЧКК може призвести до ЧКК, що містять цільову некодуючу РНК.
Зо І0026| В інших варіантах реалізації винаходу трансген містить функціональний білок, наприклад, глобіновий білок (наприклад, бета та/або гама-глобін дикого типу). В деяких варіантах реалізації винаходу вставка цільового трансгена в ендогенний ген (наприклад, глобіновий ген), приводить до експресії інтактної екзогенної білкової послідовності та відсутності будь-якої послідовності, що кодується ендогенним геном. В інших варіантах реалізації винаходу експресований ендогенний білок є злитим білком і містить амінокислоти, що кодуються трансгеном і глобіновим геном (наприклад, від ендогенного локуса-мішені або, як альтернатива, від глобін-кодуючих послідовностей на трансгені). В деяких випадках, глобіновим геном є бета- глобіновий ген, тоді як в інших випадках глобіновим геном є альфа-глобіновий ген. В інших випадках, глобіновим (геном є гама-глобіновий ген. Коли наявні, ендогенні глобінові послідовності можуть бути присутніми на аміно (М)-кінцевій частині екзогенного білка та/або карбокси (С)-кінцевій частині екзогенного білка. Глобінові послідовності можуть включати непроцесовані глобінові послідовності дикого типу або мутантні глобінові послідовності або, як альтернатива, можуть включати частково глобінові кодуючі послідовності. В деяких варіантах реалізації винаходу злиття глобін-трансген локалізується в ендогенному локусі в межах клітини, тоді як в інших варіантах реалізації глобін-трансген кодуюча послідовність вставляється в «затишну гавань» в межах геному. В деяких аспектах, «затишну гавань» вибирають з гена
СС, гена СХСК4, гена РРРІ1МК12С (також відомого як ААМ51), альбумінового гена або гена
Коза. Див., наприклад, патентні публікації США Мо 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 і 20130177960 і попередню заявку на патент США Мо 61/823689.
Крім того, з метою селекції може бути використаний локус НРКТ (див. патентну публікацію США
Мо 20130122591). (0027) В ще іншому аспекті в даному документі передбачені клітинні лінії та/або трансгенні тваринні моделі (системи). В деяких варіантах реалізації винаходу трансгенна клітина включає та/або тварина включає трансген, який кодує людський ген. В деяких випадках, трансгенна тварина містить «нокаут» в ендогенному локусі, що відповідає екзогенному трансгена (наприклад, мишачий глобіновий ген «нокаутується», а людський глобіновий ген вставляється в мишачий), тим самим роблячи можливим розвиток іп мімо системи, де людський білок може бути вивчений окремо. Такі трансгенні моделі можуть бути використані з метою скринінгу для ідентифікації невеликих молекул або великих біомолекул, або інших об'єктів, які можуть 60 взаємодіяти з або модифікувати цільовий людський білок. В деяких аспектах, трансген інтегрується у обраний локус (наприклад, глобіновий або «затишної гавані») в стовбуровій клітині (наприклад, ембріонній стовбуровій клітині, індукованій плюрипотентній клітині, гемопоетичній стовбуровій клітині і т. п) або в ембріон тварини, одержаний за будь-яким способом, описаним в даному документі, а потім ембріон імплантується таким чином, щоб народилась жива тварина. В інших аспектах, стовбурові клітини містять геномні альтерації в ендогенних локусах, таких як гени ВСІ1ТА, КГЕ1 або у-глобіну, або їх комбінації, так що підвищується експресія у-глобіну. В деяких варіантах реалізації винаходу підвищення експресії у-глобіну змінює співвідношення у-глобіну до Д-глобіну в клітині у порівнянні з нередагованою стовбуровою клітиною. Тварину потім вигодовують до статевої зрілості і дозволяють дати потомство, в якому, принаймні, деякі з потомства містять редаговану ендогенну генну послідовність або інтегрований трансген. 0028) В ще додатковому аспекті в даному документі передбачений спосіб сайт-специфічної інтеграції послідовності нуклеїнової кислоти в ендогенний локус (наприклад, глобіновий або «затишної гавані») хромосоми, наприклад, в хромосому ембріона. В певних варіантах реалізації винаходу спосіб включає: (а) ін'єкцію ембріона (ї), принаймні, одним ДНК-вектором, де ДНК- вектор містить ирзігеат-послідовність і дом/п5ігеат-послідовність, які рланкують послідовність нуклеїнової кислоти, яка буде інтегруватись, і (і), принаймні, однією молекулою РНК, що кодує нуклеазу «цинкових пальців», ТАГЕ або Са59. У випадку використання білка Са59, також вводиться 59РНК. Нуклеаза або нуклеазна система розпізнає сайт-мішень в локусі-мішені (наприклад, глобіновому локусі або локусі «затишної гавані»), а потім (б) культивують ембріон, щоб зробити можливою експресію нуклеази «цинкові пальці» або ТАЇЕ або системи
СКІБРЕ/Саз, де дволанцюговий розрив, введений в мішень за допомогою нуклеази «цинкові пальці», ТАГЕМ або системи СКІЗРЕ/Сав, потім відновлюють шляхом гомологічної рекомбінації з ДНК-вектором з тим, щоб включити послідовність нуклеїнової кислоти в хромосому.
І0029| В будь-якому із способів, описаних в даному документі, полінуклеотид, що кодує нуклеазу(и) «цинкові пальці», ТАГЕМ(и) та/або систему СКІРЗА/Са5, може містити ДНК, РНК або їх комбінацію. В певних варіантах реалізації винаходу полінуклеотид містить плазміду. В інших варіантах реалізації винаходу полінуклеотид, що кодує нуклеазу, містить мРНК.
І0030| Також передбачений набір, що містить ЕР, ТАГЕМ та/або систему СВІРЗЕ/Сав згідно винаходу. Набір може містити нуклеїнові кислоти, що кодують 2ЕР, ТА ЕМ та/або систему СКІРЗК/Саз (наприклад, молекули РНК або гени, що кодує 2ЕР, ТА ЕМ або Са59, що містяться в придатних векторах експресії), і сконструйовану 59РНК, якщо необхідно, або аліквоти нуклеазних білків, молекул-донорів, придатних ліній клітин-хазяїв, інструкції щодо виконання способів згідно винаходу і т.п. 00311 Ці та інші аспекти будуть очевидними для фахівців у даній галузі в світлі розкриття в цілому.
Короткий опис графічних матеріалів 00321 На Фіг. 1 зображене вирівнювання генної послідовності В-подібного глобіну в ділянці, що оточує мутацію серпоподібно-клітинної хвороби (вказана на Фігурі). Показані (від верхнього рядку до нижнього рядку) послідовності бета-гемоглобіну з серпоподібно-клітинною мутацією (НВВ-серп, ЗЕО ІО МО: 1); гемоглобіну бета (НВВ, 5ЕО ІЮ МО: 2); гемоглобіну дельта (НВО,
ЗЕО ІЮ МО: 3); псевдогена бета-гемоглобіну (НВВРІ1, 5ЕО ІО МО: 4); гемоглобіну іпсилон (НВЕТ,
ЗЕО ІЮ МО: 5), гемоглобіну гама-1 (НВО, 5ЕО ІО МО: 6) і гемоглобіну гама-2 (НВОаг, 5ЕО І
МО: 7). Результати аналізу активності Сеї І наведені нижче вирівнювання для вказаних п'яти пар
АРМ. 0033) На Фіг. 2, панелі А і В, показані гелі, що зображують вставку послідовності вказаного
В-глобінового донору в клітинах СОЗ4-ж. На Фіг. 2А (КЕРІ Р) зображена вставка послідовності вказаного В-глобінового донору, де вставка перевіряється за присутністю нового сайту рестрикції, наявного на донорській ДНК. На Фіг. 28 показані результати аналізу невідповідності
СеІ-1 (бБигмеуог"М, Тгапздепотіс), що підтверджують наявність нових послідовностей, які утворюють невідповідність. Відсоток алелей, що несуть мутацію (956 МНЕ)), вказаний в тексті справа від гелів (перший стовпчик, що відповідає номеру смуги на гелі). Цифри належать до комбінацій 2ЕМ; пп: нетрансфікований контроль.
І0034| Фіг. З являє собою графічне зображення ролі, яку КІЕ1 їі ВСІ11А відіграють в регуляції експресії генів ВД і гама-глобіну. Експресія КІ Е1 стимулює експресію як генів ВСІ 11а, так і ВД-глобіну. Білок ВСІ 11А пригнічує експресію гама-глобіну. 0035) На Фіг. 4, панелі А-Е, зображені гелі, що показують результати аналізу Сеї 1, як описано вище, після обробки НОС вказаними ВСІ 114А- (Фіг. 4А), КІ Е1- (Фіг. 4С і 40) або НРЕТ- (Фіг. 48) специфічними 2ЕМ ії обробки трансдукованих клітин короткотривалим гіпотермічним бо шоком (307) або за стандартних умов (377). ДНК збирали через З дні після трансфекції. На Фіг.
4Е показаний той самий тип аналізу Сеї 1, проведений з зразками, зібраними через З дні після трансфекції НОС або через 17 днів після еритроїдного диференціювання. Відсоток алелей, що несуть мутацію (96 МНЕ), вказується знизу на доріжках, а ідентичність використаних пар 7ЕМ вказується на кожній Фігурі.
І0О36| На Фіг. 5, панелі А і В, зображена експресія гама-глобіну у порівнянні з бета-глобіном (Фіг. БА) або мРНК гама-глобіну, скоригована за стандартом 185 рРНК (Фіг. 5В) на 7 або 17 день після диференціювання, як проаналізовано за допомогою процедури ТадМапФф). Відсоток мРНК гама-глобіну у порівнянні з мРНК гамажбета-глобіну показаний вище кожної смуги на Фіг. 5А. На
Фіг. 58, відносний рівень гама-глобіну, який нормований за 185 рРНК, зображений вище смуг і демонструє, що рівень мРНК гама-глобіну відносно 185 вище в клітинах, які були оброблені за допомогою ВСІ 11А-специфічних 2ЕМ.
І0037| На Фіг. б вказана кількість мРНК гама-глобіну в метилцелюлозних колоніях, одержаних від НЗС, в залежності від генотипу клітин. Клітини, в яких обидва гени ВСІ 11А є дикого типу ("ВВ"), продукують найменшу кількість мРНК гама-глобіну у порівнянні з клітинами, які мали одну ВСІ 11А-нокаутну алель ("ВВ") або мали обидві нокаутні алелі ("нокаут"). Цифри над смугами вказують відсоток гама-глобіну, одержаний із сумарного бета-глобіну.
І0038| На Фіг. 7 показана серія послідовностей ДНК (5ЕБО ІЮ МО: 140-148) в ділянці, розташованій ирзігеат від гена гама-глобіну, після обробки гама-глобін-специфічними 2ЕМ в клітинах К562. Послідовності мають ряд вставок і делецій, включаючи делецію 13 п.о. (Л13 п.о."), які ідентичні одному з людських генотипів, асоційованих з СПФГ. "Стандартна" послідовність зверху є послідовністю 5'-регуляторної ділянки дикого типу для гама-глобіну.
Сайти зв'язування пари 2Еп виділені червоним кольором, делеція 13 п.о. природного походження підкреслена.
І0039| На Фіг. 8, панелі від А до С, зображений Тадтап-аналіз еритроїдних колоній, одержаних від НС, оброблених 2ЕМ, націлюючих гама-глобіновий промотор, після чого відбувається осадження на метилцелюлозних колоніях. Число колоній вказане в нижній частині кожної смуги, як і генотип. На Фіг. 8А показані відносні співвідношення гама/бета-глобінових
МРНК; На Фіг. 88 показані рівні гама-глобінових мРНК, скориговані за рівнями 185 рРНК, а на
Фіг. 8С показаний відповідний аналіз рівнів бета-глобіну, скоригований за 185. Порівняння
Зо середніх значень співвідношень для дикого типу і мутантних колоній демонструє, що рівні гама- глобіну в колоніях з 2ЕМ-індукованими мутаціями в гама-глобіновому промоторі підвищені. 00401 На Фіг. 9 показана промоторна ділянка гама-глобінового гена (ЗЕО ІЮ МО:149-152).
Дві гама-глобінові алелі вирівняні (НВО і НВО). Відмінності в послідовностях двох алелей позначені сірими боксами. Крім того, мутації, які зв'язані з СПФГ, вказані чорними контурами.
Стартовий АТО вказується, як і межі екзону 1. Збільшення рівнів фетального глобіну, асоційованого з кожною мутацією, вказане числом над ним. 0041) На Фіг. 10, панелі А і В, зображена кількість МНЕ.) (тобто, порушення наміченого локусу, що є наслідком відновлюючої події спрямованого нуклеазою розриву, що базується на
МНЕ.) і корекція гена, виявлена для бета-глобінового гена в клітинах СО34-- з використанням вказаної нуклеази "цинкові пальці" і олігонуклеотидних донорів. 00421 На Фіг. 11 зображена кількість МНЕ) і наміченої інтеграції донорського нуклеотиду в клітини СОЗ4-, де гомологічні плечі на донорі різні.
І0043| На Фіг. 12 зображена стійкість генного редагування в еритроїдних похідних стовбурових клітин, які були оброблені 2ЕМ і олігонуклеотидним донором. Генну модифікацію аналізували у чотирьох типів клітинних популяцій, що виникли внаслідок диференціювання, еритроїдних колонієутворюючих одиницях ("СРО-Е"), еритроїдних бурстоутворюючих одиницях ("ВРО-Е"), колонієутворюючих одиницях гранулоцитів/макрофагів ССРО-ОМ") і колонієутворюючих одиницях гранулоцитів/еритроцитів/моноцитів/ макрофагів (СЕРО-СЕММ"). (0044) На Фіг. 13 зображена стабільність генної модифікації гена бета-глобіну в часі.
Детальний опис суті винаходу
І0045| В даному документі розкриті способи і композиції для вивчення і лікування генетичного захворювання, такого як гемоглобінопатія. Винахід описує геномне «редагування» клітини-мішені таким чином, що присутня сприятлива зміна експресії одного або більше глобінових генів, яка в свою чергу приводить до лікування гемоглобінопатій, таких як серпоподібно-клітинна хвороба або таласемія, у суб'єкта, який потребує цього. Сприятливі зміни експресії глобінового гена включають забезпечення гена у-глобіну у суб'єкта з аберантним
В-глобіном; та/або коригування послідовності аберантного гена с або В-глобіну, але не обмежуються ними. Крім того, доставка змінених гемопоетичних стовбурових клітин в трансплантат, змінений для експресії бажаного білкового продукту, може бути також корисною бо при лікуванні гемоглобінопатій, таких як серпоподібно-клітинна анемія або таласемія. Також описані клітинні лінії і тварини із зміненою глобіновою експресією. 0046) Таким чином, способи і композиції згідно винаходу можуть бути використані для зміни експресії одного або більше глобінових генів (наприклад, у, « та/або Д) в клітині (наприклад, еритроїдній клітині-попередниці). Ці способи і композиції можуть бути використані для руйнування генів, що беруть участь в у-глобіновій репресії (наприклад, ВСІ 11А або КІ Е1), так що після редагування клітини будуть експресувати у-глобін при більш високих рівнях і може бути одержаний НЬР. Крім того, редагування може бути використано для руйнування сайту зв'язування на гені (наприклад, руйнування зв'язування ВСІ 11А в бета-глобіновому локусі, руйнування зв'язування репресора транскрипції гама-глобіну в гама-глобіновому промоторі) для відключення репресії. Як альтернатива або в доповнення до цих змін, способи і композиції можуть бути використані для коригування аберантного «а та/або р-глобінового гена або вставки гена дикого типу в задане місце локалізації в геномі клітини (наприклад, в НЗС). Клітини- попередники можна отримати від потребуючих суб'єктів, модифікувати ех мімо, а потім повернути назад суб'єкту в трансплантаті кісткового мозку.
Загальне
І0047| Практика методів, а також одержання і застосування композицій, розкритих в даному документі, використовує, якщо не вказане інше, звичайні методи молекулярної біології, біохімії, хроматинової структури і аналізу, обчислювальної хімії, культури клітин, рекомбінантних ДНК і суміжних галузей, відомі фахівцям в даній галузі техніки. Ці методи повністю описані в літературі. Див., наприклад, ЗатьгоокК еї аї. МОГЕСИОГАЄК СІ ОМІМО: А ГАВОКАТОКУ МАМОАЇ.,
Зесопа еайіоп, Соїа бргіпуд Натог І арогаїюгу Ргезз, 1989 апа Тніга едйіоп, 2001; А!йзибеї еї аї.,
СОККЕМТ РКОТОСОІЇ 5 ІМ МОГЕСЦОГАК ВІОГОСУ, дЧопйп УМіеу 5 Боп5, Мем Мо, 1987 і періодичні оновлення; серії МЕТНОЮО5 ІМ ЕМАУМОГОСУ, Асадетіс Ргез5, зап Оіедо; УМоїНе,
СНЕОМАТІМ 5ТА!ОСТОВЕ АМО РОМСТІОМ, Тніга еайіоп, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, 1998;
МЕТНОЮОЗ ІМ ЕМАУМОГ ОС, Мої. 304, "Спготаїййп" (Р.М. М/аззаптап апа А. Р. Муоїйе, еав.),
Асадетіс Рге55, Зап Ріедо, 1999; ії МЕТНОО5 ІМ МОГ ЕСИШІ АК ВІОГОСУ, Мої. 119, "Снтотаїіп
Ргогосо!5" (Р.В. ВескКег, еа.) Нитапа Ргез5, Тоїомла, 1999.
Визначення (0048) Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" використовуються
Зо взаємозамінно і належать до дезоксирибонуклеотиду або рибонуклеотидного полімеру, лінійної або кільцевої конформації та одно- або дволанцюгової форми. Для цілей даного винаходу ці терміни не слід розглядати як обмежуючі відносно довжини полімеру. Терміни можуть включати відомі аналоги природних нуклеотидів, а також нуклеотидів, які змінюються в основному, у цукровому та/або фосфатному фрагментах (наприклад, в фосфоротіоатних скелетах). В цілому, аналог певного нуклеотиду має ту саму специфічність спарювання основ; тобто, аналог А буде утворювати пару з Т.
І0049| Терміни "поліпептид", "пептид" або "білок" використовуються взаємозамінно для позначення полімеру амінокислотних залишків. Термін також застосовується для амінокислотних полімерів, в яких одна або більше амінокислот є хімічними аналогами або модифікованими похідними відповідних амінокислот природного походження.
І0050| "Зв'язування" належить до специфічної відносно послідовності, нековалентної взаємодії між макромолекулами (наприклад, між білком і нуклеїновою кислотою). Не всі компоненти зв'язуючої взаємодії повинні бути специфічними відносно послідовності (наприклад, контакти з фосфатними залишками в скелеті ДНК), оскільки взаємодія в цілому є специфічною відносно послідовності. Такі взаємодії, як правило, характеризуються константою дисоціації (Ка) 10-6 М-1 або нижче. "Афінність" належить до сили зв'язування: підвищена афінність зв'язування корелює із зменшеною Ка.
І0О51| "Зв'язуючий білок" являє собою білок, який здатен зв'язуватись нековалентно з іншою молекулою. Зв'язуючий білок може зв'язуватись, наприклад, з молекулою ДНК (ДНК-зв'язуючий білок), молекулою РНК (РНК-зв'язуючий білок) та/або білковою молекулою (білок-зв'язуючий білок). У випадку білок-зв'язуючого білка він може зв'язуватись сам із собою (утворюється гомодимер, гомотример і т.д.) та/або він може зв'язуватись з однією або більше молекулами іншого білка або білків. Зв'язуючий білок може мати більше ніж один тип зв'язуючої активності.
Наприклад, білки «цинкові пальці» мають ДНК-зв'язуючу, РНК-зв'язуючу і білок-зв'язуючу активність.
І0052| "Білок, зв'язуючий ДНК цинкових пальців" (або зв'язуючий домен) є білком або доменом в межах більшого білка, який зв'язує ДНК способом, специфічним відносно послідовності, через один або більше цинкових пальців, які є ділянкою амінокислотної послідовності, в межах домену зв'язування якої структура стабілізується завдяки координації бо цинкового іону. Термін білок, зв'язуючий ДНК цинкових пальців, часто скорочують як білок
«цинкові пальці» або 2ЕР.
І0053| "ТАГЕ ДНК-зв'язуючий домен" або "ТАГЕ" є поліпептидом, що містить один або більше ТАГЕ повторних доменів/одиниць. Повторні домени беруть участь у зв'язуванні ТАГЕ з його когнантною ДНК-послідовністю-мішенню. Одна "повторна одиниця" (також називається "повтором") зазвичай складає 33-35 амінокислот в довжину і демонструє, принаймні, однакову гомологію послідовності з іншими послідовностями ТАЇЕ-повторів в межах білка ТАГЕ природного походження. Див., наприклад, патентну публікацію США Мо 20110301073. 0054) Зв'язуючі домени «цинкових пальців» і ТАГЕ можуть бути "сконструйованими" для зв'язування визначеної нуклеотидної послідовності, наприклад, шляхом конструювання (змінюючи одну або більше амінокислот) спіральної ділянки розпізнавання білка «цинкові пальці» або ТАГЕ природного походження. Тому, сконструйовані ДНК-зв'язуючі білки («цинкові пальці» або ТАЇЕ) являють собою білки, які не зустрічаються в природі. Необмежуючими прикладами способів конструювання ДНК-зв'язуючих білків є розробка і селекція. Розроблений
ДНК-зв'язуючий білок являє собою білок, який не зустрічається в природі і чия конструкція/склад є наслідком, головним чином, раціонального критерію. Раціональний критерій для конструкції включає застосування правил заміщення і комп'ютерних алгоритмів для обробки інформації про існуючі конструкції ЕР та/або ТАГЕ і даних зв'язування. Див., наприклад, патенти США 6 140 081; 6 453 242 і 6 534 261; див. також УМО 98/53058; УМО 98/53059; УМО 98/53060; УМО 02/016536 і
УМО 03/016496 і патентну публікацію США 20110301073. 00551 "Відібраний" білок «цинкові пальці» або ТАГЕ являє собою білок неприродного походження, продукування якого є наслідком, головним чином, емпіричного процесу, такого як фаговий дисплей, інтерактивна пастка або гібридна селекція. Див., наприклад, 05 5 789 538; 05 5925523; 0556 007 988; 056 013 455; 005 6 200 759; МО 95/19431; МО 96/06166; УМО 98/53057;
УМО 98/54311; УМО 00/27878; УМО 01/60970 УМО 01/88197; УМО 02/099084 і патентну публікацію
США 20110301073. 0056) "Рекомбінація" належить до процесу обміну генетичною інформацією між двома полінуклеотидами. Для цілей цього опису, "гомологічна рекомбінація" (НК) належить до спеціалізованої форми такого обміну, який відбувається, наприклад, під час відновлення дволанцюгових розривів в клітині за допомогою гомологічно спрямованих відновних механізмів.
Зо Цей процес вимагає гомології нуклеотидних послідовностей, використання "донорської" молекули для відновлюючої матриці молекули-"мішені" (тобто, молекули, яка зазнала дволанцюгового розриву), і відомий як "некросинговерна конверсія генів" або "короткошляхова конверсія генів", так як він приводить до передачі генетичної інформації від донора до мішені.
Не бажаючи бути пов'язаною з будь-якою конкретною теорією, така передача може включати коригування невідповідності гетеродуплексної ДНК, яка утворюється між розірваною мішенню і донором, та/або "синтез-залежний відпал нитки", в якому донор використовується для ресинтезу генетичної інформації, яка стане частиною мішені, та/або подібні процеси. Така спеціалізована НК часто приводить до зміни послідовності молекули-мішені таким чином, що частина або вся послідовність донорського полінуклеотиду включається в полінуклеотид- мішень.
І0057| В способах згідно даного розкриття, одна або більше нуклеаз-мішеней, як описано в даному документі, утворюють дволанцюговий розрив в послідовності-мішені (наприклад, клітинному хроматині) в заданому сайті, а "донорський" полінуклеотид, що має гомологію з нуклеотидною послідовністю в ділянці розриву, може бути введеним в клітину. Наявність дволанцюгового розриву, як було показано, полегшує інтеграцію донорської послідовності.
Донорська послідовність може бути фізично інтегрована або, як альтернатива, донорський полінуклеотид використовується як матриця для відновлення розриву через гомологічну рекомбінацію, в результаті чого вводиться вся або частина нуклеотидної послідовності як донора в клітинний хроматин. Таким чином, перша послідовність в клітинному хроматині може змінюватись і, в деяких варіантах реалізації, може перетворюватись в послідовність, присутню в донорському полінуклеотиді. Таким чином, використання термінів "замінити" або "заміна" можна розуміти як репрезентування заміни однієї нуклеотидної послідовності іншою (тобто, заміна послідовності в інформаційному сенсі), і не обов'язково вимагає фізичної або хімічної заміни одного полінуклеотиду іншим. 0058) В будь-якому з способів, описаних в даному документі, додаткові пари білків "цинкові пальці" або ТАГЕМ можуть бути використані для додаткового дволанцюгового розщеплення додаткових сайтів-мішеней в клітині. Крім того, система СКІЗРЕ/Са5 може бути аналогічним чином використана для індукції додаткових дволанцюгових розривів.
І0О59) В деяких варіантах реалізації способів спрямованої рекомбінації та/або заміни, та/або бо зміни послідовності в цільовій ділянці в клітинному хроматині, хромосомна послідовність змінюється шляхом гомологічної рекомбінації з екзогенною "донорською" нуклеотидною послідовністю. Така гомологічна рекомбінація стимулюється наявністю дволанцюгового розриву в клітинному хроматині, якщо присутні послідовності, гомологічні ділянці розриву.
ІЇ0О60О| В будь-якому з способів, описаних в даному документі, екзогенна нуклеотидна послідовність ("донорська послідовність" або "трансген") може містити послідовності, які гомологічні, але не ідентичні, геномним послідовностям в цільовій ділянці, тим самим стимулюючи гомологічну рекомбінацію для вставки неідентичної послідовності в цільову ділянку. Таким чином, в деяких варіантах реалізації, ділянки послідовності донора, які гомологічні послідовності в цільовій ділянці та демонструють приблизно від 80 до 99 95 (або будь-яке ціле значення між ними) ідентичність з геномною послідовністю, яка замінюється. В інших варіантах реалізації гомологія між донорською і геномною послідовністю становить вище, ніж 99 95, наприклад, якщо тільки один нуклеотид відрізняється між донорською і геномною послідовностями з більше ніж 100 суміжних пар основ. В деяких випадках, негомологічна частина донорської послідовності може містити послідовності, які відсутні в цільовій ділянці, так що нові послідовності вводяться в цільову ділянку. В цих випадках, негомологічна послідовність, як правило, фланкована послідовностями з 50-1000 пар основ (або будь-яке цілочисленне значення між ними) або будь-якої кількості пар основ, що перевищує 1000, які гомологічні або ідентичні послідовності в цільовій ділянці. В інших варіантах реалізації донорська послідовність, негомологічна першій послідовності, вставляється в геном шляхом механізмів негомологічної рекомбінації. 0061) Будь-який з способів, описаних в даному документі, може бути використаний для часткової або повної інактивації однієї або більше послідовностей-мішеней в клітині шляхом спрямованої інтеграції донорської послідовності, яка порушує експресію гена(ів), що становить інтерес. Також передбачені клітинні лінії з частково або повністю інактивованими генами. 00621 Крім того, способи спрямованої інтеграції, як описано в даному документі, також можуть бути використані для інтеграції однієї або декількох екзогенних послідовностей.
Екзогенна послідовність нуклеїнової кислоти може містити, наприклад, один або більше генів або молекул кДНК або будь-який тип кодуючої або некодуючої послідовності, а також один або декілька елементів регуляції (наприклад, промотори). Крім того, екзогенна послідовність
Зо нуклеїнової кислоти може продукувати одну або декілька молекул РНК (наприклад, короткі шпилькові РНК (кшРНК), інгібуючі РНК (РНКІс), мікроРНК (міР НК) і т.д.).
І0063| "Розщеплення" належить до розриву ковалентного скелета молекули ДНК.
Розщеплення може ініціюватись різними способами, включаючи ферментативний або хімічний гідроліз фосфодіефірного зв'язку, але не обмежуючись ними. Можливі як одноланцюгові розщеплення, так і дволанцюгові розщеплення, а дволанцюгові розщеплення можуть відбуватись в результаті двох різних подій одноланцюгових розщеплень. Розщеплення ДНК може привести до одержання тупих кінців або ступінчатих кінців. В деяких варіантах реалізації, злиті поліпептиди використовуються для адресного дволанцюгового розщеплення ДНК.
ІЇ0064| "Напівдомен розщеплення " являє собою поліпептидну послідовність, яка в сполученні з іншим поліпептидом (однаковим або відмінним) утворює комплекс, що має активність розщеплення (переважно дволанцюгову активність розщеплення). Терміни "перший і другий напівдомени розщеплення", "- і - напівдомени розщеплення" і "правий і лівий напівдомени розщеплення " використовуються як взаємозамінні для позначення пар напівдоменів розщеплення, які димеризуються.
ІЇ0065| "Сконструйований напівдомен розщеплення" є напівдоменом розщеплення, модифікованим для того, щоб утворювати облігатні гетеродимери з іншим напівдоменом розщеплення (наприклад, з іншим сконструйованим напівдоменом розщеплення). Див., також патентні публікації США Мо 2005/0064474, 2007/0218528, 2008/0131962 і 2011/0201055, включені до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. 0066) Термін "послідовність" належить до нуклеотидної послідовності будь-якої довжини, яка може бути ДНК або РНК, може бути лінійною, кільцевою або розгалуженою і може бути одноланцюговою або дволанцюговою. Термін "донорська послідовність" належить до нуклеотидної послідовності, яка вставлена в геном. Донорська послідовність може бути будь- якої довжини, наприклад, від 2 до 10000 нуклеотидів в довжину (або будь-яким цілочисленним значенням між ними або вище), переважно від 100 до 1000 нуклеотидів в довжину (або будь- яким цілочисленним значенням між ними), більш переважно від приблизно 200 до 500 нуклеотидів в довжину.
ІЇ0067| "Патогенний ген" є геном, будь-яким чином ушкодженим при моногенному захворюванні. Необмежуючі приклади моногенних захворювань включають тяжкий бо комбінований імунодефіцит, кістозний фіброз, лізосомальні хвороби накопичення (наприклад,
хвороба Гоше, Херлера, Хантера, Фабрі, Неймана-Піка, Тай-Саха і т.д.), серпоподібно-клітинну анемію і таласемію. 0068) "Хроматин" являє собою нуклеопротеїнову структуру, що містить клітинний геном.
Клітинний хроматин містить нуклеїнову кислоту, в першу чергу ДНК, і білок, включаючи гістони і негістонові хромосомні білки. Більшість еукаріотичного клітинного хроматину існує у вигляді нуклеосом, в яких нуклеосомне ядро містить приблизно 150 пар основ ДНК, зв'язаних з октамером, що містить два гістони Н2А, Н2В, НЗ і Н4; а лінкерна ДНК (перемінної довжини, в залежності від організму) простягається між нуклеосомними ядрами. Молекула гістону НІ, як правило, зв'язана з лінкерною ДНК. Для цілей даного винаходу термін "хроматин" призначений охоплювати всі типи клітинного нуклеопротеїну, як прокаріотичні, так і еукаріотичні. Клітинний хроматин включає як хромосомний, так і епісомний хроматин.
І0069| "Хромосома" являє собою хроматиновий комплекс, що включає весь або частину геному клітини. Геном клітини часто характеризується каріотипом, який являє собою сукупність всіх хромосом, що складають геном клітини. Геном клітини може містити одну або декілька хромосом. 0070) "Епісома" є нуклеїновою кислотою, що реплікується, нуклеопротеїновим комплексом або іншою структурою, що містить нуклеїнову кислоту, яка не є частиною хромосомного каріотипу клітини. Приклади епісом включають плазміди і деякі вірусні геноми. 00711) "Сайт-мішень" або "послідовність-мішень" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка визначає частину нуклеїнової кислоти, з якою зв'язуюча молекула буде зв'язуватись, і забезпечує умови, достатні для існування зв'язування. 0072) "Екзогенна" молекула являє собою молекулу, яка зазвичай не зустрічається в клітині, але може бути введена в клітину за допомогою одного або декількох генетичних, біохімічних або інших методів. "Нормальна присутність в клітині" визначається відносно конкретної стадії розвитку і оточуючих умов клітини. Так, наприклад, молекула, яка присутня лише тільки під час ембріонального розвитку м'яза, є екзогенною молекулою відносно дорослої м'язової клітини.
Аналогічно, молекула, індукована тепловим шоком, є екзогенною молекулою відносно клітини, що не піддавалась тепловому шоку. Екзогенна молекула може містити, наприклад, функціонуючу версію неправильно функціонуючої ендогенної молекули або неправильно
Зо функціонуючу версію нормально функціонуючої ендогенної молекули.
ІЇ0073| Екзогенна молекула може бути, зокрема, невеликою молекулою, наприклад, що генерується за допомогою процесу комбінаторної хімії, або макромолекулою, такою як білок, нуклеїнова кислота, вуглевод, ліпід, глікопротеїн, ліпопротеїн, полісахарид, будь-яке модифіковане похідне вищевказаних молекул або будь-який комплекс, що включає одну або більше вищевказаних молекул. Нуклеїнові кислоти включають ДНК і РНК, можуть бути одно- або дволанцюговими; можуть бути лінійними, розгалуженими або кільцевими; і можуть бути будь-якої довжини. Нуклеїнові кислоти включають кислоти, здатні утворювати дуплекси, а також триплексоутворюючі нуклеїнові кислоти. Див., наприклад, патенти США Мо 5176996 і 5422251.
Білки включають ДНК-зв'язуючі білки, фактори транскрипції, фактори реконструкції хроматину, метильовані ДНК-зв'язуючі білки, метилази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоізомерази, гірази і гелікази, але не обмежуються ними.
І0074| Екзогенна молекула може бути молекулою того самого типу, що й ендогенна молекула, наприклад, екзогенним білком або нуклеїновою кислотою. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може містити інфікуючий вірусний геном, плазміду або епісому, що вводяться в клітину, або хромосому, яка зазвичай є відсутньою в клітині. Способи введення екзогенних молекул в клітини відомі фахівцям в даній галузі і включають опосередкований ліпідами перенос (наприклад, ліпосоми, включаючи нейтральні і катіонні ліпіди), електропорацію, безпосередню ін'єкцію, злиття клітин, бомбардування частинками, фосфатно- кальцієве співосадження, ОЕАЕ-декстран-опосередкований перенос і опосередкований вірусним вектором перенос, але не обмежуються ними. Екзогенна молекула може також бути молекулою того самого типу, що й ендогенна молекула, але одержаною від іншого виду, ніж одержана клітина. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти людини може бути введена в лінії клітин, спочатку одержані від мишей або хом'яка. 0075) Навпаки, "ендогенна" молекула є молекулою, яка зазвичай наявна в певній клітині на певному етапі розвитку в конкретних умовах оточуючого середовища. Наприклад, ендогенна нуклеїнова кислота може містити хромосому, геном мітохондрії, хлоропласту або іншої органели, або бути епісомальною нуклеїновою кислотою природного походження. Додаткові ендогенні молекули можуть включати білки, наприклад, фактори транскрипції і ферменти. 60 І0076| "Злита" молекула являє собою молекулу, в якій з'єднані дві або більше субодиничних молекул, переважно, ковалентно. Молекулярні субодиниці можуть бути однакового хімічного типу, або можуть бути різними хімічними типами молекул. Приклади першого типу злитої молекули включають злиті білки (наприклад, злиття між 2ЕР або ТАГЕ ДНК-зв'язуючим доменом і одним або більше доменів активації) і злиті нуклеїнові кислоти (наприклад, нуклеїнову кислоту, що кодує злитий білок, описаний вище), але не обмежуються ними.
Приклади іншого типу злитої молекули включають злиття між триплексоутворюючою нуклеїновою кислотою і поліпептидом і злиття між білком, що зв'язується з малою борозною, і нуклеїновою кислотою, але не обмежуються ними.
І0077| Експресія злитого білка в клітині може бути результатом доставки злитого білка в клітину або шляхом доставки полінуклеотиду, що кодує злитий білок, в клітину, де полінуклеотид транскрибується, а транскрипт транслюється для одержання злитого білка.
Транс-сплайсинг, поліпептидне розщеплення і лігування поліпептиду можуть також брати участь в експресії білка в клітині. Методи полінуклеотидної і поліпептидної доставки в клітини надані в іншому розділі в цьому описі. 00781) "Ген", для цілей даного винаходу включає ділянку ДНК, що кодує генний продукт (див. нижче), а також всі ділянки ДНК, які регулюють продукування генного продукту, незалежно від того, чи є такі регуляторні послідовності суміжними з кодуючою послідовністю та/або послідовністю, що транскрибується. Відповідно, ген включає, але не обов'язково обмежується ними, промоторні послідовності, термінатори, послідовності, що регулюють трансляцію, такі як сайти зв'язування рибосом і сайти внутрішньої посадки рибосом, енхансери, сайленсери, інсулятори, межові елементи, точки початку реплікації, сайти прикріплення матриці і локусні контрольні ділянки.
І0079)| «Експресія гена» належить до перетворення інформації, що міститься в гені, в генний продукт. Генний продукт може бути прямим транскрипційним продуктом гена (наприклад, мРНК, 25. тРНК, рРНК, антисмисловою РНК, рибозимом, структурною РНК або будь-яким іншим типом
РНК) або білком, одержаним шляхом трансляції мРНК. Генні продукти також включають РНК, модифіковані за допомогою таких процесів, як кепування, поліаденілування, метилування і редагування, і білки, модифіковані, наприклад, метилуванням, ацетилуванням, фосфорилуванням, убіквітуванням, АОР-рибозилюванням, миристилюванням і
Зо глікозилюванням.
І0080)| "Модуляція" експресії гена, належить до зміни активності гена. Модуляція експресії може включати активацію генів і репресію генів, але не обмежуватись ними. Редагування геному (наприклад, розщеплення, зміна, інактивація, випадкові мутації) може бути використана для модулювання експресії. Інактивація гена належить до будь-якого зниження експресії гена у порівнянні з клітиною, яка не включає 2ЕР або ТАГ ЕМ, як описано в даному документі. Таким чином, інактивація гена може бути частковою або повною.
І0081| "Цільова ділянка" являє собою будь-яку ділянку клітинного хроматину, таку як, наприклад, ген або некодуюча послідовність в межах або в безпосередній близькості до гена, в якій бажаним є зв'язування екзогенної молекули. Зв'язування може бути для цілей наміченого розщеплення ДНК та/або наміченої рекомбінації. Цільова ділянка може знаходитись в хромосомі, епісомі, органельному геномі (наприклад, мітохондрій, хлоропластів) або інфікуючому вірусному геномі, наприклад. Цільова ділянка може знаходитись в межах кодуючої ділянки гена, некодуючих ділянок, що транскрибуються, таких як, наприклад, лідерні послідовності, трейлерні послідовності або інтрони, або в межах ділянок, що не транскрибуються, ирзігеат або доупбзігеат від кодуючої ділянки. Цільова ділянка може бути невеликою, як одна пара нуклеотидів або до 2000 пар нуклеотидів в довжину, або будь-яким цілочисленним значенням нуклеотидних пар. (0082) "Еукаріотичні" клітини включають клітини грибів (наприклад, дріжджів), рослинні клітини, клітини тварин, клітини ссавців і клітини людини (наприклад, Т-клітини), але не обмежуються ними. (0083) "Червоні кров'яні клітини" (ЧКК), або еритроцити, термінально диференційовані клітини, одержані з гемопоетичних стовбурових клітин. У них не має нуклеази і більшості клітинних органел. Еритроцити містять гемоглобін, щоб переносити кисень з легень до периферичних тканин. Насправді, 33 95 індивідуальних ЧКК складає гемоглобін. Вони також переносять СО2, що виробляється клітинами в процесі метаболізму, з тканин і назад в легені для вивільнення під час видиху. Еритроцити утворюються в кістковому мозку у відповідь на гіпоксію крові, яка опосередковується шляхом вивільнення еритропоетину (ЕРО) в нирках. ЕРО приводить до збільшення числа протоеритробластів і скорочує час, необхідний для повного дозрівання еритроцитів. Через приблизно 120 днів, оскільки ЧКК не містить ядра або будь-яких 60 інших відновлюючих можливостей, клітини видаляють з обігу за допомогою фагоцитарної активності макрофагів в печінці, селезінці та лімфатичних вузлах (- 9095) або гемолізу в плазмі (у 1095). Після поглинання макрофагами хімічні компоненти ЧКК руйнуються у вакуолях макрофагів під дією лізосомальних ферментів.
І0084| "Секреторні тканини" є тканинами тварин, які секретують продукти з окремої клітини в просвіт будь-якого типу, який зазвичай одержують з епітелію. Приклади секреторних тканини, локалізованих в шлунково-кишковому тракті, включають клітини, які вистилають кишечник, підшлункову залозу та жовчний міхур. Інші секреторні тканини включають печінку, тканини, зв'язані з оком та слизовими оболонками, такими як слинних залоз, молочних залоз, передміхурової залози, гіпофізу та інших членів ендокринної системи. Крім того, секреторні тканини включають окремі клітини типу тканини, які здатні до секреції. (0085) Терміни "функціональне з'єднання" і "функціонально зв'язаний" (або "функціонально з'єднаний") використовуються взаємозамінно з посиланням на співставлення двох або більше компонентів (наприклад, елементів послідовності), в яких компоненти розміщені таким чином, що обидва компоненти функціонують нормально і припускають можливість того, що, принаймні, один з компонентів може опосередковувати функцію, яка впливає, принаймні, на один з інших компонентів. Як ілюстрації, послідовність, що регулює транскрипцію, така як промотор, функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, якщо послідовність, що регулює транскрипцію, контролює рівень транскрипції кодуючої послідовності у відповідь на присутність або відсутність одного або більше регулюючих транскрипцію факторів. Регулююча транскрипцію послідовність зазвичай функціонально зв'язана іп сіє з кодуючою послідовністю, але необов'язково повинна бути в безпосередній близькості до неї. Наприклад, енхансер транскрипції є регуляторною послідовністю, яка функціонально зв'язана з кодуючою послідовністю, навіть якщо вони не є суміжними.
І0086| Що стосується злитих поліпептидів, то термін "функціонально зв'язаний" може стосуватись того, що кожний з компонентів виконує таку саму функцію в зв'язку з іншим компонентом так, якби вони не були зв'язані між собою. Наприклад, відносно злитого поліпептиду, в якому 2ЕР, ТАГЕ або Са5 ДНК-зв'язуючий домен злитий з доменом активації, 2ЕР, ТАГЕ або Са ДНК-зв'язуючий домен і домен активації зв'язані функціонально, якщо в злитому поліпептиді ЕР, ТАГЕ або Са ДНК-зв'язуюча ділянка домену здатна зв'язувати сайт-
Зо мішень та/або його сайт зв'язування, в той час як домен активації може підвищувати експресію генів. Коли злитий поліпептид, в якому 2ЕР або ТАГЕ ДНК-зв'язуючий домен злитий з доменом розщеплення, 2ЕР або ТАЇЕ ДНК-зв'язуючий домен і домен розщеплення зв'язані функціонально, якщо в злитому поліпептиді ЕР або ТАГЕ ДНК-зв'язуюча ділянка домену здатна зв'язувати сайт-мішень та/або його сайт зв'язування, а ділянку розщеплення може розщеплювати ДНК в безпосередній близькості від сайту-мішені. (0087) "Функціональний фрагмент" білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти являє собою білок, поліпептид або нуклеїнову кислоту, послідовність яких не співпадає з непроцесованим білком, поліпептидом або нуклеїновою кислотою, але зберігає ті самі функції, що й у непроцесованого білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти. Функціональний фрагмент може мати більшу, меншу або таку ж кількість залишків, що й відповідна природна молекула, та/або може містити одну або більше амінокислотних або нуклеотидних замін. Методи визначення функції нуклеїнової кислоти (наприклад, кодуючу функцію, здатність до гібридизації з іншою нуклеїновою кислотою) добре відомі в даній галузі техніки. Аналогічно методи визначення функції білка добре відомі. Наприклад, ДНК-зв'язуюча функція поліпептиду може бути визначена, наприклад, за допомогою методу зв'язування на фільтрах, аналізу зміни електрофоретичної рухливості або імунопреципітації Розщеплення ДНК може бути проаналізоване за допомогою гель-електрофорезу. Див. А!йзибеї і др., вище. Здатність білка взаємодіяти 3 іншим білком може бути визначена, наприклад, шляхом спільної імунопреципітації, двогібридних аналізів або комплементації, як генетичної, так і біохімічної.
Див., наприклад, Рієеїа5 еї аІ. (1989) Майшге340:245-246; патент США Мо 5585245 і РСТ УМО 98/44350. (0088) "Вектор" здатний переносити генні послідовності до клітин-мішеней. Як правило, "векторний конструкт", "вектор експресії" і "вектор переносу гена" означає будь-яку конструкцію нуклеїнової кислоти, здатну регулювати експресію цільового гена, і яка може переносити генні послідовності до клітин-мішеней. Таким чином, термін включає клонування і експресію носіїв, а також інтегруючих векторів. (0089) "Ген-репортер" або "репортерна послідовність" належить до будь-якої послідовності, яка продукує білковий продукт, який легко виміряти, переважно, хоча і необов'язково, в звичайному аналізі. Придатні гени-репортери включають послідовності, що кодують білки, які бо опосередковують резистентність до антибіотику (наприклад, резистентність до ампіциліну,
резистентність до неоміцину, резистентність до (3418, резистентність до пуроміцину), послідовності, що кодують забарвлені або флуоресцентні, або люмінесцентні білки (наприклад, зелений флуоресцентний білок, посилений зелений флуоресцентний білок, червоний флуоресцентний білок, люциферази), і білки, які опосередковують підвищений ріст клітин та/або ампліфікацію гена (наприклад, дигідрофолатредуктази), але не обмежуються ними. Епітопні мітки включають, наприклад, одну або більше копій РІГ АС, Ні, тус, Тар, НА або будь-яку виявлювану амінокислотну послідовність. "Експресійні мітки" включають послідовності, які кодують репортери, які можуть бути функціонально зв'язані з бажаною генною послідовністю, щоб контролювати експресію цільового гена.
І0090І Терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовуються взаємозамінно і належать до ссавців, таких як хворі люди і примати, що не належать до людського роду, а також до експериментальних тварин, таких як кролі, собаки, коти, щурі, миші та інші тварини. Відповідно, термін "суб'єкт" або "пацієнт", що використовується в контексті даного опису, означає будь- якого ссавця або суб'єкт, яким можуть бути введені змінені еритроцити (або стовбурові клітини) згідно даного винаходу. Суб'єкти згідно даного винаходу включають тих, хто зазнав впливу одного або більше хімічних токсинів, включаючи, наприклад, нейротоксин.
Нуклеази
І0091| В даному документі описані композиції, зокрема нуклеази, які є корисними для націлювання гена для використання при гемоглобінопатіях. В певних варіантах реалізації винаходу нуклеази мають природне походження. В інших варіантах реалізації нуклеази не є природними, тобто, є сконструйованими в ДНК-зв'язуючому домені та/або домені розщеплення.
Наприклад, ДНК-зв'язуючий домен нуклеази природного походження може бути змінений з метою зв'язування вибраного сайту-мішені (наприклад, мегануклеаза, яка була змінена для зв'язування з сайтом, що відрізняється від когнантного сайту зв'язування). В інших варіантах реалізації, нуклеаза містить гетерологічні ДНК-зв'язуючі сайти і сайти розщеплення (наприклад, нуклеази «цинкові пальці»; ТАЇ-ефекторні нуклеази; мегануклеазні ДНК-зв'язуючі домени з гетерологічними доменами розщеплення), або універсальна нуклеаза спрямовується специфічною гідовою РНК (наприклад, СКРІЗЕ/Сав).
А. ДНК-зв'язуючі домени
Зо І0092| В певних варіантах реалізації винаходу нуклеазами є мегануклеази («хомінг»- ендонуклеаза). Мегануклеази природного походження розпізнають сайти розщеплення з 15-40 пар основ і зазвичай групуються в чотири сімейства: сімейство ГАС ІБАЮО, сімейство СІМ-М/ІС, боксове сімейство Нів-Субві і сімейство НМН. Приклади «хомінг»-ендонуклеаз включають 1-5св6ї,
І-Сешці, РІ-Рері, РІ-5се, І-ЗсеїМ, І-Сеті, І-Рапі, І-5сеїї, І-Ррої, І-5сепП, І-Стеї, І-Темі, І-Темі! ї І-ТемП.
Їх послідовності розпізнавання відомі. Див. також патент США Ме 5 420032; патент США Ме 6833252; Вейцоп еї а!І.(1997) Мисієїс Асідв Нез.25:3379-3388; Юціоп єї а. (1989) Сепе82:115-118;
Репег єї аІ(1994) Мисівєїс Асідх Вевз. 22, 1125-1127; 9давіп (1996) Тгтепд5з Сепеї.12:224-228;
Сітбіе єї а. (1996) У. Мої. ВіоІ.263:163-180; Агдаві еї аї. (1998) 9. Мої. ВіоІ.280:345-353 і Мем/
Епаїапа Віоїабх саїаіодие.
ІЇ0093| В певних варіантах реалізації винаходу нуклеаза містить сконструйовану (не природного походження) «хомінг»-ендонуклеазу (мегануклеазу). Послідовності розпізнавання «хомінг»-ендонуклеаз і мегануклеаз, такі як І-5сеї, І-Сеці, РІ-Рері, РІ-5се, І-ЗсеїМ, І-Свті, І-Рапі,
І-5сеїІ, І-Ррої, І-ЗсеїПП, І-Стеї, І-Темі, І-Темі! ї І-Темі! відомі. Див. також патент США Мо 5420032; патент США Мо 6833252; Вепйогі еї аІ.(1997) Мисівїс Асіа5 Ке5.25:3379-3388; ЮОціоп еї аї. (1989)
Сепе82:115-118; Репег єї аІ(1994) Мисієїс Асідв5 Ве5. 22, 1125-1127; дазіп (1996) Тгтеєепав
Сепеї.12:224-228; Сітбріє еї а. (1996) У. Мої. ВіоІ.263:163-180; Агдавзі єї аї. (1998) 9. Мо).
ВіоІ.280:345-353 і Мем Епдіапа Віоїар5 саїаюдие. Крім того, ДНК-зв'язуюча специфічність «хомінг»-ендонуклеаз і мегануклеаз може бути сконструйована таким чином, щоб зв'язувати штучні сайти-мішені. Див., наприклад, Спемаїїег еї аї. (2002) Моїес. Сеї! 10:895-905; Еріпаї єї а!(2003) Мисієїс Асіа5 Невз. 31:2952-2962; АбзПпПмМоп еї аї. (2006) Маїшге441:656-659; Радиез еї аї. (2007) Ситепі Сепе ТНегару 7:49-66; патентну публікацію США Мо 20070117128. ДНК-зв'язуючі домени «хомінг»-ендонуклеаз і мегануклеаз можуть змінюватись в контексті нуклеаз в цілому (тобто, так що нуклеаза містить когнантний сайт розщеплення) або може бути злитою з гетерологічним доменом розщеплення
І0094| В інших варіантах реалізації винаходу ДНК-зв'язуючий домен містить природний або сконструйований (не природного походження) ТАЇ ефекторний ДНК-зв'язуючий домен. Див., наприклад, патентну публікацію Мо 20110301073, включену до даного документу шляхом посилання у повному обсязі. Фітопатогенні бактерії роду Хапіпотопавх, як відомо, спричиняють багато хвороб у важливих сільськогосподарських культур. Патогенність Хапіпотопа5 залежить бо від консервативного типу ПШ секреторної (Т35) системи, яка ін'єктує більше ніж 25 різних ефекторних білків в рослинну клітину. Серед цих ін'єктованих білків знаходяться транскрипційні активатор-подібні ефектори (ТА! Е), які імітують рослинні активатори транскрипції і маніпулюють рослинними транскриптонами (див. Кау еї аї (2007) бсіепсе 318:648-651). Ці білки містять ДНК- зв'язуючий домен і домен активації транскрипції. Одним з найбільш добре охарактеризованих
ТАГЕ є АмгВ53 з Хапіпотопа5 сатрезідгіз патовар Мезісайогіа (див. Вопаз єї а! (1989) Мої Сеп
Сепеї 218: 127-136 і ММО2010079430). ТА Е містить централізований домен тандемних повторів, кожний повтор містить приблизно 34 амінокислоти, які є ключем до ДНК-зв'язуючої специфічності цих білків. Крім того, вони містять нуклеарно локалізаційну послідовність і кислотний домен активації транскрипції (для огляду див. ЗСПОРНКСК 5, еї а! (2006) У Ріапі
РНпузіо! 163(3): 256-272). Крім того, у фітопатогенної бактерії Каїбсіопіа зоІапасеагит, як було виявлено, два гени, позначенні бгд11 і прх1!7, є гомологічними до сімейства АмгВ53 з
ХапШфотопах у штаму СМІ1000 біовару 1 К. зоЇапасеагит і у штаму К51000 біовару 4 (див.
Нешег еї а! (2007) Аррі апа Епмік Місто 73(13): 4379-4384). Ці гени на 98,9 95 ідентичні один одному в нуклеотидній послідовності, але відрізняються делецією 1575 п.о. в домені повтору прх17. Однак, обидва генні продукти мають менш ніж 40 95 ідентичність послідовностей з білками сімейства АмгВ53 з Хапіпотопав. 0095) Таким чином, в деяких варіантах реалізації винаходу ДНК-зв'язуючий домен, який зв'язує сайт-мішень в локусі-мішені (наприклад, глобіновому або «затишної гавані») є сконструйованим доменом з ТАЇ-ефектора, подібного до тих, що одержані від патогенів
ХапШпотопазх (див. Восп еї аї, (2009) 5сіепсе 326: 1509-1512 і Мозсои апа Воддапоме, (2009) зЗсіепсе326: 1501) і Каїбхіопіа (див. Непцег еї а! (2007) Арріїєй апа Епмігопітепіа! Місгобіоіоду 73(13): 4379-4384); патент США Мо 8420782 і 8440431 і патентну публікацію США 20110301073. (0096) В певних варіантах реалізації винаходу ДНК-зв'язуючий домен містить білок «цинкові пальці» (наприклад, білок «цинкові пальці», який зв'язує сайт-мішень в глобіновому гені або гені «затишної гавані»). Переважно, білок «цинкові пальці» не має природного походження, він сконструйований, щоб зв'язувати кращий сайт-мішень. Див., наприклад, Веегії еї аї. (2002)
Маїшиге Віоїесппої. 20:135-141; Рабо сеї а. (2001) Апп. Неу. Віоспет.70:313-340; Ізаїап еї аї. (2001)
Маїшцге Віоїєснпої. 19:656-660; Бедаї єї а. (2001) Сит. Оріп. Віоїеснпої. 12:632-637; Споо еї аї. (2000) Сит. Оріп. 5іписі. Віо!. 10:411-416, патенти США Мо 6453242; 6534261; 6599692; 6503717;
Зо 6689558; 7030215; 6794136; 7067317; 7262054; 7070934; 7361635; 7253273; і патентні публікації
США Мо 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, всі включені до даного документу шляхом посилання у повному обсязі.
І0097| Сконструйоване зв'язування «цинкових пальців» або домен ТАЇЕ може мати нову специфічність зв'язування у порівнянні з природним білком «цинкові пальці». Методи конструювання включають конструктивну розробку і різні типи відбору, але не обмежуються ними. Конструктивна розробка включає, наприклад, використання баз даних, що містять триплетні (або квадруплетні) нуклеотидні послідовності та індивідуальні амінокислотні послідовності «цинкових пальців», в яких кожна триплетна або квадруплетна нуклеотидна послідовність асоціюється з однією або більше амінокислотними послідовностями «цинкових пальців», які зв'язують окрему триплетну або квадруплетну послідовність. Див., наприклад, патенти США 6 453 242 і 6 534 261, включені до даного документу шляхом посилання в повному обсязі.
І0098| Приклади методів відбору, включаючи фаговий дисплей і двогібридні системи, розкриті в патентах США 5 789 538; 5 925 523: 6 007 988; 6 013 453; 6 410 248; 6 140 466; 6 200 159 і 6,242,568; а також УМО 98/37186; УМО 98/53057; УМО 00/27878; УМО 01/88197 і СВ 2,338,237.
Крім того, покращення специфічності зв'язування доменів зв'язування «цинкових пальців» описані, наприклад, в УМО 02/077227.
ІЇ0099| Крім того, як розкрито в даному документі та інших посиланнях, ДНК-домени (наприклад, мультипальцевий білок «цинкові пальці» або домени ТАГЕ) можуть об'єднуватись разом з використанням будь-якої придатної лінкерної послідовності, включаючи, наприклад, лінкери з 5 або більше амінокислот в довжину. Див., також патенти США Мо 6479626; 6903185 і 7153949 стосовно лінкерних послідовностей з б або більше амінокислот в довжину. ДНК- зв'язуючі білки, описані в даному документі, можуть включати будь-яку комбінацію придатних лінкерів між окремими «цинковими пальцями» білка. Крім того, покращення специфічності зв'язування доменів зв'язування «цинкових пальців» описані, наприклад, в МО 02/077227.
ІО10О0| Відбір сайтів-мішеней; ДНК-зв'язуючих доменів і способів для розробки і конструювання злитих білків (і полінуклеотидів, що їх кодують) відомі фахівцям в цій галузі техніки і докладно описані в патентах США Мо 61400815; 789538; 6453242; 6534261; 5925523; 6007988; 6013453; 6200759; МО 95/19431; МО 96/06166; МО 98/53057; МО 98/54311; МО 60 00/27878; МО 01/60970 УМО 01/88197; МО 02/099084; МО 98/53058; МО 98/53059; УМО 98/53060;
УМО 02/016536 і УМО 03/016496 і патентній публікації США Мо 20110301073. 0101) Крім того, як розкрито в даному документі та інших посиланнях, ДНК-зв'язуючі домени (наприклад, мультипальцевий білок «цинкові пальці») можуть об'єднуватись разом з використанням будь-якої придатної лінкерної послідовності, включаючи, наприклад, лінкери з 5 амінокислот в довжину. Див. також патенти США Мо 6479626; 6903185; і 7153949 стосовно прикладів лінкерних послідовностей з б або більше амінокислот в довжину. Білки, описані в даному документі, можуть включати будь-яку комбінацію придатних лінкерів між окремими «цинковими пальцями» білка.
В. Домени розщеплення
І0102| Будь-який придатний домен розщеплення може функціонально з'єднуватись з ДНК- зв'язуючим доменом для утворення нуклеази. Наприклад, 2ЕР ДНК-зв'язуючі домени зливаються з нуклеазними доменами для створення 2ЕМ - функціональної одиниці, яка здатна розпізнати свою намічену нуклеїнову кислоту-«мішень за допомогою свого сконструйованого (2ЕР) ДНК-зв'язуючого домену і обумовлює ДНК, що підлягає розрізанню біля сайту зв'язування
ДЕР за допомогою нуклеазної активності. Див., наприклад, Кіт еї аї. (1996) Ргос маг! Асай зсі
ИБА 93(3):1156-1160. Нещодавно, 2ЕМ були використані для модифікації геному в різних організмах. Див., наприклад, патентні публікації США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; і міжнародну публікацію УМО 07/014275. Аналогічно,
ТАГЕ ДНК-зв'язуючі домени зливаються з нуклеазними доменами для створення ТА ЕМ. Див., наприклад, патентну публікацію США Мо 20110301073. 0103) Як відмічалось вище, домен розщеплення може бути гетерологічним відносно ДНК- зв'язуючого домену, наприклад, ДНК-зв'язуючий домен «цинкових пальців» і домен розщеплення з нуклеази або ТАГЕМ ДНК-зв'язуючий домен і домен розщеплення, або мегануклеазний ДНК-зв'язуючий домен і домен розщеплення від різних нуклеаз. Гетерологічні домени розщеплення можуть бути одержані від будь-якої ендонуклеази або екзонуклеази.
Приклади ендонуклеаз, від яких можуть бути одержані домени розщеплення, включають рестрикційні ендонуклеази і «хомінг»-ендонуклеази, але не обмежуються ними. Див., наприклад, 2002-2003 Сагаіодие, Мем Епдіапа Віоїабз, Вемепу, МА; і Вегогі еї аї. (1997) Мисієїс
Асіаб5 Вез.25:3379-3388. Відомі додаткові ферменти, які розщеплюють ДНК (наприклад, нуклеаза 51; маш-нуклеаза; панкреатична ДНКаза !; мікрококова нуклеаза; дріжджова НО ендонуклеаза; див. також ГГ іпп еї аї. (ед5.) Мисієеазе5, Соїй Зргіпд Нагброг І арогайфгу Ргез55,1993).
Один або більше з цих ферментів (або їх функціональних фрагментів) можуть бути використані як джерело доменів розщеплення і напівдоменів розщеплення. (0104) Аналогічно, напівдомен розщеплення може бути одержаний від будь-якої нуклеази або її частини, як вказано вище, що потребує димеризації для розщеплюючої активності.
Зазвичай, для розщеплення цільово два злитих білки, якщо злиті білки містять напівдомени розщеплення. Як альтернатива, може бути використаний одиничний білок, що містить два напівдомени розщеплення. Два напівдомени розщеплення можуть бути одержані від однієї ендонуклеази (або її функціональних фрагментів), або кожний напівдомен розщеплення може бути одержаний від різних ендонуклеаз (або їх функціональних фрагментів). Крім того, сайти- мішені для двох злитих білків переважно розміщені відносно один одного таким чином, щоб зв'язування двох злитих білків в їх відповідних сайтах-мішенях розташовувало напівдомени розщеплення в просторовій орієнтації один до одного, що дозволяє напівдоменам розщеплення утворювати функціональний домен розщеплення, наприклад, шляхом димеризації. Таким чином, в певних варіантах реалізації винаходу ближні краї сайтів-мішеней розділені 5-8 нуклеотидами або 15-18 нуклеотидами. Однак, будь-яке ціле число нуклеотидів або нуклеотидних пар може лежати між двома сайтами-мішенями (наприклад, від 2 до 50 пар нуклеотидів і більше). В цілому, сайт розщеплення знаходиться між сайтами-мішенями.
ІО105) Рестрикційні ендонуклеази (рестрикційні ферменти) присутні у багатьох видів і здатні специфічно зв'язуватись з послідовністю ДНК (в сайті розпізнавання), і розщеплювати ДНК в або поблизу сайту зв'язування. Деякі рестрикційні ферменти (наприклад, Тип ІІ5) розщеплюють
ДНК на сайтах, віддалених від сайту розпізнавання і мають розділені домени зв'язування і розщеплення. Наприклад, тип ІЗ ферменту Рок І каталізує дволанцюгові розщеплення ДНК, з 9 нуклеотидів 3 її сайту розпізнавання на одному ланцюзі та 13 нуклеотидів з її сайту розпізнавання на іншому. Див., наприклад, патенти США 5 356 802; 5 436 150 і 5 487 9945а також Гі еї аІ.(1992) Ргос. Маї!. Асайд. Зсі. ОА 89:4275-4279; | і єї а. (1993) Ргос. Маї). Асай. 5сі.
ИБА 90:2764-2768; Кіт еї аї!. (1994а) Ргос. Маї!. Асад. бсі. ОА 91:883-887; Кіт еї аї. (199460) у.
Віої. Спет.269:31,978-31,982. Таким чином, в одному варіанті реалізації винаходу злиті білки містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення), принаймні, від одного типу ЇІ5 бо рестрикційного ферменту і один або більше доменів зв'язування «цинкових пальців», які можуть бути сконструйованими або несконструйованими. (0106) Прикладом рестрикційного ферменту типу ІІ5, чий домен розщеплення віддалений від зв'язуючого домену, є БоК І. Цей конкретний фермент активний як димер. Війпайе еї аї. (1998) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 95: 10,570-10,575. Відповідно, для цілей даного опису винаходу частина ферменту БокК І, що використовується в розкритих злитих білках, вважається напівдоменом розщеплення. Таким чином, для спрямованого дволанцюгового розщеплення та/або цілеспрямованої заміни клітинних послідовностей з використанням злиттів "цинковий палець"-РоК І, два злитих білки, кожний з яких містить напівдомен розщеплення Рок І, можуть бути використані для відновлення каталітично активного домену розщеплення. Як альтернатива, також може бути використана одна молекула поліпептиду, що містить ДНК- зв'язуючий домен і два напівдомени розщеплення Рок І.
І0107| Домен розщеплення або напівдомен розщеплення може бути будь-якою частиною білка, яка зберігає активність розщеплення або зберігає здатність до мультимеризації (наприклад, димеризації) з утворенням функціонального домену розщеплення.
І0108| Приклади рестрикційних ферментів типу ПЗ описані в міжнародній публікації УМО 07/014275, включеній до даного опису шляхом посилання в повному обсязі. Додаткові ферменти рестрикції також містять розділені домени зв'язування і розщеплення, і вони розглядаються в даному описі винаходу. Див., наприклад, Кобегі5 еї аїЇ. (2003) Мисієїс Асіав5
Вевз.31:418-420.
ІО109| В певних варіантах реалізації винаходу домен розщеплення містить один або більше сконструйованих напівдоменів розщеплення (також згадуються як мутантні домени димеризації), які мінімізують або попереджують гомодимеризацію, як описано, наприклад, в патентних публікаціях Мо 20050064474; 20060188987 і 20080131962, їх описи включені шляхом посилання до даного документу у повному обсязі. Амінокислотні залишки в положеннях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 і 538 в РОК І всі є мішенями для впливу димеризації напівдоменів розщеплення Рок І. 0110) Приклади сконструйованих напівдоменів розщеплення Рок І, які утворюють облігатні гетеродимери, включають пару, в якій перший напівдомен розщеплення включає мутації амінокислотних залишків в положеннях 490 і 538 РОК І, а другий напівдомен розщеплення
Зо включає мутації амінокислотних залишків 486 і 499. 0111) Таким чином, в одному варіанті реалізації винаходу мутація в 490 замінює Сім (Е) лізином (К); мутація в 538 замінює І5о (І) Гу (К); мутація в 486 замінює Сіп (0) Сім (Е); а мутація в положенні 499 замінює Ізо (І) Гуз (К). Зокрема, сконструйовані напівдомени розщеплення, описані в даному документі, були одержані шляхом мутації в положеннях 490 (Е -» К) і 538 (І -о
К) в одному напівдомені розщеплення для одержання сконструйованого напівдомену розщеплення, позначеного "Е490ОК: І5З8К", і мутацій в положеннях 486 (0 -» Е) і 499 (І - І) в другому напівдомені розщеплення для одержання сконструйованого напівдомену розщеплення, позначеного "5486Е: І4991". Сконструйовані напівдомени розщеплення, описані в даному документі, є облігатними гетеродимерними мутантами, в яких аберантне розщеплення мінімізоване або скасоване. Див., наприклад, патентну публікацію США Ме 2008/0131962, розкриття якої включене до даного документу як посилання в повному обсязі для всіх цілей. (0112) В певних варіантах реалізації винаходу сконструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 486, 499 і 496 (пронумеровані відносно ЕоКІ дикого типу), наприклад, мутації, які заміщують залишок Сп (С) дикого типу в положенні 486 залишком Си (Е), залишок Ізо (І) дикого типу в положенні 499 залишком лейцину (І) і залишок Азп (М) дикого типу в положенні 496 залишком Ар (0) або Сім (Е) (також згадуються як домени "ЕГО" і "ЕГЕ", відповідно). В інших варіантах реалізації винаходу сконструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 490, 538 і 537 (пронумеровані відносно ЕБоКІ дикого типу), наприклад, мутації, які заміщують залишок Си (Е) дикого типу в положенні 490 залишком Гу (К), залишок І5о (І) дикого типу в положенні 538 залишком Гуз (К) і залишок Ніз (Н) дикого типу в положенні 537 залишком Гуз (К) або залишком Агод (К) (також згадуються як домени "ККК" і "ККА", відповідно). В інших варіантах реалізації винаходу сконструйований напівдомен розщеплення містить мутації в положеннях 490 і 537 (пронумеровані відносно РОКІ дикого типу), наприклад, мутації, які заміщують залишок Си (Е) дикого типу в положенні 490 залишком Гу (К), залишок Ніз (Н) дикого типу в положенні 537 залишком Гуз (К) або залишком Аг (К) (також згадуються як домени "КІК" і "КІК", відповідно). (Див. патентну публікацію СШАМе 20110201055, включену в даний документ шляхом посилання). Сконструйовані напівдомени розщеплення, описані в даному документі, можуть бути одержані з використанням будь-якого придатного методу, наприклад, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу напівдоменів розщеплення бо дикого типу (БоК І), як описано в патентних публікаціях Мо 20050064474; 20080131962 і
ІО113) Як альтернатива, нуклеази можуть бути зібрані іп мімо в сайті-мішені нуклеїнової кислоти з використанням так званої технології "розщеплення-фермент" (див., наприклад, патентну публікацію США Мо 20090068164). Компоненти таких розщеплюючих ферментів можуть експресуватись або в окремих експресійних конструктах, або можуть об'єднуватись в одній відкритій рамці зчитування, в якій індивідуальні компоненти розділені, наприклад, саморозщеплюваним білююм 2А або послідовністю ІКЕ5. Компоненти можуть бути індивідуальними доменами зв'язування «цинкових пальців» або доменами зв'язуючого домену нуклеїнової кислоти мегануклеази.
ІЇО114| Нуклеази можуть піддаватись скринінгу на активність перед застосуванням, наприклад, в дріжджовій хромосомній системі, як описано у УМО 2009/042163 і 20090068164.
Конструкти експресії нуклеаз можна легко розробити з використанням способів, відомих в даній галузі техніки. Див., наприклад, патентні публікації США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231 і міжнародну публікацію УМО 07/014275.
Експресія нуклеази може знаходитись під контролем конститутивного промотору або індуцибельного промотору, наприклад промотору галактокінази, який активується (дерепресується) в присутності рафінози та/або галактози і пригнічується в присутності глюкози.
Система СКІБРЕ/Сав
ЇО115)| Останнім часом з'явились переконливі докази на користь існування РНК- опосередкованого геному захисного шляху у археї та багатьох бактерій, гіпотеза про який була висунута паралельно до еукаріотичного шляху РНКІ (для огляду див. соааеє апа ВісКепоп, 2006.
У. Мої. Емо!ї. 62: 718-729; ПШевіо! єї аї!., 2006. Агспавєа 2: 59-72; МакКагома єї а!., 2006. Віо!. Оігесі 1: 7.; БОгек єї аї., 2008. Маї. Вем. Місгобіо!ї. 6: 181-186). Відомий як система СКІ5БРАЕ-СА5 або прокаріотична РНКІ (пРНКІ), шлях, як передбачається, виник з двох еволюційно і часто фізично зв'язаних генних локусів: локусу СКІЗРК (кластерних коротких поліндромних повторів, розділених регулярними проміжками), який кодує РНК-компоненти системи, і локусу СА5 (СВІЗРА-асоційованого), який кодує білки (дапзеп еї аїЇ., 2002. Мої. Місгобріо!. 43: 1565-1575;
МакКагома еї а!ї., 2002. Мисівїс Асіа5 Нез. 30: 482-496; МаКагома еї а!., 2006. Віої. Рігесі 1: 7; Наїй єї аІ., 2005. РіГо5 Сотриї. ВіоЇ. 1: еб0). Локуси СКІЗБРЕ в мікробних хазяях містять комбінацію
Зо СВІЗРА-асоційованих (Са5) генів, а також некодуючі РНК-елементи, здатні програмувати специфічність СКІЗРЕ опосередкованого розщеплення нуклеїнових кислот. Індивідуальні білки
Са не поділяють значної схожості з білювими компонентами еукаріотичного РНКІ комплексу, але мають аналогічні передбачені функції (наприклад, РНК-зв'язування, нуклеазу, хеліказу і т. п.) (МаКагома єї аї!., 2006. Віо!. Оікесі 1: 7). СВІЗБРА-асоційовані (са5) гени часто зв'язані з наборами СКІЗРЕ повтор-спейсер. Описано більше ніж сорок різних Са5-білкових сімейств. В цих білкових сімействах, Са51, як уявляється, є убіквітарним серед різних систем СВІЗБРА/Сав.
Окремі комбінації генів са і структур повторів використовуються для визначення 8 підтипів
СКІБРК (Єсоїї, Мревбі, Мітепі, Омиід, Тпеар, Нтагі, Арегп і Мішре), деякі з них асоціюються з додатковим генним модулем, кодуючим повтор-асоційовані загадкові білки (КАМР). В одному геномі може знаходитись більше ніж один підтип СКІЗБРЕ. Спорадичний розподіл підтипів
СКІБРЕ/Сазх показує, що система є предметом для горизонтального генного переносу під час мікробіологічної еволюції.
ІО116) Тип Ії СКІБРЕ (представлений Са59) є однією з найбільш добре охарактеризованих систем і здійснює цілеспрямований дволанцюговий розрив ДНК в чотири послідовних етапи.
Перший, дві некодуючі РНК, набір пре-сгРНК і ігастРНК, транскрибуються з локусу СЕІЗРЕ.
Другий, ігасгтРНК гібридизує з повторними ділянками пре-сгРНК і опосередковує процесинг пре-
СГРНК в зрілі стРНК, що містять індивідуальні спейсерні послідовності. Третій, комплекс зріла
СТРНКгасгт?!НК спрямовує Саб59 до ДНК-мішені шляхом спарювання, виходячи з правила
Уотсона-Кріка, між спейсером на сгРНК і протоспейсером на ДНК-мішені поряд з протоспейсерним суміжним мотивом (РАМ), додаткова вимога для розпізнавання мішені. На завершення, Саб59 опосередковує розщеплення ДНК-мішені для створення дволанцюгового розриву в межах протоспейсеру. Активність системи СКІЗРЕ/Саз включає три етапи: (і) вставка чужих ДНК-послідовностей в набір СКІЗРК для попередження майбутніх атак в процесі, названому «адаптація», (ії) експресія релевантних білків, а також експресія і процесинг набору, за яким слідує (ії) РНК-опосередкована інтерференція з чужою нуклеїновою кислотою. Таким чином, в бактеріальній клітині декілька так званих «Са5» білків є зв'язаними з природною функцією системи СКІБРЕ/Сав5.
І0О117| Первинні продукти локусів СКІЗРК, як уявляється, є короткими РНК, які містять упроваджувані цілеспрямовані послідовності, і названі гідовими РНК або прокаріотичними бо сайленсинговими РНК (рзіРНК), виходячи з їх гіпотетичної ролі в метаболічному шляху
(МакКкагома єї а. (2006) Віо!. Оікесі 1:7; Наїеє єї а!.(2008) РНК14: 2572-2579). Аналіз РНК вказує, що локусні транскрипти СКІЗРК розщеплюються в межах послідовностей повторів з вивільненням від 60- до 7О-нітронних проміжних РНК-сполук, які містять індивідуальні захоплюючі цілеспрямовані послідовності та фланкуючі фрагменти повторів (Тапод еї аї. (2002) Ргос. Маї!.
Б Асай. 5сі. 99: 7536-7541; Тапд еї аІ. (2005) Мої. Місгобіої. 55:469-481; І Шевіо! еї аї. (2006)
Агснаєа 2:59-72; Вгошпз 6вї аї. (2008) Зсієпсе 321: 960-964; Наїйе еї а. (2008) РНК 14:2572-2579). У архаїчної Ругососсив5іигіози5, ці проміжні РНК додатково процесуються до розповсюджених, стабільних 35-45-нітронних зрілих рзіРНК (Нагїйе еї а. (2008)РНК14: 2572-2579).
Білки Са 0118) Поліпептид "Са51" належить до СКІ5РК асоційованого (Саб) білка 1. Са51 (СО01518 в кластерах ортологічної групи системи класифікації білків), є кращим маркером СКІ5ЗРЕ- асоційованих систем (САБ5). Виходячи з філогенетичних порівнянь, ідентифіковано сім окремих версій СКІБРЕ-асоційованої імунної системи (СА551-7).
І0119| Поліпептидом Саз51, що застосовується в способах, описаних в даному документі, може бути будь-який поліпептид Са51, присутній в будь-якому прокаріоті. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Са51 архаїчного мікроорганізму. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Саб5і! є поліпептид Сав51 мікроорганізму
Еигуагспаєоїа. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са5з1 є поліпептид Савз1 мікроорганізму Степагоспаеоїа. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Савб1 є поліпептид Са51 бактерії. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Савбзі є поліпептид Са51 грам-негативної або грам-позитивної бактерії. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Са51! Рзхейдотопах аегидіпоза. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Са51 Адиїехаеоїїси5. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Сав51, який є членом одного з САЗ51-7. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Саб51 є поліпептид Сав51і, який є членом
СА5З5З3З. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Саз1, який є членом СА557. В певних варіантах реалізації винаходу поліпептидом Са51 є поліпептид Сав51, який є членом САБЗЗ або СА557. (0120) В деяких варіантах реалізації винаходу поліпептид Са5з! кодується нуклеотидною послідовністю, забезпеченою СепВапкК, наприклад, під номером Сепе!р: 2781520, 1006874, 9001811, 947228, 3169280, 2650014, 1175302, 3993120, 4380485, 906625, 3165126, 905808, 1454460, 1445886, 1485099, 4274010, 888506, 3169526, 997745, 897836 або 1193018, та/або представлений амінокислотною послідовністю, що демонструє гомологію (наприклад, більше ніж 80 95, від 90 до 99 95, включаючи 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95) з амінокислотною послідовністю, що кодується цими полінуклеотидами і чиї поліпептиди функціонують як поліпептиди Сав1. 01211 Са56 є другим поліпептидом Савх, а ендорибонуклеазна активність належить в цьому документі до ендорибонуклеазної активності Саб5б. Необмежуючі приклади придатних поліпептидів вказані в сепрапк під номером доступу ААЇ 81255. Поліпептид Саб5б може бути збагаченим, виділеним або очищеним від мікробу, що має локус СКІЗРЕ і локус са5 (СКІЗРЕ- асоційований), такого як Ругососсивіигіози5, але не обмежується ним, або може бути одержаний з використанням рекомбінантних технологій, або бути хімічно або ферментативно синтезованим з використанням шаблонних методів. В деяких аспектах, поліпептид Саб5б може бути збагаченим, виділеним або очищеним від мікробу, який не має локусів СКІБРЕ. Поліпептид
Са5б містить, принаймні, один залишок, який може відігравати роль в каталізі, або його консервативне заміщення. Поліпептид Са5зб може містити інші залишки, які також можуть відігравати роль в каталізі, або їх консервативні заміщення. Очікується, що залишок(и), що відіграють роль в каталіз можуть розташовуватись біля (з-багатої петлі, яка містить розпізнавальний мотив Са5б в ЗО структурі білка. Поліпептиди Са5зб можуть містити домени, присутні в базі даних ТІСКЕАМ під номерами доступу ТІОКО1877 і РЕО1881. База даних
ТІСКЕАМ містить сімейства поліпептидів, функція яких зберігається (Най еї аї. (2003) Мисі. Асіаб
Вев. 31:371-373, Ваїетап апа Наїй (2002) Віієїтіпд5 Віоіпіоптаїййсв5, 3:236-245, і Най еї аї. (2005)
РГо5 Сотршиїайопаї Віо!. 1(6):е60).
ІО122| Інші приклади поліпептидів Саб5б, передбачені даним документом, включають поліпептиди, присутні в прокаріотичних мікробах, що мають локус СКІ5РК і локус сав.
Поліпептиди Саб5б можна легко ідентифікувати в будь-якому мікробі, який містить локус
СКІ5БРЕК. Кодуюча ділянка, яка кодує поліпептид Са5б, як правило, знаходиться в локусі сав, розташованому в безпосередній близькості до локусу СКІ5РК. Най еї аї. (2005) Рі о5
Сотршаїгйіопаї! Віої. 1(6):е60) зробив огляд сімейства білків Са і створив правила ідентифікації бо специфічних підтипів системи СКІЗРЕ/Са5. Най еї а. описав кодуючу ділянку, яка кодує поліпептиди Са5зб, як виявлено в зв'язку, принаймні, з чотирма окремими підтипами
СКІБ5БРК/Са5 (Тпеар, Нітагі, Арегп і Мішибе), і як правило є саз-кодуючою ділянкою, розташованою якнайдалі від локусу СКІЗРК. Поліпептиди Са5зб можна ідентифікувати, використовуючи ресурси, доступні від УСМІ Сотргепепзіме Місгобіа! Кезоигсе. Таким чином, поліпептиди Са5б, які корисні в способах, описаних в даному документі, можуть бути ідентифіковані фахівцем в даній галузі з використанням рутинних методів. 0123) Приклади прокаріотичних мікробів з відомими цілими геномними послідовностями, що містять кодуючі ділянки, що, як очікується, кодують поліпептид Са5зб, включають
Тпеппоїодатагійта М5В8, Сатруорасіег Тей5 підвид їей5 82-40, ЕРивзобрасіептписієашт
АТОСС 25586, 5ігеріососсив ІШепторпйи5 І! Ма 18311, Тнеппоапаегорасіепепдсопдепвівз МВА(Т),
МоогеПагШептоасеїїса АТС 39073, ЮОезиНйобасіегптнНаїпієпвсе М51, Сіовігідійт ієїапі Е88,
Сіозіаіт репгіпдепе 5М101, Сіовігідіит айісіе ОСО-32958, Сіовігаїішт роїшіїпит Наї| А Запоет",
Сіозігідійт Ббоїшіпит Е І апдеїапа, Сіовігідійт Боїшіпит В1 штам ОКга, Сіозігідійт роїшіпит АЗ штам Госп Магее, Сіовігідішт роїціпит А НаїЇ, Сіовігаішт роїшіпит А АТОСС 19397,
СатохудоїпептивзНуагодепоїогттатпь 2-2301, еарнуіососсив ерідегтідів ВРБбІ2А,
Тпеппизіпеппорпйи5 НВ8, Тпеппизіпеппорпйи5 НВ27, вид Мов5іос РОСС 7120, Апабраєпа магіабіїїб
АТСС 29413, вид БЗупеспососссих О5 тип В ргіте, вид Зупеспососсосиз О5 тип А,
Рогрпуготопаздіпдімайвє МуУ83, ВасієгоїдезітадіївУСНАб, Васієгоіїдевітадіїв / МСТС9343,
Адиіїехаєоїїси5 МЕ5, Виргорасієгхуіапорнішх О5М 9941, Мусобрасієгішт іШибрегсціовів НЗ7ВУ (лабораторний штам), Мусорасіегішт їибегсціобзії СОС1551, Мусобасіегішт Бомі5 підвид Бомів
АгР2122/97, ЕтапКкіааіпі АСМ14а, Тнепторіазтамоїсапішт С551, Рісторпіїнвіотідиз О5М 9790,
ТпептососсивзКодаКагепвії КОЮ, РугососсизпогіковпіїзпіпКаї ОТ3З, Ругососсивішіобвив О5М 3638, Ругососсивзаруззі СЕ5, МеїпапозагсіпарагКептивзаго, МеїНапозагсіпаасеїмогапе С2гА,
Меїпапососсоідезрипогії розм 6242, Меїпапососсивзіаппавснії рзма2661,
Меїпаповрасіегіштіпептоашоїгорпісит депа Н, НаІоагсишатагізтопціА ТО 43049,
Агспаєодіоривіцідійиє 05М4304, Ругорасцитаеєторпішт 1М2, ЗипоіоБивіоКодаїй штам 7, зММоЇоБри55огагагіси5 Р2, З!ИиПОоЇоризасідосаідани5О5М 639, Аегоругитрегпіх К1. Інші приклади поліпептидів Са5б відомі фахівцям в даній галузі, див., наприклад, члени групи поліпептидів
СОс1583 (доступні з кластерів ортологічних груп білків (СО) на веб-сторінці Інтернет-сайту
Зо Маїйопаї! Сепіег тог Віотесппоіоду Іптоппайоп, див. також Тафизом еї а. (1997) 5сіеєпсе 278:631-637 і Тайшзом еї а). (2003) ВМС Віоіптопгтаїйіс5 4(1):41), члени сімейства ІпіегРго, що має номер доступу ІРКО10156, МакКагома єї аї. (2002) Мис. Асіа5 Не. 30:482-496 і Най еї а. (2005) РІ о5
Сотриї. Віо!. 1(6):еб60, 474-483). 0124) Існує три типи систем СКІБРЕ/Сав, які включають сгРНК і білки Сав5. Типи І і ЇЇ мають
Саз-ендонуклеази, які обробляють пре-сгРНК, які, коли повністю перетворюються в сгРНК, збирають мульти-Са5 білковий комплекс, який здатен розщеплювати нуклеїнові кислоти, комплементарні сгРНК. 0125) В типі ІЇ систем СКІЗРЕ/Сах сгРНК продукуються з використанням різних механізмів, де транс-активуюча РНК (ІгастРНК), комплементарна повтореним послідовностям в пре-сгРНК, спричиняє процесинг дволанцюгово-специфічною рибонуклеазою І в присутності білка Саз59.
Потім Са59 здатен розщеплювати ДНК-мішень, комплементарну зрілій сгРНК, проте, розщеплення за допомогою Савз 9 залежить від утворення пар основ між сгРНК і ДНК-мішенню і від присутності короткого мотиву в сгРНК, названого послідовністю РАМ (фотоспейсерний прилеглий мотив) (див. Оі еї аі. (2013) СеїЇ 152:1173). Крім того, ігасгРНКповинна також бути присутньою у вигляді пар основ з сгРНК на своєму 3'-кінці, ії ця асоціація спричиняє активність
Сав9. (0126) Білок Са59 має, принаймні, два нуклеазних домени: один нуклеазний домен схожий на ендонуклеазу НМН, тоді як інший схожий на ендонуклеазний домен Ким. Як виявлено, домен типу НМН відповідає за розщеплення нитки ДНК, комплементарної сгРНК, тоді як домен Ким розщеплює некомплементарну нитку.
ІО127| Потреби в комплексі стРНК-ігастРНК можна уникнути, використовуючи сконструйовану "односпрямовуючу РНК" (5ОРНК), яка містить шпильки, зазвичай утворені шляхом відпалу сгТРНК і астРНК (див., іпек еї а (2012) Зсіевпсе 337816 і Сопд еї аї. (2013) зЗсіепсехрге55/10.1126/5сіепсе.1231143). В 5. ругодепе5, сконструйоване злиття ігастРНК:сгРНК, або 5З9РНК, спрямовує Са59 на розщеплення ДНК-мішені, коли дволанцюговий гетеродимер
РНЕ:ДНК утворюється між Саз-асоційованими РНК і ДНК-мішенню. Ця система, що містить білок Са59, і сконструйована 5ОРНК, що містить послідовність РАМ, була використана для РНК- спрямованого редагування геному (див. Катаїїмпдат, там же) і була корисна для редагування геному ембріона рибок даніо іп мімо (див. Нуапод еї аї!. (2013) Маїшге ВіосїесппоЇоду 31(3):227) З 60 ефективністю редагування, подібною до такої 2ЕМ і ТАГ ЕМ.
ІО128| В певних варіантах реалізації винаходу білок Саб5 може бути "функціональним похідним" білка Са5 природного походження. "Функціональне похідне" природної послідовності поліпептиду являє собою сполуку, що має якісні біологічні властивості, спільні з природною послідовністю поліпептиду. "Функціональні похідні" включають фрагменти природної послідовності і похідні природної послідовності поліпептиду та їх фрагменти, за умови, що вони мають біологічну активність, спільну з відповідною природною послідовністю поліпептиду, але не обмежуються ними. Біологічна активність, передбачена даним документом, є здатністю функціонального похідного гідролізувати субстрат ДНК на фрагменти. Термін "похідне" охоплює варіанти амінокислотної послідовності поліпептиду, ковалентні модифікації та їх злиття.
І0129| "Поліпептид Саз" охоплює непроцесований поліпептид Саз, ферментативно активний фрагмент поліпептиду Са і ферментативно активні похідні поліпептиду Са та їх фрагменти.
Придатні похідні поліпептиду Са або їх фрагменти включають мутанти, злиття, ковалентні модифікації білка Са або їх фрагменти, але не обмежуються ними.
ІО1301| Білки Саз і поліпептиди Са5 можуть бути одержані з клітин або синтезовані хімічно або за допомогою комбінації цих двох процедур. Клітиною може бути клітина, яка природним чином продукує білок Са5, або клітина, яка природним чином продукує білок Сав, і створена методом генної інженерії для продукування ендогенного білка Са5 при більш високих рівнях експресії або для продукування білка Са5 з ендогенно введеної нуклеїнової кислоти, де нуклеїнова кислота кодує Саб5, такий самий як і ендогенний Са5, або відмінний. В деяких випадках клітина не продукує білок Са5 природним чином, а є створеною методом генної інженерії для продукування білка Сав.
ІО131| Система СКІБ5БРЕ/Сах також може бути використана для інгібування генної експресії.
Ї ві єї аї. (2013) Сеї! 152(5)1173-1183) показав, що каталітично «мертвий» Са59, що не має ендонуклеазної активності, коли спільно експресується із спрямовуючою РНК, утворює ДНК- розпізнаючий комплекс, який дозволяє цілеспрямовано втручатись в транскрипційну елонгацію, зв'язування РНК полімерази або зв'язування фактору транскрипції. Ця система, названа
СКІ5БРЕ інтерференцією (СКІ5РКЇ), може ефективно пригнічувати експресію генів-мішеней.
ІО132| Крім того, були розроблені білки Са5, які містять мутації в своїх доменах розщеплення, щоб зробити їх нездатними індукувати О5В, а замість цього вводять
Зо одноланцюговий розрив в ДНК-мішень ("Саз59 никуючий фермент", див. Сопа еї аї., там же).
ІЇО133| Білки Саб5 згідно з винаходом можуть зазнавати мутагенезу з метою зміни функціональності. Приклади методів селекції, включаючи фаговий дисплей і двогібридні системи, описані в патентах США 5 789 538; 5 925 523:6 007 988;6 013 453; 6 410 248; 6 140 466; 6 200 759 і 6 242 568; а також УМО 98/37186; УМО 98/53057; УМО 00/27878; УМО 01/88197 і СВ 2 338 237.
РНК-компоненти СКІЗБРК/Саз
І0134| Са59 зв'язана система СКІБЗБРК/Са5 містить два некодуючих РНК-компоненти: іїгастРНК і має пре-стРНК, що містять нуклеазні спрямовуючі послідовності (спейсери), розділені проміжками однакових прямих повторів (ОК). Для використання системи СКІЗРК/Сав5 для завершення геномної інженерії повинні бути наявними обидві функції цих РНК (див. Сопо еї аї, (2013) Зсіепсехрге55 1/10.1126/5сіепсе 1231143). В деяких варіантах реалізації винаходу їасгРНК і рге-сТРНК постачаються окремими експресуючими конструктами або у вигляді окремих РНК. В інших варіантах реалізації винаходу конструюють химерну РНК, де генетично сконструйовану зрілу СТРНК (що надає специфічність до мішені) зливають з їгастРНК (яка забезпечує взаємодію з Са59) для створення гібриду химерна сг-РНК-ГгасгтРНК (також названого односпрямовуючою РНК). (див. діпек, там же їі Сопо, там же).
Химерні або З9дРНК можна сконструювати таким чином, щоб вони містили послідовність, комплементарну будь-якій бажаній мішені. РНК містять 22 основи, комплементарні мішені та у вигляді (п19)|, за якими слідує фотоспейсерний прилеглий мотив (РАМ) у вигляді МОС. Таким чином, в одному способі, 59ФРНК можуть бути розроблені з використанням відомих 7ЕМ, націлених в цільовий ген шляхом (ї) вирівнювання послідовності розпізнавання гетеродимеру 2ЕМ з еталонною послідовністю релевантного геному (людською, мишачою або певного виду рослин); (ії) ідентифікації спейсерної ділянки між напівсайтами 2ЕМ; (іїї) ідентифікації локалізації мотиву С|М20|5О, найближчого до спейсерної ділянки (коли більше ніж один такий мотив перекриває спейсер, мотив, який центрується відносно вибраного спейсеру); (м) використання мотиву як кору З59РНК. Цей метод переважно опирається на випробувані нуклеазні мішені. Як альтернатива, ЗФРНК можуть бути розроблені для націлювання на будь-яку цільову ділянку просто шляхом ідентифікації придатної послідовності-мішені, яка відповідає формулі З(п29|60.
Сайти-мішені бо ІЇО135| Як детально описано вище, ДНК-зв'язуючі домени можуть конструюватись для зв'язування будь-якої переважної послідовності в локусі, наприклад, глобінового гена або гена «затишної гавані». Сконструйований ДНК-зв'язуючий домен може мати нову специфічність зв'язування у порівнянні з ДНК-зв'язуючим доменом природного походження. Способи конструювання включають конструктивну розробку і різні типи відбору, але не обмежуються ними. Конструктивна розробка включає, наприклад, використання баз даних, що містять триплетні (або квадруплетні) нуклеотидні послідовності та індивідуальні амінокислотні послідовності «цинкових пальців», в яких кожна триплетна або квадруплетна нуклеотидна послідовність асоціюється з однією або більше амінокислотними послідовностями «цинкових пальців», які зв'язують окрему триплетну або квадруплетну послідовність. Див., наприклад, патенти США 6 453 242 і 6 534 261, включені до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. Конструктивна розробка ТАЇ -ефекторних доменів також проводиться. Див., наприклад, патентну публікацію США Мо 20110301073.
ІО136| Приклади методів відбору, застосовувані для ДНК-зв'язуючих доменів, включаючи фаговий дисплей і двогібридні системи, розкриті в патентах США 5 789 538; 5 925 523; 6 007 988; 6 013 453; 6 410 248; 6 140 466; 6 200 759 і 6,242,568; а також УМО 98/37186; УМО 98/53057;
УМО 00/27878; УМО 01/88197 і СВ 2,338,237.
ІО1371| Відбір сайтів-мішеней; нуклеаз і методів розробки і конструювання злитих білків (їі полінуклеотидів, що їх кодують) відомі фахівцеві в даній галузі техніки і детально описані в патентних публікаціях США Мо 20050064474 і 20060188987, включених до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. 0138) Крім того, як розкрито в цьому документі та інших посиланнях, ДНК-зв'язуючі домени (наприклад, мультипальцевого білка «цинкові пальці») можуть об'єднуватись разом з використанням будь-якої придатної лінкерної послідовності, включаючи, наприклад, лінкери з 5 амінокислот в довжину. Див., наприклад, патенти США Мо 6479626; 6903185; і 7153949 стосовно прикладів лінкерних послідовностей з 6 або більше амінокислот в довжину. Білки, описані в даному документі, можуть включати будь-яку комбінацію придатних лінкерів між окремими «цинковими пальцями» білка. Див. також патентну публікацію Мо 20110287512.
Донори
ІО139| Як відмічалось вище, екзогенну послідовність (також названу "донорською послідовністю" або "донором" або "трансгеном") вставляють, наприклад, для коригування мутантного гена або для підвищення експресії гена дикого типу. Цілком очевидно, що донорська послідовність, як правило, не ідентична геномній послідовності, на місце якої вона вміщується.
Донорська послідовність може містити негомологічну послідовність, фланковану двома ділянками гомології, щоб забезпечити ефективну НОЕК в цільовому місцеположенні. Крім того, донорські послідовності можуть містити векторну молекулу, що містить послідовності, які не є гомологічними цільовій ділянці в клітинному хроматині. Донорська молекула може містити декілька ділянок гомології, що перекриваються, до клітинного хроматину. Наприклад, для спрямованої вставки послідовностей, які зазвичай не присутні в цільовій ділянці, вказані послідовності можуть бути в молекулі донорської нуклеїнової кислоти і фланкуватись ділянками гомології до послідовності в цільовій ділянці. 0140) В даному документі описані способи спрямованої вставки будь-якого полінуклеотиду для вставки у вибране місцеположення. Полінуклеотиди для вставки також можуть називатись "екзогенними" полінуклеотидами, "донорськими" полінуклеотидами або молекулами або "«трансгенами". Донорським полінуклеотидом може бути ДНК або РНК, одноланцюгова та/або дволанцюгова, і вводитись в клітину в лінійній або кільцевій формі. Див., наприклад, патентні публікації США Мо 20100047805, 20110281361, 20110207221 і заявку США Мо 13/889162.
Донорська(ї) послідовність() може міститися в межах ДНК МС, яка може бути введена в молекулу в лінійній або кільцевій формі. Якщо вводиться в лінійній формі, то кінці донорської послідовності можуть бути захищеними (наприклад, від екзонуклеолітичної деградації) за допомогою методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки. Наприклад, два або більше дидезоксинуклеотидних залишків додають до З-термінусу лінійної молекули та/або самокомплементарні олігонуклеотиди лігують до одного або двох кінців. Див., наприклад, Спапд еї аі. (1987) Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 84:4959-4963; Менів еї аІ. (1996) Зсівепсе 272:886-889.
Додаткові методи захисту екзогенних полінуклеотидів включають додавання кінцевих аміногруп і використання модифікованих міжнуклеотидних зв'язків, таких як, наприклад, фосфортісати, фосфорамідати і О-метилрибоза або залишки дезоксирибози, але не обмежуються ними. (0141) Полінуклеотид може вводитись в клітину у вигляді частини векторної молекули, що має додаткові послідовності, такі як, наприклад, точки початку реплікації, промотори і гени, кодуючі резистентність до антибіотиків. Більше того, донорські полінуклеотиди можуть 60 вводитись у вигляді «оголеної» нуклеїнової кислоти, у вигляді нуклеїнової кислоти в комплексі з агентом, таким як ліпосома або полоксамер, або може доставлятись за допомогою вірусів (наприклад, аденовірусів, ААМ, герпесвірусу, ретровірусу, лентивірусу і інтегразодефектного лентивірусу (ОГМ)). (0142) В певних варіантах реалізації винаходу дволанцюговий донор включає послідовності (наприклад, кодуючі послідовності, також відомі як трансгени) більше ніж 1 т.н. в довжину, наприклад від 2 до 200 т.н., від 2 до 10 т.н. (або будь-яке цілочисленне значення між ними).
Дволанцюговий донор також включає, принаймні, один нуклеазний сайт-мішень, наприклад. В певних варіантах реалізації винаходу донор включає, принаймні, 1 сайт-мішень, наприклад, для використання з СКІ5БРК/Са5, або 2 сайти-мішені, наприклад, для пари 2ЕМ або ТАГЕМ.
Зазвичай, нуклеазні сайти-мішені знаходяться поза трансгенних послідовностей, наприклад, 5' та/або 3' до трансгенних послідовностей для розщеплення трансгена. Нуклеазний(ії) сайт(и) розщеплення може бути для будь-якої нуклеази. В певних варіантах реалізації винаходу нуклеазний(і) сайт(и) розщеплення, що міститься в дволанцюговому донорі, призначений для тієї самої нуклеази, що використовується для розщеплення ендогенної мішені, в яку розщеплений донор інтегрується шляхом гомологонезалежних методів.
ІЇ0143| Донор зазвичай вставляється таким чином, що його експресія регулюється ендогенним промотором в сайті вставки, а саме промотором, який регулює експресію ендогенного гена, в який вставляється донор (наприклад, глобіновий, ААМ51 і т.д.). Проте, очевидно, що донор може містити промотор та/або енхансер, наприклад, конститутивний промотор або індуцибельний або тканиноспецифічний промотор.
І0144| Донорська молекула може вставлятися в ендогенний ген таким чином, що експресуються всі, деякі або ні один з ендогенних генів. Наприклад, трансген, як описано в даному документі, може вставлятися в глобіновий локус, так що експресуються деякі або жодна з ендогенних глобінових послідовностей, наприклад, у вигляді злиття з трансгеном. В інших варіантах реалізації винаходу трансген (наприклад, з або без глобінових кодуючих послідовностей) інтегрується в будь-який ендогенний локус, наприклад, локус «затишної гавані». Див., наприклад, патентні публікації США 20080299580; 20080159996 і 201000218264.
ІО145| Коли додаткові послідовності (наприклад, глобінові послідовності, ендогенні або частина трансгена) експресуються з трансгеном, то додаткові (наприклад, глобінові)
Зо послідовності можуть бути непроцесованими послідовностями (дикого типу або мутантними) або неповними послідовностями. Необмежуючі приклади функції цих непроцесованих і неповних послідовностей, наприклад, глобінкодуючих послідовностей, включають підвищення часу напівжиття в сироватці поліпептиду, що експресується за допомогою трансгена (наприклад, терапевтичного гена) та/або діючого як носій. 0146) Крім того, хоча цього і не потрібно для експресії, екзогенні послідовності можуть також включати послідовності, що регулюють транскрипцію або трансляцію, наприклад, промотори, енхансери, інсулятори, ділянку внутрішньої посадки рибосоми, послідовності, що кодують білки 2А, та/або сигнали поліаденілування.
І0147| Трансгени, внесені в донорські послідовності, описані в даному документі, можуть бути виділеними з плазмід, клітин або інших джерел з використанням стандартних методик, відомих з рівня техніки, таких як РСК. Використовувані донори можуть включати різні типи топології, включаючи кільцеві надспіральні, кільцеві розслаблені, лінійні і т.п. Як альтернатива, вони можуть бути хімічно синтезованими з використанням стандартних методик синтезу олігонуклеотидів. Крім того, донори можуть бути метильованими або неметильованими. Донори можуть бути у вигляді штучних бактеріальних або дріжджових хромосом (ВАС або МАС). 0148) Двоспіральні донорські полінуклеотиди, описані в даному документі, можуть включати одну або більше неприродних основ та/або скелетів. Зокрема, вставку донорської молекули з метильованими цитозинами можна здійснити, застосовуючи методи, описані в даному документі, для досягнення стану транскрипційного спокою в цільовій ділянці.
І0149| Екзогенний (донорський) полінуклеотид може містити будь-яку цільову послідовність (екзогенну послідовність). Приклади екзогенних послідовностей включають будь-яку поліпептидкодуючу послідовність (наприклад, кКДНА), промоторні послідовності, енхансерні послідовності, епітопні мітки, маркерні гени, сайти розпізнавання ферментного розщеплення і різні типи експресійних конструктів, але не обмежуються ними. Маркерні гени включають послідовності, що кодують білки, які опосередковують резистентність до антибіотиків (наприклад, резистентність до ампіциліну, резистентність до неоміцину, резистентність до 418, резистентність до пуроміцину), послідовності, що кодують забарвлені або флуоресцентні, або люмінесцентні білки (наприклад, зелений флуоресцентний білок, посилений зелений флуоресцентний білок, червоний флуоресцентний білок, люциферазу), і білки, які бо опосередковують підвищений ріст клітин та/або генну ампліфікацію (наприклад,
дигідрофолатредуктазу), але не обмежуються ними. Епітопні мітки включають, наприклад, одну або більше копій БГАС, Ні5, тус, Тар, НА або будь-яку виявлювану амінокислотну послідовність.
І0150| В переважному варіанті реалізації винаходу екзогенна послідовність (трансген) містить полінуклеотид, що кодує будь-який поліпептид, експресія якого бажана в клітині, включаючи антитіла, антигени, ферменти, рецептори (клітинної поверхні або ядерні), гормони, лімфокіни, цитокіни, репортерні поліпептиди, фактори росту і функціональні фрагменти будь- якого з вищевикладених, але не обмежуються ними. Кодуючими послідовностями можуть бути, наприклад, кКДНК.
ІО151| В певних варіантах реалізації винаходу екзогенні послідовності можуть містити маркерний ген (описаний вище), який дозволяє вибирати клітини, які будуть зазнавати наміченої інтеграції і приєднану послідовність, кодуючу додаткову функціональність.
Необмежуючі приклади маркерних генів включають СЕР, маркери лікарської селекції і т.п.
ІО152| Додаткові генні послідовності, які можуть бути вставлені, можуть включати, наприклад, гени дикого типу для заміни мутованих послідовностей. Наприклад, послідовність гена бета-глобіну дикого типу може бути вставлена в геном стовбурової клітини, в якій здійснилась мутація ендогенної копії гена. Копія дикого типу може бути вставлена в ендогенний локус або, як альтернатива, може бути спрямована в локус «затишної гавані». 0153) Конструкції таких касет експресії, разом з методиками згідно з даним описом, використовують методології, добре відомі з рівня техніки молекулярної біології (див., наприклад,
А!йзибреї або Мапіаїі5). Перед використанням касет експресії для одержання трансгенних тварин, реактивність касети експресії на стресовий індуктор, зв'язаний з елементами контролю селекції, може бути протестована за допомогою введення касети експресії в придатну клітинну лінію (наприклад, первинні клітини, трансформовані клітини або іморталізовані клітинні лінії).
І0154| Крім того, не дивлячись на те, що для експресії не потрібно, але екзогенні послідовності можуть бути послідовностями, які регулюють транскрипцію або трансляцію, наприклад, промоторами, енхансерами, інсуляторами, ділянками внутрішньої посадки рибосоми, послідовностями, що кодують пептиди 2А, та/або сигналами поліаденилювання. Крім того, контрольні елементи цільових генів можуть бути функціонально зв'язаними з генами-
Зо репортерами для створення химерних генів (наприклад, репортерних касет експресії).
ІО155)| Також може бути досягнута цільова вставка некодуючої послідовності нуклеїнової кислоти. Послідовності, що кодують антисмислові РНК, РНКІ, кшШРНК ії мікроРНК (мігРНК), також можуть бути використані для цільових вставок.
І0156| В додаткових варіантах реалізації винаходу донорська нуклеїнова кислота може містити некодуючі послідовності, які є специфічними сайтами-мішенями для додаткових разробок нуклеаз. Згодом, додаткові нуклеази можуть експресуватись в клітинах, так що оригінальна донорська молекула розщеплюється і модифікується шляхом вставки іншої цільової донорської молекули. Таким чином, можуть бути одержані повторні інтеграції донорських молекул, які допускають скринінг ознак в певному цільовому локусі або в локусі «затишної гавані».
Доставка
І0157| Нуклеази, полінуклеотиди, що кодують ці нуклеази, донорські полінуклеотиди і композиції, що містять білки та/або полінуклеотиди, описані в даному документі, можуть бути доставлені іп мімо або ех мімо будь-яким придатним способом.
ІО158| Способи доставки нуклеаз, як описано в даному документі, описані, наприклад, в патентах США Мо 6453242; 6503717; 6534261; 6599692; 6607882; 6689558; 6824978; 6933113; 6979539; 7013219 і 7163824, опис яких включений до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. 0159) Нуклеази та/або донорські конструкти, як описано в даному документі, можуть також бути доставлені, використовуючи вектори, що містять послідовності, що кодують один або більше білків «цинкові пальці» або ТАГЕМ. Може бути використана будь-яка векторна система, включаючи плазмідні вектори, ретровірусні вектори, лентивірусні вектори, аденовірусні вектори, поксвірусні вектори, герпесвірусні вектори, аденоасоційовані вірусні вектори і т. п. Див. також патенти США Мо 6534261; 6607882; 6824978; 6933113; 6979539; 7013219 і 7163824, включені до даного документу шляхом посилання в повному обсязі, але не обмежуються ними. Крім того, очевидно, що будь-який з цих векторів може містити одну або більше послідовностей, необхідних для лікування. Таким чином, коли в клітину вводиться одна або більше нуклеаз і донорський конструкт, то нуклеази та/"або донорський полінуклеотид можуть переноситися одним і тим самим вектором або різними векторами. Коли використовують декілька векторів, то 60 кожний вектор може містити послідовність, що кодує одну або декілька нуклеаз та/або донорських конструктів.
ІО160| Звичайні вірусні і невірусні способи переносу генів можуть бути використані для введення нуклеїнових кислот, що кодують нуклеази і донорські конструкти, в клітини (наприклад, клітини ссавців) або тканини-мішені. Невірусні векторні системи доставки включають ДНК-плазміди, «оголену» нуклеїнову кислоту і нуклеїнову кислоту в комплексі з носієм, таким як ліпосома або полоксамер. Вірусні векторні системи доставки включають ДНК і
РНК віруси, які мають епісомальні або інтегровані геноми після доставки в клітину. Для огляду процедур генної терапії див. Апдегзоп, Зсіепсе 256:808-813 (1992); Мабеї! 8 ЕеІдпег, ТІВТЕСН 11:211-217 (1993); Міапі 5 СазКеу, ТІВТЕСН 11:162-166 (1993); ОйШоп, ТІВТЕСН 11:167-175 (1993); МіПег, Маїиге 357:455-460 (1992); Мап Вгипі, ВіоїтесппоІоду 6(10):1149-1154 (1988); Мідпе,
Вевіогайме Мецгоіоду апа Мешцгозсіепсе 8:35-36 (1995); Ктетег а Репісацаеї, Війїзи Медіса!
ВиПеїйп 51(1):31-44 (1995); Найдада еї аІ., в Сшитепі Торіс5 іп Місгобіоїоду апа Іттипоіоду
Воетпег апа Вопт (еаз.) (1995); і Ми егаІ,, Сепе Тпегару 1:13-26 (1994).
ІЇО161| Способи невірусної доставки нуклеїнових кислот включають електропорацію, ліпофекцію, мікроін'єкції, балістичну трансфекцію, віросоми, ліпосоми, імуноліпосоми, полікатіонні або ліпідні кон'югати нуклеїнових кислот, «оголені ДНК», штучні віріони і агентопідвищуюче поглинання ДНК. Для доставки нуклеїнових кислот також може бути застосована сонопорація, використовуюча, наприклад, систему Бопійгоп 2000 (Кісп-Маг).
І0162) Додаткові приклади систем доставки нуклеїнових кислот включають системи, надані Атаха Віозувієтв (Соіодпе, Септапу), Махсуїе, Іпс. (НосКміПе, Магуїапа), ВТХ Моїесшіаг Оеєїїмегу зузіетв (Ноїїївоп, МА) і Сорегпісиз Тпегареціїсз Іпс, (див., наприклад, патент США Мо 6008336).
Ліпофекція описана, наприклад, в патентах США Мо 5049386; 4946787 і 4897355), а реагенти для ліпофекції маються в продажу (наприклад, Тгапе5тесіаті| і І іротесііп(). Катіонні і нейтральні ліпіди, які придатні для ефективної рецептор-розпізнаючої ліпофекції полінуклеотидів, включають ліпіди РеІдпег, УМО 91/17424, МО 91/16024. 0163) Одержання комплексів ліпід:'нуклеїнова кислота, включаючи цільові ліпосоми, такі як імуноліпідні комплекси, добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, Сгувіаї, Зсіепсе 270:404- 410 (1995); Віаезе еї аїІ., Сапсег Сепе Тег. 2:291-297 (1995); Венг еї аї., Віосопійдаїє Спет. 5:382-389 (1994); Вету еї аї!., Віосопішдаїє Спет. 5:647-654 (1994); Сао єї аЇ., Сепе ТНегару
Ко) 2:710-722 (1995); Антаєй еї а!., Сапсег Ве5. 52:4817-4820 (1992); патенти США Мо 4186183, 4217344, 4235871, 4261975, 4485054, 4501728, 4774085, 4837028 і 4946787).
І0164| Додаткові способи доставки включають використання упаковування нуклеїнових кислот, призначених для доставки, в носії ЕпсСепеї!С (ЕОМ). Ці ЕОМ спеціально доставляються в тканини-мішені, використовуючи біспецифічні антитіла, де одне плече антитіла має специфічність до тканини-мішені, а інше - специфічність до ЕОМ. Антитіло доставляє ЕОМ до цільової клітинної поверхні, а потім ЕОМ доставляється в клітину за допомогою ендоцитозу.
Опинившись в клітині, вміст вивільняється (див. МасОіагтіа еї а! (2009) Маїшге ВіоїесппоІоду 27(7):643). 0165) Використання РНК або ДНК вірусних систем для доставки нуклеїнових кислот, що кодують сконструйовані ЕР, користується перевагами високорозвинутих процесів націлювання вірусів в певні клітини в тілі та спрямованої міграції корисного вірусного навантаження в ядро.
Вірусні вектори можуть вводитись безпосередньо суб'єктам (іп мімо) або вони можуть бути використані для обробки іп міїго, а модифіковані клітини вводитись суб'єктам (ех мімо). Звичайні вірусні системи доставки 2ЕР включають ретровірусні, лентивірусні, аденовірусні, аденоасоційовані, осповакцинні і герпетичні вірусні вектори для генного переносу, але не обмежуються ними. Інтеграція в геном-хазяїн можлива за допомогою методів генного переносу ретровірусами, лентивірусами і аденоасоційованими вірусами, часто приводячи до довготривалої експресії вставленого трансгена. Крім того, висока ефективність трансдукції спостерігається в багатьох різних клітинних типах і тканинах-мішенях. 0166) Тропізм ретровірусу може бути змінений шляхом введення чужорідних оболонкових білків, розширення потенційної популяції-мішені клітин-мішеней. Лентивірусні вектори є ретровірусними векторами, які здатні трансдукувати або інфікувати неподільні клітини ії, як правило, продукують високі вірусні титри. Вибір ретровірусної системи переносу генів залежить від тканини-мішені. Ретровірусні вектори складаються з цис-діючих довгих кінцевих повторів з упаковкою місткістю до 6-10 т.н. чужорідної послідовності. Мінімально цис-діючі ГТК є достатніми для реплікації і упаковки векторів, які потім використовуються для інтеграції терапевтичного гена в клітини-мішені, щоб забезпечити постійну експресію трансгена. Широко використовувані ретровірусні вектори включають ті, які базуються на вірусі мишачого лейкозу (Ми! М), вірусі лейкозу гібонів (Сам), вірусі імунодефіциту мавп (ЗМ), вірусі імунодефіциту 60 людини (ВІЛ), а також їх комбінації (див., наприклад, Висп5спег еї аї., 9. МігоЇ. 66:2731-2739
(1992); донапп еї аї., у. Мігої. 66:1635-1640 (1992); боттенеї єї аї., Міго!. 176:58-59 (1990); М/зоп еї аї., у. МігоІ.63:2374-2378 (1989); МіПег єї а!., У. Міко!. 65:2220-2224 (1991); РСТ/О594/05700).
ІО167| В застосуваннях, для яких переважною є тимчасова експресія, можуть бути використані аденовірусні системи. Аденовірусні вектори здатні з дуже високою ефективністю трансдукувати багато типів клітин і не потребують поділу клітин. З такими векторами можуть бути досягнуті високі титри і високі рівні експресії. Цей вектор може бути одержаний в великих кількостях у відносно простій системі. Вектори аденоасоційованих вірусів (ААМ") також використовуються для трансдукції клітин нуклеїновими кислотами-мішенями, наприклад, при іп міго продукуванні нуклеїнових кислот і пептидів, і іп мімо і ех мімо процедурах генної терапії (див., наприклад, Умеві еї аї!., Мігоїоду 160:38-47 (1987); патент США Мо 4797368; УМО 93/24641;
Коїїп, Нитап Сепе ТНегару 5:793-801 (1994); МигусаКа, 9. Сійп. Іпмевзі. 9471351 (1994).
Конструювання рекомбінантних векторів ААМ описане в ряді публікацій, включаючи патент США
Мо 5173414; Тгаївспіп еї аї., Мої. СеїІ. ВіоїЇ. 5:3251-3260 (1985); Тгаївспіп, єї аї., Мої. Сеїї. Віо!. 4:2072-2081 (1984); Нептопаї 5 Мигус2Ка, РМАБ5 81:6466-6470 (1984); і ЗатиївкКі еї аї., У. Мігої. 63:03822-3828 (1989). 0168) На даний час доступні, принаймні, шість вірусновекторних підходів для переносу генів в клінічних дослідженнях, які використовують підходи, включаючи комплементацію дефектних векторів за допомогою генів, вставлених в лінії клітин-помічників для створення трансдукційного агента.
І0169| р А5М і МЕО-5 є прикладами ретровірусних векторів, які були використані в клінічних дослідженнях (Оипбаг еї а!., Віоса 85:3048-305 (1995); Конп еї аї., Маї. Мед. 1:1017-102 (1995);
Маїесп еї аІ., РМАБ5Б 94:22 12133-12138 (1997)). РАЗІ17/р АЗМ був першим терапевтичним вектором, використаним в дослідженні генної терапії. (Віаєзе еї а!., З5сіепсе 270:475-480 (1995)).
Ефективність трансдукції 50 95 або більше була виявлена для упаковування векторів МЕС-5. (ЕПет еї аї!., Іттипої! Іттипоїнег. 44(1):10-20 (1997); Огапої еї аі.,, Нит. Сепе Тег. 1:111-2 (1997)).
ІО170| Рекомбінантні адено-асоційовані вірусні вектори (гААМ) є перспективними альтернативними системами доставки генів, що базуються на дефектному і непатогенному типі 2 парвовірусного аденоасоційованого вірусу. Всі вектори одержані з плазміди, яка зберігає
Зо тільки 145 п.о. інвертованих кінцевих повторів ААМ, фланкуючих трансгенні касети експресії.
Ефективна передача генів і стабільна доставка трансгена завдяки інтеграції в геноми трансдукованої клітини є основними характеристиками для цієї векторної системи. (Ууадпег еї а!І., Гапсеї 351:9117 1702-3 (1998), Кеатпз єї а!., Сепе Тег. 9:748-55 (1996)). Інші серотипи ААМ, включаючи ААМІ1, ААМЗ, ААМ4, ААМ5, ААМб,ААМВ8, ААМОУ і ААМТП10 і всі їх варіанти також можуть бути використані згідно з даним винаходом.
ІО171| Реплікаційно дефіцитні рекомбінантні аденовірусні вектори (Аа) можуть бути одержані при високих титрах і легко інфікувати декілька різних типів клітин. Більшість аденовірусних векторів розроблено таким чином, що трансген замінює гени Ай ЕТа, Е1р та/або ЕЗ; потім реплікація дефектного вектора розповсюджується в людських клітинах 293, які відновлюють функцію видалених генів в їгап5. Вектори Аа можуть трансдукувати різні типи тканин в живому організмі, включаючи диференційовані клітини, які не діляться, такі як ті, що в печінці, нирках і м'язах. Звичайні вектори Ай мають велику пропускну здатність. Приклад використання вектору да в клінічних дослідженнях включає полінуклеотидну терапію для протипухлинної імунізації внутрішньом'язовою ін'єкцією (З(егтап еї аЇ.,, Нит. Сепе Тег. 7:1083-9 (1998)). Додаткові приклади використання аденовірусних векторів для переносу генів в клінічних дослідженнях включають Козепескег еї аї., Іптесіоп 24:1 5-10 (1996); Біегтап єї аІ., Нит. Сепе Тег. 9:7 1083- 1089 (1998); М/еїв5Н1 вї аі., Нит. Сепе ТНег. 2:205-18 (1995); АІмаге? вї аІ., Нит. Сепе ТНег. 5:597- 613 (1997); Торі єї аІ., Сепе ТНег. 5:507-513 (1998); біептап єї а)І., Нит. Сепе ТНег. 7:1083-1089 (1998).
ІЇО172| Упаковка клітин використовується для формування вірусних частинок, здатних інфікувати клітини-хазяї. Такі клітини включають клітини 293, які упаковують аденовірус, і клітини ш2 або клітини РАЗ17, які упаковують ретровірус. Вірусні вектори, використовувані в генній терапії, як правило, продукуються клітинною лінією, яка упаковує вектор нуклеїнової кислоти в вірусну частинку. Вектори зазвичай містять мінімальні вірусні послідовності, необхідні для упаковки і наступної інтеграції до хазяїна (якщо доступний), інші вірусні послідовності замінюються касетою експресії, що кодує білок, що підлягає експресії. Вірусні функції, яких бракує, поставляються в транспакуючу клітинну лінію. Наприклад, вектори ААМ, використовувані в генній терапії, як правило, володіють тільки послідовностями інвертованого кінцевого повтору (ІТК) з геному ААМ, які необхідні для упаковки і інтеграції в геном хазяїна. бо Вірусна ДНК упаковується в клітинну лінію, яка містить допоміжну плазміду, що кодує інші гени
ААМ, а саме реп і кеп, але не має послідовності ІТК. Клітинна лінія також інфікується аденовірусом як помічником. Допоміжний вірус сприяє реплікації вектора ААМ і експресії генів
ААМ 3 плазміди-помічника. Плазміда-помічник не упаковує в значних кількостях через відсутність послідовностей ІТК. Контамінація аденовірусом може бути зменшена, наприклад, тепловою обробкою, до якої аденовірус є більш чутливим, ніж ААУ.
ІО173| В багатьох застосуваннях генної терапії бажано, щоб вектор для генної терапії доставлявся з високим ступенем специфічності до конкретного типу тканини. Відповідно, вірусний вектор може бути змінений, щоб мати специфічність для даного типу клітин шляхом експресії ліганду у вигляді злитого білка з вірусним білком оболонки на зовнішній поверхні вірусу. Ліганд вибирають таким чином, щоб мати спорідненість до рецептору, який, як відомо, присутній в клітинному типі, що становить інтерес. Наприклад, Нап еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі.
ИБА 92:9747-9751 (1995), повідомили, що вірус мишачого лейкозу Молоні може бути змінений, щоб експресувати людський херегулін, злитий з др70, а рекомбінантний вірус інфікує певні ракові клітини молочної залози людини, що експресують людський рецептор епідермального фактору росту. Цей принцип може бути поширений на інші пари клітин-мішеней для вірусів, в яких клітина-мішень експресує рецептор, а вірус експресує злитий білок, що містить ліганд для рецептора клітинної поверхні. Наприклад, нитчастий фаг може бути сконструйований таким чином, щоб відтворювати фрагменти антитіл (наприклад, баб або Гм), які мають афінність специфічності зв'язування з практично будь-яким вибраним клітинним рецептором. Хоча наведений вище опис належить, перш за все, до вірусних векторів, ті самі принципи можуть бути застосовані до невірусних векторів. Такі вектори можуть бути сконструйовані таким чином, щоб містити специфічні послідовності поглинання, які сприяють поглинанню певних клітин- мішеней.
І0О174| Вектори генної терапії можуть доставлятись іп мімо шляхом введення окремому суб'єкту, як правило, шляхом системного введення (наприклад, інтравенозної, інтраперитонеальної, інтрамускулярної, субдермальної або інтракраніальної інфузій) або місцевого застосування, як описано нижче. З іншого боку, вектори можуть доставлятися в клітини ех мімо, такі як клітини, експлантовані від індивідуального пацієнта (наприклад, лімфоцити, клітини кісткового мозку, тканини біопсії) або універсальних донорів гемопоетичних
Зо стовбурових клітин, з наступною реімплантацією клітин в тіло пацієнта, як правило, після відбору клітин, які мають інкорпорований вектор. 0175) Вектори (наприклад, ретровіруси, аденовіруси, ліпосоми і т.п.), що містять нуклеази та/або донорські конструкти, також можуть бути введені безпосередньо в організм для трансдукції клітин в живому організмі. Крім того, може бути введена "оголена" ДНК. Введення здійснюють будь-яким шляхом, зазвичай використовуваним для введення молекули в остаточний контакт з клітинами крові або тканини, включаючи ін'єкції, інфузії, місцеве введення і електропорацію, але не обмежуються ними. Придатні способи введення таких нуклеїнових кислот доступні і добре відомі фахівцям в даній галузі техніки, і, хоча може бути використаний більше ніж один шлях для введення конкретної композиції, конкретний шлях часто може забезпечити більш негайну і більш ефективну реакцію, ніж інший шлях.
І0176| Вектори, придатні для введення полінуклеотидів, описаних в даному документі, включають неінтегруючі лентивірусні вектори (ІОІ М). Див., наприклад, Огу еї а!. (1996) Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА9УЗ:11382-11388; ОШІ еї аї. (1998) 9. МігоІ.72:8463-8471; 7 Негуєї аї. (1998) 3.
МігоІ.72:9873-9880; БРоїІеплі еї аіІ. (2000) Майте Сепеїїс525:217-222; патентну публікацію Мо 2009/054985.
І0177| Фармацевтично прийнятні носії частково визначаються конкретною композицією, що підлягає введенню, а також конкретним способом, застосовуваним для введення композиції.
Таким чином, існує велике різноманіття придатних складів доступних фармацевтичних композицій, як описано нижче (див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпаптасешііса! 5сіепсев, 171п ей., 1989).
ІО178| Очевидно, що нуклеазокодуючі послідовності і донорські конструкти можуть бути доставлені з використанням тих самих або різних систем. Наприклад, донорський полінуклеотид може доставлятись за допомогою плазміди, в той час як одна або більше нуклеаз можуть доставлятись за допомогою вектору ААМ. Крім того, різні вектори можуть бути введені одним і тим самим або різними шляхами (внутрішньом'язово, ін'єкцією в хвостову вену, іншими внутрішньовенними ін'єкціями, внутрішньоочеревинним введенням та/або внутрішньом'язовою ін'єкцією). Вектори можуть бути доставлені одночасно або в будь-якій послідовності.
І0179| Таким чином, даний винахід включає іп мімо або ех мімо лікування захворювань і станів, які сприйнятливі до вставки трансгенів, що кодують терапевтичний білок, наприклад, бо лікування гемоглобінопатій шляхом нуклеазоопосередкованої інтеграції гена, що кодує білок глобіну. Композиції вводять пацієнту в кількості, ефективній для одержання бажаної концентрації терапевтичного поліпептиду в сироватці або органі-мішені, або клітинах. Введення може здійснюватись будь-якими способами, в яких полінуклеотиди доставляються в бажані клітини-мішені. Наприклад, передбачаються як іп мімо, так і ех мімо способи. Внутрішньовенне введення у воротну вену є переважним способом введення. Інші іп мімо способи введення включають, наприклад, безпосередню ін'єкцію в долі печінки або жовчну протоку і внутрішньовенні ін'єкції дистальніше печінки, в том числі через печінкову артерію, безпосередню ін'єкцію в паренхиму печінки, ін'єкцію в печінкову артерію та/або ретроградну ін'єкцію через біліарне дерево. Ех мімо способи введення включають трансдукцію іп міго резектованих гепатоцитів або інших клітин печінки з наступною інфузією трансдукованих, резектованих гепатоцитів назад в портальну васкулатуру, паренхиму печінки або жовчні протоки пацієнта-людини, див., наприклад, сго55тап еї аї., (1994) Майшге Сепеїіс5, 6:335-341.
Ї0180| Ефективна кількість нуклеази і донора, що підлягають введенню, буде змінюватись від пацієнта до пацієнта в залежності від терапевтичного поліпептиду, що становить інтерес.
Відповідно, ефективні кількості будуть краще визначатись лікарем, який вводить композиції, і відповідні дозування можуть бути легко визначені фахівцем в даній галузі техніки. Після надання достатнього часу для інтеграції і експресії (зазвичай 4-15 днів, наприклад), аналіз рівнів терапевтичного поліпептиду в сироватці або інших тканинах і порівняння з вихідним рівнем до введення буде визначати, чи є введена кількість занадто низькою, в потрібному діапазоні або занадто високою. Придатні схеми вихідного введення і наступних введень також змінюються, якщо це необхідно. Послідовні введення можуть здійснюватись через різні інтервали, щоденно, щорічно або раз накілька років. Фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що придатні імуносупресивні методи можуть бути рекомендовані, щоб уникнути інгібування або блокування трансдукції шляхом імуносупресії векторів доставки, див., наприклад, Міїдчціп еї аї., (1995) Нитап
Сепе ТНег. 6:1391-1401.
ІО1811) Препарати для ех мімо і іп мімо введень включають рідкі суспензії або емульговані рідини. Активні інгредієнти часто змішують з ексципієнтами, які є фбармацевтично прийнятними і сумісними з активним інгредієнтом. Придатні наповнювачі включають, наприклад, воду, фізіологічний розчин, декстрозу, гліцерин, етанол або тому подобне та їх комбінації. Крім того,
Зо композиція може містити невелику кількість допоміжних речовин, таких як, зволожуючі або емульгуючі агенти, рН буферні агенти, стабілізуючі агенти або інші реагенти, які підвищують ефективність фармацевтичної композиції.
Застосування
ІО182| Способи і композиції, розкриті в даному документі, є модифікацією експресії білка або корекцією аберантної генної послідовності, яка кодує білок, що експресується при генетичних захворюваннях, таких як серпоподібно-клітинна хвороба або таласемія. Таким чином, способи і композиції передбачені для лікування та/"або профілактики таких генетичних захворювань.
Геномне редагування, наприклад, стовбурових клітин, використовується для коригування аберантного гена, вставки гена дикого типу або зміни експресії ендогенного гена. Як необмежуючий приклад, ген дикого типу, наприклад, що кодує, принаймні, один глобін (наприклад, а- та/або рД-глобін), може бути вставлений в клітини, щоб забезпечити глобінові білки, яких не вистачає та/або які відсутні в клітині, і, таким чином, лікувати генетичне захворювання, наприклад, гемоглобінопатію, спричинену патологічною експресією глобіну.
Альтернативно або додатково, геномне редагування з або без введення відповідного донора може виправити патологічний ендогенний ген, наприклад, коригуючи точкову мутацію в с- або Ір- гемоглобіні, відновити експресію гена та/або лікувати генетичне захворювання, наприклад, серпоподібно-клітинну хворобу, та/або «нокаутувати» зміну (надлишкову експресію або репресію) будь-якого прямого або непрямого глобінового регуляторного гена (наприклад, інактивація у-глобінового, регулюючого гена ВСІ 11А або ВСІ 11А-регулятора КІ Е1). 01831 Способи і композиції згідно з винаходом також можуть бути використані за будь-яких обставин, де бажано надавати трансген, що кодує один або більше терапевтичних агентів, так що терапевтичний агент продукується в ЧКК та/або гемопоетичних стовбурових клітинах таким чином, що зрілі еритроцити на основі цих клітин містять терапевтичний агент. (0184) Наступні приклади належать до варіантів здіснення даного винаходу в яких нуклеаза містить нуклеазу "цинкових пальців" (7ЕМ) або ТАГЕМ. Слід мати на увазі, що ці приклади тільки для ілюстративних цілей і що можуть бути використані інші нуклеази, наприклад, "хомінг"- ендонуклеази (мегануклеази) з сконструйованими ДНК-зв'язуючими доменами та/або злиття природних сконструйованих "хомінг"-ендонуклеазних (мегануклеазних) ДНК-зв'язуючих доменів і гетерологічних доменів розщеплення та/або системи СКІЗРК/Сав, що містить сконструйовану 60 одиничну гідову РНК.
Приклади
Приклад 1: Розробка, конструювання і загальна характеристика нуклеаз білків "цинкові пальці" (2ЕМ)
ІО185) Білки «цинкові пальці» були розроблені і включені в плазміди, ААМ або аденовірусні вектори, в основному, як описано у Огпом еї аїЇ. (2005) Майшге 435(7042):646-651, Реге? еї аї (2008) Маїшцге Віотесппоіоду 26(7):808-816, і як описано в патенті США Ме 6534261. Для 2ЕМ і
ТАГЕМ, специфічних для локусу людського бета-глобіну і локусу людського НРЕТ, див. патент
США Мо 7888121 і патентні публікації США Мо 20130137104 і 20130122591. Для нуклеаз, специфічних для людського ААМ51, див. патент США Мо 8110379. Для нуклеаз, специфічних для СС, див. патент США Мо 7951925. Для нуклеаз, специфічних для альбуміну, див. патентні публікації США Мо 20130177983 і 20139177968.
Приклад 2: Активність глобін-специфічних 2ЕМ
ІО186) Пари 2ЕМ, орієнтовані на локус людського глобіну або регулятори експресії гена бета- подібного глобіну, використали для перевірки здатності цих 2ЕМ індукувати О5В в певному сайті-мішені. Амінокислотні послідовності спіральних ділянок розпізнавання кожного пальця вказаних 2ЕМ наведені в Табл. 1А разом з усіма сайтами-мішенями (сайти-мішені ДНК вказані великими літерами; неконтактні нуклеотиди вказані в нижньому регістрі).
Таблиця 1А
Нуклеази «цинкових пальців» о ЗВБбжфмішень | -// | 77777700 конструція.//7/7/://./:)63/:(ИК4ЯЯСС(Г 11111111 ва | з | 4 | б | г
ЗвВ5ЯЗ3511 ОАБЗМІ5З 055018 |АБОТІ5 | ОБОАГА | О5О0ІТ | НЕ
ЧдааСсАсСТААдСаасСА |В! (ЗБОЇВ! (5ЕО|А (5БО|А (5БО|ВА (5ЕО | АНАЛІЗУ сАСНСІіссісада ІО МО-С9) ІЮ МО 10) | 10 МО 11) | 10 МО: 12) | ІЮ МО 713) | ВАЛИ
ЗЕО І МО:8
ЗзвВ5И33533 ОБАНАК 1ІКННІ ТО | ОВБМІ М | ТОНІ | О5МНІТ | АВЗННІКА їіссаСААссатсАА ІМ (ЗЕО!(5ЗЕО Ір, в Е (ЗЕО І саетоесАюааана ІО МО 15) | МО:16) (ЗЕБЕО І (5ЕБЕО ОЇ (5ЕО І | МО20)
ЗЕО І МО:14 МО:17 МО:18 МО:19 звВ5АЗ5256 ТМОМА! І ОвАЗМАТ | РНКЗКТ | А85ОМІ 5 | АВ5БОНАК |НЕ азалдайтСсАсИатТасСАС |(5ЕО ІІТ (ЗБОЇ А (ЗБОЇ Е ((5ЕО | Т (5ЕО ІО | АНАЛІЗУ
САТ ЩІСіЧН МО:22) ІО МО:С23) | 10 МО: 24) | 10 МО:25) | МО:2б6) ВАЛИ
ЗЕО І МО21 звВБЯЗ5263 т5ОаБІ5З |ОАБ5ОЇ5 |ОВАБАГА | О55МІА |О5аНІЗ |НЕ дасАпААатсЮСсС ІА (5БЕО|А (5БЕО|А (5БЕОЇА (5ЕБО|А /(5ЕО | АНАЛІЗУ сТТасідсссюцЗЕО ІО МО:С28) | 10 МО:С29) | ІЮ МО:З30) | 10 МО:З31) | ІЮ МО:32) | ВАЛИ
ІВ МО 27 звВ5Я34770 РОМІВ | РНКЗКТ | АБ5ОМІ5 | АВ5ОНАК | В5ОНІТ | НЕ асдпосАсатСАсИата (А (ЗБОЇ ВА (ЗБОЇ Е (5БО|Т(5ЕОІЮ|О (5ЕО | АНАЛІЗУ
САСсаюдоаоісід(5ЕО ІО МО:34) | 10 МО: 24) | ІЮ МОС25) | МО:26) ІО МО:35) | ВАЛИ
ІО МО 33
ЗвВ5ЯЗ34791 АВЗТНТ | ТОБІ |0ОА85ОІЇ5 | ОВ5АВТ | ОБОМА |НЕ дасАдстссСсСОтІ ІМ (5БЕО|А (5БЕО|А (5БЕОЇА (5ЕБО|А /(5ЕО | АНАЛІЗУ
АСтТасссідіда9(5ЕО ІО МО:37) | 10 МОС28) | ІЮ МО:С29) | І МО:З38) | ІЮ МО:39) | ВАЛИ
ІЮ МО 36 звВ5ЯЗ34805 овБаріт |55508К |ОАБ5МІЗ5 | О5АОВТ | А5ОТІ5А | НЕ заАСсассСАспАСИСТ ІА (5ЗЕО|К (5БЕО|А (5БЕО|К (5ЕБЕО | (5БО 0 | АНАЛІЗУ
ССАсааддавісад (5ЕО | 10 МО:13) | 10 МО:41) | 10 МО:9) ІО МО:42) | МО-11) ВАЛИ
ІО МОс40 зв5ЯЗ4826 ГАННІ |О5ОМІН | АБАНІЗ | А85ОМІ ЗТ І АКООІА | НЕ достат ааОаСАА ІА (5БЕО|М (5БЕО|А (5ЕОЇ|(5БО І | т (5ЕО ПО | АНАЛІЗУ сасаТодаасдаюдац(вЕо | 10 МО:44) | ІЮ МО:45) | 10 МО:46) | МО:47) МО:48) ВАЛИ
ІО МОЗ
Зо
Продовження таблиці ТА
ЗзВОЯЗ5301 раАЗмМмі5 |О5аріт |ВА5ОТІ5 | ОБОАГА | О5ООІТ | НЕ ддаСАСТААСОССА | В(ЗЕО ІО | В(ЗЕО І | А(ЗЕО ІО | А(ЗЕО ІО | А(ЗЕО І | АНАЛІЗУ
САСНСсіссісадд(ЗЕО МО:9) МО:13) МО:11) МО:12) МО:13) ВАЛИ
ІО МО:8 звОяЗ5328 МОнННіВ | Ов5МІМ | Т5аНІ5 | О5МНІТ | АВ5ННІК ОО | НЕ доОаСААСаТаАА 0 (5Е0О|1ВА (5ЕО|ВА (5ЕО|Е (5ЄО | А (БЕО ІО | АНАЛІЗУ
СсетТодаюааано(ЗЕО | 10 МО:49) | 10 МО:17) | 10 МО:18) | ІЮ МО: 19) | МО:20) ВАЛИ
ІО МО:14
ЗВ5Я35497 равЗмі5 |О5аріт |ОАБ5МІ5 |1КННІТО | Ов5НІТ | АВ5ОМ А сасСАсОсОаСАСТААСЯ| ВА (5ЕО|ВА (5БЕО|ВА (5БЕО|(5БО ІА (5ЕО | Е (БЕО І
ССАСАСсНСІссСцЗЕО І МО:9) |10 МО 13) | 0 МО:9) | МО:16) ІО МО:51) | МО:52)
ІО МО:50 зв5ЯЗ5506 ОБОНІА | М5ННІВ | ОБОМА |ІАННІ ТА | ОБОМІН | НЕ саАідааанооію(ЗЕО | 10 МО:54) | ІЮ МО:55) | ІЮ МО:39) | МО:44) МО:45) ВАЛИ
ІО МО:5З3
ЗзвВОЯ43545 ЇвннітА | Оо5атАК | АБ5ОМІ 5 | О5АМАІК | ГАННІ тА | ОБОаМІН асСААИаСТТАСААСА | (5ЕБЕО І | Т(5ЕОІЮ | Т(5ЕОІЮО | (5БО 0 | (5ЕБО 0 |М (5600
САсСОаТНааддадч(ЗЕо | МО:44) МО:153) МО:154) МО:155) МО:44) МО:45)
ІО МО:158 звВОЯ43544 АМОТІВН |ОВАБ5НІА | АБОМІ5 | АБКТАК | АМ5ОВТ |НЕ аагстасСсССАСсОоасС | М(ЗЕО ІО | В(ЗЕО ІО | Е(ЗЕО ІО | М(ЗЕО І | К(ІЗЕО ІО | АНАЛІЗУ
СТСассассаасіщЗЕО | МО:156) МО:76) МО:25) МО:77) МО:157) ВАЛИ
ІО МО:159
ЗзвВ5ОЯ39172 ОВАЗМІ5 | ВОМИІМ | Т5АМІ ТМ | В5БОНІЗ | ОБОМА | ОВМОВК
СІССАСААлсСОосОсАТ | В(ЗЕБЕО ІО | (5ЕБО 10 (5ЕБО І | В(ЗЕО І | А(ЗЕО І | 5(5ЕО І
САТОаАСсіссісас(і5Е | МО'С9) МО:161) МО: 162) МО:94) МО:39) МО:163)
ОО МО:160 звВ5ОЯ43490 овЗМІ5 ІВОМИМ |1О5ОЇМ | АБОНІЗ | ОБОМА | ОВМОВК
СІССАСААлсСОосСсАТ | В(ЗЕО І | (5ЕБЕО 0 | А(ЗЕО І | В(ЗЕО І | А(ЗЕО І | 5(5ЕО І
САТОаАСсіссісас(і5Е | МО'С9) МО:161) МО:164) МО:94) МО:39) МО:163)
ОО МО:160 звоОя44642 ОВАМІ5 (І ВОМІМ |1О5ОЇМ | АБОНІЗ | ОБОМА | ОВМОВК
СІССАСААлсСОосСсАТ | В(ЗЕО І | (5ЕБЕО 0 | А(ЗЕО І | В(ЗЕО І | А(ЗЕО І | 5(5ЕО І
САТОаАСсіссісас(і5Е | МО: 165) МО:161) МО:164) МО:94) МО:39) МО:163)
ОО МО:160 звВОЯ45148 раАемі5 | Т55МАМ | НБОаМІТ | АБОНІЗ | ОБОМА | ОКМОІ 5
СІССАСААлсСОосСсАТ | В(ЗЕО ІЮ | Н(ІЗЕО І | К(ЗЕО І | В(ЗЕО І | А(ЗЕО І | В(І5ЕО І
САТОаАСсіссісас(і5Е | МО'С9) МО:166) МО:167) МО:94) МО:39) МО:168)
ОО МО:160
ЗВ5Я45147 ОВАБЗМІ5 | Т55МАМ | ОАММІК | А5ОНІ З | ОБОМА | ОКМОІ 5
СІССАСААлсСОосСсАТ | В(ЗЕО ІЮ | Н(ІЗЕО І | М(ЗЕО І | В(ЗЕО І | А(ЗЕО І | В(5ЕО І
САТОаАСсіссісасі5Е | МО:9) МО:166) МО:169) МО:94) МО:39) МО:168)
ОО МО:160
ЗВ5Я39145 АБОНІВ |ОВАБАГА |ВАБОБІВ |ОВ8Б5МАТ | 85ОНІ 5 | ОВБМІК ссСАдСа,сассСата | А(ЗЕО І | А(ЗЕО І | А(ЗЕО І | К(ІЗЕО І | А(5ЕО І | М(ІЗЕО І стотасшисаїса(в5Ео | МО:59) МО:З0) МО:171) МО:172) МО:59) МО:173)
ІО МО:170 ссСАдСа,асассата | С(5ЕО І | А(ЗЕО І | А(ЗЕО І | К(ІЗЕО І | А(5ЕО І | М(ІЗЕО І стотаснсаїсанеєво | МО:З5) МО:З0) МО:171) МО:172) МО:59) МО:173)
ІО МО:170
Продовження таблиці ТА звВОЯ44489 АБОНІ ТТ | ОАБАГА | АБО5БІ5 |ОВ8Б5УВТ | АБОНІ В | ОВ5МІ К ссСААСсасассатТа (БО І | А(5ЕО І | В(ЗЕО ІО | К(ІЗЕО ІО | А(5ЕО І | М(5ЕО І стотасисаїсакноЕо | МО:174) МО:З30) МО :171) МО:172) МО:59) МО:173)
ІО МО:170 звВОЯ45081 АБОНІВ | МАТАНО | 850515 | НТК5БІ5А | А5ОНІ 5 | ОВБМІ К ссСААСасассСатТа | А(ЗЕО ІО | А(ЗЕО ІС | В(ЗЕО ІО | (5ЕБЕО 0 | А(5ЕО І | М(ЗЕО І стотасисаїсацеЕо | МО:59) МО:175) МО :171) МО:176) МО:59) МО:173)
ІО МО:170 звВ5ОЯ44493 АБАНІТ |ОАБМІВ | АБО5БІ5 |О8Б5УВТ | АБОНІ 5 | ОВ5МІ К ссСААСасассСатТа | СО(5ЕО ІО | В(ЗЕО ІО | В(5ЕО І | К(ЗЕО ІО | А(5ЕО І | М(5ЕО І стостасисаїсак(нзЕо | МО:177) МО:178) МО :171) МО:172) МО:59) МО:173)
ІО МО:170 звВОЯ29527 АБОМІ5 | АВМОНАК | А5ОНІВ | АБАМІТ | АБОМІ 5 |ОоВ5тТАП асССАТОСАСАСО | Е(5ЕО ІО | Т(5ЕО ІО | А(5ЕО ІО | А(5ЕО ІО | МІЗЕО ІО | 5ЕО (І тассСТОддааддас(в | МО:57) МО:58) МО:59) МО:60) МО:61) МО:62)
ЕО О МО:56 звоя29528 ОАБ5МІ5 | НАОНІМ |ОВА5МІТ | О5Оа0ІТ | НАББІІМ | НЕ афтТТасСАСАСААТА | А(5ЕО ІО | Т(5ЕО ІО | А(ЗЕО ІО | А(ЗЕО ІО | (5ЕБО (0 | АНАЛІЗУ
Абсссшаассц5ЕО ІО | МОС9) МО:64) МО:65) МО:13) МО:66) ВАЛИ
МО:63
ЗзВОЯ 29525 ОБОаНІ5 | 85ОНІ 5 | АБАСІ 5 | АБ5ОМІ 5 | АБМОВК | НЕ сатоСсСАсасиатас | В(ЗЕО ІО | Т(5ЕО І | А(ЗЕО І | О(5ЕО ІО | К(5ЕО І | АНАЛІЗУ саАНададсісса(5ЕО | МО:З2) МО:67) МО:68) МО:69) МО:70) ВАЛИ
ІО МО:66 звоОя29526 АБ5ОМІ5 | АММОВК | ОБОЇ 5 | Т55МАТ | ОБОМА | О5О0ІТ дІСАСААТАТОаССС | А(ЗЕО І | Т(5ЕО І | В(ЗЕО І | К(ЗЕО І | В(ЗЕО І | А(5ЕО І
СасСАСяФдащто(зЕоО | МО:72) МО:73) МО:29) МО:74) МО:39) МО:13)
ІО МО:71 звВ5ОяЯЗ34678 ОАБ5МІ5 | НАОНІМ |ОВА5МІТ | О5ОаІТ | НАВУМН5 | НЕ афтТТасСАСАСААТА | ВА(5ЕО ІО | Т(5ЕО ІО | А(5ЕО І | А(5ЕО І | М(5ЕО ІО | АНАЛІЗУ
АСсссшаассц5ЕО ІО | МО:9) МО:64) МО:65) МО 13) МО:180) ВАЛИ
МО:179 звОяЗ34642 АБОНІВ | 055НАТ |ІВННІ ТА | ОБАНІК | АБОМІ 5 |ОоВОтТАП агбССАТОДАСАСИтТ | СО(5ЕО ІО | В(ЗЕО ІО | (5ЕБО 0 | А(5ЕО І | МЗБЕО ІО | 5ЕО (10 сабтассвоааддас(зЕ | МО:99) МО:181) МО:44) МО:182) МО:61) МО:62)
ОО МО:56 звВОЯ44889 АБАМІА |ВАІОМАТ |О5МОІМ | М/АБ5БІК | ОВБ5МАК | НЕ
СІСАСТОаТССАСАСИ | Н(ЗЕО ІО | А(5ЕО ІО | 5Б(5ЕО І | ТІ5ЕО ІВ | Т АНАЛІЗУ
АСаадссасасдд(ЗЕО | МО:184) МО:185) МО:186) МО:187) (ЗЕО І0 | ВАЛИ
ІО МО183 МО:188 звоОя44888 ОАБ5МІ5 |О5БОМІА | МКНМІ 5 | Т5О5ІТА | О5001Т | ІКОТІ ВА
ПОСТАСАСТТСТТО | А(ЗЕО ІО | А(БЕО І І О(5ЕО ОО | (5ЕБО 10 А 0 (5ЕБО | (5БО
ААСАСШсссас(ізЕО | МО:9) МО:39) МО:190) МО :191) ІО МО:13) | МО:192)
ІО МО:189 звоОя44905" ОБОМСО |АБАБІ5 | АБОНІ 5 | ОМАТВІМ | МУМЗОГ А | ОБОМА дапАлдОаССАСАСОС | 5(5ЕО ІО | А(ЗЕО І | Е(ЗЕО ІО | (5ЕО І | К (5ЕО І | АН(5ЕО І
ССОАААдасснацвЕ | МО:194) МО:68) МО:78) МО:195) МО:196) МО:39)
ОО МО:193 звоОя44904 О55015 | МКМ/ТІВ |АБАМІТ | Т5ТКІВТ | ОВ5МІТ ОО | НЕ
І9САСАСИТадАсАТТОИ | Н(ЗЕО ІО | МІЗЕО ІО | А(ЗЕО ІО | (5ЕБЕО 10 | А 0/0 (5ЕО | АНАЛІЗУ
СТасаайнснаа(ЗзЕО ІО | МО:88) МО:198) МО:60) МО:199) ІО МО:65) | ВАЛИ
МО:197
Продовження таблиці ТА звВОЯ44911 АМОТІВ |ОАБНІА |ОВАБ5МІМ | ОВ5НІА | А5ОТІ5тТ | О5Б5МВІМ дсССАСАСОСаИасадА | М(ЗЕО ІО | А(ЗЕО ІО | В(ЗЕО ІО | В(БЕО ІО | (5ЕБО 10 | (5ЕБЕО Ю асассСтТТагаааю(зЕ | МО:156) МО:76) МО:17) МО:76) МО:201) МО:202)
ОО МО:200 зВ5ОЯ44910 МОРІ МІ | ВБАМІ ТА | Т5ТКІ ВТ | ОВ5МІТ | АБОБІ БМ | НМОБАК сІССТаТасАСАСТО |(5ЕО 0 (БО 0 (5ЕБО ОЇ В(БЗЕО ІО | (5ЕБО 0 | М5ЕО І
АСАТТасіасадцеЕО | МО:204) МО:60) МО:199) МО:65) МО:205) МО:206)
ІО МО:203 звВ5ОЯ44945 ОБОМА |СВОМА | МОсМІТ | вБОМ'А | ОвАБМАТ | НА5ББІ В аассСтСАССАСаСА | В(ЗЕО ІО | М(ЗЕО І | А(5ЕО І | Е(5ЕО І | Т (5ЕО І | В(ЗЕО І
САТОаАдДаасодсаїд(ЗЕ | МО:39) МО:208) МО:209) МО:52) МО: 23) МО:210)
ОО МО:207 звВоОЯ44944 вАБОМІ/З 055018 | АБОАЇ 5 | ОМАТАТ | А5ОТІ5Е | АВ5ТАТМ
СІАСТСТОДдаСАСАС | Т(5ЕО ІО | А(ЗЕО ІО | Е(ЗЕО ІС | К(І5ЕО ІО | (5ЕБО 10 | (5ЕБЕО Ю
ССАТАСНОсаса(ЗЕеЕО | МО:154) МО 10) МО :212) МО:115) МО:84) МО:37)
ІО МО:211 звВоОя449477 СЗБЗАЇТ (ОБОМА | ТАБНІКЕ | ОМАТАТ | 85ОМІ 5 | 558МІА5
СІСАССАСОСАСАТ | О(ЗЕО ІО | В(ЗЕО ІС | (5ЕБО 0 | К(ІЗЕО І | Е (5БЕОІО | (5БО І
САДАдАСосаддсес(ЗЕ | МО:214) МО:39) МО:215) МО:115) МО: 25) МО:216)
ОО МО:213 звоОя449467 вАБОМІ/З 055018 | АБОАЇ 5 | ОМАТАТ | А5ОТІ5Е | АВ5ТАТМ
СІАСТСТОДдаСАСАС | Т(5ЕО ІО | А(ЗЕО ІО | Е(ЗЕО ІС | К(І5ЕО ІО | (5ЕБО 10 | (5ЕБЕО Ю
ССАТАСНОсаса(ЗЕеЕО | МО:154) МО 10) МО :212) МО:115) МО:84) МО:37)
ІО МО:211 звВОЯЗ6004 ТОНІВ |ОВАБ5НІА | АБОМІ5 | АБМОВК | А5ОНІ 5 | ОБОМА ддаадАдсасассСсСА | А(БЕО ІО | А(ЗЕО ІО | О(ЗЕО І | К(ІЗЕО І | Е(ЗЕО І | А(ЗЕО І саабсстТсадююс( | МО 718) МО:76) МО:69) МО:70) МО:78) МО:39)
ЗЕО ІО МО:75 звОяЗб6О21 ОВАБЗМІТ | Т5АМІ БА | В5ОНІ 5 | ОБАЗАК | НЕ НЕ асАСАСАСОАТОАСІ | В(ЗЕО ІЮ | (5ЕБО 0 | Е(ЗЕО І | М(ЗЕО ІО | АНАЛІЗУ | АНАЛІЗУ іссісаадаіюаЯа(5ЕО МО:65) МО:217) МО:78) МО:81) ВАЛИ ВАЛИ
ІО МО:79
ЗзвВОАЗ33237 ТОНІВ |ОВАБ5НІА | АБОМІ5 |АБКТАК | АБОНІ5 | ОБОМА дасАдссаасСсСА |В А (ЗЕО|Е(ЗЕОІЮО|М (5ЕО | Е (5ЕО І | А (5ЕОІЮ сасвасастсадюідс (5ЕБО 0 | 10 МО:76) | МО:25) ІО МО:77) | МО:78) МО:39)
ЗЕО І МО:75 МО:18 звоОяЗ3238 рАЗмМі5 | ТОМІ ТА | А85ОНІ 5 | ОБАЗАК | НЕ НЕ асАСАСАСОсАТОАСІ | А (5БЕО|(5БО 10 | Е(5ЕБЕОІО | М 0 (5ЕО | АНАЛІЗУ | АНАЛІЗУ
Іссісаадаїдаа І МО:9) | МО:80) МО:78) ІО МО:81) | ВАЛИ ВАЛИ
ЗЕО ІО МО:79
ЗвВОАЗ33257 АБАНІб |05508К |ОВА5НІА | 85ОТІ5Е | ОБОа0ІТ | НЕ сассАдсСасастТосСс |В (5БЕО|К(5ЕОІІ|ВА (5БО|(5БО ОА 0 (5Е6О | АНАЛІЗУ ссссссдадчаааії ІО МО:46) | МО:83) ІО МО:76) | МО:84) ІО МО:13) | ВАЛИ
ЗЕО О МО:82 звВОЯЗ3258 АБОБІІА | ВІОМІ Р | 055015 |ААБМА5 | ОВ85МІ 5 | О0БООІТ сссСАсСАСсТаСОасС |(5БО 10 | М(5ЕОІ0|А (5БЕО|К(ЗЕОІЮ| А (50 | А (5ЕО І тотацссосссадса МО:86) МО:87) ІО МО:88) | МО:89) ІО МО:9) МО 13)
ЗЕО ІО МО:85 звВОЯЗ33269 О5Б5НІТ 1055017 |ВАБОНІ5 |Н5АТАТ | А5ОНІ5 | ОВ5АВМ чсостСсссдаССос | А (5ЕО|ВА (5БЕО|Е(ЗЕОІЮІ|К(ЗЕОІЮ| А (5ЕО | 5 ((5ЕО І сасСстаслАдссачод ІО МО:91) | 10 МО:92) | МО:78) МО:93) ІО МО:94) | МО:95)
ЗЕО ІЮ МО:90
Продовження таблиці 1А звВОЯЗ3270 АБОТІБЕ | О5НМАТ | 055015 |ОВО5НІА 1055015 |ОВ5НІА аашиСОСсТоссСОасСТ | (5БЕО І0ІК(ЗЕОІЮ|ВА (5БЕО|А (5БЕО|ВА (560 | В (БЕОІЮ
ЯСААССсдідіасс МО:84) МО:97) ІО МО:88) | 10 МО:76) | 0 МО:88) | МО:76)
ЗЕО ІЮ МО:96 звВоОЯЗ3271 вБ5ОНІБ |НАБ5БО | АБО | ОВА5ТІ 55 | АБАОІ ТА | ОБООІ Т
МасСАаСаССАсСОо 10 (5БЕО10 (5БЕО|ВА (ЗБОЇ (5БО ІС (5ЕБО ІО|В(5ЕО!ІЮ0
СсСтТтТасдсісдада ІО МО:99) | І ІО МО :102) МО:103) МО:13)
ЗЕО ІЮ МО:98 МО:100 МО:101 звояЗ3272 РАБОІЇ5 | А5ТНІМА | В5О51І15Т | 05508 | В5ААГАВ | НЕ сдататАссссасца | В (ЗБЕО 0 | (5ЕБЕО ІВ|К (5ЕО 0 | АНАЛІЗУ
СССаасассадсіс (5ЕБЕО Ю | МО:105) МО:106) (5ЕБЕО Ю | МО:108) ВАЛИ
ЗЕО ІЮ МО:104 МО: 29 МО:107 зВОЯЗ6071 ММАОСІМ | Т55МІ БА | О5аНІ В | ОБОНІА | ОВТНІМ | НЕ
ССАдаїсссаадаю( ЗЕ МО:219) МО:220) МО:З2) МО:54) МО:221) ВАЛИ
ОО МО:218
ЗзвВОЯЗ6085 АБОНІВБ |Н5АТАТ | АБОНІВ |НеАТАТ | АБОНІ5 | АКБОВІК спстсасасссСоас | Е(5ЕО І | К(ІЗЕО ІО | Е(5ЕО І | К(ІЗЕО ІС | Е(5ЕО ІО | (5БЕО Ю ассоСастюдсоса(5 | МО:78) МО:93) МО:78) МО:93) МО:78) МО:223)
ЕС Ю МО:222 звВОЯЗ34360 АБОНІВ | В5ОМАК | АБ5ОМІ5К | Т55УВАТТ | АРМУТІ ВІ | ОМАТАТ
ПОСАТТОАСАТАСТ | М(ІЗЕО ІО | Т5БО І | (5ЕБО 10 | (5ЕБО 0 | (5ЕБО | К(ІЗЕО І стасСсдаадодоас(5 | МО:110) МО:111) МО: 112) МО 113) МО: 114) МО 115)
ЕС Ю МО:109 звВОЯЗ34363 ОВАБАГА | ААВОПНО | ОБОМА | АМОВАК | АБОМІ ЗЕ | НЕ астатсСТтОдААСбО | В(ЗЕО ІО | (5ЕБО І | А(БЗЕО ІС (5ЕБО 10 | (5ЕБО 0 | АНАЛІЗУ
СсСТОссідасіааасізЕ | МО:З30) МО:117) МО:39) МО:118) МО:57) ВАЛИ
ОО МО:116 звВ5ОЯЗ34398 АБОБІІА | О5САВМ | В5ОМА | НАМТІ С | МАМАСМ | НЕ
ПТаСАТТОАСАТАС | (5ЕО І | М(5ЕО І | В(ЗЕО ІО | (5ЕБО (0 | А(5ЕО І | АНАЛІЗУ
Таюдадаадад9ча(зЕО | МО:86) МО:120) МО:121) МО 122) МО:123) ВАЛИ
ІО МО119 звВ5ОЯЗ34400 О55015 | ВААРАЇЇ | ОВАБАГА | АВОП НО | ОМАНАК | ОВ5АГАН сІшТСтТОоАадсост | В(5ЕО ІО | М(5ЕО ІС | В(5БЕО ІО | (5ЕБО 0 | ТЕО І | (5ЕБЕО Ю
СеСтоасСтТааасіс(5 | МО:88) МО 25) МО:З30) МО 117) МО 26) МО:30)
ЕС Ю МО:124
ЗВ5ОЯЗ31160 АБОБІТА | ТОННІ ТО | Т5ОМІ ТА | Т5ТНІНЦ ОБО | НКУУМІ В
ІатТТОСАЇТОАСАТ |(5ЕБЕО 10 (5ЕБО 10 (5ЕБО 101 5ЕО 0 | А(ЗЕО ІС | О(5ЕО І
АстаТОСаодаада(є | МО:86) МО 128) МО:80) МО:129) МО:13) МО:130)
ЕС Ю МО:127
ЗзвВ5ОЯЗ34365 О55015 | ВААРАЇЇ | ОВАБАГА | АВОП НО | ОМАНАК | ОВ5АГАН сІшТСтТОоАадсосст | В(5ЕО ІО | М(5ЕО ІС | В(5БЕО ІО | (5ЕБО 0 | ТЕО І | (5ЕБЕО Ю
СеСтоасСтТааасіс(5 | МО:88) МО:131) МО:З30) МО 117) МО 26) МО:30)
ЕС Ю МО:124
ЗзвВ5ОЯЗ34539 АБОМІ5Е | АМОНАК | 05001 | А5ОНІ 5т | ОВБАГАВ | НЕ
ІЧСТСААСОСАдОса |(5ЕБО 0 | ТЕО ІС | А(БЗЕО ІО | (5ЕБО 0 | (5ЕБО 0 | АНАЛІЗУ
СТОдссаасссаю(5зЕ | МО:57) МО:58) МО:13) МО:67) МО:З30) ВАЛИ
ОО МО:224
ЯсССТТаАСААСОСА | Т(5ЕО І | В(ЗБЕО 10 | (5ЕБО 0 | А(ЗЕО ІС | (5ЕБО (0 | АНАЛІЗУ
ААСТндассааіад(вЕо | МО:23) МО:226) МО:227) МО:9) МО:228) ВАЛИ
ІО МО:225
Продовження таблиці ТА звВ5543865 МРАМІТА | ОМАТАТ | А85ОМІ ЗМ | ОВЗМІ З | І1КЕАГАМ | НЕ дссСТТаАСААСИСА |(5ЕБЕО ОЇ К(ЗЕО І (5ЗЕБО І А(ЗЕО ІС (5БЕО 0 | АНАЛІЗУ
ААСсІЇдассаагад(ЗЕО | МО:229) МО:115) МО:227) МО:9) МО:228) ВАЛИ
ІО МО:225 звВ52543852 АБОМІЗЕ | АМОНАК | О50011 | А5ОМІ 5 І О5БЗАВК |НЕ юдатСААсасСААсо |(5ЕО І ТЕО ІС В(ЗЕО І (ЗЕО І || К(БЕО ІО | АНАЛІЗУ
СТОдссаасссаю(5зЕ | МО:57) МО:58) МО:13) МО:154) МО:230) ВАЛИ
ОО МО: 224
Примітка: ВСІ11ТА Хі -специфічні пари 2ЕМ, позначені однією зірочкою () або двома зірочками (У), містять нові лінкери 1 7а і І 8р, відповідно. Див. Приклад 6.
І0187| Аналіз Се!-І (Зигмеуог"М, Ттгапздепотіс5), як описано у Реге еї аї. (2008) Маї.
Віоїеснпої. 26: 808-816 і Сизспіп еї а. (2010) МеїШод» Мої Віої. 649:247-56), був використаний для виявлення 2ЕМ-індукованих модифікацій гена-мішені в К562 або Н5ЗС. В цьому аналізі,
РСВ-ампліфікація сайту-мішені супроводжувалась кількісною оцінкою вставок і делецій (інсерційно-делеційні мутації) з використанням ферменту Сеї!-І, виявляючого помилки (Уапад еї а!. (2000) Віоспетівігу 39: 3533-3541), який забезпечує оцінку нижньої межі частоти ОВ. Через три дні після трансфекції вектору експресії 2ЕМ за стандартних умов (37) або з використанням гіпотермічного шоку (30 "С, див. патентну публікацію США Мо 20110041195), виділили геномну ДНК з клітин К562, використовуючи набір ОМеавзу (Оіадеп). 0188) Результати аналізу Се!-І демонструють, що 2ЕМ були здатні індукувати розщеплення в їх відповідних сайтах-мішенях (див. також, попередню патентну заявку США Мо 61/556691).
Результати продемонстровані На Фіг. 1 і показують, що активні білки були знайдені у більшості локусів-мішеней в гені бета-глобіну.
Приклад 3: Редагування бета-глобінового локусу 01891) 2ЕМ, специфічні до гена людського бета-глобіну (НВВ) (Табл. 1), були використані для введення донорської ДНК в бета-глобіновий локус наступним чином. Донорська ДНК була розроблена таким чином, що послідовність, що кодує НВВ генні послідовності, фланкувалась послідовностями, які були гомологічними (гомологічні плечі) ділянці, що оточує сайт розщеплення 2ЕМ в бета-глобіновому гені. Гомологічні плечі складають приблизно 500-600 пар основ в довжину. Донорська послідовність НВВ не має будь-яких некодуючих послідовностей, так що при вставці в бета-глобіновий сайт-мішень експресія донора регулюється бета- глобіновим промотором і будь-якими іншими бета-глобіновими регуляторними послідовностями.
При вставці НВВ-донор зливається в рамці з ендогенними глобіновими послідовностями і дає злитий білок. Крім того, НВВ-олігодонор був розроблений для захоплення в розщепленому
Зо НВВ-гені після обробки 2ЕМ. Оліго містив сайт рестрикції, так що після вставки оліго був введений новий сайт рестрикції в НВВ-ген, який згодом можна розщепити. 0190) Як показано На Фіг. 2А, рД-глобіновий олігодонор був вставлений в належний локус, як перевірено наявністю нового сайту рестрикції, присутнього на донорської ДНК. Крім того, як показано на Фіг. 2В, аналіз СеІ-І продемонстрував, що декілька пар 72ЕМ були здатні розщеплювати ДНК, хоча оліго був присутнім тільки в зразку на смузі 8.
І0191| Застосовували методи диференціювання трансгенних клітин СОЗ4- в зрілі ЧКК, відомі з рівня техніки. Наприклад, клітини СКХ СО34ж- очищували за допомогою фікол-паку (СЕ
Неанйсаге) і мікросфер СОЗ34-- (Міпнепуї Віоїес) згідно до інструкцій виробника. Клітини СОЗ34-- культивували в середовищі Дульбекко, модифікованому згідно до способу Ісков, з ВІТ 95000 (бетсеї! Тесппоїодіе5) в присутності факторів росту. Клітини диференціювали в еритроїдну клітинну лінію з використанням моделі 2-фазної рідкої культури. Протягом перших 6 днів (перша фаза), клітини СОЗ34- вирощували з 5СЕ (100 нг/мл), ЕКЗ-Ї (100 нг/мл) і ІС-3 (20 нг/мл).
Вирощені клітини потім комітували і диференціювали в еритроїдну клітинну лінію (друга фаза) з
Еро (2 Од/мл) та ЗСЕ (50 нг/мл). Див. Сіагтаїапа еї аї. (2011)ВІосд118(19):5071-9.
Приклад 4: Генна корекція мутації в бета-глобіні. 0192) Для коригування серпоподібно-клітинних мутацій в гені серпоподібного бета-глобіну був здійснений дволанцюговий розрив в бета-глобіновому локусі за допомогою 2ЕМ з наступним відновленням ДНК, з використанням екзогенного коригуючого олігонуклеотиду як матриці ("олігодонор"). Щоб уникнути вірогідності нуклеаз, які розщеплюють виправлений ген глобіну (ген, в якому олігодонор спрямовує коригування серпоподібної мутації в ендогенному гені НВВ),
був розроблений олігодонор для сумісної вставки трансляційно мовчазних мутацій в кодуючу послідовність НВВ таким чином, щоб відкоригованим алелям не вистачало однієї з послідовностей-мішеней 2ЕМ. Таким чином, спостерігалось збільшення частоти відкоригованих алелей цільових генів. Для оптимального олігонуклеотидного донору були дослідженні деякі мутації в послідовності-мішені 2ЕМ, а також довжина гомологічних плеч.
ІО193| Нижче показана послідовність, що оточує серпоподібну мутацію, а різні мутації позначені цифрами. Таким чином, мутація 1 - с на А, мутація 2 - о на А, мутація З - ТСТ на
АСС, мутація 4 - С на Т і мутація 5 - Т на б. Були одержані олігонуклеотиди, які містили різні комбінації мутацій. Послідовність дикого типу ("мі") вказана зверху (ЗЕО ІЮ МО:231), а послідовність з мутаціями ("ти") вказана нижче (ЗЕО ІЮ МО:232).
І0194| Сайти-мішені для нуклеаз (Чагдеї") вказані жирною лінією, а сайт серпоподібної мутації взятий в бокс. Олігонуклеотиди позначені відповідно мутаціям, таким чином, наприклад, олігонуклеотид 5М51 має тільки сайт 1 мовчазної мутації, тоді як 5М5 124 має сайти 1,214 мовчазних мутацій
АССАТОВТОСВОСТОАСТОСТОАЛОАСАОТСТОСОССТ Ук ї хз я Б 0195) Різні оліго були доставлені в клітини СО34- у вигляді одноланцюгових молекул як «смислові» або прямі ланцюги (позначається як "ЕР або «антисмислові» або зворотні ланцюги (позначається як "К). Оліго доставляються шляхом трансфекції за допомогою пристрою Здпцаге
УмМаме ВТХ ЕСМ 830 за наявності або без нуклеаз. Якщо не вказане інше, то доставляється З мкг нуклеаз. Генне редагування було виміряне за допомогою високоефективного секвенування ДНК ампліконів РСК гена НВВ. Відсоток генної модифікації визначали шляхом негомологічного з'єднання кінців (МНЕУ", спричинене зшиванням дволанцюгового розриву в ДНК після 2ЕМ- індукованого розщеплення) або спрямованої інтеграції оліго після розщеплення 2ЕМ ("тенна корекція") (див. Фіг. 9). Результати вказують, що деякі комбінації мутацій були здатні підвищувати генне коригування в клітинах таким чином, що до 20 95 клітин демонстрували генне коригування в серпоподібному локусі. (0196) Для дослідження впливу довжини гомологічних плеч на відсоток генної корекції були використані оліго 5М512 і 5М5124 з 41 і 46 нуклеотидами (88 п.о. олігодонору) або 50 і 50 нуклеотидами гомології (101 п.о. олігодонору) з кожного боку сайту серпоподібної мутації.
Зо Результати (див. Фіг. 10) вказують на те, що більш довгі гомологічні плечі були більш ефективними з точки зору спричинення генної корекції у до 40 95 алелей, включаючи зміни, визначені за допомогою оліго. Використані оліго показані нижче:
ЗМ5124, 88 п.о., КЕ (ЗЕО ІЮ МО:233):
БСОСТТСАССТТОССССАСАСООССАСТААСАОСАСАТТ ТТ ТОСТСАСОСАСТСАООСТОСАССАТ ссаетаттатс,аАадсаттастАатаААС
ЗМ512, 88 п.о., КЕ (ЗЕО ІЮ МО: 234):
БСОТТСАССТТОССССАСАСОСаСАаТтТААСсасСсАаАТ ттоСстТоА,СаАатсАаатТасСАССАТ ссаетаттатс,аАадсаттастАатаААС
ЗМ5124, 101 п.о., К (5ЕО ІО МО:235):
БСТТСАТССАССТТСАССТТОССССАСАСООССАСТААСАССАСАТТТТТСОСТСАСОСАСТСАС стасСАСсСсАТОСТатТОоТОТтттаАд,ааттастАаТаААСАСАС
І0197| Для дослідження диференційної здатності і довготривалості генної корекції під час диференціювання клітин СОЗ4ж, пули 2ЕМ-модифікованих клітин СОЗ34- спонукали диференціювати, використовуючи метилцелюлозне середовище Меїйосий /5(етесеїЇ
Тесппоіодіев' згідно з інструкціями виробника. Диференціювання аналізували за допомогою аналізу типу колоній, що виникали внаслідок диференціювання, спричиненого Меїпосиї колонієутворюючі одиниці, еритроїд (СРО-Е"); бурстоутворюючі одиниці, еритроїд (ВЕО-Е"); колонієутворюючі одиниці, гранулоцит/макрофаг (СЕИО-ОМ") і колонієутворюючі одиниці; гранулоцит/еритроцит/моноцит/умакрофаг СЕО-ЗЕММ"). Результати вказують на те, що 2ЕМ- оброблені клітини зберігають таку саму здатність до диференціювання, що і удавано трансфіковані клітини. Індивідуальні колонії ВЕО-Е були зібрані з чашки і генотиповані з приводу
НВВ. Результати вказують на те, що 2ЕМ-індуковані модифікації зберігались протягом диференціювання колоній (див. Фіг. 11). Крім того, частота модифікованих ВЕО-Е колоній була подібна частоті модифікованих алелей в стартовому пулі, демонструючи, що не спостерігається зміщення відносно відредагованих клітин під час утворення ВЕО-Е. Більше того, клітинна популяція в цілому була досліджена з приводу генної модифікації протягом курсу рідкої культури іп міго диференціювання червоних клітин крові. Модифікації були стабільними протягом, принаймні, 18 днів процесу диференціювання червоних клітин крові (див. Фіг. 12). 0198) Інша загальна мутація в бета-глобіновому гені, яка асоціюється з бета-таласемією, відома як ІМ51.1. ця -»А мутація локалізується в межах першої пари основ інтрону 1 бета- глобінового гена, а її наявність в гені призводить до патологічного сплайсингу бета-глобінової пре-мРНА. Таким чином, була сконструйована пара 2ЕМ для розпізнавання і розщеплення ділянки, суттєво рекапітулююча цю мутацію з модельною метою. Тестування цих 2ЕМ виявило, що вони здатні розщеплювати сайт на бета-глобіновому гені, приводячи до 52,63 95 МНЕ) в клітинах СОЗА к.
Приклад 5: Вставка бета-глобінового донору в локус «затишної гавані»
ІО199| Для вставки бета-глобінового гена дикого типу в локус «затишної гавані» таким чином, щоб експресія з трансгена коригувала дефіцит бета-глобіну в Н5С, нуклеази, специфічні до цього локусу «затишної гавані», вводяться в клітину разом з донорською нуклеїновою кислотою. Нуклеази, специфічні до НРЕТ (див. патентні публікації США Мо 20130137104 і 20130122591), ААМ51 (див. патент США 8110379), ССЕ5 (див. патент США 7951925) або бета- глобіну (див. Табл. 1А) вводяться в одержані від пацієнта стовбурові клітини СО34-. Введення може здійснюватись будь-яким методом, відомим з рівня техніки, таким як електропорація
МРНК. Розробляється донорська ДНК, що містить трансген, бета-глобін дикого типу і ділянки гомології, фланкуючі трансген, з достатньою гомологією з ділянкою, що оточує «затишну гавань»-мішень, щоб дозволити НОК (як правило, 500 п.о. з кожного боку). Як альтернатива, донорський конструкт, передбачений таким чином, що він не має або містить ділянки гомології, вводиться в 2ЕМ або ТАГЕМ-намічений локус шляхом захоплення кінців (див. попередню заявку
США Мо 13/889162). Донор сумісно вводиться в клітину СО34ж- перед, під час або після введення 2ЕМ. Модифіковані клітини СО34ж- повторно вводяться пацієнту, а потім
Зо приживляються, продукують бета-гемоглобін при достатніх рівнях для забезпечення терапевтично релевантної кількості гемоглобіну, який буде продукуватись.
Приклад 6: Інактивація ВСІ 11А і КІ Е1 (0200) Нуклеази, специфічні до ВСІ 11А їі КІ Е1 (наприклад, 2ЕМ, як показано в Табл. 1А), вводили в Н5С, як описано вище, щоб спричинити регуляцію гама-глобінової експресії (див. Фіг. 3), а геном клітин аналізували за допомогою аналізу Сеї, як описано вище (Реге? еї а! (2008), там же). 0201) Як показано на Фіг. 4, після обробки НЗС вказаними КІ'Е1-специфічними 2ЕМ, 2ЕМ успішно модифікували локус КІЕ1 (Фіг. 4С і 40). Аналогічно, ВСІ 11А-специфічні 2ЕМ модифікували локус ВСІ11А (Фіг. 4А). Пара 2ЕМ, спрямовано діюча на локус НРКТ (див. попередню заявку США Мо 61/552309), була використана як контроль і також продемонструвала успішне розщеплення (Фіг. 4В). Порівняння сигналу в день З після СОЗА-- клітинної трансдукції з днем 17 диференціювання культури (Фіг. 4Е) продемонструвало, що відсоток генетичного редагування (96 МНЕ) є стабільним в часі. В кожному гелі, показаному На Фіг. 4Е, смуги з відсутньою ідентифікацією слугують негативним контролем. (02021 Також були перевірені додаткові пари 2ЕМ, спрямовано діючі на екзон 2 або екзон 4
ВСІ11А. Для цих досліджень, кандидатні пари 24ЕМ вводили в клітини К5б2 за допомогою
Атаха, як описано вище, або вводили в клітини СО34-. Для трансдукції СО34- був застосований пристрій ВТХ ЕСМ830 з кюветою з 2 мм зазором. мРНК з клітин отримували із застосуванням тМеззадеМаспіпе Т7 Ойга Кий (Ж АМ1345, АтБбіоп). Людські клітини СОЗ4ч- вирощували в середовищі х-мімо10 (опа) з 1хСС110 (5(ет сеї ТесппоІоду) в планшетах, оброблених нетканинною культурою. Клітини підраховували і збирали центрифугуванням при 1200 обертах на хвилину протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали 1-2 рази в РВЗ при кімнатній температурі. 200000 клітин були використані для кожної трансфекції, їх ресуспендували в 100 мкл розчину ВТехрге55. Додавали по 2-4 мкг мРНК на трансфекцію, і суміш переносили в кювету. Одразу ж після передачі суміш піддавали електропорації в 250 вольт протягом 5 мс. Попередньо підігріте середовище додавали в кювету і середовище плюс клітини переносили в 48-лункові планшети, оброблені нетканинною культурою, а потім інкубували при 37 "С.
І0203| Після певної кількості днів, клітини повторно піддавались геномному аналізу із 60 застосуванням Шитіпа МібЗед. Для кількісного визначення відсотка відредагованих алелей,
цільову геномну ділянку піддавали РСК-ампліфікації із застосуванням праймерів, які додають стандартні ПШитіпа секвенуючі адаптерні послідовності. Другу групу з 13 раундів РСК проводили, щоб додати штрих-код і адаптерні місткові послідовності до обох кінців.
Секвенування проводили на Шитіпа МібЗед у відповідності до протоколів виробника для секвенування ампліконів. Мізед генерує з'єднані парнокінцеві зчитувані фрагменти і підігнаний адаптер із застосуванням стандартного програмного забезпечення для вирівнювання. Зчитувані фрагменти потім демультиплексуються зразком за допомогою пари послідовностей штрих-кодів із застосуванням звичайних сценаріїв. Послідовності ампліконів потім повсюдно вирівнювали з еталонною послідовністю за допомогою використання алгоритму МееаІєтап-У/ип5сп (Меедіетап, Заці В.; і Мупп5сй, Спгізіап О. (1970). дог Мої Віо 48 (3): 443-53). Пробіли або вставки у вирівнюванні рахували як 95 МНЕ) подій і порівнювали з необробленою контрольною послідовністю для визначення швидкості підрахунку послідовність-специфічного фону. (0204) Для розрахунку спрямованої інтеграції послідовності ампліконів були вирівняні по всій довжині з еталонною послідовністю за допомогою «біопітонного» використання алгоритму
Мевеаіетап-У/ипзсп (Мееадіетап, заці В.; ії М/сп5сп, Спгізінап 0. там же). Зміни послідовностей, одержані за допомогою експериментальних обробок, були прошукані, підраховані і порівняні з підрахунками в контрольних зразках. Відомі одноознакові поліморфізми (ЗЕР) можуть маскуватись під час цього процесу і виключатись з подальшого підрахунку (наприклад, 1-п.о. видалення 5ЕР, близьких до сайту-мішені 2ЕМ). Відсоток МНЕ) (також згадується як інсерційно- делеційна мутація) розраховували шляхом визначення відсоткової частини послідовностей, які містять вставки або делеції. Зразки, оброблені тільки вектором СЕР, були використані для оцінки РСЕ і помилок послідовності на базі фонової частоти вставок і делецій. Спостерігались фонові частоти, що складають менше 1 95. (0205) Набір репрезентативних даних показаний нижче в Табл. 1В, і демонструє, що ці нуклеазні білюи приймають активну участь в розщепленні своїх мішеней. Крім того, експресія гама-глобіну контролювалась в деяких клітинах, оброблених нуклеазою. Щоб виконати цей аналіз застосовували КТ-ДРСК в режимі реального часу ("Тадтап") як стандартну процедуру (див. нижче). Результати набору репрезентативних даних відображаються як кратність підвищення експресії гама-глобіну у порівнянні з контрольними клітинами, обробленими СЕР.
Зо Значення гама розраховували як відношення гама-глобіну до альфа-глобіну, так що будь-який спостережуваний ріст, показаний нижче, являє собою збільшення співвідношення гама до альфа в клітинах, оброблених нуклеазою, у порівнянні з співвідношенням гама до альфа в клітинах, оброблених вектором СЕР.
Таблиця 18
Активність ВСІ 11А екзону 2 і екзону 4 пар 2ЕМ до інсерційно- до інсерційно- Кратність
Мішень Пара 2ЕМ делеційних делеційних мутацій, збільшення мРНК мутацій, К562 СОз34 о Екзон2 | 39145/39172 | 77/17/6978. | зб 2 11 | з39145/43490 | -: 1988 | 77777777777777777777171771717171спас71щС 1111 р веї45/д4вба2 | 3852 | 77777777 |та 11111 р веїаБ/дт5ЯВ | 4226 | 77777777 |та 11111 р веїаБ/дт547 | 3563. | 77777777! 1111 | 44490/39172 | 29338 | 77777777 177117171спас1С 111111 44489/39172 | 2434 | 7777777777777717117117171спас1 111 р 4БОВИЗЯТ72 | 2780. | 7777777777777777171711771717171пас71щ 111111 44493/39172 | 2568. | 77777777777777/|1771717171спас71щ ннннннпнпшншиши пили ПО (Екзон4 | 34678/34642 | -:/ (С |77777/0о/со8ая | зБХ
І0206| ТАГЕМ були також зроблені як для ділянки екзону 2, так і для ділянки екзону 4
ВСІ 11А.ТАГЕМ були сконструйовані, як описано вище, за допомогою канонічного коду ТАГЕ і скелету "17" ТАГ ЕМ (див. патентну публікацію Мо 20110301073). Табл. 1С показує послідовність- мішень для ТАГЕМ, а також послідовність КМО в ДНК-зв'язуючому домені.
Таблиця 1С пари ТАГЕМ проти ВСІ 11Т1А
Номер 585 Послідовність-мішень 5-23" Послідовність ЕМО (М-»С) (екзон) 101291 сСОСТООССАСТОССАбАТ ва. | МІМ-МСа-МмМ-ММм-ММ-НО-МІ-ММ-Мае-ММ-но- (екзон 2) ФЕО ІЮ МО:236 НО-МІ-ММ-МІ-Мах (ЗЕО 1Ю МО:237) 101292 ССОАТАААААТААОААТх |! НО-МІМ-МІ-МОЕ-МІ-МІ-МІ-МІ-МІ-Ме-МІ-МІ-ММ- (екзон 2) ФЕО ІЮ МО:238 МІ-МІ-МЕ(ЗЕО ОО МО:239) 101301 АаАСТССТТСССАСССАССТе | МчМ-Ма-но-но-ма-ма-но-но-НоО-МІ-МІМ- (екзон 4) ФЕО ІЮ МО:240 НО-НО-МІ-НО-НО-МО(ЗЕО ІЮ МО:241) 101304 РІТАААОСОСТТАТТОТе МСИ-МІ-МІ-МІ-ММ-ММ-Мм-ММ-Ма-Мма-МІ-Ма- (екзон 4) ФЕО ІЮ МО:242 Ма-ммМм-Ма(зЕО ІЮ МО:243)
І0207| Пари ТАГЕМ, показані вище, були введені в клітини і продемонстрували розщеплюючу активність. Пара 101291/101292 дала 0,8 95 інсерційно-делеційних мутацій, як виміряно за допомогою аналізу Се!-1 в клітинах К562. Пара ТАГЕМ 101301/101304 дала 35,7 90 інсерційно-делеційних мутацій в клітинах СО34-, і була виявлена за допомогою аналізу КТ-
РСЕ, описаного вище, щоб спричинити підвищення експресії гама-глобінової мРНК приблизно в 2,31 рази. (0208) Пари 2ЕМ також були одержані для спрямованої дії на частину "ХІ" в сплайс-варіанті
ВСІ1А-ХІ. Ці білки перевірялись на клітинах К562, набір репрезентативних даних показаний нижче в Табл. 10. Ізоформа "ХІ" ВСІ 11А містить З додаткових природних «цинкових пальці» (пальці 4-6), таким чином, підхід включав руйнування гена ВСІ1ТА в цій ділянці, щоб спричинити розгортання потенційно «цинкових пальців» 4, 5 та/або 6 і їх комбінацій (номери від 1 до З в ділянці ХІ). Також 2ЕМ були розроблені, щоб уникнути розщеплення спорідненої генної послідовності ВСІ 118. Одна пара 2ЕМ, 44888/44889, спрямована на четвертий «цинковий палець» ВСІ 114А, тоді як дві пари, 44904/44905 і 44910/44911, спрямовані вверх на четвертий палець (номер 1 в ділянці ХІ), а дві інші пари, 44946/44947 і 44945/44944, спрямовані на п'ятий палець (номер 2 в ділянці ХІ). Ці білки перевіряли на клітинах К562, набір репрезентативних даних показаний нижче в Табл. 10. Дві з пар 2ЕМ містили нові лінкерні послідовності між ДНК- зв'язуючим доменом 2ЕР і нуклеазним доменом ЕоК1. Пара 44904/44905 містила лінкерну послідовність І 7а (див. патентну заявку США Мо 20090305419), а пара 44946/44947 містила лінкерну послідовність І 8р, обидві наведені нижче. Див. також попередню заявку США Мо 61/871219:
Ї а: НТКІНІ ВаБОЇ МКОКЗЕААДАВ(ЗЕО І МО: 244)
І вр: НТКІН ВЕЗМАРМРРІ АГА5Р (5ЕО І МО:245).
Таблиця 10
Активність пар 2ЕМ, специфічних до ХІ ВСІ 11А
Пара 2ЕМ до інсерційно-делеційних мутацій, К562 44889/44888 35,14 44905/44904 25,45 44911/44910 36,43 44945/44944 24,03 44947/44946 34,22
І0209| Пари ХІІ. ВСІ 114, перевірені на клітинах СОЗ4, є активними. Вимірювання експресії гама-глобіну показує, що модифікація ХЇ ВСІ 11А приводить до збільшення експресії гама-
Зо глобіну відносно альфа-глобіну.
І0210| Додаткові пари КІ РЕ1-специфічних 2ЕМ були перевірені з приводу активності в клітинах СОЗ4, а ці клітини були проаналізовані з приводу будь-яких змін в експресії гама- глобіну. Набір репрезентативних даних показаний нижче в Табл. 1Е.
Таблиця 1:
Активність КІ Е-специфічних пар 7ЕМ . Фо інсерційно-делеційних | Кратність збільшення (02111) Співвідношення мРНК, що кодують у-глобін і В-глобін, після обробки ВСІ 11А- або
КІ Е1-специфічними нуклеазами в НеС визначали в різні моменти часу до 17 днів після введення 2ЕМ за допомогою аналізу Тадтап, а рівні мРНК бетаподібного глобіну також нормували до рівня 185 рРНК. Рівні експресії гама-глобіну підвищувались в тих клітинах, які були оброблені ВСІ 11А- або КІ Е1-специфічними нуклеазами (Фіг. 5). Аналіз проводився згідно зі стандартним аналізом Тадтап згідно протоколу та із застосуванням геноспецифічних аналізів, що постачаються виробником (Арріїей Віозувіетзв). (0212 ВСІТ1Т1А 0 2ЕМ-модифіковані клітини також аналізувались для визначення співвідношення у/ВД мРНК як між клітинними популяціями, в яких одна алель була модифікована за допомогою 2ЕМ ("Вб"), так і клітинами, в яких обидві алелі були модифіковані за допомогою
ЕМ Снокаутовані"), і диким типом (ВВ. 0213) Як показано На Фіг. 6, співвідношення у/В мРНК відрізняється між клітинами, в яких нокаут ВСІ 11А зустрічається тільки в одній алелі (Вр, смуги 6-10 зліва) або коли нокаутовані обидві алелі (нокаут, крайні справа 5 смуг, смуги 11-15 зліва), і обидва пули клітин відрізнялись від дикого типу (ВВ, перші 5 смуг).
Приклад 7: Модифікація регуляторної ділянки гена гама-глобіну (0214) При іншому підході, щоб збільшити експресію гама-глобіну, мутації були здійснені в регуляторній ділянці гена гама-глобіну, щоб імітувати мутації СПФГ (див. Фіг. 9). Нижче показана ділянка від -202 до -102 відносно АТО в гені гама-глобіну. На цій послідовності сірі бокси вказують ділянки, які були показані, щоб зв'язуватись з СПФгГ, а підкреслена послідовність, яка при видаленні також була зв'язана з СПФГ (див. А ЗуПарив5 ої ТпаІіаззетіа
Миїайоп5 (1997) Бу Тпив Н.У. Ниіїзтап, Магіаппе Е.Н. Сагмег, і ЕгоЇ Ваузаї, опублікована Те зіскІеє Сеїї Апетіа Роипаайоп іп Аєдивіа, СА, БА. Соругідвні Ф 1997 Бу тив Н.У. Ниїзтап): -202
СССТТССССАСАСТАТСТСААТаСАААТАТИАТСТСТаАААСсООССТ ТТ оССТааСтТАААСТоСАССС
Адтасатт сабсттасстТТаАССААТАаССТТОаАС(ЗЕО ІЮ МО:132)
Коо) -102 0215) Нуклеази були розроблені, як описано в Прикладі 1 і показано в Табл. 1А, щоб зв'язуватись в ділянці цих СПФГ-асоційованих мутацій і індукувати мутації в ділянці дикого типу.
Відсоток відредагованих алелей, визначений (96 МНЕ.)) в клітинах К562 за допомогою аналізу
Сеї І (див. Реге? еї аїЇ (2008), там же), показаний нижче в Табл. 2. Крім того, деякі пари були випробувані в клітинах СОЗ34-, як описано вище, і проаналізовані за допомогою секвенування
МізЗед, як описано вище. Для деяких пар, клітини аналізували з приводу будь-якої зміни в експресії гама-глобіну. В Табл. 2 нижче показані репрезентативні набори даних.
Таблиця 2
Редагування пар 2ЕМ, специфічних до гама-глобіну (локалізація) кб5бва2 СОз4 гама мРНК о з4360/34363(-175) | 839 | ( о 34398/34400(-175) | 54 | ( о 34539/34574(-410) | .ЙиИиИ///С/С|7771111451 17711111 5З8ХС2шщС (азвб5/43852(-110) | 70/77 БвиЗ 11111111
Перші три пари, перевірені в цьому аналізі, спрямовано діяли на ділянку біля -175 в гама- промоторній ділянці, в той час як дві останні спрямовано діяли на ділянку -110 в гама-
глобіновому промоторі. (0216) Гама-промоторну ділянку в клітинах К562, яка була відредагована, секвенували для аналізу утворених мутацій. Ділянку спочатку РСК-ампліфікували, а потім РСК-продукти секвенували, спостерігалось декілька різних мутацій, в тому числі делецій і вставок (Фіг. 8). В цьому експерименті, 4295 алелей мутували, а 20 956 несло 13 п.о. делецій від -114 до -102, асоційованих з СПФГ. 02171 Дві пари 2ЕМ, спрямованих на гама-глобіновий промотор, також були використані для обробки клітин в комбінації з олігонуклеотидним донором, розробленим для відновлення найбільш розповсюджених мутацій у суб'єкта з СПФГ. Той самий протокол, описаний вище для використання з пристроєм ВТХ, був здійснений з додаванням З мкл 100 мкМ розчину донорського олігонуклеотиду. Послідовність олігонуклеотидних донорів показана нижче. Як правило, в цих експериментах застосовували прямий олігонуклеотидний донор, але й зворотний працював добре:
Нва а13 прямий: асасіаїсісааюдсаааїаісідісааасддісссіддсіааасіссасссадданддссадссідссідасааддсааасндасса агадіснададіаїссадаюадассада (124тег, ЗЕО ІЮ МО:246)
НВО а13 зворотний: ссіддссісасіддаїасісіаадасіайодісаадшодсспдісааддсаадоасіддссаасссаїддадаадшадссадддас соашсадасадчаташосандадаіацдіаї (124тег, 5ЕО ІЮ МО:247)
І0218| Для пари 24ЕМ 34539/34574 в присутності донору, продукування мРНК з гама- глобінового гена підвищується в 6,38 разів у порівнянні з клітинами, обробленими вектором
СЕР, тоді як для пари 2ЕМ 31160/34365, гама мРНК підвищується в 6,13 разів у порівнянні з клітинами, обробленими вектором сЕР.
І0219| Оброблені нуклеазами НЗС висівали на метилцелюлозу. Після генотипування індивідуальних колоній за допомогою РСК-секвенування вимірювали рівні мРНК для гама- глобіну, бета-глобіну і 185 рРНК, контролю для дикого типу, а мутантні колонії - за допомогою
ВТ-РСК. (Фіг. 8). В середньому, гама-глобінові промоторні мутанти мали більш високе співвідношення гама-глобінових мРНК до бета-глобінових мРНК, ніж клітини дикого типу, а корекція з боку сигналу 185 рРНК показує, що збільшення співвідношення гама-глобіну/бета-
Зо глобіну в мутантних колоніях спричинене підвищенням рівнів гама-глобінової мРНК в цих колоніях, а не зниженням рівнів бета-глобінової мРНК.
Приклад 8: Нуклеази ТАГЕ, спрямовано діючі на гама-глобіновий промотор (0220) Нуклеази ТАГЕ також були одержані для спрямованої дії на ділянку -200 або ділянку - 110 (описані вище) промоторної ділянки гама-глобіну. ТАГЕМ були сконструйовані, як описано вище, за допомогою канонічного коду ТАГЕ і скелету "17" ТАГЕМ (див. патентну публікацію Мо 20110301073).
Таблиця З
ТАГЕМ, специфічні до гама-глобінового промотору
ЗВ5 102314. | МАТССТСТТОСОСО | МІ-МЕО-НО-НО-МО-НО-МО-Ма-ммМ-мММ-ММ-ММм-МК сс (ЗЕО 10 МО7133) (ЗО ТО МО2134) 102318 | ЛАТТТОСАТТОА СА | МІ-Ма-Ма-Ма-мМм-НО-МІ-Ма-Ма-ММ-МІ-ММ-МІ-М-МІ-
ТАСТвІ ММ-Мо
ВЕС МОг135 (ЗЕО ТО МО 136) 102315. | МАТССТСТТОСОСО | МІ-МСО-НО-НО-Ма-НО-Ме-меа-МмМ-мММ-МмМ-ММм-ММ-НО
Ссе (ЗЕО І МО:137)
ЗЕО І МО:133 102320. | ААТТТОСАТТОА СА | МІ-Ма-Ма-Ма-мМм-НО-МІ-Ма-Ма-ММ-МІ-ММ-МІ-М-МІ
ТАрі (ЗЕО І МО:136)
ЗЕО І МО:135 102316. | МЧАТОСТСТТОСОСО | МІ-МЕ-НО-НО-Ма-НО-Ме-меа-МммМ-мМ-МмМ-ММм-ММм-НО-
ССсесе но
ЗЕО І МО7ЗЗ (ЗЕО ТО МО 138)
Продовження таблиці З 102321 | хАТТТОСАТТОСА СА | МІ-Ма-Ма-Ма-мМм-НО-МІ-Ма-Ма-ММ-МІ-ММ-МІ-Ма
Та» (ЗЕО І МО:139)
ЗЕО І МО:135 102566. | пт СО ССАОСсСтТТОсС | МО-мМ-ММ-НО-НО-МІ-ММ-НО-НО-Ма-ме-МммМ-но-нНО- (-110) СТТОас(зЕО Іо Мма-Мма-МмМк(ЗЕО ІО МО:249)
МО:248 102568 | аССТСААСсСТТТОСсС.СИ ММ-ММ-Ма-нНно-МІ-МІ-ММ-Ма-ма-ма-МмМ-нНо-нНО-Мма- (-110) ТТОТт са (ЕО І Мма-МмМ-ма (5ЕО О МО:251)
МО:250 (0221) ТАГЕМ потім застосовувались в парах для тестування розщеплення в клітинах К562 і аналізувались за допомогою аналізу Се! 1, як описано вище, а результати пар показані нижче в
Табл. 4. Крім того, пара ТАГЕМ 102566/102568 тестувалась проти клітин СОЗ4»-- і виявила 51,39
Фо МНЕ), як виміряно в аналізі Мізед. (0222| Дві пари ТАГЕМ також тестувались з приводу експресії гама-глобінової мРНК, виміряної у вигляді співвідношення гама-глобінової МРНК до альфа-глобінової мРНК. Пара 102566/102568 збільшувала гама-глобінову експресію в 6,25 разів у порівнянні з клітинами сОрз345, обробленими вектором ОЕР, а пара 102318/102314 збільшувала гама-глобін в 2,14 рази у порівнянні з клітинами СО34ж, обробленими вектором СЕР. Пару102566/102568 також перевіряли з олігодонором, описаним вище, причому було виявлено, що одержані клітини підвищували гама-глобінову експресію в 9,13 разів у порівнянні з клітинами СОЗ4к, обробленими вектором СЕР.
Таблиця 4
Редагування ділянки гама-глобінового промотору за допомогою ТАЇ ЕМ
Приклад 9: Гама-глобінове редагування в стовбурових клітинах СО34-- (0223) Нуклеази, специфічні до гама-глобінової промоторної ділянки, потім застосовували в клітинах СОЗ34-, одержаних від пацієнта. Клітини обробляли нуклеазами, а потім аналізували з приводу успішного редагування за допомогою аналізу Се! 1. Клітини додатково були проаналізовані з приводу співвідношення гама-глобіну до бета-глобіну і демонстрували підвищену експресію гама-глобіну. Репрезентативні дані, виявлені для підвищеної експресії гама-глобіну, знаходяться в експериментальних параграфах для різних підходів вище.
Приклад 10: Редагований енграфтмент СОЗ4- у мишей
І0224| Оброблені нуклеазами клітини СО34- (людські стовбурові клітини-попередники
НЗРС) зберегли здатність приживлятись у мишей МОБ/ЗСІЮЛІ2 гама(нуль) і приводити до виникнення поліклонального мультилінійного потомства, у якого гени, що беруть участь в регуляції гама-глобіну, постійно руйнуються (див. Ної еї аї, (2010) Маї Віоїесппої. Ацо9;28(8):839- 47). Аналогічно, СЮОЗ34-- або Н5РС, редаговані в локусі бета-глобіну, де мутація скоригована, або донорський бета-глобіновий ген вставлений в локус «затишної гавані», або які оброблені
Зо нуклеазами, щоб змінити експресію гама-глобіну, здатні приводити до мультилінійного потомства, що несе бажане геномне редагування. Демонстрація того, що меншість відредагованих НеРС може заповнити відредаговане потомство тварини підтверджує використання нуклеазомодифікованих аутологічних гемопоетичних стовбурових клітин як клінічний підхід до лікування гемоглобінопатії. (0225) Всі патенти, патентні заявки і публікації, згадані в даному документі, включені до даного опису шляхом посилання у повному обсязі.
І0226| Хоча опис винаходу наданий більш детально шляхом ілюстрацій і прикладів для ясності розуміння, фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що різні зміни і модифікації можуть бути здійснені без відступу від суті або обсягу розкриття. Відповідно, наведені вище опис і приклади не повинні розглядатись як обмеження.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ЗАМОАМО ВІОБСІЄМСЕ5, ІМС. «1202 СПОСОБИ ТА КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ГЕНЕТИЧНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ «13502 33725-0099.40 «1402 РСТИО52033/057214 «1315 2013-08-29 «150» 51/694,693 «151» 2012-08-29 «160» 258 «170» Ратенів уегмоп 3.5 «21051 «2115102 ка» ДНК «2132 Ното заріепь «МИ» 1 савасассвє виївсасств асіссівіде авааністесснцчаснсссівіввввса 60 авріразсні риаіразви рвінрідарк сесірирсар нії 02 «81022 «2115102 «2122 ДНК «2132 Ното 5арієпь «да 2 сарасавссаї ввівсассів асісствавн анзавіствссвЧасрсссііввивса 60 евяіявасні кваінавви євівніаня сестнвесве ві 102 «2102 3 «312102 «2125 ДНК
«213» Ното 5арієп5 «400» 3 сававсассаї реівсвісів асісстязер араавасівс їрісааївсс сіїререса бо зарірдазсеї резірсавц вріреїкаве сссірдесар ві 102 «210254 «2115101 «212» ДНК «213» Ното зарієпе «400» 4 сірасастві арірсв?янє асівстраса арааеврсінсірссассарссірірависа БО авріавеві вавзависія враррірараї істряесаввії 101 «21055 «211» 102 «2125 ДНК «213» Нота зарієпе «005 5 сіресвісаі ввівсайНі асірсіваве зразвввсівс свісасіаис сірівравса БО зЕВіравіві яравизЕвстї врарвівази сс евесав ві 102 «21056 «2115102 «212» ДНК «213х Ното 5аріепь «А» 6 садасессаї врррісаіс асаварнарр зсзаррсіасізісасаарссіріррврса 60 веріравіві врааратесї прарравава ссстврраае вії 102 «21027 «211» 102 «212» ДНК
«2132» Ното 5арієп5 «40057 савасессаї реВісацнЄ асзваввравр асаверстає 1аісасварс сівівевеЕса бо авріразіві вравваїрсї вварварава сосірревар ві 102 «2105 8 «211528 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності: синтетичний олігонмнуклертид «4005 В вЕБСаріває ввсавастіє їссісвЕВ 28 «210» 5 «21127 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 5
Азр Аге бег Ап іви 5ег Аге 1 5 «210510 «21157 «2125 РКТ «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 10
Сів бег 5ег А5ріви Ден Атр 1 5 «210511 «211257 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «800511
Агр бег Абр Тег ви бег Аїд 1 5 «210512 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 12 сій 5ег біу Аа ви Аа Аг 1 5 «210513 «21157 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид к«а00» 13 сп бег БІуУ Азрі ви Тг Атв 1 5 «210514 «211» 28 «21223 ДНК «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «8005 14 їЇврЕвсСавее ївзасвівва ївзавця 28 «210515 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 15 сій 5Зег Аа Ні Аг Гу Ап 1 5 «210516 -21157
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005 16
Геціух Ні Ніз (ей ТВг Ар 1 5 «210517 «211257 «2122 РКТ «2132 Штучна послідавність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «в00»17 сій Атв 5ег Азп бе ма! Ате 1 З «210515 «21157 «2125 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400518
Тит бек Су Ні Гец бег АгЕ 1 5
«2122 РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400519
Сів 5ег Аза Ніх ев ТА бір 1 5 «210520 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 20
Ате 5ег Ні Нізігиц і ух Дів 1 5 «810521 «211528 «2122 ДНК «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400521 акавісаряї рсассаїнрі вісіяци В «210522 «21157 «2122 РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400522
Ти Авп бів Азо Ате Це ТБ 1 5 «210523 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 23
Авр Аге бег Аза Аг ТА ТТГ 1 5 «210524 «21157 «2122 РЕТ «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 24
Атв Ап. Аа бег Агв ТАг Аге 1 5 «2105 25 «21157 «212» РТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400525
Агв бег А5р Ап ви 5ег сій 1 5 «2105 26 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 26
Аге бег біп Ніз Ага Гуз ТВГ 1 5 «210527 «2115 28 «2125 ДНК «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеротид «8002527 вірЕЗзеааві сірссрцасівсссвї 28 «2105 28 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005 28
Тр Бег сіу бегівц бат Аге 1 5 «210529 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4002 29
Азр Аге бЗег АзвВієу 5ег Аг 1 5 «2105 30 «21157 «2122 РКТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид к«адО» 30
Ар Аге бег Аіа | ги Дів Аге 1 5 «2105 31 «921157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4000» 31
Сіп бег 5ег Азпіви Аа де 1 5 «210532 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 32
Сів Зег бі Ніхіез 5ег Ате
1 5 «2105 33 «211528 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігануклеотид «4005 33 асарвавіса врірсассаї ввінісіе 28 «2105 34 «21157 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 34
Абр біп бЗег Азпівц Аг Ай 1 5 «2105 35 «21157 «2122 РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 35
Ате бег Азр Ніх ги ТА бів 1 5 «210» 36 «211528 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «а00» 36 рарзавісів сс асірс ссівіврве 28 «210537 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400537
Аїв Аге 5ег Тиг Аге Тит Аз 1 5 «2105 38 «21157 «2122 РЕТ «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 38
Азр Агв бег Ада Атв ТНг Аге 1 5 «2105 39 «21157 «212» РВТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400539
Сів бе СІ Азпіви Аа Де 1 5 «210» 80 «211528 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2920» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400» 80 їзаасвяисава си стссаса врарісав 28 «2105 81 «21157 «212» РВТ «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 81 5ег 5ег 5ег Абр АДге ув | ув 1 5 «2105 82 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 82
Сів 5еї Аа Ар Агв ТНе Гу 1 5 «2105 83 «211528 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400» 83
ВоССІВІвЕВ Есазвнівва свіввате 28 «2105 44 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а0О» 44 іецАге Ні Ніз Гец ТВг Аге 1 5 «2105» 45 «211257 «2122 РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «800» 35
Оп бЗег біу Азпіви Ні Ма 1 5 «210546 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 486
Атв 5ег Аа Ніхїец 5ег АгЕ 1 5 «210547 -21157
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400547
Атв бег Ар Майї го 5ег ТИ 1 5 «2105 48 «211257 «2122 РКТ «2132 Штучна послідавність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «ад» 45
Агвіу5 біп Азрієц Аге ТЕ 1 З «210549 «21157 «2125 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 49
Меї бак Нів Ні ей Аг А5р 1 5
«210» 50 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний олігомуклеотид «400550 сасавервсав їаасевсава СИСІССЇ 28 «2105 51 «921157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «00» 51
Азр Аг Зег Ні тей ТА Аг 1 5 «210552 -21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400552
Дте бег Ар Азпіви Аге Ов
1 5 «2105 53 «211528 «2122 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігануклеотид «400» 53 рЕСВаревїва асвівраїва ав ввів 28 «2105 54 «921157 «2122 РК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «айО» 54
Сп бег біу Ніх Гез Ав Аг 1 5 «2105 55 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 55
Уа! бе Ні5 Ніх Ге Аге Ар 1 5 «2105 56 «211528 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «а0О» 56 аїсссаїрва варріресів вразврвас 28 «210557 «211257 «212» ВТ «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «00» 57
Ате 5ег Азр Ма 1 ги 5ег бі 1 5 «2105 55 «21157 «2122 РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 58
Атв А5побів Ні5 Атр Ї у5 Тв 1 5 «2105 59 «21157 «212» РТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400559
Агв 5ег Ар Нізі ви б5ег Ав 1 5 «210» 60 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «аА00» 60
Аге 5ег Аа Ази Гей Тк Ав 1 5 «210» 1 «21157 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «а00» 61
Агр.бег Ар Уа і ги бег Ап 1 5 «210562 «211257 «2125 РКТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «800» 62
Ар Агр бег ТНг Агев Це ТВг 1 5 «2105 53 «2115258 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 653 ага рсава савіаасссстйавссї 28 «2105 64 -21157
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а00» 54
Ні Аге бів Ніє Ге) Ма! Тае 1 5 «2105 55 «211257 «2122 РКТ «2132 Штучна послідавність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а00» 655
Авр Аге бег Аз і гу ТАг Ав, 1 З «2105 56 «21157 «2125 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 66
Ні5 Аге 5ег 5егівец Гецч Ап 1 5
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400567
Атев бег Абр Ніз 2 бе ТАг 1 5 «210» 658 «21157 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 58
Атев бег Аа Азріги бе АДЕЕ 1 5 «2105 59 «21157 «2122 РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 69
Аге бег Азр Азпіви бег сій 1 5 «2105 70 «21157 «2125 РВТ «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400570 дів 5ег Аєп Ар Агв |у у5 1 5 «210571 «211528 «212» ДНК «2132» Штучна послідовність «220» «2732» Опис штучної послідовності; Синтетичний олігонуклеотид «400571 вівсарааіа грссссвсав врташів 28 «210572 «21157 «2122 РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
Агев.бег Ар Ап і ги бег Дів 1 5 «210573 «21157 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а00» 73
Агв Ази Ап Ар Агр Гу5 ТНг 1 5 «210574 «21127 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 74
Тит 5ек бег Аа Агв ТВг 1 у5 1 5 «210575 «2115 28 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігануклертид «400» 75 вЕвВавениє ссавБесеВ! сарівівс 28 «2105765 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400576
Ар Агв 5ег Нізівги Аіа АтЕ 1 5 «210577 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «2920» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 77
Аїв 5ег1у5 Тег Аге Ту А5п 1 5 «2105 78 «21157 «2122 РЕТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а00О» 78
Аге.бег Авр Ні Ге бег СВІ 1 5 «210575 «211528 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «8002 79 зсасасвера Трасіссіс ааррівре 28 «2105 80 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «аА0О» 80
ТАг Зег Оу Ап еиц Тит Ага 1 5 «2105 81
«2125 РВТ «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 81
Сів бег Аа 5ет Агр Гу5 АвБп 1 5 «2105 82 «211528 «21223 ДНК «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «400582 сессассвре сіссерессс вавєвавії 28 «2105 83 «21157 «2122 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 83
А5р 5ег5ег А5р Аг 1 ув 1 ух 1 5
«2105 84 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 ВА
Агев бег Абр Тнг Геи бек бів 1 5 «210» 85 «211528 «212» ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400» 85 сессавассої всвсісчервс всссарсе ТВ «2105 86 «21157 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 86
Атв бег Азр зегїец ей Аг
1 5 «2105 87 «211257 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «8005 87
Агвівец Ар їгріви Рго Уа 1 5 «2105 88 «21157 «2122 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «адОо» 88
Сій бег зег А5ріеи бек Аг 1 5 «2105 89 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«4005 89
АЇв Аз 5ег Азп Аг 5ег | ух 1 5 «2105 50 «211528 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігонмнуклертид «400550
ВЕСІСВЕВЕВ ССЕВБВСІВВ авссавяв 28 «2105 51 «21127 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 51 сій 5ег ех Ніх Теги ТА Аг 1 5 «2105952 «21157 «2125 РКЕТ «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 52 сів бе 5ег А5ріви Тит Аг 1 5 «2105 93 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005 953
Ні бег Аве ТВу Атрв ТАг Гу» 1 5 «2105 54 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «А00О» 54
Аге 5ег Абр Ні Гей баг Аг 1 5 «2105 95 «21157 «212» РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид к«а00» 55
Ар Аге бег Ада Атгрв Ап 5ег 1 5 «210596 «211» 28 «21223 ДНК «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «800» 56 заррсвсїве сесірсаавсс ввівіасс 258 «210597 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400597
Сів бег Ні Ап Аге ТВг і ух 1 5 «2105 98 -211528
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігамуклеротид «4005 98
ШПесавсвсє ввсессц ер всісввов 28 «210599 «211257 «2125 РКЕТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «800» 59
Ате 5ег Азр Ніз ви 5ег бій 1 5 «2105 100 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 100
Нів Аге 5ег 5егігц Су Ар 1 5 «2105101
«2125 РТ «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 101
Агр бег Ар Арі ви ТА Ав 1 5 «2105102 «921157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «40025102 сій Агр бат Тагієео 5ег 5ег 1 5 «2105103 -21157 «2125 РКТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 103
Аге 5ег Аа Ар Ге ТАК Аг
1 5 «2105 104 «211528 «212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «8005 104 свЕЇВІВссЄ верЕСссвво вссвесс 28 «2102105 «21157 «212» РКК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «а00» 105
Ате 5ег ТНг Ні Ге Уві Аг 1 5 «2105 106 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 106
Аге бег Ар бек ви 5ег ТИг 1 5 «2105107 «21157 «2125 РТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4002 107
Ар 5ег 5ег Азо Аге Тгіув 1 5 «210» 108 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005108
Аге бег Аа Аа їв Аа Ат 1 5 «21051095 «2115 28 «2125 ДНК «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеротид «400» 109 ївсанвар атавівівре разнвевс 28 «2105110 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «8005 110
Агв 5Зег А5р Ніх Гео бек Маї 1 5 «2105111 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005111
АтеЕ 5ег Авр Уві Агр Гу ТАг 1 5 «2105112 «21157 «2122 РКТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 112
Агвбзег Азр Тугієви бег Гу 1 5 «2102113 «211257 «2125 РКТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «00» 113
Тну бек бег Уаї Ага ТНг Тиг 1 5 «2105114 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «27232» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00з 114
АДтв Рго Тут Пн іец Аг і ги 1 5 «2105115
«2125 РВТ «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 115 сів Ази Аа ТВ Атв Ті у 1 5 «2105115 «211528 «21223 ДНК «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «40025115 аісівісіва аасерісссї весіааає 28 «2105117 «21157 «2125 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4002117
Аге. Ага Ар Не їец Ні ОН 1 5
«210» 118 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005118 іец дів Ту Ар Аге Аге Гук 1 5 «210» 119 «211528 «212» ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400» 119
Шевсацва ватарірівр враавеве 28 «210» 120 «21157 «212» РВТ «213» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 120
Ой Зег Сух Аа АгеЕ Азп Уа
1 5 «211257 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 121
Агр бег Ар Ахпіви Дів Аге 1 5 «2102122 «21157 «2122 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «а00» 122
Ні Аге Авп Тигієвц Гео біу 1 5 «2105123 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 123
Меї Аг Азп Агв Гец Ап Агр 1 5 «2105124 «211528 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «400» 124 сівістраза севісссіре ствавсіс 23 «21025 125 «211257 «2122 РЕТ «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 125
Ате Аги Ахр Аве ви Меї 1 5 «2105126 «21157 «2125 РЕТ «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 126 іп Ап Аа Ні Аг Гу ТТГ 1 5 «2105127 «211528 «217» ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності: синтетичний олігонмнуклертид «4005127 їаййесєві раваїарвіві вреразвев 28 «210» 128 «21127 «212» РВТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а00» 128 ігои зі Ніх НізТви Тг А5р 1 5 «2105129 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 129
Ту Бег ТвВг Ні еу Ні Це 1 5 «2105 130 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 130
Нів Гу5 Тер Маі Гей Агр Сп 1 5 «2105131 «21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005131
АтеЕ Ага А5р Дів г еч ви Меї 1 5 «2105132 «211597 «212» ДНК
«2132» Ното заріеп5 «4а005 132 сеспсссса сасівісіся аїрсаваїзі вісіствзав серісссівр стазасісса БО сссаїревії ввссцессі трассватав сон вас 37 «2105 133 «211517 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігонмнуклертид «дО» 133
ВІВІССТСН ВЕЕВВСС 17 «2105 134 «211513 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 134 агент тт 13 «2105135 «211521 «2122 ДНК «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид
«4005 135 зів всагіввеВвіавірі 21
«210» 136
«211517
«2125 ДНК
«213» Штучна послідовність
«220»
«223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид
«адО» 136 айцігсант агаїат 17
«2105137
«211514
«212» ДНК
«2132» Штучна послідовність
«220»
«223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид
«400» 137 асеасци те 14
«2105 138
«211515
«2122 ДНК
«2132 Штучна послідовність
«2205
«2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид
«400» 138 аіссіснит гегос 15 «210» 139 «211514 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «4005 139 ашігсантакаї 14 «2102 140 «211551 «2122 ДНК «13» Ното зарієпе «400» 140 веиссавсси восивасса агарссі ра сааресазас Крассавіа 8 зі «2105141 «2115 50 «2122 ДНК «2132» Нотео зарієп5 «4005141 вЕСсСВЕССИ ВССИвасса тавссірас ааресазасі ївассвзатає 50 «2105142 «211547 «2122 ДНК «2132 Ното зарієп5 «4005 145
БЕссВаВссИ росі ааівае сс расвар ясавасіяв ссавіав 47 «2105 143 «211» 85 «2122 ДНК «2135 Нота заріеп5 «доз 143 рЕСссвЕСсси сс рассс васавеврс вазсирасс азіав 45 «2102 144 «211» 85 «21223 ДНК «2132 Ното 5арієпо «дО» 144 вЕССВЕССН ЕС васса аїавсавевс заасивасс азіав аб «2102 145 «211» 38 «2122 ДНК «2132 Ното зарієп5 «а00» 145 вЕСсавссИ восивасаз висавасив ассавіай зв «2105146 «2115 51 «2122 ДНК «2132 Ното зарієп5 «8002 146 вЕссавссі восивасса заїавссів асвавесааа сірассаає а 5і «2105147 «2115 51 «2125 ДНК
«2132» Ното заріеп5 «4а005 147
ВессавссН вссИвасса аїарсарссії Теасзавеса авсирвасса з 51 «2105 148 «211551 «2125 ДНК «213» Ното заріеп5 «а» 148
ВЕсСсСаВссИ СС еЕВсса таравівро Си васавев савастевє с Бі «2105 149 «21151965 «21223 ДНК «2132» Ното 5арієепо «дО» 149 їакстіавзаре газваагава Чаравававз асіревагра сівазісреа асазерсаза 50 вЕстатваза вавацавса віаїссіст вевввсссстіссссасасі аісісвациє 120 аазівісіві сівааасеві сссіресіаз асіссассса рев Нррссавссцвосї 180 ївассватад сснва ї9е6 «2105 150 «2115 200 «2125 ДНК «2132 Ното зарієп5 «4005 150 тавстававе вавеватава Чававаааа ацевавіка сірааісвра асааввсала 50 рЕсіаїзаза завайаавс арсарівіссіспПрреввссссіпсссса сасізісїса 120 аесаватаї стрісівааа серісссіве ставасісса сссатривіївЕссарссй 180 вссипвасса віавссн ва 200 «2105151
«211» З00 «2125 ДНК «213» Ното заріенп5 «400» 151 сваресвавспевссазьа ріЕсчавнаві аїссарірар вссавевесс весеесірес 50 їарвраївза газагазазее аавсвсєсії сзесавійссзсасасісрс Нсвваасв 120 іїсівзернНа їсазвізарсі ссіавіссав зсессаївре свійЯсазсаравеввраса 180 акесіасіаї сасзавссів їврерсазервіваагрівва аваівсірва вваваавссс 240 їврезаврета весісірвів ассазевасва дерареразе вазврасссі вівссірвсв -З00 «2105 152 «211» 300 «21223 ДНК «2132» Ното 5арієепо «дО» 152 свавесвавс певссвага вістававі аїссарівар вссарееесє ввсевсівес 50 їТавеваївва раагааааре ааксасссії савсавіссасасасісвс псівнааск 120 їсіввевіїа їсазіаавсі сставіссар асессаєввв св ітсвса вадвавраса 180 аврсіасіаї саєзавсств (рревсааве ісааівірва арафвстрра врававассс 240 їбрЕзаввіа ресісірвів ассаЕрасва верарЕраав рааррвасссі вівссіввсва З «2105153 -21157 «2125 РКТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 153 сій бег іу ТНг Агр Гу5 Те
1 5 «2105 154 «211257 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 154
Агр бег Ар Ахпіви бе Те 1 5 «2102155 «21157 «2122 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «а00» 155
Азр 5ег Аа Азп Аге Пе Гу 1 5 «2105156 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 156
Аз Меє бій Тигієец Аге Ма! 1 5 «210» 157 «21157 «2125 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005157
Атгв Ап 5ег Ар Аге Тигру 1 5 «210» 158 «211528 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 158 зісзаввіса саавасавві йаарвав 28 «2105 159 «211528 «2122 ДНК «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4а005 159 заїсівссса рерссїсавсс зссаасії 28 «210» 1650 «211528 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «адО» 160 сіссавваре гевісаїває сіссісяс 28 «2105161 «211257 «2122 РЕТ «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «00» 161 іги Агв. біп Азп г ец Пе Меї 1 5 «2105162 «21157 «2125 РКТ «213» Штувзна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 162
Тпу 5ег Ав Ахп і ен ТАг Уа! 1 5 «2105163 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 163
Ой Аге Аеп Ар Агв 1 уз бек 1 5 «210» 164 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 164 івги ій 5ег біп ей Абп Ав 1 5 «2105165 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 165
Азр Агв Аг Ахпіви бег Ага 1 5 «210» 166 «211257 «2122 РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 166
Тну 5ег бег Ап Агев Азп Ні 1 5 «2105167 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «8002167
Ні бег Біу Абп Ге Те ух 1 5 «2105168 -21157
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4а0О5 168 іп мує Уві Ар 1 ви 5ет Аге 1 5 «2102 169 «211257 «2122 РКТ «2132 Штучна послідавність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «а00» 169 сій Аіа Азп А5півціуз Уді 1 З «2105170 «211528 «2125 ДНК «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «а005 170 сссавсриес свірвісіре їсаїсає 28 «2105171
«2125 РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4002171
Атгв Бег Азр бегіеи 5ег Аг 1 5 «2102172 «921157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4002172
Авр Аге Зег Ма Аге ТВгіуз 1 5 «2105173 -21157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005173
Сій Агро 5ег Азпівц ух Уа
1 5 «211257 «212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «дО» 174
Агв 5Зег Ар Ніз Гео т ТАг 1 5 «2102175 «21157 «2122 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «200» 175
Тр Аа Тр Аа Аге Абр Аге 1 5 «2105176 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 176
Ніх Тиг і у бегієец бег Ат 1 5 «2105177 «21157 «2125 РТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4002177
Агр бег АЛіа Ніх Ге ТНе бій 1 5 «2102178 «21127 «212» РВТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005178
Д5р Аге бег Ма і ви Аге Ат 1 5 «2105179 «2115 28 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігамуклертид «400» 179 аізвнрсарва савіаасссс тгавесі 28 «2105 180 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 180
Ні5 Аге Тгрівц Агр 5ег Аби 1 5 «2102181 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005181
Авр 5ег 5ег Ні Аге ТАг Агв 1 5 «2105182 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 182 сів бег Аа Ні Гец Туз Аа 1 5 «210» 183 «211528 «212» ДНК «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «дО» 183 сісасівісс асарезеаав ссасасяр 28 «2105184 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 154
Агев 5ег Аа Азп ів Аа Аг 1 5 «2105185 «21157 «2122 РЕТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4а005 185
Атгвіви Азр Аза Аге Те Аа 1 5 «2102 186 «211257 «2125 РКТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 186
Сіп Зег Азп Арі Ап бег 1 5 «2105187 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «а005 187
Тер Агв 5ет 5егівци 1у5 Тк 1 5 «2105188
«2125 РВТ «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 188
Авр Аг 5ег Ап Аг Гу Те 1 5 «2105189 «211528 «21223 ДНК «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклеотид «40025189 песіасарі їсЧезаваєс пшсссас 28 «2105190 «21157 «2122 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «40025190
Тут ух Ні Ма! 2 и 5ег Ар 1 5
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «до» 191
Ту бег бу Бек ів ТІ Аг 1 5 «2105192 «21157 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 192 іецйіу5 Азр ТНг г еч Аге Аг 1 5 «2105193 «211528 «2122 ДНК «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 193
Бавзарссас асяресвава вессицаї 28 «2105 194 «21157 «2122 РЕТ «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 194
Сів бе Су Азпіви Дер 5ег 1 5 «2105195 «211257 «2122 РКЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4000» 195 сій Азп Аа ТАт Аге Не Аби 1 5 «2105 196 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 196
Тер Ап 5ег А5рієу Аг | у 1 5 «2105197 «211528 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігонмнуклертид «4002 197 іїврасаріва вайрстаса вису ва 28 «2102 198 «21127 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005198
Тугіух Тер Тгіви Аве Ази 1 5 «2105199 «21157 «2125 РКТ «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «400» 199
Тит бе ТВг ух еи Аге ТВг 1 5 «2105 200 «211528 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклертид «АдО» 200 рссасасрер сваавевссії їаїзааір 28 «210» 201 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005201
Аге бБег Ар Тит Геи бек Те 1 5 «2105202 «21157 «2122 РТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 202
Ар баг баг Ачп Ате Не Аа 1 5 «210» 203 «211528 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «4адО» 203 сіссіртрва савієвЕвії всгасвеї 28 «2105 204 «21157 «212» РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 204
Аза Азріви Ре ецч Тугієн 1 5 «2105 205 «21157 «2122 РКТ
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005 205
Агр.бег Азр бек ви Зег Уві 1 5 «2102206 «211257 «2125 РКТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 206
Ні5 Ап Ар бег Агр Гуз Ап 1 5 «2105207 «2115258 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «8002207 аавсісасса весасаїрааз азсесаїв 28 «2105 208 -21157
«212» РЕТ «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4А0О» 208
Суб Ате біп Азп і ве Аа Ап 1 5 «210» 209 «211257 «2122 РКТ «2132 Штучна послідавність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 209
Туг бій су Ма ео Ти Ат 1 З «2105210 «21157 «2125 РЕТ «2132» Штувзна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4002 210
Ніз Агр 5ег 5ег ев Аг Ате 1 5
«211528 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний олігомуклеотид «400» 211 сізвсісірее свсаресиа ви рсага 28 «2102212 «921157 «2122 РЕТ «213» Штучна послідазність «220» «223» Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4002212
Атге 5ег Азр Аа 1 еи бег бін 1 5 «2105213 «211528 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 213 сісассаврс асаїваавас всвіресе 25
«212» РЕТ «213» Штучна послідовність «2205 «2235 Опис штучної послідовності: синтетичний пептид «4005214
СУ Зег ек АЇв Геи Те бій 1 5 «2105215 «21157 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «400» 215
ТА Аїа 5Зег Ніз Гец 1у5 Ой 1 5 «2105 216 «21157 «2122 РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005216
5ег 5ег Агя Азпіви Ав бег 1 5 «2105217 «21157 «2125 РВТ «2135 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005217
Тпу бег Аа Абп і ев 5ег Аге 1 5 «2105218 «211528 «212» ДНК «2132» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «400» 218 рЕЇвакраре аваїссаррії єссарвів 28 «2105 219 «21157 «2122 РЕТ «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид
«400» 219
Азп Ап Аг А5рієи Пе Ап 1 5 «2105220 «21157 «2125 РТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «АдО» 220
Твк Бегбег Абпіво бег АгЕ 1 5 «2102221 «21127 «212» РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005221 сій Аге Тк Нізієц Ап 5ег 1 5 «2105229 «2115 28 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігануклеотид «4005222 сИпсісвевс ссврварссср рірвЕсеся в «2105223 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005223
Агв і у5 5ег Ар Аге Це у» 1 5 «2105 224 «211528 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «2920» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 224
ТЕрісааввс зависіявсе аассстня 28 «2105225 «211528 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігамуклертид «400» 225 вссНвасва врсавасіїв ассзаєав 28 «2105226 «21157 «212» РЕТ «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «4005226
Сів 5ег Су зег ви Тит Ат 1 5 «21025227 «21157 «2122 РВТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005227
АтгеЕ Зег А5р Ап ви 5ег Уді 1 5 «2105228 «21157 «2125 РТ «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 228 ів ух Ріє АЇв Гец АЇз Ап 1 5 «2105 229 «211257 «2122 РЕТ «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «400» 229
Ап Рго Аа Азп Ге Твг Аг 1 5 «2105230 «21157 «212» РЕТ «2132» Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «8002 230
Ар 5ег 5ег Дів Аг Гу і уз 1 5 «2102231 -2115 39
«212» ДНК «2135 Нота зарієп5 «400» 231 ассаірвівс ассірасіссірарезезав ІСТЕССВИ 39 «2105 232 «2115 39 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігонмнуклертид «4002 232 ассвірвідс айїсівасісстірвверавзава врсестнір 39 «2105 233 «211» 88 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 233 свисаєси рссссасаве всаріаасав савацінссісарварісверінсасса 60
ТЕВІВІСІВІ Аракицвставівзас ва «2102 234 «2115 88 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігамуклертид «адо» 234 свисассії вссссасаре рсавіазсвр саванйнс сісарвавіс агрірсасса 6о0
ТвВЕріСТвЇ Нраввцтес тавІвзас 58 «2105 235 «2112101 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний полінмнуклеотид «800» 235 сисаїссає вїсассте ссєсасавев савтавсаврс веві сс їсавеавіса БО
ЕЕЇЕСВОСВІ ВВІВІСТеН трарецесї авівваєвса НИ «2105236 «211520 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 236 сіріревсав ірссаваїра 20 «2105237 «211516 «2125 ДНК «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеротид «400» 237 ггттсагіу ссагаї 16 «2105238 «211520 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «92232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклертид «4АдО» 238 сісватаваа вівавазірі 20 «210» 239 «211517 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «2205 «2212 модифікована основа «222»1161,.(16) «223» 8а,с,КОгЕ «4002 239 стаїзававі аагаапр 17 «2105 240
«2125 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «2235 Опис штучної послідавності: синтетичний олігамуклеротид «4А0О» 240
Віркесисе савссассісї 21 «2102241 «2112517 «2122 ДНК «2132» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігонуклертид «а00» 241 песиссса госассї 17 «2105242 -211519 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205 «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «8002 242 віававекя пас 13 «2105 243 -211515
«212» ДНК «2135 Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігамуклеротид «А0О» 243 таза ан 15 «2102 244 «11521 «2125 РКТ «2132» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний пептид «дО» 244
Ні Твг Гуз Пе Ніз ен Агр. спу бег біпіви Майіу5 Зегі уз 5ег 1 5 10 15
Січ Аа Аа Аз Аге «2105 245 «211521 «2122 РЕТ «213» Штучна послідовність «20» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний пептид «4005 245
Ні ТВг у Не Ніз Ген Атр Зіу бег Туг Аа Рго Меї Рто Рго Ге
1 5 10 15
АЇв ен Аа бет Рго «2105 245 «2115124 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідавності: синтетичний полімуклеотид «400» 246 асасівісїс авівсвавів (вістеза зсевісссів Еставасісс асссаїрерві 50 їввссавссіїрсси раса аврсавасі рассваїзві сцарарізі ссзвіваввс 120
СВЕВ 124 «210» 247 «21125124 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний полінуклеотид «4005 247 ссіввссіса стрраїасісіавеасіай врісаавц! рос рісааресварисів 60 всесаасссаї ревіррави тавссавкяа ссвцісвва саратайців сайіваваїв 120
ВІВ 124 «2105 248 «211521 «2125 ДНК
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігомуклеротид «4005 248 ви евссавс СИрОСИ ва с 21 «210» 249 «211517 «212» ДНК «213» Штузна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеотид «дО» 249
Ігтесагосі цесце 17 «2105250 -211521 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 250
Нерісварі Просвіт а 21 «2105251 «211517 «2125 ДНК «2132 Штучна послідовність
«2235 Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклеротид «4005251 писаагнії есеї 17 «2105252 «211255 «2122 РЕТ «213» Цокпомп «220» «2232» Опис невідомого сімейного пептиду: ТАБЦОАрС «4002252 івь Аів Су 1 еу Не А5р Аа Ар Оу 1 5 «210» 253 «211528 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 253 саїсссавес віррераєа вавсіссв 28 «2102 254 «211515 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідовності: синтетичний олігануклеотид «400» 254
ВІВТССЕСН ререрссс 18 «2105 255 «211519 «212» ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «2232 Опис штучної послідавності: синтетичний олігомуклеотид «4005255 звівтнвсаєівзвевіавї т «210» 256 «211519 «2122 ДНК «213» Штузна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності; синтетичний олігонуклеотид «4005 256 рІВЇСССИ веивВСССС 19 «2105257 «211518 «2122 ДНК «213» Штувзна послідовність «2205
«223» Опис штучної послідавності: синтетичний олігануклертид
«4005 257 аізвінвсаї їввевіВЕ 18
«2105 258
«211515
«212» ДНК
«2135 Штучна послідовність
«220»
«2723» Опис штучної послідовності: синтетичний олігонуклертид «005258 ацшітсаитагата 15

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Генетично модифікована клітина-попередник червоних клітин крові, яка характеризується геномною модифікацією у межах екзону 2 або екзону 4 ВСІ11А або у межах ВСІ 11А-ХІ, виконаною після розщеплення у межах гена ВСІ11А нуклеазою "цинкові пальці" (2ЕМ), нуклеазою ТАГЕ (ТАГЕМ) або системою СКІЗБРЕ/Сав, які зв'язуються із сайтом-мішенню, що містить нуклеотиди в межах будь-якої із «ФЕО ІЮ МО: 56, 63, 66, 71, 160, 170, 179, 183, 189, 193, 197, 200, 203, 207, 211 і 213 таким чином, що ген ВСІ 11А інактивується і підвищується експресія глобіну.
2. Генетично модифікована клітина-попередник червоних клітин крові за п. 1, яка відрізняється тим, що геномну модифікацію вибрано з групи, яка складається з інсерцій і/або делецій.
3. Генетично модифікована клітина- попередник червоних клітин крові за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що клітина є гемопоетичною стовбуровою клітиною або клітиною- попередником червоних клітин крові, диференційованою у червону клітину крові (ЧКК).
4. Генетично модифікована клітина-попередник червоних клітин крові за п. 1, яка відрізняється тим, ЩО: (а) ген ВСІ11А розщеплений нуклеазою "цинкові пальці"; (б) нуклеаза введена у клітину як полінуклеотид; або (в) геномна модифікація включає вбудовування донорського полінуклеотиду, який кодує трансген.
5. Генетично модифікована клітина-попередник червоних клітин крові за п. 1, яка відрізняється тим, що нуклеаза "цинкові пальці" включає білок "цинкові пальці", який містить 5 або 6 доменів "цинкових пальців", що містять спіральні ділянки розпізнавання, а також де зазначений білок "цинкові пальці" містить спіральні ділянки розпізнавання білків, у порядку, представленому у одному рядку Таблиці 1А, позначених як 5855239172, 5В5543490, 585544642, 58585545148, ЗВ5545147, 585539145, 585544490, 585855844489, 585545081, 585544493, 585529527, зв5Я429528, ЗВ5Я29525, 5В5529526, 5В5ЯЗ4678, 585534642, 5В5Я44889, 585544888, ЗВ5Я44905, 585544904, 585544911, 585544910, 585544945, 585544944, 585544947 або ЗвВ5544946.
6. Білок "цинкові пальці", який містить 5 або 6 доменів "цинкових пальців", що містять спіральні ділянки розпізнавання, а також де зазначений білок "цинкові пальці" містить спіральні ділянки розпізнавання білків, у порядку, представленому у одному рядку Таблиці ТА, позначених як ЗВ5ЯЗ39172, 585543490, 585544642, 585545148, 5В5845147, 58585539145, 5855544490, ЗВ5544489, 585545081, 585544493, 585529527, 5В5Я29528, 5В58529525, 585529526, ЗВ5ЯЗ34678, 585534642, 585544889, 585544888, 585544905, 58585544904, 58585544911, 5ЗВ5Я44910, 585544945, 585544944, 585544947 або 55544946.
7. Злитий білок, що містить білок "цинкові пальці" за п. б, а також дикотипний чи сконструйований домен розщеплення або дикотипний чи сконструйований напівдомен розщеплення.
8. Полінуклеотид, що кодує один або більше білків за п. 6 або п. 7.
9. Виділена клітина, що містить один або більше злитих білків за п. 7 або один або більше полінуклеотидів за п. 8.
10. Клітина за п. 9, яка відрізняється тим, що клітину вибрано з групи, яка складається з клітини-попередника червоних клітин крові (ЧКК), ЧКК, диференційованої з клітини-попередника ЧКК, або гемопоетичної стовбурової клітини СОЗ4 к.
11. Набір, що містить білок за п. 6, злитий білок за п. 7 або полінуклеотид за п. 8.
12. Спосіб зміни експресії глобінових генів у клітині іп міго, який включає: введення в клітину одного або більше білків за п. б або п. 7 чи одного або більше полінуклеотидів за п. 8 за таких умов, щоб один або більше білків експресувались і експресія глобінового гена змінювалась.
13. Спосіб за п. 12, у якому: (а) білки підвищують експресію глобінового гена, такого як ген гамма-глобіну або бета-глобіну; (б) спосіб додатково включає вбудовування у геном клітини донорської послідовності, наприклад, шляхом введення донорської послідовності у клітину за допомогою вірусного вектора, олігонуклеотиду або плазміди; (в) клітина являє собою клітину-попередника червоних клітин крові (ЧКК), таку як гемопоетична стовбурова клітина СОЗ34 к; і/або (г) донорська послідовність включає трансген під контролем ендогенного або екзогенного промотора.
14. Один або більше білків за п. 6 або п. 7 чи один або більше полінуклеотидів за п. 8 для застосування у лікуванні гемоглобінопатії, де спосіб включає: введення в клітину одного або більше білків за п. 6 або п. 7 чи одного або більше полінуклеотидів за п. 8 за таких умов, щоб один або більше білків експресувались і експресія глобінового гена змінювалась так, щоб гемоглобінопатія піддавалась лікуванню.
15. Один або більше білків за п. 6 або п. 7 чи один або більше полінуклеотидів за п. 8 для застосування у лікуванні гемоглобінопатії за п. 14, де гемоглобінопатія являє собою таласемію.
16. Один або більше білків за п. 6 або п. 7 чи один або більше полінуклеотидів за п. 8 для застосування у лікуванні серпоподібно-клітинної хвороби, де спосіб включає: введення в клітину одного або більше білків за п. б або п. 7 чи одного або більше полінуклеотидів за п. 8 за таких умов, щоб один або більше білків експресувались і експресія глобінового гена змінювалась так, щоб серпоподібно-клітинна хвороба піддавалась лікуванню.
ях 1 89 57 аж В зла 2 У - ТЕ х й не те і: Серп но по да х отой пк та АТАА їй х КНХЕ вявкЗ с А: у КУ . КО ких вас ЗТ х на тек По тех вето х Ти їаев Є ОА що ЗА: путатий Ко увяєтесіВ х Но ПАдІВЯ ЗА АБО я здо ог ща пхнай ле я ак ШТ: тд ся я ЗА ХОЩЕ дО УК пав ше Ек ВК ще АСУ о. У СА «А зе з зт пос Її и: 1. оса: та й с Ко аПесое ві я ве сЕсЗАх сАжо пТОв. ЗЛАКИ с сі по т. мо пох уд асо ма ши м с В ЗКаВЕ: любуєя | ; вия о гово с арах ЗВУ З і рт ТЕ а с трах кл Кота Мо ЗБАТЕ й М ах ку Ї Й шнннй ВО о , ї Н т... МТК г па ААУ. ХА І ЗАТ 1 ха ня ри | : давл 5 Й -- Н НК х не сх таз тпка Н -- х шення т. ДА У сни р ев ми -- Ми і зеяок ЗМО ВА дак іо А А пот дове зх леж лек! ши п її і 828 ї з уві р Яма п нако Ко міння ї З БОБ пиття са п ще т тент В і Най кує в! зах п. мий - КО НИ дк : ХО АК і С ЖИ М ЛЕ ще ЗБЯВЇ: і у те АП -- 7 НЯ УЗ ДАК МЕЖ Я нини пон зЕБов. Я ОК Покує енднндннй іс ет З 7 і Зі і песто іо "рій КАК ОН НО се УВУ ННЯ що : ни ке ВИННИХ нн 8 пня пери с ку песееня Ас В соя ЗІ їв є ПОН Експю: З, дасиці ї 5 т АС ху вних З З пллттятх на Я для зем «ср т од п пи птнянкжння зв. Х ще пи ре «В зд плдлжляті Ки 35 ддппчялннлння з 5 - Щі 2 У ідилднлатлаялня, 193 Фігу ше - а З КАХ се ій МО СХ ух ЗХ ОВ
А. ВЕ . ой с У ЖК с Е ОО Се ОКХ М о. ооо . с п. х п З с М ЗО УК СКК КК с СЕ ЗО КСО сх хе с пе шо ех хх с я що ї и М КМ о. ЕЕ с З З ККУ 5 о ї х с Зх х ЗУ М КЕ о с ОО с с КК Я КОКО с хе ще - СОЯ г В КО ї пи віща . КОК с о ще ОХ 5 За паї п 2 7 зо же ще п. Бах й ЕЕ МКК ще с 4 ТЯ В о. о с за о ще о с ков ще с с й ВЕН лав Е ще ПЕВ ЗХ ОХ х КК г з яко З За 0 с я п 0. о .. «ВЕ пк КХ КОИКК ЗВ кзке ОХ ОХ о хл ї ще. ЕІ щі» 5» Ж 5 БЖ БО ЗЕ о В ЗО - пи: й ЗК що МЕ ее МО СХ ОХ З в гу В що що З Б А Зх М з - М о Аню : В х о о. З ЗО ТЕ п. ХХХ СЕН Я ее - й СЕ с х с ЩЕ: ЗО Во не ши з МОУ Зо йо ї Е С ОЗ МК сх ХО о КК Ж ОХ ККУ Ван Воно у г й . З . г 5 ОХ й ПН ШЕ БУ М І о. щ ОО УМХ сошеве же ай КО Ко 5 ОО с ЗХ ХО Я ООКВОКХ ш я че о . п. і. с о 0 БО о с п о й с до о . о. о. о я о о. З с В З о. ОО ЗУ «їй с ОО СХ о. С с о ЗО МО ня КК о я З З В Х о. С о х . Х ГО ОКУ г ТЕ: М Мо ОК ОКХ о. ОО 555 с ин ОХ п. с х с ХО ЕЕ СУ хе МУ с с с. з х МОУ ЕКО зх ККХККК ЯКО ОО СКУ Я Сх Б. Зо а о. АНЯ у ММ я ОО ОО КИ ОО КУХ ЖК ноя 5 о Ка и ОК зе Шк, ее ЕК ПОВ ТОТЬ ЗВО ши ЕК ЕД У ЗМЕН, Ст, МЕНЕ пон у ще Еш ЕЕ Кий Ж пл Ж ПИ то ТЕ п : У. Кт ря ПІНКИ ї я о ПИ х що онов ся а о око, Й ТИ и ак ея А я а ВО ПИТ КЕ ит М ЕК я У ОК ту Ж тля ОН оо ново ная : і 7 ВН пу В ши а ІОН В од они УТА дош що НН ше в З ПОМ сУхх ЕЕ КОМ ОВ ох ОПН КК У п ПК КК МИ ИВВ В И А сор кове чен й веід на о зунук у ету в дос А зетАНОо ИН ИТеВ нет еЗУБОлтЕ Як, ніх отже дод у 5 В еВ МК КАК Анни ек КАНА ТИ ЛИШ ОО ВИН ОВУ сосну Не. В ВК и ПЕКИ Кт под пофомо меш тре и о В йо нини шик в -- М ОБ о ОТ ве Пе й -о щ-- СВ ОХ о. БО 1 о з се т я БУ ЕЕ п Не ДУ Б ЕВ а Кт ОО | ВО в: в дя я о КК ОЕ шо повно ЗВ СКАН КК . піс щі С ШЕІШИАИ ПИШИ ШИМИ ОДЕИИИИЖЬ ММАНИ шкі її і шо 5 : З и ен о ен І ОО ПЕШДЖМИ. оШеШтОМ ДЕЖНЕММК Кр ОК С ПМ. спри. МОСК СЕН те КОВО, с по пе ен и а о -к ПО Но прі шен п ВО й КЕ я, ШИНКИ, ПККНХ ОНИ що Еш. пошити о Едео пд, ОМЕИАЕКЄ ПО и о ПЕК В ВВ а в Не ДБ ЕХ 5 о ОН НЕ Ех п ЕК т, ПИШЕ ен ОК пе ШЕ ЯК ИМЯ СМ хх ВЕЖ ШЕ ЛО шо в Мая Б ких Б ВК АС я ПОМ золот в вних с ах ве я мкЯ 335377 З0ос йо кт З32иа5 | пом х. ду лини спяж іх мя А Я Я се ШИ ее о мно Діоди: КЕН З: ку Ко : М з я ОО М я КК З они нн ви и по Як: ОО ОК М ОБ Не о ВВ НИ І он о М В о я В Ба дено Кох З НІ ПК и В ее М я МА 5 ШК ЕК. ДЕК: В ОО ММА По КОН ЕК КК Кн Ки ВК ПИКА МКК АК КЕ КО ВОК нн ОК я. М ОХ о. о. п ПОКИ КО КК а за ОК М и В ВАТ МО ВО и ва щі ЕЕ, с . ОВ ОО ТИ ДАК А ОВ Ов нн У М ВО Я С нен ле ше ФВ МЕ ВК кош ОХ і ЗО пт Но КЖЕНИИК. МЕНЕ Не М : Я ПТШІНМ БФ по: ИН МО ЕЕ Ан а КО МКК КВ За и НН І я ПО ЕЕ КК ШО ни ПОВ КЕ ВЕН ОКО ОВЕН В ас ЗБ М пи нн ЕМЖУ У ВК О ПИНИМИЛИК ВО ПК ДК спите ВЕНИ ШЕ ЛЕН
ВА удх ! ; Пів чнеау зах 9525/28 й й за АВ вк 29527 т Жах знав нн ооонненасовооааовеісв ван ва остов вовоскоостннсї т - що арх Мн но МНН ПЕД ви сосссесе о ва Од 7. . Кі ШКТ ПРИМ Я Не ШИХ Ка ПРОШИВКИ ОД ЛИ ЛИН покрите ДИ пд ПИ Ди ЦИ нини Ти ПЕТ ПЛ ИМВ ЕТ ТИ В ПЕ ВОК В КА ШОТЕШК В В КОН КК МТ СЕ ЕЕ Нд ТК КЕ нн СД КАН мо ТЯ ТХ Ен ен ПОЛ ЛИ опи оо, о он ПФК Е К ОН Я ПЕК от ин рю на и ст о З ПІВНКН ОН В Я В ЗВ МК ж : ПИТИ ДІ ВВ КК УНК МИ М НН НН ВХ М М а ЕК: ЗИ о Я КУ ВО ВК Не НН ЗЕ ВЕ фо що о. а КОКС а З кеш ке СХ ПІВ ОК Же ВВ З ПЕК КК ОК НН ВО ВХ По ОКО ОХ ЗК ОК ОМ: МН осо ово ОБ ООН ВХ я З ОК с С КИ о КК С КК Ко БЕЙ пу ЕЕ ЗО МОХИ в ЕД ЗО ПО ЗХ сх с п ЗКУ ЯК КОМ Ж УК Я Ж ЗеНН КУВ ОСОКОМ оя ЕВ МО Кт ООН о о ВВ КВК ЗК За КО Ох о п я 3 а Б о ОВ ВЕН НН Не НН теп, ОМ ЗНО ПОКИ, . ШЛиВ ОН ОНИ Ох ККУ ли ЕМО 0 МОЯ ОО АКА Ки й я Бах ПО КВ ЗВ ХМ ЗО ХНН ТОК т Х о КИМ КИ ОПТ - З о що шо що г т о ще МО щ ВО ННЯ В СХ А МЕ Кг НАНННн НКНН МПК ПОКЕК с ПВ Под В ПТК 0. шо о.
СТ ЕКО п пи пьшй по 20 7ВИТХ ПИ МОЛІ КЖЕМННи АКХ СМ КАМИ, ПОЛЕМИТКИИИ ПЕШИИИМ НИМ КІ я о МОП ПИПЛЛИМИИ МИ МК М.
ЛІТИКИ. з В о й па ПОВЕ ДН КН По я я М ММК КК СКИНШК ЕК МІК ОКХ.
ОШИКНИЦИН І ПЕ ПІШКИ МИЛИ, ПЕКИ ККУ ООН о ОНИ и а о ОВ ПОВ и ВВЕ М и и ПОН : п о и и о З по а НН ПП МШИИИ НИ ОМВК ВК МД ПЕД НИКК ТНК ПИМИНИНх ЕН п ПМК, КВ ОК М ВИК оо ОН Ще МК В ПЕКИ НК і Кн КЕ ООН ОУН КОН ПИНИННИ СДН Ян ПНОнН и ПК Ки ПОН ПИШИ АД Е С з ОЦЕ В СОНЯ а и и М НН ша 5 М с ПДМ о п Ки А ДОМ я ПЛКНКЕКЯ К о ОНИ ІТЄВТЕШІШТІИХ ОПЛАТА ТЕМНИХ СЮ ОВЕН.
ЗИ ППД МЕИЕЛИИИИИИ СОТОК ПНО ПЕКИ НИ ОЛЕЙИМИННИТНИ І.
ПИМДМНИИИ йинекоя Се : Ех о ЛИЙ ОК ПЕК ЕНН ОО НИ ШТ ТИНИ ЛМИКИККТ Но Но ПРП РИ УНП, ПІКИ МИ зе Аве, ТЕМИ ТДЛЕФНМФИШИИМТ МДЕ ТПИУТ ПИКТИИНИИКиИ ПИ ЕЛЕ ПЕКИ ЛНИнин ПОЕТИ, ПІ - ППД ОЕ оп ЕОН ШИНИ Ва ПЕ и МНК МИЛО ОБШИВКУ, ПОЕОЕЛМт КД ТМ ШКТ ТОлдМІДНИТИх, о ДЯ ДОКТ А он, СУ ЗИш нин ПЕ и п ПЕК и ШИ МИТИ НИ о и «ДНИНИ КИ То ПЕКИ НИК ТТ ПМ ШИШКІН ШИТИ 0 ИДРЛЮТИТ НН ня с ОЗ ПК ИН Лю і В г ї ШТ Я ЛЕТИ ша ПЕ и Оки ЕЕ МЕ па в КВК ре яння й п в п і МОМ: ПН о в и Й и : о Сн нн : т ї 55 ХХ ни нн нн нин вн Ж. н рем БВ С: ЗВННе с зЗНННИЯ хз жи а а Е І 5 сов : хх др нн В ння же - ї і 5 що Е піни панни 2, я Е ЕС Ї ї г іщ і Н їх : Ежен клав м зно нин нн хх Я Я з КЗ ж : їжі 1 : ї З ще 3 ї ї вн в зни нн нн вк Е ах З Я нан ІНШЕ ни ШЕ Те ші в ТЕ вон НН і З ПС НИ я Б НЕ ЕІ ГІд Бої щі їжі У: рт Н жі ЗІ КОМ Н Н Н Я НИХ Тжу НС лк: НУ ЕД Ж о Кі і КІ их КОМ Н Н : Н і ОБ: ЗА НА СсЯНИ ЖІ НЯ їж: КІ КОЖ її Н Ім: НК На Н Н Н І Н а ІМК БА Н Н І 3 Н рум КОКО її ! РІ НЕСЕ БоВКої Н Н у ї ЕЕ ВК БЖ: Н ; : Її Н ї ! : Я Н її 1 ї хх АНУ ОБЖ. 1 Ї ї ї їх ЕК Ого ІЗ : Н ї ї ї ї ї ї ї х Н ТИЖ іш і кош Н Н Н ї її ЛИЖ т: : : Н Її ї х Н ї ї : ТІ Не ро Гаки і сеї Ба і Н Н ї Не Іл ТОБ: ї і ! 1 ї ї Н ї ї Н НЕ Е ШЕ З ШЕ ке ШИ НИ НИ кіш: шик шишиши ши ши шин ши шк : Таж НеБЗЯН ож | З Н ї їж: Как: Б Н : А Ї ї ї Н Ї Н : ті : ТЕЩА рі КО і Н Н ї її ЕС Ой. : : і ї ї ї ї ІЗ З : її : Я ПЗ Її ї Н : Н Н їщ ВЕЖІ ТІК Н : Н і ї ї Н Н Н : її 1 ЖІ 1 хе ії Е : І 1 : ї 1 їх винен ї Н Н ї ї Н Н і ї : МН : БОЖКО і і і Е Н Н Н і Ра ША ї Й Н : Н Н І Її : В А Н Не і : а ни не п п о п п і о а п жнш ни нн и я І НИ ОХ : ї й й ї 1 і: ІЗ ї Ї ї ІЗ ї Н : ї ї Н ї х : І. ї ї кю с. ї Я г І х І х їх ї ї ї ! ї УЖ я ДН | уки ої 1 : : Н Н М Кудін ідилію і Н жа дея : : Кі ТУ УК УКХ ХУ УМ КУМ УК КК Кт я ї хумрує в вх : Ті ГОВЯЕ сренннтянтниннннннння нн вн нн о Її вові Н І ТОВувю денними панда АННА АН няня няня няних тккектї РОВНЕ ЗТ еф сою пеня | - в я песто тортом ит енттннннЇ роснеаа те шик нн нн Гоа З КУ т нн ех а со ї РОН ху дні в Я У ще й пт ення ї В : ї й ск пеєюнютю т Кене сних щ Й Я ХХ.
КУ зни : їж ша пон пн пав ин М ол ке в КК В : ОЇ що. і да З 1 Ї ПК росту В рони ВК доля М. 5 : І ОХ х ї : З 1 хе : х ї х: ї ї о пд лити Кутики Н Н і сяк ш ОК Кот З ОБ оо Її в : ї ї ту у М ну мткма ОЇ Н БЖ го ЯН ГЕ Ро: НС їж і КІ Рі Гак Ї Н і : Ак І: 1 ОЖу і І РОК: ої Од 1 Ії КО її 4 | її Н ї с ЕНН гої і Н ро Тож її ЖК.
З Око.
КО і НН Н ТК. що: НКУ і 3 Н 1 1 мі: їОБЕ: Ї їй ї ї ! і щі 5 Н ; РО НЕОН Нео і ї : З ТС: жі КЗ ї Н Мі НЕ Н Ох Ше ТОЖ ої: ї Н Н ї ВО ос 1 АЕС ї Е ІЗ Н 1 : ОД їжу З ТОЩО ї ї Н ї см: тої ї І Е В :ї ІЗ 1: : ОС ож НУ Н 7 і ї ОО: НЕ Тож 1 ї у І 3 Не І: Тож її ЖЕ: ож ї їх : І Ро ОЖЖО 1 од З їх у : І ше Н їж ШВИ Ж і : ї : Н Ко: ОКО їожж ї : : Н і Н ж щі : Я : : ї Н і їшк о! рН Ко З ї ! І Я ОХ : вої ОБ З Не За ї : Н ї рожкої: ї я їж ї у ї Н ме ІЗ ТІ ОЇ : : : ї Н ії їж і о: РК: : ї ї ї Ше Е і . Ї ТОЖ: Н : ї їх : ї рої ОО: ОКО : 1 і ї 1 4 Н : і 7: : ! ї Н : : щої щі ї 1 ї Н ї : Ше і і х ! З ! І : ї : Н ЕН ЗУ ОН, : ї : ї Її і То. ї ї з ї ї ї : ї 3 і Н : Н 1: : Н пежжа ж днів : 7 Н ї ії Н а Кдшнннтитнинн ри неженняткюкю ентерит постити ї тв НН
МЕ я
! зе Же Я З
Н Е З 5 КЕ. їж : де Б ВО
Н «Воля ГЕ ОХ
: МЕЖІ З Ж
5-5 855 5 055500 0 Б 0-0 щО З 5 85 8555 55 ши ши ши щи ще ши шш ши ши ши ши ШЕ ШЕ Ще ШК
Кк т ке в У.
МІйху ОЖІДМ НІЖ Іл ам муч ВИМИ чн клнх ЕВ Генотни Ве.
Фігура 5 Етанон ВС ВОСсе ОСІ АСсОвАТАВССТ ТАС СВАТИ СВОСВАВО я іл пессдессетассттсАСсААТАСССТТОАСАВНОСВААСТТОАСОЛАТАЄ АЯВвр песо сииСстеевсс аг ТО АСААОВОАААСТТЕАССААТВО АБ ВЕСТ ен АТЕСТАТ САЛАТ АССААКВ дев щОаСКМТТ ан КТОСВАСССЛАВСТЕСАССВА ТЛ Ав МОСС ТАС СА АКАСЮ НН ян я ВЧ САВАСТТО СС КА Аззво ОСИ ССТЕОССТУВАС онов и АВС СААВСТСВССВАТАС жВрЮ Ос СсТ ОТТО АСВ САС ТОВСТА яЗВИ пвоесслвосстІсссттТтовОосАМТАССВНССТТОВСАВОСОААВСТРаВОСА ав вас ОО АС ВО ВА АОС ТТ ОАСАЛОССВААВОТКВАСН Фнура 7
UAA201501169A 2012-08-29 2013-08-29 Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання UA118957C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261694693P 2012-08-29 2012-08-29
PCT/US2013/057214 WO2014036219A2 (en) 2012-08-29 2013-08-29 Methods and compositions for treatment of a genetic condition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118957C2 true UA118957C2 (uk) 2019-04-10

Family

ID=50184630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201501169A UA118957C2 (uk) 2012-08-29 2013-08-29 Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання

Country Status (27)

Country Link
US (4) US9650648B2 (uk)
EP (1) EP2890780B8 (uk)
JP (4) JP2015533786A (uk)
KR (3) KR102218562B1 (uk)
CN (1) CN104704110B (uk)
AU (1) AU2013308770B2 (uk)
CA (2) CA3171494A1 (uk)
CL (1) CL2015000450A1 (uk)
DK (1) DK2890780T3 (uk)
EA (1) EA039384B1 (uk)
ES (1) ES2812599T3 (uk)
HK (1) HK1210502A1 (uk)
HR (1) HRP20201443T1 (uk)
HU (1) HUE050516T2 (uk)
IL (1) IL237050B (uk)
IN (1) IN2015DN01480A (uk)
LT (1) LT2890780T (uk)
MX (1) MX367081B (uk)
PH (2) PH12015500433A1 (uk)
PL (1) PL2890780T3 (uk)
PT (1) PT2890780T (uk)
RS (1) RS60838B1 (uk)
SG (2) SG10201701601WA (uk)
SI (1) SI2890780T1 (uk)
UA (1) UA118957C2 (uk)
WO (1) WO2014036219A2 (uk)
ZA (1) ZA201500900B (uk)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
BR112014020625A2 (pt) 2012-02-24 2017-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res polinucleotídeo, polipeptídeo, composição, célula e célula tronco editada por genoma
MX362866B (es) 2012-05-25 2019-02-20 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn.
EP3372679A1 (en) * 2012-10-23 2018-09-12 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
PT3138910T (pt) 2012-12-06 2017-10-18 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseado em crispr
WO2014130955A1 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
JP2016519652A (ja) 2013-03-14 2016-07-07 カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
US9873894B2 (en) * 2013-05-15 2018-01-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
EP4389903A2 (en) * 2013-06-05 2024-06-26 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
AU2014312295C1 (en) * 2013-08-28 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
KR102380245B1 (ko) 2013-11-07 2022-03-30 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
EP3492593B1 (en) * 2013-11-13 2021-08-18 Children's Medical Center Corporation Nuclease-mediated regulation of gene expression
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
HUE051232T2 (hu) * 2014-02-03 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Béta-talasszémia kezelésére szolgáló eljárások és készítmények
AU2015218576B2 (en) 2014-02-24 2020-02-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3553176A1 (en) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
CA2942762C (en) 2014-03-18 2023-10-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
JP2017511132A (ja) * 2014-03-26 2017-04-20 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． ヒト造血幹／前駆細胞のエクスビボ拡大のための組成物および方法
EP3981876A1 (en) * 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3186376B1 (en) 2014-08-27 2019-03-20 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
HUE055583T2 (hu) * 2014-09-16 2021-12-28 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények nukleáz által közvetített genommódosításhoz és -javításhoz hematopoetikus õssejtekben
JP2017536826A (ja) * 2014-11-24 2017-12-14 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 幹細胞および／または前駆細胞からの赤血球産生を改善するためのｓｈ２ｂ３の調節
WO2016094880A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
EP3262173A2 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
CN107532182A (zh) 2015-02-23 2018-01-02 克里斯珀医疗股份公司 治疗血红蛋白病的材料和方法
WO2016168371A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 Invitae Corporation Methods, systems and processes of identifying genetic variation in highly similar genes
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2016183298A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Sangamo Biosciences, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2017015637A1 (en) * 2015-07-22 2017-01-26 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
US10435441B2 (en) * 2015-09-23 2019-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT repressors and uses thereof
BR112018008109A2 (pt) * 2015-10-20 2018-11-06 Pioneer Hi Bred Int métodos para modificar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula vegetal, produzir uma planta, produzir tecido de calo de planta que tem uma sequência de nucleotídeos modificada em seu genoma sem o uso de um marcador selecionável, e planta de progênie da planta
EP4269577A3 (en) 2015-10-23 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
AU2016343887B2 (en) 2015-10-28 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor VIII expression cassettes and methods of use thereof
US20180273609A1 (en) 2015-11-04 2018-09-27 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP4036228A1 (en) 2015-11-13 2022-08-03 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
IL297018A (en) * 2015-12-18 2022-12-01 Sangamo Therapeutics Inc Directed cleavage of cell mhc receptor
EP3417061B1 (en) 2016-02-18 2022-10-26 The Regents of the University of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
CN109153994A (zh) * 2016-03-14 2019-01-04 爱迪塔斯医药公司 用于治疗β-血红蛋白病的CRISPR/CAS相关方法和组合物
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
EP3494220A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
CN109963945A (zh) 2016-08-20 2019-07-02 阿维利诺美国实验室股份有限公司 单一向导rna、crispr/cas9系统及其使用方法
MY193234A (en) * 2016-08-24 2022-09-27 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of gene expression using engineered nucleases
SG10201913948PA (en) 2016-08-24 2020-03-30 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US10960085B2 (en) 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US20190330620A1 (en) * 2016-10-14 2019-10-31 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
TWI829101B (zh) * 2017-01-09 2024-01-11 美商聖加莫治療股份有限公司 使用經工程改造之核酸酶調控基因表現
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
WO2018200597A1 (en) * 2017-04-24 2018-11-01 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Homology directed repair compositions for the treatment of hemoglobinopathies
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
BR112020001059A2 (pt) 2017-07-18 2020-07-14 Calimmune, Inc. composições e métodos para o tratamento de beta-hemoglobinopatias
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
JP2021500036A (ja) 2017-10-16 2021-01-07 ザ ブロード インスティテュート, インコーポレーテッドThe Broad Institute, Inc. アデノシン塩基編集因子の使用
WO2019081982A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Crispr Therapeutics Ag SUBSTANCES AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES
EP3511412A1 (en) 2018-01-12 2019-07-17 Genethon Genetically engineered hematopoietic stem cell as a platform for systemic protein expression
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN111954540A (zh) * 2018-02-08 2020-11-17 桑格摩生物治疗股份有限公司 工程化靶标特异性核酸酶
KR20200123201A (ko) 2018-02-21 2020-10-28 알시온 라이프사이언스 인크. 유체 전달 시스템 및 방법
EP3843826A4 (en) 2018-08-27 2022-09-14 Alcyone Therapeutics, Inc. FLUID DELIVERY SYSTEMS AND METHODS
BR112021018607A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Massachusetts Inst Technology Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
US20200316116A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Method for the treatment of beta-thalassemia
WO2020208223A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Correction of βeta-thalassemia phenotype by genetically engineered hematopoietic stem cell
CN112391410B (zh) * 2020-02-17 2024-04-02 华东师范大学 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用
WO2021022189A1 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating alpha thalassemia
WO2021026336A2 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 I Altius Institute For Biomedical Sciences Compositions and methods for modulation of gene expression
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
US20230165909A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
WO2023115039A2 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024119157A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles with cofusogens and methods of producing and using the same

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
ATE310812T1 (de) 1994-01-18 2005-12-15 Scripps Research Inst Derivate von zinkfingerproteinen und methoden
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
ATE410518T1 (de) 1994-03-23 2008-10-15 Univ Ohio Kompaktnukleinsäure und ihre verabreichung in zellen
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
ATE407205T1 (de) 1994-08-20 2008-09-15 Gendaq Ltd Verbesserung in bezug auf bindungsproteine bei der erkennung von dna
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
CO5070700A1 (es) 1998-06-05 2001-08-28 Basf Ag Genes novedosos de (adp-ribosa) polimerasa
US6140815A (en) 1998-06-17 2000-10-31 Dover Instrument Corporation High stability spin stand platform
US6532231B1 (en) 1998-08-29 2003-03-11 Lucent Technologies Inc. Arrangement for changing the destination of single link, single destination data messages
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
EP1147209A2 (en) 1999-02-03 2001-10-24 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
DE60143192D1 (de) 2000-02-08 2010-11-18 Sangamo Biosciences Inc Zellen zur entdeckung von medikamenten
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
JP2005500061A (ja) 2001-08-20 2005-01-06 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート Ｃｎｎについての亜鉛フィンガー結合ドメイン
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP2927318B1 (en) * 2003-08-08 2020-05-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7253273B2 (en) 2004-04-08 2007-08-07 Sangamo Biosciences, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
ATE418346T1 (de) 2004-04-08 2009-01-15 Sangamo Biosciences Inc Zusammensetzungen zur behandlung von neuropathischen und neurodegenerativen erkrankungen
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
CA2599004C (en) * 2005-02-28 2015-05-26 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
MX2007013757A (es) 2005-05-05 2008-01-24 Univ Arizona Reagrupacion permitida de secuencia (seer)-met odo de novedad para visualizar secuencias de adn especificas.
EP1913149A4 (en) 2005-07-26 2009-08-05 Sangamo Biosciences Inc TARGETED INTEGRATION AND EXPRESSION OF EXOGENOUS NUCLEIC ACID SEQUENCES
CA3055968A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Duke University Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and dna-binding affinity
ES2378333T3 (es) 2006-05-25 2012-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación de genes
WO2007139898A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
ATE489465T1 (de) 2007-04-26 2010-12-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
US8790345B2 (en) 2007-08-21 2014-07-29 Zimmer, Inc. Titanium alloy with oxidized zirconium for a prosthetic implant
AU2008305567B2 (en) 2007-09-27 2014-04-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US8936936B2 (en) 2007-10-25 2015-01-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
BE1018531A4 (nl) 2007-10-31 2011-03-01 Gielen Cornelis Het gebruik van niet-pathogene bacterien in sporenvorm of in slapende vorm voor het verwijderen van huismijtuitwerpselen en organische allergieverwekkende materialen van alle soorten textiel.
DE102007056956B4 (de) 2007-11-27 2009-10-29 Moosbauer, Peter, Dipl.-Ing.(FH) Schaltung zur Regelung der Stromversorgung eines Verbrauchers und Verfahren zum Betrieb einer Schaltung
JP2011518555A (ja) 2008-04-14 2011-06-30 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 標的組込みのための線形ドナーコンストラクト
WO2009154686A1 (en) 2008-05-28 2009-12-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
CA2734235C (en) 2008-08-22 2019-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
WO2010030963A2 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
KR102262704B1 (ko) 2009-08-11 2021-06-09 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
EP2526112B1 (en) 2010-01-22 2018-10-17 Dow AgroSciences LLC Targeted genomic alteration
PT2534173T (pt) 2010-02-08 2019-10-31 Sangamo Therapeutics Inc Semidomínios de clivagem manipulados
EP2660318A1 (en) 2010-02-09 2013-11-06 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
WO2011139349A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
US20140127814A1 (en) 2010-08-10 2014-05-08 Srinivasan Chandrasegaran Generation and use of pluripotent stem cells
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
WO2012073047A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Genome Research Limited Compositions and methods
KR102061557B1 (ko) 2011-09-21 2020-01-03 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 이식 유전자 발현의 조절을 위한 방법 및 조성물
CA2852955C (en) 2011-10-27 2021-02-16 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
BR112014020625A2 (pt) * 2012-02-24 2017-07-04 Hutchinson Fred Cancer Res polinucleotídeo, polipeptídeo, composição, célula e célula tronco editada por genoma
BR112014027813A2 (pt) 2012-05-07 2017-08-08 Dow Agrosciences Llc métodos e composições para integração de transgenes direcionada mediada por nuclease
US9873894B2 (en) 2013-05-15 2018-01-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition

Also Published As

Publication number Publication date
PH12019502292A1 (en) 2021-03-15
WO2014036219A3 (en) 2014-05-30
HK1210502A1 (en) 2016-04-22
US20230416775A1 (en) 2023-12-28
JP2017217012A (ja) 2017-12-14
BR112015003815A2 (pt) 2017-08-08
SI2890780T1 (sl) 2020-11-30
IN2015DN01480A (uk) 2015-07-03
EP2890780A4 (en) 2016-08-31
JP6629917B2 (ja) 2020-01-15
IL237050A0 (en) 2015-03-31
EP2890780B1 (en) 2020-06-24
IL237050B (en) 2020-04-30
EP2890780B8 (en) 2020-08-19
HUE050516T2 (hu) 2020-12-28
US9650648B2 (en) 2017-05-16
JP2015533786A (ja) 2015-11-26
PH12015500433B1 (en) 2015-04-20
KR102474010B1 (ko) 2022-12-02
JP2022001072A (ja) 2022-01-06
KR102218562B1 (ko) 2021-02-19
CN104704110B (zh) 2018-06-01
ZA201500900B (en) 2017-09-27
EA039384B1 (ru) 2022-01-20
EP2890780A2 (en) 2015-07-08
PT2890780T (pt) 2020-08-03
ES2812599T3 (es) 2021-03-17
US20140080216A1 (en) 2014-03-20
HRP20201443T1 (hr) 2020-12-11
AU2013308770A1 (en) 2015-03-05
US20180223311A1 (en) 2018-08-09
KR20220164090A (ko) 2022-12-12
CN104704110A (zh) 2015-06-10
PH12015500433A1 (en) 2015-04-20
MX367081B (es) 2019-08-05
JP2018121661A (ja) 2018-08-09
CA2882499C (en) 2023-09-26
PL2890780T3 (pl) 2021-02-08
SG11201500852WA (en) 2015-04-29
CA3171494A1 (en) 2014-03-06
US11492643B2 (en) 2022-11-08
MX2015002409A (es) 2015-10-05
CL2015000450A1 (es) 2015-07-10
KR20150047498A (ko) 2015-05-04
KR20210020174A (ko) 2021-02-23
US9963715B2 (en) 2018-05-08
CA2882499A1 (en) 2014-03-06
EA201590167A1 (ru) 2015-11-30
AU2013308770B2 (en) 2019-01-17
SG10201701601WA (en) 2017-04-27
RS60838B1 (sr) 2020-10-30
WO2014036219A2 (en) 2014-03-06
DK2890780T3 (da) 2020-09-21
LT2890780T (lt) 2020-11-10
US20140093913A1 (en) 2014-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA118957C2 (uk) Спосіб і композиція для лікування генетичного захворювання
JP7094323B2 (ja) 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
JP6788082B2 (ja) ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
US20240093193A1 (en) Dead guides for crispr transcription factors
US11624078B2 (en) Protected guide RNAS (pgRNAS)
JP2023134462A (ja) 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
EP3237615B2 (en) Crispr having or associated with destabilization domains
US20210130800A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
JP2021106611A (ja) ヌクレアーゼ介在性遺伝子発現調節
US20210222164A1 (en) Crispr-cas systems having destabilization domain
JP2021100410A (ja) Ｃｒｉｓｐｒｃｐｆ１の結晶構造
JP2020537516A (ja) 標的化された核酸編集のためのシステム、方法、及び組成物
JP2019534695A (ja) Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
TW201716572A (zh) 新型ｃｒｉｓｐｒ酶以及系統
JP2020500537A (ja) 機能的ミエリン産生を増進させるための方法および組成物
WO2024020346A2 (en) Gene editing components, systems, and methods of use
WO2023212677A2 (en) Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches