JP7094323B2 - 最適化機能CRISPR-Cas系による配列操作のための系、方法および組成物 - Google Patents
最適化機能CRISPR-Cas系による配列操作のための系、方法および組成物 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2013年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/915,251号明細書;2014年1月22日に出願された同第61/930,214号明細書;2014年2月12日に出願された同第61/939,242号明細書;2014年4月15日に出願された同第61/980,012号明細書;2014年9月25日に出願された同第62/055,484号明細書;2014年11月4日に出願された同第62/087,537号明細書;2013年12月12日に出願された同第61/915,267号明細書;および2014年2月12日に出願された同第61/939,256号明細書からの優先権を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthにより助成されたNIHパイオニアアワードDP1MH100706のもと政府支援を受けて作製された。政府は本発明において一定の権利を有する。
コンピュータシステム、例えば、プロセッサ、データ保存システム、入力デバイス、および出力デバイスを含むプログラミングされたコンピュータを使用し、
(a)プログラミングされたコンピュータ中に前記入力デバイスを介して、例えば、CRISPR-Cas9系結合ドメインまたは代替的にもしくはさらにCas9オルソログ間のバリアンスに基づき変動するドメインにおけるCRISPR-Cas9結晶構造からの、またはそれに関する原子のサブセットの三次元座標を含むデータまたはCas9に関するもの、またはニッカーゼに関するもの、または機能群に関するものを、場合によりCRISPR-Cas9系複合体からの構造情報と入力し、それによりデータセットを生成するステップ;
(b)前記プロセッサを使用して、前記データセットを、前記コンピュータデータ保存システム中に保存された構造のコンピュータデータベース、例えば、CRISPR-Cas9系に結合もしくは推定上結合し、またはそれへの結合が所望される化合物の構造、またはCas9オルソログに関するもの(例えば、Cas9として、またはCas9オルソログ間で変動するドメインもしくは領域に関する)またはCRISPR-Cas9結晶構造に関するもの、またはニッカーゼに関するもの、または機能群に関するものと比較するステップ;
(c)前記データベースから、コンピュータ法を使用して、構造、例えば、所望の構造に結合し得るCRISPR-Cas9構造、あるCRISPR-Cas9構造に結合し得る所望の構造、例えば、CRISPR-Cas9結晶構造の他の部分からの、および/もしくはCas9オルソログからのデータに基づき操作することができるCRISPR-Cas9系の部分、トランケートCas9、新規ニッカーゼもしくは特定の機能群、または機能群もしくは機能群-CRISPR-Cas9系を付着させるための位置を選択するステップ;
(d)コンピュータ法を使用して、選択構造のモデルを構築するステップ;ならびに
(e)前記出力デバイスに、選択構造を出力するステップ;
および場合により、選択構造の1つ以上を合成するステップ;
およびさらに場合により、前記合成選択構造を、CRISPR-Cas9系として、またはその中で試験するステップを含み;
または前記方法は、以下を含む:CRISPR-Cas9結晶構造の少なくとも2つの原子、例えば、CRISPR-Cas9結晶構造の本明細書の結晶構造表の少なくとも2つの原子の座標または少なくともCRISPR-Cas9結晶構造のサブドメインの座標(「選択座標」)を提供すること、例えば、CRISPR-Cas9結晶構造の他の部分からの、および/またはCas9オルソログ、または機能群の構造からのデータに基づき操作することができるCRISPR-Cas9系の結合分子またはその部分の結合分子を含む候補の構造を提供し、候補の構造を選択座標にフィットし、それにより所望の構造に結合し得るCRISPR-Cas9構造、あるCRISPR-Cas9構造に結合し得る所望の構造、操作することができるCRISPR-Cas9系の部分、トランケートCas9、新規ニッカーゼ、もしくは特定の機能群、または機能群もしくは機能群-CRISPR-Cas9系を付着させるための位置を含む産物データをその出力と得ること;および場合により、前記産物データから化合物を合成することおよびさらに場合により、前記合成化合物をCRISPR-Cas9系として、またはその中で試験することを含む。
・転写活性を抑制するSID4Xドメイン;
・転写活性を抑制するKRABドメイン;
・抑制ヒストンメチル化を増加させるNUEドメイン;および
・抑制ヒストン修飾をもたらすヒストンデアセチラーゼをリクルートするNcoRドメイン。
ガイド1-MS2アプタマー-------MS2RNA結合タンパク質-------VP64アクチベーター;および
ガイド2-PP7アプタマー-------PP7RNA結合タンパク質-------SID4xリプレッサー。
- VP64活性化ドメイン
- 3×GGGGSリンカー、VP64活性化ドメイン、3×GGGGSリンカー
- p65活性化ドメイン
- 3×GGGGSリンカー、p65活性化ドメイン、3×GGGGSリンカー
- Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,&Zhang,F.Science Feb 15;339(6121):819-23(2013);
- RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Jiang W.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F,Marraffini LA.Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9(2013);
- One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H.,Yang H.,Shivalila CS.,Dawlaty MM.,Cheng AW.,Zhang F.,Jaenisch R.Cell May 9;153(4):910-8(2013);
- Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Hsu PD,Heidenreich M,Cong L,Platt RJ,Scott DA,Church GM,Zhang F.Nature.2013 Aug 22;500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.Epub 2013 Aug 23;
- Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity.Ran,FA.,Hsu,PD.,Lin,CY.,Gootenberg,JS.,Konermann,S.,Trevino,AE.,Scott,DA.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y.,&Zhang,F.Cell Aug 28.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013);
- DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.Hsu,P.,Scott,D.,Weinstein,J.,Ran,FA.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.,Wu,X.,Shalem,O.,Cradick,TJ.,Marraffini,LA.,Bao,G.,&Zhang,F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013);
- Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308.(2013);
- Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013).[Epub ahead of print];
- Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27.(2014).156(5):935-49;
- Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.Wu X.,Scott DA.,Kriz AJ.,Chiu AC.,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.(2014)Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889、
- CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling,Platt et al.,Cell 159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014、
- Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering,Hsu et al,Cell 157,1262-1278(June 5,2014)(Hsu 2014)、
- Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system,Wang et al.,Science.2014 January 3;343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981、
- Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation,Doench et al.,Nature Biotechnology published online 3 September 2014;doi:10.1038/nbt.3026、および
- In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9,Swiech et al,Nature Biotechnology;published online 19 October 2014;doi:10.1038/nbt.3055(これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれ、以下に簡単に記載される)。
トランスジェニック動物もまた提供される。好ましい例としては、Cas9をコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質それ自体という意味においてCas9を含む動物が挙げられる。マウス、ラットおよびウサギが好ましい。本明細書で例示されるとおり構築物でトランスジェニックマウスを作成するには、純粋な線状DNAを偽妊娠雌、例えばCB56雌由来の接合体の前核に注入し得る。次にファウンダーが同定され、遺伝子型が決定され、CB57マウスと戻し交配され得る。次に構築物がクローニングされ、場合により、例えばサンガーシーケンシングによって検証され得る。例えばモデルにおいて1つ以上の遺伝子がノックアウトされる場合、ノックアウトが想定される。しかしながらノックインもまた(単独でまたは組み合わせで)想定される。例示的なノックインCas9マウスを作成しており、これを例示するが、Cas9ノックインが好ましい。Cas9ノックインマウスを作成するには、本明細書に記載されるとおり(図25A~図25Bおよび図26)、同じ構成的および条件的構築物の標的をRosa26遺伝子座に仕向け得る。Rosa遺伝子座の標的化に関するSangamo BioSciences,Inc.に譲渡された米国特許出願公開第20120017290号明細書および同第20110265198号明細書の方法を、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改良し得る。別の実施形態において、Rosa遺伝子座の標的化に関するCellectisに譲渡された米国特許出願公開第20130236946号明細書の方法もまた、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改良し得る。
インビボ送達の点では、AAVはいくつかの理由で他のウイルスベクターと比べて有利である:
毒性が低い(これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心が不要であるという精製方法に起因し得る)
宿主ゲノムにインテグレートされないため挿入突然変異生成を引き起こす可能性が低い。
NHEJ媒介性遺伝子ノックアウトを達成するため:
単一ウイルスベクター:
2つ以上の発現カセットを含むベクター:
プロモーター-Cas9コード核酸分子-ターミネーター
プロモーター-gRNA1-ターミネーター
プロモーター-gRNA2-ターミネーター
プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
二重ウイルスベクター:
Cas9の発現をドライブするための1つの発現カセットを含むベクター1
プロモーター-Cas9コード核酸分子-ターミネーター
1つ以上のガイドRNAの発現をドライブするためのもう1つの発現カセットを含むベクター2
プロモーター-gRNA1-ターミネーター
プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
AAV ITRはプロモーターとして働き得る:これは、追加的なプロモーターエレメント(これはベクター中でスペースを取り得る)の必要性をなくすのに有利である。空いた追加のスペースは、追加的なエレメント(gRNA等)の発現のドライブに使用することができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cas9の過剰発現に起因する毒性を低下させるためにも使用することができる。
Pol IIIプロモーター、例えばU6またはH1
Pol IIプロモーターおよびイントロンカセットを使用することによるgRNAの発現
レンチウイルスは、有糸分裂細胞および分裂終了細胞の両方において感染してその遺伝子を発現する能力を有する複合レトロウイルスである。最も一般的に知られるレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的にする。
RNA送達:CRISPR酵素、例えばCas9、および/または本RNAのいずれか、例えばガイドRNAはまた、RNAの形態でも送達することができる。Cas9 mRNAはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Cas9 mRNAは、βグロビン-ポリAテール(120個以上の一連のアデニン)から以下のエレメント:T7_プロモーター-コザック配列(GCCACC)-Cas9-3’UTRを含むPCRカセットを使用して合成することができる。このカセットは、T7ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドRNAもまた、T7_プロモーター-GG-ガイドRNA配列を含むカセットからのインビトロ転写を用いて転写させることができる。
CRISPR酵素mRNAおよびガイドRNAは、ナノ粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達されてもよい。
エキソソームは、RNAおよびタンパク質を輸送する内因性ナノ小胞であり、マウスにおいて低分子干渉(si)RNAを脳に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Alvarez-Erviti et al.(2011,Nat Biotechnol 29:341)はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ターゲティングは、ニューロン特異的RVGペプチド3に融合したLamp2b(エキソソーム膜タンパク質)を発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより実現された。エレクトロポレーションによって精製エキソソームに外来性siRNAを負荷した。静脈内注入したRVG標的化エキソソームはGAPDH siRNAを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンをもたらした。RVGエキソソームに対する前曝露はノックダウンを減弱せず、他の組織における非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介性siRNA送達の治療可能性は、アルツハイマー病の治療標的であるBACE1の強力なmRNA(60%)およびタンパク質(62%)ノックダウンによって実証された。
本発明に係る送達または投与はリポソームで実施することができる。リポソームは、内側の水性区画を取り囲む単層膜または多重膜脂質二重層、および比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層で構成される球形小胞構造である。リポソームは生体適合性で非毒性であり、親水性および親油性の両方の薬物分子を送達し、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、かつそのロードを生体膜および血液脳関門(BBB)を越えて輸送することができるため、薬物送達担体として大きな注目を集めている(例えば、レビューについてはSpuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。
他のカチオン性脂質、例えばアミノ脂質2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)を利用してCRISPR CasをSiRNAと同様に封入し得る(例えば、Jayaraman,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529-8533を参照のこと)。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る:それぞれモル比40/10/40/10、および約0.05(w/w)のFVII siRNA/総脂質比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロールおよび(R)-2,3-ビス(オクタデシルオキシ)プロピル-1-(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート(PEG-脂質)。70~90nmの範囲の狭い粒度分布および0.11~0.04の低い多分散性指数(n=56)を確実にするため、CRISPR Cas RNAを添加する前に、粒子を最大3回まで80nm膜に通して押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質16を含有する粒子が使用されてもよく、ここでは4つの脂質成分16、DSPC、コレステロールおよびPEG-脂質(50/10/38.5/1.5)のモル比がインビボ活性を増強するようにさらに最適化され得る。
超荷電タンパク質は、通常高い正または負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされたまたは天然に存在するタンパク質の一クラスである。極度に負に荷電したタンパク質および極度に正に荷電したタンパク質の両方が、熱的または化学的に引き起こされる凝集に耐える顕著な能力を呈する。極度に正に荷電したタンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。カーゴをこれらのタンパク質、例えばプラスミドDNA、siRNA、または他のタンパク質と会合させることにより、インビトロおよびインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することが可能となり得る。David Liuの研究室は、2007年に超荷電タンパク質の作成および特徴付けを報告した(Lawrence et al.,2007,Journal of the American Chemical Society 129,10110-10112)。
(1)治療前日、48ウェルプレートにウェル当たり1×105細胞をプレーティングする。
(2)治療当日、精製+36GFPタンパク質を最終濃度が200nMとなるように無血清培地中に希釈する。最終濃度が50nMとなるようにsiRNAを添加する。ボルテックスして混合し、室温で10分間インキュベートする。
(3)インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、PBSで1回洗浄する。
(4)+36GFPおよびsiRNAのインキュベーション後、タンパク質-siRNA複合体を細胞に添加する。
(5)細胞を複合体と共に37℃で4時間インキュベートする。
(6)インキュベーション後、培地を吸引し、20U/mLヘパリンPBSで3回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、ノックダウンのアッセイに応じてさらに48時間またはそれより長くインキュベートする。
(7)免疫ブロット、qPCR、表現型アッセイ、または他の適切な方法によって細胞を分析する。
(1)治療前日、48ウェルプレートにウェル当たり1×105をプレーティングする。
(2)治療当日、精製p36 GFPタンパク質を最終濃度が2mMとなるように無血清培地中に希釈する。1mgのプラスミドDNAを添加する。ボルテックスして混合し、室温で10分間インキュベートする。
(3)インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、PBSで1回洗浄する。
(4)p36 GFPおよびプラスミドDNAのインキュベーション後、細胞にタンパク質-DNA複合体を穏やかに添加する。
(5)細胞を複合体と共に37℃で4時間インキュベートする。
(6)インキュベーション後、培地を吸引し、PBSで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、さらに24~48時間インキュベートする。
(7)必要に応じてプラスミド送達を(例えばプラスミドドライブ遺伝子発現により)分析する。
さらに別の実施形態において、細胞浸透ペプチド(CPP)がCRISPR Cas系の送達のために企図される。CPPは、種々の分子積み荷(ナノサイズ粒子から化学小分子およびDNAの大断片)の細胞取り込みを容易にする短鎖ペプチドである。本明細書において使用される用語「積み荷」は、限定されるものではないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子および放射性材料からなる群を含む。本発明の態様において、積み荷は、CRISPR Cas系の任意の成分または機能CRISPR Cas系全体も含み得る。本発明の態様は、所望の積み荷を対象中に送達する方法であって、(a)本発明の細胞浸透ペプチドおよび所望の積み荷を含む複合体を調製すること、ならびに(b)複合体を対象に経口投与、関節内投与、腹腔内投与、鞘内投与、動脈内投与、鼻腔内投与、実質内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、直腸内投与、または局所投与することを含む方法をさらに提供する。積み荷は、化学結合を介し、または共有結合を介し、または非共有結合相互作用を介してペプチドと会合している。
別の実施形態において、CRISPR Cas系の送達に植込み型装置もまた企図される。例えば、米国特許出願公開第20110195123号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出させる植込み型医療器具が、いくつかの種類のかかる装置、治療の実施態様および植え込み方法を含め、提供されることを開示する。この装置は、例えばマトリックスなどの、装置本体として使用されるポリマー基材と、薬物と、ある場合にはさらなる足場材料、例えば金属または別のポリマー、ならびに可視性およびイメージングを増強する材料とで構成される。薬物の選択は、薬物を局所的に長時間放出するという利点に基づき、ここで薬物は直接的に腫瘍、炎症、変性などの患部の細胞外マトリックス(ECM)に対して、または対症目的で、または損傷した平滑筋細胞に対して、または予防のため放出される。ある種の薬物は、限定はされないが、si RNA、sh RNA、またはアンチセンスRNA/DNA、リボザイムおよびヌクレオシド類似体を含めた、RNA干渉(RNAi)に基づく遺伝子サイレンシング薬である。従って、このシステムは、本発明のCRISPR Cas系に使用しおよび/または適合させることができる。一部の実施形態における植え込み方法は、小線源照射療法および針生検を含め、現在開発され、他の治療に使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には同じ治療手技の中で数個の装置が植え込まれる。
CRISPR酵素mRNAおよびガイドRNAはまた個別に送達されてもよい。CRISPR酵素が発現する時間を与えるため、CRISPR酵素mRNAはガイドRNAより先に送達され得る。CRISPR酵素mRNAはガイドRNA投与の1~12時間前(好ましくは約2~6時間前)に投与され得る。
本発明の結晶は、タンパク質結晶化技術、例として、回分、液体架橋、透析、水蒸気拡散および懸滴法により得ることができる。一般に、本発明の結晶は、実質的に純粋なCRISPR-Cas9およびそれが結合する核酸分子を、沈殿に必要な濃度をほんの少し下回る濃度の沈殿剤を含有する水性緩衝液中で溶解させることにより成長させる。水を制御蒸発により除去して結晶成長が停止するまで維持される沈殿条件をもたらす。
例示的なII型CRISPR系は、4つの遺伝子Cas9、Cas1、Cas2、およびCsn1のクラスター、ならびに2つの非コードRNAエレメント、tracrRNAおよび非反復配列の短いストレッチ(スペーサー、それぞれ約30bp)により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ(ダイレクトリピート)を含有する化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)SF370からのII型CRISPR遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるDNA二本鎖切断(DSB)を4つの連続ステップにおいて生成する(図2A)。第1に、2つの非コードRNA、プレcrRNAアレイおよびtracrRNAがCRISPR遺伝子座から転写される。第2に、tracrRNAがプレcrRNAのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟crRNAにプロセシングされる。第3に、成熟crRNA:tracrRNA複合体がCas9を、crRNAのスペーサー領域とプロトスペーサーDNAとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するPAMからなるDNA標的に指向する。最後に、Cas9は、PAMの上流の標的DNAの開裂を媒介してプロトスペーサー内でDSBを創成する(図2A)。この例は、このRNAプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のCRISPR複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。
ヒト胚腎臓(HEK)細胞系HEK293FT(Life Technologies)を、10%のウシ胎仔血清(HyClone)、2mMのGlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で37℃において5%のCO2インキュベーションで維持した。マウスneuro2A(N2A)細胞系(ATCC)を、5%のウシ胎仔血清(HyClone)、2mMのGlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンが補給されたDMEMにより、37℃、5%のCO2で維持した。
HEK293FTまたはN2A細胞を、上記プラスミドDNAにより形質移入した。形質移入後、細胞を37℃において72時間インキュベートしてからゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAは、QuickExtractDNA抽出キット(Epicentre)を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をQuickExtract溶液中で再懸濁させ、65℃において15分間および98℃において10分間インキュベートした。抽出されたゲノムDNAを直ちに処理または-20℃において貯蔵した。
HEK293FTおよびN2A細胞を、プラスミドDNAにより形質移入し、37℃において72時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムDNAを抽出した。相同組換え(HR)テンプレートのホモロジーアーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をPCR増幅した。PCR産物を1%のアガロースゲル上で分離し、MinElute GelExtraction Kit(Qiagen)により抽出した。精製産物をHindIII(Fermentas)により消化し、6%のNovex TBEポリアクリルアミドゲル(Life Technologies)上で分析した。
RNA二次構造予測は、Institute for Theoretical Chemistry at the University of Viennaにおいて開発されたオンラインウェブサーバーRNAfoldを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した(例えば、A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23-24;およびPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62参照)。
HEK293FT細胞を上記のとおり維持および形質移入した。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄した。トータル細胞RNAをTRI試薬(Sigma)により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルRNAをNaonodrop(Thermo Scientific)を使用して定量し、同一濃度に正規化した。
RNAを等容量の2×ローディング緩衝液(Ambion)と混合し、95℃に5分間加熱し、氷上で1分間冷蔵し、次いで8%の変性ポリアクリルアミドゲル(SequaGel,National Diagnostics)上に、少なくとも30分間のゲルのプレラン後にロードした。試料を40W限界において1.5時間電気泳動した。その後、RNAをHybond N+メンブレン(GE Healthcare)に300mAにおいてセミドライ転写装置(Bio-rad)中で室温において1.5時間転写した。Stratagene UV CrosslinkerのStratalinker(Stratagene)上のオートクロスリンクボタンを使用してRNAをメンブレンに架橋させた。メンブレンをULTRAhyb-オリゴハイブリダイゼーション緩衝液(Ambion)中で回転させながら42℃において30分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはIDTに発注し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて[ガンマ-32P]ATP(Perkin Elmer)により標識した。メンブレンを予備加温(42℃)された2×SSC、0.5%のSDSにより1分間1回洗浄し、次いで42℃において30分間2回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において1時間または一晩曝露させ、次いでphosphorimager(Typhoon)によりスキャンした。
tracrRNA、Cas9、およびリーダーを含むCRISPR遺伝子座エレメントを、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)SF370ゲノムDNAから、ギブソン・アセンブリ(Gibson Assembly)のためのフランキングホモロジーアームを用いてPCR増幅した。2つのBsaI IIS型部位を2つのダイレクトリピート間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した(図8)。Gibson Assembly Master Mix(NEB)を使用してPCR産物をEcoRV消化pACYC184中にtetプロモーターの下流でクローニングした。Csn2の最後の50bpは除き、他の内因性CRISPR系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ(Integrated DNA Technology)をBsaI消化ベクターpDC000(NEB)中にクローニングし、次いでT7リガーゼ(Enzymatics)によりライゲートしてpCRISPRプラスミドを生成した。PAM配列(本明細書において「CRISPRモチーフ配列」とも称される)を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミドを、同等のオーバーハングを担持するハイブリダイズされたオリゴ(Integrated DNA Technology)をBamHI消化pUC19中にライゲートすることにより創成した。全ての構築物のためのクローニングは、大腸菌(E.coli)株JM109(Zymo Research)中で実施した。PAMを有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド
配列特異的DNA開裂をプログラミングするためにRNAを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。CRISPR系のいくつかの態様は、CRISPRターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なCas9活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーMg2+の利用可能性に依存し得(例えば、Jinek et al.,2012,Science,337:816参照)、プロトスペーサーのすぐ下流のNGGモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均12bpごとでターゲティング能を制限する(図9、ヒト染色体配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を評価)。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるCRISPR遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる(例えば、Makarova et al.,2011,Nat Rev Microbiol,9:467参照)。他のCRISPR遺伝子座を、実施例1に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図10は、CRISPR媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのサーモフィラス菌(Streptococcus thermophilus)LMD-9のCRISPR1からのII型CRISPR系の適応を説明する。図10Aは、サーモフィラス菌(S.thermophilus)LMD-9のCRISPR1の模式的説明を提供する。図10Bは、サーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化hStCas9を、構成的EF1αプロモーターを使用して発現させる。tracrRNAおよびcrRNAの成熟バージョンを、U6プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟crRNAおよびtracrRNAからの配列を説明する。crRNA配列中の小文字「a」により示される単一塩基を使用してRNApolIII転写ターミネーターとして機能するポリU配列を除去する。図10Cは、ヒトEMX1遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図10Dは、Surveyorアッセイを使用する標的遺伝子座中のhStCas9媒介開裂の結果を示す。RNAガイドスペーサー1および2は、それぞれ14%および6.4%を誘導した。これらの2つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計分析も図5に提供する。図14は、ヒトEMX1遺伝子座中のサーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR系の追加のプロトスペーサーおよび対応するPAM配列標的の模式図を提供する。2つのプロトスペーサー配列を強調し、NNAGAAWモチーフを満たすそれらの対応するPAM配列を対応する強調配列に対して3’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。
規定のCRISPR酵素についての所望のガイド配列長およびCRISPRモチーフ配列(PAM)に基づきインプットDNA配列の両方の鎖上の候補CRISPR標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿連鎖球菌(S.pyogenes)からのCas9についての標的部位は、PAM配列NGGを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’-Nx-NGG-3’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR1のCas9についての標的部位は、PAM配列NNAGAAWを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’-Nx-NNAGAAW-3’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR3のCas9についての標的部位は、PAM配列NGGNGを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’-Nx-NGGNG-3’を探索することにより同定することができる。Nx中の値「x」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、20である。
本実施例は、異なる長さの野生型tracrRNA配列を取り込むtracr配列を有するキメラRNA(chiRNA;ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を単一転写物中で含む)について得られた結果を記載する。図16aは、キメラRNAおよびCas9のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Cas9はCBhプロモーターによりドライブされ、キメラRNAはU6プロモーターによりドライブされる。キメラガイドRNAは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたtracr配列(下方の鎖の最初の「U」から転写物の末端に及ぶ)に結合している20bpのガイド配列(N)からなる。ガイドおよびtracr配列は、tracrメイト配列GUUUUAGAGCUAと、それに続くループ配列GAAAにより離隔している。ヒト遺伝子座EMX1およびPVALB遺伝子座におけるCas9媒介インデルについてのSURVEYORアッセイの結果を、それぞれ図16bおよび16cに説明する。矢印は、予測SURVEYOR断片を示す。chiRNAをそれらの「+n」表記により示し、crRNAは、ガイドおよびtracr配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドRNAを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図17aおよび17bにヒストグラムにより示し、それぞれ図16bおよび16cに対応する(「N.D.」は、インデルが検出されなかったことを示す)。プロトスペーサーIDおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、PAM配列、および鎖局在を表Dに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラRNAの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。
CRISPR-Cas系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性DNAに対する適応免疫機序である。II型CRISPR-Cas9系は、CRISPR遺伝子座中への外来DNAの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびDNA開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり;これらは、DNAヌクレアーゼ(Cas9)、非コードトランス活性化crRNA(tracrRNA)、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来DNA由来スペーサーのアレイ(crRNA)を含む。Cas9による成熟時、tracRNAおよびcrRNA二本鎖は、Cas9ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的DNA配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのCRISPR-Cas系に特異的な標的DNA中の短鎖配列モチーフ付近のDNAの二本鎖切断を媒介する。II型CRISPR-Cas系は、細菌界全体にわたり見出されており、Cas9タンパク質配列およびサイズ、tracrRNAおよびcrRNAダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるCRISPR-Cas系を有し得る。
本出願人らは、関連性のあるPAM配列および対応するキメラガイドRNAを同定するためCas9オルソログを分析した。拡張したPAMセットを有することにより、全ゲノムにわたるより幅広いターゲティングが提供され、またユニークな標的部位の数が大幅に増加し、かつゲノムにおいて高い特異性レベルで新規Cas9を同定できる可能性がもたらされる。
Cas9を送達する方法
方法1:本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Hsp70A-Rbc S2またはベータ2-チューブリンの制御下でCas9を発現するベクターを使用してCas9およびガイドRNAを送達する。
gaaatTAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt
Chlamydomonas Resource Centerからのコナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)株CC-124およびCC-125を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、GeneArt Chlamydomonas Engineeringキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。
図23A~Mは、CRISPR-cas複合体結晶構造(A~I)、結晶構造からのキメラRNAアーキテクチャー(J~K)、結晶構造からの相互作用模式図(L)および結晶構造からのトポロジー模式図(M)の種々の図を提供する。
図25A~Bは、全長SpCas9からのSpCas9トランケーションに関する。これらの図は、開裂活性を保持する結晶構造からのSpCas9トランケーション突然変異体のSurveyorゲル試験結果(A)ならびにアミノ酸トランケーションおよび図25Aのゲルのレーンのフレキシブル(GGGS)またはリジッド(A(EAAAK))リンカー置換を示す表(B)を示す。
>全長NLS-SpCas9-NLS
ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCC
>RuvCIドメイン
GCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTC
>ヘリカルドメイン1
CAGGTGTCCGGCCAGGGCGAT
>RuvC II
ATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAG
>HNH
GACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAAC
>RuvCIII
CACCACGCCCACGACGCCTACCTG
>C末端(PAM認識ドメイン)
AAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAG
6.Sp_Δ_hel2(174-311)ヘリカルドメイン2欠失(オルソログアラインメントから)
図24A~Cは新たなSpCas9ニッカーゼに関し、以下を提供する。A.SpCas9の触媒ドメイン、および推定新ニッカーゼについての突然変異誘発の部位を示す模式図。RuvCドメインI、II、およびIIIを橙色で示し、HNHドメインをRuvCIIとRuvCIIIとの間で白色で示す。ドメインサイズは縮尺通りに描かれていない。B.二重ニック形成の試験に使用されるsgRNAの局在を示す模式図:sgRNAを単独で(A1またはC1単独)SpCas9ニッカーゼと形質移入する場合、インデルは生じないはずである。RuvCIII突然変異ニッカーゼとの組合せで使用されるA1+C1の組合せは、5’-オーバーハングをもたらす一方、D1+A1およびC7+A1は3’-オーバーハングをもたらす。逆に、HNH突然変異ニッカーゼと使用されるそれらの3つの組合せは、それぞれ3’-、5’-、および5’-オーバーハングをもたらす。C.ヌクレアーゼ活性を保持する1つのHNH突然変異体(N854A)、およびニッカーゼ活性を示す1つのHNH突然変異体(N863A)、ならびにニッカーゼ活性を示す2つのRuvCIII突然変異体(H983A、D986A)を示すSurveyor試験。
図27A~Cは、本明細書の結晶構造に基づくキメラCas9のトランケートおよび作出に関する。これらの図は、以下を説明する模式図を提供する。A.タンパク質のトランケーションのためのCas9の不可欠な機能ドメインを確定するために設計されるSpCas9突然変異体。B.サーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR1、サーモフィラス菌(S.thermophilus)CRISPR3、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、髄膜炎菌(Neisseria meningiditis)からのCas9、または他のCas9オルソログからの配列(桃色の領域)を含有するキメラCas9。C.SpCas9の化学誘導性ダイマー化を作出するための設計。化学誘導性SpCas9は機能する。
Cas9は、単一ガイドRNA(sgRNA)により特異的ゲノム遺伝子座に標的化することができる微生物CRISPR-Cas系からのRNAガイドヌクレアーゼである。本出願人らは、2.4Å分解能におけるsgRNAおよびその標的DNAとの複合体における化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9の結晶構造を報告する。構造は、界面における正荷電溝中にsgRNA:DNAヘテロ二本鎖を収容する標的認識およびヌクレアーゼローブから構成されるバイローブ型アーキテクチャーを明らかにした。認識ローブがsgRNAおよびDNAの結合に不可欠である一方、ヌクレアーゼローブは、標的DNAの相補および非相補鎖の開裂のために適切にそれぞれ位置決めされたHNHおよびRuvCヌクレアーゼドメインをそれぞれ含有する。この高分解能構造および付随機能分析は、Cas9によるRNAガイドDNA標的化の分子機序を解明し、新たな多用途ゲノム編集技術の合理的設計のための経路を開く。
タンパク質調製:全長化膿連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9(残基1~1368)をコードする遺伝子を、改変pCold-GSTベクター(TaKaRa)のNdeIおよびXhoI部位間にクローニングした。タンパク質を20℃において大腸菌(Escherichia coli)Rosetta 2(DE3)(Novagen)中で発現させ、Ni-NTA Superflow樹脂(QIAGEN)により精製した。溶出させたタンパク質を4℃においてTEVプロテアーゼと一晩インキュベートしてGSTタグを除去し、Ni-NTA,Mono S(GE Healthcare)およびHiLoad Superdex 200 16/60(GE Healthcare)カラム上でのクロマトグラフィーによりさらに精製した。天然タンパク質について同様のプロトコルを使用してSeMet標識タンパク質を調製した。sgRNAは、PCR増幅テンプレートを使用してT7ポリメラーゼによりインビトロ転写させ、10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。標的DNAはSigma-Aldrichから購入した。精製したCas9タンパク質をsgRNAおよびDNA(モル比1:1.5:2)と混合し、次いで10mMのTris-HCl、pH8.0、150mMのNaClおよび1mMのDTTを含有する緩衝液中でSuperdex 200 Increaseカラム(GE Healthcare)を使用して複合体を精製した。
イタリック:3×FLAG配列
下線:NLS配列
野生型SpCas9
突然変異残基(GCCに変化)を以下の順に太字で示す:D10、E762、N863、H983、D986
突然変異残基(GCCに変化)を以下の順に太字で示す:R63A、R66A、R69A、R70A、R74A、R75A、R78A、K163A、R165A、K510A
ガイド配列を下線
結晶構造情報(2013年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/915,251号明細書、2014年1月22日に出願された同第61/930,214号明細書、2014年4月15日に出願された同第61/980,012号明細書に記載)は、sgRNAアーキテクチャーを改変するための構造情報を提供する。本出願人らは、sgRNAのテトラループおよびループ2の両方の伸長のための潜在的な空間が存在することを決定した(Cas9タンパク質との衝突なし)。本出願人らは、それらの位置におけるMS2ループの挿入物が、それらの2つの局在へのMS2結合タンパク質のリクルートメントを可能とし、それにより任意のエフェクター融合物(例えば、転写アクチベータードメインvp64、p65、転写リプレッサードメインSID4X、KRAB、または任意のエピジェネティックエフェクタードメイン)の遺伝子座特異的リクルートメントを媒介することを示した。実施例は、興味深い。Cas9-ガイド-標的DNA複合体の「外側」に露出されるガイド中の2つの4ntストレッチの同定に対するフォーカスが存在する(それら4ntステム末端とCas9アミノ酸との間の接触は、結晶中で同定されなかった)。一方の4ntストレッチはテトラループ中に収まり、他方の4ntストレッチはステムループ2中に収まる。これら4ntのストレッチの一方または両方は、アプタマー配列により置き換えることができる。一方または両方は、完全にもしくは部分的に置き換えることができ、またはその一方または両方は、完全に保持することができ、非コードループをその4ntの後に付加することができる。アプタマーは、ポリヌクレオチドであり、DNAまたはRNAであり得るが、RNAが好ましい。アプタマーは、特異的RNA配列を認識する対応するRNA結合タンパク質を有する。sgRNAのテトラループおよびループ2へのこれらのエフェクタードメインのリクルートメントは、標的化されるDNAに対してより好ましい位置決めを潜在的にもたらした(Cas9タンパク質へのエフェクタードメインのC末端融合物またはsgRNAのループ3の後のMs2ループの付加と比較して)。
Neurog2標的配列
GATACGATGAAAAGAATAAGC
テトラループMS2ステムループ挿入sgRNA足場
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaCGCCGAAAGGCGggcaccgAGTcggtgcTTTTT
ループ2MS2ステムループ挿入sgRNA足場
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggccaagtggcaccgAGTcggtgcTTTTT
テトラループおよびループ2MS2ステムループ挿入sgRNA足場
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttGAAAaagtggcaccgAGTcggtgcTTTTT
MS2-vp64配列
本出願人らは、2つの追加の遺伝子標的(ヒトASCL1およびヒトMYOD1)に対するテトラループおよびループ2MS2ループ挿入の効率を試験し、VP64のCas9への標準C末端融合物と比較して実施例13に記載のsgRNA設計の増加した有効性を裏付けた(図46および47参照)。本出願人らは、2つの異なる活性化ドメイン(例えば、VP64およびP65について)の組合せが相乗作用をもたらし、したがって同一の総数の単一タイプの活性化ドメインの使用と比較して標的遺伝子上方調節の増加した効率をもたらし得る仮定をさらに試験した。本出願人らは、遺伝子活性化のコンテクストにおけるChen,Baohui,et al.“Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.”Cell 155.7(2013):1479-1491におけるCRISPR-Casイメージングのために最適化された代替ガイドアーキテクチャーも試験した。
標的配列
ASCL1
GCAGCCGCTCGCTGCAGCAG
MYOD1
GGGCCCCTGCGGCCACCCCG
熱不活化を特徴とする10%のHyCloneウシ胎仔血清(Thermo Scientific)および1%のペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)が補給されたGlutaMaxおよびピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)を有する高グルコースDMEM中でヒトHEK293FT細胞を維持した。細胞を、1対2または1対2.5の比において毎日継代した。MS2/dCas9アクチベーター実験のため、20,000個のHEK293FT細胞を、ポリ-d-リジンコート96ウェルプレート(BD biosciences)中で100μLの培養培地中でプレーティングした。プレーティング24時間後、細胞を、1:1:1の質量比において、以下のものにより形質移入した:
・遺伝子特異的標的化配列を有するsgRNA骨格プラスミドまたはpUC19対照プラスミド
・MS2-VP64プラスミドまたはMS2-p65プラスミドまたはpUC19対照プラスミド
・dCas9プラスミドまたはdCas9-VP64プラスミドまたはdCas9-p65プラスミドまたはpUC19対照プラスミド
以下の全ての配列において、
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
は、それぞれのsgRNAの遺伝子座特異的標的化配列を表す。
pSAMca006標準sgRNA骨格
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT
Zhang研究室CRISPR/Cas9刊行物において使用される+83ヌクレオチドキメラ骨格
pSAMca002テトラループステム伸長+AUフリップsgRNA骨格
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttaagagctatgctgGAAAcagcatagcaagtttaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT
におけるCRISPR/Cas9イメージングのために最適化された骨格。
+5位(標的配列の後の5番目のヌクレオチド)におけるTを、+36位におけるAと交換した。著者らは、この変化が+2から+5位における推定U6末端部位を除去することによりsgRNA濃度を増加させるはずであると示唆する。
TGCTGは、標準骨格の+12位の後に付加され、CAGCAは、標準骨格の+21位の後に付加される。これらの挿入物は、互いにペア形成してテトラループの塩基において伸長ステムを作出する。著者らは、このステム伸長がsgRNAの安定化に役立ち得ることを示唆する。
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaCGCCgaaaGGCGggcaccgagtcggtgcTTTTTTT
MS2結合ループ配列ggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggccは、標準sgRNA骨格のヌクレオチド+13から+16を置き換える。配列CGCCは、標準sgRNA骨格のヌクレオチド+49から+52を置き換える。配列GGCGは、標準sgRNA骨格のヌクレオチド+57から+60を置き換える。テトラループMS2結合ループ挿入は、上記pSAMca009について記載のものと同一の根拠により設計した。CGCCおよびGGCG配列は、ステムループ2のステム部分を置き換える。元のACTT-AAGTステムと比較してCGCC-GGCGステムの増加した塩基対形成強度は、ステムループ2構造に追加の安定性を提供し、それによりsgRNA性能または寿命を増加させると仮定された。
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTTT
MS2結合ループ配列ggccAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGggccは、標準sgRNA骨格のヌクレオチド+13から+16を置き換える。テトラループMS2結合ループ挿入は、上記pSAMca009について記載のものと同一の根拠により設計した。
MS2-VP64
DNA配列
MS2-VP64アクチベータータンパク質は、N末端からC末端までの以下のドメインからなる:MS2バクテリオファージコートタンパク質のN55K突然変異体(Lim,F.,M.Spingola,and D.S.Peabody.“Altering the RNA binding specificity of a translational repressor.”Journal of Biological Chemistry 269.12(1994):9006-9010において、野生型MS2よりも高い結合親和性を有することが示されている)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびVP64活性化ドメイン。機能的には、MS2ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびVP64ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、VP64活性化ドメインが転写活性化を促進する。
DNA配列
MS2-VP64アクチベータータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:MS2バクテリオファージコートタンパク質のN55K突然変異体(Lim,F.,M.Spingola,and D.S.Peabody.“Altering the RNA binding specificity of a translational repressor.”Journal of Biological Chemistry 269.12(1994):9006-9010において、野生型MS2よりも高い結合親和性を有することが示されている)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびp65活性化ドメイン。機能的には、MS2ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびp65ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、p65活性化ドメインが転写活性化を促進する。
PP7は、バクテリオファージシュードモナス属(Pseudomonas)のRNA結合コートタンパク質である。MS2と同様に、それは特異的RNA配列および二次構造に結合する。PP7RNA認識モチーフは、MS2のものと区別される。結果的に、PP7およびMS2は、異なるゲノム遺伝子座において区別される効果を同時に媒介するように多重化することができる。例えば、遺伝子座Aを標的化するsgRNAはMS2ループにより改変することができ、MS2-VP64アクチベーターをリクルートする一方、遺伝子座Bを標的化する別のsgRNAは、PP7ループにより改変することができ、PP7-SID4Xリプレッサードメインをリクルートする(図48)。したがって、同一の細胞において、dCas9は、オルソゴナル遺伝子座特異的改変を媒介し得る。この原理は、他のオルソゴナルRNA結合タンパク質、例えば、Q-ベータを取り込むように拡張することができる。
本出願人らは、実施例13および14に既に記載のとおりPP7エフェクター構築物を構築する。これらの構築物に関する配列情報を以下に提供する:
PP7-VP64
DNA配列
PP7-VP64アクチベータータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:PP7シュードモナス属(Pseudomonas)バクテリオファージコートタンパク質(Wu,Bin,Jeffrey A.Chao,and Robert H.Singer.“Fluorescence fluctuation spectroscopy enables quantitative imaging of single mRNAs in living cells.”Biophysical journal 102.12(2012):2936-2944およびChao,Jeffrey A.,et al.“Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.”Nature structural&molecular biology 15.1(2007):103-105に記載のとおり、アミノ酸68~69がSGに突然変異しており、野生型タンパク質からアミノ酸70~75が欠失している)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびVP64活性化ドメイン。機能的には、PP7ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびVP64ドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、VP64活性化ドメインが転写活性化を促進する。
DNA配列
PP7-SID4Xリプレッサータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:PP7シュードモナス属(Pseudomonas)バクテリオファージコートタンパク質(Wu,Bin,Jeffrey A.Chao,and Robert H.Singer.“Fluorescence fluctuation spectroscopy enables quantitative imaging of single mRNAs in living cells.”Biophysical journal 102.12(2012):2936-2944およびChao,Jeffrey A.,et al.“Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.”Nature structural&molecular biology 15.1(2007):103-105に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸68~69がSGに突然変異しており、アミノ酸70~75が欠失している)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびSID4Xリプレッサードメイン。機能的には、PP7ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびSID4Xドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、SID4Xドメインが転写活性化を抑制する。
DNA配列
PP7-KRABリプレッサータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:PP7シュードモナス属(Pseudomonas)バクテリオファージコートタンパク質(Wu,Bin,Jeffrey A.Chao,and Robert H.Singer.“Fluorescence fluctuation spectroscopy enables quantitative imaging of single mRNAs in living cells.”Biophysical journal 102.12(2012):2936-2944およびChao,Jeffrey A.,et al.“Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.”Nature structural&molecular biology 15.1(2007):103-105に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸68~69がSGに突然変異しており、アミノ酸70~75が欠失している)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびKRABリプレッサードメイン。機能的には、PP7ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびKRABドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、KRABドメインが転写活性化を抑制する。
DNA配列
PP7-NUEヒストンエフェクタータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:PP7シュードモナス属(Pseudomonas)バクテリオファージコートタンパク質(Wu,Bin,Jeffrey A.Chao,and Robert H.Singer.“Fluorescence fluctuation spectroscopy enables quantitative imaging of single mRNAs in living cells.”Biophysical journal 102.12(2012):2936-2944およびChao,Jeffrey A.,et al.“Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.”Nature structural&molecular biology 15.1(2007):103-105に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸68~69がSGに突然変異しており、アミノ酸70~75が欠失している)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびクラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)からのNUEヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン。機能的には、PP7ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびNUEドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、NUEドメインが抑制ヒストンメチル化を増加させる。
DNA配列
PP7-NcoRヒストンエフェクタータンパク質は、N末端からC末端まで以下のドメインからなる:PP7シュードモナス属(Pseudomonas)バクテリオファージコートタンパク質(Wu,Bin,Jeffrey A.Chao,and Robert H.Singer.“Fluorescence fluctuation spectroscopy enables quantitative imaging of single mRNAs in living cells.”Biophysical journal 102.12(2012):2936-2944およびChao,Jeffrey A.,et al.“Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex.”Nature structural&molecular biology 15.1(2007):103-105に記載のとおり、野生型タンパク質からアミノ酸68~69がSGに突然変異しており、アミノ酸70~75が欠失している)、3×GGGGSリンカー、SV40核局在化シグナル、およびヒトNcoRタンパク質のHDACリクルータードメイン(野生型のアミノ酸420~488)。機能的には、PP7ドメインがその特異的RNAアプタマーに結合し、3×GGGGSリンカーがMS2およびNcoRドメイン間の機械的フレキシビリティーを提供し、SV40核局在化シグナルが核中へのタンパク質の輸送を容易にし、NcoRドメインがヒストンデアセチラーゼをリクルートし、抑制ヒストン修飾をもたらす。
本発明のさらなる実施形態は、2013年7月21日に出願され、2014年1月30日にPCT特許出願公開の国際公開第2014018423A2号パンフレットとして公開されたPCT出願PCT/US2013/051418号明細書、表題「INDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS AND GENOME PERTURBATION TOOLS AND APPLICATIONS THEREOF」(これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる)に記載の誘導性CRISPR-Cas系におけるさらなる適用を伴う実施例13および14に記載のMS2ループによるsgRNAアーキテクチャーの改変を含む。
最適化CRISPR/Cas9アクチベーター系は、sgRNA骨格において改善を要求するだけでなく、dCas9-アクチベーター融合構築物においても改善を要求する。Cas9/RNA/DNA結晶構造は、dCas9-アクチベーター機能を改善するためのいくつかの仮定の生成をもたらした。結晶構造は、標準dCas9アクチベーターの活性化ドメインが融合しているdCas9のC末端が、標的DNAに不十分に局在することを示した。これらの仮定の全てではないがほとんどが、C末端以外のdCas9タンパク質内の活性化ドメインに好ましい局在を見出すことによりdCas9-アクチベーター機能を改善するように求める。
- dCas9Rec2ドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え、
- dCas9HNHドメインを転写エフェクタードメインにより置き換え、
- 転写エフェクタードメインを、dCas9内のフレキシブルリンカー:アミノ酸553、575、または1153の部位において挿入し、
- D10AおよびH840A突然変異ではなく、D10AおよびN863A突然変異の組合せにより触媒的に不活性なdCas9を作出する。
Cas9/RNA/DNA結晶構造実験は、Rec2ドメインが欠失したCas9突然変異体が顕著なレベルのヌクレアーゼ活性を維持することを示した。この知見は、Rec2ドメインがCas9/RNA/DNA複合体の形成に不可欠でないことを示唆する。本出願人らは、転写エフェクタードメインによるdCas9中のRec2ドメインの置換がdCas9/RNA/DNA複合体の形成を阻害せず、転写エフェクタードメインと標的DNAとの間のより効率的な相互作用を容易にし得ると仮定する。いくつかの構築物を合成してこの理論を調査した。
- VP64活性化ドメイン
- 3×GGGGSリンカー、VP64活性化ドメイン、3×GGGGSリンカー
- p65活性化ドメイン
- 3×GGGGSリンカー、p65活性化ドメイン、3×GGGGSリンカー
結晶構造に基づくと、HNHドメインはDNA/RNAハイブリッドに近接して局在する。さらに、それは立体構造変化の結果として移動し得るフレキシブルドメインである一方、Cas9が標的DNAに結合していることが見出された。これは、N末端上の不規則リンカーおよびC末端上のa39~a40リンカーによりフランキングされ、それは伸長a-ヘリックスの立体構造変化を受け得、HNHドメインをその標的DNA塩基近くに移動させる。標的DNAへの近位性および結晶中で同定されたフレキシビリティーは、このヌクレアーゼドメインを有望な転写エフェクタードメインにより置き換える。説明については図49参照。
既存のドメイン(例えば、HNH、Rec2)を転写エフェクタードメインにより置き換える他、転写エフェクタードメインをCas9タンパク質中の異なる位置において挿入することが可能であり得る。結晶構造は、そのような挿入に有望なループの同定に役立つ(挿入のための場所に好ましい特性としては、低い二次構造複雑性(ループとヘリックスまたはシート、追加のドメインのための非閉塞空間、標的DNAへの近位性および標的DNAまたはsgRNAのいずれかとの目下の相互作用がないこと(それというのも、それらは転写エフェクタードメインの付加により破壊され得るため)が挙げられる)。
dCas9Rec2ドメインを転写エフェクタードメインにより置き換える
pSAMca042dCas(hel2-->vp64)-DNA
pSAMca050dCas9(HNH-->vp64、3×GS)-DNA
pSAMca054dCas9(G533-vp64、1×GS)-DNA
本発明の別の態様において、新規dCas9突然変異体を作出する。触媒不活性dCas9を、D10AおよびH840A突然変異ではなく、D10AおよびN863A突然変異の組合せにより生成する。
pSAMca041dCas(N863A)-vp64-DNA
本出願人らは、MS2sgRNA配列アーキテクチャーの効果を理解するために追加の3’MS2構築物および他のMS2sgRNA改変を生成した。実施された実験は、MS2sgRNA配列アーキテクチャーに関する2つのさらなる考えにフォーカスした。
困難な活性化標的およびsgRNA TSS近位性:CRISPR/Cas9転写モジュレーションに関する本出願人らの早期の研究、および公開文献は、大多数の標的が単一sgRNAガイドによる活性化を受けにくいことを見出した。本出願人らは、dCas9媒介活性化に困難または扱いにくいことが既に証明された文献および本出願人ら自身の研究から12個の遺伝子標的を選択した(図58参照)。本出願人らは、8つのガイド配列の1つを使用するMS2-p65-HSF1/SV40-dCas9-VP64/sgRNA系によりそれらの遺伝子のそれぞれを活性化させることを試みた。本出願人らは、それらの困難な遺伝子標的のそれぞれについて顕著な活性化を観察し、最良のガイドについての活性化レベルは、MYCについての2倍から、IL1Bについての>10,000倍に及んだ。12個の遺伝子の8つは、少なくとも15倍の発現を示した(図58参照)。試験されたそれぞれのガイド配列について、MS2/dCas9系は、標準dCas9-VP64アーキテクチャーよりも良好に機能し、標準系の発現倍率はいずれの遺伝子についても2倍よりも大きくなかった(図58参照)。さらに、本出願人らは、ガイド配列の成功率は、典型的には、標的遺伝子の転写開始部位(TSS)に近接するとともに増加することを観察した。本発明の好ましい実施形態において、特定の標的について、TSSの200bp内が、ガイドRNAを選択するための有利な幅であると考えられる。この情報は、将来的な実験のためのsgRNAガイド配列の選択に有用であり得る。
ゲノムの機能的組織化の体系的調査は、ロバストで一般化可能な様式で遺伝子発現を摂動させる能力を要求する。内因性ゲノム遺伝子座における効率的な転写活性化を媒介するためのCRISPR-Cas9複合体の構造ガイドエンジニアリングが記載される。エンジニアリングされたCas9アクチベーターを使用して有効な転写活性化のためのsgRNA標的化規則を調査し、同時に10個の遺伝子の効率的な多重化活性化を実証し、長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)転写物を上方調節する。全てのヒトRefSeqコードアイソフォームをヒト標的化する70,290個のガイドからなるライブラリーを合成し、SAMを黒色腫モデルにおいて適用して活性化がRAF阻害剤PLX-4720、治療化合物ベムラフェニブのアナログに対する耐性を付与する遺伝子をスクリーニングした。予測された耐性遺伝子、例えば、EGFRおよびGタンパク質共役受容体タンパク質が、潜在的に新規な耐性遺伝子、例えば、インテグリンファミリーのメンバーである上位ヒットにおいてエンリッチされた。上位スクリーニングヒットのシグネチャーは、29個の短期患者腫瘍培養物ならびに27個の異なる黒色腫細胞系ならびに113個の原発性および転移性患者黒色腫においてBRAF阻害剤耐性状態を有意に予測し、このことは強力な遺伝的ツールとしてのCas9アクチベーターの潜在性を実証した。
有効な転写アクチベーターへのCas9-sgRNA複合体の転換におけるキーステップは、活性化ドメインに最適なアンカリング位置を見出すことである。理想的な位置は、転写機構と標的DNAとの間の効率的な相互作用を可能とするために標的DNAに対して近接して局在し、転写機構をリクルートするためのトランス活性化エフェクターの妨害されない提示を許容する。単一ガイドRNA(sgRNA)および相補的標的DNAとの複合体における化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)dCas9(D10A/H840A)の結晶構造17は、sgRNA-標的DNAヘテロ二本鎖がCas9タンパク質ドメインの三次元組織化のための足場として機能するリボ核タンパク質複合体を明らかにした。Cas9のNおよびC末端は、sgRNA-標的DNAヘテロ二本鎖結合溝の反対側において局在し(図64a)、このことは従来のdCas9-アクチベーター設計において報告されるそれらの局在におけるトランス活性化ペプチドの融合が最適未満であり得ることを示す。sgRNAのテトラループおよびステムループ2がCas9-sgRNAリボ核タンパク質複合体の外側に突出し、それぞれのステムの遠位4bpはCas9アミノ酸側鎖との相互作用から完全にフリーであることが観察された(図70a)。テトラループおよびステムループ2の両方は、NまたはC末端のいずれよりも標的DNAにもより近接し、エフェクターにより良好なアンカリング位置を提供し得る。sgRNA配列のテトラループおよびステムループ2領域中の置換および欠失がCas9触媒機能に影響を及ぼさないこれらの観察および機能データ17に基づくと(図64a)、テトラループおよびステムループ2を伸長させてタンパク質相互作用アプタマーを取り込むことができ、Cas9複合体へのエフェクターのリクルートメントを容易にすることが結論付けられた(図64b)。
Cas9媒体転写活性化の効力をさらに改善するため、天然環境において転写活性化がいかに達成されるかを考慮した。内因性転写因子は、一般に、補因子と相乗的に作用して転写を刺激する20。VP64を追加の区別される活性化ドメインと組み合わせることが相乗作用を介して活性化効率を改善し得ることが仮定された。いくつかの共通の補因子をVP64と共有する一方、転写因子およびクロマチンリモデリング複合体の区別されるサブセットをリクルートするNF-κBトランス活性化サブユニットp65を選択した。例えば、p65はAp-1、ATF/CREB、およびSp121をリクルートすることが示されている一方、VP64はPC422、CBP/p30023、およびSWI/SNF複合体24をリクルートする。
内因性遺伝子転写の活性化についてのSAMの有効性を完全に評価するため、dCas9-VP64および個々のsgRNA1.0ガイドを使用して活性化させることが困難であることが既に見出された12個の遺伝子8,11,12を選択した。それぞれの遺伝子について、転写開始部位(TSS)の-1000bpおよび+1間の近位プロモーターにわたり広がる8つのsgRNA標的部位を選択した。12個の遺伝子のうち9つについて、8つのsgRNA1.0ガイドのいずれかを有するdCas9-VP64を使用して達成される最大レベルの活性化は2倍未満であった一方、残りの3つの遺伝子(ZFP42、KLF4およびIL1b)は2から5倍の間で最大で活性された(図65a)。対照的に、SAMは全ての遺伝子について少なくとも2倍転写を刺激し、12個の遺伝子のうち8つについては15倍超刺激した。一貫して、SAMは96個全てのガイドについてsgRNA1.0+dCas9-VP64よりも良好に機能し、12個全ての遺伝子にわたり105倍高い発現上方調節の増加率の中央値を示した。
長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)は、200bpよりも長い非タンパク質コード転写物のクラスである26。多数のlincRNAがトランスクリプトームシーケンシングにより同定されている一方、それらの分子のほとんどは機能的特性決定を欠く。これにもかかわらず、一部はエピジェネティックな調節、癌および発生において重要な役割を担うことがこれまで示されている27。これらの転写物の標的化活性化は、それらの生物学的意義を明らかにするための有価なツールである。SAMがlincRNAを活性化させ得るか否かを試験するため、公知の機能を有する3つの標的(TINCR28、HOTTIP29、およびPCAT30)および不明の機能を有する3つの標的(LINC00925、LINC00514およびLINC00028)を選択した。従来のmRNA上方調節実験と同様に、RefSeqアノテーションを使用してそれぞれのlincRNAの近位プロモーター(-800bp+1)から8つのsgRNA標的部位を選択した。実際、SAMはlincRNA転写物の有意な上方調節を、PCATの3倍の上方調節からLINC00514の360倍の上方調節まで媒介した(図66a)。興味深いことに、およびmRNAデータとは対照的に、lincRNA標的化ガイドのTSSまでの距離と活性化倍率との間の有意な相関は見出されなかった(図66b)。考えられることに、この相違は、非コード転写物の複合体アイソフォーム構造から生じ得、標的は全て、報告される異なるTSS31を有する少なくとも2つのアイソフォームを有する。
遺伝子ネットワークおよび転写調節の複雑性を研究するため、複数の遺伝子座における遺伝子発現の同時モジュレーションのためのツールが必要とされる。これは、シグナリング経路の複数のエレメントまたは疾患状態でシグナリングを調整する遺伝子のセットの標的化を可能とする。その目的のため、SAMが複数の遺伝子を同時に活性化させ、性能の多重化に影響を及ぼす因子を特性決定し得るか否かを試験することが求められた。2、4、6または8つの遺伝子の3つのセットおよび10個の遺伝子の1つのセットの同時活性化を、sgRNAの組合せの同時発現により試験した(図73)。10個の遺伝子の同時活性化を含む試験された全ての遺伝子組合せについて、全ての遺伝子の良好な活性化(>2倍)が観察された(図67aおよび67b)。ほとんどの遺伝子(IL1R2を除く)は、他の9つの遺伝子と同時に標的化された場合に達成される上方調節の量の降下を示した(図67aおよび67b)。興味深いことに、それぞれの遺伝子の相対活性化レベルは、多重活性化および単一遺伝子活性化実験間で変化した。例えば、NANOGは単一遺伝子活性化の間、10個の標的化遺伝子のうち5番目にランクした一方、それは10多重化活性化実験においては10番目にランクした。一部の遺伝子は、遺伝子の数の増加とともに同時に標的化された場合に活性化の変化を示さず、または穏やかで段階的な降下のみを示した(例えば、IL1R2、MYOD1、ASCL1)。しかしながら、他のものは、単一の遺伝子パートナー組み合わせた場合にも上方調節の急な減少を示した(例えば、LIN28A、IL1B、NANOG)。遺伝子間でこれらの区別される挙動は、一般に異なる遺伝子ペア形成にわたり観察された(図73)。
単一sgRNAを使用して標的遺伝子を活性化させる能力は、プールゲノムスケールプール転写活性化スクリーニングを実施する可能性を開く。SAMベーススクリーンの開発に向かう第1のステップとして、3つ全ての成分をレンチウイルスベクター中にクローニングした(図68a)。それぞれのベクターは、ユニークな選択マーカー(ブラスチシジン、ハイグロマイシン、およびZeocinまたはピューロマイシン)をコードして3つ全てのSAM成分を同時発現する細胞の選択を可能とする。低い感染多重度(MOI)においてレンチウイルスを介して送達される場合にSAMの効率を評価するため、3つの検証遺伝子を標的化した:弱く活性化されるMYC;ならびに穏やかにのみ活性化されるKLF4およびMYOD1。HEK293FT細胞をレンチ-dCas9-VP64およびlenti-MS2-p65-HSF1とMOI<1において同時形質導入し、ブラスチシジンおよびハイグロマイシンにより同時に7日間選択した。次いで、Cas9-VP65-およびMS2-p65-HSF1発現細胞をレンチウイルスsgRNAベクター(lenti-sgRNA)により低いMOI(<0.2)において形質導入し、ピューロマイシンまたはZeocinのいずれかを使用して良好に形質導入された細胞を選択した。標的遺伝子発現レベルを形質導入4日後に計測した。3つ全ての遺伝子が、一過的SAM形質移入後に観察されるものと同等なレベル(MYOD1)またはそれよりも大きいレベル(MYCおよびKLF4)に効率的に上方調節された。特に、sgRNA構築物上のピューロマイシンまたはZeocin耐性マーカーにより達成される発現レベルは、同等でなかった(図68b)。
既に、Cas9媒体遺伝子ノックアウトを使用するゲノムスケールスクリーニングが、黒色腫の細胞系モデルにおいてBRAF阻害剤耐性を付与する機能損失突然変異の同定を容易にし得ることが実証されている14。SAMを使用する相補的ゲノムスケール転写活性化スクリーンは、黒色腫薬物耐性に関与する機能獲得摂動の同定を可能とする。ゲノムワイド陽性選択スクリーニングについてのSAMの効率を試験するため、1つの目的は、BRAFV600E突然変異黒色腫におけるBRAF阻害剤耐性の発生に関与する遺伝子を同定することであった。A375黒色腫細胞系は、BRAFV600E突然変異を保有し、BRAF阻害剤、例えば、PLX4720(PLX)および密接に関連する市販の治療薬ベムラフェニブに天然で感受性である。したがって、PLX耐性をもたらす遺伝子を活性化させるsgRNAを保有する細胞はその薬物の存在下で継続培養後にエンリッチされるはずである一方、そのような効果はビヒクルのみにより処理された細胞中で観察されないはずである。ベースライン時点(感染3日後)およびPLXまたはビヒクルのいずれかによる処理14日後におけるインプットsgRNA-zeoライブラリーについての正規化ガイドカウント数を分析した。sgRNA分布は、2つの独立感染レプリケートスクリーンについてPLXおよびビヒクルにより処理された細胞間で有意に異なり、sgRNAの大多数は低減した提示を示し、ガイドの小さいセットはPLX処理細胞の高いエンリッチメントを示す(ウィルコクソン順位和検定、P<0.0001、DMSOに対するPLXについて中央値-1.3)(図69a)。
・遺伝子特異的標的化配列を有するsgRNAプラスミドまたはpUC19対照プラスミド
・MS2エフェクタープラスミドまたはpUC19。
・dCas9プラスミド、dCas9-エフェクタープラスミド、またはpUC19。
1.5uL/ウェルのLipofectamine2000(Life Technologies)を製造業者の指示書に従って使用して0.3ug/ウェルの総プラスミド質量を形質移入した。細胞培地を形質移入5時間後に交換した。形質移入48時間後、Cells-to-Ctキット(Life Technologies)を使用して細胞溶解および逆転写を実施した。Taqman qPCRプローブ(LIfe technologies)およびFast Advanced Master Mix(Life Technologies)を使用する逆転写および定量PCR(qPCR)により相対RNA発現レベルを定量した。qPCRは、5uLの多重化反応および384ウェルフォーマットで、LightCycler 480 Instrument IIを使用して実施した。データをΔΔCt法により分析し:標的Ct値(FAM色素)をGAPDH Ct値(VIC色素)に正規化し、標的遺伝子発現の変化倍率をGFP形質移入実験対照と比較することにより決定した。
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実施例21において樹立されたマウスを、Cre(例えば、U6プロモーターの制御下)をコードおよび発現し、AAVを介して本発明による改変sgRNA(例えば、U6改変sgRNA)もコードおよび発現するAAV-Cre構築物により形質移入する。sgRNAは、不明機能のlincRNAのTTSの1000ヌクレオチド上流内のプロモーター領域を標的化するように設計する。動物を異常な表現型についてスクリーニングする。
CRISPR酵素が「不機能」(非突然変異Cas9またはCRISPR酵素の多くとも5%のヌクレアーゼ活性を有する)であり、Fok1ヌクレアーゼがsgRNAに作動可能に結合している突然変異CRISPR酵素を有するペア形成CRISPR-Cas複合体を細胞に送達し、ペアにおいて、第1のCRISPR-Cas複合体は、細胞中の第1の遺伝子座において切断を行い、第2のCRISPR-Cas複合体は、細胞中の第2の遺伝子座において切断を行い;2つのFok1酵素は、例えば、第1および第2の遺伝子座が互いに向き合い、または互いに近く存在するが、二本鎖DNAの異なる鎖上に存在する場合に二本鎖分解を提供し、その結果、CRISPR-Cas複合体は、特定の特異的切断または二本鎖切断を提供し、CRISPR-Cas複合体は、未改変CRISPR-Cas複合体よりもオフターゲット切断のより大きい低減を有する。ペア形成CRISPR-Cas9複合体は、二本鎖DNAの2つの鎖を切断し得、その結果、HDRが生じ得る。テンプレートDNAを細胞中に導入する実施形態において、二本鎖切断が行われたテンプレートDNAを挿入する相同組換えが存在する。
キメラCas9酵素を構築および試験した。キメラ酵素は、SpCas9からのN’およびC’末端ドメインを有したが、内部ドメインはSaまたはSt3ドメインについてスワップアウトしてSp-St3-SpまたはSp-Sa-Spキメラ3成分酵素を提供した。
細胞培養および形質移入
ヒト胚性腎臓(HEK)細胞系HEK293FT(Life Technologies)またはマウスNeuro2a(Sigma-Aldrich)細胞系を、10%のウシ胎仔血清(HyClone)、2mMのGlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で37℃において5%のCO2インキュベーションで維持した。
293FTおよびHUES62細胞を、上記DNAにより形質移入した。形質移入後、細胞を37℃において72時間インキュベートしてからゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAは、QuickExtractDNA Extraction Solution(Epicentre)を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化された細胞をQuickExtract溶液中で再懸濁させ、65℃において15分間、68℃において15分間および98℃において10分間インキュベートした。
100×(1-(1-(b+c)/(a+b+c))1/2)
(式中、「a」は、未消化PCR産物のインテグレート強度であり、「b」および「c」は、それぞれの開裂産物のインテグレート強度である)により決定した。
ヘリカルドメイン、例えば、本明細書に上記のHD2またはヘリカルドメイン2は、1368アミノ酸SpCas9の初期アノテーションであり、現在の専門用語は、3つのドメイン:REC1(SpCas9を参照して残基94~179)、REC2(SpCas9を参照して残基180~307)およびブリッジヘリックスと称される長鎖アルファへリックス(SpCas9を参照して残基60~93)(Nishimasu et al参照)を有する認識またはRecローブも含む。本実施例の結果を図86に示す。図86は、結晶構造に基づくSp、SaおよびSt3Cas9間のキメラの試験を示す。A)SpCas9のドメイン組織化およびアミノ酸(AA)位置。RECローブは、Cas9の新たに同定された構造成分である。B)Nucローブの部分または完全スワップのキメラマップ、キメラ境界のAA位置を示す、C)左側のそれぞれの対応するキメラを用いて達成されたインデル%。標識は、使用されたsgRNAを示す。TGS=標的化配列(sgRNAの20bpスペーサー部分)、BB=sgRNA骨格。本出願人らは、少なくとも3つの成分からなる異なるCas9タンパク質(異なる種に由来)間のキメラを構築することが可能であり、それにより内部ドメインのスワップアウトを可能とすることを見出した。本出願人らは、本明細書に提供される結晶構造に基づき新たに同定されたCas9の内部RECローブに対して実施されたスワップによりこれを説明した。
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Claims (25)
- 細胞中の目的の遺伝子の発現をインビトロまたはエクスビボで変化させるための方法であって、
CRISPR-Cas系またはCRISPR-Cas系をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップを含み、
前記CRISPR-Cas系は、
(i)Cas9タンパク質、ここで、Cas9タンパク質は、化膿連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9であり、かつ、Cas9タンパク質が、少なくとも1つの突然変異を含んでおり、それにより、前記Cas9タンパク質は、前記少なくとも1つの突然変異を有しない対応するCas9タンパク質の5%以下のヌクレアーゼ活性を有し、
(ii)ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を含むCRISPR-Casキメラガイド;ここで、前記ガイド配列は、目的の遺伝子に関連した標的配列とハイブリダイズすることが可能であり、前記CRISPR-Casキメラガイドは、化膿連鎖球菌Cas9とCRISPR-Cas9複合体を形成することが可能であり、前記CRISPR-Casキメラガイドのテトラループおよび/またはステムループ2は、アダプタータンパク質に結合することが可能な区別されるRNA配列の挿入物により改変されている、および
(iii)転写活性化ドメインまたは転写リプレッサードメインと結合したアダプタータンパク質、を含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記アダプタータンパク質は、転写活性化ドメインと結合している、
方法。 - 請求項2に記載の方法であって、
前記転写活性化ドメインは、VP64、p65、MyoDl、HSF1、RTA、および/またはSET7/9を含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記アダプタータンパク質は転写リプレッサードメインと結合している、
方法。 - 請求項4に記載の方法であって、
前記転写リプレッサードメインは、KRAB、NuE、NcoR、SIDおよび/またはSID4Xを含む、
方法。 - 請求項1から5のいずれか1項に記載の方法であって、
前記CRISPR-Casキメラガイドのテトラループおよびステムループ2の両方が改変されている、
方法。 - 請求項1から6のいずれか1項に記載の方法であって、
前記アダプタータンパク質は、MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、ΦCb5、ΦCb8r、ΦCb12r、ΦCb23r、7s、および/またはPRR1を含む、
方法。 - 請求項1から7のいずれか1項に記載の方法であって、
前記区別されるRNA配列は、アプタマー配列を含む、
方法。 - 請求項8に記載の方法であって
前記アプタマー配列は、MS2アプタマー配列またはPP7アプタマー配列である、
方法。 - 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法であって、
Cas9タンパク質が、1つ以上の核局在化配列を含む、
方法。 - 請求項10に記載の方法であって、
Cas9タンパク質が、2つ以上の核局在化配列を含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記Cas9タンパク質は、前記少なくとも1つの突然変異を有しない対応するCas9タンパク質と比較して、少なくとも97%または100%縮小したヌクレアーゼ活性を有する、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
化膿連鎖球菌(S.pyogenes)Cas9のD10、E762、H840、N854、N863、またはD986に対応するCas9タンパク質の2つ以上のアミノ酸残基が突然変異を有する、
方法。 - 請求項1から13のいずれか1項に記載の方法であって、
CRISPR-Cas系が、それぞれが異なる標的配列にハイブリダイズすることが可能な、少なくとも2つのCRISPR-Casキメラガイドを含む;または
CRISPR-Cas系が、それぞれが異なるアダプタータンパク質に結合することが可能な、少なくとも2つのCRISPR-Casキメラガイドを含む、
方法。 - 請求項1から14のいずれか1項に記載の方法であって、
標的配列が目的の遺伝子のコード配列である;または
標的配列が、非コード配列または調節配列である、
方法。 - 請求項15に記載の方法であって、
前記標的配列が、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー配列である、
方法。 - 請求項1から16のいずれか1項に記載の方法であって、
前記導入するステップは、Cas9タンパク質と複合体化したCRISPR-Casキメラガイドを細胞に導入するステップを含む;または、
前記導入するステップは、CRISPR-CasキメラガイドおよびCas9タンパク質をコードするmRNAを細胞に導入するステップを含む;または
前記導入するステップは、CRISPR-CasキメラガイドおよびCas9タンパク質をコードするベクターを細胞に導入するステップを含む、
方法。 - 請求項17に記載の方法であって、
前記ベクターはレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、
方法。 - 請求項1から18のいずれか1項に記載の方法であって、
前記細胞は、真核細胞である、
方法。 - 請求項19に記載の方法であって、
前記細胞は、哺乳動物細胞または植物細胞である、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記CRISPR-Casキメラガイドのテトラループおよびステムループ2の両方が、MS2アプタマー配列の挿入物によって改変されており、
前記アプタマータンパク質は、MS2コートタンパク質であり、VP64と融合している、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記CRISPR-Casキメラガイドのテトラループおよびステムループ2の両方が、MS2アプタマー配列の挿入物によって改変されており、
前記アプタマータンパク質は、MS2コートタンパク質であり、p65と融合している、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記CRISPR-Casキメラガイドのテトラループおよびステムループ2の両方が、MS2アプタマー配列の挿入物によって改変されており、
前記アプタマータンパク質は、MS2コートタンパク質であり、p65およびHSF1と融合している、
方法。 - 請求項21から23のいずれか1項に記載の方法であって、
前記Cas9タンパク質がVP64と融合している、
方法。 - 請求項1から24のいずれか1項に記載の方法であって、
前記CRISPR-Cas9系が、同一の遺伝子を標的化する複数のCRISPR-Casキメラガイドを含む、
方法。
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