JP6529110B2 - 複数のユニットが多重に連結したdnaカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法 - Google Patents
複数のユニットが多重に連結したdnaカセットおよび該カセットを含むベクターの製造方法 Download PDFInfo
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Description
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、DNAカセット全体を設計する工程と、
組換えユニットを設計する工程と(ここで、組換えユニットは、第二の領域および第一の領域をこの順番で含んでなるものであり、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計されるか、または、固有の領域の一部若しくは全部の配列を有する二本鎖オリゴDNAを介して隣の組換えユニットと連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計される)、
設計された組換えユニット同士を連結させるか、あるいは、設計された組換えユニットを二本鎖オリゴDNAを介して連結させる工程と、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを得る工程と
を含む、
方法。
(2)上記(1)に記載の方法であって、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAである、方法。
(3)上記(1)または(2)に記載の方法であって、組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部は固有の領域内に存在する、方法。
(4)上記(2)または(3)に記載の方法であって、
以下の工程:
(1−A)Cas9の標的DNAの塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
(1−B)同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択することと、
(1−C)工程(1−B)で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(1−D)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(1−E)カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−F)カセットのガイドRNA側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドRNAまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−G)あるガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−H)工程(1−G)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(1−I)工程(1−E)、工程(1−F)、工程(1−G)および工程(1−H)で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる、方法。
(5)工程(1−B)において非対称制限酵素切断部位として制限酵素BslIの切断部位を複数選択する、上記(4)に記載の方法。
(6)工程(1−B)において非対称制限酵素切断部位として制限酵素AvaIまたはBanIIの切断部位を複数選択する、上記(4)に記載の方法。
(7)上記(2)に記載の方法であって、
方法は、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を有する二本鎖DNA断片により連結する方法であり、
以下の工程:
(2−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(2−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(2−C)核酸断片および二本鎖DNA断片であって、末端に用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片および二本鎖DNA断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
(2−D)上記工程(2−C)で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖DNA断片のすべてを得ることと、
(2−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(2−F)得られた核酸断片および二本鎖DNA断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法。
(8)上記(7)に記載の方法であって、二本鎖DNA断片がいずれもユニットに固有の領域の塩基配列を含んでなる塩基配列を有する、方法。
(9)核酸増幅断片同士を連結する二本鎖DNAの長さが一定となるように核酸断片を設計する、上記(7)または(8)に記載の方法。
(10)二本鎖DNA断片が、合成オリゴDNAのアニールにより得られた断片である、上記(7)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)IIS型制限酵素が、BsaIまたはBsmBIである、上記(7)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)上記(3)に記載の方法であって、
以下の工程:
(3−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(3−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(3−C)用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
(3−D)工程(3−C)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(3−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(3−F)工程(3−C)、(3−D)および(3−E)で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程(3−B)で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。
(13)IIS型酵素としてBsaIを用いる、上記(12)に記載の方法。
(14)IIS型酵素としてBsmBIを用いる、上記(12)に記載の方法。
(15)複数の異なるガイドRNA発現ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを有するガイドRNA発現ベクターを製造する方法であって、
上記(2)〜(14)のいずれかに記載の方法によって、DNAカセットを製造し、
その後、宿主内でベクターを増幅可能とする複製起点と、宿主内で薬剤耐性を発現する薬剤耐性遺伝子発現ユニットとを有するベクターに、得られたDNAカセットを組み込むことを含んでなる、方法。
(16)複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造するための、複数の異なるDNA断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各DNA断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも1塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、DNA断片の末端毎に異なる、
DNA断片
のセット。
(17)複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、DNAカセット全体を設計する工程と、
上記(16)に記載のDNA断片のセットを提供することと、
DNAカセットにおける、各DNA断片の位置を決定することと、
隣り合う2つのDNA断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖DNAを得ることと、
上記DNA断片のセットと、上記二本鎖DNAとをライゲーションして上記DNAカセットを得ることと、
を含む方法。
以下の工程:
(2−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(2−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(2−C’)カセット内で隣り合うガイドRNA発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片であって、別の標的配列を有する核酸増幅断片とは異なる非対称粘着末端を生じるIIS型制限酵素切断部位および認識部位を末端に有する、ガイドRNAとプロモーター領域とを含む核酸増幅断片を準備し、
その後、核酸増幅断片を当該IIS型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得ることと、
(2−D’)上記非対称粘着末端を有する断片とライゲーションすることにより、設計したカセット中のプロモーターと標的配列とガイドRNAとがシームレスに連結することができる配列と末端を有する、二本鎖DNA断片を準備することと、
(2−E’)工程(2−C’)および工程(2−D’)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(2−F’)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(2−G’)工程(2−C’)、(2−D’)、(2−E’)および(2−F’)で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程(2−B)で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。
(19)上記(18)に記載の方法であって、
工程(2−C’)において、核酸増幅断片は、以下(i)および(ii)を満たすように設計され、
(i)両末端に非対称粘着末端を生じるIIS型制限酵素の認識部位および付加塩基を該断片の末端にさらに有し、該認識部位および付加塩基は、酵素切断により断片から除去されるように配置されており、切断後の断片はカセットに含まれない余分な塩基配列を含まず;かつ、
(ii)IIS型制限酵素による切断後の非対称粘着末端を有する核酸増幅断片の一端は、ガイドRNAの一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、かつ、他端は、プロモーター領域の一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、
前記欠失した領域の長さまたは付加された領域の長さが核酸増幅断片毎に異なることに、切断後に生じる非対称粘着末端いずれもが核酸増幅断片毎にそれぞれ異なる塩基配列を有し、
工程(2−D’)において、二本鎖DNA断片は、工程(2−C’)の断片において欠失したプロモーター領域およびガイドRNAの欠失部分が末端に付加され、付加された標的配列の付加された部分が欠失した配列を有し、これにより工程(2−C’)の付加および欠失を補うことができる塩基配列、および、工程(2−C’)で得られる断片の非対称粘着末端と完全に相補的な非対称粘着末端の塩基配列を有するように設計された、
方法。
(20)工程(2−D’)において、二本鎖DNA断片が、合成オリゴDNAのアニールにより得られた断片である、上記(18)または(19)に記載の方法。
(21)得られたカセットの全長をさらに核酸増幅反応によって増幅する、上記(1)〜(15)および(17)〜(20)のいずれかに記載の方法。
以下、図2を参照しながら第一の実施形態を説明する。図2では、ユニットが4つ連結したカセットが例示されているが、ユニット数は5つ以上であってもよい。
以下の工程:
(1−A)Cas9の標的DNAの塩基配列上から複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
(1−B)同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素認識部位を選択することと、
(1−C)工程(1−B)で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(1−D)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(1−E)カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−F)カセットのガイドRNA側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドRNAまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−G)あるガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−H)工程(1−G)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(1−I)工程(1−E)、工程(1−F)、工程(1−G)および工程(1−H)で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる。
工程(1−A)では、Cas9の標的遺伝子の塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定する。標的DNAは1つであっても複数であってもよい。非対称制限酵素認識部位は、切断後に非対称粘着末端を生じる制限酵素の部位とし、かつ、それぞれの非対称粘着末端が異なる配列となるように、複数種類同定されることが好ましい。ここで非対称制限酵素認識部位は、IIS型酵素の認識部位であってもよい。
工程(1−B)では、同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択する。第一の実施形態の方法では、同定された複数の認識部位から、それぞれ異なる配列を有する非対称粘着末端を生じるように非対称制限酵素の認識部位を1つずつ選択する。この切断部位は、のちに組換えユニットの組換え部位となる。切断部位をそれぞれ異なる配列にすることにより、後のライゲーションで、組換えユニットを所望の順番および方向で連結することが可能となる。工程(1−B)では、非対称制限酵素の切断部位は前記認識部位の内部に存在することが好ましい。
工程(1−C)では、工程(1−B)で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計する。標的配列は、例えば、20塩基長の配列である。標的配列は、同定された認識配列が含まれるように設計することができる。図2下段では、一例として、標的DNA上で制限酵素部位を含むように標的配列が決定されている。標的の配列に際しては、市販の評価プログラムを用いて、最適な標的配列を決定してもよいであろう。
工程(1−D)では、ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、例えば、図2の上段に示されるように、作製目標のカセットをこの段階で設計する。後の工程では、ここで設計されたカセットを作製するための組換えユニットを準備することとなる。工程(1−D)では、カセット内の発現ユニットはすべて同じ方向を向くよう設計することができる。設計されたカセットは、プロモーター、標的配列およびガイドRNAがシームレスに結合したものとすることができる。
工程(1−E)は、例えば図2中段における、左端の断片を作製する工程であり、カセットの末端を完成させるために必要である。具体的には、カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内のプロモーター領域から上記で選択した制限酵素認識部位を認識する制限酵素の切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。得られる核酸断片のプロモーター領域側の末端は、制限酵素処理によって各組換えユニットに固有の非対称粘着末端を生じる。
工程(1−F)は、例えば図2中段における、右端の断片を作製する工程であり、カセットのもう一つの末端を完成させるために必要である。具体的には、カセットのガイドRNA側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内の上記で選択した制限酵素認識部位を認識する制限酵素の切断部位からガイドRNAまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。得られる核酸断片のガイドRNA領域側の末端は、各組換えユニットに固有の非対称粘着末端を生じる。
工程(1−G)は、例えば図2中段における、標的配列間をつなぐ領域に対応する核酸断片を作製する工程である。具体的には、あるガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得る。
工程(1−H)では、カセットを構成するすべての断片をそろえる。すなわち、工程(1―G)を繰り返して、図2中段に示されるように、すべての断片をそろえる工程である。
工程(1−I)は、上述で得られた断片を混合してライゲーションする工程である。得られたライゲーション産物は、標的配列部分に組換えに用いた制限酵素切断部位を有するカセットであり、ガイドRNA発現ユニットが多重連結したカセットである。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。工程(1−I)では、核酸増幅反応の副産物や制限酵素処理後の不要な切断断片を除去するため、ゲル濾過カラムなどのサイズ排除カラムで処理してもよい。
次に、図5により第二の実施形態を説明する。第一の実施形態では、標的配列が、制限酵素認識部位および制限酵素切断部位を含むように設計され、核酸増幅用プライマーにより供給されたが、第二の実施形態では、標的配列は、主に二本鎖DNA断片により別途供給される点で異なる。これにより、標的配列が制限酵素認識部位および/または切断部位を含まない配列であってもよくなり、標的配列の設計の自由度が第一の実施形態の設計自由度よりも格段に高い。なお、図5では、紙面の制約からユニットが3つ連結したカセットの図が描かれているが、ユニット数は4以上であってもよい。
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
以下の工程:
(2−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(2−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(2−C’)カセット内で隣り合うガイドRNA発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片であって、別の標的配列を有する核酸増幅断片とは異なる非対称粘着末端を生じるIIS型制限酵素切断部位および認識部位を末端に有する、ガイドRNAとプロモーター領域とを含む核酸増幅断片を準備し、
その後、核酸増幅断片を当該IIS型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得ることと、
(2−D’)上記非対称粘着末端を有する断片とライゲーションすることにより、設計したカセット中のプロモーターと標的配列とガイドRNAとがシームレスに連結することができる配列と末端を有する、二本鎖DNA断片を準備することと、
(2−E’)工程(2−C’)および工程(2−D’)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(2−F’)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(2−G’)工程(2−C’)、(2−D’)、(2−E’)および(2−F’)で得られた断片を混合して、ライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程(2−B)で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる。この方法は、カセット中で隣り合う2つの固有領域に介在するユニット間で共通の領域鋳型を用いて得た核酸増幅断片を組換えユニットとして用い、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の少なくとも一部の塩基配列を有する二本鎖DNA断片により連結する、方法である。
第二の実施形態では、標的配列は任意に設計することができる。例えば、オフターゲット減少の観点では、標的となる対象生物においてユニークな配列を選択することができる。
工程(2−B)では、ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、例えば図5上段に示されるように作製目標のカセットをこの段階で設計する。設計されたカセットは、プロモーター、標的配列およびガイドRNAがシームレスに連結したものとすることができる(すなわち、組換えに用いる制限酵素認識部位は発現ユニット中に含まれていなくてもよい)。また、ガイドRNA発現ユニット間の連結部も、自由に設計することができ、制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、例えば、ガイドRNA発現ユニット間がシームレスに連結したものとしてもよい。
工程(2−C’)は、標的配列間に介在する領域を含む核酸増幅断片を作製する工程である。具体的には、カセット内で隣り合うガイドRNA発現ユニット中の標的配列間をつなぐ配列を有する核酸増幅断片を準備し、その後、核酸増幅断片を当該IIS型制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する断片を得る。ここで、核酸増幅断片は、標的配列間毎に異なる非対称粘着末端を生じる制限酵素切断部位をその両末端に有するものとする。また、制限酵素切断部位は、IIS型制限酵素の切断部位とし、制限酵素の認識部位は、酵素処理後、除去されるように配置される。また、IIS型制限酵素の切断部位は、標的配列の近傍の配列の一部からなる配列である(例えば、図5中段に示されるように、切断部位は、標的配列の一部を含んでいてもよい、プロモーター領域またはガイドRNA領域の一部の配列を有する)。また、ある核酸増幅断片中の制限酵素切断部位は、別の標的配列間をつなぐ核酸増幅断片中の制限酵素切断部位とは異なる配列を有するものとする(例えば、図5中段では、PCR断片の末端は、1塩基ずつ切断部位が異なるものとなっている)。
(i)両末端に非対称粘着末端を生じるIIS型制限酵素の認識部位および付加塩基を該断片の末端に有し、該認識部位および付加塩基は、酵素処理により断片から除去されるように配置されており、切断後の断片はカセットに含まれない余分な塩基配列を含まず;かつ、
(ii)IIS型制限酵素による切断後の非対称粘着末端を有する核酸増幅断片の一端は、ガイドRNAの一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、かつ、他端は、プロモーター領域の一部を欠失していても、標的配列の一部が付加されていてもよく、
前記欠失した領域の長さまたは付加された領域の長さを核酸増幅断片毎に相違させることにより、切断後に生じる非対称粘着末端いずれもが核酸増幅断片毎にそれぞれ異なる塩基配列を有する。ある態様では、工程(2−C’)では、すべての核酸増幅断片の一端は、ガイドRNAの一部を欠失しており、他端は、プロモーター領域の一部を欠失している。
CRISPR-Cas9系では標的配列は20塩基長程度なので、二本鎖DNA断片はオリゴDNA合成技術によって得ることが可能である。第二の実施形態の方法の特徴の一つは、標的配列を二本鎖DNA断片により供給することである。工程(2−D’)では、図5中段に示されるように標的配列を含む二本鎖DNA断片を得る工程である。二本鎖DNA断片は、標的配列間をつなぐ断片とシームレスに連結させるため、工程(2−C’)で得られる断片の配列を補完するように設計することができる。現在のオリゴDNA合成技術では、30塩基長程度のDNAの合成は容易であるから、二本鎖DNA断片は、二本の合成オリゴDNAをアニールすることにより得ることができる。
工程(2−E’)では、工程(2−C’)および工程(2−D’)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間および標的配列をカバーする複数の核酸断片を得る。
工程(2−F’)では、カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得る。すなわち、工程(2−F’)は、カセット末端のプロモーター領域およびカセットの別の末端のガイドRNA領域を核酸増幅により得る工程である。
工程(2−G’)は、上記で得られた断片をライゲーションしてカセットを形成させる工程である。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造するための、複数の異なるDNA断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各DNA断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも1塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、DNA断片の末端毎に異なる、
DNA断片
のセットが提供される。ある態様では、本発明のDNA断片のセットは、両末端がそれぞれ独立して、例えば、1塩基〜100塩基、1塩基〜50塩基、1塩基〜20塩基、または1塩基〜15塩基欠失していてもよい。
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、DNAカセット全体を設計する工程と、
DNA断片のセットを提供または作製することと、
ここで、DNA断片は、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各DNA断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも1塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、DNA断片の末端毎に異なる、
DNA断片であり、
DNAカセットにおける、各DNA断片の位置を決定することと、
隣り合う2つのDNA断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖DNAを得ることと、
上記DNA断片のセットと、上記二本鎖DNAとをライゲーションして上記DNAカセットを得ることと、
を含む方法が提供される。ある態様では、本発明のDNA断片のセットは、両末端がそれぞれ独立して、例えば、1塩基〜100塩基、1塩基〜50塩基、1塩基〜20塩基、または1塩基〜15塩基欠失していてもよい。
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
工程としては、
(2−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(2−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(2−C)核酸断片および二本鎖DNA断片であって、用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片および二本鎖DNA断片をカセット全体をカバーするように設計することと、ここで、二本鎖DNA断片は、ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を含んでなる塩基配列を有し、(2−D)上記工程(2−C)で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖DNA断片のすべてを得ることと、
(2−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(2−F)得られた核酸断片および二本鎖DNA断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法ということができる。この方法は、カセット中で隣り合う2つの固有領域に介在するユニット間で共通の領域鋳型を用いて得た核酸増幅断片を組換えユニットとして用い、核酸増幅断片同士を、各ユニットに固有の領域の少なくとも一部の塩基配列を有する二本鎖DNA断片により連結する、方法である。
第二の実施形態の変形例を図7により説明する。第二の実施形態の変形例は、第二の実施形態の方法の工程をすべて実施した後に、
(2−H)得られた複数のカセットをさらに連結する工程
を実施する。
以下、第三の実施形態の方法を図8〜11により説明する。
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットをインビトロで製造する方法であって、
各ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
組換え部位が、固有の領域中に存在し、
以下の工程:
(3−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(3−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(3−C)用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の塩基配列が切断面毎に異なる、核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
(3−D)工程(3−C)で設計された核酸断片のすべてを得ることと、
(3−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、
(3−F)工程(3−C)、(3−D)および(3−E)で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程(3−B)で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる。
工程(3−A)では、標的配列は任意に設計することができる。例えば、オフターゲット減少の観点では、標的となる対象生物においてユニークな配列を選択することができる。
工程(3−B)では、ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計する。すなわち、図8〜11のそれぞれ上段に示されるように作製目標のカセットをこの段階で設計する。設計されたカセットには、組換えに用いる制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、プロモーター、標的配列およびガイドRNAがシームレスに連結したものとすることができる。また、ガイドRNA発現ユニット間の連結部も、自由に設計することができ、制限酵素切断部位は含まれていなくてもよく、例えば、ガイドRNA発現ユニット間がシームレスに連結したものとしてもよい。
工程(3−C)は、図8〜11の2段目に示されるIIS型制限酵素で生じ得る非対称粘着末端を有する核酸断片を設計する工程である。核酸断片は、用いるIIS型制限酵素の切断面の形状に対応する形状を有している。
工程(3−D)では、工程(3−C)で設計されたすべての断片を得る。得られた断片は、対応するIIS型酵素で切断されている。
工程(3−E)は、カセットの両末端の断片を得る工程である。すなわち、カセットのプロモーター側の末端から最初の標的配列の一部までを含む断片、およびカセットの最後の標的配列の一部からガイドRNA側の末端までを含む断片を得る。
工程(3−F)は、上記で得られた断片をライゲーションして得られた断片がシームレスに連結したカセットを得る工程である。カセットは、その後、ベクターに組み込まれてもよい。
第一の実施形態および第二の実施形態の実施では、H1プロモーターを持つpBSsk-gRNAH1p、第三の実施形態の実施では、U6プロモーターを持つpBSsk-gRNAU6pを用いた。両者でガイドRNA配列は共通である。
本実施例では、第一の実施形態の一例として、CRISPR/Cas9系の異なる標的配列発現ユニットを4個持つDNAの作製例を示す。
本実施例では、第二の実施形態の一例として、CRISPR/Cas9系の異なる標的配列発現ユニットを3個持つDNAの作製例を示す。
本実施例では、第三の実施形態の一例として、CRISPR/Cas9系の異なる標的配列発現ユニットを3個持つDNAの作製例を示す。
Claims (16)
- 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、DNAカセット全体を設計する工程と、
組換えユニットを設計する工程と(ここで、組換えユニットは、第二の領域および第一の領域をこの順番で含んでなるものであり、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計されるか、または、固有の領域の一部若しくは全部の配列を有する二本鎖オリゴDNAを介して隣の組換えユニットと連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され;かつ、組換えユニットの制限酵素切断後に生じる切断面が、設計された順番で組換えユニットが連結されるように切断面毎に異なるように設計される)、
設計された組換えユニットそれぞれを制限酵素処理して、設計された順番で組換えユニットが連結されるように切断面毎に異なる切断面を有する組換えユニットの断片を得る工程と、
得られた組換えユニット同士を連結させるか、あるいは、設計された組換えユニットを二本鎖オリゴDNAを介して連結させる工程と、
複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを得る工程と
を含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部が固有の領域内に存在する、方法。
- 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程:
(1−A)Cas9の標的DNAの塩基配列上の複数個の非対称制限酵素認識部位を同定することと、
(1−B)同定された複数個の認識部位から、制限酵素切断後にそれぞれ異なる非対称粘着末端を生じる複数の非対称制限酵素の認識部位を選択することと、
(1−C)工程(1−B)で選択された認識部位それぞれを含む塩基配列を標的配列として設定して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(1−D)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(1−E)カセットのプロモーター側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内のプロモーター領域から標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−F)カセットのガイドRNA側の末端に位置するガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位からガイドRNAまでの領域を含む核酸増幅断片を得て、得られた断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−G)あるガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位から隣のガイドRNA発現ユニット内の標的配列中の制限酵素切断部位までの領域を含む核酸増幅断片を対応する制限酵素で処理して非対称粘着末端を有する核酸断片を得ることと、
(1−H)工程(1−G)を繰り返して、全体としてカセット中のすべての標的配列間をカバーする複数の核酸断片を得ることと、
(1−I)工程(1−E)、工程(1−F)、工程(1−G)および工程(1−H)で得られた非対称粘着末端を有する核酸断片をライゲーションしてカセットを得ることと、
を含んでなる、方法。 - 工程(1−B)において非対称制限酵素切断部位として制限酵素BslIの切断部位を複数選択する、請求項3に記載の方法。
- 工程(1−B)において非対称制限酵素切断部位として制限酵素AvaIまたはBanIIの切断部位を複数選択する、請求項3に記載の方法。
- 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程:
(2−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(2−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(2−C)核酸断片および二本鎖DNA断片であって、末端に用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の位置をずらすことにより切断面の塩基配列が切断面毎に異なる核酸断片および二本鎖DNA断片を、カセット全体をカバーするように設計することと、ここで、二本鎖DNA断片は、ユニットに固有の領域の一部または全部の塩基配列を含んでなる塩基配列を有し、
(2−D)上記工程(2−C)で設計された配列を有する核酸断片および二本鎖DNA断片のすべてを得ることと、
(2−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、(2−F)得られた核酸断片および二本鎖DNA断片をライゲーションして、カセットを得ることと
を含んでなる、方法。 - 請求項6に記載の方法であって、二本鎖DNA断片がいずれもユニットに固有の領域の塩基配列を含んでなる塩基配列を有する、方法。
- 核酸増幅断片同士を連結する二本鎖DNAの長さが一定となるように核酸断片を設計する、請求項6または7に記載の方法。
- 二本鎖DNA断片が、合成オリゴDNAのアニールにより得られた断片である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- IIS型制限酵素が、BsaIまたはBsmBIである、請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
組換えユニットは、隣の組換えユニットの末端と連結して上記生物学的ユニットを形成するように設計され、連結部が固有の領域内に存在し、
方法は、インビトロの方法であり、
以下の工程:
(3−A)各発現ユニットに固有の標的配列を設計して、それぞれ異なる標的配列を有する各ガイドRNA発現ユニットを設計することと、
(3−B)ガイドRNA発現ユニットの連結する順番を決定して、カセット全体を設計することと、
(3−C)用いるIIS型制限酵素による切断面の形状を有し、かつ、切断面の位置をずらすことにより切断面の塩基配列が切断面毎に異なる核酸断片をカセット全体をカバーするように設計することと、
(3−D)工程(3−C)で設計された核酸断片のすべてを得ることと、
(3−E)カセットが完成するように設計されたカセットの両末端の断片を得ることと、(3−F)工程(3−C)、(3−D)および(3−E)で得られた断片をライゲーションし、これにより、得られた断片をシームレスに連結して工程(3−B)で設計したカセットを形成させることと、
を含んでなる方法。 - IIS型酵素としてBsaIを用いる、請求項11に記載の方法。
- IIS型酵素としてBsmBIを用いる、請求項11に記載の方法。
- 複数の異なるガイドRNA発現ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを有するガイドRNA発現ベクターを製造する方法であって、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法によって、DNAカセットを製造し、
その後、宿主内でベクターを増幅可能とする複製起点と、宿主内で薬剤耐性を発現する薬剤耐性遺伝子発現ユニットとを有するベクターに、得られたDNAカセットを組み込むことを含んでなる、方法。 - 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造するための、複数の異なるDNA断片のセットであって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ、第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
該セットに含まれるDNA断片は、
第二の領域と第一の領域とがこの順番で連結した各DNA断片において、
両末端がそれぞれ独立して少なくとも1塩基欠失しており、
両末端は非対称粘着末端を有し、
非対称粘着末端の配列が、DNA断片の末端毎に異なる、
DNA断片である、
DNA断片のセット。 - 複数の生物学的ユニットが多重に連結してなるDNAカセットを製造する方法であって、
各生物学的ユニットは、ユニット間で共通の第一の領域と第二の領域と、ユニットに固有の領域とを有し、かつ第一の領域、固有の領域および第二の領域がこの順番で連結してなるユニットであり、
各生物学的ユニットは、ガイドRNA発現ユニットであり、第一の領域は、ガイドRNAを発現するためのプロモーター領域であり、固有の領域は、それぞれのガイドRNA発現ユニットに固有の標的配列であり、第二の領域は、DNA切断酵素Cas9をゲノム上の標的配列に導くガイドRNAの領域であり、
方法は、インビトロの方法であり、
各生物学的ユニットの固有の領域の配列、第一の領域および第二の領域の配列を決定する工程と、
生物学的ユニットが連結する順番を決定し、DNAカセット全体を設計する工程と、
請求項15に記載のDNA断片のセットを提供することと、
DNAカセットにおける、各DNA断片の位置を決定することと、
隣り合う2つのDNA断片をシームレスに連結する配列を有し、かつ固有の領域の配列を有する二本鎖DNAを得ることと、
上記DNA断片のセットと、上記二本鎖DNAとをライゲーションして上記DNAカ
セットを得ることと、
を含む方法。
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