KR102369533B1 - 뉴클레아제 프로파일링 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용의 일부 측면은 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 표적 부위 선호도와 특이성을 결정하기 위한 전략, 방법 및 시약을 제공한다. 본원에 제공된 일부 방법은 커팅된 표적 부위와 동일하고 이에 인접한 무손상 표적 부위를 서열 분석하는 것을 통하여 관심 뉴클레아제에 의해 커팅될 수 있었던 라이브러리 구성원을 확인하기 위하여, 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 영역의 반복 단위를 포함하는 콘카테머의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 신규 "1-커트" 전략을 활용한다. 본 개시내용의 일부 측면은 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 표적 부위 선호도와 특이성을 결정하는 것에 근거하여 상기 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 선별하기 위한 전략, 방법 및 시약을 제공한다. 표적 부위 선호도와 특이성을 결정하기 위한 방법 및 시약이 또한 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 365(c) 하에 2014년 6월 30일에 출원된 미국 출원 번호 14/320,370 및 2014년 6월 30일에 출원된 미국 출원 번호 14/320,413을 우선권 주장하며, 또한 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2013년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 61/864,289를 우선권 주장하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국방 첨단 과학기술 연구소가 수주한, 허가 번호 HR0011-11-2-0003 및 N66001-12-C-4207 하의 미국 정부 지원으로 만들어졌다. 미국 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
부위-특이적 엔도뉴클레아제는 이론상, 게놈 내의 단일 부위의 표적화된 조작을 허용해주고 유전자 표적화의 맥락에서 유용할 뿐만 아니라 치료적 적용에도 유용하다. 포유류를 포함한 각종 유기체에서는, 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 비-상동 말단 결합 또는 상동 재조합을 자극함으로써 게놈 공학을 위해 사용되어 왔다. 강력한 연구 도구를 제공하는 것 이외에도, 부위-특이적 뉴클레아제는 또한, 유전자 요법 작용제로서의 잠재력을 지니고 있고, 2개의 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 최근에 임상 시험에 들어갔는데; 그 중 하나는 항-HIV 치료적 접근 방식의 일부로서 인간 CCR-5 대립 유전자를 표적으로 하는 CCR5-2246이고 (NCT00842634, NCT01044654, NCT01252641), 다른 하나는 항암 치료적 접근 방식의 일부로서 인간 VEGF-A 프로모터를 표적으로 하는 VF24684이다 (NCT01082926).
표적을 벗어난 활성(off-target activity)을 수반하지 않거나 최소한의 표적을 벗어난 활성만을 수반하는 것으로 의도된 뉴클레아제 표적 부위를 특이적으로 절단하는 것이 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 임상 적용을 위한 전제 조건이고, 또한 기본 연구 적용에서 고-효율 게놈 조작을 위한 전제 조건인데, 이는 조작된 부위-특이적 결합성 도메인의 불완전한 특이성은 의도한 표적 이외의 게놈 유전자 자리의 바람직하지 못한 변경 및 세포성 독성과 연관이 있어 왔기 때문이다. 그러나, 현재 입수 가능한 대부분의 뉴클레아제는 상당히 표적을 벗어난 활성을 나타내므로, 임상 적용에 적합하지 않을 수 있다. 따라서, 뉴클레아제 특이성을 평가하고 개선된 특이성을 지닌 뉴클레아제를 조작하기 위한 기술이 필요하다.
본 개시내용의 일부 측면은 일부 조작된 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 보고된 독성이 표적을 벗어난 결합성 단독에 근거한다기 보다는 오히려 표적을 벗어난 DNA 절단에 근거한다는 인식에 기초한다. 본 개시내용의 일부 측면은 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어, RNA-프로그램 가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 엔도뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZNF), 귀소(homing) 엔도뉴클레아제, 또는 전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제 (TALEN)의 서열 특이성을 평가하고 명확히 규명하기 위한 전략, 조성물, 시스템 및 방법을 제공한다.
본 개시내용의 전략, 방법 및 시약은 일부 측면에서, 뉴클레아제 특이성을 검정하기 위한 기존의 방법에 비해 개선을 나타낸다. 예를 들어, 후보 표적 부위를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 스크리닝함으로써 뉴클레아제 표적 부위 특이성 프로파일을 결정하는 것으로 기존에 보고된 일부 방법은, 라이브러리 구성원 핵산의 뉴클레아제의 2개의 인접한 커트로부터 비롯된 2개의 절반-부위의 서열로부터 표적 부위를 간접적으로 재구축해야 하는 "2-커트(two-cut)" 시험관내 선별 방법에 의존하였다 (예를 들어, PCT 출원 WO 2013/066438; 및 문헌 [Pattanayak, V., Ramirez, C.L., Joung, J.K. & Liu, D.R. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nature methods 8, 765-770 (2011)] 참조; 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 이러한 "2-커트" 전략과는 반대로, 본 개시내용의 방법은 뉴클레아제에 의해 1회 이상 커팅된 적이 있는 라이브러리 구성원의 식별을 허용해 주는, 최적화된 "1 커트(one cut)" 스크리닝 전략을 활용하고 있다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본원에 제공된 "1-커트" 선별 전략은 단일 말단 고-처리량 서열 분석 방법과 화합성이고, 커팅된 절반 부위로부터 절단된 표적 부위의 컴퓨터를 이용한 재구축을 요구하지 않으므로, 뉴클레아제 프로파일링 공정을 간소화시켜 준다.
본 개시내용의 일부 측면은 엔도뉴클레아제의 절단 특이성을 평가하고 목적하는 수준의 특이성을 지닌 뉴클레아제를 선별하기 위한 시험관내 선별 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 예를 들어 관심 엔도뉴클레아제를 명확히 규명하고, 목적하는 수준의 특이성을 나타내는 뉴클레아제를 확인하는 데 유용한데, 예를 들어 임상 적용을 위한 고도의 특이적 엔도뉴클레아제를 확인하는 데 유용하다.
본 개시내용의 일부 측면은 표적을 벗어난 어떠한 절단도 수반하지 않거나 적어도 최소한의 표적을 벗어난 절단을 수반한 소정의 뉴클레아제에 의한 특이적 절단을 달성하기 위해 특정 게놈 내의 다른 어떠한 부위와도 충분히 상이한, 적합한 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 예를 들어 시험관내 또는 생체 내에서 게놈 조작을 위한 표적 부위를 선택하는 경우에, 게놈 배경 상의 고 특이성으로 절단될 수 있는 후보 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 데 유용하다.
본 개시내용의 일부 측면은 현재의 뉴클레아제와 비교해서 증강된 특이성을 지닌 부위-특이적 뉴클레아제를 평가, 선별 및/또는 설계하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 감소된 결합 친화성을 갖는 결합성 도메인을 수반한 변이체 뉴클레아제를 설계함으로써, 뉴클레아제의 최종 농도를 낮춤으로써, 게놈에서 그들의 가장 가까운 서열 친족과 3개 이상의 염기쌍에서 상이한 표적 부위를 선택함으로써, 및 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 경우에는, 가장 적은 수의 표적을 벗어난 부위가 결합되고/되거나 커팅되도록 하는 유도 RNA를 선별함으로써, 예를 들어 표적을 벗어난 최소한의 절단 활성을 지닌 부위-특이적 뉴클레아제를 선별하고/하거나 설계하는 데 유용한 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법의 실시에 유용한 조성물 및 키트가 또한 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면은 뉴클레아제의 표적 부위를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 이중 가닥 핵산 표적 부위를 커팅하는 뉴클레아제를 제공하는 단계 [여기서, 이러한 표적 부위의 커팅으로 인해, 5' 포스페이트 모이어티(moiety)를 포함하는 커팅된 핵산 가닥이 생성된다]; (b) (a)의 뉴클레아제를, 이러한 뉴클레아제가 뉴클레아제의 표적 부위를 포함하는 후보 핵산 분자를 커팅하기에 적합한 조건 하에, 후보 핵산 분자의 라이브러리와 접촉시키는 단계 [여기서, 각 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머(concatemer)를 포함한다]; 및 (c) 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥 상의 커팅되지 않은 뉴클레아제 표적 부위의 서열을 결정함으로써, (b)에서의 뉴클레아제에 의해 커팅된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 평활 말단을 창출시킨다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 5' 오버행(overhang)을 창출시킨다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 5'-포스페이트-의존성 결찰(ligation)을 통하여, 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥의 5' 말단에 제1 핵산 적응인자(adapter)를 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 적응인자는 이중 가닥 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 5'-포스페이트-의존성 결찰은 평활 말단 결찰이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥에 제1 핵산 적응인자를 결찰시키기 전에 5'-오버행을 충전시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 상기 적응인자와 혼성화되는 PCR 프라이머와 상기 불변 삽입 서열과 혼성화되는 PCR 프라이머를 이용하는 PCR 반응을 통하여, 커팅되지 않은 표적 부위를 포함하는 뉴클레아제에 의해 커팅된 콘카테머의 단편을 증폭시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 커팅되지 않은 단일 표적 서열을 포함하는 분자에 대해 상기와 같이 증폭된 핵산 분자를 강화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 강화 단계는 크기 분별을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥, 또는 PCR을 통하여 수득된 그의 카피를 서열 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후보 핵산 분자의 라이브러리는 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상 또는 1012개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 특정 질환과 연관된 유전자 내의 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하는 치료용 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 치료용 뉴클레아제가 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하고, 10개 초과, 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과, 2개 초과, 1개 초과 또는 어떠한 부가의 뉴클레아제 표적 부위도 커팅하지 않는 치료용 뉴클레아제의 최대 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료용 뉴클레아제를, 최대 농도와 등가이거나 이보다 더 낮은 최종 농도를 생성시키기에 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 RNA 분자와 복합체를 형성하는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제인데, 이러한 뉴클레아제:RNA 복합체는 상기 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열과 특이적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, 이러한 RNA 분자는 단일-유도 RNA (sgRNA)이다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 5 내지 50개 뉴클레오티드, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 25개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드, 19 내지 21개 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 표적 부위는 [sgRNA-상보성 서열]-[프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)] 구조를 포함하고, 뉴클레아제는 상기 sgRNA-상보성 서열 내의 표적 부위를 커팅한다. 일부 실시양태에서, sgRNA-상보성 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 비특이적 핵산 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 FokI 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 절단 도메인 이량체화시 표적 서열을 절단하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 결합성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 아연 핑거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아연 핑거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 전사 활성인자-유사 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제 (TALEN)이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 에네다인(enediyne) 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 항생제이다. 일부 실시양태에서, 상기 화합물은 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제이다.
본 개시내용의 일부 측면은 핵산 분자의 라이브러리를 제공하는데, 여기서 각 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 10 내지 100개 뉴클레오티드의 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 삽입 서열은 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 55개 이상, 60개 이상, 65개 이상, 70개 이상, 75개 이상, 80개 이상 또는 95개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 불변 삽입 서열은 15개 이하, 20개 이하, 25개 이하, 30개 이하, 35개 이하, 40개 이하, 45개 이하, 50개 이하, 55개 이하, 60개 이하, 65개 이하, 70개 이하, 75개 이하, 80개 이하, 또는 95개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 후보 뉴클레아제 표적 부위는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터(Effector) 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 유기 화합물 뉴클레아제, 또는 에네다인 항생제 (예를 들어, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신)에 의해 절단될 수 있는 부위이다. 일부 실시양태에서, 후보 뉴클레아제 표적 부위는 Cas9 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상, 또는 1012개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 0.5 kDa 이상, 1 kDa 이상, 2 kDa 이상, 3 kDa 이상, 4 kDa 이상, 5 kDa 이상, 6 kDa 이상, 7 kDa 이상, 8 kDa 이상, 9 kDa 이상, 10 kDa 이상, 12 kDa 이상 또는 15 kDa 이상의 분자량의 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 관심 뉴클레아제의 공지된 표적 부위의 변이인 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공지된 뉴클레아제 표적 부위의 변이는 공지된 뉴클레아제 표적 부위와 비교해서 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이는 관심 뉴클레아제의 공지된 표적 부위와, 이항 분포(binomially distributed)로 평균 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 또는 30% 초과 상이하다. 일부 실시양태에서, 상기 변이는 공지된 표적 부위와, 이항 분포로 평균 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 상이하다. 일부 실시양태에서, 관심 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 귀소 엔도뉴클레아제, 유기 화합물 뉴클레아제, 또는 에네다인 항생제 (예를 들어, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신)이다. 일부 실시양태에서, 후보 뉴클레아제 표적 부위는 [sgRNA-상보성 서열]-[PAM] 구조를 포함하는 Cas9 뉴클레아제 표적 부위인데, 여기서 sgRNA-상보성 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 복수 개의 뉴클레아제로부터 컨센서스 표적 부위를 특이적으로 커팅하는 뉴클레아제를 선별하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 동일한 컨센서스 서열을 커팅하는 복수 개의 후보 뉴클레아제를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 각각의 후보 뉴클레아제에 대하여, 본원에 제공된 방법을 이용하여 컨센서스 표적 부위과 상이한 후보 뉴클레아제에 의해 절단된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 확인된 뉴클레아제 표적 부위(들)에 근거하여 뉴클레아제를 선별하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 선별된 뉴클레아제는 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제는 이러한 컨센서스 부위와 상이한 가장 적은 수의 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제는 표적 게놈의 맥락에서 상기 컨센서스 부위와 상이한 가장 적은 수의 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 선별된 후보 뉴클레아제는 컨센서스 표적 부위 이외의 어떠한 표적 부위도 절단하지 않는 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 선별된 후보 뉴클레아제는 치료상 유효 농도의 뉴클레아제에서 특정 대상체의 게놈 내의 컨센서스 표적 부위 이외의 어떠한 표적 부위도 절단하지 않는 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 특정 게놈을, 단계 (c)에서 선별된 뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 게놈은 척추동물, 포유류, 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 염소, 양, 소, 개, 고양이, 파충류, 양서류, 어류, 선충, 곤충, 또는 파리 게놈이다. 일부 실시양태에서, 게놈은 살아있는 세포 내에 있다. 일부 실시양태에서, 게놈은 대상체 내에 있다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 표적 부위는 특정 질환 또는 장애와 연관되는 대립 유전자 내에 있다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 표적 부위를 절단하면, 특정 질환 또는 장애가 치료 또는 예방되는데, 예를 들어 이러한 질환 또는 장애의 한 가지 이상의 징후 및/또는 증상이 완화 또는 예방된다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 표적 부위를 절단하면, 상기 질환 또는 장애의 특정 징후 및/또는 증상이 완화된다. 일부 실시양태에서, 컨센서스 표적 부위를 절단하면, 상기 질환 또는 장애가 예방된다. 일부 실시양태에서, 질환은 HIV/AIDS이다. 일부 실시양태에서, 대립 유전자는 CCR5 대립 유전자이다. 일부 실시양태에서, 질환은 증식성 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 대립 유전자는 VEGFA 대립 유전자이다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 방법에 따라서 선별하였던 단리된 뉴클레아제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 뉴클레아제는 특정 게놈 내의 표적 부위를 절단하도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 상기 게놈 내의 표적 부위에 대해 상보적인 sgRNA를 포함하는 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 유기 화합물 뉴클레아제 (예를 들어, 에네다인, 항생제 뉴클레아제, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 또는 그의 유도체)이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 그의 공지된 뉴클레아제 표적 부위 이외에, 다른 후보 표적 부위를 전혀 커팅하지 않거나, 1개 이하의 후보 표적 부위, 2개 이하의 후보 표적 부위, 3개 이하의 후보 표적 부위, 4개 이하의 후보 표적 부위, 5개 이하의 후보 표적 부위, 6개 이하의 후보 표적 부위, 7개 이하의 후보 표적 부위, 8개 이하의 후보 표적 부위, 8개 이하의 후보 표적 부위, 9개 이하의 후보 표적 부위, 또는 10개 이하의 후보 표적 부위를 커팅하는 것에 근거하여 선별되었다.
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 제공된 바와 같은 단리된 뉴클레아제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 단리된 뉴클레아제의 표적 부위를 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 부형제; 및 핵산을 뉴클레아제와 접촉시키는 데 적합한 조성물을 생성하기 위해 뉴클레아제를 상기 부형제와 접촉시키는 것에 관한 지시 내용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 특정 게놈 내의 핵산을 접촉시키는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 특정 세포 내의 핵산을 접촉시키는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 특정 대상체 내의 핵산을 접촉시키는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약상 허용되는 부형제이다.
본 개시내용의 일부 측면은 특정 대상체에게 투여하는 데 적합한 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 단리된 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 이러한 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
본 발명의 다른 이점, 특징 및 용도는 본 발명의 특정의 비-제한적 실시양태의 상세한 설명; 일정한 비율로 도시되지 않고 도식적인 도면; 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1. 시험관내 선별 개요. (a) 저분자 유도 RNA (sgRNA)와 복합체를 형성한 Cas9는 상기 sgRNA 서열에 대해 상보적이고 양 DNA 가닥을 절단하는 표적 DNA 기질의 약 20개 염기를 인식한다. 백색 삼각형은 절단 위치를 나타낸다. (b) 본 발명자들이 기존에 보고한 시험관내 선별의 변형된 버전을 사용하여 Cas9 특이성을 포괄적으로 프로파일링하였다. 각 분자가 표적 DNA 서열의 1012개 별개의 변이체 중 하나를 함유하는 콘카테머성 사전 선별 DNA 라이브러리 (백색 직사각형)가 결찰 및 롤링 서클 증폭에 의해 합성 DNA 올리고뉴클레오티드로부터 생성되었다. 이 라이브러리를 관심 Cas9:sgRNA 복합체와 함께 인큐베이션하였다. 절단된 라이브러리 구성원은 5' 포스페이트 기 ("P"를 수반한 원)를 함유하므로, 적응인자 결찰과 PCR을 위한 기질이다. 이로써 생성된 앰플리콘(amplicon)을 대상으로 하여 고 처리량 DNA 서열 분석과 컴퓨터 분석을 수행하였다.
도 2. Cas9:CLTA1 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도21는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. (g) 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 효과. 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화에 대해 표준화시킨, 효소 제한 조건 (200 nM DNA, 100 nM Cas9:sgRNA v2.1)과 효소 포화 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 간의 위치 특이성 변화가 CLTA1을 대상으로 하여 도시되어 있다. (h) 특이성에 대한 sgRNA 구조의 효과. 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화에 대해 표준화시킨, 효소 포화 조건 하에서의 sgRNA v1.0과 sgRNA v2.1 간의 위치 특이성 변화가 CLTA1을 대상으로 하여 도시되어 있다. CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4에 대한 상응하는 데이터에 관해서는 도 6 내지 8, 25, 및 26을 참조할 수 있다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 1에 상응한다.
도 3. 본 연구에서 프로파일링된 표적 부위. (a) sgRNA의 5' 말단은 표적 부위에 대해 상보적인 20개 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 표적 부위는 RNA:DNA 상보성 영역에 인접한 NGG 모티프 (PAM)를 함유한다. (b) 4개의 인간 클라트린(clathrin) 유전자 (CLTA) 표적 부위가 제시된다. (c, d) 4개의 인간 클라트린 유전자 (CLTA) 표적 부위가 sgRNA와 함께 제시된다. sgRNA v1.0은 sgRNA v2.1 보다 더 짧다. PAM이 각 부위에 대해 제시된다. 표적 부위의 비-PAM 말단은 sgRNA의 5' 말단에 상응한다. 서열 식별자: (b)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 2; 서열 3; 서열 4; 서열 5; 서열 6; 및 서열 7이다. (c)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 8; 서열 9; 서열 10; 서열 11; 서열 12; 서열 13; 서열 14; 서열 15; 서열 16; 서열 17; 서열 18; 및 서열 19이다. (d)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 20; 서열 21; 서열 22; 서열 23; 서열 24; 서열 25; 서열 26; 서열 27; 서열 28; 서열 29; 서열 30; 및 서열 31이다.
도 4. 시험관 내에서 표적에 적중한 DNA 서열의 Cas9:유도 RNA 절단. 4개의 CLTA 표적 부위 각각에 대하여 200 nM 표적에 적중한 부위(on-target site)와 100 nM Cas9:v1.0 sgRNA, 100 nM Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM Cas9:v1.0 sgRNA 및 1000 nM Cas9:v2.1 sgRNA를 이용하여, 대략 1-kb 선형 기질 상에서 개별 DNA 절단 검정을 수행하였다. CLTA1, CLTA2, 및 CLTA4의 경우에는, Cas9:v2.1 sgRNA가 Cas9:v1.0 sgRNA 보다 더 높은 활성을 나타낸다. CLTA3의 경우에는, Cas9:v1.0 sgRNA의 활성과 Cas9:v2.1 sgRNA의 활성이 거의 동등한 수준이었다.
도 5. 4개의 표적 부위에 대한 시험관내 선별 결과. 100 nM Cas9:sgRNA v2.1, 1000 nM Cas9:sgRNA v1.0, 또는 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서 시험관내 선별을 수행하였다. (a) 수행된 12가지 선별에 대한 후-선별 PCR 생성물이 제시된다. 각 선별에 대해 1.5 반복 서열을 함유하는 DNA를 정량화하고, 겔 정제 및 서열 분석하기 전에 등 몰량으로 풀링하였다. (b-e) 사전 선별 라이브러리 (흑색)와 후-선별 라이브러리 (착색됨)에 대한 돌연변이 분포도가 제시된다. 후-선별 라이브러리에는 사전 선별 라이브러리보다 더 적은 수의 돌연변이를 수반한 서열이 강화된다. 돌연변이는 sgRNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍과 2개 염기 쌍 PAM으로부터 계수한다. 각 패널에서 분포도 간의 모든 쌍을 이룬 비교에 대한 P-값은 < 0.01이다. P-값은 동등하지 않은 크기와 동등하지 않은 분산을 가정하고, t- 시험을 이용하여 계산하였다.
도 6. Cas9:CLTA2 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 32에 상응한다.
도 7. Cas9:CLTA3 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 32에 상응한다.
도 8. Cas9:CLTA4 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 33에 상응한다.
도 9. 서열 로고로서의 시험관내 선별 결과. 효소 제한 조건 하에서 CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1에 의해 지정된 각 표적 부위 위치 (1-20)에 대한 정보량을 플롯한다25. PAM 내에서의 위치가, 표지된 "P1", "P2" 및 "P3"이다. 정보량은 비트로 플롯된다. 2.0 비트는 절대 특이성을 표시하고, 0 비트는 특이성이 없음을 표시한다.
도 10. CLTA1에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 5,130 및 n ≥ 74,538을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 11. CLTA2에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA2 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 3,190 및 n ≥ 25,365를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 12. CLTA3에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA3 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 5,604 및 n ≥ 158,424를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 13. CLTA4에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 2,323 및 n ≥ 21,819를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 14. CLTA1 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 5,130 및 n ≥ 74,538을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 15. CLTA2 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 3,190 및 n ≥ 21,265을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 16. CLTA3 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 5,604 및 n ≥ 158,424를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 17. CLTA4 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 2,323 및 n ≥ 21,819를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 18. 100 nM Cas9:sgRNA v2.1에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v2.1에 대한 효소 제한 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 PAM에 근접한 표적 부위의 말단에서 가장 높고, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 19. 1000 nM Cas9:sgRNA v1.0에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v1.0에 대한 효소 과잉 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 표적 부위 전반에 걸쳐 비교적 일정하지만, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 20. 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v2.1에 대한 효소 과잉 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 표적 부위 전반에 걸쳐 비교적 일정하지만, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 21. PAM 뉴클레오티드 선호도. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 사전 선별 라이브러리 및 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드에 대하여 제시되어 있다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도를 증가시켰지만, 가능한 다른 PAM 디뉴클레오티드는 선별 후의 존재도를 감소시켰다.
도 22. 표적에 적중한 부위에 대한 PAM 뉴클레오티드 선호도. 유도 RNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍 내의 돌연변이를 함유하지 않는 후-선별 라이브러리 구성원만이 본 분석에 포함되었다. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 사전 선별 라이브러리 및 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드에 대하여 제시되어 있다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도를 증가시켰지만, 비록 Cas9:sgRNA의 효소 과잉 농도에 대한 상기 효과가 많은 디뉴클레오티드의 경우에는 보통 수준이거나 존재하지 않았을 지라도, 가능한 다른 PAM 디뉴클레오티드는 일반적으로, 선별 후의 존재도를 감소시켰다.
도 23. PAM 디뉴클레오티드 특이성 스코어. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 특이성 스코어가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드 (3개-뉴클레오티드 NGG PAM의 위치 2 및 3)에 대하여 제시되어 있다. 특이성 스코어는 PAM 디뉴클레오티드의 가능한 최대 강화에 대해 표준화시킨, 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리에서의 PAM 디뉴클레오티드의 강화를 표시한다. +1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 후-선별 라이브러리에서 100% 강화된다는 것을 표시하고, -1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 100% 탈강화된다는 것을 표시한다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리에서 가장 많이 강화되고, AG, GA, GC, GT, 및 TG는 다른 가능한 PAM 디뉴클레오티드와 비교해서 비교적 덜 탈강화된다.
도 24. 표적에 적중한 부위에 대한 PAM 디뉴클레오티드 특이성 스코어. 유도 RNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍 내의 돌연변이를 함유하지 않는 후-선별 라이브러리 구성원만이 본 분석에 포함되었다. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 특이성 스코어가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드 (3개-뉴클레오티드 NGG PAM의 위치 2 및 3)에 대하여 제시되어 있다. 특이성 스코어는 PAM 디뉴클레오티드의 가능한 최대 강화에 대해 표준화시킨, 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리에서의 PAM 디뉴클레오티드의 강화를 표시한다. +1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 후-선별 라이브러리에서 100% 강화된다는 것을 표시하고, -1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 100% 탈강화된다는 것을 표시한다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리에서 가장 많이 강화되었고, AG 및 GA 뉴클레오티드는 적어도 한 가지 선별 조건에서 강화되지도 않았거나 탈강화되지도 않았으며, GC, GT, 및 TG는 다른 가능한 PAM 디뉴클레오티드와 비교해서 비교적 덜 탈강화된다.
도 25. 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 효과. 효소 제한 조건 (200 nM DNA, 100 nM Cas9:sgRNA v2.1)과 효소 과잉 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 간의 위치 특이성 변화가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) 표적 부위를 표적으로 하는 sgRNA를 이용한 선별에 대해 제시되어 있다. 라인은 소정의 위치에 대한 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화를 표시한다. 특이성 상의 가장 높은 변화는 효소 농도가 증가함에 따라 PAM 근위에서 일어난다.
도 26. 특이성에 대한 sgRNA 구조의 효과. 효소 과잉 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 하에서 Cas9:sgRNA v1.0과 Cas9:sgRNA v2.1 간의 위치 특이성 변화가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) 표적 부위를 표적으로 하는 sgRNA를 이용한 선별에 대해 제시되어 있다. 라인은 소정의 위치에 대한 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화를 표시한다.
도 27. 시험관 내에서 표적을 벗어난 DNA 서열의 Cas9:유도 RNA 절단. 시험관내 선별에 의해 확인된 5개의 CLTA4 표적을 벗어난 부위와 표적에 적중한 CLTA4 부위 (CLTA4-0)에 대하여 200 nM DNA 및 1000 nM Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용하여, 96-bp 선형 기질 상에서 분리된 DNA 절단 검정을 수행하였다. 제시된 강화 값은 1000 nM Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용한 시험관내 선별로부터의 것이다. CLTA4-1 및 CLTA4-3이 이들 조건 하에서 가장 고도로 강화된 서열이었다. CLTA4-2a, CLTA4-2b, 및 CLTA4-2c는 고도의 강화에서부터 강화가 전혀 없거나 고도의 탈강화까지의 일정 범위의 강화 값을 나타내는 2개-돌연변이 서열이다. 소문자는 표적에 적중한 CLTA4 부위를 기준으로 한 돌연변이를 표시한다. 강화 값은 시험관 내에서 관찰된 절단 양과 정량적으로 일치한다. 서열 식별자: 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 34; 서열 35; 서열 36; 서열 37; 서열 38; 및 서열 39이다.
도 28. 표적을 벗어난 부위의 시험관내 절단에 대한 유도 RNA 구조 및 Cas9:sgRNA 농도의 효과. CLTA4-3 표적을 벗어난 부위에 대하여 200 nM DNA, 및 100 nM Cas9:v1.0 sgRNA, 100 nM Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM Cas9:v1.0 sgRNA 또는 1000 nM Cas9:v2.1 sgRNA를 이용하여, 96-bp 선형 기질 상에서 분리된 DNA 절단 검정을 수행하였다 [5' GggGATGTAGTGTTTCCACtGGG 3' (서열 39)-돌연변이가 소문자로 제시된다]. DNA 절단이 시험된 4가지 조건 모두 하에서 관찰되고, 절단률은 효소 과잉 조건 하에서 보다 높거나, 또는 v1.0 sgRNA와 비교해서 v2.1 sgRNA를 이용하는 경우에 보다 높다.
정의
본원 및 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 단수 및 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일 작용제 및 복수 개의 상기 작용제를 포함한다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 단백질, 또는 그의 단편을 포함하는 RNA-유도된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한, 종종 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR [클러스터링되고 규칙적으로 사이에 공간을 남겨둔 짧은 팔린드롬성(palindromic) 반복 서열]-관련 뉴클레아제로서 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전적 요소 (예를 들어, 바이러스, 전위 요소 및 접합 플라스미드)에 대항하여 보호를 제공하는 적응 면역 체계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 대해 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서 crRNA 전구를 정확하게 프로세싱하기 위해서는, 트랜스-코딩된 저분자 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. 상기 tracrRNA는 crRNA 전구의 리보뉴클레아제 3-지원 프로세싱에 대한 유도로서 제공된다. 연속해서, Cas9/crRNA/tracrRNA는 상기 스페이서에 대해 상보적인 선형 또는 환상 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오 분해적으로 절단한다. crRNA에 대해 상보적이지 않은 표적 가닥을 먼저, 엔도뉴클레오 분해적으로 커팅한 다음, 3'-5' 엑소뉴클레오 분해적으로 트리밍한다. 사실상, DNA-결합과 절단을 위해서는, 전형적으로 단백질과 양 RNA 종이 필요하다. 그러나, 단일 유도 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA와 tracrRNA 둘 다의 측면이 단일 RNA 분자 내로 혼입되도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9는 자기 대 비-자기를 구별하는 데 도움을 주기 위해 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식한다. Cas9 뉴클레아제 서열과 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오르소로그(ortholog)가 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) 및 에스. 더모필루스 (S. thermophilus)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 종에서 보고되었다. 부가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열이 본 개시내용을 근거로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 개시된 유기체 및 유전자 자리로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로서 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합성 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하므로, 이러한 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 서열 40 (뉴클레오티드); 서열 41 (아미노산))에 상응한다.
핵산 분자의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "콘카테머"는 일련으로 연결된 동일한 DNA 서열의 다수 카피를 함유하는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 특이적 서열의 10개 카피 (예를 들어, [XYZ]10)를 포함하는 콘카테머는 일련으로 서로 연결된 동일한 특이적 서열의 10개 카피, 예를 들어 5'- XYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZ -3'를 포함할 것이다. 콘카테머는 반복 단위 또는 서열의 어떠한 수의 카피, 예를 들어 2개 이상의 카피, 3개 이상의 카피, 4개 이상의 카피, 5개 이상의 카피, 10개 이상의 카피, 100개 이상의 카피, 1000개 이상의 카피 등을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열을 포함하는 핵산 서열의 콘카테머의 예는 [(표적 부위)-(불변 삽입 서열)]300일 것이다. 콘카테머는 선형 핵산 분자일 수 있거나, 또는 환상일 수 있다.
용어 "접합하는", "접합된" 및 "접합"은 두 실체, 예를 들어 두 분자, 예컨대 두 단백질, 두 도메인 (예를 들어, 결합성 도메인과 절단 도메인), 또는 단백질과 작용제, 예를 들어 단백질 결합성 도메인과 소분자의 연합을 지칭한다. 일부 측면에서, 이러한 연합은 단백질 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제)과 핵산 (예를 들어, 유도 RNA) 간의 연합이다. 상기 연합은, 예를 들어 직접 또는 간접 (예를 들어, 링커를 통함) 공유 연쇄를 통해서 또는 비공유적 상호 작용을 통해서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 연합은 공유적이다. 일부 실시양태에서, 두 분자는 양 분자를 연결하는 링커를 통하여 접합된다. 예를 들어, 두 단백질이 서로 접합하여, 예를 들어 결합성 도메인과 조작된 뉴클레아제의 절단 도메인이 접합되어 단백질 융합물을 형성하는 일부 실시양태에서, 이러한 두 단백질은 폴리펩티드 링커, 예를 들어 한 단백질의 C-말단을 다른 단백질의 N-말단과 연결시켜 주는 아미노산 서열을 통하여 접합될 수 있다.
핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "컨센서스 서열"은 복수 개의 유사한 서열 내의 각 위치에서 발견된 가장 빈번한 뉴클레오티드 잔기를 나타내는 계산된 서열을 지칭한다. 전형적으로, 컨센서스 서열은 유사한 서열을 서로 비교하고 유사한 서열 모티프를 계산하는 서열 정렬에 의해 결정된다. 뉴클레아제 표적 부위 서열의 맥락에서, 뉴클레아제 표적 부위의 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 소정의 뉴클레아제에 의해 가장 빈번하게 결합되거나 또는 가장 높은 친화도로 결합된 서열일 수 있다. RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9) 표적 부위 서열과 관련하여, 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 특정 gRNA, 또는 복수 개의 gRNA가, 예를 들어 상보적 염기 쌍 형성을 근거로 하여 결합되는 것으로 예상되거나 설계되는 서열 또는 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발시키기에 충분한 생물학상 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제의 유효량은 뉴클레아제에 의해 특이적으로 결합되고 절단된 표적 부위의 절단을 유도시키기에 충분한 뉴클레아제의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 특정 작용제, 예를 들어 뉴클레아제, 혼성체 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 각종 인자, 예를 들어 목적하는 생물학적 반응, 특이적 대립 유전자, 게놈, 표적 부위, 표적화되는 세포 또는 조직, 및 사용되는 작용제에 따라서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에네다인"은 이중 결합에 의해 분리된 2개의 삼중 결합을 함유하는 9원 환 및 10원 환 중 어느 하나를 특징으로 하는 박테리아성 자연 생성물 부류를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [K. C. Nicolaou; A. L. Smith; E. W. Yue (1993). "Chemistry and biology of natural and designed enediynes". PNAS 90 (13): 5881-5888] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 에네다인은 버그만 환화 반응 (Bergman cyclization)을 진행할 수 있고, 이로써 생성된 2가 라디칼인 1,4-데히드로벤젠 유도체는 DNA의 당 주쇄로부터 수소 원자를 끌어내어, DNA 가닥 절단을 초래할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [S. Walker; R. Landovitz; W.D. Ding; G.A. Ellestad; D. Kahne (1992). "Cleavage behavior of calicheamicin gamma 1 and calicheamicin T". Proc Natl Acad Sci U.S.A. 89 (10): 4608-12] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). DNA와의 그들의 반응성은 많은 에네다인에 항생제 형질을 부여해 주고, 일부 에네다인은 항암 항생제로서 임상적으로 연구되고 있다. 에네다인의 비제한적 예는 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신이다 (예를 들어, 문헌 [Adrian L. Smith and K. C. Bicolaou, "The Enediyne Antibiotics" J. Med. Chem., 1996, 39 (11), pp 2103-2117]; 및 [Donald Borders, "Enediyne antibiotics as antitumor agents," Informa Healthcare; 1st edition (November 23, 1994, ISBN-10: 0824789385] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "귀소 엔도뉴클레아제"는 인트론 또는 인테인에 의해 전형적으로 코딩된 특정 유형의 제한 효소를 지칭한다 [Edgell DR (February 2009). "Selfish DNA: homing endonucleases find a home". Curr Biol 19 (3): R115-R117; Jasin M (Jun 1996). "Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases". Trends Genet 12 (6): 224-8; Burt A, Koufopanou V (December 2004). "Homing endonuclease genes: the rise and fall and rise again of a selfish element". Curr Opin Genet Dev 14 (6): 609-15; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]. 귀소 엔도뉴클레아제 인식 서열은 극히 낮은 확률 (대략 7x1010 bp당 1회)로만 무작위로 발생되기에 충분히 길고, 정상적으로는 게놈당 하나의 사례에서만 발견된다.
핵산 또는 단백질의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "라이브러리"는 2개 이상의 상이한 핵산 또는 단백질의 집단을 각각 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레아제 표적 부위의 라이브러리는 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는 2개 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 101개 이상, 102개 이상, 103개 이상, 104개 이상, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상, 1012개 이상, 1013개 이상, 1014개 이상, 또는 1015개 이상의 상이한 핵산 또는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리의 구성원은 무작위적 서열, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 무작위적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 서로 무관한 핵산 분자, 예를 들어 완전히 무작위적인 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리의 적어도 일부 구성원은 관련될 수 있는데, 예를 들어 이들은 특별한 서열, 예컨대 컨센서스 표적 부위 서열의 변이체 또는 유도체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 2개의 인접한 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인과 결합성 도메인을 연결하는 분자 또는 화학 기를 지칭한다. 전형적으로, 링커는 2개 기, 분자 또는 기타 모이어티 사이에 위치되거나 또는 이들이 양옆에 위치하고 있고, 공유 결합을 통하여 각자 연결되므로, 둘을 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수 개의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레아제"는 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 작용제, 예를 들어 단백질 또는 소분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단백질, 예를 들어, 핵산 분자와 결합할 수 있고 이러한 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드 쇄의 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 "인식 서열", "뉴클레아제 표적 부위" 또는 "표적 부위"로서 본원에 지칭되기도 하는 특이적 뉴클레오티드 서열 내의 특이적 포스포디에스테르 결합과 결합하고/하거나 이러한 결합을 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 표적 부위를 보완하는 서열을 갖는 RNA와 복합체를 형성함으로써 (예를 들어, 이러한 RNA와 결합함으로써) 뉴클레아제의 서열 특이성을 제공하는 RNA-유도된 (즉, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단일 가닥 표적 부위를 인식하는 반면, 다른 실시양태에서는, 뉴클레아제가 이중 가닥 표적 부위, 예를 들어 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식한다. 많은 자연 발생적 뉴클레아제, 예를 들어 많은 자연 발생적 DNA 제한 뉴클레아제의 표적 부위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 많은 경우에 있어서, DNA 뉴클레아제, 예컨대 EcoRI, HindIII, 또는 BamHI는 4 내지 10개 염기 쌍 길이의 팔린드롬성 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식하고, 이러한 표적 부위 내의 특이적 위치에서 2개의 DNA 가닥 각각을 커팅한다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 대칭적으로 커팅하는데, 즉 양 가닥을 동일한 위치에서 커팅하여 그 말단이 염기 쌍 형성된 뉴클레오티드를 포함하도록 한다 (이는 본원에서 평활 말단으로서 지칭되기도 함). 기타 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 비대칭적으로 커팅하는데, 즉 각 가닥을 상이한 위치에서 커팅하여 그 말단이 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 이중 가닥 DNA 분자의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드는 또한, "오버행"으로서 지칭되는데, 예를 들어 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)가 각각의 DNA 가닥의 5' 또는 3' 말단을 형성하는 지에 따라서 "5'-오버행"으로서 또는 "3'-오버행"으로서 지칭된다. 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)로 종결되는 이중 가닥 DNA 분자 말단은 또한, 점착성 말단으로서 지칭되는데, 이는 이들이 쌍을 형성하지 않은 상보적 뉴클레오티드(들)를 포함하는 다른 이중 가닥 DNA 분자 말단에 "점착"될 수 있기 때문이다. 뉴클레아제 단백질은 전형적으로, 단백질과 핵산 기질의 상호 작용을 매개하고, 또한 일부 경우에는, 표적 부위와 특이적으로 결합하는 "결합성 도메인"과, 핵산 골격 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매하는 "절단 도메인"을 포함한다. 일부 실시양태에서 뉴클레아제 단백질은 단량체성 형태의 핵산 분자와 결합하고 이를 절단할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질은 표적 핵산 분자를 절단하기 위하여 이량체화되거나 또는 다량체화되어야 한다. 자연 발생적 뉴클레아제의 결합성 도메인 및 절단 도메인 뿐만 아니라 뉴클레아제 결합 특이성 표적 부위를 창출시키기 위해 융합될 수 있는 모듈(modular) 결합성 도메인 및 절단 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 아연 핑거 또는 전사 활성인자 유사 요소가 결합성 도메인으로서 사용되어 목적하는 표적 부위와 특이적으로 결합될 수 있고, 절단 도메인, 예를 들어 FokI의 절단 도메인과 융합 또는 접합되어 상기 표적 부위를 절단하는 조작된 뉴클레아제를 창출시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 뉴클레오염기 및 산성 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자인데, 여기서는 인접한 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개개의 핵산 잔기 (예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개개의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 (예를 들어, 3개 이상의 일련의 뉴클레오티드)를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은, 예를 들어 게놈, 전사물, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 기타 자연 발생적 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생적일 수 있다. 다른 한편으론, 핵산 분자는 비-자연 발생적 분자, 예를 들어 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 혼성체일 수 있거나 또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 골격 이외를 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 자연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 이용하여 생성될 수 있으며, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성될 수 있다. 적당한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당을 갖는 유사체, 및 골격 변형을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학상 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기); 삽입된 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연쇄)이거나 이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물"은 특정 질환 또는 장애 치료의 맥락에서 특정 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 활성 성분, 예를 들어, 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "증식성 질환"은 특정 세포 또는 세포 집단이 비정상적으로 상승된 증식률을 나타낸다는 점에서 세포 또는 조직 생체 항상성이 교란되는 모든 질환을 지칭한다. 증식성 질환은 과증식성 질환, 예컨대 전-종양 과형성 병태 및 종양 질환을 포함한다. 종양 질환은 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하고, 양성 종양과 악성 종양 둘 다를 포함한다. 악성 종양은 또한, 암으로서 지칭된다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 모든 크기, 구조 및 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 3개 이상의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개개의 단백질, 또는 단백질의 컬렉션을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 화학적 실체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기; 접합, 기능화 또는 기타 변형을 위한 링커 등을 부가함으로써 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한, 단일 분자일 수 있거나 또는 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지, 자연 발생적 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생적, 재조합, 또는 합성, 또는 그의 모든 조합일 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합성 도메인과 핵산 절단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합성 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 핵산, 예를 들어, RNA와의 복합체로 존재하거나, 또는 이러한 핵산과 연합된 채로 있다.
핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "무작위적"은 유리 뉴클레오티드의 혼합물, 예를 들어 4개 모든 뉴클레오티드 A, T, G, 및 C의 혼합물을 혼입시키기 위해 합성시킨 서열 내의 잔기 또는 서열을 지칭한다. 무작위적 잔기는 전형적으로, 뉴클레오티드 서열 내의 문자 N으로써 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무작위적 서열 또는 잔기는 완전히 무작위적인데, 이러한 경우에 무작위적 잔기는 각각의 서열 잔기의 합성 단계 동안 혼입될 뉴클레오티드를 동일 량 (예를 들어, 25% T, 25% A, 25% G, 및 25% C)으로 부가함으로써 합성된다. 일부 실시양태에서, 무작위적 서열 또는 잔기는 부분적으로 무작위적인데, 이러한 경우에 무작위적 잔기는 각각의 서열 잔기의 합성 단계 동안 혼입될 뉴클레오티드를 동일하지 않은 양 (예를 들어, 79% T, 7% A, 7% G, 및 7% C)으로 부가함으로써 합성된다. 부분적 무작위화로 인해, 소정의 서열 상에 주형화(template)되긴 하지만 목적하는 빈도로 돌연변이를 혼입시킨 서열을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 뉴클레아제 표적 부위가 합성 주형으로서 사용되는 경우에, 각 단계에서 각각의 잔기에 나타낸 뉴클레오티드가 79%로 합성에 부가되고 다른 3개의 뉴클레오티드는 각각 7%로 부가되는 부분적 무작위화로 인해서는, 부분적으로 무작위적인 표적 부위의 혼합물이 합성될 것인데, 이는 여전히 본래의 표적 부위의 컨센서스 서열을 나타내긴 하지만, 상기와 같이 합성된 각 잔기에 대하여 21%의 통계적 빈도로 각 잔기에서 본래의 표적 부위와 상이하다 (이항 분포). 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 서열은 컨센서스 서열과, 이항 분포로 평균 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과 또는 30% 초과 상이하다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 서열은 컨센서스 부위와, 이항 분포로 평균 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 상이하다.
용어 "RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제" 및 "RNA-유도된 뉴클레아제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 절단에 대한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA와 복합체를 형성하는 (예를 들어, 이러한 RNA와 결합되거나 연합되는) 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA와 복합체를 형성하는 경우의 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 뉴클레아제:RNA 복합체로서 지칭될 수 있다. 전형적으로, 이와 같이 결합된 RNA(들)는 유도 RNA (gRNA) 또는 단일-유도 RNA (sgRNA)로서 지칭된다. 이러한 gRNA/sgRNA는 특정 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하는 표적 부위를 보완하고, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-관련 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (Csn1)이다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 절단 부위를 결정하기 때문에, 이들 단백질은 원칙상, 유도 RNA에 의해 지정된 모든 서열을 절단할 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해 (예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)]; [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)]; [Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)]; [Jiang, W.et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "소분자" 및 "유기 화합물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 자연 발생적이든 인공적으로 창출된 것이든 (예를 들어, 화학적 합성을 통함) 비교적 저분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 유기 화합물은 탄소를 함유한다. 유기 화합물은 다수의 탄소-탄소 결합, 입체 중심, 및 기타 작용기 (예를 들어, 아민, 히드록실, 카르보닐 또는 헤테로사이클릭 환)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 단량체성이고, 약 1500 g/mol 미만의 분자량을 갖는다. 특정 실시양태에서, 소분자의 분자량은 약 1000 g/mol 미만 또는 약 500 g/mol 미만이다. 특정 실시양태에서, 소분자는 약물, 예를 들어 적당한 정부 기관 또는 규제 기관에 의해 인간 또는 동물에게 사용하는 데 안전하고 유효한 것으로 이미 간주된 약물이다. 특정 실시양태에서, 유기 분자는 핵산과 결합하고/하거나 이를 절단하는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 에네다인이다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 항생제 약물, 예를 들어 항암 항생제, 예컨대 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 또는 그의 유도체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 개개의 유기체, 예를 들어 개개의 포유류를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이, 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리, 또는 선충이다.
뉴클레아제의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 핵산" 및 "표적 게놈"은 소정의 뉴클레아제의 하나 이상의 표적 부위를 포함하는 핵산 분자 또는 게놈을 각각 지칭한다.
본원에서 용어 "뉴클레아제 표적 부위"와 상호 교환적으로 사용된 용어 "표적 부위"는 뉴클레아제에 의해 결합되고 절단되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이량체화되는 뉴클레아제, 예를 들어 FokI DNA 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 좌측-절반 부위 (뉴클레아제의 하나의 단량체에 의해 결합됨), 우측-절반 부위 (뉴클레아제의 제2의 단량체에 의해 결합됨), 및 커팅이 이루어지는 상기 절반 부위들 사이의 스페이서 서열을 포함한다. 이러한 구조 ([좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위])는 본원에서 LSR 구조로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 좌측-절반 부위 및/또는 우측-절반 부위는 10 내지 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상기 절반 부위 중 어느 하나 또는 둘 다는 더 짧거나 더 길다. 일부 실시양태에서, 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 일부 실시양태에서, 4 내지 8 bp 길이의 비-지정된 스페이서 영역의 양옆에 위치하고 있는, 각각 6 내지 18 bp 길이의 2개의 절반 부위를 포함할 수 있다. TALEN의 맥락에서, 표적 부위는 일부 실시양태에서, 10 내지 30 bp 길이의 비-지정된 스페이서 영역의 양옆에 위치하고 있는, 각각 10 내지 23 bp 길이의 2개의 절반 부위를 포함할 수 있다. RNA-유도된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 상기 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 sgRNA에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 sgRNA-상보성 서열에 인접한 3' 말단에서의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. RNA-유도된 뉴클레아제 Cas9의 경우에는, 표적 부위가 일부 실시양태에서, 20개 염기 쌍 플러스 3개 염기 쌍 PAM [예를 들어, NNN (여기서, N은 모든 뉴클레오티드를 나타낸다)]일 수 있다. 전형적으로, PAM의 제1 뉴클레오티드는 어떠한 뉴클레오티드일 수도 있지만, 2개의 하류 뉴클레오티드는 특이적 RNA-유도된 뉴클레아제에 따라서 지정된다. RNA-유도된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9에 대해 예시되는 표적 부위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, NNG, NGN, NAG, 및 NGG (여기서, N은 모든 뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상이한 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스 대신 에스. 더모필루스)로부터의 Cas9 뉴클레아제는 서열 NGGNG를 포함하는 PAM을 인식한다. NNAGAAW 및 NAAR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 부가의 PAM 서열이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 예를 들어, RNA-유도된 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어 Cas9의 표적 부위는 구조 [NZ]-[PAM] (여기서, 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드이고, Z는 1 내지 50의 정수이다)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, Z는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50이다. 일부 실시양태에서, Z는 20이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 이펙터" (TALE)는 고도로 가변적인 2개-아미노산 모티프 (반복 가변 2잔기, RVD)를 포함하는, 고도로 보존된 33 내지 34개 아미노산 서열을 함유하는 DNA 결합성 도메인을 포함하는 박테리아성 단백질을 지칭한다. 상기 RVD 모티프는 핵산 서열에 대한 결합 특이성을 결정하고, 목적하는 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 따라서 조작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143-8]; [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Boch, Jens (February 2011). "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6]; [Boch, Jens; et.al. (December 2009). "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors". Science 326 (5959): 1509-12]; 및 [Moscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). "A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors". Science 326 (5959): 1501] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아미노산 서열과 DNA 인식 간의 단순 관계는 적당한 RVD를 함유하는 반복 절편의 조합을 선택함으로써 특이적 DNA 결합성 도메인을 조작할 수 있게 해주었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제" (TALEN)는 DNA 절단 도메인, 예를 들어 FokI 도메인에 대한 전사 활성인자 유사 이펙터 DNA 결합성 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제를 지칭한다. 조작된 TALE 구조물을 생성시키기 위한 수많은 모듈 어셈블리 계획이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research]; [Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research]; [Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.]; [Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed. ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 한 가지 이상의 증상이 발생된 후 및/또는 특정 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 증상의 부재 하에, 예를 들어 증상의 발병을 방지 또는 지연시키거나, 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 감수성 개체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 증상 병력을 고려하고/하거나 유전적 또는 기타 감수성 요인을 고려한다). 치료는 또한, 증상이 해소된 후에도, 예를 들어 그의 재발을 방지하거나 지연시키기 위해 지속될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거"는 특정 폴드와, 이러한 폴드를 안정화시키는 하나 이상의 아연 이온의 배위를 특징으로 하는 소형 핵산-결합성 단백질 구조 모티프를 지칭한다. 아연 핑거는 광범위한 각종 상이한 단백질 구조를 포괄한다 (예를 들어, 문헌 [Klug A, Rhodes D (1987). "Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아연 핑거는 뉴클레오티드의 특이적 서열과 결합하도록 설계될 수 있고, 일련의 아연 핑거의 융합물을 포함하는 아연 핑거 어레이는 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 아연 핑거 어레이는, 예를 들어 핵산 절단 도메인과 접합된 경우에, 단백질, 예를 들어 뉴클레아제의 결합성 도메인을 형성할 수 있다. Cys2His2, 개그 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 아연 리본, Zn2/Cys6, 및 TAZ2 도메인-유사 모티프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 유형의 아연 핑거 모티프가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003). "Structural classification of zinc fingers: survey and summary". Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50] 참조). 전형적으로, 단일 아연 핑거 모티프는 핵산 분자의 3 또는 4개 뉴클레오티드와 결합된다. 따라서, 예를 들어 2개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 6 내지 8개 뉴클레오티드와 결합될 수 있고, 3개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 9 내지 12개 뉴클레오티드와 결합될 수 있으며, 4개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 12 내지 16개 뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 적합한 모든 단백질 공학 기술을 이용하여, 3 내지 30개 뉴클레오티드 길이로부터 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 신규 아연 핑거 융합물을 설계할 수 있고/있거나 아연 핑거의 DNA-결합 특이성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313-340]; [Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins". Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368]; 및 [Liu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997). "Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes". Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94 (11)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 핵산을 절단하는 단백질 도메인과 조작된 아연 핑거 어레이 간의 융합을 이용하여, "아연 핑거 뉴클레아제"를 생성시킬 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 전형적으로, 핵산 분자 내의 특이적 표적 부위와 결합하는 아연 핑거 도메인; 및 결합성 도메인에 의해 결합된 표적 부위 내에 또는 이러한 부위에 근접하여 핵산 분자를 커팅하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 전형적으로 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개 개개의 아연 핑거 모티프와 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이의 범위의 결합성 표적 부위를 갖는 결합성 도메인을 포함한다. 소정의 게놈 내에서 독특한 표적 부위와 결합하고 이를 절단시키는 것이 요망되는 상황 하에서는 보다 긴 표적 부위가 특히 매력적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거 뉴클레아제"는 아연 핑거 어레이를 포함하는 결합성 도메인과 접합된 핵산 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 절단 도메인은 유형 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI의 절단 도메인이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위해 소정의 핵산 분자 내의 사실상 목적하는 어떠한 서열도 표적으로 하도록 설계될 수 있고, 복합체 게놈의 맥락에서 독특한 부위와 결합하도록 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 가능성은, 예를 들어 치료적 가치의 표적화된 게놈 변경을 달성하기 위하여, 살아있는 세포 내의 단일 게놈 부위의 표적화된 절단을 허용해 준다. 이중 가닥 브레이크를 목적하는 게놈 유전자 자리로 표적화하는 것을 이용하여, 비-상동 DNA 복구 경로의 변이성 성질에 기인하여, 프레임 시프트 돌연변이를 유전자의 코딩 서열 내로 도입할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 관심 부위를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 특이성의 개개의 아연 핑거 모티프를 조합함으로써, 목적하는 특이성을 지닌 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 수 있다. DNA와 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268의 구조는 이러한 분야에서의 많은 작업에 영향을 미쳐왔고, 64개의 가능한 염기 쌍 삼중체 각각에 대한 아연 핑거를 수득한 다음, 이들 모듈 아연 핑거를 혼합 및 매칭하여 목적하는 모든 서열 특이성을 지닌 단백질을 설계한다는 개념이 보고되었다 (Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 각각 3개의 염기 쌍 DNA 서열을 인식하는 별개의 아연 핑거를 합하여, 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이 범위의 표적 부위를 인식하는 3-, 4-, 5-, 또는 6-핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 어레이가 고려된다. 다른 실시양태에서, 6 내지 8개 뉴클레오티드를 인식하는 2-핑거 모듈을 합하여, 4-, 6-, 또는 8-아연 핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 박테리아성 또는 파지 디스플레이를 이용하여, 목적하는 핵산 서열, 예를 들어 3 내지 30 bp 길이의 목적하는 뉴클레아제 표적 부위를 인식하는 아연 핑거 도메인을 발생시킨다. 아연 핑거 뉴클레아제는 일부 실시양태에서, 아연 핑거 결합성 도메인; 및 링커, 예를 들어 폴리펩티드 링커를 통하여 서로 융합되거나 또는 달리 접합된 절단 도메인을 포함한다. 링커의 길이가, 아연 핑거 도메인에 의해 결합된 핵산 서열로부터의 커팅물의 거리를 결정한다. 보다 짧은 링커가 사용된 경우에는, 절단 도메인이, 상기와 같이 결합된 핵산 서열에 보다 근접한 핵산을 커팅하는 반면, 보다 긴 링커는 상기 결합된 핵산 서열과 커팅물 간의 거리를 보다 크게 만들 것이다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 결합된 핵산을 커팅하기 위해 이량체화해야 한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이량체는 2개 단량체의 이종-이량체인데, 이러한 단량체 각각은 상이한 아연 핑거 결합성 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이량체는 FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 A를 포함하는 하나의 단량체와, FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 B를 포함하는 하나의 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 비제한적 예에서, 아연 핑거 도메인 A는 표적 부위의 한쪽의 핵산 서열과 결합되고, 아연 핑거 도메인 B는 표적 부위의 다른 쪽의 핵산 서열과 결합되며, 이량체화 FokI 도메인은 아연 핑거 도메인 결합 부위들 사이에 있는 핵산을 커팅한다.
도 2. Cas9:CLTA1 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도21는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. (g) 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 효과. 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화에 대해 표준화시킨, 효소 제한 조건 (200 nM DNA, 100 nM Cas9:sgRNA v2.1)과 효소 포화 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 간의 위치 특이성 변화가 CLTA1을 대상으로 하여 도시되어 있다. (h) 특이성에 대한 sgRNA 구조의 효과. 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화에 대해 표준화시킨, 효소 포화 조건 하에서의 sgRNA v1.0과 sgRNA v2.1 간의 위치 특이성 변화가 CLTA1을 대상으로 하여 도시되어 있다. CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4에 대한 상응하는 데이터에 관해서는 도 6 내지 8, 25, 및 26을 참조할 수 있다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 1에 상응한다.
도 3. 본 연구에서 프로파일링된 표적 부위. (a) sgRNA의 5' 말단은 표적 부위에 대해 상보적인 20개 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 표적 부위는 RNA:DNA 상보성 영역에 인접한 NGG 모티프 (PAM)를 함유한다. (b) 4개의 인간 클라트린(clathrin) 유전자 (CLTA) 표적 부위가 제시된다. (c, d) 4개의 인간 클라트린 유전자 (CLTA) 표적 부위가 sgRNA와 함께 제시된다. sgRNA v1.0은 sgRNA v2.1 보다 더 짧다. PAM이 각 부위에 대해 제시된다. 표적 부위의 비-PAM 말단은 sgRNA의 5' 말단에 상응한다. 서열 식별자: (b)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 2; 서열 3; 서열 4; 서열 5; 서열 6; 및 서열 7이다. (c)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 8; 서열 9; 서열 10; 서열 11; 서열 12; 서열 13; 서열 14; 서열 15; 서열 16; 서열 17; 서열 18; 및 서열 19이다. (d)에 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 20; 서열 21; 서열 22; 서열 23; 서열 24; 서열 25; 서열 26; 서열 27; 서열 28; 서열 29; 서열 30; 및 서열 31이다.
도 4. 시험관 내에서 표적에 적중한 DNA 서열의 Cas9:유도 RNA 절단. 4개의 CLTA 표적 부위 각각에 대하여 200 nM 표적에 적중한 부위(on-target site)와 100 nM Cas9:v1.0 sgRNA, 100 nM Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM Cas9:v1.0 sgRNA 및 1000 nM Cas9:v2.1 sgRNA를 이용하여, 대략 1-kb 선형 기질 상에서 개별 DNA 절단 검정을 수행하였다. CLTA1, CLTA2, 및 CLTA4의 경우에는, Cas9:v2.1 sgRNA가 Cas9:v1.0 sgRNA 보다 더 높은 활성을 나타낸다. CLTA3의 경우에는, Cas9:v1.0 sgRNA의 활성과 Cas9:v2.1 sgRNA의 활성이 거의 동등한 수준이었다.
도 5. 4개의 표적 부위에 대한 시험관내 선별 결과. 100 nM Cas9:sgRNA v2.1, 1000 nM Cas9:sgRNA v1.0, 또는 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서 시험관내 선별을 수행하였다. (a) 수행된 12가지 선별에 대한 후-선별 PCR 생성물이 제시된다. 각 선별에 대해 1.5 반복 서열을 함유하는 DNA를 정량화하고, 겔 정제 및 서열 분석하기 전에 등 몰량으로 풀링하였다. (b-e) 사전 선별 라이브러리 (흑색)와 후-선별 라이브러리 (착색됨)에 대한 돌연변이 분포도가 제시된다. 후-선별 라이브러리에는 사전 선별 라이브러리보다 더 적은 수의 돌연변이를 수반한 서열이 강화된다. 돌연변이는 sgRNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍과 2개 염기 쌍 PAM으로부터 계수한다. 각 패널에서 분포도 간의 모든 쌍을 이룬 비교에 대한 P-값은 < 0.01이다. P-값은 동등하지 않은 크기와 동등하지 않은 분산을 가정하고, t- 시험을 이용하여 계산하였다.
도 6. Cas9:CLTA2 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 32에 상응한다.
도 7. Cas9:CLTA3 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 32에 상응한다.
도 8. Cas9:CLTA4 sgRNA에 대한 시험관내 선별 결과. 적외선 열지도24는 효소 제한 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (a, b), 효소 과잉 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v1.0의 특이성 프로파일 (c, d), 및 효소 포화 조건 하에서의 Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1의 특이성 프로파일 (e, f)을 나타낸다. 적외선 열지도는 모든 후-선별 서열 (a, c, e), 또는 20개-염기 쌍 sgRNA-지정된 표적 부위와 2개-염기 쌍 PAM 내에 단일 돌연변이를 함유하는 서열만 (b, d, f)을 나타낸다. 1.0 및 -1.0의 특이성 스코어는 특별한 위치에서의 특별한 염기 쌍을 지지하는 100% 강화 및 상기 특별한 염기 쌍에 대항하는 100% 강화에 각각 상응한다. 흑색 박스는 의도된 표적 뉴클레오티드를 의미한다. 서열 식별자: (a-f)에 제시된 sgRNA 서열은 서열 33에 상응한다.
도 9. 서열 로고로서의 시험관내 선별 결과. 효소 제한 조건 하에서 CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1에 의해 지정된 각 표적 부위 위치 (1-20)에 대한 정보량을 플롯한다25. PAM 내에서의 위치가, 표지된 "P1", "P2" 및 "P3"이다. 정보량은 비트로 플롯된다. 2.0 비트는 절대 특이성을 표시하고, 0 비트는 특이성이 없음을 표시한다.
도 10. CLTA1에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 5,130 및 n ≥ 74,538을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 11. CLTA2에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA2 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 3,190 및 n ≥ 25,365를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 12. CLTA3에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA3 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 5,604 및 n ≥ 158,424를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 13. CLTA4에 대한 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍에서의 돌연변이를 허용하면서도, 표적에 적중한 염기 쌍을 수반한 서열 (회색) 만을 고려한 경우에 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA 선별을 대상으로 한, 각 위치에서의 최대 특이성 스코어가 제시된다 (a-l). 표적에 적중한 염기 쌍으로 제한되지 않는 위치가 암색 막대로써 표시된다. 보다 높은 특이성 스코어 값은 소정의 위치에서의 보다 높은 특이성을 표시한다. 어떠한 돌연변이도 함유하도록 허용되지 않은 위치 (회색)는 +1의 특이성 스코어와 함께 플롯되었다. 모든 패널에 대해, 특이성 스코어는 n ≥ 2,323 및 n ≥ 21,819를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 계산하였다.
도 14. CLTA1 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 5,130 및 n ≥ 74,538을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 15. CLTA2 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 3,190 및 n ≥ 21,265을 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 16. CLTA3 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 5,604 및 n ≥ 158,424를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 17. CLTA4 표적 부위 내의 PAM으로부터 원위의 돌연변이의 관용. 1000 nM Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1을 수반한 200 nM 사전 선별 라이브러리 상에서의 시험관내 선별에 대한 돌연변이의 분포도가 제시되어 있다. 제시된 돌연변이의 수는 PAM을 포함한 나머지 표적 부위가 표적에 적중한 염기 쌍만을 함유하는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 1 내지 12개 염기 쌍 표적 부위 하위서열 내에 있다 (a-l). 사전 선별 분포도와 후-선별 분포도는 3개 이하의 염기 쌍에 대해 유사한데, 이는 나머지 표적 부위가 Cas9:sgRNA와 최적의 상호 작용을 나타내는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍 내의 돌연변이를 수반한 표적 부위에 대한 관용을 명확하게 보여준다. 모든 패널에 대해, 그래프는 n ≥ 2,323 및 n ≥ 21,819를 각각 수반한 사전 선별 라이브러리 서열 및 후-선별 라이브러리 서열로부터 생성되었다.
도 18. 100 nM Cas9:sgRNA v2.1에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v2.1에 대한 효소 제한 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 PAM에 근접한 표적 부위의 말단에서 가장 높고, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 19. 1000 nM Cas9:sgRNA v1.0에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v1.0에 대한 효소 과잉 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 표적 부위 전반에 걸쳐 비교적 일정하지만, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 20. 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1에 대한 위치 특이성 패턴. 표적 부위 내의 특정 위치에서 인식된 4개의 가능한 염기 쌍 각각에 대한 특이성 스코어의 크기의 합으로서 정의된 위치 특이성이 sgRNA v2.1에 대한 효소 과잉 조건 하에서 각 표적 부위에 대해 플롯된다. 위치 특이성은 상기 표적 부위의 최대 위치 특이성 값에 대해 표준화시킨 값으로서 제시된다. 위치 특이성은 표적 부위 전반에 걸쳐 비교적 일정하지만, 표적 부위의 중간에서 가장 낮으며, 몇 가지 뉴클레오티드에서는 PAM으로부터 가장 원위에서 가장 낮다.
도 21. PAM 뉴클레오티드 선호도. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 사전 선별 라이브러리 및 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드에 대하여 제시되어 있다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도를 증가시켰지만, 가능한 다른 PAM 디뉴클레오티드는 선별 후의 존재도를 감소시켰다.
도 22. 표적에 적중한 부위에 대한 PAM 뉴클레오티드 선호도. 유도 RNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍 내의 돌연변이를 함유하지 않는 후-선별 라이브러리 구성원만이 본 분석에 포함되었다. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 사전 선별 라이브러리 및 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드에 대하여 제시되어 있다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리 내에서의 존재도를 증가시켰지만, 비록 Cas9:sgRNA의 효소 과잉 농도에 대한 상기 효과가 많은 디뉴클레오티드의 경우에는 보통 수준이거나 존재하지 않았을 지라도, 가능한 다른 PAM 디뉴클레오티드는 일반적으로, 선별 후의 존재도를 감소시켰다.
도 23. PAM 디뉴클레오티드 특이성 스코어. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 특이성 스코어가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드 (3개-뉴클레오티드 NGG PAM의 위치 2 및 3)에 대하여 제시되어 있다. 특이성 스코어는 PAM 디뉴클레오티드의 가능한 최대 강화에 대해 표준화시킨, 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리에서의 PAM 디뉴클레오티드의 강화를 표시한다. +1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 후-선별 라이브러리에서 100% 강화된다는 것을 표시하고, -1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 100% 탈강화된다는 것을 표시한다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리에서 가장 많이 강화되고, AG, GA, GC, GT, 및 TG는 다른 가능한 PAM 디뉴클레오티드와 비교해서 비교적 덜 탈강화된다.
도 24. 표적에 적중한 부위에 대한 PAM 디뉴클레오티드 특이성 스코어. 유도 RNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍 내의 돌연변이를 함유하지 않는 후-선별 라이브러리 구성원만이 본 분석에 포함되었다. 효소 제한 조건 및 효소 과잉 조건 하에서의 특이성 스코어가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) sgRNA v2.1을 이용한 선별에 대해 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드 (3개-뉴클레오티드 NGG PAM의 위치 2 및 3)에 대하여 제시되어 있다. 특이성 스코어는 PAM 디뉴클레오티드의 가능한 최대 강화에 대해 표준화시킨, 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리에서의 PAM 디뉴클레오티드의 강화를 표시한다. +1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 후-선별 라이브러리에서 100% 강화된다는 것을 표시하고, -1.0의 특이성 스코어는 특정 디뉴클레오티드가 100% 탈강화된다는 것을 표시한다. GG 디뉴클레오티드는 후-선별 라이브러리에서 가장 많이 강화되었고, AG 및 GA 뉴클레오티드는 적어도 한 가지 선별 조건에서 강화되지도 않았거나 탈강화되지도 않았으며, GC, GT, 및 TG는 다른 가능한 PAM 디뉴클레오티드와 비교해서 비교적 덜 탈강화된다.
도 25. 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 효과. 효소 제한 조건 (200 nM DNA, 100 nM Cas9:sgRNA v2.1)과 효소 과잉 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 간의 위치 특이성 변화가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) 표적 부위를 표적으로 하는 sgRNA를 이용한 선별에 대해 제시되어 있다. 라인은 소정의 위치에 대한 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화를 표시한다. 특이성 상의 가장 높은 변화는 효소 농도가 증가함에 따라 PAM 근위에서 일어난다.
도 26. 특이성에 대한 sgRNA 구조의 효과. 효소 과잉 조건 (200 nM DNA, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 하에서 Cas9:sgRNA v1.0과 Cas9:sgRNA v2.1 간의 위치 특이성 변화가, CLTA1 (a), CLTA2 (b), CLTA3 (c), 및 CLTA4 (d) 표적 부위를 표적으로 하는 sgRNA를 이용한 선별에 대해 제시되어 있다. 라인은 소정의 위치에 대한 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화를 표시한다.
도 27. 시험관 내에서 표적을 벗어난 DNA 서열의 Cas9:유도 RNA 절단. 시험관내 선별에 의해 확인된 5개의 CLTA4 표적을 벗어난 부위와 표적에 적중한 CLTA4 부위 (CLTA4-0)에 대하여 200 nM DNA 및 1000 nM Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용하여, 96-bp 선형 기질 상에서 분리된 DNA 절단 검정을 수행하였다. 제시된 강화 값은 1000 nM Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용한 시험관내 선별로부터의 것이다. CLTA4-1 및 CLTA4-3이 이들 조건 하에서 가장 고도로 강화된 서열이었다. CLTA4-2a, CLTA4-2b, 및 CLTA4-2c는 고도의 강화에서부터 강화가 전혀 없거나 고도의 탈강화까지의 일정 범위의 강화 값을 나타내는 2개-돌연변이 서열이다. 소문자는 표적에 적중한 CLTA4 부위를 기준으로 한 돌연변이를 표시한다. 강화 값은 시험관 내에서 관찰된 절단 양과 정량적으로 일치한다. 서열 식별자: 제시된 서열은 상단에서 하단으로, 서열 34; 서열 35; 서열 36; 서열 37; 서열 38; 및 서열 39이다.
도 28. 표적을 벗어난 부위의 시험관내 절단에 대한 유도 RNA 구조 및 Cas9:sgRNA 농도의 효과. CLTA4-3 표적을 벗어난 부위에 대하여 200 nM DNA, 및 100 nM Cas9:v1.0 sgRNA, 100 nM Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM Cas9:v1.0 sgRNA 또는 1000 nM Cas9:v2.1 sgRNA를 이용하여, 96-bp 선형 기질 상에서 분리된 DNA 절단 검정을 수행하였다 [5' GggGATGTAGTGTTTCCACtGGG 3' (서열 39)-돌연변이가 소문자로 제시된다]. DNA 절단이 시험된 4가지 조건 모두 하에서 관찰되고, 절단률은 효소 과잉 조건 하에서 보다 높거나, 또는 v1.0 sgRNA와 비교해서 v2.1 sgRNA를 이용하는 경우에 보다 높다.
정의
본원 및 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 표시하지 않는 한은 단수 및 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일 작용제 및 복수 개의 상기 작용제를 포함한다.
용어 "Cas9" 또는 "Cas9 뉴클레아제"는 Cas9 단백질, 또는 그의 단편을 포함하는 RNA-유도된 뉴클레아제를 지칭한다. Cas9 뉴클레아제는 또한, 종종 casn1 뉴클레아제 또는 CRISPR [클러스터링되고 규칙적으로 사이에 공간을 남겨둔 짧은 팔린드롬성(palindromic) 반복 서열]-관련 뉴클레아제로서 지칭된다. CRISPR은 이동성 유전적 요소 (예를 들어, 바이러스, 전위 요소 및 접합 플라스미드)에 대항하여 보호를 제공하는 적응 면역 체계이다. CRISPR 클러스터는 스페이서, 선행 이동 요소에 대해 상보적인 서열, 및 표적 침입 핵산을 함유한다. CRISPR 클러스터는 CRISPR RNA (crRNA)로 전사되고 프로세싱된다. 유형 II CRISPR 시스템에서 crRNA 전구를 정확하게 프로세싱하기 위해서는, 트랜스-코딩된 저분자 RNA (tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3 (rnc) 및 Cas9 단백질이 필요하다. 상기 tracrRNA는 crRNA 전구의 리보뉴클레아제 3-지원 프로세싱에 대한 유도로서 제공된다. 연속해서, Cas9/crRNA/tracrRNA는 상기 스페이서에 대해 상보적인 선형 또는 환상 dsDNA 표적을 엔도뉴클레오 분해적으로 절단한다. crRNA에 대해 상보적이지 않은 표적 가닥을 먼저, 엔도뉴클레오 분해적으로 커팅한 다음, 3'-5' 엑소뉴클레오 분해적으로 트리밍한다. 사실상, DNA-결합과 절단을 위해서는, 전형적으로 단백질과 양 RNA 종이 필요하다. 그러나, 단일 유도 RNA ("sgRNA", 또는 간단히 "gNRA")는 crRNA와 tracrRNA 둘 다의 측면이 단일 RNA 분자 내로 혼입되도록 조작될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9는 자기 대 비-자기를 구별하는 데 도움을 주기 위해 CRISPR 반복 서열 내의 짧은 모티프 (PAM 또는 프로토스페이서 인접 모티프)를 인식한다. Cas9 뉴클레아제 서열과 구조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). Cas9 오르소로그(ortholog)가 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) 및 에스. 더모필루스 (S. thermophilus)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 종에서 보고되었다. 부가의 적합한 Cas9 뉴클레아제 및 서열이 본 개시내용을 근거로 하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 이러한 Cas9 뉴클레아제 및 서열은 문헌 [Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에 개시된 유기체 및 유전자 자리로부터의 Cas9 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas9 또는 그의 단편을 포함하는 단백질은 "Cas9 변이체"로서 지칭된다. Cas9 변이체는 Cas9, 또는 그의 단편에 대한 상동성을 공유한다. 예를 들어, Cas9 변이체는 야생형 Cas9와 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 Cas9의 단편 (예를 들어, gRNA 결합성 도메인 또는 DNA-절단 도메인)을 포함하므로, 이러한 단편은 야생형 Cas9의 상응하는 단편과 약 70% 이상 동일하거나, 약 80% 이상 동일하거나, 약 90% 이상 동일하거나, 약 95% 이상 동일하거나, 약 98% 이상 동일하거나, 약 99% 이상 동일하거나, 약 99.5% 이상 동일하거나, 또는 약 99.9% 이상 동일하다. 일부 실시양태에서, 야생형 Cas9는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 (NCBI 참조 서열: NC_017053.1, 서열 40 (뉴클레오티드); 서열 41 (아미노산))에 상응한다.
핵산 분자의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "콘카테머"는 일련으로 연결된 동일한 DNA 서열의 다수 카피를 함유하는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 특이적 서열의 10개 카피 (예를 들어, [XYZ]10)를 포함하는 콘카테머는 일련으로 서로 연결된 동일한 특이적 서열의 10개 카피, 예를 들어 5'- XYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZ -3'를 포함할 것이다. 콘카테머는 반복 단위 또는 서열의 어떠한 수의 카피, 예를 들어 2개 이상의 카피, 3개 이상의 카피, 4개 이상의 카피, 5개 이상의 카피, 10개 이상의 카피, 100개 이상의 카피, 1000개 이상의 카피 등을 포함할 수 있다. 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열을 포함하는 핵산 서열의 콘카테머의 예는 [(표적 부위)-(불변 삽입 서열)]300일 것이다. 콘카테머는 선형 핵산 분자일 수 있거나, 또는 환상일 수 있다.
용어 "접합하는", "접합된" 및 "접합"은 두 실체, 예를 들어 두 분자, 예컨대 두 단백질, 두 도메인 (예를 들어, 결합성 도메인과 절단 도메인), 또는 단백질과 작용제, 예를 들어 단백질 결합성 도메인과 소분자의 연합을 지칭한다. 일부 측면에서, 이러한 연합은 단백질 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제)과 핵산 (예를 들어, 유도 RNA) 간의 연합이다. 상기 연합은, 예를 들어 직접 또는 간접 (예를 들어, 링커를 통함) 공유 연쇄를 통해서 또는 비공유적 상호 작용을 통해서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 연합은 공유적이다. 일부 실시양태에서, 두 분자는 양 분자를 연결하는 링커를 통하여 접합된다. 예를 들어, 두 단백질이 서로 접합하여, 예를 들어 결합성 도메인과 조작된 뉴클레아제의 절단 도메인이 접합되어 단백질 융합물을 형성하는 일부 실시양태에서, 이러한 두 단백질은 폴리펩티드 링커, 예를 들어 한 단백질의 C-말단을 다른 단백질의 N-말단과 연결시켜 주는 아미노산 서열을 통하여 접합될 수 있다.
핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "컨센서스 서열"은 복수 개의 유사한 서열 내의 각 위치에서 발견된 가장 빈번한 뉴클레오티드 잔기를 나타내는 계산된 서열을 지칭한다. 전형적으로, 컨센서스 서열은 유사한 서열을 서로 비교하고 유사한 서열 모티프를 계산하는 서열 정렬에 의해 결정된다. 뉴클레아제 표적 부위 서열의 맥락에서, 뉴클레아제 표적 부위의 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 소정의 뉴클레아제에 의해 가장 빈번하게 결합되거나 또는 가장 높은 친화도로 결합된 서열일 수 있다. RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9) 표적 부위 서열과 관련하여, 컨센서스 서열은 일부 실시양태에서, 특정 gRNA, 또는 복수 개의 gRNA가, 예를 들어 상보적 염기 쌍 형성을 근거로 하여 결합되는 것으로 예상되거나 설계되는 서열 또는 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 반응을 유발시키기에 충분한 생물학상 활성제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제의 유효량은 뉴클레아제에 의해 특이적으로 결합되고 절단된 표적 부위의 절단을 유도시키기에 충분한 뉴클레아제의 양을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 특정 작용제, 예를 들어 뉴클레아제, 혼성체 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드의 유효량은 각종 인자, 예를 들어 목적하는 생물학적 반응, 특이적 대립 유전자, 게놈, 표적 부위, 표적화되는 세포 또는 조직, 및 사용되는 작용제에 따라서 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에네다인"은 이중 결합에 의해 분리된 2개의 삼중 결합을 함유하는 9원 환 및 10원 환 중 어느 하나를 특징으로 하는 박테리아성 자연 생성물 부류를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [K. C. Nicolaou; A. L. Smith; E. W. Yue (1993). "Chemistry and biology of natural and designed enediynes". PNAS 90 (13): 5881-5888] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 에네다인은 버그만 환화 반응 (Bergman cyclization)을 진행할 수 있고, 이로써 생성된 2가 라디칼인 1,4-데히드로벤젠 유도체는 DNA의 당 주쇄로부터 수소 원자를 끌어내어, DNA 가닥 절단을 초래할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [S. Walker; R. Landovitz; W.D. Ding; G.A. Ellestad; D. Kahne (1992). "Cleavage behavior of calicheamicin gamma 1 and calicheamicin T". Proc Natl Acad Sci U.S.A. 89 (10): 4608-12] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). DNA와의 그들의 반응성은 많은 에네다인에 항생제 형질을 부여해 주고, 일부 에네다인은 항암 항생제로서 임상적으로 연구되고 있다. 에네다인의 비제한적 예는 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신이다 (예를 들어, 문헌 [Adrian L. Smith and K. C. Bicolaou, "The Enediyne Antibiotics" J. Med. Chem., 1996, 39 (11), pp 2103-2117]; 및 [Donald Borders, "Enediyne antibiotics as antitumor agents," Informa Healthcare; 1st edition (November 23, 1994, ISBN-10: 0824789385] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "귀소 엔도뉴클레아제"는 인트론 또는 인테인에 의해 전형적으로 코딩된 특정 유형의 제한 효소를 지칭한다 [Edgell DR (February 2009). "Selfish DNA: homing endonucleases find a home". Curr Biol 19 (3): R115-R117; Jasin M (Jun 1996). "Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases". Trends Genet 12 (6): 224-8; Burt A, Koufopanou V (December 2004). "Homing endonuclease genes: the rise and fall and rise again of a selfish element". Curr Opin Genet Dev 14 (6): 609-15; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]. 귀소 엔도뉴클레아제 인식 서열은 극히 낮은 확률 (대략 7x1010 bp당 1회)로만 무작위로 발생되기에 충분히 길고, 정상적으로는 게놈당 하나의 사례에서만 발견된다.
핵산 또는 단백질의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "라이브러리"는 2개 이상의 상이한 핵산 또는 단백질의 집단을 각각 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레아제 표적 부위의 라이브러리는 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는 2개 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 101개 이상, 102개 이상, 103개 이상, 104개 이상, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상, 1012개 이상, 1013개 이상, 1014개 이상, 또는 1015개 이상의 상이한 핵산 또는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리의 구성원은 무작위적 서열, 예를 들어 완전히 또는 부분적으로 무작위적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 서로 무관한 핵산 분자, 예를 들어 완전히 무작위적인 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 라이브러리의 적어도 일부 구성원은 관련될 수 있는데, 예를 들어 이들은 특별한 서열, 예컨대 컨센서스 표적 부위 서열의 변이체 또는 유도체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 2개의 인접한 분자 또는 모이어티, 예를 들어 뉴클레아제의 절단 도메인과 결합성 도메인을 연결하는 분자 또는 화학 기를 지칭한다. 전형적으로, 링커는 2개 기, 분자 또는 기타 모이어티 사이에 위치되거나 또는 이들이 양옆에 위치하고 있고, 공유 결합을 통하여 각자 연결되므로, 둘을 연결시켜 준다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 또는 복수 개의 아미노산 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)이다. 일부 실시양태에서, 링커는 유기 분자, 기, 중합체, 또는 화학적 모이어티이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "뉴클레아제"는 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 작용제, 예를 들어 단백질 또는 소분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단백질, 예를 들어, 핵산 분자와 결합할 수 있고 이러한 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 잔기를 연결시켜 주는 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소이다. 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드 쇄의 말단에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 "인식 서열", "뉴클레아제 표적 부위" 또는 "표적 부위"로서 본원에 지칭되기도 하는 특이적 뉴클레오티드 서열 내의 특이적 포스포디에스테르 결합과 결합하고/하거나 이러한 결합을 절단하는 부위-특이적 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 표적 부위를 보완하는 서열을 갖는 RNA와 복합체를 형성함으로써 (예를 들어, 이러한 RNA와 결합함으로써) 뉴클레아제의 서열 특이성을 제공하는 RNA-유도된 (즉, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 단일 가닥 표적 부위를 인식하는 반면, 다른 실시양태에서는, 뉴클레아제가 이중 가닥 표적 부위, 예를 들어 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식한다. 많은 자연 발생적 뉴클레아제, 예를 들어 많은 자연 발생적 DNA 제한 뉴클레아제의 표적 부위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 많은 경우에 있어서, DNA 뉴클레아제, 예컨대 EcoRI, HindIII, 또는 BamHI는 4 내지 10개 염기 쌍 길이의 팔린드롬성 이중 가닥 DNA 표적 부위를 인식하고, 이러한 표적 부위 내의 특이적 위치에서 2개의 DNA 가닥 각각을 커팅한다. 일부 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 대칭적으로 커팅하는데, 즉 양 가닥을 동일한 위치에서 커팅하여 그 말단이 염기 쌍 형성된 뉴클레오티드를 포함하도록 한다 (이는 본원에서 평활 말단으로서 지칭되기도 함). 기타 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 비대칭적으로 커팅하는데, 즉 각 가닥을 상이한 위치에서 커팅하여 그 말단이 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 포함하도록 한다. 이중 가닥 DNA 분자의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드는 또한, "오버행"으로서 지칭되는데, 예를 들어 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)가 각각의 DNA 가닥의 5' 또는 3' 말단을 형성하는 지에 따라서 "5'-오버행"으로서 또는 "3'-오버행"으로서 지칭된다. 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드(들)로 종결되는 이중 가닥 DNA 분자 말단은 또한, 점착성 말단으로서 지칭되는데, 이는 이들이 쌍을 형성하지 않은 상보적 뉴클레오티드(들)를 포함하는 다른 이중 가닥 DNA 분자 말단에 "점착"될 수 있기 때문이다. 뉴클레아제 단백질은 전형적으로, 단백질과 핵산 기질의 상호 작용을 매개하고, 또한 일부 경우에는, 표적 부위와 특이적으로 결합하는 "결합성 도메인"과, 핵산 골격 내의 포스포디에스테르 결합의 절단을 촉매하는 "절단 도메인"을 포함한다. 일부 실시양태에서 뉴클레아제 단백질은 단량체성 형태의 핵산 분자와 결합하고 이를 절단할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서, 뉴클레아제 단백질은 표적 핵산 분자를 절단하기 위하여 이량체화되거나 또는 다량체화되어야 한다. 자연 발생적 뉴클레아제의 결합성 도메인 및 절단 도메인 뿐만 아니라 뉴클레아제 결합 특이성 표적 부위를 창출시키기 위해 융합될 수 있는 모듈(modular) 결합성 도메인 및 절단 도메인은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 아연 핑거 또는 전사 활성인자 유사 요소가 결합성 도메인으로서 사용되어 목적하는 표적 부위와 특이적으로 결합될 수 있고, 절단 도메인, 예를 들어 FokI의 절단 도메인과 융합 또는 접합되어 상기 표적 부위를 절단하는 조작된 뉴클레아제를 창출시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산" 및 "핵산 분자"는 뉴클레오염기 및 산성 모이어티를 포함하는 화합물, 예를 들어 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로, 중합체성 핵산, 예를 들어 3개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 선형 분자인데, 여기서는 인접한 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연쇄를 통하여 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 개개의 핵산 잔기 (예를 들어 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 3개 이상의 개개의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체 (예를 들어, 3개 이상의 일련의 뉴클레오티드)를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA를 포괄한다. 핵산은, 예를 들어 게놈, 전사물, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, snRNA, 플라스미드, 코스미드, 염색체, 염색분체, 또는 기타 자연 발생적 핵산 분자의 맥락에서 자연 발생적일 수 있다. 다른 한편으론, 핵산 분자는 비-자연 발생적 분자, 예를 들어 재조합 DNA 또는 RNA, 인공 염색체, 조작된 게놈, 또는 그의 단편, 또는 합성 DNA, RNA, DNA/RNA 혼성체일 수 있거나 또는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 더욱이, 용어 "핵산", "DNA", "RNA" 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉 포스포디에스테르 골격 이외를 것을 갖는 유사체를 포함한다. 핵산은 자연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 이용하여 생성될 수 있으며, 임의로 정제되고, 화학적으로 합성될 수 있다. 적당한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우에, 핵산은 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당을 갖는 유사체, 및 골격 변형을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시되지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 자연 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸아데노신, 5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학상 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화 염기); 삽입된 염기; 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연쇄)이거나 이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물"은 특정 질환 또는 장애 치료의 맥락에서 특정 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 활성 성분, 예를 들어, 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "증식성 질환"은 특정 세포 또는 세포 집단이 비정상적으로 상승된 증식률을 나타낸다는 점에서 세포 또는 조직 생체 항상성이 교란되는 모든 질환을 지칭한다. 증식성 질환은 과증식성 질환, 예컨대 전-종양 과형성 병태 및 종양 질환을 포함한다. 종양 질환은 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하고, 양성 종양과 악성 종양 둘 다를 포함한다. 악성 종양은 또한, 암으로서 지칭된다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 (아미드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 모든 크기, 구조 및 기능의 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 3개 이상의 아미노산 길이일 것이다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 개개의 단백질, 또는 단백질의 컬렉션을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 아미노산은, 예를 들어 화학적 실체, 예컨대 탄수화물 기, 히드록실 기, 포스페이트 기, 파르네실 기, 이소파르네실 기, 지방산 기; 접합, 기능화 또는 기타 변형을 위한 링커 등을 부가함으로써 변형될 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 또한, 단일 분자일 수 있거나 또는 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 단지, 자연 발생적 단백질 또는 펩티드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드는 자연 발생적, 재조합, 또는 합성, 또는 그의 모든 조합일 수 있다. 단백질은 상이한 도메인, 예를 들어, 핵산 결합성 도메인과 핵산 절단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 단백질성 부분, 예를 들어, 핵산 결합성 도메인을 구성하는 아미노산 서열, 및 유기 화합물, 예를 들어, 핵산 절단제로서 작용할 수 있는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 핵산, 예를 들어, RNA와의 복합체로 존재하거나, 또는 이러한 핵산과 연합된 채로 있다.
핵산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "무작위적"은 유리 뉴클레오티드의 혼합물, 예를 들어 4개 모든 뉴클레오티드 A, T, G, 및 C의 혼합물을 혼입시키기 위해 합성시킨 서열 내의 잔기 또는 서열을 지칭한다. 무작위적 잔기는 전형적으로, 뉴클레오티드 서열 내의 문자 N으로써 나타낸다. 일부 실시양태에서, 무작위적 서열 또는 잔기는 완전히 무작위적인데, 이러한 경우에 무작위적 잔기는 각각의 서열 잔기의 합성 단계 동안 혼입될 뉴클레오티드를 동일 량 (예를 들어, 25% T, 25% A, 25% G, 및 25% C)으로 부가함으로써 합성된다. 일부 실시양태에서, 무작위적 서열 또는 잔기는 부분적으로 무작위적인데, 이러한 경우에 무작위적 잔기는 각각의 서열 잔기의 합성 단계 동안 혼입될 뉴클레오티드를 동일하지 않은 양 (예를 들어, 79% T, 7% A, 7% G, 및 7% C)으로 부가함으로써 합성된다. 부분적 무작위화로 인해, 소정의 서열 상에 주형화(template)되긴 하지만 목적하는 빈도로 돌연변이를 혼입시킨 서열을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 뉴클레아제 표적 부위가 합성 주형으로서 사용되는 경우에, 각 단계에서 각각의 잔기에 나타낸 뉴클레오티드가 79%로 합성에 부가되고 다른 3개의 뉴클레오티드는 각각 7%로 부가되는 부분적 무작위화로 인해서는, 부분적으로 무작위적인 표적 부위의 혼합물이 합성될 것인데, 이는 여전히 본래의 표적 부위의 컨센서스 서열을 나타내긴 하지만, 상기와 같이 합성된 각 잔기에 대하여 21%의 통계적 빈도로 각 잔기에서 본래의 표적 부위와 상이하다 (이항 분포). 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 서열은 컨센서스 서열과, 이항 분포로 평균 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과 또는 30% 초과 상이하다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 서열은 컨센서스 부위와, 이항 분포로 평균 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 상이하다.
용어 "RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제" 및 "RNA-유도된 뉴클레아제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 절단에 대한 표적이 아닌 하나 이상의 RNA와 복합체를 형성하는 (예를 들어, 이러한 RNA와 결합되거나 연합되는) 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RNA와 복합체를 형성하는 경우의 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 뉴클레아제:RNA 복합체로서 지칭될 수 있다. 전형적으로, 이와 같이 결합된 RNA(들)는 유도 RNA (gRNA) 또는 단일-유도 RNA (sgRNA)로서 지칭된다. 이러한 gRNA/sgRNA는 특정 표적 부위에 대한 뉴클레아제/RNA 복합체의 결합을 매개하는 표적 부위를 보완하고, 뉴클레아제:RNA 복합체의 서열 특이성을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 (CRISPR-관련 시스템) Cas9 엔도뉴클레아제, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 Cas9 (Csn1)이다 (예를 들어, 문헌 ["Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)]; ["CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)]; 및 ["A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 절단 부위를 결정하기 때문에, 이들 단백질은 원칙상, 유도 RNA에 의해 지정된 모든 서열을 절단할 수 있다. 부위-특이적 절단을 위해 (예를 들어, 게놈을 변형시키기 위해) RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)]; [Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)]; [Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)]; [Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)]; [Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)]; [Jiang, W.et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "소분자" 및 "유기 화합물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 자연 발생적이든 인공적으로 창출된 것이든 (예를 들어, 화학적 합성을 통함) 비교적 저분자량을 갖는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 유기 화합물은 탄소를 함유한다. 유기 화합물은 다수의 탄소-탄소 결합, 입체 중심, 및 기타 작용기 (예를 들어, 아민, 히드록실, 카르보닐 또는 헤테로사이클릭 환)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 단량체성이고, 약 1500 g/mol 미만의 분자량을 갖는다. 특정 실시양태에서, 소분자의 분자량은 약 1000 g/mol 미만 또는 약 500 g/mol 미만이다. 특정 실시양태에서, 소분자는 약물, 예를 들어 적당한 정부 기관 또는 규제 기관에 의해 인간 또는 동물에게 사용하는 데 안전하고 유효한 것으로 이미 간주된 약물이다. 특정 실시양태에서, 유기 분자는 핵산과 결합하고/하거나 이를 절단하는 것으로 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 에네다인이다. 일부 실시양태에서, 유기 화합물은 항생제 약물, 예를 들어 항암 항생제, 예컨대 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 또는 그의 유도체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 개개의 유기체, 예를 들어 개개의 포유류를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 양, 염소, 소, 고양이, 또는 개이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 척추동물, 양서류, 파충류, 어류, 곤충, 파리, 또는 선충이다.
뉴클레아제의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 핵산" 및 "표적 게놈"은 소정의 뉴클레아제의 하나 이상의 표적 부위를 포함하는 핵산 분자 또는 게놈을 각각 지칭한다.
본원에서 용어 "뉴클레아제 표적 부위"와 상호 교환적으로 사용된 용어 "표적 부위"는 뉴클레아제에 의해 결합되고 절단되는 핵산 분자 내의 서열을 지칭한다. 표적 부위는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이량체화되는 뉴클레아제, 예를 들어 FokI DNA 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 좌측-절반 부위 (뉴클레아제의 하나의 단량체에 의해 결합됨), 우측-절반 부위 (뉴클레아제의 제2의 단량체에 의해 결합됨), 및 커팅이 이루어지는 상기 절반 부위들 사이의 스페이서 서열을 포함한다. 이러한 구조 ([좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위])는 본원에서 LSR 구조로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 좌측-절반 부위 및/또는 우측-절반 부위는 10 내지 18개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 상기 절반 부위 중 어느 하나 또는 둘 다는 더 짧거나 더 길다. 일부 실시양태에서, 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 상이한 핵산 서열을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 일부 실시양태에서, 4 내지 8 bp 길이의 비-지정된 스페이서 영역의 양옆에 위치하고 있는, 각각 6 내지 18 bp 길이의 2개의 절반 부위를 포함할 수 있다. TALEN의 맥락에서, 표적 부위는 일부 실시양태에서, 10 내지 30 bp 길이의 비-지정된 스페이서 영역의 양옆에 위치하고 있는, 각각 10 내지 23 bp 길이의 2개의 절반 부위를 포함할 수 있다. RNA-유도된 (예를 들어, RNA-프로그램 가능한) 뉴클레아제의 맥락에서, 표적 부위는 전형적으로, 상기 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제의 sgRNA에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열, 및 이러한 sgRNA-상보성 서열에 인접한 3' 말단에서의 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함한다. RNA-유도된 뉴클레아제 Cas9의 경우에는, 표적 부위가 일부 실시양태에서, 20개 염기 쌍 플러스 3개 염기 쌍 PAM [예를 들어, NNN (여기서, N은 모든 뉴클레오티드를 나타낸다)]일 수 있다. 전형적으로, PAM의 제1 뉴클레오티드는 어떠한 뉴클레오티드일 수도 있지만, 2개의 하류 뉴클레오티드는 특이적 RNA-유도된 뉴클레아제에 따라서 지정된다. RNA-유도된 뉴클레아제, 예컨대 Cas9에 대해 예시되는 표적 부위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, NNG, NGN, NAG, 및 NGG (여기서, N은 모든 뉴클레오티드를 나타낸다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상이한 종 (예를 들어, 에스. 피오게네스 대신 에스. 더모필루스)로부터의 Cas9 뉴클레아제는 서열 NGGNG를 포함하는 PAM을 인식한다. NNAGAAW 및 NAAR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 부가의 PAM 서열이 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 예를 들어, RNA-유도된 뉴클레아제, 예컨대, 예를 들어 Cas9의 표적 부위는 구조 [NZ]-[PAM] (여기서, 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드이고, Z는 1 내지 50의 정수이다)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상, 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, Z는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50이다. 일부 실시양태에서, Z는 20이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 이펙터" (TALE)는 고도로 가변적인 2개-아미노산 모티프 (반복 가변 2잔기, RVD)를 포함하는, 고도로 보존된 33 내지 34개 아미노산 서열을 함유하는 DNA 결합성 도메인을 포함하는 박테리아성 단백질을 지칭한다. 상기 RVD 모티프는 핵산 서열에 대한 결합 특이성을 결정하고, 목적하는 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 따라서 조작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing". Nature Biotechnology 29 (2): 143-8]; [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Boch, Jens (February 2011). "TALEs of genome targeting". Nature Biotechnology 29 (2): 135-6]; [Boch, Jens; et.al. (December 2009). "Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors". Science 326 (5959): 1509-12]; 및 [Moscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). "A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors". Science 326 (5959): 1501] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아미노산 서열과 DNA 인식 간의 단순 관계는 적당한 RVD를 함유하는 반복 절편의 조합을 선택함으로써 특이적 DNA 결합성 도메인을 조작할 수 있게 해주었다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제" (TALEN)는 DNA 절단 도메인, 예를 들어 FokI 도메인에 대한 전사 활성인자 유사 이펙터 DNA 결합성 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제를 지칭한다. 조작된 TALE 구조물을 생성시키기 위한 수많은 모듈 어셈블리 계획이 보고되었다 (예를 들어, 문헌 [Zhang, Feng; et.al. (February 2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription". Nature Biotechnology 29 (2): 149-53]; [Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed. "Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity". PLoS ONE 6 (5): e19509]; [Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting". Nucleic Acids Research]; [Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011). "Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning". Nucleic Acids Research]; [Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes". Nucleic Acids Research.]; [Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed. ed. "Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning". PLoS ONE 6 (5): e19722] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다).
용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 한 가지 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나, 이러한 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 증상의 진행을 억제하는 것을 목표로 하는 임상적 개입을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료는 한 가지 이상의 증상이 발생된 후 및/또는 특정 질환이 진단된 후에 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료는 증상의 부재 하에, 예를 들어 증상의 발병을 방지 또는 지연시키거나, 또는 질환의 발병 또는 진행을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 증상의 발병 이전에 감수성 개체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 증상 병력을 고려하고/하거나 유전적 또는 기타 감수성 요인을 고려한다). 치료는 또한, 증상이 해소된 후에도, 예를 들어 그의 재발을 방지하거나 지연시키기 위해 지속될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거"는 특정 폴드와, 이러한 폴드를 안정화시키는 하나 이상의 아연 이온의 배위를 특징으로 하는 소형 핵산-결합성 단백질 구조 모티프를 지칭한다. 아연 핑거는 광범위한 각종 상이한 단백질 구조를 포괄한다 (예를 들어, 문헌 [Klug A, Rhodes D (1987). "Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition". Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82] 참조; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 아연 핑거는 뉴클레오티드의 특이적 서열과 결합하도록 설계될 수 있고, 일련의 아연 핑거의 융합물을 포함하는 아연 핑거 어레이는 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 설계될 수 있다. 이러한 아연 핑거 어레이는, 예를 들어 핵산 절단 도메인과 접합된 경우에, 단백질, 예를 들어 뉴클레아제의 결합성 도메인을 형성할 수 있다. Cys2His2, 개그 너클(Gag knuckle), 트레블 클레프(Treble clef), 아연 리본, Zn2/Cys6, 및 TAZ2 도메인-유사 모티프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 유형의 아연 핑거 모티프가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003). "Structural classification of zinc fingers: survey and summary". Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50] 참조). 전형적으로, 단일 아연 핑거 모티프는 핵산 분자의 3 또는 4개 뉴클레오티드와 결합된다. 따라서, 예를 들어 2개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 6 내지 8개 뉴클레오티드와 결합될 수 있고, 3개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 9 내지 12개 뉴클레오티드와 결합될 수 있으며, 4개의 아연 핑거 모티프를 포함하는 아연 핑거 도메인은 12 내지 16개 뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 적합한 모든 단백질 공학 기술을 이용하여, 3 내지 30개 뉴클레오티드 길이로부터 사실상 목적하는 어떠한 표적 서열과도 결합하도록 신규 아연 핑거 융합물을 설계할 수 있고/있거나 아연 핑거의 DNA-결합 특이성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001). "Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins". Annual Review of Biochemistry 70: 313-340]; [Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003). "Drug discovery with engineered zinc-finger proteins". Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368]; 및 [Liu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997). "Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes". Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94 (11)] 참조; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 핵산을 절단하는 단백질 도메인과 조작된 아연 핑거 어레이 간의 융합을 이용하여, "아연 핑거 뉴클레아제"를 생성시킬 수 있다. 아연 핑거 뉴클레아제는 전형적으로, 핵산 분자 내의 특이적 표적 부위와 결합하는 아연 핑거 도메인; 및 결합성 도메인에 의해 결합된 표적 부위 내에 또는 이러한 부위에 근접하여 핵산 분자를 커팅하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 전형적으로 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 3 내지 6개 개개의 아연 핑거 모티프와 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이의 범위의 결합성 표적 부위를 갖는 결합성 도메인을 포함한다. 소정의 게놈 내에서 독특한 표적 부위와 결합하고 이를 절단시키는 것이 요망되는 상황 하에서는 보다 긴 표적 부위가 특히 매력적이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "아연 핑거 뉴클레아제"는 아연 핑거 어레이를 포함하는 결합성 도메인과 접합된 핵산 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 절단 도메인은 유형 II 제한 엔도뉴클레아제 FokI의 절단 도메인이다. 아연 핑거 뉴클레아제는 절단을 위해 소정의 핵산 분자 내의 사실상 목적하는 어떠한 서열도 표적으로 하도록 설계될 수 있고, 복합체 게놈의 맥락에서 독특한 부위와 결합하도록 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 가능성은, 예를 들어 치료적 가치의 표적화된 게놈 변경을 달성하기 위하여, 살아있는 세포 내의 단일 게놈 부위의 표적화된 절단을 허용해 준다. 이중 가닥 브레이크를 목적하는 게놈 유전자 자리로 표적화하는 것을 이용하여, 비-상동 DNA 복구 경로의 변이성 성질에 기인하여, 프레임 시프트 돌연변이를 유전자의 코딩 서열 내로 도입할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법에 의해 관심 부위를 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 공지된 특이성의 개개의 아연 핑거 모티프를 조합함으로써, 목적하는 특이성을 지닌 아연 핑거 결합성 도메인을 설계할 수 있다. DNA와 결합된 아연 핑거 단백질 Zif268의 구조는 이러한 분야에서의 많은 작업에 영향을 미쳐왔고, 64개의 가능한 염기 쌍 삼중체 각각에 대한 아연 핑거를 수득한 다음, 이들 모듈 아연 핑거를 혼합 및 매칭하여 목적하는 모든 서열 특이성을 지닌 단백질을 설계한다는 개념이 보고되었다 (Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809-17; 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 각각 3개의 염기 쌍 DNA 서열을 인식하는 별개의 아연 핑거를 합하여, 9개 염기 쌍 내지 18개 염기 쌍 길이 범위의 표적 부위를 인식하는 3-, 4-, 5-, 또는 6-핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 보다 긴 어레이가 고려된다. 다른 실시양태에서, 6 내지 8개 뉴클레오티드를 인식하는 2-핑거 모듈을 합하여, 4-, 6-, 또는 8-아연 핑거 어레이를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 박테리아성 또는 파지 디스플레이를 이용하여, 목적하는 핵산 서열, 예를 들어 3 내지 30 bp 길이의 목적하는 뉴클레아제 표적 부위를 인식하는 아연 핑거 도메인을 발생시킨다. 아연 핑거 뉴클레아제는 일부 실시양태에서, 아연 핑거 결합성 도메인; 및 링커, 예를 들어 폴리펩티드 링커를 통하여 서로 융합되거나 또는 달리 접합된 절단 도메인을 포함한다. 링커의 길이가, 아연 핑거 도메인에 의해 결합된 핵산 서열로부터의 커팅물의 거리를 결정한다. 보다 짧은 링커가 사용된 경우에는, 절단 도메인이, 상기와 같이 결합된 핵산 서열에 보다 근접한 핵산을 커팅하는 반면, 보다 긴 링커는 상기 결합된 핵산 서열과 커팅물 간의 거리를 보다 크게 만들 것이다. 일부 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인은 결합된 핵산을 커팅하기 위해 이량체화해야 한다. 이러한 일부 실시양태에서, 이량체는 2개 단량체의 이종-이량체인데, 이러한 단량체 각각은 상이한 아연 핑거 결합성 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이량체는 FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 A를 포함하는 하나의 단량체와, FokI 절단 도메인과 접합된 아연 핑거 도메인 B를 포함하는 하나의 단량체를 포함할 수 있다. 이러한 비제한적 예에서, 아연 핑거 도메인 A는 표적 부위의 한쪽의 핵산 서열과 결합되고, 아연 핑거 도메인 B는 표적 부위의 다른 쪽의 핵산 서열과 결합되며, 이량체화 FokI 도메인은 아연 핑거 도메인 결합 부위들 사이에 있는 핵산을 커팅한다.
도입부
부위-특이적 뉴클레아제는 시험관내 또는 생체 내에서 표적화된 게놈 변형을 위한 강력한 도구이다. 일부 부위 특이적 뉴클레아제는 이론적으로, 다른 게놈 부위에는 어떠한 영향도 미치지 않으면서 절단을 위한 게놈 내의 독특한 단일 부위를 표적으로 할 수 있는, 특정 표적 절단 부위에 대한 특정 수준의 특이성을 달성할 수 있게 해준다. 살아있는 세포 내에서의 뉴클레아제 절단으로 인해, 예를 들어 상동 재조합을 통하여 절단되고 복구된 게놈 서열의 변형을 종종 초래하는 DNA 복구 기전이 촉발되는 것으로 보고되었다. 따라서, 특정 게놈 내의 독특한 특이적 서열을 표적화 절단시키면, 통상적인 유전자 표적화 방법으로는 조작하기가 어려운 세포, 예컨대 많은 인간 체세포 또는 배아 줄기 세포를 포함한 살아있는 세포 내에서 유전자를 표적화하고 유전자를 변형시키기 위한 새로운 수단을 이용할 수 있게 된다. 질환 관련 서열, 예를 들어 HIV/AIDS 환자에게서의 CCR-5 대립 유전자, 또는 종양 신생혈관증식에 필요한 유전자의 뉴클레아제-매개된 변형이 임상 상황에서 이용될 수 있고, 2개의 부위 특이적 뉴클레아제가 현재 임상 시험 중이다.
부위-특이적 뉴클레아제-매개된 변형 분야에서의 한 가지 중요한 측면은 표적을 벗어난 뉴클레아제 효과인데, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드가 의도한 표적 서열과 상이한 게놈 서열의 절단이다. 표적을 벗어난 절단의 바람직하지 못한 부작용은 유전자 표적화 현상 동안 불필요한 유전자 자리 내로의 삽입에서부터 임상 시나리오에서 중증의 합병증까지로 다양하다. 특정 대상체에게 투여된 엔도뉴클레아제에 의해 종양 억제 유전자 또는 필수 유전자 작용기를 코딩하는 서열이 표적을 벗어나서 절단되면, 이러한 대상체에게 질환이 유발되거나 심지어 사망할 수 있다. 따라서, 뉴클레아제의 효능과 안전성을 결정하기 위해서는 이를 실험실 또는 임상에서 사용하기 전에 이러한 뉴클레아제의 절단 선호도를 명확하게 규명하는 것이 요망된다. 추가로, 뉴클레아제 절단 특성을 명확히 규명하는 것이, 후보 뉴클레아제 군으로부터 특이적 과제에 가장 잘 적합한 뉴클레아제를 선별할 수 있게 해주거나 또는 복수 개의 뉴클레아제로부터 수득된 진화 생성물을 선별할 수 있게 해준다. 이와 같이 뉴클레아제 절단 특성을 명확히 규명하는 것은 또한, 증강된 특성, 예컨대 증강된 특이성 또는 효율을 지닌 뉴클레아제의 새로운 설계에 영향을 미칠 수 있다.
뉴클레아제가 핵산의 표적화된 조작을 위해 이용되는 많은 시나리오에서는, 절단 특이성이 중요한 특징이다. 일부 조작된 뉴클레아제 결합성 도메인의 불완전한 특이성은 시험관내와 생체내 둘 다에서 표적을 벗어난 절단과 바람직하지 못한 효과를 유발시킬 수 있다. ELISA 검정, 마이크로어레이, 1-혼성체 시스템, SELEX, 및 그의 변이체, 및 로제타(Rosetta)-기반 컴퓨터 예측을 포함한, 부위-특이적 뉴클레아제 특이성을 평가하는 현재의 방법은 모두, 이러한 뉴클레아제의 결합 특이성이 그의 절단 특이성과 등가이거나 이에 비례한다는 가정을 전제로 한 것이다.
뉴클레아제의 표적을 벗어난 결합 효과를 예측하는 것이, 바람직하지 못한 생물학적 효과를 초래할 수 있는 뉴클레아제의 표적을 벗어난 절단 효과의 불완전한 근사치를 구성한다는 사실이 기존에 밝혀졌다 (PCT 출원 WO 2013/066438; 및 문헌 [Pattanayak, V., Ramirez, C.L., Joung, J.K. & Liu, D.R. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nature methods 8, 765-770 (2011)]; 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 이러한 발견은 일부 부위 특이적 DNA 뉴클레아제의 보고된 독성이 표적을 벗어난 결합 단독이라기 보다는 오히려 표적을 벗어난 DNA 절단으로부터 비롯된다는 견해와 일치하였다.
본 개시내용의 방법 및 시약은 일부 측면에서, 기존의 방법에 비해 개선을 나타내고, 소정의 뉴클레아제의 표적 부위 특이성을 정확하게 평가해줄 수 있으며, 적합한 독특한 표적 부위의 선별과, 복합체 게놈의 맥락에서 단일 부위의 표적화된 절단을 위한 고도의 특이적 뉴클레아제의 설계 또는 선별을 위한 전략을 제공해 준다. 예를 들어, 후보 표적 부위를 포함하는 핵산 분자의 라이브러리를 스크리닝함으로써 뉴클레아제 표적 부위 특이성 프로파일을 결정하는 것으로 기존에 보고된 일부 방법은 라이브러리 구성원 핵산의 뉴클레아제의 2개의 인접한 커트로부터 비롯되는 2개의 절반-부위의 서열로부터 표적 부위의 간접적인 재구축을 필요로 하는 "2-커트" 시험관내 선별 방법에 의존하였다 (예를 들어, 문헌 [Pattanayak, V. et al., Nature Methods 8, 765-770 (2011)] 참조). 이러한 "2-커트" 전략과는 반대로, 본 개시내용의 방법은 뉴클레아제에 의해 1회 이상 커팅된 적이 있는 라이브러리 구성원의 식별을 허용해 주는, "1 커트" 스크리닝 전략을 활용하고 있다. 본원에 제공된 "1-커트" 선별 전략은 단일 말단 고-처리량 서열 분석 방법과 화합성이고, 커팅된 절반 부위로부터 절단된 표적 부위의 컴퓨터를 이용한 재구축을 요구하지 않는데, 이는 이들이 일부 실시양태에서, 커팅된 라이브러리 구성원 핵산 내의 무손상 표적 뉴클레아제 서열의 직접적인 서열 분석을 특징으로 하기 때문이다.
부가적으로, 본원에 개시된 "1-커트" 스크리닝 방법은 2-커트 전략에 사용되었던 기존에 보고된 구조물보다 약 10배 더 짧은 (기존의 보고서에서 약 500 bp 반복 서열 길이와 비교해서 약 50 bp 반복 서열 길이), 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 영역의 콘카테머를 활용한다. 라이브러리의 콘카테머에 있어서 이러한 반복 서열 길이 상의 차이로 인해, 후보 뉴클레아제 표적 부위의 고도로 복잡한 라이브러리, 예를 들어 1012개의 상이한 후보 뉴클레아제 표적 서열을 포함하는 라이브러리가 생성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 공지된 표적 부위의 서열을 다양하게 함으로써 공지된 Cas9 뉴클레아제 표적 부위 상에 주형화시킨, 상기와 같은 복잡성의 예시적 라이브러리를 생성시켜 왔다. 이러한 예시적 라이브러리는 본원에 제공된 전략을 이용하여, 공지된 표적 부위의 8개 이하 돌연변이를 수반한 모든 서열의 10배 초과 적용 범위를 달성할 수 있다는 것을 명확하게 보여주었다. 더 짧은 반복 서열을 사용하면, 단일 말단 서열 분석을 또한 이용할 수 있는데, 이는 동일한 라이브러리 구성원의 커팅된 절반-부위와 커팅되지 않은 인접한 부위 둘 다가 100개 뉴클레오티드 서열 분석 판독 내에 함유되기 때문이다.
본원에 제공된 전략, 방법, 라이브러리, 및 시약을 활용하여, 임의의 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 유기 화합물 뉴클레아제, 및 에네다인 항생제 (예를 들어, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신)의 서열 선호도와 특이성을 분석할 수 있다. 본원에 기재된 것 이외의 적합한 뉴클레아제는 본 개시내용에 근거하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
추가로, 본원에 제공된 방법, 시약 및 전략을 이용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자는 증강된 특이성을 지닌 뉴클레아제를 확인, 설계 및/또는 선별할 수 있고, 소정의 모든 뉴클레아제 (예를 들어, 점착성 말단을 갖는 절단 생성물을 생성시키는 부위-특이적 뉴클레아제, 예컨대 ZFN 및 TALEN 뿐만 아니라 평활 말단을 갖는 절단 생성물을 생성시키는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9)의 표적을 벗어난 효과를 최소화할 수 있다. DNA 및 DNA-절단성 뉴클레아제와의 특별한 관련성에도 불구하고, 본원에 제공된 본 발명의 개념, 방법, 전략 및 시약은 상기 측면으로 제한되지 않지만, 어떠한 핵산:뉴클레아제 쌍에도 적용될 수 있다.
부위-특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 뉴클레아제 표적 부위를 확인함
본 개시내용의 일부 측면은 임의의 부위-특이적 뉴클레아제에 의해 절단된 핵산 표적 부위를 결정하기 위한 개선된 방법 및 시약을 제공한다. 본원에 제공된 방법은 평활 말단을 창출시키는 뉴클레아제와 점착성 말단을 창출시키는 뉴클레아제 둘 다의 표적 부위 선호도와 특이성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 소정의 뉴클레아제를, 이러한 뉴클레아제가 표적 부위와 결합하고 이를 커팅하는데 적합한 조건 하에 표적 부위의 라이브러리와 접촉시키는 단계, 및 상기 뉴클레아제가 실제적으로 커팅하는 그 표적 부위를 결정하는 단계를 포함한다. 실제적 커팅에 근거하여 뉴클레아제의 표적 부위 프로파일을 결정하는 것은 부위-특이적 뉴클레아제의 표적을 벗어난 바람직하지 못한 효과를 매개하는 데 보다 관련이 있는 파라미터를 측정한다는 점에서, 결합성에 의존하는 방법에 비해 이점을 지니고 있다. 일반적으로, 본원에 제공된 방법은 공지된 서열의 적응인자를, 5'-포스페이트-의존성 결찰을 통하여 관심 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 분자에 결찰시키는 단계를 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 뉴클레아제의 표적 부위를 절단하는 경우에 커팅된 핵산 가닥의 5'-말단에 포스페이트 모이어티를 잔존시키는 뉴클레아제에 의해 커팅된 표적 부위를 확인하는 데 특히 유용하다. 적응인자를, 커팅된 핵산 가닥의 5'-말단에 결찰시킨 후, 이러한 커팅된 가닥은 서열 분석용 링커로서 상기 적응인자를 이용하여 직접적으로 서열 분석할 수 있거나, 또는 상기 커팅된 표적 부위와 동일한 무손상 표적 부위를 포함하는, 커팅된 라이브러리 구성원 콘카테머의 일부를 PCR을 통하여 증폭시킨 다음, 이러한 증폭 생성물을 서열 분석할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 이중 가닥 핵산 표적 부위를 커팅하는 뉴클레아제를 제공하는 단계 (여기서, 이러한 표적 부위의 커팅으로 인해, 5' 포스페이트 모이어티를 포함하는 커팅된 핵산 가닥이 생성된다); (b) (a)의 뉴클레아제를, 이러한 뉴클레아제가 뉴클레아제의 표적 부위를 포함하는 후보 핵산 분자를 커팅하기에 적합한 조건 하에, 후보 핵산 분자의 라이브러리와 접촉시키는 단계 (여기서, 각 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머를 포함한다); 및 (c) 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥 상의 커팅되지 않은 뉴클레아제 표적 부위의 서열을 결정함으로써, (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 뉴클레아제를 제공하는 단계; 및 이러한 뉴클레아제를, 후보 표적 부위를 포함하는 후보 핵산 분자의 라이브러리와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 후보 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 후보 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리 내의 각 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 라이브러리는 구조 R1-[(후보 뉴클레아제 표적 부위)-(불변 삽입 서열)]n-R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로, [(후보 뉴클레아제 표적 부위)-(불변 삽입 서열)] 구조의 단편을 포함할 수 있는 핵산 서열이고, n은 2 내지 y의 정수이다)를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, y는 101 이상, 102 이상, 103 이상, 104 이상, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 또는 1015 이상이다. 일부 실시양태에서, y는 102 미만, 103 미만, 104 미만, 105 미만, 106 미만, 107 미만, 108 미만, 109 미만, 1010 미만, 1011 미만, 1012 미만, 1013 미만, 1014 미만, 또는 1015 미만이다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 라이브러리의 후보 핵산 분자는 구조 [(NZ)-(PAM)]의 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함하므로, 이러한 라이브러리의 핵산 분자는 구조 R1-[(NZ)-(PAM)-(불변 영역)]X-R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로, [(NZ)-(PAM)-(불변 영역)] 반복 단위의 단편을 포함할 수 있는 핵산 서열이고; 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드를 나타내며; Z는 1 내지 50의 정수이고; X는 2 내지 y의 정수이다)를 포함한다. 일부 실시양태에서, y는 101 이상, 102 이상, 103 이상, 104 이상, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 또는 1015 이상이다. 일부 실시양태에서, y는 102 미만, 103 미만, 104 미만, 105 미만, 106 미만, 107 미만, 108 미만, 109 미만, 1010 미만, 1011 미만, 1012 미만, 1013 미만, 1014 미만, 또는 1015 미만이다. 일부 실시양태에서, Z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, Z는 20이다. 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드를 나타낸다. 따라서, NZ (여기서, Z=2)로서 제공된 서열은 NN (여기서, 각각의 N은 독립적으로, A, T, G, 또는 C를 나타낸다)일 것이다. 따라서, NZ (여기서, Z=2)는 AA, AT, AG, AC, TA, TT, TG, TC, GA, GT, GG, GC, CA, CT, CG, 및 CC를 나타낼 수 있다.
다른 실시양태에서, 라이브러리의 후보 핵산 분자는 구조 [좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위] ("LSR")의 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함하므로, 라이브러리의 핵산 분자는 구조 R1-[(LSR)-(불변 영역)]X-R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로, [(LSR)-(불변 영역)] 반복 단위의 단편을 포함할 수 있는 핵산 서열이고, X는 2 내지 y의 정수이다)를 포함한다. 일부 실시양태에서, y는 101 이상, 102 이상, 103 이상, 104 이상, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 또는 1015 이상이다. 일부 실시양태에서, y는 102 미만, 103 미만, 104 미만, 105 미만, 106 미만, 107 미만, 108 미만, 109 미만, 1010 미만, 1011 미만, 1012 미만, 1013 미만, 1014 미만, 또는 1015 미만이다. 상기 불변 영역은 일부 실시양태에서, 단일 반복 단위의 효율적인 자기-결찰을 허용해 주는 길이이다. 적합한 길이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역은 5 내지 100개 염기 쌍 길이, 예를 들어 약 5개 염기 쌍, 약 10개 염기 쌍, 약 15개 염기 쌍, 약 20개 염기 쌍, 약 25개 염기 쌍, 약 30개 염기 쌍, 약 35개 염기 쌍, 약 40개 염기 쌍, 약 50개 염기 쌍, 약 60개 염기 쌍, 약 70개 염기 쌍, 약 80개 염기 쌍, 약 90개 염기 쌍, 또는 약 100개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 16개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 이중 가닥 핵산 표적 부위를 커팅하고 평활 말단을 창출시킨다. 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 5'-오버행을 창출시킨다. 상기 일부 실시양태에서, 표적 부위는 [좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위] (LSR) 구조를 포함하고, 뉴클레아제는 스페이서 서열 내의 표적 부위를 커팅한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 이중 가닥 표적 부위를 커팅하고 평활 말단을 창출시킨다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 이중 가닥 표적 부위를 커팅하고 오버행, 또는 점착성 말단, 예를 들어 5'-오버행을 창출시킨다. 상기 일부 실시양태에서, 상기 방법은 뉴클레아제에 의해 1회 커팅되었던 핵산 분자로부터 생성된 핵산 분자의 5'-오버행을 충전시키는 것을 포함하는데, 이러한 핵산 분자는 한쪽에 좌측 또는 우측 절반-부위와 커팅된 스페이서 서열이 양옆에 위치한 불변 삽입 서열을 포함하고, 다른 쪽에 커팅되지 않은 표적 부위 서열을 포함함으로써, 평활 말단을 창출시킨다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 5'-포스페이트-의존성 결찰을 통하여, 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥의 5' 말단에 제1 핵산 적응인자를 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 평활 말단을 창출시킨다. 이러한 실시양태에서, 적응인자는 커팅된 라이브러리 구성원을, 5' 인산화가 결여된 이중 가닥의 평활 말단 적응인자와 접촉시킴으로써, 표적 부위의 뉴클레아제 커팅로부터 비롯된 평활 말단에 직접적으로 결찰시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 뉴클레아제는 오버행 (점착성 말단)을 창출시킨다. 상기 일부 실시양태에서, 적응인자는 커팅된 라이브러리 구성원을, 화합성 점착성 말단을 갖는 과량의 적응인자와 접촉시킴으로써 커팅된 부위에 결찰시킬 수 있다. 가변 절반 부위들 사이의 불변 스페이서 서열 내에서 커팅되는 뉴클레아제를 사용하는 경우에는, 이러한 스페이서 서열로부터 창출된 5' 오버행과 부합되는 점착성 말단을 설계할 수 있다. 뉴클레아제가 가변 서열 내에서 커팅하는 실시양태에서는, 가변 오버행 서열과 불변 어닐링된 서열을 갖는 적응인자 집단 (서열 분석용 링커 또는 PCR 프라이머로서 사용하기 위함)을 사용할 수 있거나, 또는 5' 오버행을 충전시켜, 적응인자 결찰 전에 평활 말단을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 상기 적응인자와 혼성화되는 PCR 프라이머와 상기 불변 삽입 서열과 혼성화되는 PCR 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여, 커팅되지 않은 표적 부위를 포함하는 뉴클레아제에 의해 커팅된 콘카테머의 단편을 증폭시키는 것을 추가로 포함한다. 전형적으로, PCR을 통하여 콘카테머를 증폭시키면, 커팅된 표적 부위와 동일한 하나 이상의 무손상 후보 표적 부위를 포함하는 앰플리콘이 산출될 것인데, 이는 각 콘카테머 내의 표적 부위가 동일하기 때문이다. 단일-방향 서열 분석하는 경우에는, 하나의 무손상 표적 부위, 2개 이하의 무손상 표적 부위, 3개 이하의 무손상 표적 부위, 4개 이하의 무손상 표적 부위, 또는 5개 이하의 무손상 표적 부위를 포함하는 앰플리콘을 강화하는 것이 바람직할 수 있다. 커팅된 핵산 분자의 증폭을 위해 PCR을 사용하는 실시양태에서는, 예를 들어 PCR 주기에서 짧은 연장 시간을 이용함으로써, 짧은 서열의 증폭을 선호하고 보다 긴 서열의 증폭을 선호하지 않도록 PCR 파라미터를 최적화할 수 있다. 짧은 앰플리콘의 강화를 위한 또 다른 가능성은, 예를 들어 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피를 통한 크기 분별이다. 크기 분별은 증폭 전 및/또는 후에 수행될 수 있다. 짧은 앰플리콘의 강화에 적합한 다른 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 개시내용은 이 점에 있어서 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)의 결정하는 것은 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥, 또는 예를 들어, PCR에 의한 증폭을 통하여 수득된 그의 카피를 서열 분석하는 것을 포함한다. 서열 분석 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본 개시내용은 이 점에 있어서 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 시스템을 이용하여 프로파일링되는 뉴클레아제는 RNA 분자와 복합체를 형성하는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제이고, 이러한 뉴클레아제:RNA 복합체는 상기 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열과 특이적으로 결합된다. 일부 실시양태에서, RNA 분자는 단일-유도 RNA (sgRNA)이다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 5 내지 50개 뉴클레오티드, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 25개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드, 19 내지 21개 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 뉴클레아제 표적 부위의 서열에 대해 상보적인 5 내지 50개 뉴클레오티드, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 25개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드, 19 내지 21개 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, sgRNA는 뉴클레아제 표적 부위에 대해 상보적인 20개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 표적 부위는 [sgRNA-상보성 서열]-[프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)] 구조를 포함하고, 뉴클레아제는 상기 sgRNA-상보성 서열 내의 표적 부위를 커팅한다. 일부 실시양태에서, sgRNA-상보성 서열은 5 내지 50개 뉴클레오티드, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 25개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드, 19 내지 21개 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제이다. RNA-프로그램 가능한 Cas9 엔도뉴클레아제는 2개 염기 쌍 PAM 모티프와 인접하고 유도 RNA 서열 (sgRNA)에 대해 상보적인 부위에서 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 절단한다. 전형적으로, 표적 부위 서열에 대해 상보적인 sgRNA 서열은 약 20개 뉴클레오티드 길이이지만, 보다 짧고 보다 긴 상보성 sgRNA 서열을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, sgRNA는 5 내지 50개 뉴클레오티드, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 15 내지 25개 뉴클레오티드, 18 내지 22개 뉴클레오티드, 19 내지 21개 뉴클레오티드, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. Cas9 시스템을 사용하여, 다수 세포 유형에서의 게놈을 변형시켰는데, 이는 용이한 게놈-공학 도구로서의 그의 잠재력을 입증해 준다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 비특이적 핵산 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 FokI 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 절단 도메인 이량체화시 표적 서열을 절단하는 핵산 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 결합성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 아연 핑거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 아연 핑거를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 결합성 도메인은 전사 활성인자-유사 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제 (TALEN)이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 유기 화합물이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 에네다인 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 항생제이다. 일부 실시양태에서, 상기 화합물은 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 또는 그의 유도체이다.
상기 뉴클레아제를 라이브러리 핵산과 함께 인큐베이션하면, 이러한 뉴클레아제에 의해 결합되고 절단될 수 있는 표적 부위를 포함하는 라이브러리 내의 콘카테머의 절단이 초래될 것이다. 소정의 뉴클레아제가 특이적 표적 부위를 고 효율로 절단하는 경우, 표적 부위를 포함하는 콘카테머가, 예를 들어 1회 또는 수회 커팅되어, 하나 이상의 반복 단위에 인접한 커팅된 표적 부위를 포함하는 단편이 생성될 것이다. 라이브러리 구성원의 구조에 따라서, 단일 뉴클레아제 절단에 의해 라이브러리 구성원 콘카테머로부터 방출되는 것으로 예시되는 커팅된 핵산 분자는 예를 들어, 구조 (커팅된 표적 부위)-(불변 영역)-[(표적 부위)-(불변 영역)]X-R2일 수 있다. 예를 들어, RNA-유도된 뉴클레아제의 맥락에서, 단일 뉴클레아제 절단에 의해 라이브러리 구성원 콘카테머로부터 방출되는 것으로 예시되는 커팅된 핵산 분자는 예를 들어, 구조 (PAM)-(불변 영역)-[(NZ)-(PAM)-(불변 영역)]X-R2일 수 있다. 그리고, 스페이서 영역 내의 LSR 구조를 커팅하는 뉴클레아제의 맥락에서, 단일 뉴클레아제 절단에 의해 라이브러리 구성원 콘카테머로부터 방출되는 것으로 예시되는 커팅된 핵산 분자는 예를 들어, 구조 (커팅된 스페이서 영역)-(우측 절반 부위)-(불변 영역)-[(LSR)-(불변 영역)]X-R2일 수 있다. 이어서, 라이브러리 후보 분자로부터 방출된 상기 커팅된 단편을 단리할 수 있고/있거나 뉴클레아제에 의해 절단된 표적 부위의 서열은 무손상 표적 부위 (예를 들어, 방출된 반복 단위의 무손상 (NZ)-(PAM) 부위)를 서열 분석함으로써 확인될 수 있다 (예를 들어, 예시를 위한 도 1b 참조).
핵산 분자의 라이브러리를 노출시키는 데 적합한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 적합한 조건은 라이브러리 핵산 또는 뉴클레아제의 변성을 초래하지 않아야 하고, 그의 뉴클레아제 활성의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상을 나타내는 뉴클레아제를 허용한다.
부가적으로, 소정의 뉴클레아제가 특이적 표적 부위를 절단하는 경우, 일부 절단 생성물은 커팅된 절반 부위와 무손상되거나 커팅되지 않은 표적 부위를 포함할 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 생성물은 통상적인 방법에 의해 단리될 수 있고; 삽입 서열이 일부 측면에서, 100개 미만의 염기 쌍이기 때문에, 상기와 같이 단리된 절단 생성물은 단일 연속 판독으로 서열 분석할 수 있는데, 이로써 예를 들어, 커팅된 절반 부위로부터 서열을 재구축하지 않고서도 표적 부위 서열을 확인할 수 있게 된다.
반복 단위의 단리 및 서열 분석에 적합한 모든 방법을 이용하여, 뉴클레아제에 의해 절단된 LSR 서열을 밝혀낼 수 있다. 예를 들어, 불변 영역의 길이는 공지되어 있기 때문에, 개개의 방출된 반복 단위는 커팅되지 않은 보다 큰 라이브러리 핵산 분자로부터 뿐만 아니라 다수의 반복 단위를 포함하는 라이브러리 핵산 분자의 단편으로부터 그들의 크기에 근거하여 분리될 수 있다 (이는 뉴클레아제에 의한 비효율적인 표적화된 절단을 표시한다). 그들의 크기에 근거하여 핵산 분자를 분리 및/또는 단리하는 데 적합한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 크기 분별 방법, 예컨대 겔 전기영동, 밀도 구배 원심분리, 및 적합한 분자 컷오프(cutoff) 값을 이용한 반투과성 막 전반에 걸친 투석을 포함한다. 이어서, 이와 같이 분리/단리된 핵산 분자는, 예를 들어 커팅된 말단에 PCR 및/또는 서열 분석용 적응인자를 결찰시키고 각각의 핵산을 증폭시키고/시키거나 서열 분석함으로써, 추가로 명확히 규명할 수 있다. 추가로, 불변 영역의 길이가 개개의 방출된 반복 단위의 자기 결찰을 선호하도록 선택되는 경우에는, 뉴클레아제 처리된 라이브러리 분자를 리가제와 접촉시킨 다음, 자기 결찰된 개개의 반복 단위의 환상 성질에 근거하여 후속 증폭 및/또는 서열 분석함으로써, 상기 개개의 방출된 반복 단위를 강화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산을 커팅시킨 결과로서 5'-오버행을 생성시키는 뉴클레아제를 사용하는 경우에는, 이와 같이 커팅된 핵산 분자의 5'-오버행을 충전시킨다. 5'-오버행을 충전시키는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소 I 클레노우(Klenow) 단편을 이용하는 방법 (클레노우 (3'->5' 엑소-))을 포함한다. 5'-오버행을 충전시키면, 오목한 가닥의 오버행-주형화된 연장이 초래되어, 결국에는 평활 말단이 생성된다. 라이브러리 콘카테머로부터 방출된 단일 반복 단위의 경우에는, 이로써 생성되는 구조가 평활 말단된 S2'R-(불변 영역)-LS1' (여기서, S1' 및 S2'는 평활 말단을 포함한다)이다. 이어서, PCR 및/또는 서열 분석용 적응인자를 평활 말단 결찰에 의해 상기 말단에 부가할 수 있고, 각각의 반복 단위 (S2'R 및 LS1' 영역 포함)를 서열 분석할 수 있다. 이러한 서열 데이터로부터, 본래의 LSR 영역을 추론할 수 있다. 뉴클레아제 절단 공정 동안 창출된 오버행을 평활하게 하면, 또한 예를 들어 비-뉴클레아제 효과, 예컨대 물리적 전단을 근거로 하여, 비특이적으로 커팅되었던 표적 부위와 각각의 뉴클레아제에 의해 적절하게 커팅되었던 표적 부위 간을 구별할 수 있게 된다. 각각의 뉴클레아제에 의해 절단되지 않았던 표적 부위는 오버행 뉴클레오티드 복제물을 포함하는 것으로 예상되지 않는 것과는 달리, 정확하게 절단된 뉴클레아제 표적 부위는 오버행 충전의 결과로서 오버행 뉴클레오티드의 복제물을 포함하는 상보성 S2'R 및 LS1' 영역의 존재에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 방출된 개개의 반복 단위의 좌측-절반 부위, 우측-절반 부위 및/또는 스페이서 서열의 서열을 결정함으로써 뉴클레아제에 의해 커팅된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계를 포함한다. 증폭 및/또는 서열 분석에 적합한 모든 방법을 이용하여, 각각의 뉴클레아제에 의해 절단된 표적 부위의 LSR 서열을 확인할 수 있다. 핵산을 증폭시키고/시키거나 서열 분석하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본 개시내용은 이 점에 있어서 제한되지 않는다. 커팅된 절반 부위와 커팅되지 않은 표적 부위를 포함하는 (예를 들어, 약 1.5개 이상의 반복 서열을 포함하는) 라이브러리 콘카테머로부터 방출된 핵산의 경우에는, 5'-오버행을 충전시키는 것이 또한, 이러한 핵산이 뉴클레아제에 의해 절단되었다는 확신을 제공한다. 핵산은 또한, 무손상되거나 커팅되지 않은 표적 부위를 포함하기 때문에, 좌측-절반 부위, 우측-절반 부위, 및/또는 스페이서 서열로부터 서열을 재구축하지 않고서도 상기 부위의 서열을 결정할 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 전략의 일부는 소정의 모든 뉴클레아제에 대한 가능한 절단 표적으로서 복수 개의 후보 표적 부위를 동시에 평가해줄 수 있다. 따라서, 이러한 방법으로부터 수득된 데이터를 이용하여, 소정의 뉴클레아제에 의해 절단된 표적 부위 목록을 편집할 수 있는데, 이는 또한 본원에서 표적 부위 프로파일로서 지칭된다. 정량적 서열 분석용 데이터를 생성시킬 수 있는 서열 분석 방법이 사용된 경우에는, 각각의 뉴클레아제에 의해 절단될 것으로 탐지된 모든 뉴클레아제 표적 부위의 상대적 존재도를 기록하는 것이 또한 가능하다. 뉴클레아제에 의해 보다 효율적으로 절단되는 표적 부위는 서열 분석 단계에서 보다 자주 탐지될 것이지만, 효율적으로 절단되지 않는 표적 부위는 후보 콘카테머로부터 개개의 반복 단위를 매우 드물게 방출할 것이므로, 있다 하더라도 매우 적은 서열 분석용 판독치를 생성할 것이다. 이러한 정량적 서열 분석용 데이터를 표적 부위 프로파일 내로 통합시켜, 고도로 바람직한 뉴클레아제 표적 부위와 덜 바람직한 뉴클레아제 표적 부위의 순위 목록을 생성시킬 수 있다.
본원에 제공된 뉴클레아제 표적 부위 프로파일링의 방법 및 전략을, 예를 들어 ZFN, TALEN, 귀소 엔도뉴클레아제, 및 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제를 포함한 모든 부위-특이적 뉴클레아제에 적용할 수 있다. 본원에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 뉴클레아제 특이성은 전형적으로, 뉴클레아제 농도가 증가함에 따라 저하되고, 본원에 기재된 방법을 이용하여, 소정의 뉴클레아제가 그의 의도된 표적 부위를 효율적으로 커팅하지만, 표적을 벗어난 어떠한 서열도 효율적으로 커팅하지 않는 농도를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료용 뉴클레아제가 그의 의도된 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하지만 10개 초과, 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과, 2개 초과, 1개 초과, 또는 어떠한 부가 부위도 커팅하지 않는, 상기 치료용 뉴클레아제의 최대 농도를 결정한다. 일부 실시양태에서, 치료용 뉴클레아제는 상기 언급된 바와 같이 결정된 최대 농도와 등가이거나 이보다 더 낮은 최종 농도를 생성시키기에 유효한 양으로 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 사용된 후보 핵산 분자의 라이브러리는 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상 또는 1012개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 특정 질환과 연관된 유전자 내의 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하는 치료용 뉴클레아제이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 치료용 뉴클레아제가 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하고, 10개 초과, 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과, 2개 초과, 1개 초과, 또는 어떠한 부가의 부위도 커팅하지 않는 치료용 뉴클레아제의 최대 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료용 뉴클레아제를, 최대 농도와 등가이거나 이보다 더 낮은 최종 농도를 생성시키기에 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
뉴클레아제 표적 부위 라이브러리
본 개시내용의 일부 실시양태는 뉴클레아제 표적 부위 프로파일링을 위한 핵산 분자의 라이브러리를 제공한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리의 후보 핵산 분자는 구조 R1-[(NZ)-(PAM)-(불변 영역)]X-R2 (여기서, R1 및 R2는 독립적으로, [(NZ)-(PAM)-(불변 영역)] 반복 단위의 단편을 포함할 수 있는 핵산 서열이고; 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드를 나타내며; Z는 1 내지 50의 정수이고; X는 2 내지 y의 정수이다)를 포함한다. 일부 실시양태에서, y는 101 이상, 102 이상, 103 이상, 104 이상, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 또는 1015 이상이다. 일부 실시양태에서, y는 102 미만, 103 미만, 104 미만, 105 미만, 106 미만, 107 미만, 108 미만, 109 미만, 1010 미만, 1011 미만, 1012 미만, 1013 미만, 1014 미만, 또는 1015 미만이다. 일부 실시양태에서, Z는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상, 45 이상 또는 50 이상이다. 일부 실시양태에서, Z는 20이다. 각각의 N은 독립적으로, 모든 뉴클레오티드를 나타낸다. 따라서, NZ (여기서, Z=2)로서 제공된 서열은 NN (여기서, 각각의 N은 독립적으로, A, T, G, 또는 C를 나타낸다)일 것이다. 따라서, NZ (여기서, Z=2)는 AA, AT, AG, AC, TA, TT, TG, TC, GA, GT, GG, GC, CA, CT, CG, 및 CC를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 좌측-절반 부위, 부분적으로 무작위적인 우측-절반 부위, 및/또는 부분적으로 무작위적인 스페이서 서열을 수반한 표적 부위를 포함하는 후보 핵산 분자를 포함하는 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 좌측 절반 부위, 완전히 무작위적인 스페이서 서열, 및 부분적으로 무작위적인 우측 절반 부위를 수반한 표적 부위를 포함하는 후보 핵산 분자를 포함하는 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 또는 완전히 무작위적인 서열을 수반한 표적 부위를 포함하는 (여기서, 이러한 표적 부위는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 구조 [NZ-(PAM)]를 포함한다) 후보 핵산 분자를 포함하는 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 부위는 컨센서스 부위와, 이항 분포로 평균 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 또는 30% 초과 상이하다.
일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 복수 개의 핵산 분자를 포함하는데, 각각은 후보 뉴클레아제 표적 부위와 불변 삽입 서열 (본원에서 불변 영역으로서 지칭되기도 함)의 콘카테머를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 라이브러리의 후보 핵산 분자는 구조 R1-[(sgRNA-상보성 서열)-(PAM)-(불변 영역)]X-R2, 또는 구조 R1-[(LSR)-(불변 영역)]X-R2 (여기서, 대괄호 안의 구조 ("[…]")는 반복 단위 또는 반복 서열로서 지칭되고; R1 및 R2는 독립적으로, 상기 반복 단위의 단편을 포함할 수 있는 핵산 서열이며, X는 2 내지 y의 정수이다)를 포함한다. 일부 실시양태에서, y는 101 이상, 102 이상, 103 이상, 104 이상, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상, 1010 이상, 1011 이상, 1012 이상, 1013 이상, 1014 이상 또는 1015 이상이다. 일부 실시양태에서, y는 102 미만, 103 미만, 104 미만, 105 미만, 106 미만, 107 미만, 108 미만, 109 미만, 1010 미만, 1011 미만, 1012 미만, 1013 미만, 1014 미만, 또는 1015 미만이다. 상기 불변 영역은 일부 실시양태에서, 단일 반복 단위의 효율적인 자기-결찰을 허용해 주는 길이이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 2개 이상의 반복 단위를 포함하는 단편으로부터 단일 반복 단위의 효율적인 분리를 허용해 주는 길이이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 하나의 서열 분석 판독에서 완전한 반복 단위의 효율적인 서열 분석을 허용해 주는 길이이다. 적합한 길이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역은 5 내지 100개 염기 쌍 길이, 예를 들어 약 5개 염기 쌍, 약 10개 염기 쌍, 약 15개 염기 쌍, 약 20개 염기 쌍, 약 25개 염기 쌍, 약 30개 염기 쌍, 약 35개 염기 쌍, 약 40개 염기 쌍, 약 50개 염기 쌍, 약 60개 염기 쌍, 약 70개 염기 쌍, 약 80개 염기 쌍, 약 90개 염기 쌍, 또는 약 100개 염기 쌍 길이이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 염기 쌍 길이이다.
LSR 부위는 전형적으로, [좌측-절반 부위]-[스페이서 서열]-[우측-절반 부위] 구조를 포함한다. 이러한 절반 부위와 스페이서 서열의 길이는 평가하고자 하는 특이적 뉴클레아제에 좌우될 것이다. 일반적으로, 상기 절반 부위는 6 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 및 바람직하게 10 내지 18개 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 각각의 절반 부위는 개별적으로, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, LSR 부위는 30개보다 더 긴 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, LSR의 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 동일한 길이이다. 일부 실시양태에서, LSR의 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 상이한 길이이다. 일부 실시양태에서, LSR의 좌측 절반 부위와 우측 절반 부위는 상이한 서열이다. 일부 실시양태에서, FokI 절단 도메인, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 유기 화합물 (예를 들어, 에네다인 항생제, 예컨대 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 및 에스페라미신; 및 블레오미신)에 의해 절단될 수 있는 LSR을 포함하는 후보 핵산을 포함하는 라이브러리가 제공된다.
일부 실시양태에서, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상, 1012개 이상, 1013개 이상, 1014개 이상, 또는 1015개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는, 후보 핵산 분자의 라이브러리가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 라이브러리의 후보 핵산 분자는 롤링 서클 증폭에 의해 장기화된(secularized) 주형으로부터 생성된 콘카테머이다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리는 5 kDa 이상, 6 kDa 이상, 7 kDa 이상, 8 kDa 이상, 9 kDa 이상, 10 kDa 이상, 12 kDa 이상, 또는 15 kDa 이상의 분자량의 핵산 분자, 예를 들어 콘카테머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 라이브러리 내의 핵산 분자의 분자량은 15 kDa 보다 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 특이적 크기 범위, 예를 들어 5 내지 7 kDa, 5 내지 10 kDa, 8 내지 12 kDa, 10 내지 15 kDa, 또는 12 내지 15 kDa, 또는 5 내지 10 kDa의 범위 또는 가능한 모든 아범위 내의 핵산 분자를 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면에 따르는 핵산 콘카테머를 생성시키는 데 적합한 일부 방법으로 인해, 상당히 상이한 분자량의 핵산 분자가 생성되긴 하지만, 이러한 핵산 분자의 혼합물을 크기 분별시켜 목적하는 크기 분포를 수득할 수 있다. 목적하는 크기의 핵산 분자를 강화시키거나 또는 목적하는 크기의 핵산 분자를 배제시키는 데 적합한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본 개시내용은 이 점에 있어서 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 부분적으로 무작위적인 부위는 컨센서스 부위와, 이항 분포로 평균 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 상이하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 부분적으로 무작위적인 부위는 5% 초과 내지 10% 이하; 10% 초과 내지 20% 이하; 20% 초과 내지 25% 이하; 5% 초과 내지 20% 이하 등이 컨센서스 부위와 상이하다. 이러한 라이브러리 내의 부분적으로 무작위적인 뉴클레아제 표적 부위를 사용하는 것이, 예를 들어 단지 1개, 단지 2개, 단지 3개, 단지 4개 또는 단지 5개의 잔기에 있어서 컨센서스 부위와 상이한, 컨센서스 부위와 밀접하게 관련되는 표적 부위를 포함하는 라이브러리 구성원의 농도를 증가시키는 데 유용하다. 이 배후의 이론적 근거는 소정의 뉴클레아제, 예를 들어 소정의 ZFN 또는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제가 그의 의도된 표적 부위 및 밀접하게 관련된 모든 표적 부위를 커팅하는 것으로 예상되지만, 의도된 표적 부위와 상당히 상이하거나 또는 이와 완전히 무관한 표적 부위는 커팅하지 않는 것으로 예상된다는 것이다. 따라서, 부분적으로 무작위적인 표적 부위를 포함하는 라이브러리를 사용하는 것이, 소정의 모든 뉴클레아제에 대한 표적을 벗어난 모든 절단 현상을 탐지하는 데 있어서의 민감도를 손상시키지 않고서도, 완전히 무작위적인 표적 부위를 포함하는 라이브러리를 사용하는 것 보다 더 효율적일 수 있다. 따라서, 부분적으로 무작위적인 라이브러리를 사용하는 것이, 소정의 뉴클레아제의 사실상 모든 표적을 벗어난 부위를 포괄할 가능성이 높은 라이브러리를 생성시키는 데 요구되는 비용과 노력을 상당히 감소시켜 준다. 그러나, 일부 실시양태에서, 예를 들어 소정의 뉴클레아제의 특이성을 소정의 게놈 내의 가능한 모든 부위의 맥락에서 평가해야만 하는 실시양태에서는, 표적 부위의 완전히 무작위적인 라이브러리를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
부위-특이적 뉴클레아제의 선별 및 설계
본 개시내용의 일부 측면은 복잡한 게놈의 맥락에서 단일의 독특한 부위의 표적화된 절단을 허용해 주는 부위-특이적 뉴클레아제를 선별하고 설계하기 위한 방법 및 전략을 제공한다. 일부 실시양태에서, 동일한 컨센서스 서열을 커팅하는 것으로 설계되거나 공지되는 복수 개의 후보 뉴클레아제를 제공하는 단계; 각 후보 뉴클레아제에 의해 실제적으로 절단된 표적 부위를 프로파일링하므로, 표적을 벗어난 절단된 모든 부위 (컨센서스 표적 부위와 상이한 표적 부위)를 탐지하는 단계; 및 이와 같이 확인된 표적을 벗어난 부위(들)에 근거하여 후보 뉴클레아제를 선별하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법을 이용하여, 후보 뉴클레아제 군으로부터 가장 특이적 뉴클레아제, 예를 들어 가장 높은 특이성으로 컨센서스 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제, 가장 낮은 수의 표적을 벗어난 부위를 절단하는 뉴클레아제, 표적 게놈의 맥락에서 가장 낮은 수의 표적을 벗어난 부위를 절단하는 뉴클레아제, 또는 컨센서스 표적 부위 이외의 어떠한 표적 부위도 절단하지 않는 뉴클레아제를 선별한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법을 이용하여, 뉴클레아제의 치료상 유효 농도와 등가이거나 이 보다 더 높은 농도에서 대상체의 게놈의 맥락에서 표적을 벗어난 어떠한 부위도 절단하지 않는 뉴클레아제를 선별한다.
본원에 제공된 방법 및 시약을 사용하여, 예를 들어 동일한 의도된 표적 부위를 표적으로 하는 복수 개의 상이한 뉴클레아제, 예를 들어 소정의 부위-특이적 뉴클레아제, 예를 들어 소정의 아연 핑거 뉴클레아제의 복수 개의 변이를 평가할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 개선된 특이성을 지닌 신규 부위-특이적 뉴클레아제를 점진적으로 발전시키거나 이를 설계하는 데 있어서의 선별 단계로서 사용될 수 있다.
게놈 내의 독특한 뉴클레아제 표적 부위를 확인함
본 개시내용의 일부 실시양태는 특정 게놈 내의 뉴클레아제 표적 부위를 선별하는 방법을 제공한다. 본원의 다른 곳에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 놀랍게도, 소정의 뉴클레아제에 의해 절단된 표적을 벗어난 부위는 전형적으로, 컨센서스 표적 부위와 고도로 유사한데, 예를 들어 단지 1개, 단지 2개, 단지 3개, 단지 4개 또는 단지 5개의 뉴클레오티드 잔기에 있어서만 컨센서스 표적 부위와 상이한 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견을 근거로 하여, 게놈 내의 뉴클레아제 표적 부위는 이러한 게놈 내의 표적을 벗어난 어떠한 부위도 절단하지 않으면서 상기 부위를 표적화하는 뉴클레아제의 가능성을 증가시키도록 선별될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 후보 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계; 및 이러한 후보 뉴클레아제 표적 부위를 게놈 내의 다른 서열과 비교하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 후보 뉴클레아제 표적 부위를 게놈 내의 다른 서열과 비교하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 범용 컴퓨터 상에서의 서열 정렬 소프트웨어 또는 알고리즘, 예컨대 BLAST를 이용하는 서열 정렬 방법을 포함한다. 이어서, 이러한 서열 비교 결과를 근거로 하여, 적합하고 독특한 뉴클레아제 표적 부위를 선별할 수 있다. 일부 실시양태에서, 후보 뉴클레아제 표적 부위가 게놈 내의 다른 서열과 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 뉴클레오티드에 있어서 상이한 경우, 이러한 뉴클레아제 표적 부위는 게놈 내의 독특한 부위로서 선별되는 반면, 상기 부위가 이러한 기준을 충족시키지 못하는 경우에는, 상기 부위가 폐기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 요약된 바와 같이, 서열 비교를 근거로 하여 일단 특정 부위가 선별되면, 이와 같이 선별된 부위를 표적으로 하는 부위-특이적 뉴클레아제를 설계한다. 예를 들어, 선별된 표적 부위를 결합시키는 아연 핑거 어레이를 구축하고, 이러한 아연 핑거 어레이를 DNA 절단 도메인과 접합시킴으로써, 선별된 어떠한 뉴클레아제 표적 부위도 표적으로 하는 아연 핑거 뉴클레아제를 설계할 수 있다. DNA를 절단하기 위해 DNA 절단 도메인을 이량체화할 필요가 있는 실시양태에서는, 각각 뉴클레아제 표적 부위의 절반 부위를 결합시키고 각각 절단 도메인과 접합되는 아연 핑거 어레이가 설계될 것이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제 설계 및/또는 생성은 재조합 기술에 의해 수행된다. 적합한 재조합 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본 개시내용은 이 점에 있어서 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 측면에 따라서 설계되거나 생성된 부위-특이적 뉴클레아제를 단리하고/하거나 정제한다. 본 개시내용의 측면에 따라서 부위-특이적 뉴클레아제를 설계하기 위한 방법 및 전략을 적용하여, 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 유기 화합물 뉴클레아제, 또는 에네다인 항생제 (예를 들어, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 어떠한 부위-특이적 뉴클레아제도 설계하거나 생성시킬 수 있다.
단리된
뉴클레아제
본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 방법 및 전략을 이용하여 설계되는, 증강된 특이성을 지닌 단리된 부위-특이적 뉴클레아제를 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 이러한 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용의 일부 실시양태는 상기 코딩 핵산을 포함하는 발현 구조물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 뉴클레아제가 그의 의도된 표적 부위를 커팅하는 데 유효한 농도에서 1개 미만, 2개 미만, 3개 미만, 4개 미만, 5개 미만, 6개 미만, 7개 미만, 8개 미만, 9개 미만, 또는 10개 미만의 표적을 벗어난 부위를 커팅하는 것으로 본원에 제공된 방법에 따라서 평가되었고, 게놈 내의 목적하는 표적 부위를 절단하도록 조작시킨 단리된 뉴클레아제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 뉴클레오티드 잔기에 있어서 게놈 내의 다른 부위와 상이하도록 선별된, 목적하는 독특한 표적 부위를 절단하도록 조작시킨 단리된 뉴클레아제가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 단리된 뉴클레아제는 RNA-프로그램 가능한 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제; 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN); 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 유기 화합물 뉴클레아제, 또는 에네다인 항생제 (예를 들어, 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신)이다. 일부 실시양태에서, 상기 단리된 뉴클레아제는 특정 질환 또는 장애와 연관되는 대립 유전자 내의 표적 부위를 절단한다. 일부 실시양태에서, 단리된 뉴클레아제는, 그의 절단으로 인해 특정 질환 또는 장애가 치료되거나 예방되는 표적 부위를 절단한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환은 HIV/AIDS, 또는 증식성 질환이다. 일부 실시양태에서, 대립 유전자는 CCR5 (HIV/AIDS를 치료하는 경우) 또는 VEGFA 대립 유전자 (증식성 질환을 치료하는 경우)이다.
일부 실시양태에서, 상기 단리된 뉴클레아제는 제약 조성물의 일부로서 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태는 본원에 제공된 바와 같은 뉴클레아제, 또는 이러한 뉴클레아제를 코딩하는 핵산, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 임의로, 하나 이상의 부가 치료상 활성 물질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여되어, 이러한 대상체 내에서의 표적화된 게놈 변형을 수행한다. 일부 실시양태에서, 세포를 상기 대상체로부터 수득하고; 이를 생체 외에서 뉴클레아제 또는 뉴클레아제-코딩 핵산과 접촉시키고; 목적하는 게놈 변형을 수행하였거나 또는 세포에서 탐지한 후에 상기 대상체에게 재투여한다. 본원에 제공된 제약 조성물의 설명이 주로, 인간에게 투여하는 데 적합한 제약 조성물에 관한 것이긴 하지만, 이러한 조성물이 일반적으로, 모든 종류의 동물에게 투여하는 데 적합하다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 제약 조성물이 각종 동물에게 투여하는 데 적합하도록 만들기 위해, 인간에게 투여하는 데 적합한 제약 조성물을 변형시키는 것이 널리 이해되고 있고, 통상의 전문 기술을 가진 수의 약리학자는, 있다 하더라고 단지 통상적인 실험을 이용해서 상기 변형을 설계하고/하거나 수행할 수 있다. 제약 조성물이 투여되는 것으로 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 포유류 (상업적으로 관련된 포유류, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 래트 포함); 및/또는 조류 (상업적으로 관련된 조류, 예컨대 치킨, 오리, 거위 및/또는 칠면조 포함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 분야에서 공지되어 있거나 추후 개발될 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연합시키는 단계, 및 이어서, 필요하고/하거나 원하는 경우에는 상기 생성물을 목적하는 단일 용량 단위 또는 다수 용량 단위로 성형하고/하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
제약 제제는 부가적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 목적하는 특별한 투여 형태에 적합한 바 대로, 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액상 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함하는 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006); 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다]에는 제약 조성물을 제제화하는 데 사용된 각종 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술이 개시되어 있다. 뉴클레아제를 포함하는 제약 조성물을 생성시키는 데 적합한 부가의 방법, 시약, 부형제 및 용매에 관해서는 또한, PCT 출원 PCT/US2010/055131을 참조할 수 있다 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 예컨대 바람직하지 못한 모든 생물학적 효과를 유발시키거나 또는 달리 유해한 방식으로 제약 조성물의 다른 성분(들)과 상호 작용함으로써, 통상적인 모든 부형제 매질이 특정 물질 또는 그의 유도체와 비화합성인 경우를 제외하고는, 상기 통상적인 부형제 매질의 용도가 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 이들 실시양태 및 기타 실시양태의 기능과 이점은 다음 실시예로부터 보다 상세히 이해될 것이다. 다음 실시예는 본 발명의 이득을 예시하고 특별한 실시양태를 설명하고자 한 것이지만, 본 발명의 전체 범위를 예시하고자 한 것은 아니다. 따라서, 다음 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다.
실시예
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드. 본 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표 9에 열거되어 있다.
에스 . 피오게네스 Cas9의 발현 및 정제. 이. 콜라이 (E. coli) 로제타 (DE3) 세포를, N-말단 6xHis-태그/말토스 결합성 단백질과 융합된 에스. 피오게네스 cas9 유전자를 코딩하는 플라스미드 pMJ80611으로 형질전환시켰다. 이로써 생성된 발현 균주를, 37℃ 하에 밤새 100 ㎍/mL의 앰피실린 및 30 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 육즙에 접종하였다. 상기 세포를 동일한 성장 배지 내로 1:100으로 희석시키고 37℃ 하에 OD600 약 0.6이 되도록 성장시켰다. 이 배양물을 18℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하고, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.2 mM으로 가하여 Cas9 발현을 유도시켰다. 약 17 h 후, 상기 세포를 8,000 g로 원심분리시킴으로써 수집하고, 이를 용해 완충액 [20 mM 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 (트리스)-HCl, pH 8.0, 1 M KCl, 20% 글리세롤, 1 mM 트리스 (2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)]에 재현탁시켰다. 세포를 초음파처리함으로써 (6 W 출력 하에 총 10분 동안 10초 펄스-온 및 30초 펄스-오프) 용해시키고, 30분 동안 20,000 g으로 원심분리시킴으로써 가용성 용해물을 수득하였다. 이러한 세포 용해물을 4℃ 하에 20분 동안 니켈-니트릴로아세트산 (니켈-NTA) 수지 [퀴아젠(Qiagen)]와 함께 인큐베이션하여 His-태그부착된 Cas9를 포획하였다. 상기 수지를 20-mL 칼럼에 옮기고, 20 칼럼 용적의 용해 완충액으로 세척하였다. Cas9를 20 mM 트리스-HCl (pH 8), 0.1 M KCl, 20% 글리세롤, 1 mM TCEP, 및 250 mM 이미다졸에서 용출시키고, 아미콘(Amicon) 초원심분리용 필터 [밀리포어(Millipore), 30-kDa 분자량 컷-오프]에 의해 농축시켜 약 50 mg/mL이 되도록 하였다. 6xHis 태그 및 말토스 결합성 단백질을 4℃ 하에 20 h 동안 TEV 프로테아제 처리함으로써 제거하고, 제2의 Ni-친화 정제 단계에 의해 포획하였다. Cas9를 함유하는 용출액을, 20 mM 트리스-HCl (pH 8), 0.1 M KCl, 20% 글리세롤, 및 1 mM TCEP를 함유하는 정제 완충액 중의 하이트랩(HiTrap) SP FF 칼럼 [GE 헬스케어(GE Healthcare)] 내로 주사하였다. Cas9를, 5 칼럼 용적에 걸쳐 0.1 M 내지 1 M의 선형 KCl 구배를 함유하는 정제 완충액으로 용출시켰다. 이와 같이 용출된 Cas9를, 정제 완충액 중의 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 칼럼에 의해 추가로 정제하고, 액체 질소에서 순간 동결시킨 다음, -80℃에서 분취액으로 저장하였다.
시험관내 RNA 전사. 100 pmol CLTA(#) v2.1 fwd 및 v2.1 주형 rev를 95℃ 하에 인큐베이션하고, 10 μM dNTP 혼합물 [바이오-래드(Bio-Rad)]을 보충시킨 NE 완충액 2 (50 mM 염화나트륨, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM 염화마그네슘, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9)에서 0.1℃/s로 37℃가 되도록 냉각시켰다. 10 U의 클레노우 단편 (3'→5' 엑소-) (NEB)을 상기 반응 혼합물에 가하고, 37℃ 하에 1 h 동안 중복 연장시킴으로써 이중 가닥 CLTA(#) v2.1 주형을 수득하였다. 200 nM CLTA(#) v2.1 주형 단독, 또는 100 nM T7 프로모터 올리고를 수반한 100 nM CLTA(#) 주형을 37℃ 하에 밤새, 1 mM rNTP 혼합물 (1 mM rATP, 1 mM rCTP, 1 mM rGTP, 1 mM rUTP)을 보충시킨 NEB RNAPol 완충액 (40 mM 트리스-HCl, pH 7.9, 6 mM 염화마그네슘, 10 mM 디티오트레이톨, 2 mM 스페르미딘) 중의 0.16 U/㎕의 T7 RNA 중합효소 (NEB)와 함께 인큐베이션하였다. 시험관내 전사된 RNA를 에탄올로 침전시키고, 크리테리온(Criterion) 10% 폴리아크릴아미드 TBE-우레아 겔 (바이오-래드) 상에서 겔 전기영동함으로써 정제하였다. 겔 정제된 sgRNA를 에탄올로 침전시키고 물에 재용해시켰다.
시험관내 라이브러리 구축. 10 pmol의 CLTA(#) lib 올리고뉴클레오티드를, 60℃ 하에 16시간 동안 20 ㎕의 총 반응 용적으로 2.5 mM 염화망간을 보충시킨 1x 서크리가제(CircLigase) II 반응 완충액 (33 mM 트리스-아세테이트, 66 mM 포타슘 아세테이트, 0.5 mM 디티오트레이톨, pH 7.5) 중의 100 단위의 서크리가제 II ssDNA 리가제 [에피센터(Epicentre)]와 함께 인큐베이션함으로써 별개로 환상화하였다. 이 반응 혼합물을 85℃ 하에 10분 동안 인큐베이션하여 상기 효소를 불활성화하였다. 5 ㎕ (5 pmol)의 상기 조 환상 단일 가닥 DNA를 제조업자의 프로토콜에 따라서 일루스트라 템플리파이(illustra TempliPhi) 증폭 키트 (GE 헬스케어)를 이용하여 콘카테머성 사전 선별 라이브러리로 전환시켰다. 콘카테머성 사전 선별 라이브러리를 퀀트-잇 피코그린(Quant-it PicoGreen) dsDNA 검정 키트 [인비트로젠(Invitrogen)]로 정량화하였다.
표적에 적중한 기질과 표적을 벗어난 기질의 시험관내 절단. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 CLTA(#) 부위 fwd/rev를 HindIII/XbaI 이중-분해된 pUC19 (NEB) 내로 결찰시킴으로써, PCR하기 위한 플라스미드 주형을 구축하였다. 플라스미드 주형, 및 시험 fwd 프라이머와 rev 프라이머를 이용하여 PCR함으로써, 표적에 적중한 기질 DNA를 생성시킨 다음, 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (퀴아젠)를 이용하여 정제하였다. 프라이머 연장함으로써 표적을 벗어난 기질 DNA를 생성하였다. 100 pmol 표적을 벗어난 (#) fwd 프라이머와 표적을 벗어난 (#) rev 프라이머를 95℃ 하에 인큐베이션하고, 10 μM dNTP 혼합물 (바이오-래드)을 보충시킨 NE 완충액 2 (50 mM 염화나트륨, 10 mM 트리스-HCl, 10 mM 염화마그네슘, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9)에서 0.1℃/s로 37℃가 되도록 냉각시켰다. 10 U의 클레노우 단편 (3'→5' 엑소-) (NEB)을 상기 반응 혼합물에 가하고, 37℃ 하에 1 h 동안 중복 연장한 다음 75℃ 하에 20분 동안 효소 불활성화시킴으로써 이중 가닥의 표적을 벗어난 주형을 수득한 후, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하였다. 200 nM 기질 DNA를, 37℃ 하에 10분 동안 Cas9 절단 완충액 (200 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 M 염화칼륨, 100 mM 염화마그네슘, 1 mM EDTA, 5 mM 디티오트레이톨) 중의 100 nM Cas9 및 100 nM (v1.0 또는 v2.1) sgRNA, 또는 1000 nM Cas9 및 1000 nM (v1.0 또는 v2.1) sgRNA와 함께 인큐베이션하였다. 크리테리온 5% 폴리아크릴아미드 TBE 겔 (바이오-래드)에서 전기영동하기 전에, 표적에 적중한 절단 반응물은 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하였고, 표적을 벗어난 절단 반응물은 퀴아퀵 뉴클레오티드 제거 키트 (퀴아젠)로 정제하였다.
시험관내 선별. 200 nM 콘카테머성 사전 선별 라이브러리를 37℃ 하에 10분 동안 Cas9 절단 완충액 (200 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 M 염화칼륨, 100 mM 염화마그네슘, 1 mM EDTA, 5 mM 디티오트레이톨) 중의 100 nM Cas9 및 100 nM sgRNA, 또는 1000 nM Cas9 및 1000 nM sgRNA와 함께 인큐베이션하였다. 사전 선별 라이브러리를 또한, 37℃ 하에 1 h 동안 NE 완충액 3 (100 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9) 중의 2 U의 BspMI 제한 엔도뉴클레아제 (NEB)와 함께 별개로 인큐베이션하였다. 평활 말단된 후-선별 라이브러리 구성원 또는 점착성 말단된 사전 선별 라이브러리 구성원을 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하고, 이를 실온 하에 밤새 (> 10 h) NEB T4 DNA 리가제 반응 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM 염화마그네슘, 1 mM ATP, 10 mM 디티오트레이톨) 중의, 1,000 U의 T4 DNA 리가제 (NEB)를 수반한 10 pmol 적응인자 1/2 (AACA) (Cas9:v2.1 sgRNA, 100 nM), 적응인자 1/2 (TTCA) (Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM), 적응인자 1/2 (Cas9:v2.1 sgRNA, 1000 nM), 또는 lib 적응인자 1/CLTA(#) lib 적응인자 2 (사전 선별)에 결찰시켰다. 적응인자-결찰된 DNA를 퀴아퀵 PCR 정제 키트로 정제하고, 완충액 HF (NEB) 중의 푸션 핫 스타트 플렉스(Phusion Hot Start Flex) DNA 중합효소 (NEB), 및 프라이머 CLTA(#) sel PCR/짧은 PE2 (후-선별) 또는 CLTA(#) lib seq PCR/lib fwd PCR (사전 선별)을 이용하여 10 내지 13 주기 동안 PCR-증폭시켰다. 증폭시킨 DNA를 겔 정제하고, KAPA 라이브러리 정량화 키트-일루미나(Illumina) [KAPA 바이오시스템즈(Biosystems)]로 정량화하며, 이를 대상으로 하여 일루미나 MiSeq 상에서 단일-판독 서열 분석하거나 또는 일루미나 HiSeq 2500 [시스템 생물학 핵심 시설에 대한 하버드 대학 FAS 센터 (Harvard University FAS Center for Systems Biology Core facility; 미국 매사추세츠주 케임브리지)] 상에서 신속 수행 단일-판독 서열 분석하였다.
선별 분석. C++로 작성된 스크립트를 이용한 변형 (알고리즘)을 수행하여, 사전 선별 및 후-선별 서열 분석 데이터를 기존에 보고된 바와 같이21 분석하였다. 미가공 서열 데이터는 제시되지 않음 (큐레이터된 요약에 관해서는 표 2 참조). 다음 식을 이용하여 특이성 스코어를 계산하였다: 양성 특이성 스코어 = (위치[후-선별]에서의 염기 쌍의 빈도 - 위치[사전 선별]에서의 염기 쌍의 빈도) / (1 - 위치[사전 선별]에서의 염기 쌍의 빈도) 및 음성 특이성 스코어 = (위치[후-선별]에서의 염기 쌍의 빈도 - 위치[사전 선별]에서의 염기 쌍의 빈도) / (위치[사전 선별]에서의 염기 쌍의 빈도). 서열 로고에 대한 표준화를 기존에 보고된 바와 같이22 수행하였다.
세포성 절단 검정. HEK293T 세포를 전사 전에 웰 (6-웰 판)당 0.8x105의 밀도로 분할하고, 5% CO2를 수반한 37℃ 가습 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청 (FBS)을 보충시킨 둘벡코(Dulbecco)의 변형 이글 배지 (DMEM)에 유지시켰다. 1일 후, 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라서 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (인비트로젠)을 이용하여 일시적으로 형질감염시켰다. HEK293T 세포를, 1.0 ㎍의 Cas9 발현 플라스미드 (Cas9-HA-2xNLS-GFP-NLS) 및 2.5 ㎍의 단일 가닥 RNA 발현 플라스미드 pSiliencer-CLTA (버전 1.0 또는 2.1)를 이용하여 6-웰 판의 각 웰에서 70% 밀집도로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 형광 현미경검사에 의해 관찰된 GFP-양성 세포의 분획을 근거로 하여 약 70%인 것으로 추정되었다. 형질감염시킨지 48 h 후, 세포를 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 펠릿화하며 -80℃ 하에 동결시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 DNeasy 혈액 및 조직 키트 (퀴아젠)를 이용하여 200 ㎕ 세포 용해물로부터 게놈 DNA를 단리하였다.
표적을 벗어난 부위 서열 결정. Cas9 발현 플라스미드와 단일 가닥 RNA 발현 플라스미드로 처리된 세포 (처리된 세포), 또는 Cas9 발현 플라스미드 단독으로 처리된 세포 (대조군 세포)로부터 단리된 100 ng 게놈 DNA를, 3% DMSO를 보충시킨 완충액 GC (NEB) 중의 푸션 핫 스타트 플렉스 DNA 중합효소 (NEB), 및 프라이머 CLTA(#)-(#)-(#) fwd 및 CLTA(#)-(#)-(#) rev를 이용하여 35주기 동안 10 s 72℃ 연장시키면서 PCR함으로써 증폭시켰다. 조 PCR 생성물의 상대적 양을 겔에 의해 정량화하고, Cas9-처리된 (대조군) 및 Cas9:sgRNA-처리된 PCR을 등몰 농도로 별개로 풀링한 후, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하였다. 정제된 DNA를, 완충액 HF (NEB) 중의 푸션 핫 스타트 플렉스 DNA 중합효소 (NEB)를 이용하여 7 주기 동안 프라이머 PE1-바코드# 및 PE2-바코드#로 PCR함으로써 증폭시켰다. 증폭된 대조군 및 처리된 DNA 풀을 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제한 다음, 아젠코트 AM퓨어(Agencourt AMPure) XP [벡크만 코울터(Beckman Coulter)]로 정제하였다. 정제된 대조군 및 처리된 DNA를 KAPA 라이브러리 정량화 키트-일루미나 (KAPA 바이오시스템즈)로 정량화하고, 1:1 비로 풀링한 다음, 일루미나 MiSeq 상에서 쌍을 이룬-말단 서열 분석을 수행하였다.
통계적 분석. 통계적 분석을 기존에 보고된 바와 같이21 수행하였다. 표 1 및 표 6 내의 P-값은 한쪽으로 치우친 피셔(Fisher)의 직접 확률 시험에 대해 계산하였다.
알고리즘
모든 스크립트는 C++로 작성되었다. 본 연구에 사용된 알고리즘은 기존에 보고된 (참조) 바와 같다 (변형을 수반함).
서열 비닝(binning). 1) 후-선별 라이브러리 구성원으로서 바코드 "AACA" 또는 "TTCA"로 시작하여 서열 쌍을 지정한다. 2) 후-선별 라이브러리 구성원의 경우 (예시된 예를 이용함):
예 판독:
i) 불변 서열 "CTCGGCAGGT" (서열 43)의 그 위치 pos1 및 pos2에 대한 쌍을 이룬 판독치 둘 다를 조사한다. ii) 바코드와 pos1 및 앞서 pos2 간의 동일한 서열을 갖는 서열만을 유지한다. iii) 불변 서열의 두 사례 간의 영역 (바코드와 pos1 사이의 영역은 커팅된 절반 부위를 함유하고; 불변 서열의 두 사례 사이에 있는 영역은 전체 부위를 함유한다)을 유지한다.
예: ACTTGCAGATGTAGTCTTTCCACATGGGTCGACACAAACACAA(서열 44)
ii) CLTA1에 대해서는 선별 바코드에 대한 서열 ("TGTGTTTGTGTT" (서열 45))을 조사하고, CLTA2에 대해서는 "AGAAGAAGAAGA" (서열 46)을 조사하며, CLTA3에 대해서는 "TTCTCTTTCTCT" (서열 47)을 조사하고 CLTA4에 대해서는 "ACACAAACACAA" (서열 48)을 조사한다.
예: ACTTGCAGATGTAGTCTTTCCACATGGGTCGACACAAACACAA(서열 49) - CLTA4
iii) 바코드 전의 서열은 완전한 후-선별 라이브러리 구성원이다 (첫 번째 4개 뉴클레오티드와 마지막 4개 뉴클레오티드는 완전히 무작위적인 양옆에 있는 서열이다).
예: ACTT GCAGATGTAGTCTTTCCACATGG GTCG (서열 50)
iv) 23개 뉴클레오티드 후-선별 라이브러리 구성원에 상응하는 위치에 대한 품질 스코어를 분석한다.
판독된 예:
v) 서열에 대한 상응하는 품질 스코어 문자열 (밑줄이 그어져 있다) FASTQ 품질 문자가 ASCII 코드에서 '?'이거나 또는 더 높은 경우 [프레드(Phred) 품질 스코어 >= 30]에만 상기 서열을 유지한다.
NHEJ
서열 호출
판독된 예:
예 품질 스코어:
양옆에 있는 서열의 예: GCTGGTGCACTGAAGAGCCA(서열 53)
AATATCTTAATCCTACTCAG(서열 54)
2) 표적을 벗어난 잠재적 부위 (양옆에 있는 서열 사이의 서열)를 확인하기 위해 양옆에 있는 서열에 대한 모든 서열 판독치를 조사한다.
표적을 벗어난 잠재적 부위의 예: CCCTGTGAAACACTACATCTGC (서열 55)
3) 표적을 벗어난 잠재적 부위가 삽입-결실 (길이가 23개 미만이다)을 함유하는 경우에는, 서열에 대한 모든 상응하는 FASTQ 품질 문자가 ASCII 코드에서 '?'이거나 또는 더 높은 경우 (프레드 품질 스코어 >= 30)에는, 이러한 서열을 표적을 벗어난 잠재적 부위로서 유지한다.
표적을 벗어난 잠재적 부위 길이의 예 = 22
상응하는 FASTQ 품질 문자의 예: HHGHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
4) 단계 2와 3을 통과한 모든 서열을 비닝하고 수동으로 검사하며, 서열이 위치 16, 17 또는 18 (비-PAM 말단으로부터 계수한 20 중에서)을 포함한 하나 이상의 결실을 갖는 경우 또는 서열이 위치 17과 18 사이에 삽입을 갖는 경우 (이는 의도된 표적 부위에 대해 관찰된 가장 빈번한 변형과 일치한다), 이러한 서열을 잠재적 변형 서열로서 유지한다 (도 3).
참조 서열을 수반한, 표적을 벗어난 잠재적 부위 (위치가 표지된, 역 보체):
4) 판독 2에 대한 단계 1 내지 3을 반복하고, 서열이 동일한 경우에만 유지한다.
5) Cas9+sgRNA 처리된 샘플에서의 전반적인 계수치를 Cas9 단독 샘플과 비교하여 변형된 부위를 확인한다.
(후-선별 서열에 대한) 절단 부위에 근거한 필터
1) 바코드 다음 (제1 불변 서열 이전) 서열 분석 판독치에서 제1 위치와 동일한 완전히 서열 분석된 인식 부위 내의 (두 불변 서열 사이) 제1 위치를 확인함으로써 인식 부위 전반에 걸친 절단 부위 위치를 표로 작성한다.
2) 표로 작성한 후, 상기 서열 분석 판독치의 5% 이상에 존재하는 절단 부위 위치를 수반한 서열 만을 유지하면서, 단계 1을 반복한다.
결과
표적을 벗어난 광범위한 DNA 절단 프로파일링 결과, RNA-프로그램된
Cas9
뉴클레아제 특이성이 밝혀졌다.
아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한 서열-특이적 엔도뉴클레아제는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)1-3, 다세포 유기체4 -8 및 생체외 유전자 요법 임상 시험9 ,10에서 유전자를 변형시키기 위한 중요한 도구였다. ZFN 및 TALEN이 이러한 유전적 조작에 유효한 것으로 입증되었지만, 각 DNA 표적 부위에 대한 새로운 ZFN 또는 TALEN 단백질을 생성시켜야만 한다. 이와는 반대로, RNA-유도된 Cas9 엔도뉴클레아제는 RNA:DNA 혼성화를 이용하여 표적 DNA 절단 부위를 결정하는데, 이로써 단일 단량체성 단백질이 원칙적으로, 유도 RNA11에 의해 지정된 모든 서열을 절단할 수 있다.
기존의 연구12 -17 결과, Cas9가, 결합된 유도 RNA 내의 20개 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 부위에서의 게놈 편집을 매개하는 것으로 입증되었다. 또한, 표적 부위는 20개 뉴클레오티드 표적 부위에 인접한 3' 말단에 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)를 포함해야만 하는데; 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 경우에는, PAM 서열이 NGG이다. 시험관내와 세포내 둘 다에서 Cas9-매개된 DNA 절단 특이성은 표적을 벗어난 잠재적 단일 돌연변이 부위의 소형 컬렉션에 대항한 검정에 근거하여 기존에 추론되었다. 이들 연구는 유도 RNA와 표적 DNA 간의 완벽한 상보성이 상기 표적 부위의 PAM 말단 (유도 RNA의 3' 말단)에 인접한 7 내지 12개 염기 쌍에 요구되고 비-PAM 말단 (유도 RNA의 5' 말단)에는 미스매치가 관용된다고 제안하였다11, 12, 17-19.
Cas9:유도 RNA 표적 인식을 명시하는 상기 제한된 수의 뉴클레오티드가, 중간 크기 내지 큰 크기 (> 약 107 bp)의 게놈 내에서의 다수 DNA 절단 부위를 예측할 것이지만, Cas9:유도 RNA 복합체가 세포12 , 13, 15와 유기체14 둘 다를 변형시키기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 제브라피시(zebrafish) 배아를 변형시키기 위해 Cas9:유도 RNA 복합체를 이용하는 연구는 ZFN 및 TALEN과 유사한 비율로 독성을 관찰하였다14. 고 처리량 서열 분석을 이용하는 촉매적으로 불활성인 Cas9 돌연변이체의 이. 콜라이에서의 DNA 결합의 특이성 (전사 억제)에 관한 최근의 광범위한 연구 결과, 비교적 작은 이. 콜라이 전사체에서는 표적을 벗어난 탐지 가능한 전사 억제가 전혀 발견되지 않았다20. 이들 연구가 Cas9에 관한 본 발명자들의 기본적 이해를 실질적으로 진전시키긴 하였지만, 다수의 관련 돌연변이체 표적 부위 상에서의 Cas9 절단 측정으로부터 생성된 Cas9:유도 RNA-매개된 DNA 절단 특이성의 체계적이고도 포괄적인 프로파일은 보고된 바가 없다. 이러한 특이성 프로파일은 조사 도구 및 앞으로의 치료제로서의 Cas9:유도 RNA 복합체의 잠재력을 이해하고 개선시키는 데 필요하다.
본 발명자들은 ZFN 절단의 오버행-함유 생성물과 비교해서 Cas9에 의해 생성된 평활 말단 절단 생성물을 프로세싱하도록 적응시킨, 본 발명자들의 기존에 공개된 시험관내 선별21을 변형시켜 Cas9:단일 유도 RNA (sgRNA)11 복합체의 표적을 벗어난 DNA 절단 프로파일을 결정하였다. 각 선별 실험은, 각각의 22개 염기 쌍 표적 서열 (2개의 염기 쌍 PAM 포함)을 기준으로 하여 8개 이하의 돌연변이를 수반한 모든 서열의 10배 적용 범위를 포함하기에 충분히 큰 크기인 약 1012개 서열을 함유하는 DNA 기질 라이브러리를 사용하였다 (도 1). 본 발명자들은 모든 22개 표적 부위 염기 쌍에 부분적으로 무작위적인 뉴클레오티드 혼합물을 사용하여, 표적 부위당 예상 평균 4.62개의 돌연변이를 수반한 돌연변이체 표적 부위의 이항 분포 라이브러리를 창출하였다. 또한, 표적 부위 라이브러리 구성원은 각 측면에 4개의 완전히 무작위적인 염기 쌍이 양옆에 위치하고 있어, 정규 20개 염기 쌍 표적 부위와 PAM에 의해 부여된 것을 훨씬 능가하는 특이성 패턴에 관하여 시험하였다.
인간 클라트린 경쇄 A (CLTA) 유전자 내의 상이한 4개 표적 서열 각각에 대하여, 1012개의 표적을 벗어난 개개의 잠재적 부위의 사전 선별 라이브러리를 생성하였다 (도 3). 합성 5'-인산화 53개-염기 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서 환상 단일 가닥 DNA와 자기 결찰시킨 다음, 롤링 서클 증폭을 통하여 콘카테머성 53개-염기 쌍 반복 서열로 전환시켰다. 이로써 생성된 사전 선별 라이브러리를 그들의 상응하는 Cas9:sgRNA 복합체와 함께 인큐베이션하였다. 유리 5' 포스페이트를 함유하는 절단된 라이브러리 구성원을, 비-인산화된 이중 가닥 서열 분석용 적응인자의 5' 포스페이트-의존성 결찰을 통하여 무손상 라이브러리 구성원으로부터 분리하였다. 이러한 결찰-태그부착된 후-선별 라이브러리를 PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 PCR 단계로 인해, 하나 이상의 인접한 상응하는 전체 부위를 수반하거나 수반하지 않는 적응인자-결찰된 커팅된 절반 부위의 증폭으로부터 비롯되는 Cas9에 의해 절단된 라이브러리 구성원의 0.5, 1.5, 또는 2.5개 등의 반복 서열을 함유하는 후-선별 DNA 단편의 혼합물이 생성되었다 (도 1). 1.5개 표적-서열 반복을 수반한 후-선별 라이브러리 구성원을 겔 정제에 의해 단리하고, 고 처리량 서열 분석함으로써 분석하였다. DNA 증폭 또는 서열 분석 동안 오류의 영향력을 최소화하기 위한 최종 컴퓨터 선별 단계에서는, 반복 커팅된 절반 부위의 2개 동일한 카피를 수반한 서열 만을 분석하였다.
사전 선별 라이브러리를 시험된 4개의 유도 RNA 표적 (CLTA1, CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4) 각각에 대하여 효소 제한 조건 하에서 (200 nM 표적 부위 라이브러리, 100 nM Cas9:sgRNA v2.1) 또는 효소 포화 조건 하에서 (200 nM 표적 부위 라이브러리, 1000 nM Cas9:sgRNA v2.1) 인큐베이션하였다 (도 3c 및 3d). sgRNA v2.1 보다 활성이 덜한 제2 유도 RNA 구조물 sgRNA v1.0을, 시험된 4개의 유도 RNA 표적 각각에 대하여 효소 포화 조건 하에서만 검정하였다 (200 nM 표적 부위 라이브러리, 1000 nM Cas9:sgRNA v1.0). 이러한 2가지 유도 RNA 구조물은 그들의 길이에 있어서 상이하고 (도 3), 상기 선별 조건 하에서의 그들의 DNA 절단 활성 수준에 있어서 상이한데, 이는 기존의 보고 내용15과 일치한다 (도 4). 사전 선별 라이브러리와 후-선별 라이브러리 둘 다는 고 처리량 DNA 서열 분석과 컴퓨터 분석에 의해 명확히 규명되었다. 예상된 바와 같이, 보다 소수의 돌연변이를 수반한 라이브러리 구성원은 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리에서 상당히 강화되었다 (도 5).
사전 선별 라이브러리 및 후-선별 라이브러리 조성. CLTA1, CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4에 대한 사전 선별 라이브러리는 2개-염기 쌍 PAM을 포함한 22개-염기 쌍 표적 부위당 각각 4.82 (n = 1,129,593), 5.06 (n = 847,618), 4.66 (n = 692,997), 및 5.00 (n = 951,503) 돌연변이의 평균 돌연변이 비율을 나타내는 것으로 관찰되었다. 효소 제한 조건 하에서 Cas9 플러스 CLTA1, CLTA2, CLTA3, 또는 CLTA4 v.2.1 sgRNA로 처리된 후-선별 라이브러리는 22개-염기 쌍 표적 부위당 평균 1.14 (n = 1,206,268), 1.21 (n = 668,312), 0.91 (n = 1,138,568), 및 1.82 (n = 560,758) 돌연변이를 함유하였다. 효소 과잉 조건 하에서는, 선별에 살아남은 서열들 중에서 평균 돌연변이 수는 CLTA1, CLTA2, CLTA3, 또는 CLTA4 v2.1 sgRNA에 대하여 22개-염기 쌍 표적 부위당 각각 1.61 (n = 640,391), 1.86 (n = 399,560), 1.46 (n = 936,414), 및 2.24 (n = 506,179) 돌연변이로 증가하였다. 이들 결과, 상기 선별로 인해서는 시험된 모든 Cas9:sgRNA 복합체에 대하여 보다 소수의 돌연변이를 수반한 라이브러리 구성원이 상당히 강화되었다는 사실과, 효소 과잉 조건으로 인해서는 효소 제한 조건과 비교해서 보다 고도로 돌연변이된 라이브러리 구성원의 절단이 추정되었다는 사실이 밝혀졌다 (도 5).
본 발명자들은 사전 선별 라이브러리와 비교해서 후-선별 라이브러리 내의 각 위치에서의 각 염기 쌍의 강화 수준 (그 염기 쌍의 가능한 최대 강화에 대해 표준화시킴)을 정량화하기 위한 특이성 스코어를 계산하였다. 양성 특이성 스코어는 후-선별 라이브러리에서 강화되었던 염기 쌍을 표시하고, 음성 특이성 스코어는 후-선별 라이브러리에서 탈강화되었던 염기 쌍을 표시한다. 예를 들어, +0.5의 스코어는 염기 쌍이 최대 강화 값의 50%로 강화된다는 것을 표시하는 반면, -0.5의 스코어는 염기 쌍이 최대 탈강화 값의 50%로 탈강화된다는 것을 표시한다.
PAM에 의해 지정된 2개의 염기 쌍 이외에도, 유도 RNA에 의해 표적화된 20개 모든 염기 쌍이 CLTA1 및 CLTA2 선별로부터의 서열에서 강화되었다 (도 2, 도 6 및 9, 및 표 2). CLTA3 및 CLTA4 선별에 대해서는 (도 7 및 8, 및 표 2), 유도 RNA-지정된 염기 쌍이, PAM으로부터 가장 원위의 2개 염기 쌍 (유도 RNA의 5' 말단)을 제외한 모든 위치에서 각각 강화되었다. 이와 같이 PAM으로부터 가장 멀리 있는 비-지정된 위치에서는, 3개 대체 염기 쌍 중 적어도 2개가 상기 지정된 염기 쌍과 거의 동일하게 강화되었다. 전체 20개 염기 쌍 표적 부위와 2개 염기 쌍 PAM이 Cas9:sgRNA DNA 절단 특이성에 기여할 수 있다는 본 발명자들의 발견은, 단지 7 내지 12개 염기 쌍과 2개 염기 쌍 PAM이 지정된다는 것을 제안하고 있는11 , 12, 15 기존의 단일-기질 검정으로부터의 결과와 대조된다.
모든 단일-돌연변이체 사전 선별 라이브러리 구성원 (n ≥ 14,569)과 후-선별 라이브러리 구성원 (n ≥ 103,660)을 컴퓨터 상으로 비교하여, 가능한 모든 단일-돌연변이체 서열에 대한 선별 강화 값을 제공하였다. 이러한 분석 결과 (도 2 및 도 6 및 8)는 단일-돌연변이체 서열만을 고려한 경우에는, PAM에 가장 근접한 6 내지 8개 염기 쌍이 일반적으로 고도로 지정되고 비-PAM 말단은 효소 제한 조건 하에서 거의 지정되지 않는다는 것을 나타내는데, 이는 기존의 발견 내용과 일치한다11 , 12, 17- 19. 그러나, 효소 포화 조건 하에서는, PAM에 가장 가까운 위치의 6 내지 8개 염기 쌍 내에서 조차의 단일 돌연변이도 관용되는데, 이는 DNA 표적 부위의 PAM 말단에서의 높은 특이성은 효소 농도가 기질과 비교해서 높은 경우에 상쇄될 수 있다는 것을 제안하고 있다 (도 2). PAM에 근접한 단일 돌연변이에 대항하여 높은 특이성이 관찰된다는 것은 단일 돌연변이를 수반한 서열에만 적용되고, 이러한 선별 결과는 PAM으로부터 가장 멀리 있는 표적 부위의 영역에서는 어떠한 조합의 돌연변이도 관용된다는 모델을 지지해주지 못한다 (도 10 내지 15). 사전 선별 라이브러리와 후-선별 라이브러리 조성에 관한 분석은 본원의 다른 곳에 기재되어 있고, 위치-의존성 특이성 패턴은 도 18 내지 20에 예시되어 있으며, PAM 뉴클레오티드 특이성은 도 21 내지 24에 예시되어 있고, 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 보다 상세한 효과는 도 2g 및 도 25에 기재되어 있다.
표적 부위의 비-PAM 말단에서의 특이성. 효소 과잉 조건 하에서 PAM으로부터 원위의 다수 돌연변이를 관용할 수 있는 Cas9:v2.1 sgRNA의 능력을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 PAM으로부터 가장 원위의 표적 부위의 말단에 1개 내지 12개 염기 쌍의 영역 내에서만 돌연변이를 함유하였던 서열에 대한 각 위치에서의 최대 특이성 스코어를 계산하였다 (도 10 내지 17).
이러한 분석 결과는 나머지 서열이 돌연변이를 함유하지 않는 경우에 PAM으로부터 가장 멀리 있는 분자의 말단에, 표적 부위에 따라서 3개 이하의 돌연변이를 수반한 서열에 대항하여 선별이 전혀 없다는 (최대 특이성 스코어 약 0) 것을 보여준다. 예를 들어, PAM으로부터 가장 멀리 있는 3개의 염기 쌍만이 CLTA2 표적 부위에서 변화될 수 있는 경우에 (도 11c에서 암색 막대로써 표시됨), 3개 가변 위치 각각에서의 최대 특이성 스코어는 0에 근접한데, 이는 이러한 3개 가변 위치 각각에서의 4개의 가능한 염기 쌍 중 어느 것에 대해서도 선별이 없었다는 것을 표시한다. 그러나, PAM으로부터 가장 멀리 있는 8개 염기 쌍이 변화될 수 있는 경우에는 (도 11h), 위치 4 내지 8에서의 최대 특이성 스코어가 모두 +0.4 보다 큰데, 이는 나머지 기질이 표적에 적중한 바람직한 염기 쌍을 함유하는 경우에서도 Cas9:sgRNA가 이들 위치에서 서열 선호도를 갖고 있다는 것을 표시하고 있다.
본 발명자들은 또한, 표적 부위의 첫 번째 1 내지 12개 염기 쌍만을 변화시킬 수 있는 경우, 효소 과잉 조건 하에 사전 선별 라이브러리와 v2.1 sgRNA-처리된 후-선별 라이브러리 둘 다에서의 돌연변이의 분포도 (도 15 내지 17)를 계산하였다. 데이터의 일부에 대해서만 사전 선별 라이브러리와 후-선별 라이브러리 간에 상당한 중복이 있는데 (도 15 내지 17, a-c), 이는 표적 부위의 첫 번째 3개 염기 쌍에서만 돌연변이를 수반한 서열에 대한 후-선별 라이브러리에서는 최소한의 선별 내지 선별이 없다는 것을 입증해 준다. 이들 결과는 집합적으로, 나머지 표적 부위에 최대의 sgRNA:DNA 상호 작용이 제공된 경우에, Cas9:sgRNA는 PAM으로부터 가장 멀리 있는 서열의 말단에 소수의 돌연변이 (약 1 내지 3개)를 관용할 수 있다는 것을 보여준다.
표적 부위의 PAM 말단에서의 특이성. 본 발명자들은 가장 고도로 지정된 위치에 대한 동일한 합에 대해 표준화시킨, 각 표적 부위의 각 위치에서 4개의 모든 염기 쌍에 대한 특이성 스코어의 크기 합으로서 위치 특이성을 플롯하였다 (도 18 내지 20). 효소 제한 조건과 효소 과잉 조건 둘 다 하에서는, 표적 부위의 PAM 말단이 고도로 지정된다. 효소 제한 조건 하에서는, 상기 분자의 PAM 말단이 CLTA1, CTLA2, 및 CLTA3 유도 RNA에 의해 (도 2 및 도 6 내지 9) 거의 절대적으로 지정되고 (유도 RNA-지정된 염기 쌍에 대한 특이성 스코어 ≥ +0.9), CLTA4 유도 RNA에 의해 고도로 지정된다 (특이성 스코어 +0.7 내지 +0.9). 이러한 고 특이성 영역 내에서, 유도 RNA와 표적 DNA 간의 워블(wobble) 쌍형성과 일치하는 특이적 단일 돌연변이가 관용된다. 예를 들어, 단일-돌연변이체 서열에 대한 효소 제한 조건 하에서는, 표적을 벗어난 dA:dT 염기 쌍과 유도 RNA-지정된 dG:dC 염기 쌍이 CLTA3 표적 부위의 20개 위치 (표적 부위의 비-PAM 말단을 기준으로 함) 중에서 위치 17에서 동등하게 관용된다. 이러한 위치에서, rG:dT 워블 RNA:DNA 염기 쌍이 형성될 수 있는데, 이는 절단 활성이 최소한 가시적으로 손실되었다.
중요하게도, 이러한 선별 결과는 유도 RNA 헤어핀을 선택하는 것이 특이성에 영향을 미친다는 것을 또한 밝혀내었다. 보다 짧고 덜 활성인 sgRNA v1.0 구조물은 세포성 환경 하의 기질과 비교해서 과량의 효소를 반영하고 있는 동일한 효소 포화 조건 하에서 검정되는 경우에, 보다 길고 더 활성인 sgRNA v2.1 구조물보다 더 특이적이다 (도 2 및 도 5 내지 8). sgRNA v2.1에 비해 sgRNA v1.0의 보다 높은 특이성은, CLTA3 및 CLTA4 (< 40% 차이)에 대해서 보다는 CLTA1 및 CLTA2 (약 40 내지 90% 차이)에 대해서 더 크다. 흥미롭게도, 이러한 특이성 차이는 각 표적 서열에 대한 표적 부위의 상이한 영역에 국한된다 (도 2h 및 26). 집합적으로, 이들 결과는 상이한 유도 RNA 구조로 인해 상이한 DNA 절단 특이성이 초래된다는 것과, 특이성에 있어서의 유도 RNA-의존성 변화가 표적 부위 내의 모든 위치에 동등하게 영향을 미치지 않는다는 것을 표시한다. 상기 언급된 Cas9:sgRNA 농도와 특이성 간의 반비례 관계를 고려해 볼때, 본 발명자들은 유도 RNA 구조들 간의 특이성 상의 차이가 그들의 DNA-절단 활성의 전반적인 수준 상의 차이로부터 비롯된다고 추측한다.
DNA 절단 특이성에 대한 Cas9:sgRNA 농도의 효과. 시험된 4개의 표적 부위에 대한 특이성의 패턴에 대한 효소 농도의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 위치 특이성 상의 농도-의존성 차이를 계산하였고, 이를 위치 특이성 상의 가능한 최대 변화와 비교하였다 (도 25). 일반적으로, 특이성은 효소 과잉 조건 하에서 보다 효소 제한 조건 하에서 더 높았다. 효소 과잉 조건에서 효소 제한 조건으로의 변화는 일반적으로, 표적의 PAM 말단에서의 특이성을, 특이성 상의 가능한 최대 변화의 ≥ 80% 정도로 증가시켰다. 효소 농도 상의 감소로 인해 일반적으로, PAM으로부터 가장 멀리 있는 표적 부위의 말단에서의 특이성 상의 작은 (약 30%) 증가가 유도되긴 하지만, 농도 감소는 PAM에 가장 근접한 표적 부위의 말단에서의 특이성을 훨씬 더 크게 증가시켜 준다. CLTA4에 대해서는, 효소 농도 상의 감소가 PAM으로부터 가장 멀리 있는 표적 부위의 말단 근처의 일부 염기 쌍에서의 특이성 상의 작은 (약 30%) 감소를 동반한다.
PAM 뉴클레오티드의 특이성. 특이성에 대한 PAM의 기여를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 관찰된 모든 후-선별 표적 부위 서열을 고려하거나 (도 21) 또는 유도 RNA에 의해 지정된 20개 염기 쌍 내에 돌연변이를 전혀 함유하지 않았던 후-선별 표적 부위 서열만을 고려하여 (도 22), 사전 선별 라이브러리와 후-선별 라이브러리 내의 16개의 가능한 모든 PAM 디뉴클레오티드의 존재도를 계산하였다. 관찰된 모든 후-선별 표적 부위 서열을 고려하여, 효소 제한 조건 하에서, GG 디뉴클레오티드는 CLTA1, CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용하여 선별하는 경우에 후-선별 PAM 디뉴클레오티드의 99.8%, 99.9%, 99.8%, 및 98.5%를 각각 나타내었다. 이와는 달리, 효소 과잉 조건 하에서, GG 디뉴클레오티드는 CLTA1, CLTA2, CLTA3, 및 CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용하여 선별하는 경우에 후-선별 PAM 디뉴클레오티드의 97.7%, 98.3%, 95.7%, 및 87.0%를 각각 나타내었다. 이들 데이터는 효소 농도 상의 증가로 인해, 비-정규 PAM 디뉴클레오티드를 함유하는 기질의 절단이 증가되었다는 것을 입증해 준다.
PAM 디뉴클레오티드의 사전 선별 라이브러리 분포도를 고려하기 위하여, 본 발명자들은 이러한 PAM 디뉴클레오티드에 대한 특이성 스코어를 계산하였다 (도 23). 표적에 적중한 후-선별 서열만을 효소 과잉 조건 하에 고려한 경우에는 (도 24), 2개의 G 보다는 오히려 단일 G를 수반한 비-정규 PAM 디뉴클레오티드가 비교적 관용된다. 효소 과잉 조건 하에서는, Cas9:CLTA4 sgRNA 2.1이 시험된 모든 Cas9:sgRNA 조합물의 비-정규 PAM 디뉴클레오티드의 가장 높은 관용을 나타내었다. AG 및 GA 디뉴클레오티드가 가장 잘 관용되었고, 그 다음으로는 GT, TG, 및 CG PAM 디뉴클레오티드가 잘 관용되었다. 효소 과잉 조건 하에서 Cas9:CLTA1, 2, 또는 3 sgRNA 2.1을 이용하여 선별하는 데 있어서, AG가 우세한 비-정규 PAM이었다 (도 23 및 24). 본 발명자들의 결과는 Cas9:sgRNA가 AG PAM 디뉴클레오티드를 인식할 수 있다는 것을 보여주는 PAM 특이성에 관한 또 다른 최근 연구23와 일치한다. 또한, 본 발명자들의 결과는 효소 제한 조건 하에서는, GG PAM 디뉴클레오티드가 고도로 지정되고, 효소 과잉 조건 하에서는, 단일 G를 함유하는 비-정규 PAM 디뉴클레오티드가 유도 RNA 맥락에 따라서 관용될 수 있다는 것을 보여준다.
시험관내 선별 결과가 시험관 내에서의 Cas9의 절단 행동을 정확하게 반영한다는 것을 확증하기 위하여, 본 발명자들은 표적 부위 내에 1개 내지 3개의 돌연변이를 함유하는 6개의 표적을 벗어난 CLTA4 기질의 분리된 절단 검정을 수행하였다. 본 발명자들은 후-선별 라이브러리 내의 각 서열의 존재도를 사전 선별 라이브러리 내의 계산된 존재도로 나눔으로써, 효소 포화 조건 하에서 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA에 대한 후-선별 라이브러리 내의 모든 서열에 대한 강화 값을 계산하였다. 효소 포화 조건 하에서는, 가장 높은 강화 값 (27.5, 43.9, 및 95.9)을 갖는 단일의 1개, 2개 및 3개 돌연변이 서열을 ≥ 71% 완료가 되도록 절단하였다 (도 27). 1.0의 강화 값을 갖는 2개-돌연변이 서열을 35%가 되도록 절단하였고, 0에 가까운 (0.064) 강화 값을 갖는 2개-돌연변이 서열은 절단하지 않았다. CLTA4 v2.1 sgRNA에 의해 77%가 되도록 절단되었던 3개-돌연변이 서열을 CLTA4 v1.0 sgRNA에 의해 53%의 보다 낮은 효율이 되도록 절단하였다 (도 28). 이들 결과는 개개 서열의 선별 강화 값이 시험관내 절단 효율을 예측한다는 것을 표시한다.
시험관내 선별과 시험관내 절단 검정의 결과가 인간 세포 내에서의 Cas9:유도 RNA 활성에 관한 것인지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 시험관내 선별에서 강화되었으면서도 인간 게놈에 존재하였던 8개 이하의 돌연변이를 함유하는 51개의 표적을 벗어난 부위 (CLTA1에 대해서는 19개이고 CLTA4에 대해서는 32개이다)를 확인하였다 (표 3 내지 5). 본 발명자들은 일시적 형질감염에 의해 HEK293T 세포에서 Cas9:CLTA1 sgRNA v1.0, Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1, Cas9:CLTA4 sgRNA v1.0, Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1, 또는 sgRNA를 수반하지 않는 Cas9를 발현하였고, 게놈 PCR 및 고 처리량 DNA 서열 분석을 이용하여 51개의 표적을 벗어난 부위 중 46개에서 뿐만 아니라 표적에 적중한 유전자 자리에서 Cas9:sgRNA 변형의 명백한 증거를 찾고자 하였는데; 이러한 예측된 51개의 표적을 벗어난 부위 중 5개 (CLTA1에 대해서는 3개이고 CLTA4에 대해서는 2개이다)에 대해서는 특이적으로 증폭된 DNA가 전혀 수득되지 못하였다.
Cas9:CLTA1 sgRNA 또는 Cas9:CLTA4 sgRNA로 처리된 HEK293T 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 심층 서열 분석한 결과, 표적에 적중한 부위에서 및 시험된 49개의 표적을 벗어난 부위 중 5개 (CLTA1-1-1, CLTA1-2-2, CLTA4-3-1, CLTA4-3-3, 및 CLTA4-4-8)에서 비-상동 말단-결합 (NHEJ)이 분명히 나타난 서열을 확인하였다. (표 1 및 6 내지 8). CLTA4 표적 부위는 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA에 의해 76%의 빈도로 변형된 반면, 표적을 벗어난 부위 CLTA4-3-1, CLTA4-3-3, 및 CLTA4-4-8은 각각 24%, 0.47% 및 0.73%의 빈도로 변형되었다. CLTA1 표적 부위는 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA에 의해 0.34%의 빈도로 변형된 반면, 표적을 벗어난 부위 CLTA1-1-1 및 CLTA1-2-2는 각각 0.09% 및 0.16%의 빈도로 변형되었다.
v2.1 sgRNA를 수반한 효소 포화 조건 하에서는, 2개의 검증된 표적을 벗어난 CLTA1 부위 CLTA1-1-1 및 CLTA1-2-2는 시험관내 선별에서 확인된 가장 고도로 강화된 3개 서열 중 2개였다. CLTA4-3-1과 CLTA4-3-3은 게놈에 존재하기도 하는, 시험관내 선별에서 강화된 7개의 CLTA4 3-돌연변이 서열 중 가장 많이 강화된 서열과 세 번째로 가장 많이 강화된 서열이었다. 4-돌연변이 서열의 시험관내 선별 강화 값은 계산하지 않았는데, 이는 4-돌연변이를 함유하는 게놈 내의 14개 CLTA4 서열 중 12개 (CLTA4-4-8 포함)가 후-선별 라이브러리에서 계수된 단지 1개 서열의 수준에서 관찰되었기 때문이다. 취합해 보면, 이들 결과는 인간 게놈에 존재하는, 시험관내 선별에서 확인된 표적을 벗어난 기질 중 몇 가지가 인간 세포에서 Cas9:sgRNA 복합체에 의해 실제로 절단된다는 사실을 확증시켜 주고, 또한 상기 선별에서 가장 고도로 강화된 표적을 벗어난 게놈 서열이 세포 내에서 가장 큰 정도로 변형된다는 것을 제안하고 있다.
본 발명자들이 세포에서 확인한 표적을 벗어난 부위는 본 발명자들의 시험관내 선별에서 가장 고도로 강화되었고, 의도된 표적 부위와 비교해서 4개 이하의 돌연변이를 함유하고 있다. 이종-염색질 또는 공유 DNA 변형이 세포에서 표적을 벗어난 게놈 부위를 평가할 수 있는 Cas9:유도 RNA 복합체의 능력을 저하시킬 수 있었다는 것이 가능하긴 하지만, 0이거나 많은 것보다는 오히려, 본 연구에서 시험된 49개의 표적을 벗어난 세포성 부위 중 5개가 확인되었다는 것은, Cas9-매개된 DNA 절단이 최근의 연구에서 제안된 바와 같이11 , 12, 19 7 내지 12개 염기 쌍 표적 서열만을 특이적으로 표적화하는 것에 제한되지 않는다는 것을 강력하게 제안하고 있다.
이러한 세포성 게놈 변형 데이터는 또한, 시험관내 선별 데이터 및 분리된 검정에서 관찰된 sgRNA v2.1 sgRNA와 비교해서 sgRNA v1.0의 특이성 상의 증가와 일치한다. CLTA1-2-2, CLTA 4-3-3, 및 CLTA 4-4-8 부위가 Cas9-sgRNA v2.1 복합체에 의해 변형되긴 하였지만, 이들 3개 부위 중 어느 것에서 변형되었다는 명백한 증거가 Cas9:sgRNA v1.0-처리된 세포에서 전혀 탐지되지 않았다. Cas9:v2.1 sgRNA-처리된 세포에서 표적에 적중한 CLTA4 부위 변형 빈도의 32%에서 변형되었던 CLTA4-3-1 부위는 v1.0 sgRNA-처리된 세포에서 표적에 적중한 변형 빈도의 0.5%에서만 변형되었는데, 이는 선별성 상에 있어서의 62배 변화를 나타낸다. 취합해 보면, 이들 결과는 유도 RNA 구조가 세포 내에서 Cas9 특이성에 대해 상당한 영향을 나타낼 수 있다는 것을 입증해 준다. 본 발명자들의 특이성 프로파일링 발견 내용은 유도 RNA 공학을 통하여 Cas9:유도 RNA 복합체의 전반적인 DNA 변형 활성을 개선시키기 위한 최근의 지속적인 노력에 대한 중요한 경고를 제시한다11 , 15.
전반적으로, Cas9의 표적을 벗어난 DNA 절단 프로파일링 및 후속 분석 결과, (i) Cas9:유도 RNA 인식이 시험된 4개의 표적 부위에 대하여 2개-염기 쌍 PAM 및 18 내지 20개 지정된 표적 부위 염기 쌍으로 연장되고; (ii) Cas9:유도 RNA 농도를 증가시키면, 시험관 내에서 DNA-절단 특이성이 감소될 수 있으며; (iii) 보다 활성인 sgRNA 구조를 이용하면, 시험관 내와 세포 둘 다에서 DNA-절단 특이성을 증가시킬 수는 있지만, 시험관 내와 세포 둘 다에서 DNA-절단 특이성을 손상시킬 수 있고; (iv) 본 발명자들의 시험관내 결과에 의해 예측되는 바와 같이, Cas9:유도 RNA는 표적에 적중한 부위를 기준으로 하여 4개 이하의 돌연변이를 수반한 세포에서 표적을 벗어난 부위를 변형시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들의 발견 내용은 RNA-프로그램된 Cas9 특이성에 관한 본 발명자들의 이해에 대한 중요한 통찰력을 제공하고, DNA-절단 특이성에 있어서의 sgRNA 구조에 대한 공지되지 않은 기존의 역할을 밝혀내었다. 본 연구에서 밝혀진 원리는 또한, DNA 절단을 벗어난 기능을 매개하도록 조작된 Cas9-기반 이펙터에 적용할 수 있다.
등가 및 범위
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단지 통상적인 실험을 이용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가내용을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명으로 제한되지 않고, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같와 같다.
청구범위에서, 단수 형태는 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한 하나 이상을 의미한다. 특정 군의 하나 이상의 구성원들 간의 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 이러한 군 구성원 중 하나, 2개 이상, 또는 모두가 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백하지 않는 한은 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 경우에 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 상기 군의 바로 하나의 구성원이 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 군 구성원의 2개 이상 또는 모두가 소정의 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이용되거나 또는 달리 관련되는 실시양태를 포함한다.
더욱이, 본 발명이 청구항들 중 하나 이상으로부터, 또는 상기 설명의 관련 부분으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절, 기술적 용어 등이 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변동, 조합 및 순열을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속항인 어떠한 청구항도 동일한 기본 청구항에 종속적인 다른 청구항에서 발견된 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 더욱이, 청구항이 조성물을 인용하는 경우, 달리 표시되지 않는 한 또는 모순이나 불일치가 발생할 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하지 않는 한은, 본원에 개시된 목적 중 어느 것을 위하여 이러한 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본원에 개시된 제조 방법 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법 중 어느 것에 따라서 상기 조성물을 제조하는 방법이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
요소들이 목록으로서, 예를 들어 마쿠쉬(Markush) 군 형식으로 제시되는 경우에는, 이러한 요소들의 각 아군이 또한 개시되고, 어떠한 요소(들)도 이러한 군으로부터 제거될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는"은 부가의 요소 또는 단계의 봉입을 허용하고 개방하기 위한 것이란 사실에 주목해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특별한 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 것으로 지칭되는 경우, 본 발명 또는 본 발명의 측면의 특정 실시양태는 이러한 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 것으로 이해되어야 한다. 편의상, 이들 실시양태는 본원에서 그런 말로 구체적으로 제시되지 않았다. 따라서, 하나 이상의 요소, 특징, 단계 등을 포함하는 본 발명의 각 실시양태에 대하여, 본 발명은 또한, 이러한 요소, 특징, 단계 등으로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 실시양태를 제공한다.
범위가 제공되는 경우에는, 종말점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되지 않거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 맥락 및/또는 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 본 발명의 상이한 실시양태에서 언급된 범위 내의 모든 구체적 값 내지 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한은 이러한 범위의 하한치의 단위의 1/10을 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 달리 표시되지 않거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 맥락 및/또는 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로서 표현되는 값은 소정의 범위 내의 모든 아범위를 추정할 수 있는 것으로 이해되어야 하는데, 여기서 이러한 아범위의 종말점은 상기 범위의 하한치의 단위의 1/10과 동일한 정확도로 표현된다.
또한, 본 발명의 특별한 어떠한 실시양태도 어떠한 하나 이상의 청구항으로부터도 명백하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위 내의 어떠한 값도 어떠한 하나 이상의 청구항으로부터도 명백하게 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 어떠한 실시양태, 요소, 특징, 적용 또는 측면도 어떠한 하나 이상의 청구항으로부터도 배제될 수 있다. 간결성을 위해, 하나 이상의 요소, 특징, 목적 또는 측면이 배제되는 모든 실시양태가 본원에 명백하게 제시되지 않는다.
표
표 1. Cas9:CLTA4 sgRNA에 의해 유도된 세포성 변형. 효소 제한 조건 또는 효소 포화 조건 하에서 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA 시험관내 선별에서 강화되었던 33개의 인간 게놈 DNA 서열을 확인하였다. 밑줄친 부위는 HEK293T 세포에서 유의적인 Cas9:sgRNA-매개된 변형과 일치하는 삽입 또는 결실 (삽입-결실)을 함유한다. Cas9:CLTA4 v1.0 sgRNA 또는 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA를 이용한 선별에 대한 시험관내 강화 값이, 3개 이하의 돌연변이를 수반한 서열에 대해 제시되어 있다. 적은 수의 시험관내 선별 서열 계수치로 인해, 4개 이상의 돌연변이를 수반한 서열에 대해서는 강화 값을 계산하지 않았다. sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA4 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA4 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포에서의 변형 빈도 (삽입-결실을 수반한 서열의 수를 서열 총수로 나눈다). sgRNA를 수반하지 않은 Cas9로 처리된 세포와 비교해서 v1.0 sgRNA-처리된 세포 또는 v2.1 sgRNA-처리된 세포에서의 유의적인 변형을 나타내는 부위에 대한 P-값이 열거되어 있다. "시험되지 않음 (n.t.)"은 게놈 서열의 PCR이 특이적 증폭 생성물을 제공하지 못하였다는 것을 표시한다.
표 2: 미가공 선별 서열 계수치. 위치 -4 내지 -1은 20개-염기 쌍 표적 부위 앞에 있는 4개의 뉴클레오티드이다. PAM1, PAM2, 및 PAM3은 표적 부위 바로 다음에 있는 PAM 위치이다. 위치 +4 내지 +7은 PAM 바로 다음의 4개 뉴클레오티드이다.
표 3: CLTA1 표적을 벗어난 게놈 서열. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA 시험관내 선별에서 강화되었던 20개의 인간 게놈 DNA 서열을 확인하였다. "m"은 소분자로 나타낸 돌연변이를 수반한 표적에 적중한 서열로부터의 돌연변이 수를 지칭한다. 밑줄친 부위는 HEK293T 세포에서 유의적인 Cas9:sgRNA-매개된 변형과 일치하는 삽입 또는 결실 (삽입-결실)을 함유한다. 각 부위에 대한 인간 게놈 좌표가 제시된다 (어셈블리 GRCh37). CLTA1-0-1이 2개의 유전자 자리에 존재하고, 서열 계수치를 양 유전자 자리로부터 풀링하였다. sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA1 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA1 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포로부터의 각 부위에 대하여 증폭되고 서열 분석된 DNA에 대한 서열 계수치가 제시되어 있다.
표 4: CLTA4 표적을 벗어난 게놈 서열. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA 시험관내 선별에서 강화되었던 33개의 인간 게놈 DNA 서열을 확인하였다. "m"은 소분자로 나타낸 돌연변이를 수반한 표적에 적중한 서열로부터의 돌연변이 수를 지칭한다. 밑줄친 부위는 HEK293T 세포에서 유의적인 Cas9:sgRNA-매개된 변형과 일치하는 삽입 또는 결실 (삽입-결실)을 함유한다. 각 부위에 대한 인간 게놈 좌표가 제시된다 (어셈블리 GRCh37). sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA4 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA4 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포로부터의 각 부위에 대하여 증폭되고 서열 분석된 DNA에 대한 서열 계수치가 제시되어 있다.
표 5: CLTA1 및 CLTA4 표적을 벗어난 부위의 게놈 좌표. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA 및 Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA 시험관내 선별에서 강화되었던 54개의 인간 게놈 DNA 서열을 확인하였다. 각 부위에 대한 인간 게놈 좌표가 제시된다 (어셈블리 GRCh37).
표 6: Cas9:CLTA1 sgRNA에 의해 유도된 세포성 변형. 효소 제한 조건 또는 효소 과잉 조건 하에서 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA 시험관내 선별에서 강화되었던 20개의 인간 게놈 DNA 서열을 확인하였다. 밑줄친 부위는 HEK293T 세포에서 유의적인 Cas9:sgRNA-매개된 변형과 일치하는 삽입 또는 결실 (삽입-결실)을 함유한다. Cas9:CLTA1 v1.0 sgRNA 또는 Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA를 이용한 선별에 대한 시험관내 강화 값이, 3개 이하의 돌연변이를 수반한 서열에 대해 제시되어 있다. 적은 수의 시험관내 선별 서열 계수치로 인해, 4개 이상의 돌연변이를 수반한 서열에 대해서는 강화 값을 계산하지 않았다. sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA1 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA1 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포에서의 변형 빈도 (삽입-결실을 수반한 서열의 수를 서열 총수로 나눈다). sgRNA를 수반하지 않은 Cas9로 처리된 세포와 비교해서 v1.0 sgRNA-처리된 세포 또는 v2.1 sgRNA-처리된 세포에서의 유의적 변형을 나타내는 부위의 P-값이 CLTA1-0-1에 대해서는 1.1E-05 (v1.0) 및 6.9E-55 (v2.1)이고, CLTA1-1-1에 대해서는 2.6E-03 (v1.0) 및 2.0E-10 (v2.1)이며, CLTA1-2-2에 대해서는 4.6E-08 (v2.1)이었다. P-값은 한쪽으로 치우친 피셔의 직접 확률 시험을 이용하여 계산하였다. "시험되지 않음 (n.t.)"은 그 부위가 시험되지 않았거나 또는 게놈 서열의 PCR이 특이적 증폭 생성물을 제공하지 못하였다는 것을 표시한다.
표 7: CLTA1 표적을 벗어난 게놈 삽입-결실 서열. 표적에 적중한 게놈 서열 (CLTA1-0-1)에 대해 증폭되고 서열 분석된 DNA로 처리된 세포로부터의 삽입 및 결실 함유 서열, 및 sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA1 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA1 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포로부터의 각각의 변형된 표적을 벗어난 부위. "ref"는 각 부위에 대한 인간 게놈 참조 서열을 지칭하고, 변형된 부위가 다음에 열거되어 있다. 표적에 적중한 게놈 서열을 기준으로 한 돌연변이가 소문자로 제시되어 있다. 삽입 및 결실은 각각 밑줄친 볼드체 또는 대시로 제시되어 있다. 대조군 (sgRNA 없음)과 비교해서 변형된 서열의 통계상 유의적 강화를 나타내는 조건 (v1.0 sgRNA 또는 v2.1 sgRNA)에 대한 변형 비율 (%)이 제시되어 있다.
표 8: CLTA4 표적을 벗어난 게놈 삽입-결실 서열. 표적에 적중한 게놈 서열 (CLTA4-0-1)에 대해 증폭되고 서열 분석된 DNA로 처리된 세포로부터의 삽입 및 결실 함유 서열, 및 sgRNA를 수반하지 않은 Cas9 ("sgRNA 없음"), CLTA4 v1.0 sgRNA를 수반한 Cas9, 또는 CLTA4 v2.1 sgRNA를 수반한 Cas9로 처리된 HEK293T 세포로부터의 각각의 변형된 표적을 벗어난 부위. "ref"는 각 부위에 대한 인간 게놈 참조 서열을 지칭하고, 변형된 부위가 다음에 열거되어 있다. 표적에 적중한 게놈 서열을 기준으로 한 돌연변이가 소문자로 제시되어 있다. 삽입 및 결실은 각각 밑줄친 볼드체 또는 대시로 제시되어 있다. 대조군 (sgRNA 없음)과 비교해서 변형된 서열의 통계상 유의적 강화를 나타내는 조건 (v1.0 sgRNA 또는 v2.1 sgRNA)에 대한 변형 비율 (%)이 제시되어 있다.
표 9: 본 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드. 모든 올리고뉴클레오티드는 인티그레티드 DNA 테크놀로지로부터 구입하였다. 별표 (*)는 선행 뉴클레오티드가 이러한 선행 뉴클레오티드에 상응하는 포스포르아미다이트 79 몰%와 다른 3개 정규 포스포르아미다이트 각각의 4 몰%로 이루어진 포스포르아미다이트의 수동 혼합물로서 혼입되었다는 것을 표시한다. "/5Phos/"는 합성 동안 설치된 5' 포스페이트 기를 의미한다.
<표 1>
<표 2>
<표 3>
<표 4>
<표 5>
<표 6>
<표 7>
<표 8>
<표 9>
참고문헌
상기 열거된 항목을 포함한, 본원에 언급된 모든 공개 공보, 특허 및 서열 데이터베이스 목록은 마치 각각의 개별 공개 공보 또는 특허가 특이적이고도 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되었던 것처럼 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 분쟁이 있는 경우, 본원의 모든 정의를 포함한 본 출원이 우선할 것이다.
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 5
agatattgca gatgtagtgt ttccacaggg tggctcttca gtgcacca 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 6
taatcctact cagtgaagct cttcacagtc attggattaa ttatgttg 48
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 7
caacataatt aatccaatga ctgtgaagag cttcactgag taggatta 48
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 8
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 9
cctgcttgag ggagatgagg act 23
<210> 10
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 10
gaguccucau cucccucaag cguuuuagag cuagaaauag cuuaaaauaa ggcuaguccg 60
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 11
ctccctcaag caggccccgc tgg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 12
ccagcggggc ctgcttgagg gag 23
<210> 13
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 13
gcucccucaa gcaggccccg cguuuuagag cuagaaauag cuuaaaauaa ggcuaguccg 60
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 14
tgtgaagagc ttcactgagt agg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 15
cctactcagt gaagctcttc aca 23
<210> 16
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 16
gugugaagag cuucacugag uguuuuagag cuagaaauag cuuaaaauaa ggcuaguccg 60
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 17
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 18
ccctgtggaa acactacatc tgc 23
<210> 19
<211> 60
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 19
ggcagaugua guguuuccac aguuuuagag cuagaaauag cuuaaaauaa ggcuaguccg 60
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 20
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 21
cctgcttgag ggagatgagg act 23
<210> 22
<211> 73
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 22
gaguccucau cucccucaag cguuuuagag cuaugcugaa aagcauagcu uaaaauaagg 60
cuaguccguu auc 73
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 23
ctccctcaag caggccccgc tgg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 24
ccagcggggc ctgcttgagg gag 23
<210> 25
<211> 73
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 25
gcucccucaa gcaggccccg cguuuuagag cuaugcugaa aagcauagcu uaaaauaagg 60
cuaguccguu auc 73
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 26
tgtgaagagc ttcactgagt agg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 27
cctactcagt gaagctcttc aca 23
<210> 28
<211> 73
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 28
gugugaagag cuucacugag uguuuuagag cuaugcugaa aagcauagcu uaaaauaagg 60
cuaguccguu auc 73
<210> 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 29
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 30
ccctgtggaa acactacatc tgc 23
<210> 31
<211> 73
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 31
ggcagaugua guguuuccac aguuuuagag cuaugcugaa aagcauagcu uaaaauaagg 60
cuaguccguu auc 73
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
ctccctcaag caggccccgc ngg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 33
gcagatgtag tgtttccaca ngg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 34
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 35
gaagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 36
gaagatgtag tgtttccact ggg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 37
gcagatggag ggtttccaca ggg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 38
gcagatgtag tgttaccaga ggg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 39
ggggatgtag tgtttccact ggg 23
<210> 40
<211> 4104
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 40
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg attataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg gcagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggcag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa atctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtagagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga gaaatggctt gtttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg attgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatagt gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaagc gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgagggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggcgcct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agataggggg atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga tattcaaaaa gcacaggtgt ctggacaagg ccatagttta 2160
catgaacaga ttgctaactt agctggcagt cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaaattg ttgatgaact ggtcaaagta atggggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280
gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340
aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400
gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctacaaaa tggaagagac 2460
atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520
gttccacaaa gtttcattaa agacgattca atagacaata aggtactaac gcgttctgat 2580
aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640
tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700
aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760
gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820
aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880
ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940
catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3000
ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060
attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 3120
atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 3180
ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 3240
acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 3300
acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 3360
cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 3420
tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 3480
gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 3540
ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 3600
agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660
aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720
tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780
cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840
ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900
atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctccc 3960
gctgctttta aatattttga tacaacaatt gatcgtaaac gatatacgtc tacaaaagaa 4020
gttttagatg ccactcttat ccatcaatcc atcactggtc tttatgaaac acgcattgat 4080
ttgagtcagc taggaggtga ctga 4104
<210> 41
<211> 1367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polypeptide
<400> 41
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Asp Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Gly Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Ile Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Ala Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Gly Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly His Ser Leu
705 710 715 720
His Glu Gln Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val
980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1025 1030 1035
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr
1055 1060 1065
Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
1070 1075 1080
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu
1085 1090 1095
Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg
1100 1105 1110
Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys
1115 1120 1125
Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu
1130 1135 1140
Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe
1160 1165 1170
Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu
1175 1180 1185
Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe
1190 1195 1200
Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu
1205 1210 1215
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn
1220 1225 1230
Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1265 1270 1275
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
1280 1285 1290
Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile
1295 1300 1305
Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe
1310 1315 1320
Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1340 1345 1350
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 42
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 42
aacacatggg tcgacacaaa cacaactcgg caggtacttg cagatgtagt ctttccacat 60
gggtcgacac aaacacaact cggcaggtat ctcgtatgcc 100
<210> 43
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<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ctcggcaggt 10
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 44
acttgcagat gtagtctttc cacatgggtc gacacaaaca caa 43
<210> 45
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 45
tgtgtttgtg tt 12
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 46
agaagaagaa ga 12
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<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 47
ttctctttct ct 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 48
acacaaacac aa 12
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 49
acttgcagat gtagtctttc cacatgggtc gacacaaaca caa 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 50
acttgcagat gtagtctttc cacatgggtc g 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 51
aacacatggg tcgacacaaa cacaactcgg caggtacttg cagatgtagt ctttccacat 60
gggtcgacac aaacacaact cggcaggtat ctcgtatgcc 100
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 52
caatctcccg catgcgctca gtcctcatct ccctcaagca ggccccgctg gtgcactgaa 60
gagccaccct gtgaaacact acatctgcaa tatcttaatc ctactcagtg aagctcttca 120
cagtcattgg attaattatg ttgagttctt ttggaccaaa cc 162
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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gctggtgcac tgaagagcca 20
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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aatatcttaa tcctactcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ccctgtgaaa cactacatct gc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 56
gcagatgtag tgtttcacag gg 22
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<213> Artificial Sequence
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gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
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gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
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acatatgtag tatttccaca ggg 23
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<213> Artificial Sequence
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gcagttttag tgttttcaca ggg 23
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<212> DNA
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gcagagttag tgtttccaca cag 23
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<213> Artificial Sequence
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gcagatggag ggttttcaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ggaaatttag tgtttccaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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aaagaagtag tatttccaca tgg 23
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<212> DNA
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aaagatgtag tcattccaca agg 23
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aaatatgtag tctttccaca ggg 23
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atagatgtag tgtttccaaa gga 23
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ccagaggtag tgctcccaca ggg 23
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ccagatgtga ggtttccaca agg 23
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
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ctacatgtag tgtttccata tgg 23
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tagatgaagt gcttccacat gg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcaaatgtat tatttccact agg 23
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gcagcttaag tgttttcaca tgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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ttacatgtag tgtttacaca cgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 80
gaagaggaag tgtttgccca ggg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 81
gaagatgtgg agttgacaca tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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gcagaagtac tgttgttaca agg 23
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gcagatgtgg aattacaaca ggg 23
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<212> DNA
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<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 84
gcagtcatag tgtatacaca tgg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 85
taagatgtag tatttccaaa agt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gcagctggca tttctccaca cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 87
ggagatctga tggttctaca agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 88
taaaatgcag tgtatccata tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 89
gccagaatag tttttcaaca agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 90
ttgtatttag agattgcaca agg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 91
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 92
agtcctcaac tccctcaagc agg 23
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<212> DNA
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<220>
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<400> 93
agccctcatt tccctcaagc agg 23
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<212> DNA
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<400> 94
actcctcatc cccctcaagc cgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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agtcatcatc tccctcaagc aga 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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cgtcctcctc tcccccaagc agg 23
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<212> DNA
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tgtcctcttc tccctcaagc aga 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 98
aagcttcatc tctctcaagc tgg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 99
agtactcttt tccctcaggc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 100
agtcttaaat tccctcaagc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 101
agtgctcatc taccagaagc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 102
cctcctcatc tccctgcagc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 103
ctacatcatc tccctcaagc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 104
ggtcctcatc tccctaaaac aga 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 105
tgtcctcatc ggcctcaggc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 106
agacaccatc tcccttgagc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 107
aggcatcatc tacatcaagt tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 108
agtaatcact tccatcaagc cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 109
tcccctcacc tccctaaagc agg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 110
tgtctttatt tccctctagc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 111
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 112
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 113
acatatgtag tatttccaca ggg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 114
gcatatgtag tgtttccaaa tgt 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 115
ccagatgtag tattcccaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 116
gcagttttag tgttttcaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 117
gcagagttag tgtttccaca cag 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 118
gcagatggag ggttttcaca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 119
ggaaatttag tgtttccaca ggg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 120
aaagaagtag tatttccaca tgg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 121
aaagatgtag tcattccaca agg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 122
aaatatgtag tctttccaca ggg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 123
atagatgtag tgtttccaaa gga 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 124
ccagaggtag tgctcccaca ggg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 125
ccagatgtga ggtttccaca agg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 126
ctacatgtag tgtttccata tgg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 127
ctagatgaag tgcttccaca tgg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 128
gaaaatggag tgtttacaca tgg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 129
gcaaatgaag tgtcaccaca agg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 130
gcaaatgtat tatttccact agg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 131
gcagatgtag cttttgtaca tgg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 132
gcagcttaag tgttttcaca tgg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 133
ttacatgtag tgtttacaca cgg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 134
gaagaggaag tgtttgccca ggg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 135
gaagatgtgg agttgacaca tgg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 136
gcagaagtac tgttgttaca agg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 137
gcagatgtgg aattacaaca ggg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 138
gcagtcatag tgtatacaca tgg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 139
taagatgtag tatttccaaa agt 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 140
gcagctggca tttctccaca cgg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 141
ggagatctga tggttctaca agg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 142
taaaatgcag tgtatccata tgg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 143
gccagaatag tttttcaaca agg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 144
ttgtatttag agattgcaca agg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 145
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 146
agtcctcaac tccctcaagc agg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 147
agccctcatt tccctcaagc agg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 148
actcctcatc cccctcaagc cgg 23
<210> 149
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 149
agtcatcatc tccctcaagc aga 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 150
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<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 151
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<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 152
aagcttcatc tctctcaagc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 153
agtactcttt tccctcaggc tgg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 154
agtcttaaat tccctcaagc agg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 155
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 156
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 157
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 158
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 160
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 161
aggcatcatc tacatcaagt tgg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 162
agtaatcact tccatcaagc cgg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 163
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<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 164
tgtctttatt tccctctagc tgg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 165
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 166
agtcctcatc tccctcaagc agg 23
<210> 167
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 167
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 168
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 169
agtcctcatc tccctcatag cagg 24
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 170
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 171
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<210> 172
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 172
agtcctcaag cagg 14
<210> 173
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 173
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<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 174
agtcctcatc tccctcatta gcagg 25
<210> 175
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 175
agtcctcatc tccctcaggg cttgtttaca gctcaccttt gaatttgcac aagcgtgcaa 60
gcagg 65
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 176
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<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 177
agtcctcatc cctcaagcag g 21
<210> 178
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 178
agtcctcatc tccctaagca gg 22
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 179
agtcctcaac tccctcaagc agg 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 180
agtcctcaac tccctcaaag cagg 24
<210> 181
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 181
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<210> 182
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 182
agtcctcaac tccctcagca gg 22
<210> 183
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 183
agtcctcaac tccctcaaga aaggtgttga aaatcagaaa gagagaaaca agcagg 56
<210> 184
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 184
agtcctcaac tccctcaatc tacggtccat tcccgtttcc actcaccttg cgccgcagca 60
gg 62
<210> 185
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 185
agtcctcaac tccctaagca gg 22
<210> 186
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 186
agtcctcaac tccctcaacc aactttaaca tcctgctggt tctgtcatta ataagttgaa 60
agcagg 66
<210> 187
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 187
agtcctcaac tccctcacag caaataaaaa agttgtttat gcatattcag ataagcaaag 60
cagg 64
<210> 188
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 188
agtcctcaac tcccaagcag g 21
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 189
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 190
actcctcatc cccctcaaag ccgg 24
<210> 191
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 191
actcctcatc cccctcagag ccgg 24
<210> 192
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 192
actcctcagc cgg 13
<210> 193
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 193
actcctcatc cccctcaaaa gccgg 25
<210> 194
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 194
actcctcatc cccctcagca gccgg 25
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 195
actcctcatc cccctcatag ccgg 24
<210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 196
actcctcatc cccctcatcc ccgg 24
<210> 197
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 197
actcctcatc ccagccgg 18
<210> 198
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 198
actcctcatc cccctaagcc gg 22
<210> 199
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 199
actcctcatc cccctcaata gccgg 25
<210> 200
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 200
actcctcacc cccctcagca gccgg 25
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 201
gcagatgtag tgtttccaca ggg 23
<210> 202
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 202
gcagatgtag tgtttcacag gg 22
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 203
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<210> 204
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 204
gcagatgtag tgcacaggg 19
<210> 205
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 205
gcagatgtag tgtttcccag gg 22
<210> 206
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 206
gcagatgtac acaggg 16
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 207
gcagatgtag tgtcacaggg 20
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 208
gcagatgtag tgttcacagg g 21
<210> 209
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 209
gcagatgtag tgtttccagg g 21
<210> 210
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 210
gcagatgtag tcacaggg 18
<210> 211
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 211
gcagatgtag gg 12
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 212
acatatgtag tatttccaca ggg 23
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 213
acatatgtag tatttcccac aggg 24
<210> 214
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 214
acatatgtag tatttcacag gg 22
<210> 215
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 215
acatatgtag tatttccagg g 21
<210> 216
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 216
acatatcaca ggg 13
<210> 217
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 217
acatcacagg g 11
<210> 218
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 218
acatatgtag tcacaggg 18
<210> 219
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 219
acatatgtag tatttcc 17
<210> 220
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 220
acatatgtag gg 12
<210> 221
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 221
acatatgtag cacaggg 17
<210> 222
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 222
ccagatgtag tattcccaca ggg 23
<210> 223
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 223
ccagatgtag tattccccac aggg 24
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 224
ccagatgtag tatacaggg 19
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 225
ccagatgtag tatcacaggg 20
<210> 226
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 226
ccagatgtag tattcccaac acaggg 26
<210> 227
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 227
ccagatgtag tattcacagg g 21
<210> 228
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 228
ccagatgtag tattcccagg g 21
<210> 229
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 229
ccagatgtag tattccacag gg 22
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 230
ctagatgaag tgcttccaca tgg 23
<210> 231
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 231
ctagatgaag tgcttcccac atgg 24
<210> 232
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 232
ctagatgaag tgcttcacat gg 22
<210> 233
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 233
ctagatgaag tg 12
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 234
ctagatgaag tgcttccaca catgg 25
<210> 235
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 235
ctagatgaag tgcttccatg g 21
<210> 236
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 236
ctagatgaag tgcttcccat gg 22
<210> 237
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 237
taatacgact cactatagga gtcctcatct ccctcaagcg ttttagagct atgctg 56
<210> 238
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 238
taatacgact cactataggc tccctcaagc aggccccgcg ttttagagct atgctg 56
<210> 239
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 239
taatacgact cactataggt gtgaagagct tcactgagtg ttttagagct atgctg 56
<210> 240
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 240
taatacgact cactataggg cagatgtagt gtttccacag ttttagagct atgctg 56
<210> 241
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 241
gataacggac tagccttatt ttaacttgct atgcttttca gcatagctct aaaac 55
<210> 242
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 242
cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa acgcttgagg gagatgagga 60
ctcctatagt gagtcgtatt a 81
<210> 243
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 243
cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa acgcggggcc tgcttgaggg 60
agcctatagt gagtcgtatt a 81
<210> 244
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 244
cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa acactcagtg aagctcttca 60
cacctatagt gagtcgtatt a 81
<210> 245
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 245
cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa actgtggaaa cactacatct 60
gccctatagt gagtcgtatt a 81
<210> 246
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 246
taatacgact cactatagg 19
<210> 247
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 247
aacacannnn ccngcttgag ggagatgagg actnnnnacc tgccgagaac aca 53
<210> 248
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 248
tcttctnnnn ccngcggggc ctgcttgagg gagnnnnacc tgccgagtct tct 53
<210> 249
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 249
agagaannnn ccnactcagt gaagctcttc acannnnacc tgccgagaga gaa 53
<210> 250
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(10)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(37)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 250
ttgtgtnnnn ccntgtggaa acactacatc tgcnnnnacc tgccgagttg tgt 53
<210> 251
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 251
ctagcagtcc tcatctccct caagcaggc 29
<210> 252
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 252
agctgcctgc ttgagggaga tgaggactg 29
<210> 253
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 253
ctagtctccc tcaagcaggc cccgctggt 29
<210> 254
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 254
agctaccagc ggggcctgct tgagggaga 29
<210> 255
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 255
ctagctgtga agagcttcac tgagtagga 29
<210> 256
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 256
agcttcctac tcagtgaagc tcttcacag 29
<210> 257
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 257
ctagtgcaga tgtagtgttt ccacagggt 29
<210> 258
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
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agctaccctg tggaaacact acatctgca 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 259
gcgacacgga aatgttgaat actcat 26
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 260
ggagtcaggc aactatggat gaacg 25
<210> 261
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 261
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgcag atgtagtgtt tccacagggt 60
<210> 262
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 262
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgaag atgtagtgtt tccacagggt 60
<210> 263
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 263
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgaag atgtagtgtt tccactgggt 60
<210> 264
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 264
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgcag atggagggtt tccacagggt 60
<210> 265
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 265
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgcag atgtagtgtt accagagggt 60
<210> 266
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 266
actgtgaaga gcttcactga gtaggattaa gatattgggg atgtagtgtt tccactgggt 60
<210> 267
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 267
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc tgtggaaaca ctacatctgc 60
<210> 268
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 268
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc tgtggaaaca ctacatcttc 60
<210> 269
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 269
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc agtggaaaca ctacatcttc 60
<210> 270
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 270
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc tgtggaaacc ctccatctgc 60
<210> 271
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 271
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc tctggtaaca ctacatctgc 60
<210> 272
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 272
tccctcaagc aggccccgct ggtgcactga agagccaccc agtggaaaca ctacatcccc 60
<210> 273
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 273
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctaa 60
ca 62
<210> 274
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 274
tgttagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgtaga tctcggtgg 49
<210> 275
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 275
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttt 60
ca 62
<210> 276
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 276
tgaaagatcg gaagagcgtc gtgtagggaa agagtgtaga tctcggtgg 49
<210> 277
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 277
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 278
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 278
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgtagatctc ggtgg 45
<210> 279
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 279
gacggcatac gagat 15
<210> 280
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 280
aacaatctcg tatgccgtct tctgcttg 28
<210> 281
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 281
tcttatctcg tatgccgtct tctgcttg 28
<210> 282
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 282
agagatctcg tatgccgtct tctgcttg 28
<210> 283
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 283
ttgtatctcg tatgccgtct tctgcttg 28
<210> 284
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 284
caagcagaag acggcatacg agattgtgtt ctcggcaggt 40
<210> 285
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 285
caagcagaag acggcatacg agatagaaga ctcggcaggt 40
<210> 286
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 286
caagcagaag acggcatacg agatttctct ctcggcaggt 40
<210> 287
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 287
caagcagaag acggcatacg agatacacaa ctcggcaggt 40
<210> 288
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 288
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 289
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(62)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 289
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnacctacct gccgagaaca ca 82
<210> 290
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(62)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 290
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnacctacct gccgagtctt ct 82
<210> 291
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(62)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 291
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnacctacct gccgagagag aa 82
<210> 292
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(62)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 292
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnacctacct gccgagttgt gt 82
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 293
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 294
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 294
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaagtct agcaagcagg cca 53
<210> 295
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 295
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcaggcac tgagtgggaa agt 53
<210> 296
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 296
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttaacccc aagtcagcaa gca 53
<210> 297
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 297
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttgctgg tcaataccct ggc 53
<210> 298
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 298
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgagtac ccctgaaatg ggc 53
<210> 299
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 299
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcgctac caatcagggc ttt 53
<210> 300
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 300
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctccattgc cacttgtttg cat 53
<210> 301
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 301
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcctaccc ccacaacttt gct 53
<210> 302
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 302
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtgtaca tccagtgcac cca 53
<210> 303
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 303
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttcggaaa ggactttgaa tacttgt 57
<210> 304
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 304
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcggccca agacctcatt cac 53
<210> 305
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 305
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgtcctct ctggggcaga agt 53
<210> 306
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 306
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctagctgag tcatgagttg tctcc 55
<210> 307
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 307
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctgccag cttctcacac cat 53
<210> 308
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 308
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctctgaagg acaaaggcgg gaa 53
<210> 309
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 309
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggtgc taaaggctcc acg 53
<210> 310
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 310
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaccatt ggtgagccca gag 53
<210> 311
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 311
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttttttcg ggcaactgct cac 53
<210> 312
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 312
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcaagcc ttctctcctc aga 53
<210> 313
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 313
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacacaaa cttccctgag accc 54
<210> 314
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 314
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgagtta gccctgctgt tca 53
<210> 315
<211> 55
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<213> Artificial Sequence
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<400> 399
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctacttcc ttccttttga gaccaagt 58
<210> 400
<211> 54
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 400
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcggca gattcctggt gatt 54
<210> 401
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 401
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggtcac catcagcaca gtca 54
<210> 402
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 402
caagcagaag acggcatacg agatatatca gtgtgactgg agttcagacg tgtgct 56
<210> 403
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 403
caagcagaag acggcatacg agattttcac cggtgactgg agttcagacg tgtgct 56
<210> 404
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 404
caagcagaag acggcatacg agatccactc atgtgactgg agttcagacg tgtgct 56
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 405
caagcagaag acggcatacg agattacgta cggtgactgg agttcagacg tgtgct 56
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 406
caagcagaag acggcatacg agatcgaaac tcgtgactgg agttcagacg tgtgct 56
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<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 407
caagcagaag acggcatacg agatatcagt atgtgactgg agttcagacg tgtgct 56
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<211> 57
<212> DNA
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<220>
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<400> 408
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ttactcgaca ctctttccct acacgac 57
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 409
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ccggagaaca ctctttccct acacgac 57
<210> 410
<211> 57
<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 410
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gctcattaca ctctttccct acacgac 57
Claims (80)
- (a) 이중 가닥 핵산 표적 부위를 커팅하는 뉴클레아제를 제공하며, 여기서 이러한 표적 부위의 커팅으로 인해, 5' 포스페이트 모이어티를 포함하는 커팅된 핵산 가닥이 생성되는 단계;
(b) 단계 (a)의 뉴클레아제를, 이러한 뉴클레아제가 후보 뉴클레아제 표적 부위에서 후보 핵산 분자를 커팅하여 커팅되지 않은 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는 커팅된 말단을 형성하기에 적합한 조건 하에, 후보 핵산 분자의 라이브러리와 접촉시키며, 여기서 각 후보 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 10 내지 80개 뉴클레오티드의 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머를 포함하는 것인 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 뉴클레아제에 의해 커팅되었던 핵산 가닥 상의 커팅되지 않은 뉴클레아제 표적 부위를 커팅된 말단으로부터 단일 연속 판독으로 직접 서열 분석함으로써, 단계 (b)에서의 뉴클레아제에 의해 커팅된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계
를 포함하는, 뉴클레아제의 표적 부위를 확인하는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (c) 전에, 핵산 적응인자를 후보 핵산 분자 상의 커팅된 말단에 결찰시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 직접 서열 분석하는 단계가 핵산 적응인자로부터 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계가 커팅된 절반-부위의 서열로부터 표적 부위의 컴퓨터를 이용한 재구축을 요구하지 않는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 커팅된 말단이 평활 커팅된 말단인 방법.
- 제1항에 있어서, 커팅된 말단이 5'-오버행을 갖는 점착성 커팅된 말단인 방법.
- 제2항에 있어서, 결찰이 5'-포스페이트-의존성 결찰 반응인 방법.
- 제6항에 있어서, 5'-오버행을 충전시켜 평활 말단을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 핵산 분자의 라이브러리가 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상 또는 1012개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 질환과 연관된 유전자 내의 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하는 치료용 뉴클레아제인 방법.
- 제10항에 있어서, 특이적 뉴클레아제 표적 부위를 커팅하고, 10개 초과, 5개 초과, 4개 초과, 3개 초과, 2개 초과, 1개 초과 또는 어떠한 부가의 뉴클레아제 표적 부위도 커팅하지 않는 치료용 뉴클레아제의 최대 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 뉴클레아제가 RNA 분자와 복합체를 형성하는 RNA-유도된 뉴클레아제이고, 이러한 뉴클레아제:RNA 복합체가 상기 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제인 방법.
- 제12항에 있어서, RNA 분자가 단일-유도 RNA (sgRNA)인 방법.
- 제14항에 있어서, sgRNA가 RNA 분자의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열에 상보적인 15 내지 25개, 19 내지 21개, 또는 20개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 뉴클레아제 표적 부위가 [sgRNA-상보성 서열]-[프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)] 구조를 포함하고, 뉴클레아제가 상기 sgRNA-상보성 서열 내의 표적 부위를 커팅하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, sgRNA-상보성 서열이 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 비특이적 핵산 절단 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 뉴클레아제가 절단 도메인 이량체화시 표적 서열을 절단하는 핵산 절단 도메인; 핵산 서열과 특이적으로 결합하는 결합성 도메인; 및 FokI 절단 도메인 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 결합성 도메인이 아연 핑거를 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 결합성 도메인이 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아연 핑거를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 결합성 도메인이 전사 활성인자-유사 요소 (TALE)를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 전사 활성인자-유사 요소 뉴클레아제 (TALEN)인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 유기 화합물을 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 유기 화합물이 항생제인 방법.
- 제24항에 있어서, 유기 화합물이 다이네미신, 네오카르지노스타틴, 칼리케아미신, 에스페라미신, 블레오미신, 에네다인 또는 그의 유도체인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 귀소 엔도뉴클레아제인 방법.
- (a) 동일한 컨센서스 서열을 커팅하는 복수 개의 후보 뉴클레아제를 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)의 각각의 후보 뉴클레아제에 대하여, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 컨센서스 표적 부위와 상이한 후보 뉴클레아제에 의해 절단된 뉴클레아제 표적 부위를 확인하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 확인된 뉴클레아제 표적 부위(들)에 근거하여 뉴클레아제를 선별하는 단계
를 포함하는, 복수 개의 뉴클레아제로부터 컨센서스 표적 부위를 특이적으로 커팅하는 뉴클레아제를 선별하는 방법. - 제28항에 있어서, 단계 (c)에서 선별된 뉴클레아제가 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제인 방법.
- 제29항에 있어서,
(i) 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제가 상기 컨센서스 부위와 상이한 가장 적은 수의 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제이거나, 또는
(ii) 가장 높은 특이성을 지닌 컨센서스 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제가 표적 게놈의 맥락에서 상기 컨센서스 부위와 상이한 가장 적은 수의 표적 부위를 절단하는 후보 뉴클레아제인
방법. - 제29항에 있어서, 단계 (c)에서 선별된 후보 뉴클레아제가 뉴클레아제의 치료상 유효 농도에서 대상체의 게놈 내의 컨센서스 표적 부위 이외의 어떠한 표적 부위도 절단하지 않는 뉴클레아제인 방법.
- 제28항에 있어서, 게놈을 단계 (c)에서 선별된 뉴클레아제와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 게놈이 척추동물, 포유류, 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 염소, 양, 소, 개, 고양이, 파충류, 양서류, 어류, 선충, 곤충 또는 파리 게놈인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 게놈이 살아있는 세포 내에 있는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 게놈이 대상체 내에 있는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 컨센서스 표적 부위가 질환 또는 장애와 연관되는 대립 유전자 내에 있는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, (i) 컨센서스 표적 부위의 절단이 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, (ii) 컨센서스 표적 부위의 절단이 질환 또는 장애의 증상을 완화하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 질환이 HIV/AIDS 또는 증식성 질환인 방법.
- 제38항에 있어서, 질환이 HIV/AIDS이고, 대립 유전자가 CCR5 대립 유전자인 방법.
- 제38항에 있어서, 질환이 증식성 질환이고, 대립 유전자가 VEGFA 대립 유전자인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 (c) 전에, 핵산 적응인자와 혼성화되는 PCR 프라이머 및 불변 삽입 서열과 혼성화되는 PCR 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 커팅된 핵산 분자의 단편을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 복수 개의 핵산 분자를 포함하며, 여기서 각 핵산 분자는 후보 뉴클레아제 표적 부위와 10 내지 80개 뉴클레오티드의 불변 삽입 서열을 포함하는 서열의 콘카테머를 포함하고, 후보 뉴클레아제 표적 부위는 RNA-유도된 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)에 의해 절단될 수 있는 것인 핵산 분자의 라이브러리.
- 제42항에 있어서, 후보 뉴클레아제 표적 부위가 [sgRNA-상보성 서열]-[PAM] 구조를 포함하는 Cas9 뉴클레아제 표적 부위이고, 여기서 sgRNA-상보성 서열은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 라이브러리.
- 제43항에 있어서, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상, 1010개 이상, 1011개 이상 또는 1012개 이상의 상이한 후보 뉴클레아제 표적 부위를 포함하는 라이브러리.
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