CN105658794B - 核酸酶概况分析系统 - Google Patents

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Abstract

本公开的一些方面提供了用于确定核酸酶靶位点偏好性和位点特异性内切核酸酶的特异性的策略、方法和试剂。本文中提供的一些方法利用了新的“单切割”策略来筛选包含候选核酸酶靶位点和恒定插入区的重复单元的多联体文库，经由对临近和等同于切割靶位点的完整靶位点测序，从而鉴定出可由感兴趣的核酸酶切割的文库成员。本公开的一些方面提供了基于测定位点特异性内切核酸酶的靶位点偏好性和特异性，用于选择位点特异性内切核酸酶的策略、方法和试剂。还提供了用于测定靶位点偏好性和特异性的方法和试剂。

Description

核酸酶概况分析系统
相关申请
本申请要求35U.S.C.§365(c)下对2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N 14/320,370和2014年6月30日提交的美国申请U.S.S.N 14/320,413的优先权，而且还要求35U.S.C.§119(e)下对2013年8月9日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/864,289的优先权，其各自通过提述并入本文。
政府支持
在美国政府支持下，本发明在国防高等研究计划署(Defense Advanced ResearchProjects Agency)资助的项目号HR0011-11-2-0003和N66001-12-C-4207下进行。美国政府对本发明具有某些权利。
发明背景
位点特异性内切核酸酶理论上允许靶向性操作基因组内的单个位点且可用于基因靶向以及治疗应用的背景中。在包括哺乳动物在内的多种生物体中，位点特异性内切核酸酶被用于基因组工程，其通过刺激非同源末端连接或同源重组进行。除了提供强大的研究工具以外，位点特异性核酸酶还具有作为基因治疗剂的潜力，而且最近两种位点特异性内切核酸酶进入临床试验：一种是CCR5-2246，其靶向人CCR-5等位基因，作为抗HIV治疗性办法的一部分(NCT00842634,NCT01044654,NCT01252641)，另一种是VF24684，其靶向人VEGF-A启动子，作为抗癌症治疗性办法的一部分(NCT01082926)。
对意图的核酸酶靶位点进行特异性切割而没有或仅有最小的脱靶活性是临床应用位点特异性内切核酸酶和基础研究应用中高效基因组操作的前提，因为工程化的位点特异性结合域的不完美的特异性与细胞毒性和意图靶物以外的基因组基因座的不想要的改变关联。然而，当前可获的大多数核酸酶展现出显著的脱靶活性，如此可能不适用于临床应用。因此，需要用于评估核酸酶特异性和以改进的特异性工程化核酸酶的技术。
发明概述
本公开的一些方面基于以下认知，即一些工程化的位点特异性内切核酸酶的报道的毒性基于脱靶DNA切割而不仅仅是脱靶结合。本公开的一些方面提供了评估和表征位点特异性核酸酶的序列特异性的策略、组合物、系统和方法，例如可RNA编程的(RNAprogrammable)内切核酸酶，如Cas9内切核酸酶、锌指核酸酶(ZNF)、归巢内切核酸酶、或转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。
在一些方面，本公开的策略、方法和试剂代表相对于用于测定核酸酶特异性的以前方法的改进。例如，一些先前报道的用于测定核酸酶靶位点特异性概况(profile)的方法(通过筛选包含候选靶位点的核酸分子文库)依赖于“两切割(two-cut)”体外选择方法，其需要从核酸酶对文库成员核酸的两次临近切割产生的两个半位点的序列间接重建靶位点(参见例如PCT申请WO 2013/066438；和Pattanayak,V.,Ramirez,C.L.,Joung,J.K.&Liu,D.R.Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases byin vitro selection.Nature methods 8,765-770(2011)，其各自完整内容通过提述并入本文)。与这类“两切割”策略相对的是，本公开的方法利用了优化的“单切割(one cut)”筛选策略，其允许鉴定出被核酸酶切割至少一次的文库成员。如本文中别处更详细解释的，本文中提供的“单切割”选择策略与单端高通量测序方法兼容且不需要从切割的半位点计算机重建处切割的靶位点，因此简化了核酸酶概况分析(profiling)过程。
本公开的一些方面提供了用于评估内切核酸酶的切割特异性和选择具有期望的特异性水平的核酸酶的体外选择方法。这类方法可用于例如表征感兴趣的内切核酸酶和用于鉴定展现出期望特异性水平的核酸酶，例如用于鉴定高度特异性内切核酸酶用于临床应用。
本公开的一些方面提供了鉴定与基因组内的任何其他位点充分不同的适宜核酸酶靶位点，以实现由给定的核酸酶进行特异性切割而没有任何或有至少最少的脱靶切割的方法。这类方法可用于鉴定出在基因组背景上能以高特异性切割的候选核酸酶靶位点，例如在选择用于体外或体内基因组操作的靶位点时。
本公开的一些方面提供评估、选择和/或设计相比于当前的核酸酶具有增强的特异性的位点特异性核酸酶的方法。例如，本文中提供了可用于选择和/或设计具有最小的脱靶切割活性的位点特异性核酸酶的方法，例如通过设计具有有降低的结合亲和力的结合域的变体核酸酶，通过降低核酸酶的终浓度，通过选择与其在基因组中的亲缘性最密切的序列相差至少3个碱基对的靶位点，以及在可RNA编程的核酸酶的情况中，通过选择产生最少的被结合和/或切割的脱靶位点的导引RNA。
还提供了可用于实践本发明中描述的方法的组合物和试剂盒。
本公开的一些方面提供了用于鉴定核酸酶的靶位点的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5’磷酸模块的经切割的核酸链；(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在适合所述核酸酶切割包含所述核酸酶的靶位点的候选核酸分子的条件下接触，其中每个核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和恒定的插入序列；和(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过测定在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点的序列。在一些实施方案中，所述核酸酶创建平末端。在一些实施方案中，所述核酸酶创建5′突出。在一些实施方案中，步骤(c)的测定包括经由5’-磷酸依赖性连接将第一核酸接头连接至在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链的5’端。在一些实施方案中，核酸接头以双链形式提供。在一些实施方案中，5′-磷酸依赖性连接是平端连接。在一些实施方案中，所述方法包括在将第一核酸接头连接到被核酸酶切割的核酸链之前，在5′突出中填补。在一些实施方案中，步骤(c)的测定进一步包括使用与所述接头杂交的PCR引物和与所述恒定插入序列杂交的PCR引物经由PCR反应扩增被核酸酶切割的多联体的片段，该片段包含未切割的靶位点。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述扩增的核酸分子富集包含单个未切割靶序列的分子。在一些实施方案中，富集步骤包括片段分级。在一些实施方案中，步骤(c)的所述测定包括对在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链或经由PCR获得的其拷贝测序。在一些实施方案中，候选核酸分子的文库包含至少108,至少109,至少1010,至少1011或至少1012个不同的候选核酸酶切割位点。在一些实施方案中，所述核酸酶是治疗性核酸酶，其切割与疾病有关的基因中的特定核酸酶靶位点。在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定所述治疗性核酸酶切割该特定的核酸酶靶位点且不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或无另外的核酸酶靶位点时所述治疗性核酸酶的最大浓度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述治疗性核酸酶以有效生成等于或低于所述最大浓度的最终浓度的量施用给受试者。在一些实施方案中，所述核酸酶是与RNA分子形成复合物的可RNA编程的核酸酶，且其中该核酸酶:RNA复合物特异性结合与所述RNA分子的序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA分子是单导引RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，所述sgRNA包含5-50个核苷酸、10-30个核苷酸、15-25个核苷酸、18-22个核苷酸、19-21个核苷酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶靶位点包含[sgRNA互补性序列]-[原间隔区(protospacer)临近基序(PAM)]结构，且所述核酸酶切割所述sgRNA互补性序列内的靶位点。在一些实施方案中，所述sgRNA互补性序列包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸酶包含非特异性核酸切割域。在一些实施方案中，所述核酸酶包含FokI切割域。在一些实施方案中，所述核酸酶包含核酸切割域，且在切割域二聚化时切割靶序列。在一些实施方案中，所述核酸酶包含特异性结合核酸序列的结合域。在一些实施方案中，所述结合域包含锌指。在一些实施方案中，所述结合域包含至少2、至少3、至少4或至少5个锌指。在一些实施方案中，所述核酸酶是锌指核酸酶。在一些实施方案中，所述结合域包含转录激活物样元件。在一些实施方案中，所述核酸酶是转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，所述核酸酶是有机化合物。在一些实施方案中，所述核酸酶包含烯二炔功能团。在一些实施方案中，所述核酸酶是抗生素。在一些实施方案中，所述化合物是达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、加利车霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicin)、博来霉素、或其衍生物。在一些实施方案中，所述核酸酶是归巢式内切核酸酶。
本公开的一些方面提供核酸分子的文库，其中每种核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选核酸酶靶位点和10-100个核苷酸的恒定插入序列。在一些实施方案中，所述恒定插入序列长度为至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80或至少95个核苷酸。在一些实施方案中，所述恒定插入序列长度不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过35、不超过40、不超过45、不超过50、不超过55、不超过60、不超过65、不超过70、不超过75、不超过80、或不超过95个核苷酸。在一些实施方案中，所述候选核酸酶靶位点是能被以下切割的位点：可RNA编程的核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶、有机化合物核酸酶、烯二炔、抗生素(例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素)。在一些实施方案中，所述候选核酸酶靶位点可被Cas9核酸酶切割。在一些实施方案中，文库包含至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012种不同的候选核酸酶靶位点。在一些实施方案中，文库包含具有分子量为至少0.5kDa、至少1kDa、至少2kDa、至少3kDa、至少4kDa、至少5kDa、至少6kDa、至少7kDa、至少8kDa、至少9kDa、至少10kDa、至少12kDa或至少15kDa的核酸分子。在一些实施方案中，文库包含是感兴趣的核酸酶的已知靶位点的变体的候选核酸酶靶位点。在一些实施方案中，所述已知的核酸酶靶位点的变体相比于已知的核酸酶靶位点包含10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少的突变。在一些实施方案中，所述变体与所述感兴趣的核酸酶的已知靶位点的差别为平均超过5％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％或超过30％，呈二项式分布。在一些实施方案中，所述变体与所述已知靶位点的差别为平均不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过40％或不超过超过50％，呈二项式分布。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸酶是Cas9核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、归巢内切核酸酶、有机化合物核酸酶、烯二炔抗生素(例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素)。在一些实施方案中，所述候选核酸酶靶位点是包含[sgRNA互补性序列]-[PAM]结构的Cas9核酸酶靶位点，其中所述sgRNA互补性序列包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
本公开的一些方面提供用于从多个核酸酶选择特异性切割共有靶位点的核酸酶的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)提供切割相同共有序列的多种候选核酸酶；(b)对于步骤(a)的每种候选核酸酶，使用本文中提供的方法鉴定由候选核酸酶切割的不同于所述共有靶位点的核酸酶靶位点；(c)基于步骤(b)中鉴定的一种或多种核酸酶靶位点选择核酸酶。在一些实施方案中，步骤(c)中选择的核酸酶是以最高特异性切割所述共有靶位点的核酸酶。在一些实施方案中，以最高特异性切割所述共有靶位点的核酸酶是切割最低数目的不同于共有位点的靶位点的候选核酸酶。在一些实施方案中，以最高特异性切割所述共有靶位点的候选核酸酶是在靶基因组的背景中切割最低数目的不同于共有位点的靶位点的候选核酸酶。在一些实施方案中，步骤(c)中选择的候选核酸酶是不切割共有靶位点以外的任何靶位点的核酸酶。在一些实施方案中，步骤(c)中选择的候选核酸酶是在受试者的基因组内在该核酸酶的治疗有效浓度不切割共有靶位点以外的任何靶位点的核酸酶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使基因组与步骤(c)中选择的核酸酶接触。在一些实施方案中，所述基因组是脊椎动物、哺乳动物、人、非人灵长类、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、牛、犬、猫、爬行动物、两栖动物、鱼、线虫、昆虫或蝇基因组。在一些实施方案中，基因组在活细胞内。在一些实施方案中，基因组在受试者内。在一些实施方案中，共有靶位点在与疾病或病症有关的等位基因内。在一些实施方案中，对共有靶位点的切割引起对疾病或病症的治疗或预防，例如改善或预防疾病或病症的至少一种症候和/或症状。在一些实施方案中，对共有靶位点的切割引起疾病或病症的症候和/或症状的减轻。在一些实施方案中，对共有靶位点的切割引起疾病或病症的预防。在一些实施方案中，疾病是HIV/AIDS。在一些实施方案中，等位基因是CCR5等位基因。在一些实施方案中，疾病是增殖性疾病。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，所述等位基因是VEGFA等位基因。
本公开的一些方面提供根据本文中提供的方法选出的分离的核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶被工程化为切割基因组内的靶位点。在一些实施方案中，所述核酸酶是Cas9核酸酶，其包含与基因组内的靶位点互补的sgRNA。在一些实施方案中，所述核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)或转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶，或有机化合物核酸酶(例如烯二炔、抗生素核酸酶、达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素、或其衍生物)。在一些实施方案中，所述核酸酶基于除了其已知的核酸酶靶位点外，不切割其他候选靶位点、切割不超过1种候选靶位点、不超过2种候选靶位点、不超过3种候选靶位点、不超过4种候选靶位点、不超过5种候选靶位点、不超过6种候选靶位点、不超过7种候选靶位点、不超过8种候选靶位点、不超过8种候选靶位点、不超过9种候选靶位点、或不超过10种候选靶位点选出。
本公开的一些方面提供包含核酸分子的文库的试剂盒，所述核酸分子包含如本文中提供的候选核酸酶靶位点。本公开的一些方面提供包含如本文中提供的分离的核酸酶的试剂盒。在一些实施方案中，所述核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含核酸分子，所述核酸分子包含所述分离的核酸酶的靶位点。在一些实施方案中，所述试剂盒包含赋形剂，和将所述核酸酶与所述赋形剂接触以生成适用于使核酸与所述核酸酶接触的组合物的用法说明书。在一些实施方案中，所述组合物适用于接触基因组内的核酸。在一些实施方案中，所述组合物适用于接触细胞内的核酸。在一些实施方案中，所述组合物适用于接触受试者内的核酸。在一些实施方案中，所述赋形剂是药学可接受的赋形剂。
本公开的一些方面提供适用于施用给受试者的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含如本文中提供的分离的核酸酶。在一些实施方案中，所述组合物包含编码这类核酸酶的核酸。在一些实施方案中，所述组合物包含药学可接受的赋形剂。
本发明的其他优点、特征和用途从本发明的某些非限制性实施方案的详细描述、不意图按照比例绘出的示意性附图和权利要求将是明显的。
附图简述
图1.体外选择概述。(A)与短导引RNA(sgRNA)复合的Cas9识别靶DNA底物的与sgRNA序列互补的～20个碱基，并切割两个DNA链。白色三角代表切割位置。(B)使用我们之前描述的体外选择的修改版本来全面概况分析Cas9特异性。通过连接和滚环扩增从合成的DNA寡核苷酸生成多联体性预选择DNA文库，其中每种分子含有靶DNA序列(白色矩形)的1012种不同变体之一。将该文库与感兴趣的Cas9:sgRNA复合物温育。经切割的文库成员含有5′磷酸根基团(“P”画圈)且因此是接头连接和PCR的底物。所得扩增子进行高通量DNA测序和计算机分析。
图2.Cas9:CLTA1 sgRNA的体外选择结果.热图21显示在酶限制性条件下Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1(A,B)，在酶饱和条件下Cas9:CLTA1 sgRNA v1.0(C,D)和在酶饱和条件下Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1(E,F)的特异性概况。热图显示所有的选择后序列(A,C,E)或仅在20碱基对sgRNA指定的靶位点和两碱基对PAM中含有单个突变的那些序列(B,D,F)。特异性得分1.0和-1.0分别对应于在特定位置处的特定碱基对的100％富集支持和反对(forand against)。黑框指示意图的靶核苷酸。(G)Cas9:sgRNA浓度对特异性的影响。对于CLTA1，显示了在酶限制性(200nM DNA,100nM Cas9:sgRNA v2.1)和酶饱和(200nM DNA,1000nM Cas9:sgRNA v2.1)条件之间的位置特异性变化，其相对于位置特异性中的最大可能变化标准化。(H)sgRNA结构体系对特异性的影响。对于CLTA1，显示了酶饱和条件下sgRNAv1.0和sgRNA v2.1之间的位置特异性变化，其相对于位置特异性中的最大可能变化标准化。对于CLTA2、CLTA3和CLTA4的相应数据，见图6-8、25和26。序列标识：(A-F)中显示的sgRNA序列对应于SEQ ID NO:1。
图3.该研究中进行概况分析的靶位点。(A)sgRNA的5′端具有与靶位点互补的20个核苷酸。所述靶位点含有NGG基序(PAM)，其临近于RNA:DNA互补区域。(B)显示了4个人网格蛋白(clathrin)基因(CLTA)靶位点。(C,D)与sgRNA一起显示了4个人网格蛋白基因(CLTA)靶位点。sgRNA v1.0短于sgRNA v2.1。显示了每个位点的PAM。靶位点的非PAM端对应于sgRNA的5′端。序列标识：(B)中显示的序列从上到下为SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；和SEQ ID NO:7。(C)中显示的序列从上到下为SEQ IDNO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；和SEQ ID NO:19。(D)中显示的序列从上到下为SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQID NO:30；和SEQ ID NO:31。
图4.在体外对中靶(on target)DNA序列的Cas9:导引RNA切割。对于4种CLTA靶位点的每种，使用200nM中靶位点和100nM Cas9:v1.0 sgRNA、100nM Cas9:v2.1 sgRNA、1000nM Cas9:v1.0 sgRNA和1000nM Cas9:v2.1sgRNA在约1kb线性底物上实施了离散的DNA切割测定。对于CLTA1、CLTA2和CLTA4，Cas9:v2.1 sgRNA显示比Cas9:v1.0 sgRNA更高的活性。对于CLTA3，Cas9:v1.0 sgRNA和Cas9:v2.1 sgRNA的活性相当。
图5.4种靶位点的体外选择结果.在200nM预选择文库上使用100nM Cas9:sgRNAv2.1,1000nM Cas9:sgRNA v1.0,或1000nM Cas9:sgRNA v2.1实施了体外选择。(A)对于实施的12个选择显示了选择后PCR结果。对于每个选择量化含有1.5个重复的DNA并以等摩尔量合并，接着是凝胶纯化和测序。(B-E)对于预选择(黑色)和选择后文库(彩色)显示了突变的分布。选择后文库富集的序列具有的突变少于预选择文库。从由sgRNA指定的20碱基对和两碱基对PAM中计算突变数。对于每组中分布之间的所有成对比较，P值<0.01。使用t检验计算P值，假定不等大小和不等方差。
图6.Cas9:CLTA2 sgRNA的体外选择结果。热图24显示在酶限制性条件下Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1(A,B)，在酶过量条件下Cas9:CLTA2 sgRNA v1.0(C,D)和在酶过量条件下Cas9:CLTA2 sgRNA v2.1(E,F)的特异性概况。热图显示所有的选择后序列(A,C,E)或仅在20碱基对sgRNA指定的靶位点和两碱基对PAM中含有单个突变的那些序列(B,D,F)。特异性得分1.0和-1.0分别对应于在特定位置处的特定碱基对的100％富集支持和反对。黑框指示意图的靶核苷酸。序列标识：(A-F)中显示的sgRNA序列对应于SEQ ID NO:32。
图7.Cas9:CLTA3 sgRNA的体外选择结果。热图24显示在酶限制性条件下Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1(A,B)，在酶过量条件下Cas9:CLTA3 sgRNA v1.0(C,D)和在酶饱和条件下Cas9:CLTA3 sgRNA v2.1(E,F)的特异性概况。热图显示所有的选择后序列(A,C,E)或仅在20碱基对sgRNA指定的靶位点和两碱基对PAM中含有单个突变的那些序列(B,D,F)。特异性得分1.0和-1.0分别对应于在特定位置处的特定碱基对的100％富集支持和反对。黑框指示意图的靶核苷酸。序列标识：(A-F)中显示的sgRNA序列对应于SEQ ID NO:32。
图8.Cas9:CLTA4 sgRNA的体外选择结果。热图24显示在酶限制性条件下Cas9:CLTA4 sgRNA(A,B)，在酶过量条件下Cas9:CLTA4 sgRNA v1.0(C,D)和在酶饱和条件下Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1(E,F)的特异性概况。热图显示所有的选择后序列(A,C,E)或仅在20碱基对sgRNA指定的靶位点和两碱基对PAM中含有单个突变的那些序列(B,D,F)。特异性得分1.0和-1.0分别对应于在特定位置处的特定碱基对的100％富集支持和反对。黑框指示意图的靶核苷酸。序列标识：(A-F)中显示的sgRNA序列对应于SEQ ID NO:33。
图9.体外选择结果作为序列符号。对于酶限制条件下由CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)sgRNA v2.1指定的每种靶位点位置(1-20)绘出信息内容25。PAM中的位置标记为“P1”、“P2”和“P3”。信息内容以位数(bit)绘出。2.0位数表示绝对特异性而0位数表示无特异性。
图10.对于CLTA1，PAM远端的突变的容许性。当仅考虑具有灰色中靶碱基对同时允许在头1-12个碱基对中的突变的那些序列时，对于Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA选择显示了在每个位置的最大特异性得分(A-L)。不受限于中靶碱基对的位置由黑色竖条指示。特异性得分值越高，表明在给定位置的特异性越高。不允许含有任何突变的位置(灰色)以特异性得分+1绘出。对于所有组，从分别具有n≥5,130和n≥74,538的预选择文库序列和选择后文库序列计算特异性得分。
图11.对于CLTA2，PAM远端的突变的容许性。当仅考虑具有灰色中靶碱基对同时允许在头1-12个碱基对中的突变的那些序列时，对于Cas9:CLTA2 v2.1 sgRNA选择显示了在每个位置的最大特异性得分(A-L)。不受限于中靶碱基对的位置由黑色竖条指示。特异性得分值越高，表明在给定位置的特异性越高。不允许含有任何突变的位置(灰色)以特异性得分+1绘出。对于所有组，从分别具有n≥3,190和n≥25,365的预选择文库序列和选择后文库序列计算特异性得分。
图12.对于CLTA3，PAM远端的突变的容许性。当仅考虑具有灰色中靶碱基对同时允许在头1-12个碱基对中的突变的那些序列时，对于Cas9:CLTA3 v2.1 sgRNA选择显示了在每个位置的最大特异性得分(A-L)。不受限于中靶碱基对的位置由黑色竖条指示。特异性得分值越高，表明在给定位置的特异性越高。不允许含有任何突变的位置(灰色)以特异性得分+1绘出。对于所有组，从分别具有n≥5,604和n≥158,424的预选择文库序列和选择后文库序列计算特异性得分。
图13.对于CLTA4，PAM远端的突变的容许性。当仅考虑具有灰色中靶碱基对同时允许在头1-12个碱基对(A-L)中的突变的那些序列时，对于Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA选择显示了在每个位置的最大特异性得分。不受限于中靶碱基对的位置由黑色竖条指示。特异性得分值越高，表明在给定位置的特异性越高。不允许含有任何突变的位置(灰色)以特异性得分+1绘出。对于所有组，从分别具有n≥2,323和n≥21,819的预选择文库序列和选择后文库序列计算特异性得分。
图14.CLTA1靶位点中PAM远端的突变的容忍性。对于使用1000nM Cas9:CLTA1sgRNA v2.1在200nM预选择文库上的体外选择显示了突变的分布。当包括PAM在内的剩余靶位点仅含有中靶碱基对时，显示的突变数目在最远离PAM的1-12碱基对靶位点子序列中(A-L)。预选择和选择后分布对于多达3个碱基对是类似的，显示了当剩余靶位点与Cas9:sgRNA具有最佳相互作用时，对具有最远离PAM的3个碱基对中突变的靶位点的容忍性。对于所有组，从分别具有n≥5,130和n≥74,538的预选择文库序列和选择后文库序列产生图。
图15.CLTA2靶位点中PAM远端的突变的容忍性。对于使用1000nM Cas9:CLTA2sgRNA v2.1在200nM预选择文库上的体外选择显示了突变的分布。当包括PAM在内的剩余靶位点仅含有中靶碱基对时，显示的突变数目在最远离PAM的1-12碱基对靶位点子序列中(A-L)。预选择和选择后分布在多达3个碱基对中是类似的，显示了当剩余靶位点与Cas9:sgRNA具有最佳相互作用时，对具有最远离PAM的3个碱基对中突变的靶位点的容忍性。对于所有组，从分别具有n≥3,190和n≥21,265的预选择文库序列和选择后文库序列产生图。
图16.CLTA3靶位点中PAM远端的突变的容忍性。对于使用1000nM Cas9:CLTA3sgRNA v2.1在200nM预选择文库上的体外选择显示了突变的分布。当包括PAM在内的剩余靶位点仅含有在靶碱基对时，显示的突变数目在最远离PAM的1-12碱基对靶位点子序列中(A-L)。预选择和选择后分布在多达3个碱基对中是类似的，显示了当剩余靶位点与Cas9:sgRNA具有最佳相互作用时，对具有最远离PAM的3个碱基对中突变的靶位点的容忍性。对于所有组，从分别具有n≥5,604和n≥158,424的预选择文库序列和选择后文库序列产生图。
图17.CLTA4靶位点中PAM远端的突变的容忍性。对于使用1000nM Cas9:CLTA4sgRNA v2.1在200nM预选择文库上的体外选择显示了突变的分布。当包括PAM在内的剩余靶位点仅含有中靶碱基对时，显示的突变数目在最远离PAM的1-12碱基对靶位点子序列中(A-L)。预选择和选择后分布在多达3个碱基对中是类似的，显示了当剩余靶位点与Cas9:sgRNA具有最佳相互作用时，对具有最远离PAM的3个碱基对中突变的靶位点的容忍性。对于所有组，从分别具有n≥2,323和n≥21,819的预选择文库序列和选择后文库序列产生图。
图18.100nM Cas9:sgRNA v2.1的位置特异性模式。对于sgRNA v2.1，绘出了在酶限制条件下每种靶位点的位置特异性，其定义为对于在靶位点中某个位置处识别的4种可能的碱基对的每种的特异性得分的量级之和。位置特异性显示为对靶位点的最大位置特异性值标准化的值。位置特异性在PAM近端的靶位点末端处最高，且在靶位点的中间和PAM最远端的几个核苷酸中最低。
图19.1000nM Cas9:sgRNA v1.0的位置特异性模式。对于sgRNA v1.0，绘出了在酶过量条件下每种靶位点的位置特异性，其定义为对于在靶位点中某个位置处识别的4种可能的碱基对的每种的特异性得分的量级之和。位置特异性显示为对靶位点的最大位置特异性值标准化的值。位置特异性在整个靶位点中相对恒定，但在靶位点的中间和PAM最远端的几个核苷酸中最低。
图20.1000nM Cas9:sgRNA v2.1的位置特异性模式。对于sgRNA v2.1，绘出了在酶过量条件下每种靶位点的位置特异性，其定义为对于在靶位点中某个位置处识别的4种可能的碱基对的每种的特异性得分的量级之和。位置特异性显示为对靶位点的最大位置特异性值标准化的值。位置特异性在整个靶位点中相对恒定，但在靶位点的中间和PAM最远端的几个核苷酸中最低。
图21.PAM核苷酸偏好。对于用CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)sgRNAv2.1选择的所有16种可能的PAM二核苷酸，显示了在酶限制或酶过量条件下预选择文库和选择后文库中的丰度。GG二核苷酸在选择后文库中丰度增加，而其他可能的PAM二核苷酸在选择后丰度降低。
图22.对于中靶位点的PAM二核苷酸偏好。在此分析中仅包括在由导引RNA指定的20碱基对中不含突变的选择后文库成员。对于用CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)sgRNA v2.1选择的所有16种可能的PAM二核苷酸，显示了在酶限制或酶过量条件下预选择文库和选择后文库中的丰度。GG二核苷酸在选择后文库中丰度增加，而其他可能的PAM二核苷酸在选择后一般丰度降低，虽然这种Cas9:sgRNA的酶过量浓度的效应对于许多二核苷酸来说是适度或不存在的。
图23.PAM二核苷酸特异性得分。对于用CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)sgRNA v2.1选择的所有16种可能的PAM二核苷酸(三核苷酸NGG PAM的位置2和3)，显示了在酶限制或酶过量条件下的特异性得分。该特异性得分指示选择后文库中的PAM二核苷酸相对于预选择文库的富集，其相对于该二核苷酸的最大可能富集标准化。特异性得分+1.0指示该二核苷酸在选择后文库中100％富集，而特异性得分-1.0指示该二核苷酸为100％去富集的(de-enriched)。GG二核苷酸是选择后文库中最多富集的，而AG,GA,GC,GT和TG相比于其他可能的PAM二核苷酸显示更少的相对去富集。
图24.中靶位点的PAM二核苷酸特异性得分。在此分析中仅包括在由导引RNA指定的20碱基对中不含突变的选择后文库成员。对于用CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)sgRNA v2.1选择的所有16种可能的PAM二核苷酸(三核苷酸NGG PAM的位置2和3)，显示了在酶限制或酶过量条件下的特异性得分。该特异性得分指示选择后文库中的PAM二核苷酸相对于预选择文库的富集，其相对于该二核苷酸的最大可能富集标准化。特异性得分+1.0指示该二核苷酸在选择后文库中100％富集，而特异性得分-1.0指示该二核苷酸为100％去富集的。GG二核苷酸是选择后文库中最多富集的，AG和GA核苷酸在至少一种选择条件下即未富集也未去富集，而GC,GT和TG相比于其他可能的PAM二核苷酸显示更少的相对去富集。
图25.Cas9:sgRNA浓度对特异性的影响。对于使用靶向CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)靶位点的sgRNA进行的选择，显示了在酶限制(200nM DNA,100nM Cas9:sgRNA v2.1)和酶过量(200nM DNA,1000nM Cas9:sgRNA v2.1)条件之间的位置特异性变化。线指示对于给定位置，位置特异性中的最大可能变化。当酶浓度升高时，特异性中的最高变化发生在临近于PAM处。
图26.sgRNA结构体系对特异性的影响。对于使用靶向CLTA1(A),CLTA2(B),CLTA3(C)和CLTA4(D)靶位点的sgRNA进行的选择，显示了在酶过量(200nM DNA,1000nM Cas9:sgRNA v2.1)条件下Cas9:sgRNA v1.0和Cas9:sgRNA v2.1之间的位置特异性变化。线指示对于给定位置，位置特异性中的最大可能变化。
图27.在体外对脱靶DNA序列的Cas9:导引RNA切割。使用200nM DNA和1000nMCas9:CLTA4 v2.1 sgRNA，对于通过体外选择鉴定的中靶CLTA4位点(CLTA4-0)和5种CLTA4脱靶位点实施了在96-bp线性底物上的离散的DNA切割测定。显示的富集值来自使用1000nMCas9:CLTA4 v2.1 sgRNA的体外选择。CLTA4-1和CLTA4-3是在这些条件下最高富集的序列。CLTA4-2a,CLTA4-2b和CLTA4-2c是代表从高富集到无富集到高去富集的一系列富集值的两种突变序列。小写字母指示相对于中靶CLTA4位点的突变。富集值在体外观察到的切割量定性一致。序列标识：从上到下显示的序列是SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；和SEQ ID NO:39。
图28.导引RNA体系结构和Cas9:sgRNA浓度对脱靶位点的体外切割的影响。对于CLTA4-3脱靶位点(5′GggGATGTAGTGTTTCCACtGGG 3′(SEQ ID NO:39)-突变以小写字母显示)使用200nM DNA和100nM Cas9:v1.0sgRNA,100nM Cas9:v2.1 sgRNA,1000nM Cas9:v1.0sgRNA,或1000nM Cas9:v2.1 sgRNA实施了在96-bp线性底物上的离散DNA切割测定。在测试的所有4种条件下观察到了DNA切割，且切割率在酶过量条件下更高，或使用v2.1 sgRNA比v1.0 sgRNA高。
定义
如本文和权利要求中使用的，单数形式“一个/一种”和“该”包括单数和复数指代物，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如提到“一个/一种试剂”包括一种试剂和多种这类试剂。
术语“Cas9”或“Cas9核酸酶”指RNA导引的核酸酶，其包含Cas9蛋白或其片段。Cas9核酸酶有时还称为casn1核酸酶或CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复(clusteredregularly interspaced short palindromic repeat))有关的核酸酶。CRISPR是提供对移动性遗传元件(例如病毒、转座元件和接合质粒)的保护的适应性免疫系统。CRISPR簇含有间隔物、与前期移动元件互补的序列和靶物侵入性核酸。CRISPR簇转录和加工成CRISPRRNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，对前crRNA的正确加工需要反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA充当核糖核酸酶3辅助的对前crRNA加工的导引。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA端以内切核苷酸方式切割与间隔物互补的线性或环状dsDNA靶物。不与crRNA互补的靶链首先被内切核苷酸方式切割，然后以外切核苷酸方式在3′-5′修剪。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA种类。然而，可以工程化单导引RNA(“sgRNA”或简称为“gNRA”)以将crRNA和tracrRNA两者的示象(aspect)均纳入到单RNA分子中。参见例如，Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,HauerM.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其完整内容通过提述据此并入本文。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或原间隔区临近基序)来帮助区分自身和非自身。Cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员公知的(参见，例如“Completegenome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.expand/collapse author list McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,SharmaC.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011)；和“A programmable dual-RNA-guided DNA endonucleasein adaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其各自完整内容通过提述并入本文)。已在多种物种中描述了Cas9直系同源物，包括但不限于酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。基于本公开，其他适宜的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是明显的，而且这类Cas9核酸酶和序列包括来自Chylinski,Rhun和Charpentier,“The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunitysystems”(2013)RNA Biology 10:5,726-737(其完整内容通过提述并入本文)中公开的生物和基因座的Cas9序列。在一些实施方案中，包含Cas9或其片段的蛋白质称为“Cas9变体”。Cas9变体与Cas9或其片段共享同源性。例如，Cas9变体与野生型Cas9至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同，或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，Cas9变体包含Cas9的片段(例如gRNA结合域或DNA切割域)，从而该片段与野生型Cas9的相应片段至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同，或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，野生型Cas9对应于来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(NCBI参考序列：NC_017053.1,SEQ ID NO:40(核苷酸)；SEQ ID NO:41(氨基酸))。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQ ID NO:1)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDDYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFGSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLADSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQIYNQLFEENPINASRVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKRNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNSEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGAYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDRGMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGHSLHEQIANLAGSPAIKKGILQTVKIVDELVKVMGHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFIKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:2)
术语“多联体”，如本文中在核酸分子的背景中使用的，指含有系列连接的同一DNA序列的多个拷贝的核酸分子。例如，包含10个拷贝的特定核苷酸序列的多联体(例如[XYZ]10)将包含同一特定序列的10个拷贝彼此系列连接，例如5′-XYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZXYZ-3′。多联体可以包含任意拷贝数的重复单元或序列，例如至少2个拷贝，至少3个拷贝，至少4个拷贝，至少5个拷贝，至少10个拷贝，至少100个拷贝，至少1000个拷贝等。包含核酸酶靶位点和恒定插入序列的核酸序列的多联体的例子将是[(靶位点)-(恒定插入序列)]300。多联体可以是线性核酸分子或可以是环状。
术语“缀合”和“缀合的”指两个实体的关联，例如两个分子如两个蛋白质、两个域(例如结合域和切割域)、或蛋白质和试剂，例如蛋白质结合域和小分子。在一些方面，该关联在蛋白质(例如可RNA编程的核酸酶)和核酸(例如导引RNA)之间。该关联可以例如经由直接或间接(例如经由接头)共价连接或经由非共价相互作用。在一些实施方案中，该关联是共价的。在一些实施方案中，两个分子经由连接两个分子的接头而缀合。例如，在其中两个蛋白质(例如工程化核酸酶的结合域和切割域)彼此缀合以形成蛋白融合物的一些实施方案中，两个蛋白质可经由多肽接头，例如将一个蛋白质的C末端连接到另一蛋白质的N末端的氨基酸序列来缀合。
术语“共同(consensus)序列”，如本文中在核酸序列的背景中使用的，指代表在多种相似的序列中在每个位置所见的最频繁的核苷酸残基的经计算序列。典型地，通过序列比对来确定共同序列，其中将相似的序列互相比较并计算相似的序列基序。在核酸酶靶位点序列的背景中，核酸酶靶位点的共同序列在一些实施方案中可以是被给定核酸酶最频繁结合或以最高亲和力结合的序列。对于可RNA编程的核酸酶(例如Cas9)靶位点序列，所述共同序列在一些实施方案中可以是预期gRNA或多种gRNA结合或设计为结合的序列或区域，例如基于互补碱基配对。
术语“有效量”，如本文中使用的，指足以引发期望的生物学应答的生物学活性试剂量。例如，在一些实施方案中，核酸酶的有效量可以指足以诱导被核酸酶特异性结合和切割的靶位点的切割的核酸酶量。如熟练技术人员会领会的，试剂例如核酸酶、杂合蛋白或多核苷酸的有效量可能依赖于多种因素，如例如期望的生物学应答，靶向的具体的等位基因、基因组、靶位点、细胞或组织，和使用的试剂。
术语“烯二炔”，如本文中使用的，指一类细菌天然产物，其特征在于含有被双键间隔开的三键的9元环和10元环(参见，例如K.C.Nicolaou；A.L.Smith；E.W.Yue(1993).“Chemistry and biology of natural and designed enediynes”.PNAS 90(13):5881–5888；其完整内容通过提述并入本文)。一些烯二炔能进行Bergman环化，且所得双自由基，一种1,4-脱氢苯衍生物，能从DNA的糖骨架转移氢原子，其导致DNA链切割(参见，例如S.Walker；R.Landovitz；W.D.Ding；G.A.Ellestad；D.Kahne(1992).“Cleavage behaviorof calicheamicin gamma 1and calicheamicin T”.Proc Natl Acad Sci U.S.A.89(10):4608–12；其完整内容通过提述并入本文)。它们与DNA的反应性赋予许多烯二炔以抗生素的性质，且将一些烯二炔作为抗癌抗生素研究。烯二炔的非限制性离子是达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素(参见，例如Adrian L.Smith和K.C.Bicolaou,“The EnediyneAntibiotics”J.Med.Chem.,1996,39(11),pp 2103–2117；和Donald Borders,“Enediyneantibiotics as antitumor agents,”Informa Healthcare；第一版(1994年11月23日，ISBN-10:0824789385；其完整内容通过提述并入本文)。
术语“归巢内切核酸酶”，如本文中使用的，指一种限制酶类型，其通常由内含子或内含肽(intein)Edgell DR编码(2009年2月)。“Selfish DNA:homing endonucleases finda home”.Curr Biol 19(3):R115–R117；Jasin M(Jun 1996).“Genetic manipulation ofgenomes with rare-cutting endonucleases”.Trends Genet 12(6):224–8；Burt A,Koufopanou V(December 2004).“Homing endonuclease genes:the rise and fall andrise again of a selfish element”.Curr Opin Genet Dev 14(6):609–15；其完整内容通过提述并入本文。归巢内切核酸酶识别序列足够长，从而仅以非常低的概率随机存在(约每7×1010bp一个)，且通常每基因组中仅发现一个。
术语“文库”，如本文中在核酸或蛋白质的背景中使用的，分别指两种或更多种不同核酸或蛋白质的群体。例如，核酸酶靶位点的文库包含至少两种含有不同核酸酶靶位点的核酸分子。在一些实施方案中，文库包含至少101,至少102,至少103,至少104,至少105,至少106,至少107,至少108,至少109,至少1010,至少1011,至少1012,至少1013,至少1014或至少1015种不同的核酸或蛋白质。在一些实施方案中，文库的成员可以包含随机化的序列，例如完全或部分随机化的序列。在一些实施方案中，文库包含彼此不相关的核酸分子，例如包含完全随机化序列的核酸。在其他实施方案中，文库的至少一些成员可以是相关的，例如，它们可以是特定序列如共同靶位点序列的变体或衍生物。
术语“接头”，如本文中使用的，指连接两个临近的分子或模块，例如核酸酶的结合域和切割域的化学基团或分子。典型地，接头位于两个基团、分子或其他模块之间或由其侧接，且经由共价键连接至每一个，如此将两者连接。在一些实施方案中，所述接头是氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，所述接头是有机分子、基团、聚合物或化学模块。
术语“核酸酶”，如本文中使用的，指能切割连接核酸分子中的核苷酸残基的磷酸二酯键的试剂，例如蛋白质或小分子。在一些实施方案中，核酸酶是但编织，例如能结合核酸分子和切割连接核酸分子中的核苷酸残基的磷酸二酯键的酶。核酸酶可以是内切核酸酶，其切割多核苷酸链中的磷酸二酯键，或者是外切核酸酶，其切割在多核苷酸链末端处的磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸酶是位点特异性核酸酶，其结合和/或切割特定核苷酸序列内的特定磷酸二酯键，该核苷酸序列在本文中亦称为“识别序列”、“核酸酶靶位点”或“靶位点”。在一些实施方案中，核酸酶是RNA导引的(即可RNA编程的)核酸酶，其与具有与靶位点互补的序列的RNA复合(例如结合)，从而提供该核酸酶的序列特异性。在一些实施方案中，核酸酶识别单链的靶位点，而在其他实施方案中，核酸酶识别双链的靶位点，例如双链的DNA靶位点。许多天然存在的核酸酶例如许多天然存在的DNA限制核酸酶的靶位点是本领域技术人员公知的。在许多情况中，DNA核酸酶如EcoRI、HindIII或BamHI识别长度为4至10个碱基对的回文双链DNA靶位点，并在该靶位点内的特定位置处切割两条DNA链的每条。一些内切核酸酶对称地切割双链核酸靶位点，即在相同位置切割两条链，从而使得末端包含碱基配对的核苷酸，在本文中也称为平末端。其他内切核酸酶不对称地切割双链核酸靶位点，即在不同位置切割每条链，从而使得末端包含不配对的核苷酸。双链DNA分子的末端处不配对的核苷酸也称为“突出”，例如“5′-突出”或“3′-突出”，根据不配对的核苷酸形成的是相应DNA链的5′还是3′端。以不配对核苷酸为末端的双链DNA分子端也称为粘端，因此它们能“黏着于”包含互补的不配对核苷酸的其他双链DNA分子端。核酸酶蛋白通常包含介导蛋白与核酸底物的相互作用(在一些情况张还特异性结合靶位点)的“结合域”和催化核酸骨架内的磷酸二酯键的切割的“切割域”。在一些实施方案中，核酸酶蛋白能以单体形式结合和切割核酸分子，而在其他实施方案中，核酸酶蛋白必须二聚化或多句话以切割靶核酸分子。天然存在的核酸酶的结合域和切割域，以及能融合以创建核酸酶的模式结合域和切割域，是本领域技术人员公知的。例如，锌指或转录激活物样元件可用作结合域以特异性结合期望的靶位点，并融合或缀合于切割域，例如FokI的切割域，以创造切割靶位点的工程化的核酸酶。
术语“核酸”和“核酸分子”，如本文中使用的，指包含核碱基和酸性模块(例如核苷、核苷酸或核苷酸聚合物)的化合物。通常地，聚合核酸，例如包含3个或多个核苷酸的核酸分子是线性分子，其中相邻的核苷酸经由磷酸二酯键彼此连接。在一些实施方案中，“核酸”指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”指包含3个或更多个个体核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文中使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以交换使用以指核苷酸的聚合物(例如至少3个核苷酸的串)。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然存在的，例如在基因组、转录本、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体、或其他天然存在的核酸分子的背景中。在另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如重组的DNA或RNA，人工染色体，工程化的基因组，或其片段，或合成的DNA、RNA、DNA/RNA杂合体，或包含非天然存在的核苷酸或核苷。例如，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有磷酸二酯骨架以外的形式的类似物。可从天然来源纯化核酸，使用重组表达系统产生，并任选地纯化，化学合成等等。在适宜时，例如在化学合成的分子的情况中，核酸可以包含核苷类似物如具有经化学修饰的碱基或糖和骨架修饰的类似物。除非另外说明，核酸序列以5′至3′方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然的核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔-尿苷、C5-丙炔-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷(deazaadenosine)、7-脱氮尿苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸根基团(例如硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺连接)。
术语“药物组合物”，如本文中使用的，指在疾病或病症治疗的背景中可施用给受试者的组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含活性成分，例如核酸酶或编码核酸酶的核酸，和药学可接受的赋形剂。
术语“增殖性疾病”，如本文中使用的，指其中由于细胞或细胞群体展现出异常升高的增殖率而细胞或组织内稳态被扰乱的任何疾病。增殖性疾病包括增殖过多疾病，如赘生前增生状况和赘生性(neoplastic)疾病。赘生性疾病特征在于细胞的异常增殖且包括良性和恶性赘生物形成。恶性赘生物形成也称为癌症。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可交换使用，且指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语指任意大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常地，蛋白质、肽或多肽长度将至少为3个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可以指个体蛋白质或蛋白质的集合。可以修饰蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸，例如通过添加化学实体如糖基团、羟基基团、磷酸基团、法呢基(farnesyl)基团、异法呢基基团、脂肪酸基团、用于缀合的接头，功能化，或其他修饰等等。蛋白质、肽或多肽还可以是单分子或可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任意组合。蛋白质可以包含不同的域，例如核酸结合域和核酸切割域。在一些实施方案中，蛋白质包含蛋白质性部分，例如构成核酸结合域的氨基酸序列，和有机化合物，例如可充当核酸切割剂的化合物。在一些实施方案中，蛋白与核酸例如RNA复合或关联。
术语“随机化的”，如本文中在核酸序列的背景中使用的，指序列或序列内的残基，其合成为掺入游离核苷酸的复合物，例如所有4个核苷酸A,T,G和C的复合物。随机化的残基通常由核苷酸序列内的字母N表示。在一些实施方案中，随机化的序列或残基是完全随机化的，在该情况中，随机化的残基通过在相应序列残基的合成步骤期间添加等量的要纳入的核苷酸(例如25％T,25％A,25％G和25％C)来合成。在一些实施方案中，随机化的序列或残基是部分随机化的，在该情况中，随机化的残基通过在相应序列残基的合成步骤期间添加不等量的要纳入的核苷酸(例如79％T,7％A,7％G和7％C)来合成。部分随机化允许以给定序列为模板的序列的生成，但具有期望的频率的纳入突变。例如，如果将已知的核酸酶靶位点用作合成模板，那么其中每个步骤在相应残基处代表的核苷酸以79％添加至合成而其他3种核苷酸各以7％添加的部分随机化将产生所合成的部分随机化的靶位点的混合物，其仍代表原始靶位点的共同序列，但在每个残基处对于如此合成的每个残基(二项式分布)与原始靶位点具有21％的统计频率的差异。在一些实施方案中，部分随机化的序列与共同序列相差的差别为平均超过5％,超过10％,超过15％,超过20％,超过25％或超过30％，呈二项式分布。在一些实施方案中，部分随机化的序列与共同位点的差别为平均不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过40％或不超过超过50％，呈二项式分布。
术语“可RNA编程的核酸酶”和“RNA导引的核酸酶”在本文中可交换使用且指与一种或多种不是切割靶物的RNA形成复合物(例如结合或关联)的核酸酶。在一些实施方案中，可RNA编程的核酸酶在与RNA复合时可以称为核酸酶:RNA复合物。通常，结合的一种或多种RNA称为导引RNA(gRNA)或单导引RNA(sgRNA)。所述gRNA/sgRNA包含与靶位点互补的核苷酸序列，其介导核酸酶/RNA复合物对所述靶位点的结合并提供核酸酶:RNA复合物的序列特异性。在一些实施方案中，所述可RNA编程的核酸酶是(CRISPR-associated system，CRISPR关联系统)Cas9内切核酸酶，例如来自酿脓链球菌的Cas9(Csn1)(参见，例如“Completegenome sequences of an M1strain of Streptococcus pyogenes.”Ferretti J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.expand/collapse author list McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.”Deltcheva E.,Chylinski K.,SharmaC.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature471:602-607(2011)；和“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease inadaptive bacterial immunity.”Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,DoudnaJ.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)，其各自完整内容通过提述并入本文。
由于可RNA编程的核酸酶(例如Cas9)利用RNA:DNA杂交来确定靶DNA切割位点，因此这些蛋白质在原理上能切割由导引RNA指定的任意序列。使用可RNA编程的核酸酶如Cas9用于位点特异性切割(例如以修饰基因组)的方法是本领域中公知的(参见例如Cong,L.等Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823(2013)；Mali,P.等RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339,823-826(2013)；Hwang,W.Y.等Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.Nature biotechnology 31,227-229(2013)；Jinek,M.等RNA-programmedgenome editing in human cells.eLife 2,e00471(2013)；Dicarlo,J.E.等Genomeengineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.nucleicacids research(2013)；Jiang,W.等RNA-guided editing of bacterial genomes usingCRISPR-Cas systems.Nature biotechnology 31,233-239(2013)；其各自完整内容通过提述并入本文)。
术语“小分子”和“有机化合物”在本文中可交换使用且指具有相对低分子量的分子，不管是天然存在还是人工创建的(例如经由化学合成)。有机化合物通常含有碳。有机化合物可以含有多个碳-碳键、立构中心和其他功能团(例如胺、羟基、羰基或杂环)。在一些实施方案中，有机化合物是单体且具有低于约1500g/mol的分子量。在某些实施方案中，小分子的分子量低于约1000g/mol或低于约500g/mol。在某些实施方案中，小分子是药物，例如已被合适的政府机构或监管机构视为对于用于人或动物安全且有效的药物。在某些实施方案中，已知有机分子结合和/或切割核酸。在一些实施方案中，所述有机化合物是烯二炔。在一些实施方案中，所述有机化合物是抗生素药物，例如抗癌抗生素例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素、或其衍生物。
术语“受试者”，如本文中使用的，指个体生物如个体哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是绵羊、山羊、牛、猫或犬。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、蝇或线虫。
术语“靶核酸”和“靶基因组”，如本文中在核酸酶的背景中使用的，分别指包含给定核酸酶的至少一个靶位点的核酸分子或基因组。
术语“靶位点”，在本文中可与术语“核酸酶靶位点”交换使用，指被核酸酶结合和切割的核酸分子内的序列。靶位点可以是单链或双链的。在二聚化的核酸酶例如包含FokIDNA切割域的核酸酶的背景中，靶位点通常包含左半位点(由核酸酶的一个单体结合)、右半位点(由核酸酶的第二单体结合)，和其中进行切割的两个各半位点之间的间隔序列。该结构([左半位点]-[间隔序列]-[右半位点])在本文中称为LSR结构。在一些实施方案中，左半位点和/或右半位点长度为10-18个核苷酸。在一些实施方案中，所述半位点之一或两者更短或更长。在一些实施方案中，左和右半位点包含不同的核酸序列。在锌指核酸酶的背景中，靶位点在一些实施方案中可以包含各自6-18bp长的两个成半位点，其侧接4-8bp长的非特定的间隔区。在TALEN的背景中，靶位点可以在一些实施方案中包含各自10-23bp长的两个成半位点，其侧接10-30bp长的非特定的间隔区。在RNA导引的(例如可RNA编程的)核酸酶的背景中，靶位点通常包含与可RNA编程的核酸酶的sgRNA互补的核苷酸序列，和在临近sgRNA互补性序列的3′端处的原间隔区临近基序(PAM)。对于RNA导引的核酸酶Cas9，所述靶位点在一些实施方案中可以是20个碱基对加上3碱基对PAM(例如NNN，其中N代表任意核苷酸)。通常地，PAM的第一个核苷酸可以是任意核苷酸，而两个下游核苷酸根据具体的RNA导引的核酸酶指定。RNA导引的核酸酶如Cas9的例示性靶位点是本领域技术人员已知的，且包括但不限于，NNG,NGN,NAG和NGG，其中N代表任意核苷酸。另外，来自不同物种(例如嗜热链球菌而非酿脓链球菌)的Cas9核酸酶识别包含序列NGGNG的PAM。已知另外的PAM序列，包括但不限于NNAGAAW和NAAR(参见，例如Esvelt和Wang,Molecular Systems Biology,9:641(2013)，其完整内容通过提述并入本文)。例如，RNA导引的核酸酶如例如Cas9的靶位点可以包含结构[NZ]-[PAM]，其中每个N独立地为任意核苷酸，且Z是1至50的整数。在一些实施方案中，Z为至少2,至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少25,至少30,至少35,至少40,至少45或至少50。在一些实施方案中，Z为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，Z为20。
术语“转录激活物样效应子”(TALE)，如本文中使用的，指包含DNA结合域的细菌蛋白质，该DNA结合域含有高度保守的33-34氨基酸序列，该序列包含高度可变的两氨基酸基序(重复可变二残基，Repeat Variable Diresidue,RVD)。RVD基序决定对核酸序列的结合特异性，且可以依照本领域技术人员公知的方法工程化以特异性结合期望的DNA序列(参见，例如Miller,Jeffrey；等(February 2011).“A TALE nuclease architecture forefficient genome editing”.Nature Biotechnology 29(2):143–8；Zhang,Feng；等(February 2011).”Efficient construction of sequence-specific TAL effectorsfor modulating mammalian transcription”.Nature Biotechnology 29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.ed.“Transcriptional Activators of Human Genes with ProgrammableDNA-Specificity”.PLoS ONE 6(5):e19509；Boch,Jens(February 2011).“TALEs ofgenome targeting”.Nature Biotechnology 29(2):135–6；Boch,Jens；等(December2009).“Breaking the Code of DNA Binding specificity of TAL-Type IIIEffectors”.Science 326(5959):1509–12；和Moscou,Matthew J.；Adam J.Bogdanove(December 2009).“A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors”.Science 326(5959):1501；其各自完整内容通过提述并入本文)。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适宜RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合域。
术语“转录激活物样元件核酸酶”(TALEN)，如本文中使用的，指包含针对DNA切割域例如FokI域的转录激活物样效应子DNA结合域的人工核酸酶。已报道了一些用于生成工程化的TALE构建体的模式装配设计(参见例如Zhang,Feng；等(February 2011).“Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription”.Nature Biotechnology 29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.ed.“Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity”.PLoS ONE 6(5):e19509；Cermak,T.；Doyle,E.L.；Christian,M.；Wang,L.；Zhang,Y.；Schmidt,C.；Baller,J.A.；Somia,N.V.等(2011).“Efficient design andassembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNAtargeting”.Nucleic Acids Research；Morbitzer,R.；Elsaesser,J.；Hausner,J.；Lahaye,T.(2011).“Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modularcloning”.Nucleic Acids Research；Li,T.；Huang,S.；Zhao,X.；Wright,D.A.；Carpenter,S.；Spalding,M.H.；Weeks,D.P.；Yang,B.(2011).“Modularly assembled designer TALeffector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement ineukaryotes”.Nucleic Acids Research.；Weber,E.；Gruetzner,R.；Werner,S.；Engler,C.；Marillonnet,S.(2011).Bendahmane,Mohammed.ed.“Assembly of Designer TALEffectors by Golden Gate Cloning”.PLoS ONE 6(5):e19722；其各自完整内容通过提述并入本文)。
术语“治疗/处理”指目的为如本文中描述的疾病或病症或其一种或多种症状的逆转、减轻、延迟其发作、或抑制其进展的临床干预。如本文中使用的，术语“治疗/处理”指目的为如本文中描述的疾病或病症或其一种或多种症状的逆转、减轻、延迟其发作、或抑制其进展的临床干预。在一些实施方案中，治疗可以在一种或多种症状已形成和/或已诊断出疾病后施用。在其他实施方案中，治疗可以在不存在症状的情况下施用，例如以预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如，治疗可以在症状发作之前对易感个体施用(例如根据症状史和/或根据遗传或其他易感性因素)。治疗还可以在症状已消退后持续，例如以预防或延迟其复发。
术语“锌指”，如本文中使用的，指小核酸结合蛋白结构基序，其特征在于折叠和稳定该折叠的一个或多个锌离子的配位。锌指涵盖很多种不同的蛋白结构(参见，例如KlugA,Rhodes D(1987).“Zinc fingers:a novel protein fold for nucleaserecognition”.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52:473–82,其完整内容通过提述并入本文)。锌指可以设计为结合核苷酸的特定序列，且包含一系列锌指的融合物的锌指阵列可以设计为结合实际上任何期望的靶序列。这类锌指阵列可以形成蛋白质例如核酸酶的结合域，例如如果缀合于核酸切割域时。不同类型的锌指基序是本领域技术人员已知的，包括但不限于Cys2His2、Gag指节(knuckle)、Treble clef、锌带(Zinc ribbon)、Zn2/Cys6和TAZ2域样基序(参见，例如Krishna SS,Majumdar I,Grishin NV(January 2003).“Structuralclassification of zinc fingers:survey and summary”.Nucleic Acids Res.31(2):532–50)。单个锌指基序通常结合核酸分子的3或4个核苷酸。因此，包含2个锌指基序的锌指域可以结合6-8个核苷酸，包含3个锌指基序的锌指域可以结合9-12个核苷酸，包含4个锌指基序的锌指域可以结合12-16个核苷酸，如此类推。可以采用任何适宜的蛋白质工程化技术来改变锌指的DNA结合特异性和/或设计新的锌指融合物来结合实际上任何期望的长度从3–30个核苷酸的靶序列(参见，例如Pabo CO,Peisach E,Grant RA(2001).“Design andselection of novel cys2His2Zinc finger proteins”.Annual Review ofBiochemistry 70:313–340；Jamieson AC,Miller JC,Pabo CO(2003).“Drug discoverywith engineered zinc-finger proteins”.Nature Reviews Drug Discovery 2(5):361–368；和Liu Q,Segal DJ,Ghiara JB,Barbas CF(May1997).“Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(11)；其各自完整内容通过提述并入本文)。工程化的锌指阵列和切割核酸的蛋白质域之间的融合物可用于生成“锌指核酸酶”。锌指核酸酶通常包含结合核酸分子内的特定靶位点的锌指域，和切割在由结合域结合的靶位点内或附近处的核酸分子的核酸切割域。典型的工程化的锌指核酸酶包含结合域，其具有3至6个个体锌指基序和长度范围从9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。更长的靶位点在期望结合和切割在给定基因组中是独特的靶位点的情况下更有吸引力。
术语“锌指核酸酶”，如本文中使用的，指包含缀合于结合域的核酸切割域的核酸酶，所述结合域包含锌指阵列。在一些实施方案中，切割域是II型限制内切核酸酶FokI的切割域。锌指核酸酶可以设计为靶向给定核酸分子中用于切割的实际上任意期望的序列，且设计锌指结合域结合完整基因组背景中的独特位点的可能性活细胞中单个基因组位点的靶向性切割，例如以实现具有治疗价值的靶向性基因组改变。将双链断裂靶向至期望的基因组基因座可用于将移码突变(frame-shift mutation)引入基因的编码序列中，这是由非同源DNA修复途径的易错性质所致。可通过本领域技术人员公知的方法生成锌指核酸酶以靶向感兴趣的位点。例如，可以设计具有期望特异性的锌指结合域，其通过组合具有已知特异性的个体锌指基序。结合DNA的锌指对比Zif268的结构已显示了本领域中的很多工作，且已描述了对于64种可能的碱基对三联体的每种，获得锌指然后混合和匹配这些模式锌指来设计具有任何期望的序列特异性的蛋白质的思路(Pavletich NP,Pabo CO(May 1991).“Zinc finger-DNA recognition:crystal structure of a Zif268-DNA complex at2.1A”.Science 252(5007):809–17，其完整内容通过提述并入本文)。在一些实施方案中，组合各自识别3碱基对DNA序列的分别的锌指以生成识别长度范围从9碱基对至18碱基对的靶位点的3-,4-,5-或6-锌指阵列。在一些实施方案中，涵盖更长的阵列。在其他实施方案中，组合识别6-8个核苷酸的2锌指模块以生成4-,6-或8-锌指阵列。在一些实施方案中，利用细菌或噬菌体展示来开发识别期望核酸序列，例如长度为3-30bp的期望核酸酶靶位点的锌指域。在一些实施方案中，锌指核酸酶包含融合或者经由接头(例如多肽接头)彼此缀合的锌指结合域和切割域。接头的长度决定切割离锌指域结合的核酸序列的距离。如果使用较短的接头，那么切割域将切割更接近结合的核酸序列的核酸，而更长的接头将导致切割与结合的核酸序列之间的更大的距离。在一些实施方案中，锌指核酸酶的切割域必须二聚化以切割结合的核酸。在一些这类实施方案中，二聚体是两个单体的异二聚体，其各自包含不同的锌指结合域。例如在一些实施方案中，二聚体可以包含包括缀合于FokI切割域的锌指域A的一个单体，和包含缀合于FokI切割域的锌指域B的一个单体。在该非限制性例子中，锌指域A在靶位点的一侧结合核酸序列，锌指域B在靶位点的另一侧结合核酸序列，且二聚化FokI域切割锌指域结合位点之间的核酸。
本发明特定实施方案的具体描述
导言
位点特异性核酸酶是体外或体内进行靶向性基因组修饰的强大工具。一些位点特异性核酸酶在理论上对于靶切割位点能够实现允许靶向切割的基因组中的单个独特位点而不影响任何其他基因组位点的特异性水平。已报道了活细胞中的核酸酶切割触发一种DNA修复机制，其经常导致对经切割的修复的基因组序列的修饰，例如经由同源重组。因此，对基因组内特定的独特序列的靶向性切割打开了活细胞中基因靶向和基因修饰的新途径，所述细胞包括难以用常规基因靶向方法操作的细胞，如许多人体细胞或胚胎干细胞。对疾病相关的序列例如HIV/AIDS患者中的CCR-5等位基因，或肿瘤新血管形成必需的基因的核酸酶介导的修饰可以用在临床背景中，而且两种位点特异性核酸酶目前正在临床试验中。
位点特异性核酸酶介导的修饰的领域中一个重要的方面是脱靶核酸酶效应，例如对与意图的靶序列相差一个或多个核苷酸的基因组序列的切割。脱靶切割的不想要的副作用可以从在基因靶向事件期间插入不期望的基因座到临床情况下的严重并发症。施用给受试者的内切核酸酶对编码必要基因功能或肿瘤抑制基因的序列的脱靶切割可能导致疾病或甚至受试者的死亡。因此，期望在实验室或临床中使用核酸酶之前表征该核酸酶的切割偏好以确定其功效和安全性。另外，对核酸酶切割特性的表征允许从一组候选核酸酶中选出最适合特定任务的核酸酶，或选择从多种核酸酶获得的进化产物。对核酸酶切割特性的这类表征还可以赋予核酸酶的从头设计以增强的特性，例如增强的特异性或效率。
在将核酸酶用于核酸的靶向性操作的许多情况下，切割特异性是一项关键的特征。一些工程化的核酸酶结合域的有缺点的特异性可能在体外和体内导致脱靶切割和不想要的作用。目前评估位点特异性核酸酶特异性的方法，包括ELISA测定法、微阵列、单杂交系统、SELEX、及其变形、和基于Rosetta的计算机预测均以以下假设为前提：核酸酶的结合特异性与其切割特异性等同或成比例。
之前发现对核酸酶脱靶结合效应的预测形成的是对核酸酶的脱靶切割效应的有缺陷的近似，其可能导致不想要的生物学效果(参见PCT申请WO 2013/066438；和Pattanayak,V.,Ramirez,C.L.,Joung,J.K.&Liu,D.R.Revealing off-target cleavagespecificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection.Nature methods8,765-770(2011)，其各自完整内容通过提述并入本文中)。该发现与报道的一些位点特异性DNA核酸酶的毒性来自脱靶DNA切割而不仅仅是脱靶结合的观点一致。
在一些方面，本公开的方法和试剂代表对之前方法的改进且允许对给定核酸酶的靶位点特异性的准确估测，以及提供用于选择适宜的独特靶位点和设计或选择高度特异性的核酸酶用于完整基因组背景中单个位点得到靶向性切割的策略。例如，一些先前报道的通过筛选包含候选靶位点的核酸分子文库来测定核酸酶靶位点特异性概况的方法依赖于“两切割(two-cut)”体外选择方法，其需要从核酸酶对文库成员核酸的两次临近切割产生的两个半位点的序列间接重建靶位点(参见例如Pattanayak,V.等,Nature Methods 8,765-770(2011))。与这类“两切割”策略相对的是，本公开的方法利用了“单切割(one cut)”筛选策略，其允许鉴定出被核酸酶切割至少一次的文库成员。本文中提供的“单切割”选择策略与单端高通量测序方法兼容且不需要从切割的半位点计算机重建处切割的靶位点，因为在一些实施方案中，其特点是对经切割的文库成员核酸中的完整靶核酸酶序列直接测序。
另外，本发明公开的“单切割”筛选方法利用候选核酸酶靶位点和恒定插入区的多联体，其比之前报道的用于两切割策略的构建体短约10倍(～50bp重复序列长度对之前报道中的～500bp重复序列长度)。文库的多联体中重复序列长度的差异允许生成候选核酸酶靶位点的高度复杂的文库，例如包含1012种不同的候选核酸酶靶序列的文库。如本文中描述的，已生成具有这类复杂性的例示性文库，其以已知的Cas9核酸酶靶位点为模板通过改变已知靶位点的序列而产生。该例示性文库证明可以使用本文中提供的策略实现具有对已知靶位点的8个或更少突变的所有序列的超过10倍覆盖。使用更短的重复序列也允许使用单端测序，因为同一文库成员的经切割的半位点和临近的未切割的位点都包含在100核苷酸测序读段中。
本文中提供的策略、方法、文库和试剂可用于分析任意位点特异性核酸酶的序列偏好和特异性，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶、有机化合物核酸酶、和烯二炔抗生素(例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素)。基于本公开，除了本文中描述的那些以外的适宜的核酸酶对于本领域技术人员来说将是明显的。
此外，本文中提供的方法、试剂和策略允许本领域技术人员鉴定、设计和/或选择出具有增强特异性的核酸酶和最小化任何给定核酸酶(例如位点特异性核酸酶如ZFN，和产生具有粘端的切割产物的TALENS，以及可RNA编程的核酸酶如Cas9，其产生具有平端的切割产物)的脱靶效应。尽管与DNA和切割DNA的核酸酶特别相关，但本文中提供的发明概念、方法、策略和试剂不限于此方面，而是可以应用于任何核酸:核酸酶对。
鉴定被位点特异性核酸酶切割的核酸酶靶位点
本公开的一些方面提供改进的方法和试剂来测定由任意位点特异性核酸酶切割的核酸靶位点。本文中提供的方法可用于评估创建平端的核酸酶和创建粘端的核酸酶两者的靶位点偏好性和特异性。一般而言，这类方法包括使给定的核酸酶与靶位点的文库在适合所述核酸酶结合和切割靶位点的条件下接触，并测定所述核酸酶实际切割的靶位点。基于实际的切割来测定核酸酶的靶位点概况相对于依赖结合的方法的优势在于，其测量的是与介导位点特异性核酸酶的不想要的脱靶效应更相关的参数。一般地，本文中提供的方法包括经由5′-磷酸根依赖性连接将已知序列的接头连接于已被感兴趣的核酸酶切割的核酸分子。因此，本文中提供的方法尤其可用于鉴定被以下核酸酶切割的靶位点，该核酸酶在离开其靶位点时在经切割的核酸链的5’端留下磷酸模块。在将接头连接于经切割的核酸链的5′端后，可以使用接头作为测序接头对经切割的链直接测序，后者可以经由PCR扩增包含与经切割的靶位点相同的完整靶位点的切割文库成员多联体的部分，然后可以对扩增产物测序。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5’磷酸根模块的经切割的核酸链；(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在适合所述核酸酶切割包含所述核酸酶的靶位点的候选核酸分子的条件下接触，其中每个核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和恒定的插入序列；和(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过测定在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点的序列。
在一些实施方案中，所述方法包括提供核酸酶和使该核酸酶与包含候选靶位点的候选核酸分子的文库接触。在一些实施方案中，所述候选核酸分子是双链核酸分子。在一些实施方案中，所述候选核酸分子是DNA分子。在一些实施方案中，文库中的每种核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和恒定的插入序列。例如，在一些实施方案中，所述文库包含包括结构R1-[(候选核酸酶靶位点)-(恒定插入序列)]n-R2的核酸分子，其中R1和R2独立地为可以包含[(候选核酸酶靶位点)-(恒定插入序列)]结构的片段的核酸序列，且n是2至y的整数。在一些实施方案中，y为至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014或至少1015。在一些实施方案中，y小于102、小于103、小于104、小于105、小于106、小于107、小于108、小于109、小于1010、小于1011、小于1012、小于1013、小于1014或小于1015。
例如，在一些实施方案中，文库的候选核酸分子包含具有结构[(NZ)–(PAM)]的候选核酸酶靶位点，由此文库的核酸分子包含结构R1–[(NZ)–(PAM)-(恒定区)]X–R2，其中R1和R2独立地为可以包含[(NZ)–(PAM)-(恒定区)]重复单元的片段的核酸序列；每个N独立地表示任意核苷酸；Z是1至50的整数；且X是2至y的整数。在一些实施方案中，y为至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014或至少1015。在一些实施方案中，y小于102、小于103、小于104、小于105、小于106、小于107、小于108、小于109、小于1010、小于1011、小于1012、小于1013、小于1014或小于1015。在一些实施方案中，Z为至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些实施方案中，Z是20。每个N独立地表示任意核苷酸。因此，呈现为NZ且Z＝2的序列将是NN，每个N独立地表示A、T、G或C。因此，NZ且Z＝2可以表示AA、AT、AG、AC、TA、TT、TG、TC、GA、GT、GG、GC、CA、CT、CG和CC。
在其他实施方案中，文库的候选核酸分子包含具有结构[左半位点]-[间隔序列]-[右半位点](“LSR”)的候选核酸酶靶位点，因此文库的核酸分子包含结构R1–[(LSR)–(恒定区)]X–R2，其中R1和R2独立地为包含[(LSR)–(恒定区)]重复单元的片段的核酸序列，且X是2至y的整数。在一些实施方案中，y是至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014或至少1015。在一些实施方案中，y小于102、小于103、小于104、小于105、小于106、小于107、小于108、小于109、小于1010、小于1011、小于1012、小于1013、小于1014或小于1015。在一些实施方案中，恒定区具有允许单个重复单元有效自连接的长度。适宜的长度对于本领域技术人员来说将是明显的。例如，在一些实施方案中，恒定区为5至100个碱基对长，例如，约5个碱基对、约10个碱基对、约15个碱基对、约20个碱基对、约25个碱基对、约30个碱基对、约35个碱基对、约40个碱基对、约50个碱基对、约60个碱基对、约70个碱基对、约80个碱基对、约90个碱基对、或约100个碱基对长。在一些实施方案中，恒定区为16个碱基对长。在一些实施方案中，所述核酸酶切割双链核酸靶位点并创造平端。在其他实施方案中，所述核酸酶创造5′-突出。在一些这类实施方案中，所述靶位点包含[左半位点]-[间隔序列]-[右半位点](LSR)结构，且所述核酸酶切割间隔序列内的靶位点。
在一些实施方案中，核酸酶切割双链靶位点并创造平端。在一些实施方案中，核酸酶切割双链靶位点并创造突出，或粘端，例如5′突出。在一些这类实施方案中，所述方法包括在已被所述核酸酶切割一次的核酸分子产生的核酸分子的5′突出中填补，其中所述核酸分子包含一侧侧接左或右半位点和切割间隔序列，而另一侧侧接未切割的靶位点序列的恒定插入序列，由此创建平端。
在一些实施方案中，步骤(c)的测定包括经由5’-磷酸依赖性连接来将第一核酸接头连接至步骤(b)中被核酸酶切割的核酸链的5′端。在一些实施方案中，核酸酶创建平端。在这类实施方案中，接头可以直接连接到从靶位点的核酸酶切割产生的平端，其通过将经切割的文库成员与缺乏5’磷酸化的双链、平端接头接触。在一些实施方案中，所述核酸酶创建突出(粘端)。在一些这类实施方案中，可以通过将经切割的文库成员与过量的具有相容粘端的接头接触来将接头连接至经切割的位点。如果使用在可变半位点之间的恒定间隔序列中切割的核酸酶，那么粘端可以设计为匹配从间隔序列创造的5′突出。在其中核酸酶在可变序列中切割的实施方案中，可使用具有可变突出序列和恒定退火序列的接头群体(用作测序接头或PCR引物)，或者在接头连接前可以填补5′突出以形成平端。
在一些实施方案中，步骤(c)的测定进一步包括使用与所述接头杂交的PCR引物和与所述恒定插入序列杂交的PCR引物经由PCR扩增被核酸酶切割的多联体的片段，该片段包含未切割的靶位点。经由PCR对多联体的扩增通常将得到包含至少一个与经切割靶位点相同的完整候选靶位点的扩增子，因为每个多联体中的靶位点是相同的。对于单方向测序，可以期望富集包含一个完整靶位点、不超过两个完整靶位点、不超过三个完整靶位点、不超过四个完整靶位点、不超过五个完整靶位点的扩增子。在其中将PCR用于扩增经切割的核酸分子的实施方案中，可以优化PCR参数以利于扩增短序列和不偏好扩增更长序列，例如通过在PCR循环中使用短延伸时间。另一个富集段扩展至的可能性是大小分级，例如经由凝胶电泳或大小排阻层析。大小分级可在扩增之前和/或之后实施。其他适用于富集短扩增子的方法对于本领域技术人员将是明显的且本公开在此方面不受限制。
在一些实施方案中，步骤(c)的测定步骤包括对在步骤(b)中被核酸酶切割的核酸链或经由扩增例如PCR获得的其拷贝测序。测序方法是本领域技术人员公知的。本公开在此方面不受限制。
在一些实施方案中，使用本发明系统进行概况分析的核酸酶是与RNA分子形成复合物的可RNA编程的核酸酶，且其中所述核酸酶:RNA复合物特异性结合与RNA分子的序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述RNA分子是单导引RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，所述sgRNA包含5-50个核苷酸、10-30个核苷酸、15-25个核苷酸、18-22个核苷酸、19-21个核苷酸、例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述sgRNA包含与核酸酶靶位点的序列互补的5-50个核苷酸、10-30个核苷酸、15-25个核苷酸、18-22个核苷酸、19-21个核苷酸、例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，所述sgRNA包含与核酸酶靶位点互补的20个核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸酶是Cas9核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶靶位点包含[sgRNA互补性序列]-[原间隔区临近基序(PAM)]结构，且该核酸酶切割sgRNA互补性序列中的靶位点。在一些实施方案中，所述sgRNA互补性序列包含5-50个核苷酸、10-30个核苷酸、15-25个核苷酸、18-22个核苷酸、19-21个核苷酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施方案中，可RNA编程的核酸酶是Cas9核酸酶。可RNA编程的Cas9内切核酸酶在临近于两碱基对PAM基序处且与导引RNA序列(sgRNA)互补的位点切割双链DNA(dsDNA)。与靶位点序列互补的sgRNA序列通常长度为约20个核苷酸，但也可以使用更短和更长的互补sgRNA序列。例如在一些实施方案中，所述sgRNA包含5-50个核苷酸、10-30个核苷酸、15-25个核苷酸、18-22个核苷酸、19-21个核苷酸，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。Cas9系统已被用来修饰多种细胞类型中的基因组，证明了其作为一种容易的基因组工程化工具的潜力。
在一些实施方案中，核酸酶包含非特异性核酸切割域。在一些实施方案中，核酸酶包含FokI切割域。在一些实施方案中，核酸酶包含在切割域二聚化时切割靶序列的核酸切割域。在一些实施方案中，核酸酶包含特异性结合核酸序列的结合域。在一些实施方案中，结合域包含锌指。在一些实施方案中，结合域包含至少2、至少3、至少4或至少5个锌指。在一些实施方案中，所述核酸酶是锌指核酸酶。在一些实施方案中，结合域包含转录激活物样元件。在一些实施方案中，核酸酶是转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，所述核酸酶是归巢内切核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶是有机化合物。在一些实施方案中，所述核酸酶包含烯二炔功能团。在一些实施方案中，所述核酸酶是抗生素。在一些实施方案中，化合物是达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素、或其衍生物。
将核酸酶与文库核酸温育将导致文库中包含可被该核酸酶结合和切割的靶位点的那些多联体的切割。如果给定的核酸酶以高效率切割特异性靶位点，那么包含靶位点的多联体将被切割例如一次或多次，从而导致包含临近于一个或多个重复单元的经切割的靶位点的片段的生成。根据文库成员的结构，通过单核酸酶切割从文库成员多联体释放的例示性的经切割核酸分子可以例如具有结构(经切割的靶位点)-(恒定区)-[(靶位点)–(恒定区)]X–R2。例如，在RNA导引的核酸酶的背景中，通过单核酸酶切割从文库成员多联体释放的例示性的经切割核酸分子可以例如具有结构(PAM)-(恒定区)-[(NZ)–(PAM)-(恒定区)]X–R2。而且，在切割间隔区内LSR结构的核酸酶的背景中，通过单核酸酶切割从文库成员多联体释放的例示性的经切割核酸分子可以例如具有结构(切割的间隔区)-(右半位点)-(恒定区)-[(LSR)–(恒定区)]X–R2。然后，可以纯化从文库候选分子释放的这类经切割片段和/或鉴定被核酸酶切割的靶位点的序列，其通过对释放的重复单元的完整靶位点(例如完整(NZ)-(PAM)测序。见例如图1B的例示。
用于暴露核酸分子的文库的适宜条件对于本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案中，适宜条件不会导致文库核酸或核酸酶的变性并允许核酸酶展现其核酸酶活性的至少50％,至少60％,至少70％,至少80％,至少90％,至少95％或至少98％。
另外，如果给定的核酸酶切割特定的靶位点，一些切割产物将包含经切割的半位点和完整或未经切割的靶位点。如本文描述的，这类产物可通过常规方法分离，且由于在一些方面，插入序列短于100个碱基对，这类分离的切割产物可以以单读段通量测序，从而允许在不重建序列(例如从半位点)的情况下鉴定靶位点序列。
可以采用任何适用于分离和测序重复单元的方法来阐明被核酸酶切割的LSR序列。例如，由于恒定区的长度已知，可以基于其大小从较大的未经切割的文库核酸分子以及从包含多个重复单元的文库核酸分子的片段(指示核酸酶的低效的靶向性切割)分开释放的重复单元个体。适用于基于其大小分开和/或分离核酸分子的方法是本领域技术人员公知的，且包括例如大小分级方法，如凝胶电泳、密度梯度离心、和对具有适宜分子截留值的半渗透膜渗析。然后，可以进一步表征分离/纯化的核酸分子，例如通过将PCR和/或测序接头连接到经切割末端并扩增和/或测序相应的核酸。进一步地，如果选择恒定区的长度为有利于释放的重复单元个体的自连接，那么可以富集这类释放的重复单元个体，其通过使经核酸酶处理的文库分子与连接酶接触，接着基于自连接的个体重复单元的环化性质来扩增和/或测序。
在一些其中使用生成5’突出作为切割靶核酸结果的核酸酶的实施方案中，填补经切割核酸分子的5′突出。用于填补5′突出的方法是本领域技术人员公知的，且包括例如使用缺少外切核酸酶活性的DNA聚合酶I Klenow片段(Klenow(3′->5′外切-))的方法。在5′-突出中填补导致对凹入链的以突出为模板的延伸，这相应地产生平端。在从文库多联体释放的单重复单元的情况中，所得结构是平端S2′R-(恒定区)-LS1′，其中S1′和S2′包含平端。然后，PCR和/或测序接头可通过平端连接添加到末端且可以对相应的重复单元(包括S2′R和LS1′区)测序。从测序数据，可以推导出原始LSR区。对核酸酶切割过程中创建的突出的平端化还允许区分被相应核酸酶适当切割的靶位点和非特异性切割(例如基于非核酸酶效应如物理剪切)的靶位点。正确切割的核酸酶靶位点可被存在的互补性S2′R和LS1′区识别，该区域包含由突出填补产生的突出核苷酸的复制物，而未被相应核酸酶切割的靶位点不太可能包含突出核苷酸复制物。在一些实施方案中，所述方法包括鉴定被核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过测定释放的个体重复单元的左半位点、右半位点和/或间隔序列的序列。可以使用任何适用于扩增和/或测序的方法来鉴定被相应核酸酶切割的靶位点的LSR序列。用于扩增和/或测序核酸的方法是本领域技术人员公知的且本公开在此方面不受限制。在从文库多联体释放的包含经切割的半位点和未经切割的靶位点(例如包含至少约1.5个重复序列)的核酸的情况中，5′-突出填补还提供了核酸被核酸酶切割的保证。由于所述核酸还包含完整或未经切割的靶位点，可以测定所述位点的序列而不用从左半位点、右半位点和/或间隔序列重建序列。
本文中提供的一些方法和策略允许同时评估作为任何给定核酸酶的可能切割靶物的多种候选靶位点。因此，从这类方法获得的数据可用于汇编由给定核酸酶切割的靶位点的列表，其在本文中也称为靶位点概况。如果使用允许生成定量测序数据的测序方法，那么还可以记录检测到被相应核酸酶切割的任意核酸酶靶位点的相对丰度。更有效地被核酸酶切割的靶位点将在测序步骤中更频繁地被检测处，而不太有效切割的靶位点将仅稀少地从候选多联体释放个体重复单元，如此将近生成很少的(若有的话)测序读段。这类定量测序数据可整合到靶位点概况以生成高度优选和不太优选的核酸酶靶位点的排序列表。
本文中提供的核酸酶靶位点概况分析的方法和策略可应用于任何位点特异性核酸酶，包括例如ZFN、TALEN、归巢内切核酸酶和可RNA编程的核酸酶如Cas9核酸酶。如本文中更详细描述的，核酸酶特异性通常随着增加的核酸酶浓度而降低，且本文中描述的方法可用于测定给定的核酸酶有效切割其意图靶位点但不有效切割任何脱靶序列时所处的浓度。在一些实施方案中，测定治疗性核酸酶切割其意图核酸酶靶位点但不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或任何另外位点时所处的治疗性核酸酶的最大浓度。在一些实施方案中，以有效生成等同或低于如上文描述测定的最大浓度的终浓度的量对受试者施用治疗性核酸酶。
在一些实施方案中，本文描述的方法中使用的候选核酸分子的文库包含至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012种不同的候选核酸酶靶位点。
在一些实施方案中，所述核酸酶是治疗性核酸酶，其在与疾病有关的基因中切割特定的核酸酶靶位点。在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定治疗性核酸酶的最大浓度，在该浓度所述治疗性核酸酶切割特定的核酸酶靶位点且不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或没有切割另外的位点。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以有效生成等同或低于该最大浓度的终浓度的量对受试者施用治疗性核酸酶。
核酸酶靶位点文库
本公开的一些实施方案提供用于核酸酶靶位点概况分析的核酸分子的文库。在一些实施方案中，文库的候选核酸分子包含结构R1–[(NZ)–(PAM)-(恒定区)]X–R2，其中R1和R2独立地为可以包含[(NZ)–(PAM)-(恒定区)]重复单元的片段的核酸序列；每个N独立地表示任何核苷酸；Z是1至50的整数；且X是2至y的整数。在一些实施方案中，y是至少101,至少102,至少103,至少104,至少105,至少106,至少107,至少108,至少109,至少1010,至少1011,至少1012,至少1013,至少1014或至少1015。在一些实施方案中，y小于102、小于103、小于104、小于105、小于106、小于107、小于108、小于109、小于1010、小于1011、小于1012、小于1013、小于1014或小于1015。在一些实施方案中，Z为至少2,至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少25,至少30,至少35,至少40,至少45或至少50。在一些实施方案中，Z是20。每个N独立表示任意核苷酸。因此，呈现为NZ且Z＝2的序列将是NN，每个N独立代表A,T,G或C。因此，NZ且Z＝2可表示AA,AT,AG,AC,TA,TT,TG,TC,GA,GT,GG,GC,CA,CT,CG和CC。
在一些实施方案中，提供包含候选核酸分子的文库，所述候选核酸分子包含具有部分随机化的左半位点、部分随机化的右半位点和/或部分随机化的间隔序列的靶位点。在一些实施方案中，提供包含候选核酸分子的文库，所述候选核酸分子包含具有部分随机化的左半位点、完全随机化的间隔序列和部分随机化的右半位点的靶位点。在一些实施方案中，提供包含候选核酸分子的文库，所述候选核酸分子包含具有部分或完全随机化的序列的靶位点，其中所述靶位点包含结构[NZ-(PAM)]，例如如本文描述的。在一些实施方案中，部分随机化的位点与共同位点的差异是平均超过5％,超过10％,超过15％,超过20％,超过25％或超过30％，呈二项式分布。
在一些实施方案中，这类文库包含多种核酸分子，每种包含候选核酸酶靶位点和恒定插入序列(本文中也称为恒定区)的多联体。例如，在一些实施方案中，文库的候选核酸分子包含结构R1-[(sgRNA互补性序列)-(PAM)-(恒定区)]X-R2，或结构R1–[(LSR)–(恒定区)]X–R2，其中方括号(“[…]”)中的结构称为重复单元或重复序列；R1和R2独立地为可以包含重复单元片段的核酸序列，且X是2至y的整数。在一些实施方案中，y是至少101,至少102,至少103,至少104,至少105,至少106,至少107,至少108,至少109,至少1010,至少1011,至少1012,至少1013,至少1014或至少1015。在一些实施方案中，y小于102、小于103、小于104、小于105、小于106、小于107、小于108、小于109、小于1010、小于1011、小于1012、小于1013、小于1014或小于1015。在一些实施方案中，恒定区的长度允许单个重复单元的有效自连接。在一些实施方案中，恒定区的长度允许将单重复单元从包含两个或多个重复单元的片段有效分离。在一些实施方案中，恒定区的长度允许对一个测序读段中的完整重复单元有效测序。适宜的长度对于本领域技术人员将是明显的。例如在一些实施方案中，所述恒定区的长度是5至100个碱基对，例如约5个碱基对、约10个碱基对、约15个碱基对、约20个碱基对、约25个碱基对、约30个碱基对、约35个碱基对、约40个碱基对、约50个碱基对、约60个碱基对、约70个碱基对、约80个碱基对、约90个碱基对或约100个碱基对。在一些实施方案中，所述恒定区长度为1,2,3,4,5,6,7,8,9,0,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80个碱基对。
LSR位点通常包含[左半位点]-[间隔序列]-[右半位点]结构。半大小和间隔序列的长度将依赖于要评估的特异性将依赖于要评估的具体核酸酶。一般地，半位点将长为6-30个核苷酸，优选长为10-18个核苷酸。例如，每个半位点分别可以长为6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30个核苷酸。在一些实施方案中，LSR位点可以比30个核苷酸长。在一些实施方案中，LSR的左半位点和右半位点具有相同长度。在一些实施方案中，LSR的左半位点和右半位点具有不同长度。在一些实施方案中，LSR的左半位点和右半位点具有不同序列。在一些实施方案中，提供包含候选核酸的文库，其包含可由FokI切割域、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)、归巢内切核酸酶或有机化合物(例如烯二炔抗生素如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、和埃斯波霉素；和博来霉素)切割的LSR。
在一些实施方案中，提供候选核酸分子的文库，其包含至少105,至少106,至少107,至少108,至少109,至少1010,至少1011,至少1012,至少1013,至少1014或至少1015种不同的候选核酸酶靶位点。在一些实施方案中，所述文库的候选核酸分子是通过滚环扩增从环化(secularized)模板产生的多联体。在一些实施方案中，所述文库包含分子量为至少5kDa,至少6kDa,至少7kDa,至少8kDa,至少9kDa,至少10kDa,至少12kDa或至少15kDa的核酸分子，例如多联体。在一些实施方案中，文库中核酸分子的分子量可以大于15kDa。在一些实施方案中，所述文库包含在特定大小范围内的核酸分子，例如在5-7kDa,5-10kDa,8-12kDa,10-15kDa或12-15kDa或5-10kDa或任何可能的子范围内。尽管依照本公开的一些方面适用于生成核酸多联体的一些方法导致具有极大不同分子量的核酸分子的生成，但可以对核酸分子的这类混合物大小分级以获得期望的大小分布。适用于富集具有期望大小的核酸分子或排除具有期望大小的核酸分子的方法是本领域技术人员公知的且本公开在此方面不受限制。
在一些实施方案中，部分随机化的位点与共同位点的差异平均不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过40％、或不超过50％，呈二项式分布。例如，在一些实施方案中，部分随机化的位点与共同位点的差异超过5％，但不超过10％；超过10％，但不超过20％；超过20％，但不超过25％；超过5％，但不超过超过20％，以此类推。使用文库中的部分随机化的核酸酶靶位点可用于增加包含靶位点的文库成员的浓度，所述靶位点与共同位点关系紧密，例如与共同位点的差异仅为1、仅为2、仅为3、仅为4或仅为5个残基。这背后的原理是给定的核酸酶，例如给定的ZFN或可RNA编程的核酸酶，可能切割其意图的靶位点和任何密切相关的靶位点，但不太可能切割与意图靶位点差异较多或完全不相关的靶位点。因此，使用包含部分随机化靶位点的文库可以比使用包含完全随机化靶位点的文库更有效，且不损害检测任何给定核酸酶的任何脱靶切割事件的灵敏性。如此，使用部分随机化的文库显著降低产生具有覆盖给定核酸酶的实际上所有脱靶位点的高可能性的文库所需的成本和工作。然而，在一些实施方案中，可能期望使用靶位点的完全随机化的文库，例如在给定核酸酶的特异性要在给定基因组中的任何可能位点的背景中评估的实施方案中。
位点特异性核酸酶的选择和设计
本公开的一些方面提供用于选择和设计位点特异性核酸酶的方法和策略，所述位点特异性核酸酶允许复杂基因组的背景中单一、独特位点的靶向性切割。在一些实施方案中，提供以下方法，其包括提供多种设计为或已知切割相同的共同序列的候选核酸酶；对由每种候选核酸酶实际切割的靶位点进行概况分析，由此检测任何切割的脱靶位点(不同于共同靶位点的靶位点)；和基于如此鉴定的一种或多种脱靶位点选择候选核酸酶。在一些实施方案中，该方法用于从一组候选核酸酶中选出最特异性的核酸酶，例如以最高特异性切割共同靶位点的核酸酶，切割最低数目的脱靶位点的核酸酶，在靶基因组的背景中切割最低数目的脱靶位点的核酸酶，或不切割共同靶位点以外的任何靶位点的核酸酶。在一些实施方案中，该方法用于选出在等于或高于核酸酶的治疗有效浓度的浓度处在受试者的基因组的背景中不切割任何脱靶位点的核酸酶。
本文中提供的方法和试剂可用于，例如评估靶向同一意图的靶位点的多种不同的核酸酶，例如给定的位点特异性核酸酶(例如给定的锌指核酸酶)的多种变体。这类方法可用作进化或设计出具有改进特异性的新位点特异性核酸酶中的选择步骤。
鉴定基因组内的独特核酸酶靶位点
本公开的一些实施方案提供用于选择基因组内的核酸酶靶位点的方法。如本文中别处更详细描述的，惊讶地发现由给定核酸酶切割的脱靶位点一般高度类似于共同靶位点，例如与共同靶位点的差异为仅1个、仅2个、仅3个、仅4个或仅5个核苷酸残基。基于该发现，可以选择基因组内的核酸酶靶位点来增加靶向该位点不切割基因组内的任何脱靶位点的核酸酶的可能性。例如，在一些实施方案中，提供一种方法，其包括鉴定候选核酸酶靶位点；和将候选核酸酶靶位点与基因组内的其他序列比较。用于将候选核酸酶靶位点与基因组内其他序列比较的方法是本领域技术人员公知的且包括例如序列比对方法，例如使用序列比对软件或算法，如在一般目的计算机上的BLAST。然后，可以基于序列比较的结果选择适宜的独特核酸酶靶位点。在一些实施方案中，如果候选核酸酶靶位点与基因组内的任何其他序列的差异为至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9或至少10个核苷酸，那么该核酸酶靶位点被选择基因组内的独特位点，而如果位点不满足该标准，那么该位点可能被弃去。在一些实施方案中，一旦基于上文概述的序列比较选出位点，就设计靶向该选择位点的位点特异性核酸酶。例如，锌指核酸酶可以设计为靶向任何选择的核酸酶靶位点，其通过构建结合靶位点的锌指阵列，和将锌指阵列缀合于DNA切割域。在其中DNA切割域需要二聚化以切割DNA的实施方案中，将设计两个锌指阵列，各自结合核酸酶靶位点的半位点，且各自缀合于切割域。在一些实施方案中，通过重组技术完成核酸酶设计和/或生成。适宜的重组技术是本领域技术人员公知的，且本公开在此方面不受限制。
在一些实施方案中，依照本公开的方面设计或生成的位点特异性核酸酶是分离和/或纯化的。依照本公开的方面用于设计位点特异性核酸酶的方法和策略可应用于设计或生成任何位点特异性核酸酶，包括但不限于锌指核酸酶、转录激活物样效应子核酸酶(TALENs)、归巢内切核酸酶、有机化合物核酸酶、或烯二炔抗生素(例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素)。
分离的核酸酶
本公开的一些方面提供具有增强特异性的分离的位点特异性核酸酶，其使用本文中描述的方法和策略设计。本公开的一些实施方案提供编码这类核酸酶的核酸。本公开的一些实施方案提供包含这类编码核酸的表达构建体。例如，在一些实施方案中，提供已工程化为切割基因组内的期望靶位点的分离的核酸酶，且该核酸酶依照本文提供的方法估测为在对于该核酸酶切割其意图靶位点有效的浓度切割小于1、小于2、小于3、小于4、小于5、小于6、小于7、小于8、小于9或小于10个脱靶位点。在一些实施方案中，提供已工程化为切割期望的独特靶位点的分离的核酸酶，该核酸酶已被选择为与基因组中的任意其他位点的差异为至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9或至少10个核苷酸残基。在一些实施方案中，所述分离的核酸酶是可RNA编程的核酸酶，如Cas9核酸酶；锌指核酸酶(ZFN)；或转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)，归巢内切核酸酶，有机化合物核酸酶，或烯二炔抗生素(例如达内霉素、新制癌菌素、加利车霉素、埃斯波霉素、博来霉素)。在一些实施方案中，分离的核酸酶切割与疾病或病症有关的等位基因内的靶位点。在一些实施方案中，分离的核酸酶切割靶位点，其切割引起对疾病或病症的治疗或预防。在一些实施方案中，所述疾病是HIV/AIDS或增殖性疾病。在一些实施方案中，所述等位基因是CCR5(用于治疗HIV/AIDS)或VEGFA等位基因(用于治疗增殖性疾病)。
在一些实施方案中，提供分离的核酸酶作为药物组合物的部分。例如，一些实施方案提供包含如本文中提供的核酸酶，或编码这类核酸酶的核酸和药学可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的治疗活性物质。
在一些实施方案中，本文中提供的组合物施用给受试者例如人受试者已实现受试者内的靶向性基因组修饰。在一些实施方案中，从受试者获得细胞并与核酸酶或编码核酸酶的核酸离体接触，并在细胞中实现或检测到期望的基因组修饰后重施用给受试者。尽管本文中提供的药物组合物的描述主要针对适用于施用给人的药物组合物但本领域技术人员将理解这类组合物也一般适用于施用给所有种类的动物。容易理解对适用于施用给人的药物组合物进行修饰以使得该组合物适于施用给各种动物，且普通的技术熟练的兽医药理学家能通过普通实验(若有的话)设计和/或实施这类修饰。涵盖施用所述药物组合物的受试者包括但不限于，人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业相关的禽类如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文中描述的药物组合物的配制剂可通过药理学领域已知的或此后开发的任意方法来制备。一般地，这类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分关联，然后，如果需要和/或期望的话，将产物成形和/或包装成期望的单或多剂量单位。
药物配制剂可以另外包含药学可接受的赋形剂，如本文使用的，其包括任意和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮辅助、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适用于期望的具体剂量形式的。Remington的The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过提述完整并入本文)公开了用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于其配制的已知技术。对于其他适用于产生包含核酸酶的药物组合的方法、试剂、赋形剂和溶剂，亦参见PCT申请PCT/US2010/055131，通过提述完整并入本文。除非任意常规赋形介质与物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不想要的生物效果或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，那么在本公开的范围内涵盖其使用。
本发明的这些和其他实施方案的功能和优点从以下实施例将得到更完全的理解。以下实施例意图例示本发明的益处和描述具体的实施方案，但不意图例示本发明的完整范围。因此，应理解所述实施例不意图限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
寡核苷酸.本研究中使用的所有寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies。寡核苷酸序列在表9中列出。
酿脓链球菌Cas9的表达和纯化.将大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞用质粒pMJ80611转化，该质粒编码融合于N末端6xHis标签/麦芽糖结合蛋白的酿脓链球菌cas9基因。将所得表达菌株接种到含有100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的Luria-Bertani(LB)培养液中，在37℃过夜。将细胞以1:100稀释到相同培养基中并在37℃生长至OD600～0.6。将培养物在18℃温育30min，并以0.2mM添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)以诱导Cas9表达。在～17h后，通过在8,000g离心收集细胞并重悬于裂解缓冲液(20mM三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)-HCl，pH 8.0，1M KCl，20％甘油，1mM三(2-羧乙基)膦(TCEP))中。通过超声处理裂解细胞(10秒脉冲开和30秒脉冲关，总计10min，6W输出)，且通过在20,000g离心30min获得可溶裂解物。将细胞裂解物与镍-氮川乙酸(镍-NTA)树脂(Qiagen)在4℃温育20min以捕捉带His标签的Cas9。将树脂转移至20-mL柱并用20个柱体积的裂解缓冲液清洗。Cas9在20mM Tris-HCl(pH 8),0.1M KCl,20％甘油,1mM TCEP和250mM咪唑中洗脱，并通过Amicon ultra离心滤器(Millipore,30-kDa分子量截留)浓缩至～50mg/mL。除去6xHis标签和麦芽糖结合蛋白，其通过在4℃用TEV蛋白处理20h，并通过第二Ni亲和纯化步骤捕捉。将含有Cas9的洗脱物注入到HiTrap SP FF柱(GEHealthcare)中，该柱在含有20mM Tris-HCl(pH 8),0.1M KCl,20％甘油和1mM TCEP的纯化缓冲液中。将Cas9用含有从0.1M至1M的线性KCl梯度的纯化缓冲液在5个柱体积中洗脱。将洗脱的Cas9通过HiLoad Superdex 200柱在纯化缓冲液中进一步纯化，在液氮中速冻，并以等分试样储藏于-80℃。
体外RNA转录.将100pmol CLTA(#)v2.1fwd和v2.1模板rev在补充有10μM dNTP混合物(Bio-Rad)的NEBuffer2(50mM氯化钠，10mM Tris-HCl，10mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇，pH7.9)中在95℃温育和以0.1℃/s降温至37℃。向反应混合物添加10U的Klenow片段(3'→5′外切–)(NEB)，并通过在37℃重叠延伸1h获得双链CLTA(#)v2.1模板。将单独的200nM CLTA(#)v2.1模板或100nM CLTA(#)模板和100nM T7启动子寡聚体在37℃与0.16U/μL T7RNA聚合酶(NEB)在补充有1mM rNTP混合物(1mM rATP,1mM rCTP,1mM rGTP,1mM rUTP)的NEBRNAPol缓冲液(40mM Tris-HCl，pH 7.9，6mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇，2mM亚精胺)中过夜温育。将体外转录的RNA用乙醇沉淀并通过凝胶电泳在Criterion 10％聚丙烯酰胺TBE-Urea凝胶(Bio-Rad)上纯化。将凝胶纯化的sgRNA用乙醇沉淀并再溶于水。
体外文库构建.将10pmol的CLTA(#)lib寡核苷酸分别环化，其通过与100单位的CircLigase II ssDNA连接酶(Epicentre)在补充有2.5mM氯化锰的1x CircLigase II反应缓冲液(33mM Tris-醋酸盐，66mM醋酸钾，0.5mM二硫苏糖醇，pH 7.5)中在总反应反应20μL中于60℃温育16小时。将反应混合物在85℃温育10分钟以使酶失活。将5μL(5pmol)的粗制环状单链DNA用illustra TempliPhi扩增试剂盒(GE Healthcare)依照制造商方案转化成多联体预选择文库。将多联体预选择文库用Quant-it PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen)定量。
中靶和脱靶底物的体外切割.构建PCR的质粒模板，其通过将退火的寡核苷酸CLTA(#)位点fwd/rev插入HindIII/XbaI双消化的pUC19(NEB)中进行。通过用质粒模板和测试fwd和测试rev引物的PCR生成中靶底物DNA，然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。通过引物延伸生成脱靶底物DNA。在用10μM dNTP混合物(Bio-Rad)补充的NEBuffer2(50mM氯化钠,10mM Tris-HCl,10mM氯化镁,1mM二硫苏糖醇,pH 7.9)中将100pmol脱靶(#)fwd和脱靶(#)rev引物在95℃温育并以0.1℃/s降温至37℃。向反应混合物添加10U的Klenow片段(3'→5′外切-)(NEB)并获得双链脱靶模板，其通过在37℃重叠延伸1h，接着在75℃酶失活20min进行，然后用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。将200nM底物DNA与100nM Cas9和100nM(v1.0或v2.1)sgRNA或1000nM Cas9和1000nM(v1.0或v2.1)sgRNA在Cas9切割缓冲液(200mM HEPES,pH 7.5,1.5M氯化钾,100mM氯化镁,1mM EDTA,5mM二硫苏糖醇)中在37℃温育10min。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化中靶切割反应物，并用QIAquick Nucleotide Removal试剂盒(Qiagen)纯化脱靶切割反应物，之后在Criterion5％聚丙烯酰胺TBE凝胶(Bio-Rad)中电泳。
体外选择.将200nM多联体预选择文库与100nM Cas9和100nM sgRNA或1000nMCas9和1000nM sgRNA在Cas9切割缓冲液(200mM HEPES,pH 7.5,1.5M氯化钾,100mM氯化镁,1mM EDTA,5mM二硫苏糖醇)中在37℃温育10min。预选择文库还分开与2U的BspMI限制内切核酸酶(NEB)在NEBuffer 3(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇,pH7.9)中在37℃温育1h。使用QIAQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化平端的选择后文库成员或粘端预选择文库成员，并使用1,000U T4 DNA连接酶(NEB)在NEB T4 DNA连接酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,10mM氯化镁,1mM ATP,10mM二硫苏糖醇)中室温过夜(>10h)连接于10pmol接头1/2(AACA)(Cas9:v2.1 sgRNA,100nM),接头1/2(TTCA)(Cas9:v2.1 sgRNA,1000nM),接头1/2(Cas9:v2.1 sgRNA,1000nM),或lib接头1/CLTA(#)lib接头2(预选择)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化用接头连接的DNA，并用缓冲液HF(NEB)中的Phusion HotStart Flex DNA聚合酶(NEB)和引物CLTA(#)sel PCR/PE2短(选择后)或CLTA(#)lib seqPCR/lib fwd PCR(预选择)PCR扩增10-13个循环。扩增的DNA用凝胶纯化，用KAPA文库定量试剂盒-Illumina(KAPA Biosystems)定量，并在Illumina MiSeq上进行单读段测序或在Illumina HiSeq 2500(Harvard University FAS Center for Systems Biology Corefacility,Cambridge,MA)上进行Rapid Run单读段测序。
选择分析.如先前描述的21分析预选择和选择后测序数据，其使用了用C++写的脚本进行修改(算法)。未显示原始序列数据；关于策划的汇总(curated summary)，参见表2。特异性得分使用以下公式计算：正特异性得分＝(位置处的碱基对频率[选择后]-位置处的碱基对频率[预选择])/(1-位置处的碱基对频率[预选择])，而负特异性得分＝(位置处的碱基对频率[选择后]-位置处的碱基对频率[预选择])/(位置处的碱基对频率[预选择])。对序列标识(logo)的标准化如先前描述的实施22。
细胞切割测定法.在转录前将HEK293T细胞以0.8x105每孔(6孔板)的密度分开，并且在5％CO2的37℃潮湿培养箱中维持于用10％胎牛血清(FBS)补充的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中。1天后，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照制造商方案瞬时转染细胞。将HEK293T细胞在6孔板的每孔中在70％汇合时用1.0μg Cas9表达质粒(Cas9-HA-2xNLS-GFP-NLS)和2.5μg单链RNA表达质粒pSiliencer-CLTA(版本1.0或2.1)转染。基于通过荧光显微术观察到的GFP阳性细胞的分数，转染效率估测为～70％。转染后48h，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，沉淀并冷冻于-80℃。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)依照制造商方案从200μL细胞裂解物分离基因组DNA。
脱靶位点序列测定.将从用Cas9表达质粒和单链RNA表达质粒(经处理细胞)或仅Cas9表达质粒(对照细胞)处理的细胞分离的100ng基因组DNA通过10s 72℃延伸达35个循环的PCR扩增，其使用引物CLTA(#)-(#)-(#)fwd和CLTA(#)-(#)-(#)rev和Phusion HotStart Flex DNA聚合酶(NEB)在用3％DMSO补充的缓冲液GC(NEB)中进行。通过凝胶量化粗制PCR产物的相对量，并将用Cas9处理的(对照)和用Cas9:sgRNA处理的PCR以等摩尔浓度分别合并，接着使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。将纯化的DNA通过使用引物PE1-barcode#和PE2-barcode#和Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶(NEB)在缓冲液HF(NEB)中PCR扩增7个循环。将扩增的对照和经处理DNA合并物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，接着用Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)纯化。将纯化的对照和经处理DNA用KAPA文库定量试剂盒-Illumina(KAPA Biosystems)定量，以1:1比合并，并在Illumina MiSeq上进行配对末端测序。
统计学分析.如先前描述的实施统计学分析21。计算表1和表6中的P值用于单侧Fisher精确检验。
算法
所有脚本用C++撰写。本研究中使用的算法是具有修改的先前描述算法(参考)。
序列框并法(binning).1)将以条码“AACA”或“TTCA”开始的序列对指定为选择后文库成员。2)对于选择后文库成员(有例示例子)：
示例读段：
AACA
Figure BDA0000958014900000481
CTCGGCAGGTACTTGCAGATGTAGTCTTTCCA
Figure BDA0000958014900000482
CTCGGCAGGTATCTCGTATGCC(SEQ ID NO:42)
i)寻找恒定序列“CTCGGCAGGT”(SEQ ID NO:43)的位置，pos1和pos2的两个成对读段。ii)仅保留在条形码和pos1和在前pos2之间具有
Figure BDA0000958014900000483
的序列。iii)保留恒定序列的两个情况之间的区域(条形码和pos1之间的区域含有切割的半位点；恒定序列的两个情况之间的区域含有完整位点)
例子：
ACTTGCAGATGTAGTCTTTCCA
Figure BDA0000958014900000484
(SEQ ID NO:44)
ii)寻找选择条形码的序列(对于CLTA1，“TGTGTTTGTGTT”(SEQ ID NO:45)，对于CLTA2，“AGAAGAAGAAGA”(SEQ ID NO:46)，对于CLTA3，“TTCTCTTTCTCT”(SEQ ID NO:47)，对于CLTA4，“ACACAAACACAA”(SEQ ID NO:48))
例子：
ACTTGCAGATGTAGTCTTTCCACATGGGTCGACACAAACACAA(SEQ ID NO:49)-CLTA4
iii)条形码之前的序列是完全的选择后文库成员(头四个和最后4个核苷酸是完全随机化的侧翼序列)
例子：ACTT GCAGATGTAGTCTTTCCACATGG GTCG(SEQ ID NO:50)
iv)解析对应于23核苷酸的选择后文库成员的位置的质量得分
示例读段：
AACACATGGGTCGACACAAACACAACTCGGCAGGTACTTGCAGATGTAGTCTTTCCACATGGGTCGACACAAACACAACTCGGCAGGTATCTCGTATGCC(SEQ ID NO:51)
CCCFFFFFHHHHHJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJJGIJJJJIJIJJJIIIHIIJJJHHHGHAEFCDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD？CDDEDD@DCCCD
v)仅当序列的相应质量得分串(有下划线)FASTQ质量字符在ASCII码中为'？'或更高(Phred质量得分>＝30)时保留序列
NHEJ序列调入(calling)
示例读段：
CAATCTCCCGCATGCGCTCAGTCCTCATCTCCCTCAAGCAGGCCCCGCTGGTGCACTGAAGAGCCACCCTGTGAAACACTACATCTGCAATATCTTAATCCTACTCAGTGAAGCTCTTCACAGTCATTGGATTAATTATGTTGAGTTCTTTTGGACCAAACC(SEQ ID NO:52)
示例质量得分：
CCBCCFFFFCCCGGGGGGGGGGHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHGGGGGGGGGHHHHHHHHHHHHHHHHHGHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHGHHHHHHHHHHHHHHHHHFHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHGHFHHHHHF
1)为每个靶位点鉴定20个碱基对的靶位点+3个碱基对的PAM的两侧侧翼的20碱基 对
示例侧翼序列：GCTGGTGCACTGAAGAGCCA(SEQ ID NO:53)
AATATCTTAATCCTACTCAG(SEQ ID NO:54)
2)检索侧翼序列的所有序列读段以鉴定潜在的脱靶位点(侧翼序列之间的序列)
示例的潜在脱靶位点：CCCTGTGAAACACTACATCTGC(SEQ ID NO:55)
3)如果潜在的脱靶位点含有indel(长度小于23)，那么当序列的所有相应FASTQ质量字符在ASCII码中为'？'或更高(Phred质量得分>＝30)时保留序列作为潜在的脱靶位点
示例的潜在脱靶位点长度＝22
示例的对应的FASTQ质量字符：HHGHHHHHHHHHHHHHHHHHHH
4)对通过步骤2和3的所有序列进行框并和手动检查，且如果序列具有涉及位置16,17或18(在从非PAM端起算的20个中)的至少一个缺失时或如果序列具有位置17和18之间的插入时(与对于意图的靶位点所观察到的最频繁修饰一致)，保留序列作为潜在的经修饰序列(图3)
示例的潜在脱靶位点(反向互补物，位置有标记)，具有参考序列：
11111111112222
非PAM端12345678901234567890123PAM端
GCAGATGTAGTGTTTC-ACAGGG(SEQ ID NO:56)
GCAGATGTAGTGTTTCCACAGGG(SEQ ID NO:57)
4)对于读段2重复步骤1-3并仅当序列相同时保留
5)将用Cas9+sgRNA处理的样品与仅Cas9样品中的总体计数比较以鉴定经修饰的位点
基于切割位点的过滤(对于选择后序列)
1)通过鉴定完整测序识别位点中的第一位置(两个恒定序列之间)列表识别位点内的切割位点位置，所述第一位置与条形码后测序读段中第一个位置(在第一恒定序列之前)是相同的。
2)在列表后，重复步骤1，仅保留具有存在于至少5％的测序读段中的切割位点位置的序列。
结果
广泛脱靶DNA切割概况分析揭示了经RNA编程的Cas9核酸酶特异性.
包括锌指核酸酶(ZFN)和转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)在内的序列特异性内切核酸酶已成为修饰在诱导的多能干细胞(iPSC)1-3、多细胞生物体4-8、和离体基因治疗临床试验9,10中基因的重要工具。尽管已证明ZFN和TALEN对于这类遗传操作有效，但对于每种DNA靶位点必须生成新的ZFN或TALEN蛋白。比较而言，RNA导引的Cas9内切核酸酶利用RNA:DNA杂交来测定靶DNA切割位点，从而使单一单体蛋白在原则上能切割任意被导引RNA指定的序列11。
先前的研究12-17显示Cas9在与结合的导引RNA中的20核苷酸序列互补的位点处介导基因组编辑。另外，靶位点必须在临近于该20核苷酸靶位点的3’端处包含原间隔区临近基序(PAM)；对于酿脓链球菌Cas9，PAM序列是NGG。在体外和细胞中的Cas9介导的DNA切割特异性之前已基于针对潜在单突变脱靶位点的小集合的测定法推断出。这些研究表明，在临近于靶位点PAM端(导引RNA的3’端)的7-12碱基对中需要导引RNA与靶DNA之间完美互补，而在非PAM端(导引RNA的5′端)容忍错配11,12,17-19。
尽管指定Cas9:导引RNA靶物识别的这类有限数目的核苷酸将预测中等到较大的基因组(>～107bp)中的多个DNA切割位点，但Cas9:导引RNA复合物已被成功用于修饰细胞12,13,15和生物体14。使用Cas9:导引RNA复合物来修饰斑马鱼胚胎的一项研究与ZFN和TALEN以相似的比率观察到毒性14。使用高通量测序在大肠杆菌中对催化性失活Cas9突变体的DNA结合特异性(转录阻遏)的一项最近的广泛研究在相对小的大肠杆菌转录组中未发现可检测的脱靶转录阻遏20。尽管这些研究实质性推动了我们对Cas9的基础理解，但未描述在大数量的相关突变靶位点上的Cas9切割测量产生的Cas9:导引RNA介导的DNA切割特异性的系统性和全面概况。需要这类特异性概况来理解和改进Cas9:导引RNA复合物作为研究工具和未来治疗剂的潜力。
我们改良了我们之前发表的体外选择21(相比于ZFN切割的含突出的产物，为了处理由Cas9产生的平端切割产物而改编)以测定Cas9:单导引RNA(sgRNA)11复合物的脱靶DNA切割概况。每项选择实验使用含有～1012序列的DNA底物文库，该大小大得足以包含相对于每种22碱基对靶序列(包含2碱基对PAM)有8个或更少的突变的所有序列的10倍覆盖(图1)。我们在所有22靶位点碱基对使用了部分随机化的核苷酸混合物以创建突变靶位点的二项式分布文库，该文库具有预期的4.62突变每靶位点的均值。另外，靶位点文库成员侧翼的每一侧是4个完全随机化的碱基对以测试由规范的20碱基对靶位点和PAM施加的那些以外的特异性模式。
对于人网格蛋白轻链A(CLTA)基因中的4种不同靶序列的每种，生成了有1012个个别可能的脱靶位点的预选择文库(图3)。合成的5′-磷酸化的53碱基的寡核苷酸体外自连接成环状单链DNA，然后经由滚环复制转化成多联体53碱基对重复。将所得预选择文库与其相应的Cas9:sgRNA复合物温育。经由未磷酸化双链测序接头的5’磷酸根依赖性连接，将含有游离5′磷酸根的经切割文库成员从完整文库成员分离。通过PCR扩增连接加标签的选择后文库。PCR步骤生成了含有被Cas9切割的文库成员的0.5,1.5或2.5个等重复的选择后DNA片段的混合物，其从连接接头的经切割半位点在有或无一个或多个临近的相应完整位点情况下的扩增产生(图1)。具有1.5个靶序列重复的选择后文库成员通过凝胶纯化分离，并通过高通量测序分析。在最小化DNA扩增或测序期间的误差影响的最终计算机选择步骤中，仅分析具有重复的经切割半位点的两个相同拷贝的序列。
对于测试的4种导引RNA靶物(CLTA1,CLTA2,CLTA3和CLTA4)的每种，将预选择文库在酶限制条件(200nM靶位点文库,100nM Cas9:sgRNA v2.1)或酶饱和条件(200nM靶位点文库,1000nM Cas9:sgRNA v2.1)下温育(图3C和3D)。对于测试的4种导引RNA靶物的每种，仅在酶饱和条件下测定第二导引RNA构建体sgRNA v1.0，其活性低于sgRNA v2.1(200nM靶位点文库,1000nM Cas9:sgRNA v1.0)。两种导引RNA构建体在其长度(图3)及其在选择条件下的DNA切割活性水平上不同，与之前的报道15一致(图4)。预选择和选择后文库两者均通过高通量DNA测序和计算机分析表征。如预期的，具有更少突变的文库成员在选择后文库中相对于预选择文库显著富集(图5)。
预选择和选择后文库组成.CLTA1,CLTA2,CLTA3和CLTA4的预选择文库分别观察到4.82(n＝1,129,593),5.06(n＝847,618),4.66(n＝692,997)和5.00(n＝951,503)个突变每22碱基对靶位点(包含两碱基对PAM)的均值突变率。在酶限制条件下用Cas9加CLTA1,CLTA2,CLTA3或CLTA4 v.2.1 sgRNA处理的选择后文库含有1.14(n＝1,206,268),1.21(n＝668,312),0.91(n＝1,138,568)和1.82(n＝560,758)个突变每22-碱基对靶位点的均值。在酶过量条件下，选择后仍然存在的序列中的均值突变数目对于CLTA1,CLTA2,CLTA3或CLTA4v2.1 sgRNA分别增加至1.61(n＝640,391),1.86(n＝399,560),1.46(n＝936,414)和2.24(n＝506,179)个突变每22-碱基对靶位点。这些结果揭示了对于测试的所有Cas9:sgRNA复合物，选择显著富集了具有更少突变的文库成员，且酶过量条件比酶限制条件产生对更高度突变的文库成员的推定切割(图5)。
我们计算了特异性得分来量化在选择后文库中相对于预选择文库在每个位置处每种碱基对的富集水平，相对于该碱基对的最大可能富集标准化。正特异性得分指示在选择后文库中富集的碱基对，而负特异性得分指示在选择后文库中去富集的碱基对。例如，得分+0.5指示碱基对富集至最大富集值的50％，而得分–0.5指示碱基对被去富集至最大去富集值的50％。
除了由PAM指定的两碱基对以外，由导引RNA靶向的所有20碱基对在来自CLTA1和CLTA2选择的序列中富集(图2、图6和9、和表2)。对于CLTA3和CLTA4选择(图7和8，和表2)，导引RNA指定的碱基对分别在除距离PAM(导引RNA的5′端)的两个最远端的碱基对以外的所有位置富集。在离PAM最远的这些非指定位置，3个交替的碱基对中的至少2个几乎与指定的碱基对一样富集。我们的发现，即完整20碱基对靶位点和两碱基对PAM能促进Cas9:sgRNA DNA切割特异性与先前的单底物测定法的结果相反，后者表明仅指定的是7-12碱基对和两碱基对PAM11,12,15。
对所有单突变预选择(n≥14,569)和选择后文库成员(n≥103,660)计算机分析以提供每个可能单突变序列的选择富集值。该分析的结果(图2和图6和8)显示当仅考虑单突变序列时，与PAM最近的6至8个碱基对一般是高度指定的，而非PAM端在酶限制条件下是较差指定的，这与先前的发现11,12,17-19一致。然而，在酶饱和条件下，甚至在最靠近PAM的6至8个碱基对中的单突变也是容忍的，表明DNA靶位点的PAM端的高特异性在酶浓度相对于底物较高时可能受损(图2)。观察到的对接近PAM的单突变的高特异性仅适用于具有单突变的序列且该选择结果不支持以下模型，其中在最远离PAM的靶位点区域中容许突变的任意组合(图10-15)。对预选择和选择后文库组成的分析在本文中别处描述，位置依赖性特异性模式例示于图18-20，PAM核苷酸特异性例示于图21-24，且Cas9:sgRNA浓度对特异性的更详细效果描述于图2G和图25)。
靶位点非PAM端的特异性。为了评估Cas9:v2.1 sgRNA在酶过量条件下容忍PAM远端的多个突变的能力，我们计算了在序列的每个位置的最大特异性得分，所述序列仅在PAM最远端的靶位点末端处的1至12个碱基对区域中含有突变(图10-17)。
该分析的结果显示根据靶位点，在最远离PAM的分子末端处没有对具有多达3个突变的序列的选择(最大特异性得分～0)，当剩余序列不含突变时。例如，当CLTA2靶位点中仅允许最远离PAM的3个碱基对变化(由图11C中的黑色条指示)，3个可变位置的每个处的最大特异性得分接近0，表明在3个可变位置的每个处没有对4种可能碱基对的任一种的选择。然而，当允许最远离PAM的8个碱基对变化时(图11H)，位置4-8处的最大特异性得分均大于+0.4，表明Cas9:sgRNA在这些位置具有序列偏好，即使当剩余的底物含有优选的中靶碱基对时。
我们还计算了当仅允许靶位点的头1-12个碱基对变化时，在酶过量条件下预选择和用v2.1 sgRNA处理的选择后文库两者中的突变分布(图15-17)。对于仅数据的子集，预选择和选择后文库之间有显著重叠(图15-17,a-c)，显示对于仅具有在靶位点头3个碱基对中突变的序列，在选择后文库中选择最小或无选择。这些结果合起来显示Cas9:sgRNA能容忍在最远离PAM的序列端处的数目较少的突变(～1至3)，当提供剩余靶位点中最大sgRNA:DNA相互作用时。
靶位点PAM端处的特异性。我们将位置特异性作为在每种靶位点的每个位置处所有4种碱基对的特异性得分的量级总和绘出，其相对于最高度指定位置的相同总和标准化(图18-20)。在酶限制和酶过量条件下，靶位点的PAM端是高度指定的。在酶限制条件下，分子的PAM端几乎被CLTA1,CTLA2和CLTA3导引RNA绝对指定(对于导引RNA指定的碱基对，特异性得分≥+0.9)(图2和图6-9)，和被CLTA4导引RNA高度指定(特异性得分+0.7至+0.9)。在该高特异性区域内，与导引RNA和靶DNA之间的摇摆(wobble)配对一致的特定单突变是容忍的。例如，对于单突变序列在酶限制条件下，dA:dT脱靶碱基对和导引RNA指定的dG:dC碱基对在CLTA3靶位点的20个位置(相对于靶位点的非PAM端)中的位置17是等同容忍的。在该位置，可以形成rG:dT摇摆RNA:DNA碱基对，其具有最小的切割活性的表观丧失。
重要地，该选择结果还揭示导引RNA发夹的选择影响特异性。当在反映细胞背景中酶相对于底物过量的相同酶饱和条件下测定时，更短的、活性较低的sgRNA v1.0构建体比更长的、更具活性的sgRNA v2.1构建体特异性更高(图2和图5-8)。sgRNA v1.0比sgRNAv2.1更高的特异性对于CLTA1和CLTA2(～40-90％差异)比对于CLTA3和CLTA4(<40％差异)更大。有意思的是，该特异性差异对于每种靶序列定位于靶位点的不同区域(图2H和26)。总之，这些结果指示不同的导引RNA体系结构产生不同的DNA切割特异性，且特异性中的导引RNA依赖性变化不等同影响靶位点中的所有位置。鉴于上文描述的Cas9:sgRNA浓度和特异性之间的相反关系，我们推测导引RNA体系结构之间特异性中的差异来自其DNA切割活性的总水平中的差异。
Cas9:sgRNA浓度对DNA切割特异性的影响.为了评估对于测试的4种靶位点，酶浓度对特异性模式的影响，我们计算了位置特异性中的浓度依赖性差异并将其与位置特异性中的最大可能变化相比较(图25)。一般地，特异性在酶限制条件下高于在酶过量条件下。从酶过量到酶限制条件的变化一般将靶物PAM端处的特异性提高特异性最大可能变化的≥80％。尽管酶浓度的降低通常诱导最远离PAM的靶位点末端处特异性中的少量(～30％)增加，但浓度降低诱导最接近PAM的靶位点末端处特异性中的大得多的增加。对于CLTA4，酶浓度的降低伴随有在最远离PAM的靶位点末端附近一些碱基对处特异性中的少量(～30％)降低。
PAM核苷酸的特异性.为了评估PAM对特异性的贡献，我们计算了在预选择和选择后文库中所有16种可能的PAM二核苷酸的丰度，考虑所有观察到的选择后靶位点序列(图21)或仅考虑在导引RNA指定的20个碱基对中不含突变的选择后靶位点序列(图22)。考虑所有观察到的选择后靶位点序列，在酶限制条件下，对于分别使用CLTA1,CLTA2,CLTA3和CLTA4 v2.1 sgRNA的选择，GG二核苷酸占99.8％,99.9％,99.8％和98.5％的选择后PAM二核苷酸。比较而言，在酶过量条件下，对于分别使用CLTA1,CLTA2,CLTA3和CLTA4 v2.1sgRNA的选择，GG二核苷酸占97.7％,98.3％,95.7％和87.0％的选择后PAM二核苷酸。这些数据证明酶浓度的增加导致对含有非规范PAM二核苷酸的底物的增加的切割。
为了阐明PAM二核苷酸的预选择文库分布，我们计算了PAM二核苷酸的特异性得分(图23)。当仅在酶过量条件下考虑中靶选择后序列时(图24)，具有单个G而非两个G的非规范PAM二核苷酸是相对被容忍的。在酶过量条件下，Cas9:CLTA4 sgRNA 2.1对于测试的所有Cas9:sgRNA组合展现出非规范PAM二核苷酸的最高容忍度。AG和GA二核苷酸是最容忍的，其次是GT,TG和CG PAM二核苷酸。在使用Cas9:CLTA1,2或3 sgRNA 2.1在酶过量条件选择时，AG是占主导的非规范PAM(图23和24)。我们的结果与PAM特异性的另一项最近的研究一致，该研究显示Cas9:sgRNA能识别AG PAM二核苷酸23。另外，我们的研究显示在酶限制条件下，GG PAM二核苷酸是高度指定的，且在酶过量条件下，根据导引RNA背景，含有单个G的非规范PAM二核苷酸可以被容忍。
为了确认体外选择结果准确地反映了Cas9体外切割行为，我们实施了对6种CLTA4脱靶靶物的离散切割测定法，所述靶物在靶位点中含有1至3个突变。我们计算了对于Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA在酶饱和条件下选择后文库中所有序列的富集值，其通过将每种序列在选择后文库中的丰度除以在预选择文库中的计算的丰度进行。在酶饱和条件下，具有最高富集值(27.5,43.9和95.9)的单一1个、2个和3个突变序列被裂开至≥71％完全(图27)。具有1.0的富集值的2突变序列被裂开至35％，且具有接近0的富集值(0.064)的2突变序列未被分裂。被CLTA4 v2.1 sgRNA分裂至77％的3突变序列通过CLTA4 v1.0sgRNA被分裂至53％的较低效率(图28)。这些结果表明个体序列的选择富集值预测体外切割效率。
为了测定体外选择和体外切割测定法的结果是否属于人细胞中的Cas9:导引RNA活性，我们鉴定了既在体外选择中被富集又存在于人基因组的含有多达8个突变的51种脱靶位点(对于CLTA1为19且对于CLTA4为32)(表3-5)。我们通过瞬时转染在HEK293T细胞中表达了Cas9:CLTA1 sgRNA v1.0,Cas9:CLTA1 sgRNA v2.1,Cas9:CLTA4 sgRNA v1.0,Cas9:CLTA4 sgRNA v2.1，或无sgRNA的Cas9，并利用基因组PCR和高通量DNA测序来寻找在51种脱靶位点的46种以及在靶基因座中Cas9:sgRNA修饰的证据；对于51种预测的脱靶位点中的5种没有获得特定的扩增DNA(对于CLTA1为3种且对于CLTA4为2种)。
对从用Cas9:CLTA1 sgRNA或Cas9:CLTA4 sgRNA处理的HEK293T细胞分离的基因组DNA的深度测序鉴定了在中靶位点处和在49种测试的脱靶位点的5种(CLTA1-1-1,CLTA1-2-2,CLTA4-3-1,CLTA4-3-3和CLTA4-4-8)处非同源端连接(NHEJ)明显的序列(表1和6-8)。CLTA4靶位点被Cas9:CLTA4 v2.1sgRNA以76％的频率修饰，而脱靶位点CLTA4-3-1CLTA4-3-3和CLTA4-4-8被分别以24％,0.47％和0.73％的频率修饰。CLTA1靶位点被Cas9:CLTA1v2.1 sgRNA以0.34％的频率修饰，而脱靶位点CLTA1-1-1和CLTA1-2-2被分别以0.09％和0.16％的频率修饰。
在使用v2.1 sgRNA的酶饱和条件下，两种确认的CLTA1脱靶位点CLTA1-1-1和CLTA1-2-2是体外选择鉴定的3种最高富集的序列中的2种。CLTA4-3-1和CLTA4-3-3是在体外选择中富集的且也存在于基因组中的7种CLTA4三突变序列中最高和第三高富集的序列。未计算4突变序列的体外选择富集值，因为在含有4种突变的基因组中14种CLTA4序列中有12种(包括CLTA4-4-8)以在选择后文库中仅一个序列计数的水平被观察到。总之，这些结果证实了体外选择中鉴定的且存在于人基因组中的几种脱靶底物的确在人细胞中被Cas9:sgRNA复合物切割，且还表明选择中最高度富集的基因组脱靶序列在细胞中以最大程度被修饰。
我们在细胞中鉴定的脱靶位点在我们的体外选择中的最高度富集者中且相对于意图的靶位点含有多达4个突变。尽管异染色质或共价DNA修饰可以能减小Cas9:导引RNA复合物到达细胞中基因组脱靶位点的能力，但是在本研究中从49种测试的细胞脱靶位点鉴定出5种而不是0或许多种，强烈表明Cas9介导的DNA切割不限于如最近研究中提出的11,12,19仅仅特异性靶向7-12-碱基对靶序列。
与在体外选择数据和离散测定法中观察到的sgRNA v1.0相比，细胞基因组修饰数据也与sgRNA v2.1 sgRNA的特异性增加一致。尽管CLTA1-2-2,CLTA 4-3-3和CLTA 4-4-8位点被Cas9-sgRNA v2.1复合物修饰，但在用Cas9:sgRNA v1.0处理的细胞中没有检测到在这3个位点的任一中的修饰的证据。在用Cas9:v2.1 sgRNA处理的细胞中以中靶CLTA4位点的频率的32％修饰的CLTA4-3-1位点在用v1.0 sgRNA处理的细胞中仅以中靶修饰频率的0.5％修饰，这代表了选择性中62倍的变化。总之，这些结果证明了导引RNA结构体系对于细胞中的Cas9特异性可具有显著影响。我们的特异性概况分析发现对最近的且进行的努力呈现重要告诫，该努力用于经由导引RNA工程改进Cas9:导引RNA复合物的总DNA修饰活性11,15。
总之，对Cas9的脱靶DNA切割概况分析和后续分析显示(i)对于测试的4种靶位点，Cas9:导引RNA识别扩展至18-20个指定的靶位点碱基对和两碱基对PAM；(ii)增加Cas9:导引RNA浓度能降低体外DNA切割特异性；(iii)使用更具活性的sgRNA体系结构能增加体外和在细胞中的DNA切割特异性，但损害在体外和在细胞中的DNA切割特异性；和(iv)如我们的体外结果预测的，Cas9:导引RNA能修饰细胞中相对于中靶位点具有多达4个突变的脱靶位点。我们的发现提供了对RNA编程性的Cas9特异性的理解的关键认知，且揭示了sgRNA结构体系在DNA切割特异性中的先前未知的作用。本研究中揭示的原理还可以应用于工程化为介导DNA切割以外的功能的基于Cas9的效应器。
等同物和范围
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在权利要求中，除非指定为相反含义或从上下文是明显的，冠词如“一个/一种”和“该”可以意指一种或超过一种。除非指定为相反含义或从上下文是明显的，如果一种、超过一种或所有的组成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关，则该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被视为满足的。本发明包括以下实施方案，其中组的正好一个成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关。本发明还包括以下实施方案，其中组的超过一个或所有成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关。
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当要素呈现为表时，例如马库什组形式时，应理解还公开了要素的每个亚组，且可从该组除去任何一种或多种要素。还注意到术语“包括/包含”意图为开放式的，且允许纳入另外的要素或步骤。应理解，一般来说，当本发明或本发明的方面称为包含具体的要素、特征、步骤等时，本发明或本发明方面的某些实施方案组成或基本组成为这类要素、特征、步骤等。出于简洁目的，那些实施方案并未逐字地具体在本文中列出。如此，对于包含一个或多个要素、特征、步骤等的本发明的每个实施方案，本发明还提供由那些要素、特征、步骤等组成或基本由其组成的实施方案。
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另外，应理解本发明的任意具体实施方案可从任何一个或多个权利要求中明确地排除。当给定范围时，该范围内的任意值可从任何一个或多个权利要求中明确地排除。本发明的组合物和/或方法的任何实施方案、要素、特征、应用或方面可从任何一个或多个权利要求中明确地排除。出于简洁目的，其中排除了一个或多个要素、特征、目的或方面的所有实施方案未在本文中明确记载。
表
表1.由Cas9:CLTA4 sgRNA诱导的细胞修饰.鉴定了在Cas9:CLTA4v2.1 sgRNA体外选择中在酶限制或酶饱和条件下富集的33个人基因组DNA序列。划线显示的位点含有插入或缺失(indel)，其与在HEK293T细胞中的显著Cas9:sgRNA介导的修饰一致。对于具有3个或更少突变的序列，显示了使用Cas9:CLTA4 v1.0 sgRNA或Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA选择的体外富集值。对于具有4个或更多突变的序列未计算富集值，因为体外选择序列计数数目较少。在用无sgRNA的Cas9(“无sgRNA”)，具有CLTA4 v1.0 sgRNA的Cas9，或具有CLTA4 v2.1sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞中的修饰频率(具有indel的序列数目除以总序列数目)。对于在用v1.0 sgRNA-或v2.1 sgRNA处理的细胞中相比于用无sgRNA的Cas9处理的细胞显示显著修饰的那些位点，列出了P值。“未测试(n.t.)”表明基因组序列的PCR未能提供特定的扩增产物。
表2：原始选择序列计数.位置-4至-1是在20-碱基对靶位点之前的4个核苷酸。PAM1,PAM2和PAM3是紧接在靶位点之后的PAM位置。位置+4至+7是紧接在PAM之后的4个核苷酸。
表3：CLTA1基因组脱靶序列.鉴定了在Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA体外选择中在酶限制或酶过量条件下富集的20个人基因组DNA序列。“m”指来自具有以小写字母显示的突变的中靶序列的突变数目。划线显示的位点含有插入或缺失(indel)，其与在HEK293T细胞中的显著Cas9:sgRNA介导的修饰一致。对于每个位点显示了人基因组坐标(assembly GRCh37)。CLTA1-0-1存在于两个基因座，且从两个基因座合并了序列计数。对于来自用无gRNA的Cas9(“无sgRNA”),具有CLTA1 v1.0 sgRNA的Cas9或具有CLTA1 v2.1 sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞的每个位点的扩增和测序的DNA，显示了序列计数。
表4:CLTA4基因组脱靶序列.鉴定了在Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA体外选择中在酶限制或酶过量条件下富集的33个人基因组DNA序列。“m”指来自具有以小写字母显示的突变的中靶序列的突变数目。划线显示的位点含有插入或缺失(indel)，其与在HEK293T细胞中的显著Cas9:sgRNA介导的修饰一致。对于每个位点显示了人基因组坐标(assembly GRCh37)。对于来自用无gRNA的Cas9(“无sgRNA”),具有CLTA4 v1.0 sgRNA的Cas9或具有CLTA4v2.1sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞的每个位点的扩增和测序的DNA，显示了序列计数。
表5：CLTA1和CLTA4脱靶位点的基因组坐标.鉴定了在Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA和Cas9:CLTA4 v2.1 sgRNA体外选择中在酶限制或酶过量条件下富集的54个人基因组DNA序列。对于每个位点显示了人基因组坐标(assembly GRCh37).
表6：由Cas9:CLTA1 sgRNA诱导的细胞修饰.鉴定了在Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA体外选择中在酶限制或酶过量条件下富集的20个人基因组DNA序列。划线显示的位点含有插入或缺失(indel)，其与在HEK293T细胞中的显著Cas9:sgRNA介导的修饰一致。对于具有3个或更少突变的序列，显示了使用Cas9:CLTA1 v1.0 sgRNA或Cas9:CLTA1 v2.1 sgRNA的体外选择富集值。对于具有4个或更多突变的序列未计算富集值，因为体外选择序列计数数目较少。在用无sgRNA的Cas9(“无sgRNA”)，具有CLTA1 v1.0 sgRNA的Cas9，或具有CLTA1v2.1sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞中的修饰频率(具有indel的序列数目除以总序列数目)。在用v1.0 sgRNA-或v2.1 sgRNA处理的细胞中相比于用无sgRNA的Cas9处理的细胞显示显著修饰的位点的P值为，对于CLTA1-0-1为1.1E-05(v1.0)和6.9E-55(v2.1)，对于CLTA1-1-1为2.6E-03(v1.0)和2.0E-10(v2.1)，和对于CLTA1-2-2为4.6E-08(v2.1)。使用单侧Fisher精确检验计算P值。“未测试(n.t.)”表明没有测试位点或者基因组序列的PCR未能提供特定的扩增产物。
表7：CLTA1基因组脱靶indel序列.来自用中靶基因组序列(CLTA1-0-1)和每种经修饰的脱靶位点的扩增和测序的DNA处理的细胞的含插入和缺失的序列，所述经修饰的脱靶位点来自用无sgRNA的Cas9(“无sgRNA”),基因CLTA1 v1.0 sgRNA的Cas9或具有CLTA1v2.1 sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞。“ref”指每个位点的人基因组参照序列，且修饰位点如下列出。相对于中靶基因组序列的突变以小写字母显示。插入和缺失分别以划线粗体字母显示或破折号显示。对于显示修饰序列相比于对照(无sgRNA)的统计学显著富集的那些条件(v1.0 sgRNA或v2.1 sgRNA)显示修饰百分比。
表8：CLTA4基因组脱靶indel序列.来自用中靶基因组序列(CLTA4-0-1)和每种经修饰的脱靶位点的扩增和测序的DNA处理的细胞的含插入和缺失的序列，所述经修饰的脱靶位点来自用无sgRNA的Cas9(“无sgRNA”),具有CLTA4 v1.0 sgRNA的Cas9或基因CLTA4v2.1 sgRNA的Cas9处理的HEK293T细胞。“ref”指每个位点的人基因组参照序列，且修饰位点如下列出。相对于中靶基因组序列的突变以小写字母显示。插入和缺失分别以划线粗体字母显示或破折号显示。对于显示修饰序列相比于对照(无sgRNA)的统计学显著富集的那些条件(v1.0 sgRNA或v2.1 sgRNA)显示修饰百分比。
表9：本研究中使用的寡核苷酸.所有寡核苷酸均购自Integrated DNATechnologies。星号(*)指示在前核苷酸以亚磷酰胺的手动混合物掺入，其由79mol％对应于在前核苷酸的亚磷酰胺和4mol％其他三种规范亚磷酰胺的每种组成。“/5Phos/”指在合成期间装配的5′磷酸根基团。
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表3
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表4
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表5
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表7
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表8
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Claims (49)

1.一种用于鉴定核酸酶的靶位点的方法，该方法包括：
(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5′磷酸模块的经切割的核酸链；
(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在以下条件下接触，所述条件适合所述核酸酶在所述核酸酶的核酸酶靶位点处切割候选核酸分子以形成经切割的末端，其中每个候选核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和至少10个且不超过80个核苷酸的恒定的插入序列；和
(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过以单读段通量从所述经切割的末端对在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点直接测序来进行。
2.权利要求1的方法，其中所述经切割的末端是平末端。
3.权利要求1的方法，其中所述经切割的末端具有5′突出。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(c)包括经由5′-磷酸依赖性连接将第一核酸接头连接至所述经切割的末端。
5.权利要求4的方法，其中所述核酸接头以双链形式提供。
6.权利要求5的方法，其中所述5′-磷酸依赖性连接是平端连接。
7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述方法包括在将所述第一核酸接头连接至所述经切割的末端之前填补5′突出。
8.权利要求4-7中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括使用与所述接头杂交的PCR引物和与所述恒定插入序列杂交的PCR引物经由PCR反应扩增被核酸酶切割的多联体的片段，该片段包含未切割的靶位点。
9.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括对所述扩增的核酸分子富集包含单个未切割靶序列的分子。
10.权利要求9的方法，其中所述富集包括大小分级。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述候选核酸分子的文库包含至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012个不同的候选核酸酶切割位点。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸酶是治疗性核酸酶，其切割与疾病有关的基因中的特定核酸酶靶位点。
13.权利要求12的方法，其进一步包括测定所述治疗性核酸酶切割该特定的核酸酶靶位点且不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或无另外的核酸酶靶位点的所述治疗性核酸酶的最大浓度。
14.权利要求13的方法，其进一步包括将所述治疗性核酸酶以有效生成等于或低于所述最大浓度的最终浓度的量施用给受试者，其中所述受试者不是人类。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述核酸酶是与RNA分子形成复合物的可RNA编程的核酸酶，且其中该核酸酶:RNA复合物特异性结合与所述RNA分子的序列的一部分互补的核酸序列。
16.权利要求15的方法，其中所述RNA分子是单导引RNA(sgRNA)。
17.权利要求16的方法，其中所述sgRNA包含与所述核酸酶靶位点互补的15-25、19-21或20个核苷酸。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶。
19.权利要求15-18中任一项的方法，其中所述核酸酶靶位点包含[sgRNA-互补性序列]-[原间隔区临近基序(PAM)]结构，且所述核酸酶切割所述sgRNA互补性序列内的靶位点。
20.权利要求19的方法，其中所述sgRNA互补性序列包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
21.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述核酸酶包含非特异性核酸切割域。
22.权利要求21的方法，其中所述核酸酶包含FokI切割域。
23.权利要求21或22的方法，其中所述核酸酶包含核酸切割域，其在切割域二聚化时切割核酸酶靶位点。
24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述核酸酶包含特异性结合核酸序列的结合域。
25.权利要求24的方法，其中所述结合域包含锌指。
26.权利要求25的方法，其中所述结合域包含至少2、至少3、至少4或至少5个锌指。
27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶。
28.权利要求24-27中任一项的方法，其中所述结合域包含转录激活物样元件。
29.权利要求28的方法，其中所述核酸酶是转录激活物样元件核酸酶(TALEN)。
30.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述核酸酶包含有机化合物。
31.权利要求30的方法，其中所述核酸酶包含烯二炔。
32.权利要求30或31的方法，其中所述核酸酶是抗生素。
33.权利要求31或32的方法，其中所述化合物是达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、加利车霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicin)、博来霉素、或其衍生物。
34.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述核酸酶是归巢式内切核酸酶。
35.从多种核酸酶选出特异性切割共同靶位点的核酸酶的方法，所述方法包括：
(a)提供切割相同的共同序列的多种候选核酸酶；
(b)对于步骤(a)的每种候选核酸酶，使用权利要求1的方法鉴定被所述候选核酸酶切割的不同于所述共同靶位点的核酸酶靶位点；和
(c)基于步骤(b)中鉴定的一种或多种核酸酶靶位点来选择核酸酶。
36.权利要求35的方法，其中步骤(c)中选择的核酸酶是以最高特异性切割所述共同靶位点的核酸酶。
37.权利要求36的方法，其中所述以最高特异性切割所述共同靶位点的核酸酶是切割最少数目的不同于所述共同位点的靶位点的候选核酸酶。
38.权利要求36的方法，其中所述以最高特异性切割所述共同靶位点的候选核酸酶是在靶基因组的背景中切割最少数目的不同于所述共同位点的靶位点的候选核酸酶。
39.权利要求35-38中任一项的方法，其中步骤(c)中选择的候选核酸酶是不切割所述共同靶位点以外的任何靶位点的核酸酶。
40.权利要求39的方法，其中步骤(c)中选择的候选核酸酶是在所述核酸酶的治疗有效浓度在受试者的基因组中不切割所述共同靶位点以外的任何靶位点的核酸酶。
41.权利要求35-40中任一项的方法，其还包括使基因组与步骤(c)中选择的核酸酶接触。
42.权利要求41的方法，其中所述基因组是脊椎动物、哺乳动物、人、非人灵长类、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、牛、犬、猫、爬行动物、两栖动物、鱼、线虫、昆虫或苍蝇基因组。
43.权利要求41或42的方法，其中所述基因组在活细胞内。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中所述基因组在受试者内。
45.权利要求35-44中任一项的方法，其中所述共同靶位点在与疾病或病症有关的等位基因内，其中所述方法不是用于疾病或病症的治疗的方法。
46.权利要求45的方法，其中所述疾病是HIV/AIDS。
47.权利要求46的方法，其中所述等位基因是CCR5等位基因。
48.权利要求45的方法，其中所述疾病是增殖性疾病。
49.权利要求48的方法，其中所述等位基因是VEGFA等位基因。
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