JP2018533376A - 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された細胞の遺伝子編集の方法、上記方法により得られた細胞、及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、医療分野に関し、特に哺乳動物被験体における赤血球系譜を冒す代謝疾患の治療のための治療アプローチとしての遺伝子編集に関する。本発明の具体的な実施形態においては、その実施態様は、赤血球系譜を冒す代謝疾患へのこれらの先進技術の潜在的応用の最初の実例としての、ＰＫＤ治療のための細胞リプログラミング及び遺伝子編集の組み合わせに関する。この意味において、ＰＫＤ患者特異的ｉＰＳＣは、ＰＢ−ＭＮＣ（末梢血単核細胞）からＳｅＶ非組み込み型の系によって効率的に作製され、ピルビン酸キナーゼ欠損症の治療のために効果的に使用された。ＰＫＬＲ遺伝子修正のための遺伝子編集方略は、造血始原体に直接的に適用することにも成功した。【選択図】なし

Description

本発明は、医療分野に関し、特に哺乳動物被験体における赤血球系譜を冒す代謝疾患の治療のための治療アプローチとしての遺伝子編集に関する。

ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ；ＯＭＩＭ：２６６２００）は、赤血球におけるＲ型ピルビン酸キナーゼ（ＲＰＫ）及び肝細胞におけるＬ型ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）をコードするＰＫＬＲ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる希少な代謝性赤血球系疾患である。ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、成熟赤血球における主要なＡＴＰ源である解糖の最終工程を触媒する（非特許文献１）。ＰＫＤは、常染色体劣性遺伝疾患であり、慢性非球状赤血球性溶血性貧血の最も一般的な原因である。ピルビン酸キナーゼ欠損症は、ＲＰＫ活性が赤血球において正常活性の２５％未満に減少した場合に臨床的意義のあるものとなる。ＰＫＤ治療は、定期的な輸血及び脾臓摘出術等の対症手段に基づいている。ＰＫＤの唯一の根治的治療は、同種異系骨髄移植である（非特許文献２、非特許文献３）。

しかしながら、適合するドナーが見つかる可能性が低いこと、及び同種異系骨髄移植に付随する危険性により、その臨床適用は限られたものとなっている。

Zanella et al., 2007 Suvatte et al., 1998 Tanphaichitr et al., 2000

本発明において、本発明者らは、ＰＫＤの代替療法を提供するという課題に立ち向かった。この目的のために、本発明者らは、ＰＫＤ治療（correction）のための細胞リプログラミング及び遺伝子編集の組み合わせを、赤血球系譜を冒す代謝疾患へのこれらの先進技術の潜在的応用の最初の実例として評価した。この意味において、ＰＫＤ患者特異的ｉＰＳＣが、ＰＢ−ＭＮＣ（末梢血単核細胞）からＳｅＶ非組み込み型の系によって効率的に作製された。ＰＫＬＲ転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によりＰＫＬＲ遺伝子を編集して、相同組換え（ＨＲ）により部分的なコドン最適化ｃＤＮＡを２番目のイントロンに導入した。驚くべきことに、本発明者らは、修正されるべきアレルを選択する可能性を裏付ける、ＨＲにおけるアレル特異性を見出した。

ＳｅＶによるＰＢ−ＭＮＣリプログラミングを示す図である。健康なドナー及びＰＫＤ患者からのＰＢ−ＭＮＣを、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃＭＹＣのｍＲＮＡを発現するＳｅＶによってリプログラムした。健康なドナー（ＰＢ２ｉＰＳＣ）、患者ＰＫＤ２（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ）、及び患者ＰＫＤ３（ＰＫＤ３ｉＰＳＣ）からの幾つかの系統を単離し、増殖させ、そしてキャラクタリゼーションを行った。（Ａ）リプログラミングプロトコルの図。（Ｂ）ＰＢ２のＭＮＣ、ＰＫＤ２のＭＮＣ、又はＰＫＤ３のＭＮＣに由来する種々のｉＰＳＣ系統の代表的な顕微鏡写真。スケールバーは、２００ｍｍに相当する。（Ｃ）ＰＢ２ｉＰＳＣ、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ、及びＰＫＤ３ｉＰＳＣにおけるＰＫＬＲ遺伝子中の各々の患者特異的突然変異のサンガー法シーケンシング。^＊患者ＰＫＤ２に存在する突然変異。^＃患者ＰＫＤ３に存在する突然変異。 ＰＫＬＲ座位における遺伝子編集を示す図である。（Ａ）ＨＲにより治療マトリクスがＰＫＬＲ座位中のどこに導入されるかを示す図。組み込まれたマトリクスをＰＣＲ（水平の矢印）及びサザンブロット（垂直の矢印）によって確認する方略が示され、予想されるＤＮＡ断片サイズが示されており、そしてＰｕｒｏＲ／チミジンキナーゼ融合カセット上の線は、プローブ位置を示している。部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫの始めと終わりとにある小さい四角形は、それぞれカセット中に存在するスプライシングアクセプター及びＦＬＡＧタグ配列を示し、薄い灰色の四角形は、内因性（ｍＲＮＡ）ＲＰＫエキソンを表し、濃い灰色の四角形は、それぞれＰＫＬＲ遺伝子の始めと終わりとにある１番目のＬＰＫエキソン及び３０ ＵＴＲを表し、かつ黒い四角形は、ホモロジーアームを表す。（Ｂ）特異的なマトリクスの組み込みを確認するためにＰＣＲによって増幅されたＰｕｒｏＲ−ＰＫＤ２ｉＰＳＣクローンからのｇＤＮＡのＤＮＡ電気泳動。（Ｃ）ＰＫＬＲ座位におけるマトリクスの正しい組み込みを確認するためにＳｃａＩ又はＳｐｅＩによって消化された、編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローンからのｇＤＮＡのサザンブロット。 ＰＫＬＲ座位へのアレル特異的標的化を示す図である。（Ａ）サンガー法シーケンシングにより確認された、ＰＫＤ２患者細胞におけるＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロンにおいて検出された一塩基多型（ＳＮＰ）。黒い矢印は、その多型を指している。（Ｂ）全ての編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローンでの非標的アレルにおけるＰＫＤ２のＳＮＰの配列。赤い文字は、ＳＮＰを示す。（Ｃ）標的アレルにおけるＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの理論上の切断部位及びマトリクスの組み込みに対する上記ＳＮＰの位置を示す図。 ＰＫＤ２ｉＰＳＣの赤血球系分化を示す図である。ＰＢ２ｉＰＳＣ、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ、及び編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣを、特定の条件下で赤血球系細胞へと分化させ、３１日後にｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖及び分化条件において分析した。（Ａ）赤血球系分化は、フローサイトメトリー分析によって確認した。臍帯血ＭＮＣ、ＰＢ２ｉＰＳＣクローンｃ３３、ＰＫＤ２ｉＰＣクローンｃ７８、及び編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローンｅ１１の代表的な分析が示されている。（Ｂ）種々のｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞におけるＲＰＫ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝６）によって評価した。（Ｃ）特異的ＲＴ−ＰＣＲによる、編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣにおけるキメラ型（ｍＲＮＡ）ＲＰＫの増幅。プライマーは、内因性（ｍＲＮＡ）ＲＰＫ配列と導入されたコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ配列との間の連結部付近の領域を増幅した。矢印は、編集された細胞（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１）からのＲＮＡだけに存在する予想されたバンド及び相応のサイズを示している。（Ｄ）キメラ型転写産物の配列を、内因性エキソン２（青い囲い）及び外因性エキソン３（赤い囲い）の間の正しいスプライシング後に理論上予想される配列とアライメントさせた。（Ｅ）ウェスタンブロットにより評価された、ＰＢ２ｉＰＳＣ、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ、及び編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞におけるＲＰＫタンパク質の存在（上段）；ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１における移動度の変化は、キメラ型タンパク質に付加されたＦＬＡＧタグによるものである。キメラ型タンパク質の発現は、編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞においてのみ抗ＦＬＡＧ抗体によって検出された（下段）。 編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣにおける表現型修正を示す図である。（Ａ）健康なｉＰＳＣ（ＰＢ２ｉＰＳＣ）、ＰＫＤｉＰＳＣ（患者ＰＫＤ２及びＰＫＤ３）、及び編集されたＰＫＤｉＰＳＣ（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１クローン、ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８クローン、及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１クローン）に由来する赤血球系細胞におけるＡＴＰレベル。データは、３つの独立した実験により２人の異なる患者に由来する６個の異なるｉＰＳＣ系統から得られた。（Ｂ）ＰＢ２ｉＰＳＣのクローンｃ３３（−）、ＰＫＤ２ｉＰＣのクローンｃ７８（：）、及び編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣのクローンｅ１１（Ｃ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖及び分化。ｎｓ（統計学的に非有意）。 造血始原体におけるＰＫＬＲ座位の遺伝子編集を示す図である。（Ａ）造血始原体での遺伝子編集プロトコル。（Ｂ）ピューロマイシン選択を行ってない場合と行った場合での増殖後の造血コロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量。８００個のＣＢ−ＣＤ３４を、ＨＳＣ−ＣＦＵ培地（Stem Cell Technologies社）１ミリリットル当たりに播種し、そして２週間後に得られたＣＦＵを計数した。全てのデータは、播種された５０００個のＣＢ−ＣＤ３４に正規化された。ＣＦＵは、顕微鏡下で１０倍及び２０倍の対物レンズを使用した観察により計数した。Ｍ：相同組換えマトリクス、ＴＭ：相同組換えマトリクス及びＰＫＲＬ ＴＡＬＥＮサブユニット、ＣＴＬ（コントロール）：培地に核酸物質を一切加えずにヌクレオフェクションされたＣＢ−ＣＤ３４細胞。（Ｃ）トランスフェクションされ、増殖され、そしてピューロマイシン選択されたＣＢ−ＣＤ３４細胞からの骨髄球系ＣＦＵ及び赤血球系ＣＦＵ。骨髄球系コロニー及び赤血球系コロニーは、それらの形態及び各々のコロニーを形成する細胞の型に基づき判別した。骨髄球系コロニーは、顆粒球又は単球により形成される白色又は暗白色であった。赤血球系コロニーは、赤血球により形成される赤色又は褐色であった。 ＰＫＬＲ遺伝子が編集されたＣＢ−ＣＤ３４細胞から得られたＣＦＵにおける相同組換えの分析を示す図である。（Ａ）ＰＫＬＲ座位での遺伝子編集を分析するように設計されたネステッドＰＣＲの図。（Ｂ）ＴＭがエレクトロポレーションされ、そしてピューロマイシンで選択されたＣＢ−ＣＤ３４に由来するＣＦＵのネステッドＰＣＲ分析。（Ｃ）ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ^Ｒ）細胞に由来するＣＦＵの数、相同組換え分析に関して陽性のＣＦＵの数、及び遺伝子編集されたＣＦＵのパーセンテージを示す、３つの独立した実験からのデータ。全てのＣＦＵは、ＴＭでトランスフェクションされ、ピューロマイシンで選択された造血始原体に由来していた。ＣＴＬ細胞又はＭでヌクレオフェクションされた細胞のいずれからもＣＦＵは確認されなかった（６ｄ＋４ｄプロトコル）。（Ｄ）４日間の増殖期間及び２日間のピューロマイシン選択期間（４ｄ＋２ｄプロトコル）の後に得られたピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ^Ｒ）細胞に由来するＣＦＵの数を示す、２つの独立した実験からのデータ。 ヌクレアーゼの送達の改善を示す図である。ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡとしての送達。（Ａ）ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡの図。両方のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニットを、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲ（Hyde et al, Science 14 February 2014: 783-787に記載される配列に由来する）、β−グロビンの３’ＵＴＲ又はその両方の配列のいずれかによって修飾した。（Ｂ）１×１０^５個のＣＢ−ＣＤ３４を、異なる量の核酸（０．５μｇ又は２μｇ）を使用して４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Lonza社）において、プラスミドＤＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ、又は種々の修飾を有するｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ（未修飾のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲのｍＲＮＡ、及びβ−グロビンの３’ＵＴＲのｍＲＮＡ）としてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのいずれかでヌクレオフェクションした。種々のヌクレアーゼがＰＫＬＲ座位の標的部位において挿入及び欠失（インデル）を生ずる能力を測定するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＩＤＴ）を、エレクトロポレーションから３日後に（左側のパネル）、又はヌクレオフェクションした造血始原体に由来するＣＦＵにおいて（右側のパネル）実施した。（Ｃ）Ｂで示されたＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおいて得られたインデルの定量を、バンドの濃度計測、及び開裂の方のバンドと非開裂の方のバンドとの間のバンド強度の比率（％）によって評価した。 ＮＳＧに生着された造血幹細胞でのＰＫＬＲ座位の遺伝子編集を示す図である。（Ａ）ＮＳＧマウスへの生着の後のヒト造血幹細胞における遺伝子編集分析の図。新鮮なＣＢ−ＣＤ３４細胞を、ＨＲマトリクスと一緒にプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによってヌクレオフェクションさせた。それらの細胞を培養し、そしてピューロマイシンで選択した。選択されたＣＢ−ＣＤ３４細胞を、亜致死量照射された免疫不全ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ）に静脈内移植した。移植から４ヶ月後に、ヒト生着をＦＡＣＳにより分析し、ｉ）ヒト造血細胞（ｈＣＤ４５陽性）対マウス造血細胞（ｍＣＤ４５陽性）、及びｉｉ）ヒト造血始原体（ＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性）を確認した。次いで、ＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性細胞を、マウス骨髄からセルソーティングによって単離した。単離されたヒト始原体を、図７Ｃに示されるように培養し、ピューロマイシンで選択し、その後にＣＦＵアッセイを実施した。これらの生着されたヒト造血始原体における遺伝子編集を、個々のＣＦＵにおいて、図７Ａに示されるようにネステッドＰＣＲによって分析した。（Ｂ）移植４ヶ月後のＮＳＧの骨髄におけるヒト造血生着のＦＡＣＳ分析。（左側のパネル）マトリクス及びＤＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮでヌクレオフェクションされたＣＢ−ＣＤ３４が移植されたＮＳＧマウスにおけるヒト生着；（右側のパネル）マトリクス及びｍＲＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮでヌクレオフェクションされたＣＢ−ＣＤ３４が移植されたＮＳＧマウスにおけるヒト生着。（Ｃ）ｈＣＤ４５陽性ＣＤ３４陽性細胞についてセルソーティングにより濃縮し、更にピューロマイシン処理をした後の、ＮＳＧマウスに生着されたヒト造血始原体におけるネステッドＰＣＲによる遺伝子編集分析。生着されたヒトＣＤ３４に由来するＣＦＵは、遺伝子編集がｍＲＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのエレクトロポレーションにより媒介された場合に、ＨＲに関して陽性であった。

本明細書において、本発明者らは、ＰＫＤ患者のための治療アプローチとして細胞リプログラミング及び遺伝子編集を組み合わせる可能性を示した。本発明者らは、非組み込み型ウイルス系を使用してＰＫＤ患者から採取されたＰＢ−ＭＮＣからｉＰＳＣを作製した。これらのＰＫＤｉＰＳＣ系統は、特異的なＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによって促進されて、ＰＫＬＲ座位でのノックイン方略を介して効果的に遺伝子編集された。より重要なことには、本発明者らは、ＰＫＤに冒された解糖段階の部分的修復による、編集されたＰＫＤｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞における疾患表現型の回復、及びＰＫＤｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞における全ＡＴＰレベルの改善を実証した。ＰＫＤ患者に由来する赤血球系細胞におけるエネルギーバランスの修復は、ＰＫＤ患者の治療のために遺伝子編集を使用する可能性を開く。

患者細胞をリプログラムするために、本発明者らは、入手しやすい患者細胞源であるＰＢ−ＭＮＣを使用するプロトコル及びＳｅＶベクター（センダイウイルスベクタープラットフォーム）を基礎とする組み込みを伴わないリプログラミング方略を採用した。ＰＢ−ＭＮＣが選ばれたのは、採血が患者の追跡調査でよくあることであり、かつ侵襲性が最小限に抑えられるからである。さらに、通常の採血から、幾つかのリプログラミング実験を実施するのに十分なＰＢ−ＭＮＣを回収することが可能である。最後に、これまでの研究により、ＰＢ−ＭＮＣは、非常に低い効率であるもののリプログラミングされ得ることが示されている（Staerk et al., 2010）。その一方で、ＳｅＶリプログラミングプラットフォームは、標的細胞に対する広い指向性を有するｉＰＳＣリプログラミングのための非常に効果的な非組み込み型の系として記載されている（Ban et al., 2011；Fusaki et al., 2009）。リプログラムしたＳｅＶは、細胞リプログラミングの後に、新たに生成されたｉＰＳＣとウイルス性ｍＲＮＡとの間の複製の相違のため排除される（Ban et al., 2011；Fusaki et al., 2009）。しかしながら、全ＰＢ−ＭＮＣが選ばれる場合には、リプログラムされたＴ細胞又はＢ細胞が優先される可能性がある。それというのも、当該細胞はこれらの試料中で最も豊富な有核細胞の型であるからである。Ｔ細胞又はＢ細胞のリプログラミングは、ＴＣＲ又は免疫グロブリンの再構成のいずれかを伴うｉＰＳＣを生成し、これらの再構成されたｉＰＳＣに由来する造血細胞の免疫学的レパートリーを減らす危険性がある。この可能性を避けるために、本発明者らは、ＰＢ−ＭＮＣを必須のサイトカインと一緒に培養することによって、そのプロトコルをＴリンパ球又はＢリンパ球のいずれかのリプログラミングから遠ざけるようにバイアスし、造血始原体及び骨髄球系細胞の維持及び増殖を優先させた。このアプローチは、本明細書では、ＳｅＶベクターがこれらの特定の条件下で造血始原体及び骨髄球系細胞を優先的に形質導入し、したがって分析されたｉＰＳＣ系統のいずれも免疫グロブリン及びＴＣＲの再構成を伴わないことを実証することによって確認された。本発明者らは、ＳｅＶを使用したＰＢ−ＭＮＣからのｉＰＳＣの生成が実現可能であり、かつ簡単であり、そして調査目的又は臨床目的のために更に使用することができる真のｉＰＳＣの全ての特徴を有する組み込みを伴わないｉＰＳＣ系統が作製されることを更に実証した。

遺伝子療法の次の目標は、細胞ゲノムにおける治療配列の特異的挿入である（Garate et al., 2013；Genovese et al., 2014；Karakikes et al., 2015；Song et al., 2015）。特異的突然変異の遺伝子改変、セーフハーバー部位での治療配列の組み込み、又は同じ遺伝子座位へのノックインを含む数多くの異なる遺伝子編集方略が記載されている。本発明者らは、コドン最適化された形のＲＰＫの部分的なｃＤＮＡをＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中に挿入するノックイン方略に目を向けた。臨床的に使用される場合に、この方略は、患者の９５％まで、つまり３番目のエキソンから（ｃＤＮＡ）ＲＰＫの終わりまでに突然変異を有する患者の治療を可能にすることとなる（Beutler and Gelbart, 2000；Fermo et al., 2005；Zanella et al., 2005）。さらに、このアプローチは、遺伝子編集の後にＲＰＫの内因性調節を保持し、ＲＰＫのような不可欠な因子は、赤血球系分化の間に厳しく調節される。この緻密な制御は、セーフハーバー方略が選ばれた場合には失われることとなる。

作製されたＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮは、非常に特異的であり、かつ非常に効果的である。オフサイト検索アルゴリズムによって定義され、ＰＣＲによって分析され、かつ遺伝子シーケンシングされた理論上のオフターゲット部位のどこにも突然変異は一切見出されなかった。さらに、本発明者らは、そのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮが使用された場合に、ヌクレオフェクションに関連した毒性を考慮することなく、１０００００個のエレクトロポレーションされたＰＫＤｉＰＳＣのうち２．８５個が遺伝子編集され、他者によりこれまでに公表された値（Porteus and Carroll, 2005）と類似の値に達することを確認した。興味深いことに、編集されたＰＫＤｉＰＳＣクローンの４０％は、非標的アレルにおいてインデルを有するか、又は両アレルで標的化されており、そのことは、開発されたＴＡＬＥＮが、高い頻度で本来の標的の配列において非常に効果的に切断することを示している。

驚くべきことに、本発明者らは、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ切断部位から４３ｂｐ離れた単一のＳＮＰの存在が、ＨＲの妨げとなることを見出した。ＴＡＬＥＮによる切断が起こったものと考慮して、非標的アレルにおいてインデルが検出され得るので、マトリクスの挿入の不存在は、該マトリクスとゲノム配列との完璧なアニーリングに関連した問題点と直接的に関連していると思われる。このＳＮＰは、非常に繰り返しの多い領域であって、既に述べられた（Renkawitz et al., 2014）ように、この領域とそのホモロジーアームとの間のＨＲ特異性を高める構造的配置を形成すると考えられる領域に位置していることを指摘する必要がある。このように、ＨＲが起こるべきゲノムコンテキストは、重要な役割を担い、そしてＨＲを促進又は減退させ得る。いずれにせよ、これらのデータは、遺伝子編集方略のために、編集されることとなる個々のＤＮＡからＨＲマトリクスのホモロジーアームを作製することの重大な必要性を裏付けている。これは、編集されるべきゲノム領域中に同様のＳＮＰを有する患者へとＨＲマトリックスを制限することとなる。したがって、ノックイン方略又はセーフハーバー方略を使用したいずれの遺伝子編集療法も、最初に、選択されたホモロジーアーム中にＳＮＰが存在することについて各々の患者をスクリーニングすべきである。その一方で、顕性アレルの存在が、例えばα地中海貧血でのように病原性である場合（De Gobbi et al., 2006）に、特定のＳＮＰの存在は、アレル特異的遺伝子標的化の実施の補助ともなり得る。

ＰＫＤを治療するために本明細書で利用される遺伝子編集方略は安全であった。それというのも、ゲノム改変の導入も、挿入による隣接遺伝子の発現の改変も外因性配列の発現も起こらなかったからである。このことは、選択カセットが近くの遺伝子を脱調節したこれまでの結果（Zou et al., 2011）と比べて、あらゆる遺伝子のシス活性化を伴わない上記ノックイン遺伝子編集方略の安全性を裏付けている。さらに、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ遺伝子編集によって引き起こされるオフターゲット効果は一切観測されなかった。

本発明者らは、ＣＧＨ及びエキソームシーケンシング解析により幾つかのゲノム改変を見出した。しかしながら、該ゲノム改変の大部分は、リプログラミング前のＰＫＤ ＰＢ−ＭＮＣにおいて既に存在しており、特に両アレルで標的化されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ３１の場合に、全てのＣＮＶは、ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４中に既に存在しており、このことは、当初の試料中の細胞モザイクを有するｉＰＳＣクローンにおけるこれらのＤＮＡ多様性を関連付けるこれまでのデータを裏付けている（Abyzov et al., 2012）。しかしながら、当初の試料中で検出することができなかったｉＰＳＣ中に存在する幾つかの突然変異が存在したが、それは、技術的制約によるものか、又はリプログラミング過程及びｉＰＳＣ培養に付随する固有の遺伝的不安定性によるものであったかもしれない（Gore et al., 2011；Hussein et al., 2011）。この最後の可能性の裏付けとして、本発明者らは、ＣＮＶがＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８には存在するが、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１には存在しないことを見出した（表２）。ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８は、もう数回の継代にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されるので、ＨＲの後で、かつＣＧＨ分析の前に、遺伝子編集で得られたクローン中に存在しなかった幾つかの新しい変化が生じたのかもしれない。１つのＣＮＶが、ＰＬＡＧ１の転座パートナーとして唾液腺腫に間接的に関与しているＴＣＥＡ１遺伝子に含まれている（Asp et al., 2006）が、確認されたこれらのゲノム改変のいずれも、造血器悪性腫瘍、細胞増殖、又はアポトーシス制御に関係しておらず、そのことは、遺伝子編集によるＰＫＤ療法におけるそれらの中立性を示唆している。

普遍的活性なｍＰＧＫプロモーターからのＰｕｒｏ／ＴＫの構成的発現は、このアプローチの治療的利用を妨げるかもしれない。確かにこれらの免疫原性の高い原核性／ウイルス性のタンパク質は、遺伝子修復された細胞の細胞表面に主要組織適合複合体クラスＩ分子によって提示され得るため、患者に移植されると細胞に対する免疫応答が刺激される。本明細書では、Ｐｕｒｏ／ＴＫカセットは、編集されたＰＫＤｉＰＳＣ系統において維持されるが、そのカセットは２つのｌｏｘＰ部位の間に挿入されているため、それにより該カセットを臨床利用する前に切り出すことが可能となる。さらに、本発明のアプローチの潜在的な臨床的使用のために、欠損型の神経成長因子受容体と組み合わせた磁気ソーティングによる濃縮、又はＰＧＫ構成的プロモーターの代わりに誘導的又は胚特異的プロモーターを使用するＰｕｒｏ／ＴＫ発現の制限等のその他の選択系を使用することができる。

最後に、本発明者らは、ＰＫＤｉＰＳＣにおけるＰＫＬＲ遺伝子を編集して、編集されたＰＫＤｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞におけるエネルギーバランスを回復させることの有用性を明確に実証した。解糖に関係しているＡＴＰ及びその他の代謝物は、キメラ型ＲＰＫを生理学的に発現することによって修復された。単一アレルで修正されたＰＫＤｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞は、ＡＴＰレベルの部分的修復をもたらし、両アレルで修正されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１に由来する赤血球系細胞は、ＡＴＰレベルを完全に回復した（図５Ａ）。さらに、修正されていないＰＫＤｉＰＳＣ及び修正されたＰＫＤｉＰＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた赤血球系集団において何ら差異を確認することはできなかったが、それは恐らく、成熟な脱核された赤血球の作製に使用されたプロトコルの終わりの分化／脱核を欠いているからである。さらに、本発明者らは、１個の出発ｉＰＳＣ当たりに２００００個の赤血球系細胞を作製することが可能であり、こうして本発明のアッセイのために豊富な材料が提供され、これらの細胞の治療的使用に着手する可能性が与えられる。

まとめると、遺伝子編集と患者特異的ｉＰＳＣとを組み合わせて、ＰＫＤが治療された。本発明の遺伝子編集方略は、部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫをＰＫＬＲ座位へと、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮを媒介して細胞ゲノム又は隣接遺伝子発現を改変することなく挿入することを基礎としている。さらに、本発明者らは、単一ＳＮＰがＨＲを回避し得るので、相同性の高い配列特異性を見出した。得られた編集されたＰＫＤｉＰＳＣ系統は、多数の赤血球系細胞に分化することができ、その際、ＰＫＤ赤血球のエネルギー欠損は効果的に修正された。このことは、疾患モデリングのためのｉＰＳＣの使用を実証し、かつＰＫＤ及び完全機能の赤血球の連続的な起源が必要とされるその他の代謝的赤血球疾患の治療のための遺伝子編集の潜在的な将来的な使用を裏付けている。

さらに、本発明者らは、ｉＰＳＣと一緒に使用することに成功した遺伝子編集方略が、ヒト造血始原体に直接的に適用することができることを見出し、そのことは、遺伝子編集法に関してｉＰＳＣを造血始原体へとリプログラムする過程が回避されるという利点をもたらす。特に、治療マトリクスのＰＫＬＲ座位への特異的な組み込みは、造血始原体においてもＰＫＬＲ遺伝子中の欠陥を修正することが示された（実施例９及び実施例１０）。ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニットが、５’修飾及び／又は３’修飾されたｍＲＮＡとしてトランスフェクションされた場合に、改善された結果が得られた（実施例１１及び実施例１２）。

したがって、本発明の第１の態様は、赤血球系譜へと分化する能力を有する細胞、例えばｉ）造血幹細胞若しくは造血始原細胞、又はｉｉ）成熟細胞から得られた人工多能性幹細胞（Li et al., 2014）、好ましくは赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体から単離された末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞であって、上記代謝疾患を引き起こす遺伝子中の１つ以上の突然変異が、内因性の１番目のエキソン及び部分的なｃＤＮＡによって形成されるキメラ型ｍＲＮＡを内因性プロモーターの制御下に発現するように、部分的なｃＤＮＡが標的遺伝子の或る座位に挿入されるノックイン方略を介した、成熟細胞から得られた人工多能性幹細胞の遺伝子編集により修正された細胞に関する。

用語「細胞」及び「細胞集団」は、互換的に使用される。本明細書で使用される用語「細胞系譜」とは、限定されるものではないが、造血幹細胞又は造血始原細胞を含む始原細胞又は幹細胞に由来する細胞系統を指す。

造血細胞は、一般的に（ＣＤ４５陽性）であることを特徴とし、ヒト造血幹細胞又は始原細胞はＣＤ４５陽性及びＣＤ３４陽性であることを特徴とする。本明細書で使用される用語「造血幹細胞」とは、適切な１種又は複数種のサイトカインに曝したときに、リンパ球系細胞系譜若しくは骨髄球系細胞系譜の始原細胞へと分化し得るか、又は更なる分化が開始することなく幹細胞集団として増殖し得る多能性幹細胞又はリンパ球系幹細胞若しくは骨髄球系幹細胞を指す。造血幹細胞又は造血始原細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、胎盤、又は末梢血から得ることができる。上記細胞は、分化された細胞系統から、国際公開第２０１３／１１６３０７号に記載されるような細胞リプログラミング法によって得ることもできる。

本明細書で使用される用語「始原体」及び「始原細胞」とは、細胞が更に１種のサイトカイン又は１群のサイトカインに曝したときに、造血細胞系譜に更に分化することとなる発育段階に分化した原始造血細胞を指す。本明細書で使用される「始原体」及び「始原細胞」には、幾つかの型の始原細胞に由来する「前駆」細胞も含まれ、該細胞は、幾つかの成熟な分化した造血細胞の直接前駆細胞である。本明細書で使用される用語「始原体」及び「始原細胞」には、限定されるものではないが、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞（ＧＭ−ＣＦＣ）、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ｍｅｇａ）、赤芽球系バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｍｅｇａ）、Ｂ細胞コロニー形成細胞（Ｂ−ＣＦＣ）及びＴ細胞コロニー形成細胞（Ｔ−ＣＦＣ）が含まれる。「前駆細胞」には、限定されるものではないが、赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、顆粒球コロニー形成細胞（Ｇ−ＣＦＣ）、好塩基球コロニー形成細胞（ＣＰＣ−Ｂａｓ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−Ｅｏ）及びマクロファージコロニー形成細胞（Ｍ−ＣＦＣ）といった細胞が含まれる。

本発明の第１の態様による始原体及び前駆細胞は、赤血球系譜の細胞、すなわち赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）及び赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）を含む骨髄球系及び赤血球系の始原細胞である。

本明細書で使用される用語「サイトカイン」とは、更に動物組織又はヒト組織から単離される任意の天然のサイトカイン又は成長因子、及び当初の親サイトカインの生物学的活性を維持するその任意の断片又は誘導体を指す。サイトカイン又は成長因子は更に、組換えサイトカイン又は組換え成長因子とすることができる。本明細書で使用される用語「サイトカイン」とは、幹細胞特性を有する細胞の分化、例えばｉＰＳＣ若しくは造血幹細胞からの、造血始原細胞若しくは前駆細胞への分化及び／又はその増殖を誘導し得る任意のサイトカイン又は成長因子を指す。本発明で使用するために適したサイトカインには、限定されるものではないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及びインスリン、並びにそれらの組み合わせが含まれる。造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖のために適したサイトカインは、例えばＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びそれらの組み合わせであり、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖のための好ましいサイトカインの組み合わせは、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ及びＩＬ−３である。

本発明の第１の態様の好ましい一実施形態においては、上記代謝疾患は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）である。

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態においては、上記代謝疾患は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）であり、かつ上記遺伝子編集は、スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介して行われ、かつこのマトリクスは、相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に導入される。好ましくは、上記遺伝子編集は、スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介して行われ、かつこのマトリクスは、相同組換えによりＰＫＬＲ座位の２番目のイントロン中に導入される。より好ましくは、上記治療マトリクスは、好ましくは上記部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＰＫＬＲ遺伝子の下流にあるホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジン（ＴＫ）融合遺伝子を含む、陽性−陰性選択カセットを更に含む。

本発明の第２の態様は、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖を促進する方法であって、哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体から単離された末梢血単核細胞を培養し、そしてこれらの細胞を、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３の存在下で、好ましくは少なくとも４日間にわたり増殖させ、任意にこれらの細胞を回収することを含む、方法に関する。

本発明の第３の態様は、末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞又は人工多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法であって、
ａ． 哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体から単離された末梢血単核細胞を培養し、そしてこれらの細胞を、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３の存在下で、好ましくは少なくとも４日間にわたり増殖させることで、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖を促進する工程と、
ｂ． 上記工程ａ）から得られた細胞を、好ましくは以下の４種のリプログラミング因子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするセンダイウイルスベクタープラットフォーム（ＳｅＶ）を使用した形質導入プロトコルを使用することによってリプログラムし、そしてこれらの細胞を、好ましくは同じ培地中で好ましくは３日間から６日間まで維持する工程と、
ｃ． 任意に、上記細胞を回収する工程と、
を含む、方法に関する。

本発明の第３の態様の好ましい実施形態においては、上記末梢血単核細胞は、赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している、好ましくはピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験体から単離される。

本発明の第３の態様の好ましい別の実施形態においては、上記末梢血単核細胞は、赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離され、かつ上記方法は、
ｄ． 内因性の１番目のエキソン及び部分的なｃＤＮＡによって形成されるキメラ型ｍＲＮＡを内因性プロモーターの制御下で発現するように、部分的なｃＤＮＡが標的遺伝子の或る座位中に挿入されるノックイン方略を介した、好ましくは相同組換え（ＨＲ）を促進するためにヌクレアーゼが使用される遺伝子編集により、人工多能性幹細胞において存在する代謝疾患を引き起こす遺伝子中の１つ以上の突然変異を修正する工程と、
ｅ． 任意に、上記ノックイン細胞を回収する工程と、
を更に含む。

本発明の第３の態様の好ましい別の実施形態においては、上記末梢血単核細胞は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験体から単離され、かつ上記方法は、
ｄ． スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介した、好ましくはＨＲを促進するためにヌクレアーゼが使用されるＰＫＬＲ遺伝子の遺伝子編集により、人工多能性幹細胞において存在するＰＫＬＲ遺伝子中の１つ以上の突然変異を修正し、このマトリクスが相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に導入される工程と、
ｅ． 任意に、上記ノックイン細胞を回収する工程と、
を更に含む。

本発明の第３の態様の好ましい別の実施形態においては、上記末梢血単核細胞は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験体から単離され、かつ上記方法は、
ｄ． スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介した、好ましくはＨＲを促進するためにヌクレアーゼが使用されるＰＫＬＲ遺伝子の遺伝子編集により、人工多能性幹細胞において存在するＰＫＬＲ遺伝子中の１つ以上の突然変異を修正し、このマトリクスが相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中に導入される工程と、
ｅ． 任意に、上記ノックイン細胞を回収する工程と、
を更に含む。

ゲノム編集のための様々なヌクレアーゼは、当該技術分野でよく知られており、これらには、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー）が含まれる。レビューについては、例えば、Lopez-Manzaneda S. 2016を参照のこと。

本発明の第３の態様の好ましい実施形態においては、上記ヌクレアーゼは、ＰＫＬＲ転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、好ましくは、上記ヌクレアーゼは、配列番号１及び配列番号２によって規定される２つのサブユニットを含むＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮである。

配列番号１（左側のサブユニットＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ）
ＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＣＣＡＣＧＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＴＴＧＣＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＡＡ。

配列番号２（右側のサブユニットＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ）
ＡＴＧＧＧＣＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＣＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＧＧＣＣＡＣＧＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＴＴＧＣＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＡＡＧＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＴＴＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＣＣＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＡＴＡＡ。

本発明の第３の態様の別の好ましい実施形態においては、上記ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして、好ましくは５’修飾及び／又は３’修飾を有するｍＲＮＡとして、より好ましくはＶＥＥＶの５’ＵＴＲ（配列番号３：ＡＣＴＡＧＣＧＣＴＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＡＡ）が５’末端に付加されており、及び／又はβ−グロビンの３’ＵＴＲ（配列番号４：ＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＡＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣ）が３’末端に付加されているｍＲＮＡとして使用される。

本発明の第３の態様による方法における治療マトリクス及び任意に上記ヌクレアーゼの宿主細胞中への導入は、当該技術分野でよく知られた形質転換法又はトランスフェクション法、例えばヌクレオフェクション、リポフェクション等によって行うことができる。例えばGreen & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012を参照のこと。

本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの方法により得られた又は得ることが可能な人工多能性幹細胞に関する。

本発明の第５の態様は、療法で使用するための、本発明の第１の態様又は本発明の第４の態様による人工多能性幹細胞に関する。

本発明の第６の態様は、赤血球系譜を冒す代謝疾患の治療で使用するための、好ましくはピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）の治療で使用するための、本発明の第１の態様又は本発明の第４の態様による人工多能性幹細胞に関する。

本発明の第７の態様は、スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスに関し、このマトリクス自体は、相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に導入することが可能である。

好ましい一実施形態においては、上記治療マトリクスは、タグに融合された、スプライスアクセプターシグナル（配列番号７：ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ）を先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子（配列番号５）を含む。

配列番号５（ｃｏＲＰＫ Ｅ３−Ｅ１１）
ＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＣＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＡＴＴＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＧＣＣＧＡＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣ。

当該技術分野でよく知られる種々のタグを使用することができる。これらには、限定されるものではないが、３ｘＦＬＡＧ、ポリＡｒｇタグ、ポリＨｉｓタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＨＡＴタグ、カルモジュリン結合ペプチドフラグ、セルロース結合ドメインタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、又はマルトース結合タンパク質タグが含まれる。好ましくは、上記タグは、ＦＬＡＧタグ（配列番号６：ＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＡ）である。

より好ましい実施形態においては、上記治療マトリクスは、陽性−陰性選択カセットを更に含む。種々の選択マーカー、例えば抗生物質に対する耐性遺伝子のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、又はグルタミン合成酵素、表面遺伝子（ＣＤ４又は欠損型ＮＧＦＲ）、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ等）を使用することができる。

好ましくは、上記陽性−陰性選択カセットは、上記部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＰＫＬＲ遺伝子の下流にあるホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジン（ＴＫ）融合遺伝子である。ＰＧＫの代わりに、その他のプロモーター、例えば伸長因子１α（ＥＦ１α）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＳＦＶ）、キメラ型のサイトメガロウイルスエンハンサー並びにニワトリβ−アクチンプロモーターの１番目のエキソン及び１番目のイントロン並びにウサギβ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプター（ＣＡＧ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は任意のその他の普遍的プロモーター若しくは造血特異的プロモーターを使用することもできる。

好ましくは、上記陽性−陰性選択カセットは、上記部分的な（ｃＤＮＡ）ＲＰＫの下流に位置するマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジンキナーゼ（ＴＫ）融合遺伝子（配列番号８）を含む。

配列番号８：ｍＰＧＫ−Ｐｕｒｏ／ＴＫ
ＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧＣＧＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＴＡＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＧＣＧＣＧＴＣＧＧＧＣＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＴＧＣＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣＧＧＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＧＧＴＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＧＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＧＡＧＡＣＡＡＴＣＧＣＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＡＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＴＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＣＧＧＧＣＴＡＣＴＴＧＣＣＡＡＴＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＴＡＴＣＧＧＧＧＡＣＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＧＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＴＧＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＣＴＣＣＧＴＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＣＡＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＧＡＣＧＡＴＡＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣ。

好ましくは、これらの要素の両端に、ＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中の配列に一致する２つのホモロジーアーム（配列番号９及び１０）を有する（図２Ａ）。

配列番号９（左側のホモロジーアーム）
ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＴＡＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＣＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＴＴＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＴＧＧＣＡＧＡＴＣＧＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧ。

配列番号１０（右側のホモロジーアーム）
ＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＡＣＴＣＣＧＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＡＡＣＡＴＧ。

遺伝子編集の効率を高めるために、本発明者らは、２番目のイントロン中の特定のゲノム配列（配列番号１１）を標的とする、ホモロジーアームを両端に有するＰＫＬＲ特異的ＴＡＬＥＮを開発した：ＴＧＡＴＣＧＡＧＣＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴＡＧＡＧＡ（左側及び右側のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ認識部位に下線が引かれている）。

したがって、本発明はまた、特別に設計されたＰＫＬＲ転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も提供する。より具体的には、それは２つのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニットを含む。ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの左側のサブユニットは、配列番号１によって規定され、かつＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの右側のサブユニットは、配列番号２によって規定される。

本発明の第８の態様は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験者から単離された赤血球系譜の末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞におけるＰＫＬＲ遺伝子中の１つ以上の突然変異を、ノックイン方略を介して遺伝子編集することにより修正するための、本発明の第４の態様の治療マトリクスのｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

本発明の第９の態様は、以下の４種のリプログラミング因子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするセンダイウイルスベクタープラットフォーム（ＳｅＶ）に関する。

本発明の第１０の態様は、赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された赤血球系譜の末梢血単核細胞をリプログラムするための、好ましくは、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験体から単離された赤血球系譜の末梢血単核細胞をリプログラムするための、本発明の第９の態様のセンダイウイルスベクタープラットフォームのｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

本発明の第１１の態様は、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖の促進のための、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３を含む組成物、好ましくは細胞用培地のｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に関する。

第１２の態様は、本発明の先の態様のいずれかの人工多能性幹細胞の赤血球系分化を誘導することにより得られた赤血球系譜の末梢血単核細胞を含む細胞集団に関する。好ましくは、これらの細胞は、赤血球系譜を冒す代謝疾患の治療において、より好ましくはピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）の治療のために使用される。

本発明の第１３の態様は、本発明の第３の態様又はその好ましい実施形態のいずれかの方法であって、人工多能性幹細胞の赤血球系分化を誘導する工程、及び任意に上記分化過程から得られた赤血球系譜の末梢血単核細胞を回収する工程を更に含む、方法に関する。

以下の実施例は、本発明を単に説明するものであって、限定するものではない。

実施例１． ＰＫＤ患者の末梢血に由来する組み込みを伴わない特異的ｉＰＳＣの作製
最初に、非組み込み型ＳｅＶによりｉＰＳＣへとリプログラムされるべき細胞源としてのＰＢ−ＭＮＣの潜在的使用を評価するために、本発明者らは、これらの細胞のＳｅＶへの感受性を分析した。ＰＢ−ＭＮＣを、特定のサイトカイン（幹細胞因子［ＳＣＦ］、トロンボポエチン［ＴＰＯ］、ＦＬＴ３Ｌ、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ］及びＩＬ−３）の存在下で４日間にわたり増殖させることで、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖を促進した。次いで、細胞に、アザミグリーン蛍光マーカーをコードするＳｅＶを感染させた。５日後に、造血始原細胞（ＣＤ３４陽性）、骨髄球系細胞（ＣＤ１４陽性／ＣＤ１５陽性）及びリンパ球系Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）及びＢ細胞（ＣＤ１９陽性）の形質導入を、フローサイトメトリーによって評価した。培養物中の大部分の細胞がＴリンパ球系マーカー又はＢリンパ球系マーカーを発現したが、それらのより低い割合（Ｔ細胞のうち１０％、Ｂ細胞のうち３％）が、アザミグリーンを発現した。それに対して、培養物中に存在する骨髄球系細胞のうち５４％及び造血始原体のうち７６％は、上記蛍光マーカーについて陽性であり（データは示していない）、これは、ＳｅＶが、これらの培養条件下で、より少ない数の造血始原体及び骨髄球系細胞を優先的に形質導入することを裏付けている。

次いでこの形質導入プロトコルを使用することで、健康なドナー及びＰＫＤ患者由来のＰＢ−ＭＮＣを、４つの「山中」リプログラミング因子（ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、及びｃ−ＭＹＣ；図１Ａ）をコードするＳｅＶによってリプログラムした。ＥＳＣ様コロニーは、１人の健康なドナー（ＰＢ２）及び２人のＰＫＤ患者（ＰＫＤ２及びＰＫＤ３）のＰＢ−ＭＮＣからの試料から得られた。ＰＢ２から２０個までのＥＳＣ様コロニー、ＰＫＤ２から１００個のＥＳＣ様コロニー、そしてＰＫＤ３から５０個のＥＳＣ様コロニーを単離し、増殖させた（図１Ｂ）。種々の樹立された系統の胚性幹（ＥＳ）様細胞に対する完全なリプログラミングを評価した。ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現アレイにより、本発明のリプログラムされた細胞及び参照のヒトＥＳＣ系統Ｈ９において、多能性及び自己複製に関連する主要な遺伝子の同様の発現レベルが確認された。ＥＳマーカーのＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ４、及びＴｒａ−１−６０はまた、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及び免疫蛍光によっても実証された。メチル化されていない状態のＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２プロモーターは、パイロシーケンシング法によって確認された。ＮＡＮＯＧプロモーターは、ＰＢ２、ＰＫＤ２及びＰＫＤ３に由来する系統において強く脱メチル化された。驚くべきことに、ＳＯＸ２プロモーターは、ＰＢ−ＭＮＣにおいて既にメチル化されていなかった。さらに、ＰＢ−ＭＮＣに由来するこれらの系統の多能性を、それらの系統がＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ／Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス中に奇形腫を発生する能力によって確認し、その際、全ての注射されたマウスは、３つの異なる胚葉からなる組織を示す奇形腫を生じた。これらのデータにより、ＰＢ２ｉＰＳＣ、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ、及びＰＫＤ３ｉＰＳＣとして示される真のｉＰＳＣ系統としてリプログラムされた系統が確認された。さらに、作製された種々のヒトｉＰＳＣ系統における野生型（ＷＴ）配列又は患者特異的突然変異の存在は、相応のゲノム座位のサンガー法シーケンシングによって確認した（図１Ｃ）。ＰＫＤ２ｉＰＳＣは、エキソン３（３５９Ｃ＞Ｔ）及びエキソン８（１１６８Ｇ＞Ａ）に２つのヘテロ接合型突然変異を示し、かつＰＫＤ３ｉＰＳＣは、患者に特徴的なエキソン９／イントロン９（ＩＶＳ９（＋１）Ｇ＞Ｃ）のスプライシングドナー配列にホモ接合型突然変異を有した。これらの突然変異は、末梢血由来の人工多能性幹細胞（ＰＢｉＰＳＣ）において検出することはできず、それは、予想されたＷＴ配列を示した（図１Ｃ）。

異所性のリプログラム遺伝子発現が存在しないことを確認するために、本発明者らは、作製されたｉＰＳＣにおけるＳｅＶベクターの消失を分析した。異所性タンパク質の存在は、アザミグリーンを発現するＳｅＶがリプログラミングベクターと一緒に同時形質導入されたので、蛍光マーカーの残存によって追跡することができた。アザミグリーン発現は、リプログラムされていない線維芽細胞様細胞において初期継代においてのみ検出された。緑色蛍光は、全てのｉＰＳＣコロニーにおいて消失した。重要なことには、ＳｅＶのｍＲＮＡは、ＰＢ−ＭＮＣに由来するｉＰＳＣにおいて後期継代において検出されなかった。

さらに、確立されたプロトコルが、骨髄球系細胞及び／又は始原細胞における優先的なリプログラミングを可能にするかどうかを確認するために、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び免疫グロブリン重鎖ゲノムの再編成を、作製されたｉＰＳＣにおいて研究した。分析されたｉＰＳＣクローン（ＰＢ２ｉＰＳＣ ｃ３３、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８、ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ１４、ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ１０、及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ３５）のいずれも、Ｔ再編成又はＢ再編成を一切有さず、それは、ｉＰＳＣクローンが、Ｔリンパ球から作製されたものでもなければ、Ｂリンパ球から作製されたものでもないことを意味する。これらの結果は、ＳｅＶベースのリプログラミング系を末梢血のリプログラミングにおける最良の選択肢として保証する。それというのも、そのリプログラミングベクターは、ｉＰＳＣ作製後に取り除かれ、かつｉＰＳＣは、非リンパ系細胞から作製されるからである。後続のＰＢ２、ＰＫＤ２及びＰＫＤ３からのクローンの遺伝子編集工程を進めるために、ＰＢ−ＭＮＣが無作為に選択された。

実施例２． ＰＫＤｉＰＳＣのＰＫＬＲ座位におけるＴＡＬＥＮベースの遺伝子編集
ＰＫＤｉＰＳＣの修正を達成するために、本発明者らは、ＦＬＡＧタグ（配列番号６）に融合された、スプライスアクセプターシグナル（配列番号７）を先頭に有するエキソン３からエキソン１１（配列番号５）にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含む治療マトリクスの挿入を基礎とするノックイン遺伝子編集方略を使用した。さらに、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジンキナーゼ（ＴＫ）融合遺伝子（配列番号８）を含む陽性−陰性選択カセットが、上記部分的な（ｃＤＮＡ）ＲＰＫの下流に含まれていた。これらの要素の両端には、ＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中の配列に一致する２つのホモロジーアーム（配列番号９及び１０）を有していた（図２Ａ）。

遺伝子編集の効率を高めるために、本発明者らは、２番目のイントロン中の特定のゲノム配列（配列番号１１）を標的とする、ホモロジーアームを両端に有するＰＫＬＲ特異的ＴＡＬＥＮを開発した。標的配列におけるＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼ活性を、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ及びＰＫＤ３ｉＰＳＣにおけるヌクレアーゼの両方のサブユニットをヌクレオフェクションした後にＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって検証した。

２つの独立した実験において、２人の異なるＰＫＤ患者からの２つのｉＰＳＣ系統ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４を、コントロールプラスミド又は開発されたマトリクス（以後、治療マトリクス又は相同組換え（ＨＲ）マトリクスと呼ぶ）で、単独に又は２種の異なる用量のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ（１．５ｍｇ又は５ｍｇの各々のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニット）と一緒にヌクレオフェクションした。２日後に、１週間にわたりＰｕｒｏを培地に添加した。申し分のない形態を有するＰｕｒｏ耐性（ＰｕｒｏＲ）コロニーが現れ、それらを個々にピックし、サブクローニングした。ほとんどのＰｕｒｏＲコロニーは、上記マトリクス及びＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニットの両方でヌクレオフェクションされた細胞から確認されたが、幾つかのコロニーは、上記治療マトリクスだけを与えた後に増殖させた。種々の患者からのＰＫＤｉＰＳＣ系統間の多数のＰｕｒｏＲコロニーに差異はなかった。ＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロンにおける治療マトリクスの狙った挿入を確認するために、本発明者らは、特異的ＰＣＲ分析を実施した（図２Ａ）。予想されるＰＣＲ産物は、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８からの１４個のＰｕｒｏＲクローンのうち１０個に検出され、かつＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４からの４０個のＰｕｒｏＲクローンのうち３１個に検出された（図２Ｂ）。まとめると、２人のリプログラムされた患者について、ＰｕｒｏＲクローンのうちのＨＲ頻度が７５％を上回ると見積もられた（表１）。

さらに、治療マトリクス単独でヌクレオフェクションされたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４クローンからの２つのＰｕｒｏＲクローンは、ノックインについて陽性であり、それにより１×１０^５個のヌクレオフェクションされた細胞につき０．６個の編集効率が見積もられる。ヌクレアーゼを用いずにＨＲが検出されるにもかかわらず、ＨＲ頻度は、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮを添加した場合には、ほぼ５倍も高まった（１×１０^５個のヌクレオフェクションされた細胞につき２．８５個の編集されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ）。さらに、治療マトリクスのノックイン挿入を、サザンブロットによって検証し（図２Ｃ）、こうして所望のゲノム座位に単独の挿入が確認された。

次に、本発明者らは、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮが非標的アレルも切断するかどうかを試験した。ＰＫＤ２の編集されたクローンの４０％まで及びＰＫＤ３の編集されたクローンの３１％までが、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ標的部位の非標的アレルにおいて挿入−欠失（インデル）を有し（表１）、それは、このＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの高い効率を裏付けている。さらに、ＰＫＤ３ｉＰＳＣからの４０個の編集されたクローンのうち３個は、標的アレル及び非標的アレルの両方を単独のＰＣＲで分析した場合に測定されるように、両アレルで標的化された。それに対して、編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローンは、両アレルの標的化を示さなかった。

ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの特異性を確認するために、本発明者らは、種々の編集されたＰＫＤｉＰＳＣクローンにおいて潜在的なオフターゲット切断部位を探した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ研究によって、本発明者らは、このＴＡＬＥＮについて５つの仮説的なオフターゲット部位を見出した。これらの５つのオフターゲットは、ホモダイマー又はヘテロダイマーとして合わされた２つのサブユニットによって認識され得て、その際、左側のサブユニットが右側のサブユニットに結合し得るか、又は各々のサブユニットが種々のスペーサー配列及び長さで結合し得る。全ての潜在的なオフターゲットは、少なくとも５つのミスマッチ塩基を有し、それによりＴＡＬＥＮによる認識は見込まれない。ＴＡＬＥＮの特異性を確認するために、本発明者らは、ゲノムＤＮＡを、幾つかの編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローン及びＰＫＤ３ｉＰＳＣクローンから増幅させ、４つのオフターゲット（オフターゲット１、２、４及び５）周りのサンガー法シーケンシングを行った。分析されたクローンのいずれも、分析されたオフターゲットのどこにも一切インデルを示さなかった。オフターゲット３は、ＰＣＲによって増幅することはできなかった。それにもかかわらず、オフターゲット３の５０の認識部位のおける最初の塩基はＡであったので、このオフターゲットのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによる認識は大幅に低減される（Boch et al., 2009）。この高い特異性と共にＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの高い効率は、開発されたＴＡＬＥＮ及び治療マトリクスが、ＰＫＬＲ座位におけるＨＲを促進する可能性を裏付けている。

最後に、本発明者らは、編集されたｉＰＳＣの遺伝子編集後の多能性を、ＮＳＧマウスへのｉｎ ｖｉｖｏでの奇形腫形成により検証した。編集されたクローンは、３つの胚葉からなる組織を有する奇形腫を生成し得た。より重要なことには、ヒトＣＤ４５汎白血球マーカーを発現する細胞（全体の奇形腫形成細胞の４．５４％）及び編集されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１奇形腫に由来するヒト始原体（ＣＤ４５陽性ＣＤ３４陽性；全ｈＣＤ４５陽性細胞の２．７４％）の存在によって実証されたヒト造血を、ｉｎ ｖｉｖｏで検出することもできた。全体として、上記データは、ＰＫＤｉＰＳＣにおけるＰＫＬＲ遺伝子をそれらの多能特性に影響を及ぼすことなく編集するための、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの使用を裏付けている。

実施例３． 一塩基多型は、アレル特異的標的化をもたらす
サンガー法シーケンシングによる非標的アレルにおけるインデルの存在を評価するなかで、本発明者らは、ＰＫＤ２ｉＰＳＣにおけるＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ切断部位から４３塩基離れたところにｇ［２２６８Ａ＞Ｇ］のＳＮＰの存在を確認した（図３Ａ）。興味深いことに、全ての編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣクローン（１０個中１０個）からの非標的アレルは、上述のＳＮＰを有しており、それは、ＳＮＰ変異体を有するアレルがＨＲを行うための妨げとなることを示唆している。さらに、どのＰＫＤ２ｉＰＳＣ編集クローンにおいても両アレルでの標的化は検出されなかった。それに対して、ホモロジーゲノム領域に一切ＳＮＰを有さない３１個の編集されたＰＫＤ３ｉＰＳＣクローンのうち３個は、両アレルで標的化された。

実施例４． ＰＫＤｉＰＳＣ及び遺伝子編集されたＰＫＤｉＰＳＣの遺伝子安定性
本発明者らは、リプログラミング及び遺伝子編集の全工程が、得られた細胞において遺伝的不安定性を誘導するかどうかを研究する必要があった。最初のアプローチとして、本発明者らは、種々のｉＰＳＣ系統の核型分析を実施し、全ての場合において通常の核型を確認した。しかしながら、より明確な評価を有するために、本発明者らは、ｉＰＳＣ作製及び遺伝子編集修正を含む全ての工程を通して、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）及びエキソームシーケンシングによって遺伝的安定性を観察した。ＰＫＤ２患者からのＰＢ−ＭＮＣ、リプログラムされたＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ５８及び編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１を、各々の工程の代表として選択した。これらの試料において、参照ゲノムＤＮＡと比較した後に、コピー数多様性（ＣＮＶ）が定義された。確認された全ＣＮＶのなかで、３１個のＣＮＶは、ＰＫＤ２由来の当初のＰＢ−ＭＮＣ中に存在し、３４個のＣＮＶは、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８に検出され、そして３２個のＣＮＶは、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１中に検出された（表２）。ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８において検出された２３個のＣＮＶは、既にＰＫＤ２のＰＢ−ＭＮＣ中に存在しており、それは、当初の患者試料のモザイク現象を示している。その一方で、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８及びＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１に存在する４個のＣＮＶだけは、一次試料中には検出されなかった。注目すべきことに、これらの４個のＣＮＶは、ＲＯＢＯ１、ＧＢＥ１、ＴＣＥＡ１、ＬＹＰＬＡ１、ＤＬＧ２、ＰＬＥＫＨＡ５、及びＡＥＢＰ２等の遺伝子を含む染色体１ｑ４４、２ｐ２１、３ｐ１２．３−ｐ１２．１、及びＸｐ１１．２２に存在した（表２）。

より重要なことには、当初のｉＰＳＣクローン中には存在しなかった２個のＣＮＶだけが、遺伝子編集後に現れた。１つ目のＣＮＶは、幾つかの嗅覚受容器遺伝子（例えば、ＯＲ２Ｔ１１、ＯＲ２Ｔ３５、又はＯＲ２Ｔ２７）を含む６．６ｋｂの欠失であり、そして２つ目のＣＮＶは、ＦＧＤ１遺伝子を含む０．６ｋｂの拡大であった。さらに、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１におけるこれらの２個のＣＮＶ周囲の配列は、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ認識部位と８個より多くのミスマッチを有しており、それは、これらのゲノム改変が、遺伝子編集によって生じたものではないことを示唆している。

さらに、本発明者らは、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ活性のゲノム安定性における潜在的な有害効果を確認するために、遺伝子編集の前後のＰＫＤ３ｉＰＳＣにおけるＣＮＶの存在を分析した（表Ｓ４）。編集されたクローンＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１（両アレルで標的化されている）は、親ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４の１１個のＣＮＶのうち１０個を示し、そしてＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８（単一アレルで標的化されている）は、２個の新たなＣＮＶを示した。さらに、編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１中に存在するＣＮＶのいずれも、これらの２個のＰＫＤ３ｉＰＳＣ編集クローンには存在しておらず、そのことは、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮが、ＰＫＤｉＰＳＣクローンにおいて特定のＣＮＶを一切誘導しないことを示唆している。

同時に、３個のＰＫＤ２試料を、エキソームシーケンシングのためにIllumina社製のＨｉＳｅｑ ２０００システムを使用して分析した。シーケンシングデータとヒトゲノム参照とを比較することによるバイオインフォマティクス解析の後に、ＰＫＤ２のＰＢ−ＭＮＣは、それらの配列において６８２６０個の変化を示し、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８は、６８５４２個の変化を示し、かつＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１は、６７７２８個の変化を示した。ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１で検出された全ての変異体のうち１０個だけが、ＳＮＰデータベース中に含まれるエキソン領域中に存在しており、ＰＫＤ２のＰＢ−ＭＮＣ中には確認されなかった（表２）。さらに、それらのうちの４個は、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８中にも検出された。サンガー法シーケンシングによりこれらの突然変異の存在を検証するために、本発明者らは、これらの領域をＰＣＲ増幅し、シーケンシングした。ＲＵＳＣ２遺伝子、ＴＡＣＲ２遺伝子、及びＡＰＯＡ５遺伝子中の突然変異だけが、シーケンシングにより確認することができた（データは示していない）。１０種の変異体のいずれも、癌に関与する既知の全ての体細胞突然変異を含むＣＯＳＭＩＣデータベース（Wellcome Trust Sanger Institute, 2014）には含まれていなかった。

全体的に見て、遺伝的安定性分析は、本発明の遺伝子編集アプローチの安全性を確認した。確認された全ての遺伝子改変は、ＰＢ−ＭＮＣ中に存在していたか、又はそれらのリプログラミング若しくはｉＰＳＣ増殖の間に生成された。さらに、確認された改変のいずれも、潜在的に危険な突然変異とは関連していないものと考えられる。

実施例５． 遺伝子編集されたＰＫＤｉＰＳＣは、ＲＰＫ機能を回復する
ノックイン組み込みを確認したら、遺伝子編集されたｉＰＳＣのＰＫ表現型修正を評価した。本発明者らは、健康なドナーのｉＰＳＣ系統（ＰＢ２ｉＰＳＣ ｃ３３）、両方の患者に由来するＰＫＤのｉＰＳＣ系統（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４）、及び相応の編集されたクローン（単一アレルで編集されたＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８、並びに両アレルで標的化されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１）からの種々のｉＰＳＣ系統の赤血球系分化を誘導した。ＣＤ４３、ＣＤ３４、及びＣＤ４５等の特徴的な造血始原体マーカーが、時間の経過につれて現れ始め、同様の割合の細胞において発現された。赤血球系細胞は、その培養物中に明らかに観察され、そしてＣＤ７１抗原及びＣＤ２３５ａ抗原の特定の赤血球系の組み合わせは、分化２１日後に大部分の細胞に発現された（図４Ａ）。さらに、分化３１日目に分析された全てのｉＰＳＣ系統に由来する細胞は、α−グロビン及びγ−グロビンが優勢で、β−グロビンが少量であり、残りは胚性ε−グロビン及びｚ−グロビンが検出される同様のグロビンパターンを示し、それは、これらの多能性系統の赤血球系分化を確証するものである。より重要なことには、３個のｉＰＳＣ系統に由来する赤血球系細胞は、ＲＰＫを発現することが可能であった（図４Ｂ及び図４Ｅ）。編集された赤血球系細胞における近位遺伝子の発現の改変が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認されなかったことは注目すべきことである。

編集されたＰＫＤｉＰＳＣ系統の全てにおけるキメラ転写物の存在は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。ＰＫＬＲ遺伝子の２番目の内因性エキソン及び部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ中の配列を認識するプライマーは、正確なサイズを有するアンプリコンを、特に遺伝子編集されたＰＫＤｉＰＳＣに由来する赤血球系細胞において産生することが可能であった（図４Ｃ）。このアンプリコンをシーケンシングすることで、内因性配列及び外因性配列の転写に由来するｍＲＮＡの両方の部分の間の結合が検出された（図４Ｄ）。さらに、ＲＰＫの存在は、ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｃ７８（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１；図４Ｅ）及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４（ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１）に由来する編集されたｉＰＳＣ系統の全てに由来する赤血球系細胞におけるウェスタンブロットによって裏付けられた。興味深いことに、（ｍＲＮＡ）ＲＰＫは、ＰＫＤ３に由来する全てのｉＰＳＣ系統に由来する赤血球系細胞において検出することができたが、ＲＰＫタンパク質は、おそらく、ＲＮＡ翻訳に関する突然変異の激しさのため、ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｃ５４においては検出されなかったと考えられる。しかしながら、ＰＫＤ３ｉＰＳＣの遺伝子編集は、両アレル（ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１）編集系統及び単一アレル（ＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８）編集系統のいずれにおいてもＲＰＫタンパク質発現を修復した。さらに、キメラ型転写物及びＲＰＫタンパク質のレベルの両方とも、単一アレルで標的化されたクローンＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８におけるよりも、両アレルで標的化されたクローンＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１での方がより高かった。フラグの付いたＲＰＫが、ＰＫＤｉＰＳＣの遺伝子編集後に、生成された赤血球系細胞において検出されたことは注目に値し（図４Ｅ）、こうして、編集されたゲノムからのＲＰＫタンパク質の起源が確認された。

最後に、修正された細胞の代謝機能の修復を、分化された細胞において、従来の生化学的分析によって、及び液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって評価した（図５）。単一アレルで編集されたＰＫＤｉＰＳＣ（ＰＫＤ２ｉＰＳＣ ｅ１１及びＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ８８）に由来する赤血球系細胞におけるＡＴＰレベルは、遺伝子編集後に増大し（図５Ａ）、ＷＴのｉＰＳＣからの赤血球系細胞及びそれらの各々の患者特異的ｉＰＳＣ系統において観察されたレベルの間の中間レベルに達した。さらに、両アレルで標的化されたＰＫＤ３ｉＰＳＣ ｅ３１に由来する赤血球系細胞は、ＡＴＰレベルを健康な値にまで完全に修復した（図５Ａ）。編集された赤血球系細胞において、２，３−ジホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、及びＬ−乳酸等のその他の解糖代謝物は、コントロールのレベルと、ＰＢ２ｉＰＳＣ及びＰＫＤｉＰＳＣに由来する欠陥赤血球系細胞のレベルとの間に達した。さらに、１ヶ月間で２〜３×１０^４倍の細胞の増殖が得られ、それは、単独のｉＰＳＣから２００００個までの赤血球系細胞が生成され得たことを意味する（図５Ｂ）。予想されるように、種々のｉＰＳＣの間で統計学的差異は観察されず、それは、ＲＰＫ欠損は、増殖が行われない赤血球系分化の最終過程だけに影響することを示している。全体的に見ると、本発明のデータは、修正されたＲＰＫタンパク質を発現するこのノックインアプローチの有効性を確証し、そしてＰＫＤ表現型を治療的に修正し、その成熟の間に、又は更に潜在的な治療的使用のために、包括的な生化学的かつ代謝的な分析のために必要とされる多数（１０^９個〜１０^１０個）の分化している細胞を生成する能力を裏付けている。

実施例６． 末梢血試料及びリプログラミング
ＰＫＤ患者及び健康なドナーからの末梢血を、通常の採血においてＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃｏ Ｉｎｆａｎｔｉｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ Ｎｉｎｏ Ｊｅｓｕｓ（スペイン、マドリード）、Ｃｅｎｔｒｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒｉｏ ｄｅ Ｃｏｉｍｂｒａ（ポルトガル、コインブラ）、及びＣＩＥＭＡＴ（スペイン、マドリード）の医療的ケアサービスから収集した。全ての試料は、同意書及び治験審査委員会の同意のもと収集した。ＰＢ−ＭＮＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（GE Healthcare社）を使用して密度勾配によって単離した。ＰＢ−ＭＮＣを、ＳｔｅｍＳｐａｎ（STEMCELL Technologies社）において、１００ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、１００ｎｇ／ｍｌのｈＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのｈＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、及び２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３（Peprotech社）を加えて４日間予備刺激した（図１Ａ）。次いで、細胞を、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ−ＭＹＣ、及びアザミグリーンを発現するDNAvec社（日本）寄贈のそれぞれ３のＭＯＩのＳｅＶのミックスで形質導入した。形質導入された細胞を、同じ培養培地中で更に４日間にわたり維持して、その後に、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を供給した。形質導入から５日後に、細胞を回収し、ヒトＥＳ培地（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、２０％のｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、１ｍＭのＬ−グルタミン、及び１％の非必須アミノ酸［全てLife Technologies社製］）、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich社）、及び１０ｎｇ／ｍｌの塩基性のヒトＦＧＦ（Peprotech社）を有する照射されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ−１）がコートされた（ＡＴＣＣ）培養プレート上に播種した。ヒトＥＳ培地は、一日置きに交換した。ヒトＥＳ様コロニーが現れたら、それらのコロニーを、実体顕微鏡（Olympus社）下で選択し、そして各々のコロニーからのクローン培養物を樹立した。

実施例７． ｉＰＳＣにおける遺伝子編集
ｉＰＳＣを、Ｒｏｃｋの阻害剤Ｙ−２７６３２（Sigma社）で処理してから、ｉＰＳＣの単細胞懸濁液を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Life Technologies社）処理によって作製し、次いで１．５ｍｇ又は５ｍｇの各々のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニットと一緒に４ｍｇのＨＲマトリクスと一緒に又はＨＲマトリクス無しで、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Lonza社）によりＡ２３プログラムを使用してヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後に、細胞を、照射されたＰｕｒｏＲマウス胚性線維芽細胞のフィーダー中にＹ−２７６３２の存在下で播種し、そしてトランスフェクションから４８時間後に、ピューロマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、ヒトＥＳ培地に添加した。新たに形成されたＰｕｒｏＲ−ＰＫＤｉＰＳＣコロニーを、６日間から１０日間のピューロマイシン選択期間の間に個別にピックした。ＰｕｒｏＲ−ＰＫＤｉＰＳＣコロニーを、ＰＣＲ及びサザンブロットにより増殖させて、分析することで、ＨＲを検出した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。

実施例８． 赤血球系分化
ｉＰＳＣ系統からの赤血球系分化は、特許された方法（国際公開第２０１４／０１３２５５号）を使用して実施した。簡潔には、本発明者らは、E.O.により開発された多段階のフィーダー不要のプロトコルを使用した。分化の前に、通常のｉＰＳＣ、病気のｉＰＳＣ、及び修正されたｉＰＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ培地（Life Technologies社）中で、２０ｎｇ／ｍｌの塩基性のＦＧＦを組換えビトロネクチン断片（Life Technologies社）の基質に添加して手動による継代を使用して維持した。分化の開始のために、胚様体（ＥＢ）を、ＢＭＰ４、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔ３ａ、及びアクチビンＡを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Sigma Aldrich社）中で形成した。第２工程において、造血分化を、ＦＧＦａ、ＳＣＦ、ＩＧＦ２、ＴＰＯ、及びヘパリンをＥＢ因子に添加することによって誘導した。１０日後に、造血始原体を採取し、赤血球系譜に沿った直接的な分化と、大規模な増殖の支持とのために、ＢＭＰ４、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を供給した新たなＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地に再播種した。１７日後に、細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＳＣＦ、ＩＧＦ１、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、及びＥＰＯを含むより特異的な赤血球系カクテルを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中に７日間にわたり移した。７日間の最終成熟工程（２４日目〜３１日目）において、細胞を、インスリン、トランスフェリン、及びＢＳＡを含み、ＥＰＯを補ったＩＭＤＭ中に移した。細胞を、１０日目、１７日目、２４日目、及び３１日目に分析のために採取した。

実施例９． ＰＫＬＲ座位におけるヒト造血始原体の遺伝子編集
ヒト造血始原体における本発明のノックイン遺伝子編集アプローチの適用の実現可能性を調査するために、ｉＰＳＣ遺伝子編集プロトコルを、造血始原体で実施するように適合させた。

材料及び方法： 臍帯血ＣＤ３４陽性（ＣＢ−ＣＤ３４）細胞を、ＳｔｅｍＳｐａｎ（StemCell Technologies社）／０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社）／１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ／１００ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ／１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ（全てのサイトカインは、Peprotech社製）中で２４時間にわたり培養してから、上記マトリクス及びＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによってヌクレオフェクションした。１×１０^６個のＣＢ−ＣＤ３４を、５μｇの相同組換えマトリクス（Ｍ）又は／及びＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中の特異的配列を標的とする各々のＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮサブユニット（Ｔ）２．５μｇで、Ａｍａｘａ（商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＩＩ（Lonza社）によってＵ０８プログラムを使用してヌクレオフェクションした。次いで、上記ＣＢ−ＣＤ３４細胞を、６日間にわたり増殖させ、更にもう４日間にわたりピューロマイシン（Sigma-Aldrich社）で選択した。ＨＳＣ−ＣＦＵ培地（Myltenyi社）を使用する造血始原体（コロニー形成単位［ＣＦＵ］アッセイ）の確認のための半固体培養を実施し、それらのコロニーを計数し、ピックし、それらを特異的な組み込みについてネステッドＰＣＲによって分析した。遺伝子編集プロトコルの略図は、図６Ａに示されている。

結果： ＣＢ−ＣＤ３４が上記マトリクス及びＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによりエレクトロポレーションされた場合に、偽エレクトロポレーション（ＣＴＬ）又はＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのみでエレクトロポレーションした場合と比較して、細胞の全体数及びＣＦＵの全体数が低下することにより指摘される高い死亡率が存在した。この死亡率は、ＤＮＡエレクトロポレーションに関連した毒性によるものであった（図６Ｂ）。しかしながら、Ｐｕｒｏ^Ｒ始原体に由来するＣＦＵは、ＣＢ−ＣＤ３４細胞を上記マトリクスと一緒にＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮでエレクトロポレーションした場合にのみ確認された。興味深いことに、Ｐｕｒｏ^Ｒ始原体は、骨髄球系ＣＦＵ又は赤血球系ＣＦＵのいずれかを生じた（図６Ｃ）。

実施例１０． ネステッドＰＣＲによる、ＰＫＬＲ座位におけるマトリクスの特異的な組み込み
ＰＫＬＲ座位におけるマトリクスの特異的な組み込みを、ネステッドＰＣＲにより測定した。

材料及び方法： 個々のＣＦＵをピックし、ネステッドＰＣＲにより分析することで、ＰＫＬＲ座位におけるマトリクスの特異的な組み込みが確認された（図７Ａ）。ネステッドＰＣＲは、感度を高めるため、そして非特異的増幅を減らすために使用された。ネステッドＰＣＲは、ＰＫＬＲ座位での遺伝子編集を分析するように設計した。そのネステッドＰＣＲは、２種のプライマーセット：
第１のセット、ＫＩ Ｆ２（配列番号１２：ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧ）及びＫＩ Ｒ２（配列番号１３：ＧＧＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧＡＣＴＡＧＧＧ）、並びに、
第２のセット、ＫＩ Ｆ３（配列番号１４：ＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＡＧＡＣＡＴＣ）及びＫＩ Ｒ３（配列番号１５：ＣＧＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣ）、
を要した。

これらは、ＰＣＲの２つの連続的な実行において使用した。第２のプライマーセットは、３．３ｋｂの第１の実行産物中の２．０ｋｂの二次標的を増幅した。２つのフォワードプライマーは、マトリクスの組み込み部位から下流にあるゲノム内因性ＰＫＬＲ配列を認識し、リバースプライマーは、組み込まれたマトリクス中のＰｕｒｏ^Ｒカセット及びｃｏＲＰＫカセットにそれぞれ結合した。ネステッドＰＣＲは、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Agilent社）を使用して実施した。遺伝子編集方略を改善するために、ノックインプロトコルを短縮して、造血幹細胞の能力を維持した。増殖期間を６日間から４日間にまで短縮し、選択期間を４日間から２日間にまで短縮した（４ｄ＋２ｄプロトコル）（図７Ｄ）。

結果： Ｐｕｒｏ^Ｒヒト造血始原体に由来するほとんどのＣＦＵは、本発明の方略により正しく遺伝子編集された（図７Ａ）。図７Ｂは、ＴＭでエレクトロポレーションされ、そしてピューロマイシンで選択されたＣＢ−ＣＤ３４に由来するＣＦＵのネステッドＰＣＲ分析から生ずる２．０ｋｂの増幅された配列を示す。分析されたＣＦＵの７４％までが、ノックイン組み込みについて陽性であった（６ｄ＋４ｄプロトコル）（図７Ｃ）。遺伝子編集方略を改善するために、ノックインプロトコルを短縮して、造血幹細胞の能力を維持した。増殖期間を６日間から４日間にまで短縮し、かつ選択期間を４日間から２日間にまで短縮しても（４ｄ＋２ｄプロトコル）、遺伝子編集されたヒト造血始原体のパーセンテージは、大きくは変化しなかった（ＣＦＵの７１％までが、特異的な組み込みについて陽性であった、図７Ｄ）。さらに、幾つかの原始ＣＦＵ（ＧＥＭＭ−ＣＦＵ）が確認され得たため、原始ヒト造血始原体を、本発明によるプロトコルで遺伝子編集した。

実施例１１． ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの送達の改善
ヌクレオフェクションされたＤＮＡに関連する毒性を減らすために、ｍＲＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮの使用を研究した。ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡの安定性を改善するために、幾つかの修飾を導入することで、そのｍＲＮＡ（配列番号４、β−グロビンの３’ＵＴＲ）を安定化させるか、又は外因性ｍＲＮＡに対する免疫応答を低減させた（配列番号３、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲ、Hyde et al, Science 14 February 2014: 783-787を参照）。

材料及び方法： ＣＢ−ＣＤ３４細胞を、プラスミドＤＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ、又は種々の修飾を有するｍＲＮＡ（未修飾のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲのｍＲＮＡ、及びβ−グロビンの３’ＵＴＲのｍＲＮＡ）としてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのいずれかでヌクレオフェクションした（図８Ａ）。１×１０^５個のＣＢ−ＣＤ３４を、プラスミドＤＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮ又は種々の修飾を有するｍＲＮＡ（未修飾のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲのｍＲＮＡ、及びβ−グロビンの３’ＵＴＲのｍＲＮＡ）としてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのいずれかでヌクレオフェクションし、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Thermo Fisher Scientific社）によって種々の量（０．５μｇ又は２μｇ）を使用して４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Lonza社）においてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させた。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＩＤＴ）を、エレクトロポレーションから３日後に（図８Ｂ、左側のパネル）実施し、又はヌクレオフェクションされた造血始原体に由来するＣＦＵにおいて（図８Ｂ、右側のパネル）実施した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）突然変異検出キットは、ＤＮＡ中の突然変異及び多型を検出するための簡単かつロバストな方法を提供する。そのキットの主要な構成要素は、セロリから得られたミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーの一員であるＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼである。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）又は小さい挿入若しくは欠失の存在によるミスマッチを認識及び開裂する。図８Ｂで示されるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにおいて得られたインデル（挿入／欠失）を、バンドの濃度計測、及び開裂の方のバンドと非開裂の方のバンドとの間のバンド強度の比率（％）によって評価した（図８Ｃ）。

結果： 興味深いことに、ＰＫＬＲ座位における最も高い標的化は、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡが、ＶＥＥＶの５’ＵＴＲ又はβ−グロビンの３’ＵＴＲのいずれかによって修飾された場合に得られた。こうして、５’修飾及び／又は３’修飾を有するＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡを、後続の実験において使用した。

実施例１２． ＮＳＧマウスにおける遺伝子編集されたヒト造血幹細胞の生着
遺伝子編集されたＨＳＣの生着を、ＮＳＧマウスの骨髄において移植から４ヶ月後に、ヒト造血細胞（ｈＣＤ４５陽性）及びヒト造血始原体（ＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性）の存在をＦＡＣＳにより測定することによって評価した。

材料及び方法： 新鮮なＣＢ−ＣＤ３４細胞を、ＨＲマトリクス（Ｍ）と一緒に、プラスミドＤＮＡ又は上記のｍＲＮＡ修飾の両方を有するｍＲＮＡのいずれかとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮによってヌクレオフェクションさせた。上記のように増殖され、かつ薬物選択されたＰｕｒｏ^Ｒ細胞（４ｄ＋２ｄプロトコル）を、亜致死量照射された免疫不全ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ）に静脈内移植した（図４Ａ）。これらの動物は、ヒト造血幹細胞の異種生着及びヒト成熟造血細胞の作製を可能にする。移植から４ヶ月後に、ＦＡＣＳにより、ヒト造血細胞（ｈＣＤ４５陽性）対マウス造血細胞（ｍＣＤ４５陽性）、及びヒト造血始原体（ＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性）を確認することによりヒト生着を分析した。次いで、ＣＤ４５陽性／ＣＤ３４陽性細胞を、マウス骨髄からセルソーティングによって単離した。単離されたヒト始原体を培養し、ピューロマイシンで選択し、そしてＣＦＵアッセイを実施した。これらの生着されたヒト造血始原体における遺伝子編集を、個々のＣＦＵにおいて、上記のようにネステッドＰＣＲによって分析した。

結果： ヒト造血細胞は、マトリクス及びＤＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮでヌクレオフェクションされたＣＢ−ＣＤ３４で移植された動物において確認されたが（図９Ｂ、左側のパネル）、このヒト生着（ｈＣＤ４５陽性細胞の％）は、全マウス骨髄の０．５％未満であり、ヒト造血始原体の存在（ｈＣＤ４５陽性ｈＣＤ３４陽性細胞の％）は少ない。しかしながら、ｍＲＮＡとしてのＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮと一緒にマトリクスによって移植された動物（図９Ｂ、右側のパネル）においては、ヒト造血生着は、全体のマウス骨髄球系細胞の５．５７％で高まった。さらに、ヒト造血始原体の有意な存在が観察された。全体として見て、これらのデータは、ＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのためのｍＲＮＡのヌクレオフェクションが使用されたことが、ヒト造血幹細胞の維持に関してより好ましい条件であることを示唆している。このアッセイの分解能を高めるために、ヒト始原体（ｈＣＤ４５陽性ＣＤ３４陽性）の集団をマウス骨髄から単離した後に、２回目のピューロマイシン選択を実施した。ＣＦＵアッセイを実施し、これらの造血コロニーを、上記のように予想されるゲノム部位におけるノックイン組み込みについて調べた。生着されたヒトＣＤ３４に由来する２７個のＣＦＵのうちの１個は、遺伝子編集がＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮのｍＲＮＡにより媒介された場合にはＨＲについて陽性であった（図９Ｃ）。これは、ＰＫＬＲ遺伝子編集が、ヒト造血幹細胞において行われて、その生着能力を維持していたことを示している。全体として見て、造血幹細胞の遺伝子編集によるノックイン方略がＰＫＤを治療することの実現性を指摘している。

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Claims (23)

1. 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された細胞であって、前記細胞において存在する代謝疾患を引き起こす遺伝子中の１つ以上の突然変異が、内因性の１番目のエキソン及び部分的なｃＤＮＡによって形成されるキメラ型ｍＲＮＡを内因性プロモーターの制御下で発現するように、部分的なｃＤＮＡが前記遺伝子の標的座位中に挿入されるノックイン方略を介した遺伝子編集により修正されており、かつ赤血球系譜へと分化する能力を有する、細胞。
2. 前記細胞は、ｉ）造血幹細胞若しくは始原細胞、又はｉｉ）成熟細胞から得られた人工多能性幹細胞、好ましくは末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
3. 前記代謝疾患は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）である、請求項１又は２に記載の細胞。
4. 前記遺伝子編集は、スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介して行われ、かつこのマトリクスは、相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に導入される、請求項３に記載の細胞。
5. 前記標的座位は、ＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロンである、請求項４に記載の細胞。
6. 前記治療マトリクスは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジン（ＴＫ）融合遺伝子を好ましくは含む陽性−陰性選択カセットを更に含み、前記陽性−陰性選択カセットは、前記部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子の下流に位置する、請求項４又は５に記載の細胞。
7. 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された細胞においてノックイン方略を介した遺伝子編集によって、前記細胞において存在する前記代謝疾患を引き起こす遺伝子中の１つ以上の突然変異を修正する方法であって、前記細胞は、前記赤血球系譜へと分化する能力を有し、かつ前記方法は、
   内因性の１番目のエキソン及び部分的なｃＤＮＡによって形成されるキメラ型ｍＲＮＡを内因性プロモーターの制御下で発現するように、部分的なｃＤＮＡが前記代謝疾患を引き起こす遺伝子の標的座位中に挿入されるノックイン方略を介した、好ましくは相同組換え（ＨＲ）を促進するために遺伝子特異的ヌクレアーゼが使用される遺伝子編集により、前記細胞において存在する前記代謝疾患を引き起こす遺伝子中の１つ以上の突然変異を修正する工程と、
   任意に、前記ノックイン細胞を回収する工程と、
   を含む、方法。
8. 前記細胞は、ｉ）造血幹細胞若しくは始原細胞、又はｉｉ）成熟細胞から得られた人工多能性幹細胞、好ましくは末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
9. 前記細胞は、
   ａ． 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された末梢血単核細胞を細胞培養培地中で培養し、そしてこれらの細胞を、トロンボポエチン、ＦＬＴ３Ｌ、幹細胞因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３の存在下で、好ましくは少なくとも４日間にわたり増殖させることで、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖を促進する工程と、
   ｂ． 工程ａ）から得られた細胞を、以下の４種のリプログラミング因子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするセンダイウイルスベクタープラットフォーム（ＳｅＶ）を使用することによる形質導入プロトコルによってリプログラムし、そしてこれらの細胞を、好ましくは同じ培地中で好ましくは３日間から６日間まで維持する工程と、
   ｃ． 任意に、前記細胞を回収する工程と、
   を含む方法により末梢血単核細胞から得られる人工多能性幹細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 前記代謝疾患は、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）であり、前記遺伝子は、ＰＫＬＲ遺伝子であり、かつＰＫＬＲ遺伝子は、スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスを使用することによるノックイン方略を介して、好ましくはＨＲを促進するために遺伝子特異的ヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されており、このマトリクスは、相同組換え（ＨＲ）によりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に導入される、請求項７又は８に記載の方法。
11. 前記標的座位は、ＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロンである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ヌクレアーゼは、ＰＫＬＲ転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、好ましくは、前記ヌクレアーゼは、配列番号１及び配列番号２によって規定される２つのサブユニットを含むＰＫＬＲ ＴＡＬＥＮである、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして、好ましくは５’修飾及び／又は３’修飾を有するｍＲＮＡとして、より好ましくは、配列番号３が５’末端に付加されており、及び／又は配列番号４が３’末端に付加されているｍＲＮＡとして使用される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細胞は、
    ａ． ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験体から単離された末梢血単核細胞を細胞培養培地中で培養し、そしてこれらの細胞を、トロンボポエチン、ＦＬＴ３Ｌ、幹細胞因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及びＩＬ−３の存在下で、好ましくは少なくとも４日間にわたり増殖させることで、造血始原体及び骨髄委任細胞の維持及び増殖を促進する工程と、
    ｂ． 工程ａ）から得られた細胞を、以下の４種のリプログラミング因子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ−ＭＹＣをコードするセンダイウイルスベクタープラットフォーム（ＳｅＶ）を使用することによる形質導入プロトコルによってリプログラムし、そしてこれらの細胞を、好ましくは同じ培地中で好ましくは３日間から６日間まで維持する工程と、
    ｃ． 任意に、前記細胞を回収する工程と、
    を含む方法により末梢血単核細胞から得られる人工多能性幹細胞である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法により得られた又は得ることが可能な細胞。
16. 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られた又は得ることが可能な細胞。
17. 療法において使用するための、請求項１〜６又は請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
18. 赤血球系譜を冒す代謝疾患の治療において使用するための、請求項１〜２又は請求項１５のいずれか一項に記載の細胞。
19. ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）の治療において使用するための、請求項３〜６又は請求項１６のいずれか一項に記載の細胞。
20. スプライスアクセプターシグナルを先頭に有するエキソン３からエキソン１１にまたがる部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫ遺伝子を含み、これらの要素の両端にＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中の配列と一致する２つのホモロジーアームを有する治療マトリクスであって、相同組換えによりＰＫＬＲ遺伝子の標的座位中に、好ましくはＰＫＬＲ遺伝子の２番目のイントロン中にそれ自体の導入が可能である、治療マトリクス。
21. ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターによって駆動されるピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性／チミジン（ＴＫ）融合遺伝子を好ましくは含む陽性−陰性選択カセットを更に含み、前記陽性−陰性選択カセットは、前記部分的なコドン最適化（ｃＤＮＡ）ＲＰＫの下流に位置している、請求項２０に記載の治療マトリクス。
22. ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）に罹患している被験者から単離された赤血球系譜の末梢血単核細胞に由来する人工多能性幹細胞において存在するＰＫＬＲ遺伝子中の１つ以上の突然変異を、ノックイン方略を介して遺伝子編集することにより修正するための、請求項２０又は２１に記載の治療マトリクスのｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
23. 配列番号１により規定される左側のサブユニット及び配列番号２により規定される右側のサブユニットを含む、ＰＫＬＲ転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）。