ES2885833T3

ES2885833T3 - Composición y métodos para potenciar la expresión génica de PKLR

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Publication number: ES2885833T3
Application number: ES17786662T
Authority: ES
Inventors: Jose C Segovia; Maria G Gomez; Susana Navarro; Nestor Meza; Juan Bueren; Maria G Bravo
Original assignee: Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Hepaticas y Digestivas CIBEREHD; Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz; Consorcio Centro de Investigacion Biomedica en Red MP
Current assignee: Centro de Investigaciones Energeticas Medioambientales y Tecnologicas CIEMAT; Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Hepaticas y Digestivas CIBEREHD; Instituto de Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz; Consorcio Centro de Investigacion Biomedica en Red MP
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2021-12-15
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: PT3445406T; JP7045362B2; KR102440880B1; US20190284573A1; CN109641063B; JP2019514422A; HUE055862T2; US20220177920A1; EP3445406A1; PL3445406T3; WO2017184903A1; AU2017254665C1; CN116179580A; EP3445406A4; MX2018012872A; CN109641063A; EP3445406B1; KR20190053136A; IL262459A; RU2018140783A3

Abstract

Un vector de suministro génico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende en el siguiente orden de 5' a 3': a) una secuencia promotora; b) una secuencia que codifica un producto génico terapéutico, en donde el producto génico terapéutico es un polipéptido de piruvato ciclasa humana de hígado y glóbulos rojos (PKLR); y c) una señal de exportación de ácido ribonucleico (ARN), en donde la secuencia promotora está unida operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido PKLR y en donde el vector de suministro génico recombinante es un lentivirus (LV).

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y métodos para potenciar la expresión génica de PKLR

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la terapia génica de la deficiencia de piruvato cinasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La deficiencia de piruvato cinasa (PKD) es una enfermedad metabólica monogénica causada por mutaciones en el gen PKLR que conduce a la anemia hemolítica de sintomatología variable y que puede ser mortal durante el periodo neonatal. El rasgo de herencia recesiva de la PKD y su tratamiento curativo por trasplante alógeno de médula ósea brindan un escenario ideal para el desarrollo de métodos de terapia génica.

Entre muchos otros defectos enzimáticos hereditarios que afectan a los eritrocitos, la deficiencia de piruvato cinasa (PKD) es la más frecuente que causa anemia hemolítica no esferocítica crónica (CNSHA) (Zanella et al. 2007). El inicio y la gravedad de la PKD son muy variables y oscilan de anemia neonatal leve a grave, que se vuelven mortales durante la infancia en los casos más graves (Pissard et al. 2006). El retraso del crecimiento, la hidropesía fetal y la muerte durante el periodo neonatal también se informaron con baja frecuencia (Gilsanz et al. 1993). La prevalencia de la PKD se ha estimado en 1:20.000 en la población caucásica general (Beutler et al. 2000) y, hasta ahora, se han identificado más de 195 mutaciones diferentes en el gen PKLR (http://www.lovd.nl/pklr). El trasplante de médula ósea (TMO) alógeno se ha usado con éxito para curar pacientes con PKD grave (Tanphaichitr et al. 2000), pero la baja disponibilidad de donantes histocompatibles y las graves complicaciones asociadas con el TMO de estos pacientes (es decir, enfermedad de injerto contra huésped, infecciones oportunistas, etc.) hacen que las transfusiones de sangre periódicas y la esplenectomía sean las principales opciones terapéuticas para la mayoría de las formas graves de la PKD (Zanella et al. 2005), lo que aumenta espectacularmente la morbilidad y mortalidad del paciente (Hilgard et al.

2005). La eficacia limitada y los efectos secundarios de las opciones terapéuticas para pacientes con PKD grave y su rasgo de herencia recesiva hacen de la PKD una enfermedad adecuada para ser tratada con terapia génica.

La PKD es causada por defectos en la enzima piruvato cinasa (PK) (Zanella 2005) que cataliza la última reacción generadora de ATP de la ruta de la glucólisis en todas las células. En eritrocitos maduros, la PK se vuelve esencial ya que los RBC expresan solo la isoforma específica de tipo R (RPK) (Kanno et al. 1992) debido a la regulación del promotor alternativo específico eritroide del locus PKLR (Noguchi et al. 1987). Por lo tanto, cualquier pérdida de actividad de RPK afecta el metabolismo de RBC y la vida útil (Zanella 2005), lo que lleva a CNSHA.

Un método prometedor para tratar y prevenir enfermedades y trastornos genéticos y otros es el suministro de agentes terapéuticos con un vector de terapia génica. Actualmente, los vectores víricos muestran la mayor eficacia en la transferencia génica y, para la corrección de enfermedades genéticas, de tal manera que se requiera una expresión génica persistente, los vectores basados en herpesvirus, retrovirus, lentivirus, adenovirus o AAV son deseables debido a la naturaleza integradora del ciclo de vida vírico.

La terapia génica para enfermedades monogénicas, particularmente aquellas que afectan al sistema hematopoyético, ha proporcionado evidencia convincente de que la corrección genética de las células madre hematopoyéticas autólogas (HSC) es una opción terapéutica alternativa al HSCT alógeno, evitando sus principales complicaciones (Cartier et al. 2009; Cavazzana-Calvo et al. 2010; Cartier et al. 2012; Aiuti et al. 2013; Biffi et al. 2013). La corrección genética para las enfermedades que afectan a los eritrocitos, tales como la p-talasemia y la enfermedad de células falciformes, se ha abordado en modelos animales (Pestina et al. 2009I Breda et al. 2012) y también en humanos (Cavazzana-Calvo et al. 2010). Sin embargo, los métodos de terapia génica para las deficiencias metabólicas eritroides hereditarias, tales como la PKD, aún son limitados. La viabilidad de la terapia génica HSC para la PKD se ha demostrado tanto en modelos experimentales deficientes en RPK en ratones (Tani et al. 1994; Meza et al. 2009) como en perros (T robridge et al. 2012) que muestran que el quimerismo del donante y los niveles de transducción son puntos clave para alcanzar una corrección eficiente del fenotipo hemolítico (Richard et al. 2004) dada la falta de ventaja selectiva de las HSC corregidas por el gen del donante. El trabajo previo con un modelo de ratón de PKD mostró que la expresión de RPK humana derivada retrovíricamente era capaz de corregir completamente el fenotipo de PKD cuando más del 25 % de las células corregidas genéticamente fueron trasplantadas (Meza et al. 2009). Un umbral terapéutico similar de células corregidas se informó recientemente en un perro Basenji con PKD infundido con HSC expandidas in vivo y corregidas por vector espumoso (Trobridge et al. 2012).

Existen varios desafíos con respecto al diseño de casetes de polinucleótidos y vectores de expresión para su uso en terapia génica. Un desafío importante es obtener la expresión suficiente del transgén en las células diana. Una necesidad no satisfecha de larga duración en la técnica ha sido una expresión suficientemente fuerte de transgenes después de la transferencia génica. En algunos casos, se requiere una expresión más eficiente para la eficacia de ciertos vectores, por ejemplo, vectores de ADN plasmídico. En otros casos, se desean casetes de expresión génica más eficientes para permitir una dosis terapéutica más baja que tenga un perfil de seguridad más favorable o una vía de administración menos invasiva.

Se pueden alcanzar altos niveles de expresión del transgén cuando se usan vectores gammarretrovíricos (gamma-RV) debido al hecho de que la expresión del transgén terapéutico está regulada por sus secuencias LTR. Sin embargo, los primeros ensayos clínicos basados en este tipo de vector plantearon problemas de seguridad, ya que varios pacientes desarrollaron leucemias inesperadas (Hacein-Bey-Abina et al. 2008). La fuerte actividad promotora de las secuencias LTR podría afectar la regulación de los genes circundantes, ya sea por activación de promotores protoncogénicos o por inhibición de genes supresores de tumores, lo que lleva a mutagénesis de inserción (Ott et al.

2006; Howe et al. 2008; Stein et al. 2010; Braun et al. 2014). Estos hallazgos resaltaron la necesidad de usar vectores más seguros y eficientes que los vectores gammarretrovíricos para la terapia génica de la PKD.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización, la presente invención proporciona un casete de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende: a) una secuencia promotora; b) una secuencia que codifica un producto génico; y c) una señal de exportación de ácido ribonucleico (ARN), en donde la secuencia promotora está unida operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido de piruvato cinasa, y opcionalmente cuando a)-c) están presentes en el casete de expresión en el orden de 5' a 3'. En ciertas realizaciones, el promotor es un promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK). En algunas realizaciones, el producto génico es un producto génico terapéutico. En algunas realizaciones, el producto génico terapéutico es un polipéptido de piruvato cinasa (PK), opcionalmente un polipéptido de piruvato cinasa, de hígado y de glóbulos rojos (PKLR). En ciertas realizaciones, la secuencia que codifica el producto génico es de codones optimizados. En realizaciones particulares, la señal de exportación de ARN es un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (Wpre). En ciertas realizaciones, el Wpre mutado es un Wpre quimérico que comprende una secuencia que tiene al menos el 80 % de identidad con SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende además una o más secuencias potenciadoras. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende además una secuencia señal del tracto de polipurina (PPT) o de poliadenilación (poIiA). En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende además una o más de las siguientes secuencias: i) una secuencia señal de encapsidación; ii) una secuencia Gag truncada; iii) un elemento sensible a Rev (RRE); iv) un tracto central de polipurina (cPPT); v) una secuencia terminal central (CTS); y vi) un elemento de secuencia en el extremo 5' (USE), opcionalmente del virus de simio 40 (SV40-USE). En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende además secuencias de repeticiones terminales largas de 5' y 3'.

En una realización relacionada, la presente invención proporciona un vector de suministro génico recombinante que comprende un casete de expresión desvelado en el presente documento. En ciertas realizaciones, el vector de suministro génico recombinante es un virus o vector vírico. En ciertas realizaciones, el virus o vector vírico es un lentivirus (LV).

En otra realización relacionada, la presente invención proporciona una célula que comprende un casete de expresión o un vector de suministro génico desvelado en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula es un glóbulo sanguíneo. En algunas realizaciones, la célula es una célula eritroide. En algunas realizaciones, la célula es una célula de la médula ósea, por ejemplo, una célula de la médula ósea de linaje reducido. En algunas realizaciones, la célula es una célula madre hematopoyética. En algunas realizaciones, la célula es una célula madre hematopoyética CD34+. En algunas realizaciones, la célula es una célula progenitora eritroide hematopoyética diferenciada.

En aún otra realización relacionada, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un vector o célula de suministro de genes recombinantes desvelados en el presente documento.

En otra realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende proporcionar al sujeto un casete de expresión, un vector de suministro génico o una composición farmacéutica desvelada en el presente documento. En una realización, la enfermedad o trastorno es una deficiencia de piruvato cinasa (PKD) y el producto génico es un polipéptido de piruvato cinasa (PK), opcionalmente un polipéptido de piruvato cinasa, de hígado y de glóbulos rojos (PKLR). En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica comprende el vector de suministro génico recombinante. En otras realizaciones, la composición farmacéutica comprende la célula. En una realización, la célula es autóloga para el sujeto. En otra realización, la célula es alógena para el sujeto.

En una realización relacionada, la presente invención proporciona un método de expresión de un transgén en células eritroides, que comprende poner en contacto una o más células eritroides con una cantidad eficaz de un vector vírico recombinante, en donde el vector comprende un promotor de la fosfoglicerato cinasa humana, una versión de codones optimizados de un transgén del ADNc de la piruvato cinasa, de hígado y de glóbulos rojos (PKLR) y un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota, en donde después de dicho contacto, el PKLR se expresa en niveles detectables en una o más células eritroides.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

La FIG. 1 representa un esquema que refleja la posición de los diferentes elementos descritos presentes en el esqueleto del vector lentivírico.

La FIG. 2a es una representación esquemática de los vectores lentivíricos autoinactivadores usados en todos los experimentos de terapia génica que albergan al promotor de PGK humana que regula la expresión del transgén EGFP en el vector de control (diagrama superior) o la expresión de una secuencia de codones optimizados del ADNc del gen PKLR (coRPK) en el vector terapéutico (diagrama inferior).

La FIG. 2b es un protocolo de terapia génica esquemático realizado para abordar la funcionalidad del vector lentivírico PGK-coRPK desarrollado.

Las FIG. 3a-d representan datos que muestran la corrección del fenotipo de PKD en sangre periférica de receptores primarios después de la corrección genética. La FIG. 3a los RBC y la FIG. 3b son niveles de reticulocitos en ratones sanos (barra negra, n = 5) y anémicos con PKD (barra gris, n = 6), y ratones anémicos con PKD que se trasplantaron con las células transducidas con EGFP (barra blanca, n = 9) o coRPK (barra rayada, n = 17). Los datos se representan como el promedio ± EEM y se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. La FIG. 3c muestra la estrategia de citometría de flujo usada para detectar los RBC marcados con biotina a lo largo del tiempo y la FIG. 3d muestra la cinética de supervivencia de RBC en ratones sanos (línea negra, n = 2), anémicos (línea gris, n = 2) y genéticamente corregidos (línea discontinua, n = 4). Los datos se representan como el promedio ± EEM y se analizaron mediante una prueba ANOVA de dos vías. Ratones de control sanos, no trasplantados; PKD, ratones con PKD no trasplantados; coRPK, ratones con PKD que expresan el transgén terapéutico.

Las FIG. 4a-c muestran la reconstitución hematopoyética multi-linaje en ratones trasplantados secundarios. La FIG. 4a es un diagrama de la estrategia de citometría de flujo usada para identificar los diferentes linajes hematopoyéticos mediante el marcado con los anticuerpos CD3-PE, B220-PE, B220-PECy5, Gr1 -biotina y Mac1 -biotina más SAV-PE-Cy5. La FIG. 4b representa gráficas de puntos representativos y la FIG. 4c representa los porcentajes de cada linaje en SP 140 días después del trasplante. Las barras representan el porcentaje promedio ± EEM de los controles de ratones sanos (n = 2, barra negra) y con PKD (n = 2, barra gris) y los ratones trasplantados secundarios que expresan el transgén terapéutico coRPK (n = 4, barra rayada).

Las FIG. 5a-d representan la corrección del fenotipo de PKD en ratones trasplantados secundarios. La FIG. 5a muestra la tinción con azul de cresilo brillante de frotis de sangre de ratones no trasplantados y receptores secundarios para identificar la población de reticulocitos (en azul). La FIG. 5b es un análisis de citometría de flujo de los niveles de reticulocitos en la sangre periférica. La FIG. 5c representa el porcentaje de RBC y la FIG. 5d el porcentaje de reticulocitos en ratones trasplantados secundarios que expresan el transgén coRPK (barra rayada, n = 4), en ratones sanos (barra negra, n = 3) y en ratones de control anémicos (barra gris, n = 3). Los datos representan el promedio ± EEM y se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney bilateral.

Las FIG. 6a-c muestran la cuantificación de integraciones províricas. La FIG. 6a muestra el número de copias del vector por célula en las UFC de MO de ratones trasplantados individuales de 120 a 170 días después del trasplante. También se muestran los porcentajes de transducción y quimerismo. La FIG. 6b muestra el número de copias de provirus en células de diferentes compartimentos hematopoyéticos. Las columnas representan el promedio ± EEM de los diferentes grupos de ratones trasplantados. La FIG. 6c muestra la cinética de las integraciones províricas en células de MO de ratones que expresan EGFP trasplantados individuales (líneas grises) y ratones que llevan el transgén coRPK (líneas negras).

Las FIG. 7a-c representan la normalización del patrón de diferenciación eritroide en ratones corregidos genéticamente. La FIG. 7a muestra los porcentajes de las diferentes subpoblaciones eritroides en la médula ósea y el bazo 140 días después del trasplante. La FIG. 7b representa gráficas de puntos representativos de la estrategia de citometría de flujo usada. La intensidad de la expresión de los marcadores CD71 y Ter119 permite la identificación de cuatro subpoblaciones eritroides. Población I: proeritroblastos tempranos (Ter119med CD71alto), población II: eritroblastos basófilos (Ter119alto CD71alto), población III: eritroblastos basófilos y policromatófilos tardíos (Ter119alto CD71med) y la población IV: eritroblastos ortocromatófilos, reticulocitos y células eritroides maduras (Ter119alto CD71bajo). La FIG. 7c muestra los niveles plasmáticos de Epo medidos por ELISA en ratones no trasplantados y trasplantados. Los puntos representan valores de ratones individuales. Las líneas representan el promedio ± EEM y se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Ratones de control sanos, no trasplantados; PKD, ratones con PKD no trasplantados; EGFP, ratones con PKD que expresan el transgén EGFP; coRPK, ratones con PKD que expresan el transgén terapéutico.

Las FIG. 8a-b muestran ensayos de progenitores hematopoyéticos en ratones de control y ratones trasplantados con células transducidas. Los datos muestran el total de UFC del bazo (FIG. 8a) y la médula ósea (FIG. 8b) 140 días después del trasplante. Los puntos representan el número de colonias por ratón analizado y las líneas representan el promedio ± EEM en cada grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis.

Las FIG. 9a-c muestran la reversión de la esplenomegalia y la patología de los órganos en ratones corregidos genéticamente 140 días después del trasplante. La FIG. 9a son imágenes de bazos representativos y la FIG. 9b muestra la relación entre el peso del bazo y el peso corporal total de ratones con PKD trasplantados primarios y secundarios. Los puntos representan valores de ratones individuales. Las líneas representan el promedio ± EEM por grupo. Los datos se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. La FIG. 9c muestra el estudio histológico del bazo e hígado de ratones con PKD trasplantados primarios. La primera y la segunda columnas muestran las secciones histológicas representativas del bazo y del hígado teñidas con hematoxilinaeosina y fotografiadas utilizando un objetivo de 4x y 10x, respectivamente, en un microscopio óptico. Las flechas apuntan a grupos de células eritroides indicativos de eritropoyesis extramedular. La tercera columna muestra la tinción con azul de Prusia (Fe) de las secciones del hígado para detectar depósitos de hierro indicados por puntas de flecha. Las fotografías fueron tomadas usando un objetivo de 20x. Leyendas de grupo como en la FIG. 7 2 coRPK, receptores secundarios.

Las FIG. 10a-g representan perfiles metabólicos en muestras de RBC de ratones trasplantados con células modificadas genéticamente. Análisis de cambios significativos en el perfil metabólico en ratones sanos y trasplantados en comparación con animales con PKD en dos experimentos independientes. La FIG. 10a muestra el mapa de calor de RBC completo obtenido por un perfil no dirigido, donde los niveles de metabolitos más altos y más bajos se representan en rojo y azul, respectivamente. Los metabolitos enumerados tienen al menos una comparación que es significativa usando los siguientes criterios: múltiplo de variación absoluto> 1,5; señal mínima > 2000; valor de p ajustado <0,01. Las cajas negras resaltan los cambios de metabolitos con un perfil distinto entre los grupos. Las FIG. 10b, 10c y 10d representan los niveles de ATP, ADP y piruvato en RBC, respectivamente, medidos por perfiles no dirigidos en comparación con los ratones con PKD 140 días después del trasplante. Ensayo 1: ratones sanos (barras negras) n = 1, PKD (barras grises) n = 1, hPGK-EGFP (barras blancas) n = 2, hPGK-coRPK (barras rayadas) n = 3. Ensayo 2: ratones sanos n = 2, PKD n = 2, hPGK-EGFP n = 6, hPGK-coRPK n = 10. Las FIG. 10e, 10f y 10g representan los perfiles metabólicos dirigidos a RBC de un número seleccionado de metabolitos involucrados en la ruta glucolítica (PEP, ácido 3-fosfoglicérico y ácido D-láctico, respectivamente) 280 días después del trasplante. Los puntos representan valores de ratones individuales. Las líneas representan el promedio ± EEM y se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Ensayo 2: ratones sanos n = 7, PKD n = 5, hPGK-EGFP n = 3, hPGK-coRPK n = 5.

Las FIG. 11a-c representan la actividad de la piruvato cinasa, la FIG. 11b la actividad de hexocinasa y la FIG. 11c la relación de las actividades enzimáticas de la piruvato cinasa y la hexocinasa en los RBC de ratones de control y ratones trasplantados con células transducidas. Los RBC se purificaron a partir de muestras de sangre a través de una columna de celulosa para evitar la contaminación de la actividad de PK de los leucocitos y se sometieron a una evaluación de la actividad enzimática. Barras negras, ratones sanos (n = 2); barras blancas, ratones trasplantados con células transducidas con el vector de expresión de EGFP (n = 3); barras rayadas, ratones trasplantados con células transducidas con el vector que expresa coRPK (n = 3). Las barras a cuadros representan los valores de un voluntario sano (n = 1). Los datos representan el promedio ± EEM de cada grupo.

Las FIG. 12a-d muestran un perfil metabólico no dirigido en muestras de WBC de ratones trasplantados con células modificadas genéticamente. La FIG. 12a representa el análisis de componentes principales del perfil de metabolitos no dirigidos en los RBC (puntos rojos; izquierda y centro) y los WBC (puntos azules; agrupamiento en la derecha) en los ratones de control y trasplantados. Las FIG. 12b, 12c y 12d representan niveles de ATP, ADP y piruvato, respectivamente, en WBC en comparación con ratones con PKD. Ensayo 1: ratones sanos (barras negras) n = 1, PKD (barras grises) n = 1, hPGK-EGFP (barras blancas) n = 2, hPGK-coRPK (barras rayadas) n = 3. Ensayo 2: ratones sanos n = 2, p Kd n = 2, hPGK-EGFP n = 6, hPGK-coRPK n = 10. Los datos representan el promedio ± EEM por grupo y se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal- Wallis.

La FIG. 13 muestra una imagen de gel de los productos de LAM-PCR generados con la enzima Tsp5091 para muestras recogidas de todos los ratones en diferentes momentos y tejidos. Los sitios de integración de vectores se identificaron mediante la amplificación LAM-PCR de uniones de genoma LTR del vector 3'. Se utilizó un sistema automatizado MultiNA, que generó un patrón caracterizado por varias bandas. La banda de control interno (IC) de Tsp509I derivada del esqueleto del vector se indica mediante una flecha.

La FIG. 14 muestra una imagen de gel de los productos de LAM-PCR generados con la enzima HpyCH4IV5 para muestras recogidas de todos los ratones en diferentes momentos y tejidos. Los sitios de integración de vectores se identificaron mediante la amplificación por LAM-PCR de uniones de genoma LTR del vector 3'. Se utilizó un sistema automatizado MultiNA, generando un patrón caracterizado por varias bandas. La banda de control interno (IC) de HpyCH4IV5 derivada del esqueleto del vector se indica mediante una flecha.

La FIG. 15 representa un esquema general del análisis del mapeo de sitios de integración realizado en ratones trasplantados con progenitores hematopoyéticos modificados genéticamente. Las muestras de médula ósea y de glóbulos blancos de ratones trasplantados pertenecientes a dos experimentos independientes (Tabla 3) y recogidos en diferentes momentos después del trasplante se analizaron como se describe en los métodos complementarios que siguen a la tubería mostrada.

Las FIG. 16a-b muestra la distribución de las integraciones LV a lo largo del genoma de los ratones trasplantados. La FIG. 16a representa la distribución de frecuencias del sitio de integración (IS) alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) del gen RefSeq más cercano, que engloba 500 Kb en el extremo 5' y en el extremo 3' del TSS. Los números en la parte superior son el número de IS detectado para todas las muestras y momentos. La FIG. 16b representa la distribución cromosómica de los sitios de integración LV en ratones trasplantados que expresan el transgén EGFP (barras negras) o el transgén terapéutico coRPK (barras grises), sin mostrar desviaciones hacia ningún cromosoma particular.

Las FIG. 17a-c muestran el análisis de abundancia clonal de células transducidas con coRPK-LV. Representación de la gráfica de puntos de la abundancia clonal de integraciones agrupadas en cada ratón de los ensayos 1 (FIG. 17a) y 2 (FIG. 17b y 17c). El porcentaje relativo (eje y) para cada sitio de integración es relativo al número total de lecturas de secuencias obtenidas en cada conjunto de datos. IS, sitio de integración; MO, médula ósea; SP, sangre periférica; coRPK1-14, ratones trasplantados con células hematopoyéticas transducidas con el vector terapéutico.

La FIG. 18 presenta las integraciones compartidas seguidas entre ratones receptores primarios y secundarios que portan el vector LV PGK-coRPK terapéutico. Las integraciones detectadas en cualquier ratón en cualquier órgano y en cualquier momento se agrupan. Los receptores secundarios recibieron la combinación de MO de ratones trasplantados coRPK11 a 14. El resto de los IS detectados se detectaron o en los receptores primarios o secundarios. Los números en las celdas muestran la representatividad en porcentaje de la integración correspondiente en el ratón referido. Además de > 5 % de filtro aplicado en el análisis de integración, se eliminaron todas las integraciones con un recuento de secuencia <3.

La FIG. 19 muestra el análisis de abundancia clonal de células transducidas con EGFP-LV. Representación de la gráfica de puntos de la abundancia clonal de integraciones agrupadas en cada ratón en la médula ósea. El porcentaje relativo (eje y) para cada sitio de integración es relativo al número total de lecturas de secuencias obtenidas en cada conjunto de datos. De manera similar a las células transducidas con co-RPK (FIG. 17), la gráfica indica que la gran mayoría de los ratones trasplantados muestran un patrón policlonal de repoblación hematopoyética. IS, sitio de integración.

La FIG. 20 representa el perfil de integración genómica LV. El análisis de ontología de genes (GO) se realizó usando en software GREAT en muestras de ratones trasplantados. Todas las integraciones recuperadas de este estudio (N = 2220) mostraron representaciones excesivas de las funciones génicas indicadas en la parte izquierda de la figura. Para abordar si las integraciones más abundantes se enriquecieron en clases de genes específicos, se seleccionaron todos los sitios de integración con un recuento de secuencias relativo > 5 % del conjunto de datos completo (mostrado en la FIG. 17), que no muestra clases de genes GO representadas en exceso.

La FIG. 21 representa un diagrama esquemático del medicamento (LV PGK-coRPK).

Las FIG. 22a-b representa el mecanismo de acción del medicamento. La FIG. 22a representa la expresión ectópica del medicamento LV PGK-coRPK que rescatará el fenotipo natural de los eritrocitos de PKD, que de otra manera no podrían generar una proteína de RPK funcional para producir energía suficiente para llevar a cabo sus funciones. La FIG. 22b muestra la estrategia de terapia génica para pacientes con PKD basada en la transducción ex vivo de progenitores hematopoyéticos CD34+ deficientes en RPK con el medicamento y el trasplante posterior en el paciente. El medicamento desarrollado que lleva el ADNc del gen PKLR humano terapéutico se integrará en el genoma de la célula CD34+ del paciente tras la transducción ex vivo. Estas células corregidas genéticamente se volverán a infundir en el paciente, donde producirán RBC que expresan el transgén terapéutico y, por lo tanto, producen proteínas de RPK funcionales que corregirán el fenotipo patológico de la PKD. Figura modificada del blog del Hospital infantil de Boston.

DESCRIPCIÓN DE TALLADA DE LA INVENCIÓN

DEFINICIONES

Un "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una macromolécula o asociación de macromoléculas que comprende o se asocia con un polinucleótido y que se puede usar para mediar en el suministro del polinucleótido a una célula. Los vectores ilustrativos incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores víricos, liposomas y otros vehículos de suministro génico.

El término "LV es una abreviatura de lentivirus, y se puede usar para referirse al virus en sí o a sus derivados. El término cubre todos los subtipos y tanto a las formas naturales como recombinantes, excepto que se requiera lo contrario.

Como se usa en el presente documento, el término "gen" o "secuencia codificante" se refiere a una secuencia de nucleótidos in vitro o in vivo que codifica un producto génico. En algunos casos, el gen consiste o consiste esencialmente en una secuencia codificante, es decir, una secuencia que codifica el producto génico. En otros casos, el gen comprende una secuencia no codificante adicional. Por ejemplo, el gen puede o no incluir regiones que preceden y siguen a la región codificante, por ejemplo, secuencias no traducidas 5’ (UTR 5') o "conductoras" y secuencias UTR 3' o "traseras", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

Como se usa en el presente documento, un "gen terapéutico" se refiere a un gen que, cuando se expresa, confiere un efecto beneficioso sobre la célula o el tejido en el que está presente, o sobre un mamífero en el que se expresa el gen. Los ejemplos de efectos beneficiosos incluyen la mejoría de un signo o síntoma de una afección o enfermedad, la prevención o inhibición de una afección o enfermedad, o la concesión de una característica deseada. Los genes terapéuticos incluyen genes que corrigen una deficiencia genética en una célula o mamífero.

Como se usa en el presente documento, un transgén es un gen que se suministra a una célula mediante un vector.

Como se usa en el presente documento, el término "producto génico" se refiere al producto de expresión deseado de una secuencia de polinucleótidos, tal como un polipéptido, péptido, proteína o ARN interferente que incluye ARN interferente pequeño (ARNip), miARN o ARN de horquilla pequeña (ARNhp).

Como se usa en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente de marcado.

Por "que comprende" se entiende que los elementos citados se requieren, por ejemplo, en la composición, el método, el kit, etc., pero se pueden incluir otros elementos para formar, por ejemplo, la composición, el método, el kit, etc., dentro del alcance de la reivindicación. Por ejemplo, un casete de expresión "que comprende" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor es un casete de expresión que puede incluir otros elementos además del gen y promotor, por ejemplo, secuencia de poliadenilación, elementos potenciadores, otros genes, dominios conectores, etc.

Por "que consiste esencialmente en" se entiende una limitación del alcance de, por ejemplo, la composición, el método, el kit, etc., descritos para los materiales o etapas especificados que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de, por ejemplo, la composición, el método, el kit, etc. Por ejemplo, un casete de expresión "que consiste esencialmente en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a una secuencia promotor y de poliadenilación puede incluir secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias conectoras, siempre que no afecten materialmente a la transcripción o traducción del gen. Como otro ejemplo, un fragmento polipeptídico de variante o mutante "que consiste esencialmente en" una secuencia citada tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia citada más o menos aproximadamente 10 restos de aminoácidos en los límites de la secuencia basándose en el polipéptido sin tratamiento de longitud completa de la cual se obtuvo, por ejemplo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos menos que el resto de aminoácido limitante, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos más que el resto de aminoácido limitante citado.

Por "que consiste en" se entiende la exclusión de la composición, el método o el kit de cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación. Por ejemplo, un casete de expresión "que consiste en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor, y un elemento regulador postranscripcional, consiste solo en el promotor, la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido terapéutico y el elemento regulador postranscripcional. Como otro ejemplo, un polipéptido "que consiste en" una secuencia citada contiene solo la secuencia citada.

Un "vector de expresión", como se usa en el presente documento, engloba un vector, por ejemplo, plásmido, minicírculo, vector vírico, liposoma y similares como se describe anteriormente o como se conoce en la técnica, que comprende un polinucleótido que codifica un producto génico de interés, y se usa para efectuar la expresión de un producto génico en una célula diana deseada. Un vector de expresión también comprende elementos de control unidos operativamente a la región codificante para facilitar la expresión del producto génico en la diana. La combinación de elementos de control, por ejemplo, promotores, potenciadores, UTR, secuencias de direccionamiento de miARN, etc., y un gen o genes a los que están unidos operativamente para la expresión se denominan a veces como un "casete de expresión". Muchos de dichos elementos de control son conocidos y están disponibles en la técnica o se pueden construir fácilmente a partir de componentes que están disponibles en la técnica.

Un "promotor", como se usa en el presente documento, engloba una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y, por lo tanto, promueve la síntesis de ARN, es decir, una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Los promotores y la expresión de proteínas o polipéptidos correspondiente pueden ser ubicuos, lo que significa que son muy activos en una amplia gama de células, tejidos y especies o específicos del tipo celular, específicos del tejido o específicos de la especie. Los promotores pueden ser "constitutivos", es decir, continuamente activos o "inducibles", lo que significa que el promotor puede activarse o desactivarse por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. También se incluyen en las construcciones o vectores de ácido nucleico de la invención secuencias potenciadoras que pueden o no ser contiguas con la secuencia promotora. Las secuencias potenciadoras influyen en la expresión del gen dependiente del promotor y pueden ubicarse en las regiones 5' o 3' del gen nativo.

Un "potenciador", como se usa en el presente documento, engloba un elemento que actúa en cis que estimula o inhibe la transcripción de genes adyacentes. Un potenciador que inhibe la transcripción también se denomina un "silenciador". Los potenciadores pueden funcionar (es decir, pueden estar asociados con una secuencia codificante) en cualquier orientación, en distancias de hasta varios pares de kilobases (kb) desde la secuencia codificante y desde una posición en el extremo 3' de una región transcrita.

Una "secuencia señal de terminación", como se usa en el presente documento, engloba cualquier elemento genético que hace que la ARN polimerasa termine la transcripción, tal como, por ejemplo, una secuencia señal de poliadenilación.

Como se usa en el presente documento, los términos "unido operativamente" o "unido operablemente" se refieren a una yuxtaposición de elementos genéticos, por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia señal de terminación, secuencia de poliadenilación, etc., en donde los elementos están en una relación que les permite operar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una región codificante si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia codificante. Puede haber restos intermedios entre el promotor y la región codificante siempre que se mantenga esta relación funcional.

Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta de la del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido introducido por técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Como otro ejemplo, un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo. Por lo tanto, por ejemplo, un vector LV que incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un vector LV que incluye un ácido nucleico que normalmente no se incluye en un LV natural, sin mutaciones, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico que normalmente no está codificado por un LV natural, sin mutaciones.

El término "endógeno", como se usa en el presente documento con referencia a una molécula de nucleótido o producto génico, se refiere a una secuencia del ácido nucleico, por ejemplo, gen o elemento genético, o producto génico, por ejemplo, ARN, proteína, natural, en o asociado con un virus o célula hospedadora.

El término "nativo", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, gen, o producto génico, por ejemplo, ARN, proteína, que está presente en un virus o célula natural.

El término "variante", como se usa en el presente documento, se refiere a un mutante de una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos de referencia, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos nativa, es decir, que tiene una identidad de secuencia inferior al 100 % con la secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos de referencia. Dicho de otra manera, una variante comprende al menos una diferencia de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de aminoácidos, inserción de aminoácidos, deleción de aminoácidos) con respecto a una secuencia de polinucleótidos de referencia, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos nativa. Por ejemplo, una variante puede ser un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia del 70 % o más con una secuencia de polinucleótidos nativa de longitud completa, por ejemplo, una identidad del 75 % o del 80 % o más, como del 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, del 98 % o del 99 % de identidad con la secuencia de polinucleótidos nativa de longitud completa. Como otro ejemplo, una variante puede ser un polipéptido que tiene una identidad de secuencia del 70 % o más con una secuencia de polipéptidos nativa de longitud completa, por ejemplo, una identidad del 75 % o del 80 % o más, como del 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, del 98 % o del 99 % de identidad con la secuencia de polipéptidos nativa de longitud completa. Las variantes también pueden incluir fragmentos de variante de una secuencia de referencia, por ejemplo, nativa, que comparte una identidad de secuencia del 70 % o más con un fragmento de la secuencia de referencia, por ejemplo, nativa, por ejemplo, una identidad del 75 % o del 80 % o más, como del 85 %, 90 % o 95 % o más, por ejemplo, del 98 % o del 99 % de identidad con la secuencia nativa.

Como se usa en el presente documento, los términos "actividad biológica" y "biológicamente activa" se refieren a la actividad atribuida a un elemento biológico particular en una célula. Por ejemplo, la "actividad biológica" de una "inmunoglobulina", "anticuerpo" o fragmento o variante del mismo se refiere a la capacidad de unirse a un determinante antigénico y, por lo tanto, facilitar la función inmunológica. Como otro ejemplo, la actividad biológica de un polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo se refiere a la capacidad del polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo para llevar a cabo sus funciones nativas de, por ejemplo, unión, actividad enzimática, etc. Como un tercer ejemplo, la actividad biológica de un elemento regulador de gen, por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia de Kozak, y similares, se refiere a la capacidad del elemento regulador o fragmento funcional o variante del mismo para regular, es decir, promover, potenciar o activar la traducción de, respectivamente, la expresión del gen al que está unido operativamente.

Los términos "administrar" o "introducir", como se usan en el presente documento, se refieren al suministro de un vector para la expresión de proteínas recombinantes a una célula, a las células y/u órganos de un sujeto, o a un sujeto. Dicha administración o introducción puede tener lugar in vivo, in vitro o ex vivo. Un vector para la expresión de un producto génico puede introducirse en una célula mediante transfección, lo que normalmente significa la inserción de ADN heterólogo en una célula por medios físicos (por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, electroporación, microinyección o lipofección); infección, que normalmente se refiere a la introducción por medio de un agente infeccioso, es decir, un virus; o transducción, que normalmente significa una infección estable de una célula con un virus o la transferencia de material genético de un microorganismo a otro por medio de un agente vírico (por ejemplo, un bacteriófago).

"Transformación" se usa normalmente para referirse a bacterias que comprenden ADN o células heterólogas que expresan un oncogén y, por lo tanto, se han convertido en un modo de crecimiento continuo, tal como las células tumorales. Un vector usado para "transformar" una célula puede ser un plásmido, virus u otro vehículo.

Normalmente, una célula se denomina "transducida", "infectada"; "transfectada" o "transformada" dependiendo de los medios usados para la administración, introducción o inserción de ADN heterólogo (es decir, el vector) en la célula. Los términos "transducido", "transfectado" y "transformado" se pueden usar indistintamente en el presente documento independientemente del método de introducción del ADN heterólogo.

El término "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que ha sido transducida, infectada, transfectada o transformada con un vector. El vector puede ser un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la técnica. Se apreciará que el término "célula hospedadora" se refiere a la célula original transducida, infectada, transfectada o transformada y a su descendencia.

Los términos "tratamiento", "que trata" y similares se usan en el presente documento para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma, por ejemplo, reduciendo la probabilidad de que la enfermedad o los síntomas de la misma ocurran en el sujeto, y/o puede ser terapéutico en términos de una curación parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. El "tratamiento", como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero e incluye: (a) prevenir que ocurra la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después de la aparición de la enfermedad o lesión. El tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Dicho tratamiento se realiza deseablemente antes de la pérdida de función completa en los tejidos afectados. La terapia del sujeto se administrará deseablemente durante la etapa sintomática de la enfermedad, y en algunos casos después de la etapa sintomática de la enfermedad.

Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren a un mamífero, que incluye, pero no se limita a, primates humanos y no humanos, que incluyen simios y humanos; animales deportivos mamíferos (por ejemplo, caballos); animales de granja mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mascotas mamíferas (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).

La terminología usada en el presente documento tiene la intención de describir solo realizaciones particulares y no pretende ser limitante de la invención. Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" pretenden incluir las formas en plural también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos se usan en la descripción detallada y/o las reivindicaciones, dichos términos pretenden ser incluyentes de una manera similar al término "que comprende".

El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular que se ha determinado por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "alrededor de" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, "alrededor de" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, más preferiblemente hasta el 5 %, y más preferiblemente aún hasta el 1 % de un valor dado. Alternativamente, de manera particular con respecto a los sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describan valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir el término "alrededor de" dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

A menos que se indique lo contrario, todos los términos usados en el presente documento tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica y la práctica de la presente invención empleará técnicas convencionales de microbiología y tecnología de ADN recombinante, que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, bioquímica e inmunología, que están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona polinucleótidos, casetes de polinucleótidos y vectores de expresión para la expresión de un gen en células. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para el uso de cualquiera de las composiciones en la promoción de la expresión de un gen en células, por ejemplo, en un individuo, por ejemplo, para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno. Estos y otros objetivos, ventajas y propiedades de la invención se harán evidentes para los expertos en la técnica al leer los detalles de las composiciones y métodos que se describen más detalladamente a continuación.

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la biología molecular y la virología y, en particular, a los casetes de expresión genética, y a los vectores que los comprenden útiles para el suministro de segmentos de ácido nucleico que codifican construcciones terapéuticas seleccionadas (que incluyen, por ejemplo, péptidos, polipéptidos, ribozimas y moléculas de ARN catalíticas) a células y tejidos seleccionados de animales vertebrados. En particular, estas construcciones genéticas son útiles en el desarrollo de vectores de terapia génica, que incluyen, por ejemplo, vectores lentivíricos, para el tratamiento de enfermedades, trastornos y disfunciones de mamíferos y, en particular, de seres humanos.

Las composiciones desveladas pueden utilizarse en una variedad de regímenes de investigación, diagnóstico y terapéuticos, que incluyen la prevención y el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas. Las diversas composiciones y métodos de la invención se describen a continuación.

Aunque las composiciones y métodos particulares se ejemplifican en el presente documento, se entiende que cualquiera de una serie de composiciones y métodos alternativos es aplicable y adecuada para su uso en la práctica de la invención. También se entenderá que una evaluación de las construcciones de expresión y métodos de la invención se puede llevar a cabo usando procedimientos habituales en la técnica.

En ciertas realizaciones, se proporcionan métodos y composiciones para la preparación de composiciones de vectores de terapia génica, por ejemplo, vectores víricos, que comprenden estos casetes de expresión genética para su uso en la preparación de medicamentos útiles en terapia génica central y dirigida de enfermedades, trastornos y disfunciones en un animal, y en humanos en particular.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una terapia génica para la PKD basada en un vector lentivírico que alberga el promotor eucariota de hPGK que impulsa la expresión del ADNc de PKLR. Este vector terapéutico se puede usar para transducir células madre hematopoyéticas de PKD de ratón (HSC) y posteriormente trasplantarse en ratones con PKD mielosuprimidos. La expresión ectópica de RPK normaliza el compartimiento eritroide corrigiendo el fenotipo hematológico y revirtiendo la patología de los órganos. Los estudios metabolómicos muestran la corrección funcional de la ruta glucolítica en RBC obtenidos de HSC de PKD corregidas genéticamente, sin alteraciones metabólicas en los leucocitos. El análisis de los sitios de inserción lentivírica en el genoma de las células hematopoyéticas trasplantadas no demuestra evidencia de genotoxicidad en ninguno de los animales trasplantados. En general, los resultados subrayan el potencial terapéutico del vector lentivírico hPGK-coRPK y proporcionan altas expectativas hacia la terapia génica de la PKD y otros trastornos genéticos metabólicos eritroides.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un vector lentivírico (LV) de RPK para la corrección genética de la PKD. La modificación genética de las PKD-HSC murinas con este vector puede corregir de manera eficiente el fenotipo hemolítico y el perfil de metabolitos de RBC en ratones con PKD trasplantados. Sorprendentemente, no se observan evidencias de alteraciones metabólicas en los leucocitos y genotoxicidad derivada de la integración del vector, lo que respalda el potencial terapéutico del vector LV PGK-coRPK. En general, los resultados proporcionan evidencia alentadora de la viabilidad de la terapia génica para la PKD con un LV diseñado para aplicación clínica.

Ciertas realizaciones de la presente invención comprenden un vector lentivírico autoinactivador que expresa una versión de codones optimizados del gen PKLR humano. El vector de expresión comprende una región promotora, una secuencia codificadora y un elemento regulador postranscripcional.

Ciertas realizaciones de casetes de polinucleótidos de la presente invención comprenden una región promotora que comprende una secuencia promotora, o un fragmento funcional de la misma. En una realización, el promotor es un promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) humana.

Algunas realizaciones de la presente invención comprenden casetes de polinucleótidos para la expresión potenciada de la piruvato cinasa. En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una versión de codones optimizados del ADNc de PKLR humano (coRPK) para aumentar la estabilidad del ARNm tras la transcripción. Para la optimización, se puede usar el software GeneArt®, que aumenta el contenido de GC y elimina los sitios de corte y empalme crípticos para evitar el silenciamiento transcripcional y, por lo tanto, aumentar la expresión del transgén. La secuencia de coRPK optimizado mostró una homología del 80,4 % con el gen PKLR humano, sin cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Alternativamente, puede usarse cualquier método de optimización conocido en la técnica.

En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una señal de exportación de ARN en el extremo 3' del segundo potenciador. La señal de exportación de ARN puede comprender la secuencia del elemento postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). En algunas realizaciones, también se incluye un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (Wpre), que carece de un marco abierto de lectura residual (Schambach, Bohne et al. 2006) para mejorar el nivel de expresión y la estabilidad del gen terapéutico.

En algunos aspectos de la invención, se proporcionan vectores de suministro génico que comprenden un casete de polinucleótidos de la presente invención. En algunas realizaciones, el vector de suministro génico es un lentivirus.

En algunos aspectos de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un casete de polinucleótidos de la invención y un excipiente farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un vector de suministro génico de la invención y un excipiente farmacéutico.

En algunos aspectos de la invención, se proporcionan métodos para expresar un transgén en células de mamífero. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una o más células de mamífero con una cantidad eficaz de un casete de polinucleótidos de la invención o un vector de suministro génico de la invención, en donde el transgén se expresa a niveles detectables en una o más células de mamífero. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto una o más células de mamífero con una cantidad eficaz de un casete de polinucleótidos de la invención o un vector de suministro génico de la invención, en donde el transgén se expresa a niveles terapéuticos en una o más células de mamífero. En algunas realizaciones, el método es in vitro. En otras realizaciones, el método es in vivo.

En algunos aspectos de la invención, se proporcionan métodos para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o trastorno en un mamífero en necesidad de tratamiento o profilaxis para una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención, en donde la secuencia codificante codifica un producto génico terapéutico.

COMPOSICIONES

En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan composiciones para la expresión de un transgén en célula(s) eucariota(s). En algunos aspectos, la célula eucariota es una célula de mamífero. En algunos aspectos, la célula de mamífero es una célula madre hematopoyética. En algunas realizaciones, la célula es una célula de la médula ósea, por ejemplo, una célula de la médula ósea de linaje reducido. En algunos aspectos, la célula de mamífero es un progenitor eritroide hematopoyético diferenciado.

En algunas realizaciones de la divulgación, la composición es un casete de polinucleótidos. Por "casete de polinucleótidos" se entiende una secuencia de polinucleótidos que comprende dos o más secuencias de polinucleótidos funcionales, por ejemplo, elementos reguladores, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias codificantes y/o secuencias de terminación, etc., normalmente en enlaces operativos entre sí. Del mismo modo, por un "casete de polinucleótidos para la expresión de un transgén en una célula de mamífero" se entiende una combinación de dos o más secuencias de polinucleótidos funcionales, por ejemplo, promotor, potenciador, UTR 5', secuencia de iniciación de la traducción, secuencia codificante y/o secuencias de terminación, etc., que promueve la expresión del transgén en una célula.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende: promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) humana, una versión de codones optimizados del ADNc de PKLR humano (coRPK) y un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (Wpre).

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, el promotor de PKLR humano comprende o consiste en la siguiente secuencia, un fragmento funcional de la misma, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

ATTATGGTAAATCCACTTACTGTCTGCCCTCGTAGCCATCGAGATAAACCCTACC

GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCC

CGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATC

CACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCT

ACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGA

CGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCG

CTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCT

CCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCA

GGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCA

TTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC

GGGCCTTTCGACCTGCAGCCC (SEQ ID NO:4).

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, el promotor PKLR humano comprende o consiste en la siguiente secuencia, un fragmento funcional de la misma, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

TCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGAC

GCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTC

GCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTG

GGCCCCCCGGCGACGCTTCCTCGTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGT

TCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCG

CAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTG

GCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGGCGCCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGC

GGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCG

GTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTT

GACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO:8),

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la secuencia de RPE comprende o consiste en la siguiente secuencia, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, en al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

TCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGC

TGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATT

TGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCAT

CAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCT (SEQ ID NO:3).

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la secuencia psi es una secuencia psi del VIH-1 o la secuencia psi comprende o consiste en la siguiente secuencia, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

TCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGC

GACTGGTGAGT ACGCC AA AA ATTTTGACT AGCGG AGGCT AG A AGGAGAGAGATG

GGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAG (SEQ ID NO:5).

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la LTR 5' comprende o consiste en la siguiente secuencia, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGG

GTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAAC

CCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC

GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTG

GAAAATCTCTAGCAGT (SEQ ID NO:6).

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la LTR de 3' comprende o consiste en la siguiente secuencia, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGG

GTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAAC

CCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC

GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTG

GAAAATCTCTAGCAG (SEQ ID NO:7).

En algunas realizaciones, los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación proporcionan una expresión potenciada de un transgén en células de mamífero. Como lo demuestran los ejemplos prácticos de la presente divulgación, los presentes inventores han descubierto varios elementos de polinucleótidos, es decir, elementos mejorados en comparación con los conocidos en la técnica, que proporcionan individual y sinérgicamente la expresión potenciada de transgenes en células de mamífero. En ciertas realizaciones, la disposición de las dos o más secuencias de polinucleótidos funcionales dentro de los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación proporciona una expresión potenciada de un transgén en células de mamífero. Por "potenciado" se entiende que la expresión del transgén se incrementa, aumenta o es más fuerte en las células que llevan los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación con respecto a las células que llevan el transgén unido operativamente a elementos reguladores comparables, por ejemplo, como se conoce en la técnica. Dicho de otra manera, la expresión del transgén se incrementa, aumenta o es más fuerte a partir de los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación con respecto a la expresión de un casete de polinucleótidos que no comprende uno o más elementos optimizados de la presente divulgación, es decir, un control de referencia. En cierta realización, la expresión potenciada es específica o está limitada a uno o más tipos de células deseados.

Por ejemplo, la expresión del transgén puede potenciarse, aumentarse o ser más fuerte en células que comprenden un casete de polinucleótidos que comprende un promotor desvelado en el presente documento que en células que llevan el transgén unido operativamente a un promotor diferente, por ejemplo, como se conoce en la técnica. Como otro ejemplo, la expresión del transgén puede potenciarse, o incrementarse, aumentarse o ser más fuerte, en células que comprenden un casete de polinucleótidos que comprende una secuencia potenciadora desvelada en el presente documento que en células que llevan el transgén unido operativamente a una secuencia potenciadora diferente.

Los elementos promotores y potenciadores pueden ser específicos de tejido o específicos de etapa. Por ejemplo, un promotor o potenciador específico de tejido impulsa preferentemente la expresión (o un nivel más alto de expresión) en uno o más tipos de células particulares. Los ejemplos de tipos de células incluyen, pero no se limitan a: células madre hematopoyéticas, células madre hematopoyéticas a largo plazo, células madre hematopoyéticas a corto plazo, progenitores multipotentes, células CD34+ hematopoyéticas y cualquier subpoblación de diferenciación de grupos dentro de la población CD34+. Un promotor o potenciador específico de etapa impulsa de manera preferencial la expresión (o un nivel más alto de expresión) durante una o más etapas específicas del ciclo o desarrollo celular. Estos incluyen, pero no se limitan a, la región de control del locus de beta-globina, el promotor de espectrina y un promotor específico eritroide.

Sin pretender queda ligado a teoría alguna, se cree que la expresión potenciada de un transgén en las células se debe a una acumulación más rápida del producto génico en las células o un producto génico más estable en las células. Por lo tanto, la expresión potenciada de un transgén por los casetes de polinucleótidos de la divulgación objeto se puede observar de varias maneras. Por ejemplo, se puede observar una expresión potenciada detectando la expresión del transgén después del contacto del casete de polinucleótidos con las células antes, por ejemplo, 2 días antes, 7 días antes, 2 semanas antes, 3 semanas antes, 4 semanas antes, 8 semanas antes, 12 semanas antes o más, de que la expresión se detecte si el transgén estuviera unido operativamente a elementos reguladores comparables, por ejemplo, como se conoce en la técnica. La expresión potenciada también se puede observar como un incremento en la cantidad de producto génico por célula. Por ejemplo, puede haber un incremento de 2 veces o más, por ejemplo, un incremento de 3 veces o más, un incremento de 4 veces o más, un incremento de 5 veces o más, o un incremento de 10 veces o más en la cantidad de producto génico por célula de mamífero. La expresión potenciada también se puede observar como un incremento en el número de células de mamíferos que expresan niveles detectables del transgén transportado por el casete de polinucleótidos. Por ejemplo, puede haber un incremento de 2 veces o más, por ejemplo, un incremento de 3 veces o más, un incremento de 4 veces o más, un incremento de 5 veces o más, o un incremento de 10 veces o más en el número de células de mamíferos que expresan niveles detectables del transgén. Como otro ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede promover niveles detectables del transgén en un mayor porcentaje de células en comparación con un casete de polinucleótidos convencional; por ejemplo, cuando un casete convencional puede promover niveles detectables de expresión transgénica en, por ejemplo, menos del 5 % de las células en una determinada región, el polinucleótido de la presente invención promueve niveles detectables de expresión en el 5 % o más de las células en esa región; por ejemplo, 10 % o más, 15 % o más, 20 % o más, 25 % o más, 30 % o más, 35 % o más, 40 % o más, o 45 % o más, en algunos casos 50 % o más, 55 % o más; 60 % o más, 65 % o más, 70 % o más, o 75 % o más, por ejemplo 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, o 95 % o más de las células que se contactaron, expresará niveles detectables de producto génico. La expresión potenciada también se puede observar como una alteración en la viabilidad y/o la función de las células.

Los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación comprenden normalmente una región promotora. Cualquier región promotora o secuencia promotora adecuada en la misma se puede usar en los casetes de polinucleótidos objetivo, siempre que la región promotora promueva la expresión de una secuencia codificante en células eucariotas. En ciertas realizaciones, la región promotora promueve la expresión de una secuencia codificante en células de mamífero. En algunos casos, el promotor es un promotor ubicuo, es decir, es un promotor que está activo en una amplia variedad de células, tejidos y especies. En otros casos, el promotor es un promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) humana.

En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende uno o más potenciadores. Los potenciadores son elementos de ácido nucleico conocidos en la técnica por potenciar la transcripción, y pueden ubicarse en cualquier lugar en asociación con el gen que regulan, por ejemplo, en el extremo 5', en el extremo 3', dentro de un intrón, etc. Se puede usar cualquier elemento potenciador en los casetes de polinucleótidos y vectores de terapia génica de la presente divulgación, siempre que potencie la expresión del gen cuando se use en combinación con el promotor.

La secuencia codificante que se va a expresar en las células puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, gen o ADNc que codifica un producto génico, por ejemplo, un polipéptido o terapéutico basado en ARN (ARNip, antisentido, ribozima, ARNhp, etc.). La secuencia codificante puede ser heteróloga a la secuencia promotora a la que está unida operativamente, es decir, no está asociada operativamente de forma natural con ella. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser endógena a la secuencia promotora a la que está unida operativamente, es decir, está asociada en la naturaleza con ese promotor. El producto génico puede actuar de manera intrínseca en la célula de mamífero, o puede actuar de manera extrínseca, por ejemplo, puede ser secretado. Por ejemplo, cuando el transgén es un gen terapéutico, la secuencia codificante puede ser cualquier gen que codifique un producto génico deseado o un fragmento funcional o variante del mismo que pueda usarse como un agente terapéutico para tratar una enfermedad o trastorno. En varias realizaciones preferidas, el transgén codifica PKLR humano.

En una realización de la invención, la secuencia codificante del transgén se modifica, o se "optimizan los codones" para potenciar la expresión reemplazando codones representados con poca frecuencia con codones representados con mayor frecuencia. La secuencia codificante es la porción de la secuencia de ARNm que codifica los aminoácidos para la traducción. Durante la traducción, cada uno de los 61 codones de trinucleótidos se traduce en uno de 20 aminoácidos, lo que lleva a una degeneración, o redundancia, en el código genético. Sin embargo, diferentes tipos de células y diferentes especies de animales utilizan ARNt (cada uno de los cuales lleva un anticodón) que codifican los mismos aminoácidos a diferentes frecuencias. Cuando una secuencia de genes contiene codones que se representan con poca frecuencia por el ARNt correspondiente, la maquinaria de traducción del ribosoma puede ralentizarse, impidiendo una traducción eficiente. La expresión puede mejorarse a través de la "optimización de codones" para una especie particular, donde la secuencia codificante se altera para codificar la misma secuencia de proteínas, pero utilizando codones que están altamente representados y/o son utilizados por proteínas humanas altamente expresadas (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). En un aspecto de la presente invención, la secuencia codificante del transgén se modifica para reemplazar los codones poco frecuentemente expresados en mamíferos o en primates con codones frecuentemente expresados en primates. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia codificante codificada por el transgén codifica un polipéptido que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con un polipéptido codificado por una secuencia desvelada anteriormente o en el presente documento, por ejemplo, al menos un 90 % de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 95 % de identidad de secuencia, al menos un 98 % de identidad, al menos un 99 % de identidad, en donde al menos un codón de la secuencia codificante tiene una mayor frecuencia de ARNt en seres humanos que el codón correspondiente en la secuencia desvelada anteriormente o en el presente documento.

En una realización adicional de la invención, la secuencia codificante del transgén se modifica para potenciar la expresión mediante la terminación o eliminación de marcos abiertos de lectura (ORF) que no codifican el transgén deseado. Un marco abierto de lectura (ORF) es la secuencia del ácido nucleico que sigue a un codón de inicio y no contiene un codón de parada. Los ORF pueden estar orientados hacia adelante o hacia atrás, y pueden estar "dentro del marco" o "fuera de marco" en comparación con el gen de interés. Dichos marcos abiertos de lectura tienen el potencial de expresarse en un casete de expresión junto con el gen de interés, y podrían provocar efectos adversos no deseados. En un aspecto de la presente invención, la secuencia codificante del transgén se ha modificado para eliminar los marcos abiertos de lectura al alterar adicionalmente el uso de codones. Esto se hizo eliminando los codones de inicio (ATG) e introduciendo codones de parada (TAG, TAA o TGA) en ORF de orientación inversa o fuera de marco, mientras se conserva la secuencia de aminoácidos y se mantienen los codones altamente utilizados en el gen de interés (es decir, evitando codones con frecuencia < 20 %). En la presente invención, la secuencia codificante del transgén puede optimizarse mediante o la optimización del codón y la eliminación de ORF no transgénicos o usando ambas técnicas. Como será evidente para un experto en la técnica, es preferible eliminar o minimizar los ORF no transgénicos después de la optimización de codones para eliminar los ORF introducidos durante la optimización de codones.

En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos de la presente invención comprende además una señal de exportación de ARN. Las secuencias de exportación de ARN a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, secuencias del elemento postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). El elemento regulador postranscripcional (Wpre) del virus de la hepatitis de la marmota (VHM) aumenta significativamente la expresión transgénica en las células diana, al aumentar la estabilidad del ARN de forma transgénica, promotora e independiente del vector (Zuffrey et al., 1999). Sin embargo, puede expresar una proteína truncada de 60 aminoácidos derivada del gen X del VHM involucrado en el cáncer de hígado (Kingsman et al., 2005). Por lo tanto, la mayoría de los protocolos preclínicos y ensayos clínicos incluyen una versión mutada del elemento Wpre (Zanta-Boussif et al., 2009). Por otro lado, se ha visto que el uso de dos elementos SV40-USE en vectores SIN-LV es más eficiente que la secuencia de WPRE en la supresión de la lectura transcripcional (Schambach et al., 2007). Más concretamente, el WPRE desvelado en el presente documento es un WPRE quimérico que transporta 589 nucleótidos del WPRE modificado realizado por Axel Schambach (nucleótidos 1-589) (documento de patente WO 2008136670 A2; [5]) y 88 de un WPRE anterior (nucleótido 590-677) (Zuffrey et al., 1999). Los datos desvelados en el presente documento muestran que este wpre quimérico funciona mejor que el WPRE anterior. La secuencia quimérica de WPRE comprende la secuencia enumerada en la tabla a continuación.

Tabla 1. Secuencia de WPRE modificada

La presente invención también incluye una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos, que comprende una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, o al menos 99 % de identidad con la secuencia descrita en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:9. En realizaciones particulares, la secuencia de polinucleótidos comprende la secuencia descrita en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:9.

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la secuencia de Wpre comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO:1, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la secuencia de SEQ ID NO:1.

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, la secuencia de Wpre comprende o consiste en la siguiente secuencia, o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con la siguiente secuencia:

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATT

T A AATGTT AAT A AA ACAAA ATGGTGGGGC A ATC ATTT AC ATTTTT AGGGAT ATGT A ATT A

CTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCT

CTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAA

CTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATT

GCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGA

GGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAAC

CCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCC

CTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCT

AGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTG

CGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCT

CCCCGCCTG (SEQ ID NO:9).

En ciertas realizaciones, un casete de expresión o un vector de suministro génico, por ejemplo, un lentivirus, comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende las siguientes secuencias en el orden de 5' a 3':

a) una secuencia promotora de PGK, opcionalmente una secuencia promotora de PGK humana;

b) una secuencia que codifica un polipéptido de piruvato cinasa, opcionalmente una secuencia codificante de RPK de codones optimizados o de ADNc; y

c) una secuencia de Wpre mutante, que opcionalmente comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO:1.

a) una secuencia de cPPT;

b) secuencia promotora de PGK, opcionalmente una secuencia promotora de PGK humana;

c) una secuencia que codifica un polipéptido de piruvato cinasa, opcionalmente una secuencia codificante de RPK de codones optimizados o de ADNc; y

d) una secuencia de Wpre mutante, que opcionalmente comprende o consiste en la secuencia de SEQ ID NO:1.

a) una LTR 5', opcionalmente una LTR 5' modificada;

b) una secuencia de cPPT;

c) secuencia promotora de PGK, opcionalmente una secuencia promotora de PGK humana;

d) una secuencia que codifica un polipéptido de piruvato cinasa, opcionalmente una secuencia codificante de RPK de codones optimizados o de ADNc;

e) una secuencia de Wpre mutante, que comprende opcionalmente o consiste en la secuencia de SEQ ID NO:1; y

f) una LTR 3', opcionalmente una LTR 3' modificada.

En ciertas realizaciones, el vector de suministro génico es LV PGK-coRPK, o comprende los elementos representados en la FIG. 21.

En realizaciones particulares de cualquiera de los casetes de expresión y vectores de suministro génico descritos en el presente documento, el ADNc de RPK de codones optimizados o la secuencia codificante codifica un polipéptido de PKLR que comprende o consiste en la secuencia desvelada en cualquiera de los accesos de GenBank números XP_016856982.1, XP_100507942.1, XP_006811449.1, o NP_000289.1, o un fragmento funcional de cualquiera de estas secuencias, o una secuencia que tenga al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con cualquiera de estas secuencias.

El experto en la técnica apreciará fácilmente otras combinaciones de elementos, como se divulga en el presente documento o como se conoce en la técnica.

Además, como reconocerá un experto en la técnica, los casetes de polinucleótidos pueden contener opcionalmente otros elementos que incluyen, pero no se limitan a, sitios de restricción para facilitar la clonación y los elementos reguladores de un vector de expresión génica particular.

En algunos aspectos de la presente invención, los casetes de polinucleótidos objeto se usan para suministrar un gen a las células de un animal, por ejemplo, para determinar el efecto que el gen tiene sobre la viabilidad y/o función celular, para tratar un trastorno celular, etc. En consecuencia, en algunos aspectos de la invención, la composición que proporciona la expresión de un transgén en células de mamíferos es un vector de suministro génico, en donde el vector de suministro génico comprende los casetes de polinucleótidos de la presente divulgación.

Cualquier vector de terapia génica conveniente que encuentre uso para suministrar secuencias de polinucleótidos a células de mamíferos está englobado por los vectores de suministro génico de la presente divulgación. Por ejemplo, el vector puede comprender ácido nucleico monocatenario o bicatenario, por ejemplo, ADN monocatenario o bicatenario. Por ejemplo, el vector de suministro génico puede ser ADN, por ejemplo, un ADN desnudo, por ejemplo, un plásmido, un minicírculo, etc. El vector puede comprender ARN monocatenario o bicatenario, que incluye formas modificadas de ARN. En otro ejemplo, el vector de suministro génico puede ser un ARN, por ejemplo, un ARNm o un ARNm modificado.

Como otro ejemplo, el vector de suministro génico puede ser un vector vírico derivado de un virus, por ejemplo, un adenovirus, un virus adenoasociado, un lentivirus (LV), un virus del herpes, un virus alfa o un retrovirus, por ejemplo, el virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), el virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), el virus del tumor mamario murino (MuMTV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de la leucemia felina (FLV), un espumavirus, el virus de la leucemia murina de Friend, el virus de las células madre murinas (MSCV) y el virus del sarcoma de Rous (RSV) o lentivirus. Aunque las realizaciones que engloban el uso de lentivirus se describen con mayor detalle a continuación, se espera que el experto en la técnica comprenda que un conocimiento y una habilidad similares en la técnica también pueden aplicarse a los vectores de terapia génica sin LV. En algunas realizaciones, el vector de suministro génico es un lentivirus autolimitado.

En dichas realizaciones, el casete de polinucleótidos objeto está flanqueado en los extremos 5' y 3' por secuencias de repetición terminal larga (LTR) funcional. En una realización, la posición de los diferentes elementos presentes en el esqueleto del vector lentivírico se representa en la Figura 1. Ambas secuencias de LTR se han modificado para generar vectores LV autoinactivadores (SIN). Los vectores SIN tienen una deleción de 400 pb en la LTR 3', que cubre los elementos promotores/potenciadores de la región U3. La expresión del transgén es, por lo tanto, dependiente de los promotores internos, lo que reduce el riesgo de RCL y disminuye la interferencia del promotor (Ginn et al., 2003). Esta deleción de LTR 3' elimina la caja TATA, lo que previene el inicio de la transcripción (Miyoshi et al. 1998; Zuffrey et al. 1998); y, por lo tanto, inactiva el vector. La región U3 de la LTR 5' ha sido reemplazada por otras secuencias promotoras heterólogas (es decir, CMV o RSV) para lograr una transcripción independiente de Tat e incrementar la síntesis de ARN genómico, lo que resulta en el aumento del título vírico. Debido a que la región U3 de 5' impulsa la expresión de transcritos primarios, sus modificaciones no estarán presentes en las células transducidas (Schambach et al. 2009). Los elementos exógenos, tales como las señales de poliadenilación de p-globina o SV40 (Iwakuma et al., 1999) o el elemento de secuencia en el extremo 5' (USE) del virus simio 40 (SV40-USE) (Schambach et al. 2007), también se han incluido en la región R de la LTR 3' vírica para disminuir la lectura transcripcional de los promotores internos (Zaiss et al., 2002) o de los remanentes de la región U3 eliminada de los vectores SIN-LV (Almarza et al.

2011) que impiden la posible activación transcripcional de los genes en el extremo 3'. La región conductora contiene la señal de encapsidación (^), y se pensó que los vectores LV requerían aproximadamente 300 pb del gen Gag en esta región. Actualmente, esta secuencia Gag se ha reducido a solo 40 pb (Figura 1). El elemento sensible a Rev (RRE) también se ha incluido para mejorar la eficiencia de la transferencia génica, aunque contiene remanentes Env circundantes. Se ha observado que el tracto central de polipurina (cPPT), que facilita la translocación nuclear de los complejos de preintegración, junto con la secuencia terminal central (CTS) involucrada en la separación de la transcriptasa inversa, mejora el título vírico (Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000). En realizaciones particulares, el cPPT presente en cualquiera de los casetes de expresión o vectores de suministro génico descritos en el presente documento comprende o consiste en la siguiente secuencia:

TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGT (SEQ. ID NO:2), o una secuencia que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad con SEQ ID NO:2.

La señal dNEF/PPT es esencial para la transcripción inversa, y su incorporación mejora significativamente la producción del vector LV.

Los vectores de terapia génica que encapsulan los casetes de polinucleótidos de la presente descripción pueden producirse usando una metodología estándar. Por ejemplo, en el caso de los viriones LV, un vector de expresión LV según la invención puede introducirse en una célula productora, seguido de la introducción de una construcción auxiliar LV, donde la construcción auxiliar incluye regiones codificantes LV que pueden expresarse en la célula productora y que complementan las funciones auxiliares LV ausentes en el vector LV. A esto le sigue la introducción de virus auxiliar y/o vectores adicionales en la célula productora, en donde el virus auxiliar y/o los vectores adicionales proporcionan funciones accesorias capaces de soportar la producción eficiente de virus LV. Las células productoras se cultivan entonces para producir LV. Estas etapas se llevan a cabo usando metodología estándar.

Se puede usar cualquier método adecuado de producción de partículas víricas para el suministro de los casetes de polinucleótidos objeto, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en los ejemplos que siguen. Cualquier concentración de partículas víricas adecuada para transducir eficazmente células de mamífero puede prepararse para poner en contacto células de mamífero in vitro o in vivo. Por ejemplo, las partículas víricas se pueden formular a una concentración de 108 genomas vectoriales por mL o más, por ejemplo, 5 x 108 genomas vectoriales por mL; 109 genomas vectoriales por mL; 5 x 109 genomas vectoriales por mL, 1010 genomas vectoriales por mL, 5 x 1010 genomas vectoriales por mL; 1011 genomas vectoriales por mL; 5 x 1011 genomas vectoriales por mL; 1012 genomas vectoriales por mL; 5 x 1012 genomas vectoriales por mL; 1013 genomas vectoriales por mL; 1,5 x 1013 genomas vectoriales por mL; 3 x 1013 genomas vectoriales por mL; 5 x 1013 genomas vectoriales por mL; 7,5 x 1013 genomas vectoriales por mL; 9 x 1013 genomas vectoriales por mL; 1 x 1014 genomas vectoriales por mL, 5 x 1014 genomas vectoriales por mL o más, pero generalmente no más de 1 x 1015 genomas vectoriales por mL.

En la preparación de las composiciones LV objetivo, puede emplearse cualquier célula hospedara para producir viriones LV, que incluyen, por ejemplo, células de mamífero (por ejemplo, células 293), células de insecto (por ejemplo, células SF9), microorganismos y levaduras. Las células hospedaras también pueden ser células de encapsidación en las que los genes rep y cap LV se mantienen de manera estable en la célula hospedara o las células productoras en las que el genoma vectorial LV se mantiene y encapsida de forma estable. Las células de encapsidación y productoras a modo de ejemplo derivan de células SF-9, 293, A549 o HeLa. Se purifican los vectores LV y se formulan usando técnicas habituales conocidas en la técnica.

En ciertas realizaciones, la presente invención incluye una célula que comprende un casete de expresión o un vector de suministro génico desvelado en el presente documento. En realizaciones relacionadas, la célula se transduce con un vector vírico que comprende un casete de expresión desvelado en el presente documento o tiene un casete de expresión desvelado en el presente documento integrado en el genoma de la célula. En ciertas realizaciones, la célula es una célula usada para producir un vector de suministro génico vírico. En otras realizaciones, la célula es una célula que se suministra a un sujeto para proporcionar al sujeto el producto génico codificado por el casete de expresión. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la célula es autóloga para el sujeto que se tratará o se obtuvo del sujeto que se tratará. En otras realizaciones, la célula es alógena para el sujeto que se tratará o se obtuvo de un donante distinto del sujeto que se tratará. En realizaciones particulares, la célula es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana. En ciertas realizaciones, la célula es un glóbulo sanguíneo, un eritrocito, una célula progenitora hematopoyética, una célula de la médula ósea, por ejemplo, una célula de la médula ósea de linaje reducido, una célula madre hematopoyética (por ejemplo, CD34+) o una célula progenitora hematopoyética diferenciada.

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un casete de polinucleótidos, un vector de suministro génico o una célula descrita en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. El casete polinucleotídico objeto, el vector de suministro génico o la célula se pueden combinar con vehículos, diluyentes y reactivos farmacéuticamente aceptables útiles en la preparación de una formulación que es en general segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para su uso en primates. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición de aerosol, gaseosos. Los ejemplos de dichos excipientes, vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, disoluciones de Ringer, disolución de dextrosa y 5 % de albúmina de suero humano. También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las formulaciones. Las disoluciones o suspensiones usadas para las formulaciones pueden incluir un diluyente estéril, tal como agua para inyectables, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; compuestos antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; detergentes, tales como Tween 20 para prevenir la agregación; y compuestos para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. En realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas son estériles.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen además disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles.

Las disoluciones estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, en caso de necesidad, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

En una realización, las composiciones se preparan con vehículos que protegerán el casete génico o el vector de expresión contra la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico.

Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales, oculares o parenterales en forma unitaria de administración para facilitar la administración y la uniformidad de la administración. Forma unitaria de administración, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como administraciones unitarias para el sujeto que se tratará; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de administración de la invención viene impuesta por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la preparación de composiciones, tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador, por ejemplo, jeringa, por ejemplo, una jeringa precargada, junto con instrucciones para su administración.

Las composiciones farmacéuticas de la invención engloban cualquier sal, éster o sal farmacéuticamente aceptable de dichos ésteres, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal que comprende un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o resto del mismo.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. Se conocen en la técnica una variedad de sales farmacéuticamente aceptables y se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17a edición, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, EE. UU., 1985 (y sus ediciones más recientes), en la "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3a edición, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, EE. UU., 2007, y en J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977). Además, para una revisión de sales adecuadas, consulte el Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use de Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002)

Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los metales usados como cationes comprenden sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Las aminas comprenden N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína (véase, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Las sales de adición de base de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de ácido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren de sus formas de sal respectivas en ciertas propiedades físicas, tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus ácidos libres respectivos para los fines de la presente invención.

El casete de polinucleótidos objeto, el vector de suministro génico, por ejemplo, virus recombinante (viriones) o célula (por ejemplo, transducida con un vector de suministro génico desvelado en el presente documento) puede incorporarse en composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes mamíferos, particularmente primates y más particularmente humanos. El casete de polinucleótidos objeto, el vector de suministro génico, por ejemplo, viriones, o la célula se pueden formular en vehículos acuosos no tóxicos, inertes, farmacéuticamente aceptables, preferiblemente a un pH que oscila desde 3 hasta 8, más preferiblemente oscila desde 6 hasta 8. Dichas composiciones estériles comprenderán el vector o virión que contiene el ácido nucleico que codifica la molécula terapéutica disuelta en un tampón acuoso que tiene un pH aceptable tras la reconstitución.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula, vector o virión desvelado en el presente documento mezclado con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, disolución salina, disolución salina tamponada con fosfato, fosfato y aminoácidos, polímeros, polioles, azúcares, amortiguadores, conservantes y otras proteínas. Aminoácidos, polímeros y azúcares y similares ejemplares son compuestos de octilfenoxipolietoxietanol, compuestos de monoestearato de polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitano, sacarosa, fructosa, dextrosa, maltosa, glucosa, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero bovino

o humano, citrato, acetato, soluciones de Ringer y Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno y glicol. Preferiblemente, esta formulación es estable durante al menos seis meses a 4°C.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento comprende un amortiguador, como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o fosfato sódico/sulfato de sodio, tampón tris, tampón glicina, agua estéril y otros tampones conocidos por los expertos en la técnica como los descritos por Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. El pH del tampón en el que la composición farmacéutica comprende el gen supresor de tumores contenido en el sistema de suministro de vectores adenovíricos puede estar en el intervalo de 6,5 a 7,75, preferiblemente de 7 a 7,5, y más preferiblemente de 7,2 a 7,4.

En ciertas realizaciones, los vectores víricos pueden formularse en cualquier dosis unitaria adecuada, que incluyen, sin limitación, 1 x 108 genomas vectoriales o más, por ejemplo, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 o 1 x 1013 genomas vectoriales o más, en ciertos casos, 1 x 1014 genomas vectoriales, pero generalmente no más de 4x1015 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es a lo sumo de 5 x 1015 genomas vectoriales, por ejemplo, 1 x 1014 genomas vectoriales o menos, por ejemplo, 1 x 1013, 1 x 1012, 1 x 1011, 1 x 1010 o 1 x 109 genomas vectoriales o menos, en ciertos casos 1 x 108 genomas vectoriales o menos, y normalmente no menos de 1 x 108 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es de 1 x 1010 a 1 x 1011 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es de 1 x 1010 a 3 x 1012 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es de 1 x 109 a 3 x 1013 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es de 1 x 108 a 3 x 1014 genomas vectoriales. En una realización, el intervalo es de aproximadamente 5 x 1010 a aproximadamente 1 x 1011 genomas vectoriales. En algunas realizaciones, el intervalo es de aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1010 genomas vectoriales.

En algunos casos, la dosis unitaria de una composición farmacéutica puede medirse usando una multiplicidad de infección (MOI). Por MOI se entiende la relación, o múltiplo, entre genomas vectoriales o víricos y las células a las que se puede administrar el ácido nucleico. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 106. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 105 -1 x 107. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 104-1 x 108. En algunos casos, los virus recombinantes de la divulgación son al menos aproximadamente de 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017 y 1 x 1018 m O i. En algunos casos, los virus recombinantes de esta divulgación son de 1 x 108 a 3 x 1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la divulgación son a lo sumo aproximadamente de 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017 y 1 x 1018 MOI. En algunas realizaciones, el intervalo es desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 400 MOI.

En algunos aspectos, la cantidad de composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1015 virus recombinantes, aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1014 virus recombinantes, aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 virus recombinantes, o aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 3 x 1012 virus recombinantes.

MÉTODOS

Como se divulga en el presente documento, los casetes de polinucleótidos y los vectores de suministro génico objeto, denominados en conjunto en el presente documento las "composiciones objeto", encuentran uso en la expresión de un transgén en células de un animal. Por ejemplo, las composiciones objeto se pueden usar en investigación, por ejemplo, para determinar el efecto que tiene el gen en la viabilidad y/o función celular. Como otro ejemplo, las composiciones objeto se pueden usar en medicina, por ejemplo, para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno. Por lo tanto, en algunos aspectos de la invención, se proporcionan métodos para la expresión de un gen en células, comprendiendo el método poner en contacto las células con una composición de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el contacto ocurre in vitro o ex vivo. En algunas realizaciones, el contacto ocurre in vivo, es decir, la composición objeto se administra a un sujeto.

Para los casos en los que las células de mamíferos deben ponerse en contacto in vitro o ex vivo con un casete de polinucleótidos objeto o un vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto, las células pueden ser de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, roedor (por ejemplo, ratones, ratas, jerbos, ardillas), conejo, felino, canino, cabra, ovino, cerdo, equino, bovino, primate, humano. Las células pueden ser de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a células y cultivos celulares que han derivado de un sujeto y se ha permitido que crezcan in vitro durante un número limitado de pases, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haberse sometido a pases 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no pasan suficientes veces por la etapa de crisis. Normalmente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pases in vitro.

Las realizaciones de la presente invención comprenden células de mamífero (por ejemplo, células CD34+) transducidas con un vector de suministro vírico, por ejemplo, un vector lentivírico que contiene el gen de piruvato cinasa de hígado humano y eritroide (PKLR). Por consiguiente, la presente invención incluye un método de transducción de una célula de mamífero, por ejemplo, una célula madre hematopoyética humana u otra célula descrita en el presente documento, que comprende poner en contacto la célula con un vector de suministro vírico, por ejemplo, un vector lentivírico, que comprende un casete de expresión descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, la célula se obtuvo previamente de un sujeto que se tratará, o de otro donante. En realizaciones particulares, el sujeto fue diagnosticado con PKD, y la célula se transduce con un LV que comprende un casete de expresión que codifica la piruvato cinasa, por ejemplo, una región codificante de RPK de codones optimizados o ADNc. Se entiende que los métodos desvelados, por ejemplo, los usados para suministrar un producto génico de la piruvato cinasa, por ejemplo, usando una secuencia de ADNc de coPRK, a un sujeto también se pueden usar para tratar anemia hemolítica y/o normalizar la diferenciación eritroide, aumentar el número de eritrocitos maduros funcionales, reducir la eritropoyesis extramedular, reducir la esplenomegalia y otros efectos secundarios de la anemia hemolítica o PKD.

Para promover la expresión del transgén, el casete de polinucleótidos objeto o el vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto se pondrá en contacto con las células durante aproximadamente 30 minutos a 24 horas o más, por ejemplo, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas. 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 24 horas, etc.

El casete de polinucleótidos objeto o el vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto puede proporcionarse a las células del sujeto una o más veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces, o más de tres veces, y se permitió que las células se incubaran con el (los) agente(s) durante cierta cantidad de tiempo después de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas, después de lo cual los medios se reemplazan con medios nuevos y las células se cultivan más. El contacto con las células puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y en cualquier condición de cultivo que promueva la supervivencia de las células. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que las células responden. Los factores de crecimiento, como se definen en el presente documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembranario. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.

Normalmente, se proporciona una cantidad eficaz de casete de polinucleótidos objeto o vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto para producir la expresión del transgén en células. Como se describe en otra parte del presente documento, la cantidad eficaz se puede determinar fácilmente de forma empírica, por ejemplo, detectando la presencia o los niveles de producto génico transgénico, detectando un efecto sobre la viabilidad o función de las células, etc. Normalmente, una cantidad de efecto del casete de polinucleótidos objeto o vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto promoverá una mayor expresión del transgén en células que la misma cantidad de un casete de polinucleótidos como se conoce en la técnica. Normalmente, la expresión se potenciará 2 veces o más con respecto a la expresión de un casete de polinucleótidos de referencia, o control, por ejemplo, como se conoce en la técnica, por ejemplo, 3 veces, 4 veces, o 5 veces o más, en algunos casos 10 veces, 20 veces o 50 veces o más, por ejemplo, 100 veces.

Para los casos en los que las células deben ponerse en contacto in vivo con un casete de polinucleótidos objeto o un vector de suministro génico que comprende un casete de polinucleótidos objeto, el sujeto puede ser cualquier mamífero, por ejemplo, roedor (por ejemplo, ratones, ratas, jerbos), conejo, felino, canino, cabra, ovino, cerdo, equino, bovino o primate. En una realización preferida adicional, el primate es un humano. En una realización adicional, las células son células CD34+.

Los métodos y las composiciones de la presente divulgación encuentran uso, por ejemplo, en el tratamiento de la deficiencia de piruvato cinasa.

En otra realización, la presente invención incluye un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de células transducidas con un vector de suministro génico, por ejemplo, un vector vírico, que expresa un producto génico terapéutico en las células. En realizaciones particulares, las células son autólogas para el sujeto. En ciertas realizaciones, las células son células eritroides, por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células progenitoras eritroides hematopoyéticas diferenciadas. En algunas realizaciones, la célula es una célula de la médula ósea, por ejemplo, una célula de la médula ósea de linaje reducido. En realizaciones particulares, el método se usa para tratar la PKD, y el vector vírico es un LV que comprende una construcción de expresión desvelada en el presente documento que comprende un promotor de PGK humana unido operativamente a un ADNc del gen PKLR humano de codones optimizados o secuencia codificante, y un Wpre mutado desvelado en el presente documento. En realizaciones particulares, las células se proporcionan al sujeto por vía parenteral, por ejemplo, por inyección intravenosa.

En otra realización, la presente invención incluye un método de tratamiento de la PKD en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de células madre autólogas C34+ transducidas con un vector lentivírico que expresa un ADNc de PKLR de codones optimizados en el células, en donde el vector lentivírico comprende un promotor de PGK humana unido operativamente al ADNc de PKLR humano de codones optimizados o secuencia codificante, y una secuencia de Wpre mutada desvelada en el presente documento. En realizaciones particulares, las células son células madre hematopoyéticas o células progenitoras eritroides hematopoyéticas diferenciadas, por ejemplo, células de la médula ósea. En realizaciones particulares, las células se proporcionan al sujeto por vía parenteral, por ejemplo, por inyección Intravenosa.

En otra realización, la presente invención proporciona un tratamiento de una enfermedad en un sujeto en necesidad el mismo, que comprende proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de un vector de suministro génico, por ejemplo, un vector vírico, que expresa un producto génico terapéutico en el sujeto. En realizaciones particulares, el método se usa para tratar la PKD, y el vector vírico es un LV que comprende una construcción de expresión desvelada en el presente documento que comprende un promotor de PGK humana unido operativamente a un ADNc del gen PKLR humano de codones optimizados o secuencia codificante, y un Wpre mutado desvelado en el presente documento. En realizaciones particulares, el vector de suministro génico se proporciona al sujeto por vía parenteral, por ejemplo, por inyección intravenosa.

En realizaciones particulares, las células o los vectores de suministro génico se proporcionan al sujeto en composiciones farmacéuticas.

En algunas realizaciones, los métodos objeto dan como resultado un beneficio terapéutico, por ejemplo, la prevención del desarrollo de un trastorno, la detención de la progresión de un trastorno, la inversión de la progresión de un trastorno, etc. En algunas realizaciones, el método objeto comprende la etapa de detectar que se ha logrado un beneficio terapéutico. El experto en la técnica apreciará que dichas medidas de eficacia terapéutica serán aplicables a la enfermedad particular que se está modificando, y reconocerá los métodos de detección apropiados para usar para medir la eficacia terapéutica.

Se espera que la expresión del transgén que usa el transgén objeto sea fuerte. En consecuencia, en algunos casos, la expresión del transgén, por ejemplo, como se detectó midiendo los niveles de producto génico, midiendo la eficacia terapéutica, etc., se puede observar dos meses o menos después de la administración, por ejemplo, 4, 3 o 2 semanas 0 menos después de la administración, por ejemplo, 1 semana después de la administración de la composición objeto. También se espera que la expresión del transgén persista con el tiempo. En consecuencia, en algunos casos, la expresión del transgén, por ejemplo, como se detectó midiendo los niveles del producto génico, midiendo la eficacia terapéutica, etc., se puede observar 2 meses o más después de la administración de la composición objetivo, por ejemplo, 4, 6, 8 o 10 meses o más, en algunos casos 1 año o más, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 años, en ciertos casos, más de 5 años.

En ciertas realizaciones, el método comprende la etapa de detectar la expresión del transgén en las células o en el sujeto, en donde la expresión se potencia con respecto a la expresión de un casete de polinucleótidos que no comprende el uno o más elementos mejorados de la presente divulgación. Normalmente, la expresión se potenciará 2 veces o más con respecto a la expresión de una referencia, es decir, un casete de polinucleótidos de control, por ejemplo, como se conoce en la técnica, por ejemplo, 3 veces, 4 veces o 5 veces o más, en algunos casos 10 veces, 20 veces o 50 veces o más, por ejemplo, 100 veces, como se demuestra, por ejemplo, por detección temprana, de niveles más altos de producto genético, un impacto funcional más fuerte en las células, etc.

Normalmente, si la composición objeto es un LV que comprende el casete de polinucleótidos objeto de la presente divulgación, una cantidad efectiva para lograr un cambio será de aproximadamente 1 x 108 genomas vectoriales o más, en algunos casos 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 o 1 x 1013 genomas vectoriales o más, en ciertos casos, 1 x 1014 genomas vectoriales o más, y generalmente no más de 1 x 1015 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se suministra es a lo sumo de 1 x 1015 genomas vectoriales, por ejemplo, 1 x 1014 genomas vectoriales o menos, por ejemplo, 1 x 1013, 1 x 1012, 1 x 1011, 1 x 1010, o 1 x 109 genomas vectoriales o menos, en ciertos casos 1 x 108 genomas vectoriales, y normalmente no menos de 1 x 108 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administra es de 1 x 1010 a 1 x 1011 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administra es de 1 x 1010 a 3 x 1012 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administra es de 1 x 109 a 3 x 1013 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administra es de 1 x 108 a 3 x 1014 genomas vectoriales.

En algunos casos, la cantidad de composición farmacéutica que se va a administrar se puede medir usando una multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, la MOI puede referirse a la relación, o múltiplo, entre genomas vectoriales o víricos y las células a las que se puede administrar el nucleico. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 106. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 105-1 x 107. En algunos casos, la MOI puede ser 1 x 104 -1 x 108. En algunos casos, los virus recombinantes de la divulgación son al menos aproximadamente de 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017 y 1 x 1018 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la divulgación son 1 x 108 a 3 x 1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la divulgación son al menos aproximadamente 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014, 1 x 1015, 1 x 1016, 1 x 1017 y 1 x 1018 MOI.

En algunos aspectos, la cantidad de composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1015 partículas de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1014 partículas de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1013 partículas de virus recombinantes, o aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 3 x 1012 partículas de virus recombinantes.

Se puede administrar al mamífero cualquier número total de partículas víricas adecuadas para proporcionar la transducción apropiada de células para conferir el efecto deseado o tratar la enfermedad. En varias realizaciones preferidas, se inyectan al menos 108; 5 x 108; 109; 5 x 109, 1010, 5 x 1010, 1011, 5 x 1011; 1012; 5 x 1012; 1013; 1,5 x 1013; 3 x 1013; 5 x 1013; 7,5 x 1013; 9 x 1013; 1 x 1014 partículas víricas o 5 x 1014 partículas víricas o más, pero normalmente no más de 1 x 1015 partículas víricas. Se puede hacer cualquier número adecuado de administraciones del vector al mamífero o al ojo de primate. En una realización, los métodos comprenden una administración única; en otras realizaciones, se realizan múltiples administraciones con el tiempo según lo considere apropiado un médico clínico. En algunas realizaciones, se requieren al menos 2 x 108 VG/mL de 5 x 105 células/mL en una administración única (transducción de 24 horas) para dar lugar a altas eficiencias de transducción.

Las dosis individuales no son normalmente menores que una cantidad requerida para producir un efecto medible en el sujeto, y pueden determinarse basándose en la farmacocinética y la farmacología para la absorción, distribución, metabolismo y excreción ("ADME") de la composición objeto o sus subproductos y, por lo tanto, se basa en la disposición de la composición en el sujeto. Esto incluye la consideración de la vía de administración, así como la cantidad de dosis. Las cantidades eficaces de la dosis y/o la pauta posológica pueden determinarse fácilmente de forma empírica a partir de ensayos preclínicos, de ensayos de seguridad y de aumento y de intervalo de dosis, relaciones individuales de médico-paciente, así como de ensayos in vitro e in vivo, tales como los descritos en el presente documento e ilustrados en los ejemplos.

Varios aspectos de la invención se describen en el presente documento con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de la invención. Sin embargo, un técnico habitual en la técnica relevante reconocerá fácilmente que la invención puede ponerse en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente invención no está limitada por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes órdenes y/o concurrentemente con otros actos o eventos. Además, no se requiere que todos los actos o eventos ilustrados implementen una metodología según la presente invención.

Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de dicha terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la descripción de elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".

Las publicaciones expuestas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar confirmación independiente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo realizar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cerca de la atmosférica.

Métodos experimentales

Vectores y producción de sobrenadante lentivírico. Se generaron los LV como se describe en el presente documento. Se diseñó la secuencia de coRPK usando el software GeneArt® para aumentar el contenido de GC de la secuencia y evitar los sitios de corte y empalme crípticos. Se desarrollaron los vectores utilizando la construcción pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-Wpre* como esqueleto, proporcionada generosamente por el Dr. Naldini (HSR-TIGET, San Raffaele Telethon Institute, Milán, Italia). Se prepararon las reservas vectoriales de LV pseudotipados VSV-G mediante transfección mediada por fosfato de calcio de plásmido 3 en células 293T (ATCC: CRL-1573, Rockeville, MD, EE. UU.), como se describió anteriormente [Follenzi A, et al. (2000). Nat Genet 25: 217-222], Se determinaron los títulos de LV infecciosos en células HT1080 (ATCC: CCL-121) mediante qPCR como se describe en otra parte [Charrier S, et al. (2005). Gene Ther 12: 597-606]. Se obtuvieron de forma habitual reservas lentivíricas de 107-108 partículas víricas (pv)/mL de títulos.

Purificación y transducción de HSC murinas. Se recogieron MO de ratones con PKD de 8-14 semanas de edad de los huesos de las patas y se purificaron las células de linaje negativo (Lin-) usando el kit de agotamiento de células Lin-(Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania), obteniéndose una pureza del 70-90 %. Se estimularon previamente las células Lin- con 100 ng/mL de IL-11 humana recombinante (Peprotech EC Ltd., Londres, Reino Unido) y 100 ng/mL de SCF murino recombinante (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) en medio IMDM-Glutamax complementado con 20 % de FBS y 0,5 % de antibióticos (50 U/mL de penicilina y 50 pg/mL de estreptomicina, (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) durante 24 h, y luego se transdujeron con EGFp o coRPK que portan LV en dos ciclos de transducción a MOI de 1-10 pv/célula. Cada transducción se llevó a cabo durante 24 h en presencia de las citocinas mencionadas anteriormente en placas previamente recubiertas con el fragmento de fibronectina CH-296 (2 pg/cm2; Retronectin, TakaraShuzo, Otsu, Japón) durante la noche a 4 °C.

Supervivencia de RBC in vivo. A los ratones trasplantados que portaban el transgén coRPK se les inyectó tres inyecciones intravenosas consecutivas (separadas 12 horas) de sal sódica del éster de 3-sulfo-N-hidroxisuccinimidabiotina (50 mg/kg) (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Doce horas después de la última inyección, se extrajo sangre de la vena de la cola y se marcó con 2 pg/mL de Ter119-PE anti-ratón (BD Bioscience, San José, CA) y estreptavidlna-FITC (50 pg/mL, BD Biosciences, San José, CA) durante 30 min a 4 °C. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo EPICS XL (Beckman Coulter, Brea, CA) cada 2-4 días durante 40 días después de la inyección. La cinética de supervivencia de RBC se midió por el porcentaje de células biotiniladas dentro de la población total de RBC.

Ensayo de CFC. Se realizó el ensayo de CFC en MO y bazo de ratones de control y trasplantados según el procedimiento del fabricante del medio Methocult GF M3434 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá). Se recogieron las células de MO en diferentes momentos después del trasplante de todos los grupos de ratones, y se puntuaron las UFC (grupos de 30 o más células) 7 días después de la siembra en un microscopio Nikon Diaphot-TMD.

Identificación de linajes hematopoyéticos. Se obtuvieron CMSP de la vena de la cola de los animales trasplantados y se marcaron con un panel de anticuerpos para detectar diferentes células hematopoyéticas. Se detectaron las células mieloides con anticuerpos biotinilados anti-GR-1 y anti-Mac-1 (BD Bioscience, San José, CA, 5 gg/mL), mientras que se detectaron las células linfoides utilizando anticuerpos anti-CD3-PE para los linfocitos T, y anticuerpos anti-B220-PE y anti-B220-PECy5 para los linfocitos B (BD Bioscience, San José, CA, 10 gg/mL), junto con anticuerpo secundario SAV-TRC (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se analizaron las muestras en un citómetro Fortessa BD LSR (BD Bioscience, San José, CA, EE. UU.) añadiendo DAPI (Boehringer, Ingelheim, Alemania, 2 gg/mL) para excluir las células muertas.

Estudios estructurales e histológicos. Se recogieron, se fotografiaron y se pesaron en balanzas de precisión los bazos para determinar la presencia de esplenomegalia. Se realizaron estudios histológicos en cortes de bazo e hígado obtenidos mediante métodos histológicos convencionales y se tiñeron con hematoxilina (hematoxilina Gill-2, Thermo, Pittsburgh, EE. UU.) y eosina (eosina alcohólica, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). También se estudiaron los depósitos de hierro en el bazo mediante tinción con azul de Prusia o de Perls (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se examinaron todos los cortes usando un microscopio óptico Olympus BX40 y se fotografiaron con una cámara Olympus DP21, con un aumento final de 100x o 200x.

Diferenciación eritroide. Se usó análisis de citometría de flujo de las intensidades de los marcadores Ter119 y CD71 en la MO y el bazo para identificar las diferentes subpoblaciones eritroides como se describe en otra parte [Socolovsky M, et al. (2001). Blood 98: 3261 -3273] usando 4 gg/mL de anticuerpo anti-ratón Ter119-PE (BD Bioscience, San José, CA,), 10 gg/mL de anticuerpo anti-CD71 biotinilado (BD Bioscience, San José, CA) y estreptavidina tricolor (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se analizaron las células en un citómetro de flujo EPICS XL (Beckman Coulter, Brea, CA) usando yoduro de propidio (IP, 2 gg/mL) para detectar células vivas.

Cuantificación de provirus. Se realizó la detección y cuantificación del provirus integrado por célula usando cebadores complementarios a la secuencia provírica de encapsidación (^ ) y al gen de mantenimiento Titin de ratón. Se recogieron periódicamente muestras de MO total y sangre periférica, y se aisló el ADN genómico de células nucleadas usando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Venlo, Limburg, Países Bajos). Se amplificaron de veinte a 50 ng de ADN genómico (ADNg) mediante qPCR múltiple usando el sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y los cebadores y sondas descritos previamente [Charrier S, et al. (2011). Gene Ther 18: 479-487].

Quimerismo. Se cuantificó la presencia de células donantes por qPCR detectando el gen SRY del cromosoma Y y el gen de mantenimiento de p-actina de ratón. Se usaron los cebadores y sondas descritos anteriormente [Navarro S et al. (2006). Mol Ther 14: 525-535] y se amplificó el ADN genómico de SP de ratones trasplantados utilizando el sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se prepararon curvas estándar usando extractos de ADNg de muestras que contenían del 0 % al 100 % de células de MO de mezclas de ratón macho/hembra y se calculó el quimerismo como: % de injerto de donante = 100 x 2(CtpAct - CtSRY).

Procedimiento de LAM-PCR. Para identificar los sitios de integración de vectores, se amplificaron las uniones del genoma LTR del vector 3' mediante LAM-PCR siguiendo el método publicado por Schmidt et al. 2007 [Nat Methods 4: 1051-1057], Se realizó la amplificación lineal inicial (100 ciclos) usando cebadores específicos de LTR biotinilados y hasta 100 ng de ADNg como molde. Se purificaron los productos de amplificación lineal usando perlas magnéticas de estreptavidina y seguido de síntesis de cadena complementaria, digestión paralela con 2 enzimas de restricción diferentes (Tsp509l y HpyCH4IV) y dos reacciones de ligación usando casetes conectores complementarios a los extremos dejados por el corte de la enzima. Se amplificaron los fragmentos generados mediante dos etapas de PCR exponenciales adicionales. Se separaron y se cuantificaron los productos de LAM-PCR mediante electroforesis en gel en un sistema automatizado MultiNA (Shimadzu).

Configuración de productos de LAM-PCR para la secuenciación de MiSeq de lllumina. Siguiendo el método publicado por Parazynski et al. [Paruzynski A, et al. (2010). Nat Protoc 5: 1379-1395], se volvieron a amplificar 40 ng de los segundos productos de PCR exponencial generados por las enzimas Tsp509I y HpyCH4ÍV usando cebadores de fusión que contienen secuencias específicas que permiten una secuenciación final emparejada en un secuenciador MiSeq de lllumina. Se adaptaron las muestras de LAM-PCR para la pirosecuenciación 454 mediante PCR de fusión para añadir los adaptadores 454 GS-FLX de Roche: se añadió el adaptador A más un código de barras de 8 nucleótidos al extremo LTR del amplicón de LAM-PCR; se añadió el adaptador B al lado del casete conector. En la orientación 5'-3', el amplicón final estuvo compuesto de la siguiente manera: adaptador A, código de barras, secuencia LTR, secuencia de genoma desconocida, secuencia de casete conector y cebador B. Se procesaron y cuantificaron los productos de PCR de cebador de fusión purificados en un sistema de electroforesis automático MultiNA y se agruparon para obtener una biblioteca equimolar final de 10 nM. Se volvió a cuantificar la biblioteca final usando un kit de cuantificación de bibliotecas KAPA para la plataforma de secuenciación lllumina (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) en un sistema de PCR en tiempo real Viia7 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), obteniendo una concentración estimada de 16,35 nM. Finalmente, se secuenciaron las bibliotecas usando el kit de reactivos MiSeq de lllumina.

Análisis bioinformático. Para extraer los sitios de integración (IS) de vectores de una plataforma de secuenciación de alto rendimiento, tanto 454 de Roche como MiSeq/HiSeq de lllumina, se diseñó una tubería que toma como entrada los datos de la fila (normalmente en formato de archivo FastQ), que proporciona la lista de IS fiable y el gen más cercano. Los análisis de nivel superior para la cuantificación de la abundancia clónica y el enriquecimiento de ontología de genes se realizaron usando Excel, GraphPad Prism (TM) y las herramientas disponibles en línea.

Procesamiento de datos NGS y uso de tubería . La etapa del procesamiento de datos de NGS se ocupa de la gestión de datos de alto rendimiento de las plataformas de secuenciación MiSeq de lllumina y tiene como objetivo identificar el IS en el que todas las lecturas de secuencias válidas están alineadas con el genoma de referencia. El procesamiento de datos comprende dos actividades principales: 1. Inspección y análisis de calidad de los datos, en el que se recortan las secuencias de vectores lentivíricos y otros contaminantes. 2. Identificación del sitio de integración, en la que todas las lecturas de secuencias válidas se alinean con el genoma de referencia y se recuperan los IS válidos.

Análisis de calidad de los datos. Para identificar el IS a partir de los datos brutos de MiSeq de lllumina, se desarrolló una tubería de bioinformática. Los productos estándar de LAM-PCR contienen una secuencia LTR, una secuencia genómica humana flanqueante y una secuencia de casete conector (LC). La tecnología 459 permitió la recuperación de secuencias de LAM-PCR con una longitud que oscila de 10 pb a 900 pb. Se obtuvieron resultados similares de las lecturas de los extremos emparejados de MiSeq de lllumina. Estos límites de longitud son parámetros importantes a considerar en el proceso de análisis de calidad, ya que afectan tanto al procedimiento de alineación posterior como al algoritmo de la identificación de componentes del vector. Se descartaron las secuencias demasiado cortas para alinearse correctamente con el gen de referencia, así como las que excedían el tamaño máximo alcanzable con la tecnología NSG para evitar perder parte o la totalidad de la secuencia LC. Una vez que finaliza la tubería para cada grupo, se recopilaron todos los sitios de integración tanto en archivos (archivados en el almacenamiento de archivos adjuntos de la red TIGET -NAS-) como en la base de datos interna, y se mantuvieron en un servidor de almacenamiento que realiza un seguimiento de las copias modificadas.

Identificación del sitio de integración. Para identificar sitios de integración únicos y extraer el archivo de Excel con todos los IS en filas y cada muestra en columnas (matriz IS) con las anotaciones genéticas más cercanas, los presentes inventores realizaron las siguientes etapas: 1. Creación de la matriz IS usando el programa llamado create_matrix, que permite la detección de colisiones entre proyectos. Este programa producirá un archivo separado por tabulaciones (TSV); 2. Anotación del archivo de matriz IS usando el programa annotate_bed, que se llamará de la siguiente manera para cada grupo que usa el archivo TSV de entrada: awk ’{print "chr"$1"\t"$2"\t"$2}’ TSV_FILE | tailn 2 > TSV_FILE.bed; annotate bed-a /opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene.TIGETgtf-b TSV_FILE.bed -o TSV_FILE.annotated.bed; 3. Importación del archivo de anotaciones y de matriz en una nueva hoja de cálculo de Excel, en el presente documento llamado XLS.

Detección de colisiones. Para obtener un conjunto de datos fiable de IS de cada ratón trasplantado, filtramos los presentes inventores filtraron los datos de posibles contaminaciones/colisiones y de positivos falsos basados en los recuentos de secuencias. Se requirió una etapa adicional de normalización de datos para combinar los sitios de integración resultantes de diferentes experimentos.

El término "colisión" se usa para identificar la presencia de IS idéntico en muestras independientes. En el entorno experimental de los presentes inventores, la integración del vector en la misma posición genómica en diferentes células es un evento de probabilidad muy baja. Por lo tanto, la detección de IS idénticos en muestras independientes deriva probablemente de la contaminación, que puede ocurrir en diferentes etapas de los procedimientos de laboratorio en húmedo (purificación de muestras, extracción de ADN, LAM-PCR y secuenciación). Aunque nuestra tubería de trabajo está diseñada para minimizar la aparición de contactos entre muestras, el análisis de alto rendimiento de los IS conlleva intrínsecamente un cierto grado de contaminación de fondo. La identificación del grado de contaminación entre las muestras es crucial también porque la recuperación del mismo IS en diferentes muestras obtenidas del mismo ratón se usa en etapas posteriores para sacar una conclusión sobre las propiedades biológicas de las células hematopoyéticas marcadas por el vector (es decir, potencial de multi-linaje y actividad clonogénica sostenida). Por lo tanto, deben poder distinguir la aparición real del mismo IS en diferentes muestras (del mismo ratón) de una contaminación/colisión. Para abordar estos problemas, evaluamos el grado del IS compartido entre las muestras derivadas de diferentes elementos de prueba y ratones como una forma de medir el grado de colisión en sus análisis y luego diseñaron reglas para descartar de cada conjunto de datos del ratón los que se pueden atribuir a la colisión y minimizar la probabilidad de puntuar positivos falsos al buscar IS compartido entre muestras del mismo mouse. Diseñaron un proceso de detección de colisiones que permitía la validación de cada locus de integración. El resultado global debe ser que, dado el conjunto I de loci de integración, en caso de clasificación de un locus de integración i en I como colisión, i se descarta de I. Aplicamos el proceso de detección de colisión entre 3 grupos de trasplantes independientes: 1. coPKR170: Los ratones del ensayo 1 se sacrificaron a los 170 días después del trasplante con células Lin- transducidas con el vector LV que expresa coRPK (coRPK 1-3). 2. EGFP: Los ratones del ensayo 2 trasplantados con células Lin- que portan el vector LV que expresa EGFP (EGFP 1-6). 3. coPKR-TC: Los ratones del ensayo 2 trasplantados con células Lin- transducidas con el vector LV que expresa coPKR (coRPK 1 -14), cuya sangre y MO se analizaron en diferentes momentos, que incluyen los receptores secundarios trasplantados con una mezcla de MO de un subgrupo de ratones trasplantados primarios (coRPK 11-14).

Cada IS idéntico tiene diferentes lecturas de secuencias (recuento de secuencia) entre los diferentes ratones. Se pueden usar los recuentos de secuencias para determinar si las muestras de un ratón contaminaron las muestras de los otros ratones según el criterio de abundancia. En la justificación de los presentes inventores, una integración encontrada en dos ratones se asignará al ratón que muestre la mayor abundancia, mientras que en el otro ratón se considerará un contaminante. Por lo tanto, podríamos identificar un umbral de recuento de secuencia diferencial que permita asignar una colisión dada a un ratón y eliminar de los demás. Recuperaron el valor de umbral de sus datos obteniendo un valor de 10, lo que significa que para cada IS, entre todas las TI, si un IS tiene un valor de abundancia (relación de recuento de secuencia porcentual) 10 veces más bajo que el valor de abundancia más alto (recuento de secuencia porcentual) de las otras Tl, entonces se descarta de la T i actual. Aplicaron estas reglas entre la TI y los grupos seleccionados, y se usaron archivos de Excel para calcular la detección de colisiones mediante la aplicación de las siguientes reglas (aquí se detallan para el filtrado de TI, pero que también se extienden al filtrado de grupos): 1. Aislar cada TI, agrupar todas las muestras de la misma TI sumando los recuentos de secuencia. 2. Para las tres TI obtenidas, para cada IS, calcular la relación porcentual de la secuencia IS frente a la suma total de lecturas para la TI.

3. Luego, aplicar la siguiente regla para calcular la etapa de decisión con el umbral de 10 que permitió asignar cada IS a una TI fiable.

Una vez que se detectó la eliminación de un IS, las lecturas de ese IS se eliminaron del grupo para que ya no se asignaran a ese grupo. El filtro descrito anteriormente se aplicó entre los ratones trasplantados con diferentes poblaciones de células transducidas ex vivo (una cohorte de ratones que expresan EGFP del ensayo 2 y dos cohortes de ratones coPKR que pertenecen a dos experimentos de trasplante independientes). Además, para el grupo coPKR-TC (ensayo 2), el método de filtro mencionado anteriormente se modificó de dos maneras: a) Para resaltar mejor el intercambio de integraciones entre momentos en el contexto del análisis de abundancia clonal, añadieron la siguiente regla: si se comparte una integración entre uno o más ratones, entonces la integración se mantendrá para todos los momentos, incluso si el recuento de secuencias es inferior al 10 % del recuento de secuencia máximo entre los ratones; b) Para las relaciones de seguimiento de linaje, aplicaron un filtro más riguroso al eliminar el IS con un recuento de secuencia inferior a 3 y el filtro de recuento de secuencia del 10 % para compartir entre momentos. Lo que significa que una integración compartida entre dos momentos se mantendrá o descartará solo si es más o menos que el otro, respectivamente.

Análisis de ontología de genes. Todos los análisis de ontología de genes se realizaron usando el software GREAT en línea (http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/). La página web permite cargar las coordenadas genómicas de las integraciones de cada conjunto de datos y calcula los niveles de enriquecimiento en el conjunto de datos probado mediante la correlación de la información de posición (basada en el análisis de distribución binomial para los cálculos del valor p) y la función anotada de los genes más cercanos a los sitios de integración (basados en el análisis de distribución hipergeométrica para cálculos del valor p) [Groeschel S, et al. (2011). J Inherit Metab Dis 34: 1095 1102]. Los procesos biológicos y las funciones moleculares de la base de datos de Gene Ontology se eligieron para el análisis de enriquecimiento. Solo se consideraron las clases de genes con una tasa de descubrimiento falso <0,05 para ambos análisis estadísticos (Fig. 20).

Almacenamiento de datos. Todos los datos, tanto los datos de la fila como los resultados, se almacenan en el almacenamiento de archivos adjuntos (NAS) de la red TIGET en la carpeta raíz, en la que están disponibles todas las alineaciones de la tubería, así como la matriz de abundancia y las gráficas. El almacenamiento NAS está protegido por políticas de autenticación y autorización, y se basó en una infraestructura fiable y escalable usando una matriz redundante de discos RAID 5, y se realiza una copia de seguridad en el software CrashPlan de los presentes inventores registrado en TIGET.

Ejemplo 1

El vector lentivírico terapéutico PGK-coRPK conduce a una corrección estable y a largo plazo del fenotipo anémico en ratones con PKD corregidos genéticamente.

Se ensayó la eficacia in vivo del LV PGK-coRPK (Fig. 2a) mediante transducción y trasplante de células de MO de linaje reducido (células Lin-) de ratones con PKD (Fig. 2b). La Fig. 2a es una representación esquemática de los vectores lentivíricos autoinactivadores usados en todos los experimentos de terapia génica que albergan el promotor de PGK humana que regula la expresión del transgén EGFP en el vector de control (diagrama superior) o la expresión de una secuencia de codones optimizados de ADNc del gen PKLR (coRPK) en el vector terapéutico (diagrama inferior). La secuencia de coRPK mostró una homología del 80,4 % con el ADNc de PKLR humano y una homología del 76,5 % con el ADNc de Pklr de ratón, sin cambios en la secuencia de aminoácidos. La Figura 2b es un esquema del protocolo de terapia génica realizado para abordar la funcionalidad del vector lentivírico PGK-coRPK desarrollado. La corrección del fenotipo de PKD se estudió durante 4 a 9 meses después del trasplante en SP y MO mediante análisis hematológico y perfiles metabólicos. El análisis de integración se realizó en diferentes tejidos y momentos de todos los ratones para abordar la seguridad del vector LV. 280 días después del trasplante, se trasplantó nuevamente la MO total de ratones trasplantados primarios que portaban el transgén coRPK en ratonas con PKD letalmente irradiadas (receptores secundarios) para probar la estabilidad y seguridad del injerto. Los ratones con PKD irradiados letalmente trasplantados con células deficientes transducidas con el LV coRPK mostraron una mejora significativa en todos los parámetros de eritroides sanguíneos probados cuando se compararon con los compañeros de camada con PKD no trasplantados o con ratones trasplantados con células transducidas con un LV EGFP (Fig. 3 y Tabla 2).

Tabla 2. Variables hematológicas registradas 140 días después del trasplante en sangre periférica.

Grupo HGB (g/dL) HTC (%) MCV MCH (pg)

Sano (n=5) 14,64 ± 0,99 36,15 ± 2,64 38,20 ± 0,86 15,44 ± 0,21

PKD (n=9) 9,70 ± 0,55 28,91 ± 1,53 51,56 ± 0,50 17,23 ± 0,31

EGFP (n=8) 6,81 ± 0,68 21,32 ± 1,51 49,13 ± 0,72 15,46 ± 0,62

coRPK (n=17) 10,67 ± 0,53* 31,09 ± 1,45* 45,65 ± 0,84 15,35 ± 0,53

2° coRPK (n=4) 12,40 ± 0,67** 34,11 ± 1,49* 46,25 ± 0,85 16,78 ± 0,23

Los datos representan la media ± EEM y se analizaron estadísticamente en comparación con los ratones que expresan EGFP usando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. *p <0,05; **p <0,01.

Los recuentos de RBC aumentaron ya a los 40 días después del trasplante (Fig. 3a) y la reticulocitosis constitutiva, que es uno de los signos más comunes de la PKD, se revirtió significativamente en ratones portadores del transgén PGK-coRPK, alcanzando niveles cercanos a los observados en controles sanos durante al menos 9 meses después del trasplante (Fig. 3b). Por el contrario, los animales con PKD trasplantados con células transducidas con LV EGFP presentaron anemia y reticulocitosis notable en paralelo con los ratones con PKD en todos los momentos analizados. Los niveles de hemoglobina (HGB), índice de hematocrito (HTC), volumen corpuscular medio (MCV) y valores de hemoglobina corpuscular media (MCH) también se corrigieron en ratones trasplantados con células corregidas de manera lentivírica cuando se compararon con compañeros de camada con PKD no trasplantados (Tabla 2). Esta corrección hematológica se logró con un 63,66 ± 4,45 % de quimerismo donante y las eficacias de transducción que oscilaron entre el 60 % y el 90 % (Tabla 3).

Tabla 3. Parámetros moleculares relevantes en ratones trasplantados con células modificadas genéticamente.

% de Número de copias de vector % de quimerismo Ensayo Grupos (NCPV/célula) transducción del donante

WBC MO total UFC UFC de Células de provirus+ SP SRY+

1 EGFP (n=2) 0,83 ± 0,05 0,42 ± 0,03 0,42 ± 0,00 57,73 ± 12,28 n.d.

MOI

coRPK (n=3) 0,76 ± 0,28 0,58 ± 0,34 3,07 ± 0,76 91,08 ± 3,67 n.d.

1-4

2 EGFP (n=6) 0,56 ± 0,50 0,19 ± 1,29 3,93 ± 0,98 92,32 ± 7,68 61,82 ± 3,61

MOI coRPK (n=14) 0,65 ± 0,08 0,99 ± 0,13 1,89 ± 0,42 62,06 ± 11,73 63,66 ± 4,45

10 2° coRPK

_(n=4)0,44 ± 0,08 n.d. n.d. 63,15 ± 0,31a 62,89 ± 5,61

Los datos representan la media ± EEM, n.d, no determinado. a porcentaje de transducción estimado obtenido por interpolación en la regresión lineal construida a partir del experimento 1 (eje X: NCV/WBC, eje Y: % de UFC de provirus+).

Las células transducidas mostraron en promedio 1,65 ± 0,08 copias del vector integradas por célula, lo que indica que el vector LV PGK-coRPK proporcionó suficiente expresión transgénica de RPK humana para revertir la anemia hemolítica. Sorprendentemente, la expresión del transgén coRPK condujo a una prolongación de la semivida de las células eritroides cuando se comparó con los ratones con PKD no trasplantados (Fig. 3c, d). En promedio, los ratones con PKD mostraron una semivida de RBC de 19 días, mientras que en los ratones corregidos genéticamente se prolongó hasta 25 días (prolongación de de 6 días), alcanzando valores cercanos a la semivida de RBC natural (Fig. 3d). Por lo tanto, los RBC de los ratones que expresan coRPK mostraron una cinética de supervivencia intermedia entre los ratones de control sanos y deficientes (Fig. 3c), muy probablemente debido a que no se logró un quimerismo completo en estos animales (Tabla 3).

Nueve meses después del trasplante, los progenitores hematopoyéticos de receptores primarios fueron trasplantados a receptores secundarios que mantuvieron los niveles de injerto (62,89 ± 5,61 %) y NCV (1,44 ± 0,08 copias) (Tabla 3). Los receptores de trasplante secundarios mostraron una reconstitución hematopoyética multi-linaje hasta 5 meses después del trasplante (Fig. 4) y una mejora significativa en todos los parámetros eritroides de SP (Fig. 5 y Tabla 2). La Figura 4a es un diagrama de la estrategia de citometría de flujo usada para identificar los diferentes linajes hematopoyéticos marcando con anticuerpos CD3-PE, B220-PE, B220-PECy5, Gr1-biotina y Mac1-biotina más SAV-PE-Cy5. La Figura 4b representa gráficas de puntos y porcentajes representativos (Figura 4c) de cada linaje en SP 140 días después del trasplante. Las barras representan el porcentaje promedio ± EEM de los controles de ratones sanos (n = 2, barra negra) y con PKD (n = 2, barra gris) y los ratones trasplantados secundarios que expresan el transgén terapéutico coRPK (n = 4, barra rayada). Además, las integraciones províricas se detectaron en progenitores hematopoyéticos diferenciados de manera diferente (Fig. 6a,b) y su número se mantuvo constante con el tiempo (Fig. 6c), lo que demuestra la estabilidad de la corrección genética y resalta la seguridad del LV PGK-coRPK. La Figura 6a muestra el número de copias del vector por célula en UFC de MO de ratones trasplantados individuales 120 a 170 días después del trasplante. También se muestran los porcentajes de transducción y de quimerismo. La Figura 6b muestra el número de copias de provirus en células de diferentes compartimentos hematopoyéticos. Las columnas representan el promedio ± EEM de los diferentes grupos de ratones trasplantados. La Figura 6c muestra la cinética de las integraciones províricas en células de MO de ratones que expresan EGFP trasplantados individuales (líneas grises) y ratones que llevan el transgén coRPK (líneas negras).

Ejemplo 2

La expresión de RPK derivada de lentivirus normaliza la diferenciación eritroide y permite la producción de eritrocitos maduros funcionales

Los ratones con PKD muestran una expansión característica del compartimiento eritroide causada por el mecanismo compensatorio de la eritropoyesis (Min-oo et al. 2004). El estudio del patrón de diferenciación eritroide en ratones trasplantados indicó que la expresión ectópica de RPK revirtió este mecanismo (Fig. 7a,b). Los ratones que expresan PKD y EGFP mostraron un predominio de precursores eritroides inmaduros (subpoblación I: proeritroblastos y subpoblación II: eritroblastos basófilos) en MO y bazo, y una notable disminución en las células eritroides tardías (población IV: reticulocitos y eritrocitos maduros), mientras que los ratones trasplantados con células transducidas con el LV coRPK mostraron una reducción significativa de los precursores eritroides inmaduros (subpoblaciones I y II) en MO y bazo, y un aumento significativo del último compartimiento eritroide (subpoblación IV) equivalente a ratones sanos (Fig. 7a,b). Además, a diferencia de los ratones que expresan PKD y EGFP, los portadores del transgén coRPK mostraron una reducción significativa de los niveles de eritropoyetina (Epo) en plasma (Fig. 7c). La Figura 8a muestra el total de UFC del bazo y la Figura 8b muestra la médula ósea 140 días después del trasplante. Los puntos representan el número de colonias por ratón analizado y las líneas representan el promedio ± EEM en cada grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. La normalización de la eritropoyesis en ratones con PKD tratados con el vector terapéutico se acompañó de una reducción del número esplénico del contenido de progenitores hasta niveles normales (Fig. 8a), aunque no se observaron cambios en el contenido de UFC de MO (Fig. 8b).

Ejemplo 3

El trasplante de células transducidas con el vector lentivírico coRPK revierte la eritropoyesis extramedular y la patología de los órganos

Debido a la destrucción activa de eritrocitos deficientes en RPK, los ratones que expresan PKD y EGFP presentaron esplenomegalia aguda con un aumento del peso y tamaño del bazo de más del 200 % en comparación con los controles sanos (Fig. 9a,b). También se observó una estructura desorganizada del tejido esplénico y la expansión de la pulpa roja del bazo en estos animales, lo que indica una eritropoyesis extramedular intensa también respaldada por la presencia de grupos de células eritroides en los cortes de hígado que expresan PKD y EGFP (Fig. 9c). Sorprendentemente, la expresión ectópica del transgén coRPK revirtió completamente la patología hepática y del bazo en ratones corregidos genéticamente, reduciendo las acumulaciones de RBC y normalizando la estructura y el tamaño histológico del bazo (Fig. 9). Además, los estudios histológicos revelaron la ausencia total de depósitos de hierro en el hígado de ratones corregidos genéticamente, mientras que los ratones con PKD del grupo no trasplantado o del grupo trasplantado con HSC transducidas con el vector portador de EGFP mostraron una intensa sobrecarga de hierro debido al proceso hemolítico continuo (Fig. 9c). En general, el trasplante de HSC corregidas genéticamente en ratones con PKD restableció el estado normal de la eritropoyesis y todos los efectos secundarios causados por la anemia hemolítica.

La expresión derivada de LV PGK-coRPK restaura la ruta de la glucólisis en RBC sin modificar el equilibrio metabólico de WBC.

A continuación, los presentes inventores realizaron un amplio análisis metabolómico de todos los ratones trasplantados y de control para estudiar la corrección funcional de la actividad enzimática de RPK. Siguiendo una estrategia de perfiles no dirigidos, observaron cambios significativos de los intermedios glucolíticos en RBC entre los diferentes grupos, identificando tres grandes grupos de patrones de metabolitos con distintas tendencias (Fig. 10a). Los RBC de ratones que expresan coRPK mostraron un aumento de los metabolitos del conjunto 1, similar a los controles sanos, pero diferente de los ratones trasplantados que portan el transgén EGFP. Del mismo modo, el conjunto 3 reflejó una tendencia reducida de metabolitos en ratones corregidos genéticamente similares a los ratones naturales y diferentes de los ratones que expresan EGFP. Sin embargo, el conjunto 2 del ensayo 1 no mostró diferencias en el perfil de metabolitos entre los grupos de ratones trasplantados (ratones que expresan EGFP y coRPK) (Fig. 10a). El perfil metabólico no dirigido también mostró que la modificación genética fue capaz de modificar algunos intermedios glucolíticos importantes, logrando un aumento en los niveles de ATP (Fig. 10b), ADP (Fig. 10c) y piruvato (Fig. 10d) en eritrocitos aislados de ratones trasplantados con HSC transducidas con LV PGK-coRPK. Teniendo en cuenta estas tendencias metabólicas, analizaron otros metabolitos ubicados más cerca de la reacción catalizada por PK usando un método de perfil dirigido. Los niveles del sustrato de PK directo, el fosfoenolpiruvato (PEP) (Fig. 10e) y el 3-fosfoglicerato (3-PG) (Fig. 10f), ubicados en el extremo 5' de la reacción catalizada por PK, se aproximaron a los de los ratones de control sanos. Los eritrocitos deficientes que expresan el transgén coRPK también produjeron un aumento de D-lactato (Fig. 10g), el producto final de la glucólisis anaerobia, cuando se compara con los ratones que expresan PKD y EGFP. Para probar si la compensación en los metabolitos glucolíticos fue el resultado de la normalización en la actividad de PK en eritrocitos maduros, midieron la actividad de esta enzima y la normalizaron en relación con la actividad de la hexocinasa para evitar la influencia de altas cantidades de reticulocitos en los animales deficientes. Se purificaron los RBC a través de una columna de celulosa para evitar la contaminación de la actividad de PK de los leucocitos. Se observó una compensación completa de la actividad de PK en los animales que expresan coRPK que alcanzan relaciones similares a las obtenidas de animales sanos naturales y de un voluntario donante de sangre sano normal (Fig. 11). La Figura 11a muestra la actividad de la piruvato cinasa, la Figura 11b muestra la actividad de la hexocinasa y la Figura 11c muestra la relación de las actividades enzimáticas de la piruvato cinasa y la hexocinasa en los RBC de ratones de control y ratones trasplantados con células transducidas. Se purificaron los RBC a partir de muestras de sangre a través de una columna de celulosa para evitar la contaminación de la actividad de PK de los leucocitos y se sometieron a una evaluación de la actividad enzimática. Barras negras, ratones sanos (n = 2); barras blancas, ratones trasplantados con células transducidas con el vector que expresa EGFP (n = 3); barras rayadas, ratones trasplantados con células transducidas con el vector que expresa coRPK (n = 3). Las barras a cuadros representan los valores de un voluntario sano (n = 1). Los datos representan el promedio ± EEM de cada grupo.

El análisis de componentes principales mostró que el patrón de metabolitos de RBC era diferente dependiendo del grupo y notablemente diferente al perfil de WBC (Fig. 12a). Por el contrario, los subgrupos de WBC se agruparon con muy poca diferencia entre los grupos, lo que indica que no hay cambios en el equilibrio metabólico de los leucocitos cuando se expresa el coRPK ectópico (Fig. 12a). Además, los cambios específicos de metabolitos observados en el perfil no dirigido de RBC no estaban presentes en los WBC (Fig. 12b-d).

Ejemplo 5

Las células transducidas con LV PGK-coRPK producen la reconstitución hematopoyética policlonal sin evidencia de genotoxicidad del vector.

Se analizó el perfil de integración de los LV que portan o el transgén coRPK o el transgén EGFP en ratones trasplantados. Como resultado del perfil de integración hologenómico de LV, cada inserción crea una marca genética única que se puede usar para seguir el comportamiento clonal en células transducidas individuales. Se obtuvo ADN genómico (ADNg) de WBC y de células de MO y de ratones trasplantados primarios y secundarios, así como de agrupamientos de células transducidas antes del trasplante (células Lin-). Se usó PCR mediada por amplificación lineal (LAM-PCR) (Fig. 13 y 14) para amplificar las uniones vector/genoma, y para identificar los sitios de inserción del vector (IS). La Figura 13 demuestra que los sitios de integración de vectores se identificaron mediante la amplificación por LAM-PCR de las uniones de genoma LTR del vector 3'. Se usó un sistema automatizado MultiNA, que genera un patrón caracterizado por varias bandas. La banda de control interno (IC) Tsp509I derivada del esqueleto del vector se indica mediante una flecha. La Figura 14 demuestra que los sitios de integración de vectores se identificaron mediante la amplificación por LAM-PCR de las uniones de genoma LTR del vector 3'. Se usó un sistema automatizado MultiNA, que genera un patrón caracterizado por varias bandas. La banda de control interno (IC) HpyCH4IV5 derivada del esqueleto del vector se indica mediante una flecha.

Los productos de PCR se secuenciaron por la plataforma MiSeq de lllumina y las secuencias obtenidas se mapearon en el genoma del ratón mediante una tubería de bioinformática y se filtraron para las colisiones como se describe en la sección anterior de Métodos (Fig. 15). La Figura 15 es el esquema general del análisis del mapeo del sitio de integración realizado en ratones trasplantados con progenitores hematopoyéticos modificados genéticamente. Las muestras de médula ósea y de glóbulos blancos de ratones trasplantados pertenecientes a dos experimentos independientes (Tabla 3) y recogidos en diferentes momentos después del trasplante se analizaron como se describe en los métodos complementarios que siguen a la tubería mostrada.

En general, los presentes inventores mapearon 5.173.892 lecturas de secuenciación en el genoma de ratón trasplantado, dando como resultado 2.220 sitios de integración de vectores únicos. La distribución genómica de los IS de dos experimentos independientes coincidió con la preferencia de LV previamente informada para la integración dentro de las unidades transcripcionales (particularmente dentro de los primeros 50 Kb en el extremo 3' del sitio de inicio de la transcripción -TSS-) (Fig. 16a), sin mostrar desviación hacia ningún cromosoma particular en el genoma del ratón (Fig. 16b). La Figura 16a muestra la distribución de frecuencias del sitio de integración (IS) alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS) del gen RefSeq más cercano, que engloba 500 Kb en el extremo 5' y en el extremo 3’ del TSS. Los números en la parte superior son el número de IS detectados para todas las muestras y momentos. La Figura 16b muestra la distribución cromosómica de los sitios de integración de LV en ratones trasplantados que expresan el transgén EGFP (barras negras) o el transgén terapéutico coRPK (barras grises), sin mostrar desviación hacia ningún cromosoma particular.

Se estudió la seguridad de la terapia génica basada en LV PGK-coRPK mediante estimaciones de abundancia clonal, calculando el porcentaje de recuento de secuencias para cada IS (una marca clonal) con respecto al número total de secuencias del conjunto de datos. Las gráficas de puntos y las representaciones de mapas de calor de la abundancia relativa de cada IS recuperado para cada ratón (Fig. 17,18 y 19) mostraron fuertes fluctuaciones en la composición clonal de los diferentes ratones y de las células Lin- cultivadas in vitro. La Figura 17 es una gráfica de integraciones compartidas seguidas entre ratones receptores primarios y secundarios que portan el vector LV PGK-coRPK terapéutico. Se agrupan las integraciones detectadas en cualquier ratón en cualquier órgano y en cualquier momento. Los receptores secundarios recibieron la mezcla de MO de los ratones trasplantados coRPKl 1 a 14. El resto de los IS detectados se detectaron o en los receptores primarios o en los secundarios. Los números en las celdas muestran la representatividad en porcentaje de la integración correspondiente en el ratón referido. Además de > 5 % de filtro aplicado en el análisis de integración, se eliminaron todas las integraciones con un recuento de secuencia <3. La Figura 19 presenta una representación de la gráfica de puntos de la abundancia clonal de integraciones agrupadas en cada ratón en la médula ósea. El porcentaje relativo (eje y) para cada sitio de integración es relativo al número total de lecturas de secuencias obtenidas en cada conjunto de datos. De manera similar a las células transducidas con coRPK (Fig. 17), la gráfica indica que la gran mayoría de los ratones trasplantados muestran un patrón policlonal de repoblación hematopoyética.

También, fue posible apreciar que, para varias muestras, un pequeño número de integraciones contribuyó a una gran cantidad de lecturas de secuencias (Fig. 17 y 18), revelando un patrón policlonal de repoblación de HSC transducidas. Además, la integración compartida seguida entre los ratones primarios que portaban el LV PGK-coRPK terapéutico y los ratones secundarios posteriormente trasplantados no mostró un fuerte intercambio de las integraciones entre los grupos, lo que confirma la ausencia de dominancia clonal (Fig. 18).

Para determinar si las características distintivas de la mutagénesis por inserción estaban presentes en los ratones trasplantados, los presentes inventores evaluaron la aparición de sitios de inserción comunes (CIS) similares a los ensayos clínicos actualmente en curso mediados por LV. Los CIS son puntos calientes de inserción que pueden resultar de un sesgo de integración en el momento de la transducción o la selección in vivo de clones que albergan integraciones de vectores que confieren ventajas de crecimiento. Los CIS se identificaron usando un algoritmo basado en Abel y col. y la prueba de Grubbs para valores atípicos que no encontraron CIS y, por lo tanto, no hay signos alarmantes de genotoxicidad por esta lectura. Además, el análisis de ontología génica (GO) no reveló desviación hacia las clases de genes implicados en el cáncer, la proliferación celular o la regulación de la apoptosis en ninguno de los conjuntos de datos de integración ordenados por distribución tisular, momento o abundancia de repoblación de clones de células hematopoyéticas (Fig. 20). La Figura 20 representa el perfil de integración genómica LV. El análisis de ontología génica (GO) se realizó usando el software GREAT en muestras de ratones trasplantados. Todas las integraciones recuperadas de este estudio (N = 2220) mostraron representaciones excesivas de las funciones genéticas indicadas en la parte izquierda de la figura. Para abordar si las integraciones más abundantes se enriquecieron en clases de genes específicos, se seleccionaron todos los sitios de integración con un recuento de secuencias relativo > 5 % del conjunto de datos completo (que se muestra en la Fig. 17), que no muestra clases de genes GO representadas en exceso.

Estos resultados indican neutralidad en la integración del vector y demuestran la seguridad del LV PGK-coRPK en un ámbito preclínico.

Ejemplo 6

Ensayo clínico humano

Se realiza un ensayo clínico para evaluar la seguridad y la eficacia preliminar del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) autólogas usando el medicamento EU/3/14/1130 (células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas transducidas con el vector lentivírico que contiene el gen RPK) en pacientes con deficiencia de piruvato cinasa con antecedentes de anemia grave y dependiente de transfusión resistente a la esplenectomía.

La ODD EU/3/14/1130 comprende un vector lentivírico autoinactivador que expresa la versión de codones optimizados del gen PKLR humano terapéutico (Figura 21).

Los vectores lentivíricos autoinactivadores (SIN-LV) proporcionan una expresión más fuerte (Ellis 2005) y son menos susceptibles al silenciamiento transcripcional que los vectores gammarretrovíricos (Pfeifer, Ikawa et al. 2002). También muestran un perfil de integración mucho más seguro (Schroder, Shinn et al. 2002) (Mitchell, Beitzel et al. 2004) (Wu, Li et al. 2003), y debido a la deleción de 400 pb que llevan en la secuencia LTR 3' (Miyoshi, Blomer et al. 1998) (Zufferey, Dull et al. 1998), la expresión del transgén está regulada por promotores internos, lo que aumenta la seguridad de la modificación genética basada en LV.

La secuencia de vectores del vector lentivírico aceptado también incluye varias modificaciones para mejorar la expresión del transgén y la seguridad en las células diana.

Una modificación es el uso del promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK) humana, ya caracterizado por su actividad in vivo estable y propiedades de seguridad mejoradas en comparación con otros promotores usados en la terapia génica (Montini, Cesana et al. 2006, Modlich, Navarro et al. 2009, Montini, Cesana et al. 2009, Biffi, Montini et al.

2013). La PGK conduce a una expresión más fisiológica del transgén y a una menor susceptibilidad al silenciamiento transcripcional (Gerolami, Uch et al. 2000, Zychlinski, Schambach et al. 2008).

Otra modificación es una versión de codones optimizados del ADNc de PKLR humano (coRPK) para aumentar la estabilidad del ARNm tras la transcripción. Para la optimización, se ha usado el software GeneArt®, que aumenta el contenido de GC y elimina los sitios de corte y empalme crípticos para evitar el silenciamiento transcripcional y, por lo tanto, aumentar la expresión del transgén. La secuencia optimizada de coRPK mostró una homología del 80,4 % con el gen PKLR humano, sin cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Otra modificación es un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (Wpre), que carece de un marco abierto de lectura residual (Schambach, Bohne et al. 2006), que también se incluye para mejorar el nivel de expresión y estabilidad del gen terapéutico. El esqueleto, el promotor y las secuencias de Wpre* de este vector lentivírico (LV PGK-coRPK) son los mismos que los correspondientes al medicamento "vector lentivírico que contiene el gen de la anemia A de Fanconi (FANCA) para la terapia de pacientes con anemia de Fanconi de tipo A" (referencia 141/2000), así como el esqueleto de vector usado en el ensayo clínico actualmente en curso para la leucodistrofia metacromática (MLD) (Biffi, Montini et al. 2013).

Modo de acción

Después de recoger las células progenitoras CD34+ de pacientes con PKD, ya sea de médula ósea (MO) o de células de sangre periférica movilizadas, se transducirán ex vivo con el medicamento y el vector terapéutico se integrará en el genoma de las células. Una vez integrado, el gen humano terapéutico (coRPK) se transcribirá y se traducirá dentro de las células deficientes para producir la proteína RPK terapéutica que falta o se reduce en los eritrocitos maduros de la PKD. Los progenitores hematopoyéticos de la PKD transducidos se corregirán genéticamente y, por lo tanto, podrán producir RBC con cantidades suficientes de ATP para cumplir sus funciones (Figura 22). Estos progenitores hematopoyéticos corregidos genéticamente (que constituirán el medicamento) se trasplantarán luego nuevamente al paciente, donde una vez injertados generarán eritrocitos normales, que curarán la enfermedad durante toda la vida.

El principio activo consistirá en una suspensión celular de células madre hematopoyéticas corregidas (CD34+) con el vector lentivírico terapéutico PGK.coRPK.wpre diseñado como fármaco sin interés comercial por la Comisión europea (ODD EU/3/14/1130) para el tratamiento de la deficiencia de piruvato cinasa. Por lo tanto, este nuevo medicamento debe incluirse en los grupos de desarrollos de terapia avanzada dentro de la subclase de terapia génica.

El principio activo estará compuesto por una suspensión celular modificada genéticamente de al menos 2x106 células CD34+/kg de peso corporal con al menos 0,1 copias del vector terapéutico por célula. Las células se suspenderán en un tampón salino con 2 % de HSA.

El producto terapéutico final se producirá según las reglas de GMP, por lo que los requisitos del producto para su liberación y su infusión en el paciente se relacionarán con la calidad del producto. En relación con esto, estas especificaciones serán la viabilidad celular > 30 %, la esterilidad (prueba de Gram y esterilidad por la farmacopea), la ausencia de micoplasma, la ausencia de partículas lentivíricas competitivas replicativas y la demostración de la potencia del potencial terapéutico mediante la detección de la presencia de al menos 0,1 copias del vector por célula mediante PCR cuantitativa. Además, se realizarán investigaciones y estudios de investigación sobre el contenido de los progenitores hematopoyéticos y el número de copias del vector en estos. Se realizarán tres validaciones independientes con células de control sanas para garantizar que el procedimiento cumpla con los requisitos descritos anteriormente.

El producto final se envasará en una bolsa de transferencia sellada por calor y especialmente para congelación y almacenamiento hasta su infusión al paciente; previamente, se recogerán muestras para los controles de calidad correspondientes precisos.

Movilización

Los pacientes serán movilizados en sus respectivos hospitales, aunque los dos primeros pacientes serán movilizados en el Hospital del Niño Jesús, Madrid (España). El proceso de movilización consistirá en la administración de factor estimulante recombinante de colonias de granulocitos (G-CSF, Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, EE. UU.) en dosis de 12 mg/kg dos veces al día hasta ocho días desde el nacimiento, Plerixafor 4° día 240 mg/kg/d (Mozobil®, Genzyme Europe BV, Naarden, Países Bajos) en cuatro dosis subcutáneas durante 4 días consecutivos. Las células progenitoras hematopoyéticas de la sangre periférica se recogerán mediante leucoféresis en grandes volúmenes desde el día 5 de movilización mediante un separador de células y de acuerdo con los protocolos estándar en el Hospital del Niño Jesús de Madrid. Todos los instrumentos y las disoluciones tienen el marcado CE y cumplen con las especificaciones de la legislación para dispositivos médicos.

Purificación de células CD34+

De acuerdo con el proceso de movilización, la aféresis se llevará a cabo en el hospital donde se moviliza al paciente. La aféresis se procesará de inmediato para seleccionar progenitores hematopoyéticos (células CD34+) mediante la tecnología de "clasificación de células magnéticas" MACS (Miltenyi Biotec, Alemania) que permite la separación de células por un gradiente de campo magnético alto, a través de un potente imán permanente y una columna de separación con una matriz ferromagnética. El sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) consiste en un ordenador (CliniMACS®plus Instrument), un software de selección de CD34+ específico, un conjunto de tubos estériles (CliniMACS Tubing Sets), un instrumento estéril reactivo controlado magnéticamente (CliniMACS CD34 Reagent) y un tampón estéril (CliniMACS PBS/EDTA Buffer). El instrumento y los reactivos usados tendrán el marcado CE y cumplirán con las especificaciones de la legislación para dispositivos médicos. Durante esta fase y en lavados posteriores se emplean inmunoglobulina inespecífica (Flebogamma intravenosa al 5 % 0,5 g, Grifols) y albúmina humana (albúmina humana de Grifols® 20 %, Grifols), que luego se eliminan mediante lavado después de la centrifugación. Luego se cuantificarán las células CD34+. Los controles microbiológicos de los productos obtenidos se realizarán tomando muestras estándar de hongos, bacterias aerobias y de anaerobios para cultivos siguiendo los protocolos específicos.

Transducción de CD34+

La transducción de las células CD34+ purificadas con ODD EU/3/14/1130 se realizará en las condiciones de GMP en una ventana de tiempo dentro de las 48 h desde la extracción de las células del paciente (aféresis). El cultivo ex vivo de las células durará menos de 48 horas, y se cultivará siguiendo normas establecidas que incluyen el uso de medios X-vivo-20 (Lonza) formulados correctamente, la adición de factores de crecimiento hematopoyéticos (100 ng/mL de ^{hrSCF, 100 ng/mL de hrFlt-3, 100 ng/mL de}TpO ^{y 20 ng/mL de IL-3 (todos de Prepotech), 1gg/mL de Pulmozyme y}concentración controlada de 5 % de O². La transducción se realizará con un lote lentivírico GMP de ODD EU/3/14/1130 producido por VIVEbiotech (San Sebastián, España). Después de la transducción, las células se lavarán en X-vivo-20 (Lonza) para finalmente envasarse en una bolsa de transferencia adecuada para la crioconservación. Se recogerán muestras específicas para determinar si el producto final cumple con todas las especificaciones ya mencionadas para su liberación final. Se realizarán tres validaciones independientes para evaluar la estabilidad del producto. Todos los productos y disoluciones, incluido el vector, cumplirán con las especificaciones de la legislación para dispositivos médicos y uso clínico. Antes de la producción, todas las materias primas (incluidos los consumibles, los reactivos biológicos y los polvos químicos) serán inspeccionadas por la unidad de control de calidad (QC) de CliniStem de acuerdo con los procedimientos normalizados de trabajo (SOP).

Acondicionamiento

Los pacientes se acondicionarán según los protocolos normalizados y específicos considerados para el ensayo. Para considerar a un paciente para el acondicionamiento una alternativa, se mantendrá congelada una copia de reserva de 2x106 células CD34+ no manipuladas/kg para usarla en caso de que el producto preparado no reconstituya completamente la hematopoyesis del paciente tratado.

Infusión

Antes de la infusión, se verificará la elegibilidad del paciente para asegurarse de que cumple con los requisitos del estudio. Se registrará el día de infusión, premedicación y medicación profiláctica usada.

Ejemplo 7

Desarrollo no clínico

El trabajo anterior demostró la viabilidad de la terapia génica de HSC para la PKD en ratones cuando se trasplantó por encima del 25 % de células corregidas genéticamente. Estos resultados indican que se necesita un número significativo de HSC corregidas por el gen del donante (Zaucha, Yu et al. 2001) y altos niveles de expresión de transgenes para lograr un efecto terapéutico en la PKD. Los presentes inventores han desarrollado un nuevo vector lentivírico terapéutico propuesto para este ensayo clínico, que alberga el promotor eucariótico de hPGK que impulsa la expresión del ADNc de PKLR que se designó como medicamento sin interés comercial en agosto de 2014 (EU/3/14/1130). Con este vector, realizaron un protocolo de terapia génica preclínica para la PKD en un modelo de ratón de la enfermedad. Con las dosis lentivíricas basadas en normas clínicas, la expresión ectópica de RPK fue capaz de normalizar el compartimiento eritroide, corrigiendo el fenotipo hematológico y revirtiendo la patología de los órganos. Los estudios metabolómicos demostraron la corrección funcional de la ruta glucolítica en los RBC corregidos genéticamente, sin observarse alteraciones metabólicas en los leucocitos. Sorprendentemente, los WBC analizados en paralelo no mostraron alteraciones del equilibrio metabólico en los leucocitos cuando la RPK se expresa ectópicamente bajo la actividad de un promotor ubicuo como la PGK, descartando una ventaja metabólica de los leucocitos como una posible preocupación de seguridad y refuerza el potencial terapéutico del vector UE/3/14/1130.

La reconstitución multi-linaje y la ausencia de cualquier evento leucémico o expansión clonal en receptores secundarios después del estrés proliferativo inducido por el retrasplante de MO demuestran la estabilidad y seguridad a largo plazo del protocolo basado en el vector LV PGK-coRPK. El uso del promotor eucariota de PGK humana que i) condujo probablemente a una expresión más fisiológica del transgén RPK, ii) ha demostrado ser un transactivador débil y iii) se está usando actualmente en el ensayo clínico para leucodistrofia metacromática (MLD), también podría explicar la seguridad de todo el procedimiento.

Para evaluar la seguridad a largo plazo de la terapia génica de HSC mediante el análisis de los sitios de integración de vectores, se usó la secuenciación de nueva generación para predecir el riesgo de oncogénesis de inserción en HSC. Se mapearon más de 5.173.892 secuencias de lecturas en el genoma del ratón con un total de 2220 vectores únicos IS, no encontrando evidencia de expansión in vivo o selección de clones que albergan IS. Más bien, los datos de los presentes inventores muestran la composición clonal y la dinámica de la hematopoyesis después del trasplante de HSC transducidas en ratones, lo que indica una modificación genética in vivo de HSC genuina y estable con el tiempo. En general, el análisis del patrón de integración del vector enfatiza las propiedades de seguridad del vector LV PGK-coRPK que proporciona la corrección genética de la PKD sin evidencia de genotoxicidad.

Ejemplo 8

Desarrollo clínico

Hasta la fecha, no se han realizado estudios clínicos con el medicamento. Esta es la primera vez que se solicita asistencia de protocolo a una autoridad reguladora. El objetivo de los presentes inventores es realizar un ensayo clínico patrocinado por la Comisión europea. Se ha establecido el consorcio ForGeTPKD, compuesto por diferentes profesionales clínicos e investigadores básicos en Europa, para centrarse en la investigación de la PKD y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. El ensayo clínico ForGeTPKD será la primera administración de este medicamento en humanos. Está diseñado como un estudio internacional, multicéntrico, de fase l/ll y de etiqueta abierta para evaluar la seguridad y la eficacia del trasplante de células CD34+ autólogas transducidas ex vivo con un vector lentivírico que contiene el gen de la piruvato cinasa de tipo de glóbulos rojos (RPK) (EU/3/14/1130) en pacientes con deficiencia grave de piruvato cinasa.

Estado reglamentario

El medicamento no tiene autorización de comercialización en este momento. El objetivo del consorcio de PKD es avanzar hacia el desarrollo clínico del medicamento para recibir finalmente una autorización de comercialización.

El producto final mencionado se producirá con un vector lentivírico que ha recibido la designación de fármaco sin interés comercial relacionada con:

Indicación: Tratamiento de la deficiencia de piruvato cinasa.

Criterios: El único tratamiento curativo para la PKD es el TMO alógeno, que se ha usado en pacientes con anemia grave y dependiente de transfusión resistente a otras medidas. Sin embargo, el TMO alógeno no es un tratamiento ampliamente aceptado para la PKD (solo se informó de un paciente en la bibliografía (Tanphaichitr, Suvatte et al.

2000)) ya que está asociado con complicaciones graves relacionadas con el acondicionamiento intensivo previo al TMO alógeno mediante quimioterapia o quimiorradioterapia, así como enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) aguda y crónica. La hipótesis de los presentes inventores es que la terapia génica que usa células madre hematopoyéticas autólogas transducidas con vectores víricos que contienen la versión natural del gen, proporcionada por la ODD EU/3/14/1130, puede representar una posible oportunidad curativa para estos pacientes, evitando los riesgos de GVHD, la principal causa de fracaso de un trasplante de progenitores hematopoyéticos.

Principio activo: Células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas, transducidas con un vector lentivírico que contiene el gen de la piruvato cinasa de tipo de glóbulos rojos (RPK) (ODD EU/3/14/1130), que expresa la versión natural de la proteína

Producto terminado: Bolsa congelada que contiene al menos 2x106 principios activos/kg de peso corporal del paciente, suspendido en un tampón salino con 2 % de HAS.

Ejemplo 9

Farmacología

Estudios completados: El medicamento desarrollado incluye varias modificaciones en su secuencia que proporcionan algunas ventajas para la terapia génica para la PKD: 1) El uso de un diseño de vector SIN-LV permitió una producción relativamente fácil y segura de reservas víricas, capaz de transducir eficientemente las HSC; 2) el uso de un promotor débil y eucariota, tal como hPGK, que es menos susceptible al silenciamiento por metilación (Gerolami, Uch et al.

2000), conduce a una expresión más fisiológica del transgén, logrando niveles terapéuticos con una dosis vírica (1,65 NCV) dentro de las normas clínicas (Matrai, Chuah et al. 2010); y 3) la secuencia de transgén de codones optimizados y la presencia de la secuencia de Wpre mutada aumentan la estabilidad del ARNm del transgén: no se incluyó gen indicador en la secuencia del vector terapéutico, evitando posibles problemas inmunogénicos (Morris, Conerly et al.

2004); (Stripecke, Carmen Villacres et al. 1999).

El medicamento desarrollado LV hPGK-coRPK revirtió eficazmente la patología de la PKD en ratones deficientes tanto primarios como secundarios trasplantados con progenitores transducidos y corregidos con la ODD EU/3/14/1130. La corrección se logró con células que portaban en promedio 1,65 copias por célula del transgén terapéutico.

El promotor de PGK humana era lo suficientemente potente como para expresar niveles clínicamente relevantes de la proteína coRPK, restaurando el fenotipo hemolítico en ratones trasplantados.

La corrección genética fue capaz de: prolongar la semivida de RBC; normalizar las variables hematológicas y los niveles de reticulocitos; revertir la eritropoyesis compensatoria activada constitutivamente en ratones con PKD; rescatar la patología en el bazo y el hígado, lo que reduce sorprendentemente la sobrecarga de hierro, que es una de las complicaciones potencialmente mortales de la PKD. Además, la expresión ectópica de RPK humana corrigió el defecto energético en los RBC sin alterar el equilibrio metabólico en WBC, haciendo hincapié en la eficacia y la seguridad del medicamento.

Ejemplo 10

Estudios en curso

Transducción de progenitores hematopoyéticos humanos de donantes sanos y pacientes con PKD para el estudio de: 1) eficiencia de la transducción de la ODD EU/3/14/1130 en células humanas; 2) definición del número de copias de vector/célula óptimo para obtener una expresión eficiente y terapéutica de la proteína terapéutica RPK; y 3) definición de las condiciones óptimas para obtener niveles de transducción terapéutica sin perder la capacidad de las células madre hematopoyéticas.

Los estudios planificados incluyen la configuración de las condiciones para la transducción a gran escala en la instalación de GMP y estudios de validación previa y 3 de validación para establecer las condiciones óptimas para alcanzar las especificaciones requeridas definidas para el producto terapéutico final.

Toxicología

Los estudios completados incluyen 1) la expresión ectópica de RPK humana corrigió el defecto energético en los RBC sin alterar el equilibrio metabólico en WBC; 2) el análisis de integración del genoma del vector ha demostrado que (i) el análisis de la abundancia relativa de clones celulares específicos reveló una reconstitución hematopoyética oligoclonal para algunos ratones, que no muestra dominancia clonal para ningún ratón trasplantado primario ni secundario; (ii) sitios de integración comunes (CIS, agrupaciones densas de integraciones de vectores en intervalos genómicos definidos), considerados un distintivo de la mutagénesis de inserción, no mostraron ningún signo de genotoxicidad, ni un enriquecimiento anormal de CIS con el tiempo y los CIS detectados de los dos experimentos de terapia génica independientes realizados en ratones no estaban representados por altos recuentos de secuencias y no se dirigían preferentemente a oncogenes; (iii) el análisis de ontología génica (GO) de los genes dirigidos por la integración de lentivirus y el estudio de la posición de las integraciones del vector en regiones específicas del genoma no mostraron desviación hacia las clases de genes implicados en el cáncer, la proliferación celular o la regulación de la apoptosis; y (iv) en general, el análisis de integración de medicamentos no mostró evidencia de genotoxicidad.

Los estudios planificados incluyen 1) análisis de la producción de lentivirus competentes recombinantes (RCL): linfocitos T humanos de donantes sanos y de pacientes con PKD se transducirán con la ODD EU/3/14/1130 y el cultivo in vitro durante períodos de tiempo prolongados. La presencia de la proteína p24 vírica se analizará en los sobrenadantes mediante ELISA para evaluar la posible generación de RCL y 2) biodistribución del medicamento: los progenitores hematopoyéticos de ratón serán transducidos con la ODD EU/3/14/1130 y se trasplantarán en receptores letalmente irradiados. Un mes después del trasplante se sacrificarán los animales y se analizarán diferentes órganos (gónadas, hígado, riñón, cerebro, médula ósea, bazo y sangre periférica) para la presencia de ADN vector; y 3) integroma de vectores en células humanas: los progenitores hematopoyéticos de donantes sanos y de pacientes con PKD se transducirán con la ODD EU/3/14/1130 y se trasplantarán a ratones inmunodeficientes graves para permitir el injerto y la proliferación de células hematopoyéticas humanas. En diferentes momentos (1, 2 y 3 meses después del trasplante) se tomarán sangre y trasplantes de MO, se clasificarán para las células humanas y se someterán a un análisis de integroma de vectores como ya se realizó con las células de ratón.

Ejemplo 11

Ensayo clínico humano

Para probar la eficacia clínica, se llevará a cabo el ensayo ForgetPKD. El ensayo clínico propuesto tiene como objetivo evaluar la seguridad y la eficacia preliminar del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) autólogas usando el medicamento EU/3/14/1130 (células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas transducidas con un vector lentivírico que contiene el gen piruvato cinasa de tipo glóbulos rojos (RPK) en pacientes con deficiencia de piruvato cinasa con antecedentes de anemia grave y dependiente de transfusión resistente a la esplenectomía.

El objetivo principal es evaluar la seguridad y la tolerabilidad/viabilidad del tratamiento. Se medirán los siguientes criterios de valoración según: 1) la incidencia y caracterización de los acontecimientos adversos (AE), que incluyen: AE relacionados con la infusión de las células transducidas, AE derivados del acondicionamiento antes de la infusión de las células y AE derivados de la evolución clonal relacionada con las células transducidas; y 2) el número de pacientes con injerto de células madre 30 días después del trasplante.

Los objetivos secundarios son evaluar la eficacia del tratamiento preliminar. Se medirán los siguientes criterios de valoración según: número de pacientes que se vuelven "independientes de la transfusión" al final del estudio; en pacientes que todavía necesitan transfusiones después del tratamiento, la relación entre el número medio de transfusiones necesarias dentro del periodo de estudio (1 año) con respecto al número medio de transfusiones en los últimos 1,5 años antes de la evaluación en el nivel basal; reducción clínicamente significativa de la anemia, definida como el número de pacientes con aumento en los niveles de hemoglobina en 2 g/dL desde el nivel basal al final del estudio; reducción clínicamente significativa de la reticulocitosis, definida como el número de pacientes con una reducción del 50 % desde la evaluación en el nivel basal al final del estudio; y número de pacientes con injerto de células madre donde se puede detectar el 1 % de células transducidas a los 6 y 12 meses después de la infusión de células y al final del estudio.

Un objetivo exploratorio es evaluar el impacto del tratamiento sobre la calidad de vida del paciente. El siguiente criterio de valoración se medirá según: la mejora en la calidad de vida desde el nivel basal al final del estudio, usando un cuestionario de la calidad de vida (SF-36 para adultos o PEDSQL para niños) y sus versiones validadas traducidas en el idioma de los países participantes (italiano, holandés y español).

El ensayo ForGetPKD es un ensayo internacional y multicéntrico, que se llevará a cabo en 3 estados miembros de la UE: España, Italia y los Países Bajos. Los centros participantes incluyen investigadores e instituciones nacionales de referencia para el diagnóstico y tratamiento de la PKD.

El ensayo representará la primera administración a seres humanos del producto descrito. Está diseñado como un estudio no comparativo de fase I/II, de etiqueta abierta y de dosis única.

La duración del estudio global será de 2 años desde la primera visita del primer paciente hasta la última visita del último paciente. Esto incluye 1 año de periodo de selección y 1 año de periodo de tratamiento y seguimiento temprano (inmediato). Una vez finalizado el ensayo, se pedirá a los sujetos incluidos que participen en un estudio de seguimiento posterior que supervisará la seguridad y la eficacia hasta 5 años después del trasplante.

De acuerdo con la incidencia de la enfermedad y el diseño del estudio, planeamos incluir 6 pacientes en un año. Esta estimación se ha decidido teniendo en cuenta que hay 3 posibles participantes ya identificados.

Los procedimientos del estudio incluyen un periodo de selección, un periodo de tratamiento y un periodo de seguimiento. Los detalles de las visitas en cada fase y los procedimientos de estudio asociados se detallan a continuación y se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4.

Periodo de selección

Visita -1: Visita de preselección

Los posibles candidatos serán informados de los objetivos y las características del ensayo, y el paciente (o su representante legal si es menor de edad) recibirá, cumplimentará y firmará el consentimiento informado por escrito, por duplicado. Para ser aptos para el estudio, los pacientes deben cumplir todos los criterios de inclusión y ninguno de los criterios de exclusión, que se verificarán. Esto incluye un procedimiento de tratamiento previo para movilizar y obtener células CD34+ viables, para A. Almacenar 2x106 células CD34+/kg de peso corporal para servir como copia de reserva en caso de no injerto, B. Transducir al menos 6x106 células CD34+/kg de peso corporal con el vector EU/3/14/1130 para generar el medicamento y realizar todo el control de calidad necesario para la liberación del medicamento. Solo los pacientes con suficientes células transducidas disponibles después de la liberación del medicamento (2x106 células CD34+ transducidas/kg de peso corporal) se incluirán en el estudio.

Los siguientes procedimientos también se realizarán en esta visita:

- Registro de los antecedentes médicos o quirúrgicos relevantes.

- Registro de datos demográficos y resultados de exámenes físicos clínicamente relevantes.

- Registro de medicamentos simultáneos relevantes.

- Análisis de sangre periférica para los hemogramas habituales (CBC), bioquímica, determinación de la coagulación y serología.

- Ecocardiograma, prueba de función pulmonar y radiografía de tórax.

- Cuestionario de calidad de vida (SF-36 o PEDSQL)

- Diagnóstico genético de la PKD.

Para ser aptos para el estudio, los pacientes deben cumplir todos los siguientes criterios de inclusión y ninguno de los criterios de exclusión.

Los criterios de inclusión son pacientes masculinos o femeninos, edad > 2 años en el momento de la selección, dispuestos a dar su consentimiento informado firmado (que será firmado por sus padres o representante legal en el caso de niños menores de 18 años), diagnóstico previo de PKD confirmado por pruebas genéticas, antecedentes de anemia grave dependiente de transfusión, que no responde a la esplenectomía, candidato a trasplante de células madre hematopoyéticas autólogas, > 2x106 células CD34+ transducidas/kg de peso corporal disponible y tratamiento y seguimiento durante al menos los 2 últimos años en un centro especializado que mantuvo historias clínicas detalladas, incluido el historial de transfusiones.

Los criterios de exclusión son positivos para la presencia del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 o 2 (VIH 1 y VIH 2), trastorno de sangrado no corregido, presencia de otras causas de hemólisis, cualquier neoplasia maligna previa o actual o trastorno mieloproliferativo o de inmunodeficiencia, familiar directo con un síndrome de cáncer familiar conocido o sospecha (que incluye, pero no se limita a, síndrome de cáncer de mama y de ovario hereditario, síndrome de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis y poliposis adenomatosa familiar), en pacientes con trasplante alógeno previo, presencia de células residuales de origen del donante, pacientes con complicaciones graves que, después de una evaluación médica, se considera que padecen anomalías de la función cardíaca, pulmonar, hepática o renal de grado lll/IV, trastorno convulsivo incontrolado, capacidad de difusión de monóxido de carbono (DLco) <50 % de lo previsto (corregido para hemoglobina), cualquier otra evidencia de intensa sobrecarga de hierro que, en opinión del investigador, justifica la exclusión, participación en otro estudio clínico con un fármaco en investigación en los 30 días posteriores a la selección, la disponibilidad de un donante familiar de HLA idéntico para el trasplante alógeno de médula ósea, mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, pacientes que, según los criterios del investigador, no podrán entender los propósitos, beneficios y riesgos del estudio y/o cumplir con los procedimientos del estudio, un estado funcional deficiente, evidenciado por un índice de Kamofsky <80 en adultos o Lansky <80 en niños.

El análisis estadístico del estudio será descriptivo. Los criterios de valoración cualitativos se describirán por frecuencias y porcentajes. Los criterios de valoración cualitativos incluyen los acontecimientos adversos, el número de pacientes con injerto de células madre, el número de pacientes que se vuelven "independientes de transfusión", el número de pacientes que tienen una reducción de la anemia clínicamente significativa, el número de pacientes que tienen una reducción clínicamente significativa de reticulocitosis, el número de pacientes con injerto de células madre donde se puede detectar la presencia de células transducidas, y la mejora en la calidad de vida desde el nivel basal medido por el cuestionario SF-36 o PEDSQL. Los criterios de valoración cuantitativos se describirán por media y desviación estándar o por mediana y cuartiles. Los criterios de valoración cuantitativos incluyen las reducciones de la anemia y la reticulocitosis desde el nivel basal, el número de transfusiones necesarias dentro del periodo de estudio con respecto al número de transfusiones en el último año antes de la evaluación en el nivel basal, y el número de copias del vector en la sangre periférica y la médula ósea. Todos los criterios de valoración se describirán al final del estudio.

El trabajo anterior demostró la viabilidad de la terapia génica de HSC para la PKD en ratones cuando se trasplantó por encima del 25 % de células corregidas genéticamente. Estos resultados indican que se necesita un número significativo de HSC corregidas por el gen del donante (Zaucha, Yu et al. 2001) y altos niveles de expresión de transgenes para lograr un efecto terapéutico en la PKD. Los presentes inventores han desarrollado un nuevo vector lentivírico terapéutico propuesto para este ensayo clínico, que alberga el promotor eucariótico hPGK que impulsa la expresión del ADNc de PKLR que se designó como medicamento sin interés comercial en agosto de 2014 (EU/3/14/1130). Con este vector, realizaron un protocolo de terapia génica preclínica para la PKD en un modelo de ratón de la enfermedad. Con las dosis lentivíricas basadas en normas clínicas, la expresión ectópica de RPK fue capaz de normalizar el compartimento eritroide, corrigiendo el fenotipo hematológico y revirtiendo la patología de los órganos. Los estudios metabolómicos demostraron la corrección funcional de la ruta glucolítica en los RBC corregidos genéticamente, sin observarse alteraciones metabólicas en los leucocitos. Sorprendentemente, los WBC analizados en paralelo no mostraron alteraciones del equilibrio metabólico en los leucocitos cuando la RPK se expresa ectópicamente bajo la actividad de un promotor ubicuo como la PGK, descartando una ventaja metabólica de los leucocitos como una posible preocupación de seguridad y refuerza el potencial terapéutico del vector UE/3/14/1130.

La reconstitución de multi-linaje y la ausencia de cualquier evento leucémico o expansión clonal en receptores secundarios después del estrés proliferativo inducido por el retrasplante de MO demuestran la estabilidad y seguridad a largo plazo del protocolo basado en el vector LV PGK-coRPK. El uso del promotor eucariota de PGK humana que condujo probablemente a una expresión más fisiológica del transgén RPK, que se ha demostrado que es un transactivador débil y se está usando actualmente en el ensayo clínico para leucodistrofia metacromática (MLD) también podría explicar la seguridad de todo el procedimiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de suministro génico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende en el siguiente orden de 5' a 3':

a) una secuencia promotora;

b) una secuencia que codifica un producto génico terapéutico, en donde el producto génico terapéutico es un polipéptido de piruvato ciclasa humana de hígado y glóbulos rojos (PKLR); y

c) una señal de exportación de ácido ribonucleico (ARN),

en donde la secuencia promotora está unida operativamente a la secuencia que codifica el polipéptido PKLR y en donde el vector de suministro génico recombinante es un lentivirus (LV).

2. El vector de suministro génico recombinante de la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK).

3. El vector de suministro génico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la secuencia que codifica el producto génico es de codones optimizados.

4. El vector de suministro génico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la señal de exportación de ARN es un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (Wpre), opcionalmente un Wpre quimérico que comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con SEQ ID NO:1.

5. El vector de suministro génico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que comprende además una o más secuencias potenciadoras y/o una secuencia señal del tracto de polipurina (PPT) o de poliadenilación (poliA).

6. El vector de suministro génico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que comprende además una o más de las siguientes secuencias:

i) una secuencia señal de encapsidación;

ii) una secuencia Gag truncada;

iii) un elemento sensible a Rev (RRE);

iv) un tracto central de polipurina (cPPT);

v) una secuencia terminal central (CTS); y

vi) un elemento de secuencia en el extremo 5' (USE), opcionalmente del virus simio 40 (SV40-USE).

7. El vector de suministro génico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además secuencias de repetición terminal larga 5' y 3'.

8. Una célula que comprende el vector de suministro génico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. La célula de la reivindicación 8, en donde la célula es una célula madre hematopoyética o una célula progenitora eritroide hematopoyética diferenciada.

10. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y el vector de suministro génico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la célula de la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en un método de tratamiento o de prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto en necesidad del mismo que comprende proporcionar al sujeto la composición farmacéutica.

12. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en donde la enfermedad o trastorno es una deficiencia de piruvato cinasa (PKD).

13. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, en donde la composición farmacéutica comprende la célula de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, opcionalmente en donde la célula es autóloga o alógena para el sujeto.

14. Un método in vitro para la expresión de una transgén en células eritroides, que comprende poner en contacto una o más células eritroides con una cantidad eficaz de un vector vírico recombinante, en donde el vector comprende un promotor de la fosfoglicerato cinasa humana, una versión de codones optimizados de un transgén del ADNc de la piruvato cinasa humana, de hígado y de glóbulos rojos (PKLR) y un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota, en donde después de dicho contacto, el PKLR se expresa en niveles detectables en la una o más células eritroides.