JP2022101543A - Pklrの遺伝子発現増強のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる2016年4月20日に出願された米国仮出願第62/325,397号に基づく優先権を主張する。
本発明は、ピルビン酸キナーゼ欠損症に対する遺伝子療法に関する。
ピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)は、可変性の症候の溶血性貧血をもたらし、新生児期に致死的であり得る、PKLR遺伝子の変異によって引き起こされる一遺伝子性代謝疾患である。PKDの劣性遺伝形質および同種骨髄移植による治療的処置は、遺伝子療法アプローチを開発するための理想的なシナリオを提供する。
[本発明1001]
5'から3'の順で
(a)プロモーター配列;
(b)遺伝子産物をコードする配列;および
(c)リボ核酸(RNA)輸送シグナル
を含むポリヌクレオチド配列を含み、該プロモーター配列が、ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列に機能的に連結されている、発現カセット。
[本発明1002]
プロモーターがホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、本発明1001の発現カセット。
[本発明1003]
遺伝子産物が治療用遺伝子産物である、本発明1001または1002の発現カセット。
[本発明1004]
治療用遺伝子産物がピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意で、肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR;pyruvate kinase, liver and red blood cell)ポリペプチドである、本発明1003の発現カセット。
[本発明1005]
遺伝子産物をコードする配列がコドン最適化されている、本発明1001~1004のいずれかの発現カセット。
[本発明1006]
RNA輸送シグナルが変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Wpre)である、本発明1001~1005のいずれかの発現カセット。
[本発明1007]
変異型Wpreが、SEQ ID NO:1との少なくとも80%の同一性を有する配列を含むキメラWpreである、本発明1006の発現カセット。
[本発明1008]
1個または複数個のエンハンサー配列をさらに含む、本発明1001~1007のいずれかの発現カセット。
[本発明1009]
ポリプリントラクト(PPT)またはポリアデニル化(ポリA)シグナル配列をさらに含む、本発明1001~1008のいずれかの発現カセット。
[本発明1010]
以下の配列のうちの1個または複数個をさらに含む、本発明1001~1009のいずれかの発現カセット:
(i)パッキングシグナル配列;
(ii)短縮型Gag配列;
(iii)Rev応答要素(RRE);
(iv)セントラルポリプリントラクト(cPPT);
(v)セントラルターミナル配列(CTS);および
(vi)上流配列要素(USE)、任意で、サルウイルス40由来のもの(SV40-USE)。
[本発明1011]
5'および3'の長い末端反復配列をさらに含む、本発明1001~1010のいずれかの発現カセット。
[本発明1012]
本発明1001~1011のいずれかの発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1013]
ウイルスまたはウイルスベクターである、本発明1012の組換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1014]
ウイルスまたはウイルスベクターがレンチウイルス(LV)である、本発明1013の組換え遺伝子送達ベクター。
[本発明1015]
本発明1001~1011のいずれかの発現カセットまたは本発明1012~1014のいずれかの遺伝子送達ベクターを含む、細胞。
[本発明1016]
造血幹細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1017]
運命付けられた(committed)造血赤血球前駆細胞である、本発明1015の細胞。
[本発明1018]
薬学的に許容される賦形剤と、本発明1012~1014のいずれかの組換え遺伝子送達ベクターまたは本発明1015~1017のいずれかの細胞とを含む、薬学的組成物。
[本発明1019]
その必要のある対象へ本発明1018の薬学的組成物を提供する工程を含む、該対象における疾患または障害の処置または防止の方法。
[本発明1020]
疾患または障害がピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)であり、遺伝子産物がピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意で、肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR)ポリペプチドである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
薬学的組成物が組換え遺伝子送達ベクターを含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
薬学的組成物が細胞を含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1023]
細胞が対象に対して自己である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
細胞が対象に対して同種である、本発明1022の方法。
[本発明1025]
1個または複数個の赤血球細胞を有効量の組換えウイルスベクターと接触させる工程を含む、赤血球細胞においてトランスジーンを発現させるための方法であって、ベクターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒト肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR)cDNAトランスジーンのコドン最適化バージョン、および変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Wpre)を含み、該接触させる工程の後に1個または複数個の赤血球細胞において検出可能なレベルでPKLRが発現される、方法。
定義
「ベクター」とは、本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドを含むかまたはポリヌクレオチドと会合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る高分子または高分子が会合したものをさす。例示的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、およびその他の遺伝子送達媒体が含まれる。
本開示のいくつかの局面において、真核細胞におけるトランスジーンの発現のための組成物が提供される。いくつかの局面において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの局面において、哺乳動物細胞は、造血幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、骨髄細胞、例えば、系統枯渇骨髄細胞である。いくつかの局面において、哺乳動物細胞は、運命付けられた造血赤血球前駆細胞である。
(a)PGKプロモーター配列、任意で、ヒトPGKプロモーター配列;
(b)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意で、コドン最適化されたRPKのコード配列またはcDNA配列;および
(c)任意で、SEQ ID NO:1の配列を含むか、またはそれからなる、変異体Wpre配列。
(a)cPPT配列;
(b)PGKプロモーター配列、任意で、ヒトPGKプロモーター配列;
(c)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意で、コドン最適化されたRPKのコード配列またはcDNA配列;および
(d)任意で、SEQ ID NO:1の配列を含むか、またはそれからなる、変異体Wpre配列。
(a)5'LTR、任意で、修飾型5'LTR;
(b)cPPT配列;
(c)PGKプロモーター配列、任意で、ヒトPGKプロモーター配列;
(d)ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列、任意で、コドン最適化されたRPKのコード配列またはcDNA配列;
(e)任意で、SEQ ID NO:1の配列を含むか、またはそれからなる、変異体Wpre配列;および
(f)3'LTR、任意で、修飾型3'LTR。
またはSEQ ID NO:2との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
本明細書中に開示されるように、本明細書中で集合的に「本発明の組成物」と呼ばれる本発明のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターは、動物の細胞におけるトランスジーンの発現において有用である。例えば、本発明の組成物は、研究において、例えば、細胞の生存度および/または機能に対して遺伝子が及ぼす効果を決定するため、使用され得る。もう一つの例として、本発明の組成物は、医療において、例えば、疾患または障害を処置するかまたは防止するため、使用され得る。従って、本発明のいくつかの局面において、細胞を本開示の組成物と接触させる工程を含む、細胞における遺伝子の発現の方法が提供される。いくつかの態様において、接触は、インビトロまたはエクスビボで行われる。いくつかの態様において、接触は、インビボで行われる、即ち、本発明の組成物が対象へ投与される。
ベクターおよびレンチウイルス上清の作製。本明細書中に記載されるように、LVを生成した。coRPK配列は、配列のGC含量を増加させ、潜在性のスプライス部位を防止するため、GeneArt(登録商標)ソフトウェアを使用して設計された。ベクターは、Dr.Naldini(HSR-TIGET, San Raffaele Telethon Institute, Milano, Italy)から寛大に提供されたpCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-Wpre*構築物を骨格として使用して開発された。VSV-Gシュードタイプ化LVのベクターストックは、以前に記載されたように[Follenzi A, et al.(2000).Nat Genet 25:217-222]、293T細胞(ATCC:CRL-1573, Rockeville, MD, USA)における3プラスミドリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによって調製された。感染性LVの力価は、他の場所に記載されたように[Charrier S, et al.(2005).Gene Ther 12:597-606]、qPCRによって、HT1080細胞(ATCC:CCL-121)において決定された。107~108ウイルス粒子(vp)/mLの力価のレンチウイルスストックが、ルーチンに入手された。
;3. アノテーションおよびマトリックスファイルの両方の、本明細書においてXLSと呼ばれる新しいExcelワークシートへのインポート。
PGK-coRPK治療用レンチウイルスベクターは、遺伝学的に矯正されたPKDマウスにおいて、貧血表現型の安定的かつ長期的な矯正をもたらす
PGK-coRPK LV(図2a)のインビボ効力を、PKDマウスに由来する系統枯渇BM細胞(Lin-細胞)の形質導入および移植によってアッセイした(図2b)。図2aは、対照ベクターにおけるEGFPトランスジーンの発現(上図)または治療用ベクターにおけるPKLR遺伝子cDNAのコドン最適化配列(coRPK)の発現(下図)を制御するヒトPGKプロモーターを保有する遺伝子療法実験全体で使用された自己不活化型レンチウイルスベクターの模式図である。coRPK配列は、アミノ酸配列の変化なしに、ヒトPKLR cDNAとの80.4%の相同性、マウスPklr cDNAとの76.5%の相同性を示した。図2bは、開発されたPGK-coRPKレンチウイルスベクターの機能性を解明するために実施された遺伝子療法プロトコルの模式図である。PKD表現型の矯正は、血液学的分析および代謝プロファイリングを通して、PBおよびBMにおける移植の後に4~9ヶ月間研究された。組み込み分析は、LVベクターの安全性を解明するため、全てのマウスに由来する異なる組織および時点で実施された。移植後280日目に、生着の安定性および安全性を試験するため、coRPKトランスジーンを保持する一次移植マウスに由来する全BMを、致死的に照射された雌PKDマウス(二次レシピエント)へ再び移植した。coRPK LVによって形質導入された欠損細胞を移植された致死的に照射されたPKDマウスは、非移植PKD同腹仔と比較して、またはEGFP LVによって形質導入された細胞を移植されたマウスと比較して、全ての試験された血中赤血球パラメータの有意な改善を示した(図3および表2)。
レンチウイルスに由来するRPK発現は、赤血球分化を正常化し、機能性成熟赤血球の生成を可能にする
PKDマウスは、代償的な赤血球生成機序によって引き起こされる、赤血球コンパートメントの特徴的な増大を示す(Min-oo et al 2004)。移植マウスにおける赤血球分化パターンの研究は、異所RPK発現がこの機序を逆転させることを示した(図7a、b)。EGFP発現PKDマウスは、BMおよび脾臓における未熟赤血球前駆細胞(亜集団I:前赤芽球および亜集団II:好塩基性赤芽球)の優勢ならびに後期赤血球細胞(集団IV:網状赤血球および成熟赤血球)の著しい減少を示したが、coRPK LVによって形質導入された細胞を移植されたマウスは、健常マウスと等しい、BMおよび脾臓における未熟赤血球前駆細胞(亜集団IおよびII)の有意な低下ならびに最後期赤血球コンパートメント(亜集団IV)の有意な増加を示した(図7a、b)。さらに、EGFP発現PKDマウスと異なり、coRPKトランスジーンを保持するものは、血漿中のエリスロポエチン(Epo)レベルの有意な低下を示した(図7c)。図8aは、脾臓からの全CFUを示し、図8bは、移植後140日目の骨髄を示す。ドットは、分析された各マウスのコロニー数を表し、線は各群における平均値±SEMを表す。データは、ノンパラメトリッククラスカル・ウォリス検定によって統計的に分析された。BM CFU含量の変化は認められなかったが(図8b)、治療用ベクターによって処置されたPKDマウスにおける赤血球生成の正常化は、脾臓前駆細胞数の正常レベルへの低下を伴った(図8a)。
coRPKレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞の移植は髄外赤血球生成および器官病理を逆転させる
RPK欠損赤血球の活発な破壊のため、EGFP発現PKDマウスは、健常対照と比較された時、200%を超える脾臓の重量およびサイズの増加を伴う急性脾腫を示した(図9a、b)。EGFP発現PKD肝臓切片における赤血球細胞クラスタの存在によっても支持される極度の髄外赤血球生成を示す、脾組織の構造の崩壊および赤脾髄の増大も、これらの動物において観察された(図9c)。注目すべきことに、coRPKトランスジーンの異所発現は、遺伝学的に矯正されたマウスにおいて脾臓および肝臓の病理を完全に逆転させ、RBC蓄積を低下させ、脾臓の組織学的構造およびサイズを正常化した(図9)。さらに、組織学的研究は、遺伝学的に矯正されたマウスの肝臓における鉄沈着物の完全な欠如を明らかにしたが、非移植群またはEGFP保持ベクターによって形質導入されたHSCを移植された群のいずれかからのPKDマウスは、連続的な溶血過程による極度の鉄過剰を示した(図9c)。全体として、PKDマウスにおける遺伝学的に矯正されたHSCの移植は、赤血球生成の正常な状態および溶血性貧血によって引き起こされた全ての二次的効果を回復させた。
PGK-coRPK LVに由来する発現は、WBC代謝バランスを改変することなく、RBCにおける解糖経路を回復させる
次に、本発明者らは、RPK酵素活性の機能的矯正を研究するため、全ての移植マウスおよび対照マウスの広範囲のメタボローム分析を実施した。ノンターゲットプロファイリング戦略に従って、本発明者らは、異なる群の間のRBC内の解糖中間体の有意な変化を観察し、別個の傾向を有する代謝物質パターンの3つの広いクラスタを同定した(図10a)。coRPK発現マウスに由来するRBCは、健常対照と類似しており、EGFPトランスジーンを保持する移植マウスと異なる、クラスタ1からの代謝物質の増加を示した。同様に、クラスタ3は、野生型マウスと類似しており、EGFP発現マウスと異なる、遺伝学的に矯正されたマウスにおける低下した代謝物質傾向を反映した。にも関わらず、アッセイ1からのクラスタ2は、移植マウス群(EGFP発現マウスおよびcoRPK発現マウス)の間の代謝物質プロファイルの違いを示さなかった(図10a)。ノンターゲット代謝プロファイリングは、遺伝子改変が、いくつかの重要な解糖中間体を修飾することができ、PGK-coRPK LV形質導入HSCを移植されたマウスから単離された赤血球においてATP(図10b)、ADP(図10c)、およびピルビン酸(図10d)のレベルの増加を達成し得ることも示した。これらの代謝傾向を考慮して、次いで、本発明者らは、ターゲットプロファイリングアプローチを使用して、PK触媒反応のより近くに位置する他の代謝物質を分析した。PK触媒反応の上流に位置する、直接のPK基質ホスホエノールピルビン酸(PEP)(図10e)および3-ホスホグリセリン酸(3-PG)(図10f)のレベルは、健常対照マウスのものに近づいた。coRPKトランスジーンを発現する欠損赤血球は、EGFP発現PKDマウスと比較された時、嫌気的解糖の最終産物であるD-乳酸の増加も生じた(図10g)。解糖代謝物質の代償が、成熟赤血球におけるPK活性の正常化の結果であるか否かを試験するため、本発明者らは、この酵素の活性を測定し、欠損動物における多量の網状赤血球の影響を回避するため、ヘキソキナーゼ活性に対してそれを標準化した。白血球PK活性混入を防止するため、セルロースカラムを通してRBCを精製した。野生型健常動物および正常健常血液ドナーボランティアから入手されたものと類似した比に達する、PK活性の完全な代償が、coRPKを発現する動物において観察された(図11)。図11aは、対照マウスおよび形質導入細胞を移植されたマウスに由来するRBCにおけるピルビン酸キナーゼ活性を示し、図11bは、ヘキソキナーゼ活性を示し、図11cは、ピルビン酸キナーゼおよびヘキソキナーゼの酵素活性の比を示す。RBCは、白血球PK活性混入を回避するため、セルロースカラムを通して血液試料から精製され、酵素活性評価に供された。黒色バー、健常マウス(n=2);白色バー、EGFP発現ベクターによって形質導入された細胞を移植されたマウス(n=3);斜線付きのバー、coRPK発現ベクターによって形質導入された細胞を移植されたマウス(n=3)。格子縞のバーは、健常ボランティアからの値を表す(n=1)。データは、各群の平均値±SEMを表す。
PGK-coRPK LV形質導入細胞はベクター遺伝毒性の証拠なしにポリクローナル造血再構築を与える
coRPKトランスジーンまたはEGFPトランスジーンのいずれかを保持するLVの組み込みプロファイルを、移植マウスにおいて分析した。LVのゲノムワイドの組み込みプロファイルに起因して、各挿入は、個々の形質導入細胞におけるクローン挙動を追跡するために使用することができる独特の遺伝子マークを作出する。一次移植マウスおよび二次移植マウスに由来するWBCおよびBM細胞から、ゲノムDNA(gDNA)を入手し、移植前の形質導入細胞プール(Lin-細胞)からも入手した。ベクター/ゲノムジャンクションを増幅し、ベクター挿入部位(IS)を同定するため、線形増幅媒介(Linear Amplification Mediated)PCR(LAM-PCR)を使用した(図13および14)。図13は、3'ベクターLTR-ゲノムジャンクションのLAM-PCR増幅によってベクター組み込み部位が同定されたことを証明する。いくつかのバンドを特徴とするパターンを生成するMultiNA自動系を使用した。ベクター骨格に由来するTsp509I内部対照バンド(IC)は、矢印によって示される。図14は、3'ベクターLTR-ゲノムジャンクションのLAM-PCR増幅によってベクター組み込み部位が同定されたことを証明する。いくつかのバンドを特徴とするパターンを生成するMultiNA自動系を使用した。ベクター骨格に由来するHpyCH4IV5内部対照バンド(IC)は、矢印によって示される。
ヒト臨床試験
臨床試験は、脾摘出に対して抵抗性の重症輸血依存性貧血の病歴を有するピルビン酸キナーゼ欠損症を有する患者において、EU/3/14/1130医療用生成物(RPK遺伝子を含有しているレンチウイルスベクターによって形質導入された自己CD34+造血幹細胞)を使用した自己造血幹細胞移植(HSCT)の安全性および予備効力を評価するために実施される。
骨髄(BM)または動員された末梢血細胞のいずれかから、PKD患者由来のCD34+前駆細胞を採集した後、それらを医療用生成物によってエクスビボで形質導入し、治療用ベクターを細胞のゲノムに組み込む。組み込まれた後、PKD成熟赤血球において欠如しているかまたは低下している治療用RPKタンパク質が産生されるよう、治療用ヒト遺伝子(coRPK)が、欠損細胞において転写され翻訳される。次いで、形質導入されたPKD造血前駆細胞は、遺伝学的に矯正され、従って、機能を達成するために十分な量のATPを有するRBCを産生することができる(図22)。(医療用生成物を構成する)これらの遺伝学的に矯正された造血前駆細胞は、次いで、患者に、戻し移植され、生着後、一生、正常な赤血球を生成し、疾患を治療する。
患者は、それぞれの病院において動員されるが、最初の2人の患者は、Hospital del Nino Jesus(Madrid, Spain)において動員されるであろう。動員過程は、12mg/kgの用量の組換え刺激因子顆粒球コロニー(G-CSF、Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)の生後8日間までの1日2回の投与、240mg/kg/dのプレリキサホル(Mozobil(登録商標)、Genzyme Europe BV, Naarden, Netherlands)の4日目から4日連続の4回の皮下投与であろう。末梢血由来の造血前駆細胞が、MadridのHospital Nino Jesusにおいて、標準的なプロトコルに従って、細胞分離装置を通して、動員の5日目から、白血球アフェレーシスによって大量に収集される。全ての器機および溶液が、CEマーク付きであり、医療機器に関する法律の明細を満たしている。
動員過程と一致して、アフェレーシスは、患者が動員される病院において行われるであろう。アフェレーシスは、強力な永久磁石および強磁性マトリックスを含む分離カラムを通した高磁場勾配による細胞の分離を可能にするMACS「磁気細胞選別」テクノロジー(Miltenyi Biotec, Germany)を通して、造血前駆細胞(CD34+細胞)を選択するため、即座に処理されるであろう。CliniMACS(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)系は、コンピューター(CliniMACS(登録商標)plus Instrument)、特異的CD34+選択ソフトウェア、無菌チューブのセット(CliniMACS Tubing Sets)、磁気によって調節される反応性無菌器機(CliniMACS CD34 Reagent)、および無菌緩衝液(CliniMACS PBS/EDTA Buffer)からなる。使用される器機および試薬は、CEマーク付きであり、医療機器に関する法律の明細を満たしている。この相および後の洗浄において、非特異的免疫グロブリン(静脈内フレボガンマ(Flebogamma)5% 0.5gr、Grifols)およびヒトアルブミン(ヒトアルブミンGrifols(登録商標)20%、Grifols)が利用され、それらは遠心分離後の洗浄によって後に除去される。次いで、CD34+細胞が定量化される。入手された生成物に対する微生物学的調節は、特定のプロトコルによる培養のため、標準的な真菌、好気性細菌、および嫌気性生物の試料を採取することによって実施される。
精製されたCD34+細胞のODD EU/3/14/1130による形質導入は、患者からの細胞の抽出(アフェレーシス)から48時間以内の時間枠でGMP条件下で行われる。細胞のエクスビボ培養を、48時間未満続け、適切に製剤化された培地X-vivo-20(Lonza)の使用、造血増殖因子(10Ong/ml hrSCF、10Ong/ml hrFlt-3、10Ong/ml TPO、および20ng/mL IL-3(全て、Prepotech))、1μg/mLプルモザイム(Pulmozyme)、ならびに調節された5%O2濃度の添加を含む、確立された標準に従って培養する。形質導入は、VIVEbiotech(San Sebastian, Spain)によって作製されたODD EU/3/14/1130のGMPレンチウイルスバッチによって実施される。形質導入後、細胞は、X-vivo-20(Lonza)で洗浄され、最終的には、凍結保存のために適当な輸送バッグにパッケージングされる。最終生成物が最終的な遊離のための既に言及された全ての明細を満たするか否かを決定するため、特定の試料が収集される。3種の独立のバリデーションが、生成物の安定性を評価するために実施される。ベクターを含む全ての生成物および溶液が、医療機器および臨床的使用についての法律の明細を満たす。作製の前に、(消耗品、生物学的試薬、および化学的粉末を含む)全ての原材料が、標準操作手順(SOP)に従って、Quality Control(QC)Unit of CliniStemによって検査される。
患者は、治験のために考慮された標準化された特定のプロトコルに従ってコンディショニングされる。代替のコンディショニングのために患者を考慮するため、調製された生成物が処置された患者の造血を完全に再構成しないケースにおいて使用するため、2×106個の未操作のCD34+細胞/kgのバックアップを凍結する。
注入前に、研究の必要条件を満たすことを確実にするため、患者の適格性をチェックする。注入の日、使用された前投薬および予防的投薬を記録する。
非臨床開発
以前の研究は、25%を超える遺伝学的に矯正された細胞が移植された時、マウスにおけるPKDのHSC遺伝子療法が実行可能であることを証明した。これらの結果は、PKDにおける治療効果を達成するためには、相当数のドナー遺伝子矯正HSC(Zaucha, Yu et al. 2001)および高レベルのトランスジーン発現が必要であることを示唆する。本発明者らは、2014年8月にオーファンドラッグとして指定された、PKLR cDNAの発現を駆動するhPGK真核生物プロモーターを保有している、この臨床試験のために提唱された新しい治療用レンチウイルスベクターを開発した(EU/3/14/1130)。このベクターを用いて、本発明者らは、疾患のマウスモデルにおいてPKDの前臨床遺伝子療法プロトコルを実施した。臨床標準に基づくレンチウイルス投薬量で、異所RPK発現は、赤血球コンパートメントを正常化し、血液学的表現型を矯正し、器官病理を逆転させることができた。メタボローム研究は、遺伝学的に矯正されたRBCにおける解糖経路の機能的矯正を証明し、白血球における代謝妨害は観察されなかった。注目すべきことに、RPKがPGKのような偏在性プロモーターの活性の下で異所発現される時、平行して分析されたWBCは、白血球における代謝バランスの変更を示さず、そのことから、可能性のある安全性問題としての白血球代謝優位性が除外され、EU/3/14/1130ベクターの治療可能性が強化される。
臨床開発
現在までのところ、医療用生成物による臨床研究は実施されていない。プロトコルアシスタンスが規制当局へ必要とされるのは、これが最初である。本発明者らの目標は、European Commissionによって支援された臨床試験を実施することである。欧州の種々の臨床医および基礎研究者によって構成されるForGeTPKDコンソーシアムが、PKD研究および新しい治療戦略の開発に焦点を当てるために設立されている。ForGeTPKD臨床試験は、ヒトにおけるこの医療用生成物の最初の投与になる。それは、重症ピルビン酸キナーゼ欠損症を有する患者における赤血球型ピルビン酸キナーゼ(RPK)遺伝子を含有しているレンチウイルスベクター(EU/3/14/1130)によってエクスビボで形質導入された自己CD34+細胞の移植の安全性および効力を評価するための国際多施設第I/II相非盲検研究として設計される。
医療用生成物は、現時点で販売承認を有していない。PKDコンソーシアムの目的は、最終的に販売承認を受けるため、医療用生成物の臨床開発へ前進することである。
薬理学
完了した研究:開発された医療用生成物は、PKDの遺伝子療法のためのいくつかの利点を提供する数種の改変を配列内に含む:(1)SIN-LVベクター設計の使用が、HSCを効率的に形質導入することができるウイルスストックの比較的容易で安全な作製を可能にした;(2)メチル化によるサイレンシングを受けにくい(Gerolami, Uch et al. 2000)hPGKのような弱い真核生物プロモーターの使用が、トランスジーンのより生理学的な発現をもたらし、臨床標準内のウイルス投薬量(1.65 VCN)で治療的レベルを達成する(Matrai, Chuah et al. 2010);(3)コドン最適化されたトランスジーン配列および変異型Wpre配列の存在が、トランスジーンmRNA安定性を増加させ:レポーター遺伝子が治療用ベクター配列に含まれず、可能性のある免疫原性の問題が回避された(Morris, Conerly et al. 2004);(Stripecke, Carmen Villacres et al. 1999)。
進行中の研究
(1)ヒト細胞におけるODD EU/3/14/1130の形質導入の効率の研究;(2)RPK治療用タンパク質の効率的な治療的な発現を得るための最適ベクターコピー数/細胞の明確化;および(3)造血幹細胞の能力を失うことなく、治療的な形質導入レベルを得るための最適条件の明確化:のための健常ドナーおよびPKD患者に由来するヒト造血前駆細胞の形質導入。
完了した研究には、以下のものが含まれる。(1)ヒトRPKの異所発現は、WBCにおける代謝バランスを変更することなく、RBCにおけるエネルギー的欠陥を矯正した;(2)ベクターのゲノム組み込み分析は、以下のことを証明した。(i)特定の細胞クローンの相対存在量の分析は、いくつかのマウスのオリゴクローナルな造血再構築を明らかにし、一次移植マウスおよび二次移植マウスについてのクローン優勢を示さなかった;(ii)挿入変異誘発のホールマークと見なされる好発組み込み部位(CIS、定義されたゲノム間隔におけるベクター組み込みの高密度クラスタ)は、遺伝毒性の兆候を示さず、経時的なCISの異常な濃縮も、マウスにおいて実施された2回の独立の遺伝子療法実験から検出されたCISも、高いシーケンスカウントによって提示されず、癌遺伝子を優先的に標的としなかった;(iii)レンチウイルス組み込みによって標的とされた遺伝子のジーンオントロジー(GO)分析およびゲノムの特定の領域におけるベクター組み込みの位置の研究は、癌、細胞増殖、またはアポトーシスの制御に関与する遺伝子クラスへの歪みを示さなかった;(iv)全体として、医療用生成物組み込み分析は、遺伝毒性の証拠を示さなかった。
ヒト臨床試験
臨床効力を試験するため、ForgetPKD治験を実施する。提唱された臨床試験は、脾摘出に対して抵抗性の重症輸血依存性貧血の病歴を有するピルビン酸キナーゼ欠損症を有する患者において、EU/3/14/1130医療用生成物(赤血球型ピルビン酸キナーゼ(RPK)遺伝子を含有しているレンチウイルスベクターによって形質導入された自己CD34+造血幹細胞)を使用した自己造血幹細胞移植(HSCT)の安全性および予備的な効力を評価することを目標とする。
初回診察:プレスクリーニング診察
可能性のある候補に、治験の目的および特徴が通知され、インフォームド・コンセント文書が二通入手され、記入され、患者(未成年の場合、法定代理人)によって署名される。研究に適格であるため、患者は、全ての選択基準を満たしていなければならず、いかなる除外基準も満たしていてはならず、それがチェックされる。これは、A. 非生着のケースのバックアップとして役立つ体重1kg当たり2×106個のCD34+細胞を保管し、B. 医療用生成物を生成し、医療用生成物の遊離のために必要とされる全ての品質管理を実施するため、体重1kg当たり少なくとも6×106個のCD34+細胞をEU/3/14/1130ベクターによって形質導入するため、生CD34+細胞を動員し入手するための前処理手法を含む。医療用生成物の遊離の後に十分な形質導入細胞(体重1kg当たり2×106個の形質導入CD34+細胞)が入手可能である患者のみが、研究に含まれる。
-関連する病歴および手術歴の登録
-人口統計的データおよび臨床的に関連する身体検査所見の登録
-関連する併用薬の登録
-ルーチンの血球数算定(CBC)、生化学、凝固決定、および血清学のための末梢血試験
-心エコー図、肺機能試験、および胸部X線
-生活の質に関する調査票(SF-36またはPEDSQL)
-PKDの遺伝学的診断
Claims (25)
- 5'から3'の順で
(a)プロモーター配列;
(b)遺伝子産物をコードする配列;および
(c)リボ核酸(RNA)輸送シグナル
を含むポリヌクレオチド配列を含み、該プロモーター配列が、ピルビン酸キナーゼポリペプチドをコードする配列に機能的に連結されている、発現カセット。 - プロモーターがホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである、請求項1記載の発現カセット。
- 遺伝子産物が治療用遺伝子産物である、請求項1または2記載の発現カセット。
- 治療用遺伝子産物がピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意で、肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR;pyruvate kinase, liver and red blood cell)ポリペプチドである、請求項3記載の発現カセット。
- 遺伝子産物をコードする配列がコドン最適化されている、請求項1~4のいずれか一項記載の発現カセット。
- RNA輸送シグナルが変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Wpre)である、請求項1~5のいずれか一項記載の発現カセット。
- 変異型Wpreが、SEQ ID NO:1との少なくとも80%の同一性を有する配列を含むキメラWpreである、請求項6記載の発現カセット。
- 1個または複数個のエンハンサー配列をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項記載の発現カセット。
- ポリプリントラクト(PPT)またはポリアデニル化(ポリA)シグナル配列をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項記載の発現カセット。
- 以下の配列のうちの1個または複数個をさらに含む、請求項1~9のいずれか一項記載の発現カセット:
(i)パッキングシグナル配列;
(ii)短縮型Gag配列;
(iii)Rev応答要素(RRE);
(iv)セントラルポリプリントラクト(cPPT);
(v)セントラルターミナル配列(CTS);および
(vi)上流配列要素(USE)、任意で、サルウイルス40由来のもの(SV40-USE)。 - 5'および3'の長い末端反復配列をさらに含む、請求項1~10のいずれか一項記載の発現カセット。
- 請求項1~11のいずれか一項記載の発現カセットを含む組換え遺伝子送達ベクター。
- ウイルスまたはウイルスベクターである、請求項12記載の組換え遺伝子送達ベクター。
- ウイルスまたはウイルスベクターがレンチウイルス(LV)である、請求項13記載の組換え遺伝子送達ベクター。
- 請求項1~11のいずれか一項記載の発現カセットまたは請求項12~14のいずれか一項記載の遺伝子送達ベクターを含む、細胞。
- 造血幹細胞である、請求項15記載の細胞。
- 運命付けられた(committed)造血赤血球前駆細胞である、請求項15記載の細胞。
- 薬学的に許容される賦形剤と、請求項12~14のいずれか一項記載の組換え遺伝子送達ベクターまたは請求項15~17のいずれか一項記載の細胞とを含む、薬学的組成物。
- その必要のある対象へ請求項18記載の薬学的組成物を提供する工程を含む、該対象における疾患または障害の処置または防止の方法。
- 疾患または障害がピルビン酸キナーゼ欠損症(PKD)であり、遺伝子産物がピルビン酸キナーゼ(PK)ポリペプチド、任意で、肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR)ポリペプチドである、請求項19記載の方法。
- 薬学的組成物が組換え遺伝子送達ベクターを含む、請求項19または20記載の方法。
- 薬学的組成物が細胞を含む、請求項19または20記載の方法。
- 細胞が対象に対して自己である、請求項22記載の方法。
- 細胞が対象に対して同種である、請求項22記載の方法。
- 1個または複数個の赤血球細胞を有効量の組換えウイルスベクターと接触させる工程を含む、赤血球細胞においてトランスジーンを発現させるための方法であって、ベクターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ヒト肝臓・赤血球型ピルビン酸キナーゼ(PKLR)cDNAトランスジーンのコドン最適化バージョン、および変異型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Wpre)を含み、該接触させる工程の後に1個または複数個の赤血球細胞において検出可能なレベルでPKLRが発現される、方法。
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