KR102673203B1 - Pklr의 유전자 발현 증강을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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센트로 데 인베스띠가씨오네스 에너제티까스 메디오암비엔딸레스 와이 테크놀로지까스, 오.에이., 엠.피.
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콘소르시오 센트로 데 인베스티카시온 비오메디카 엔 레드
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Abstract

본 발명은, 피루베이트 키나제 결손에 대한 유전자 치료를 제공하기 위해 폴리뉴클레오티드 카세트, 발현 벡터 및 포유동물에서 유전자의 발현 방법을 제공한다.

Description

PKLR의 유전자 발현 증강을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENE EXPRESSION OF PKLR}
[관련 출원의 상호-참조]
본 출원은, 2016년 4월 20일자로 출원된 미국 가특허원 제62/325,397호를 우선권으로 주장하고, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.
[발명의 분야]
본 발명은 피루베이트 키나제 결손의 유전자 치료에 관한 것이다.
피루베이트 키나제 결손(PKD)은, PKLR 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 단인자 대상성 질환이고, 다양한 증상의 용혈성 빈혈을 유도하며 신생아 기간 동안 치명적일 수 있다. PKD 열성 유전 형질 및 동종이계 골수 이식에 의한 이의 치유적 치료는 유전자 치료 접근법을 개발하기 위한 이상적 시나리오를 제공한다.
적혈구에 영향을 미치는 기타 다수의 유전적 효소 결손 중에서, 피루베이트 키나제 결손(PKD)은 만성 비구상 용혈성 빈혈(CNSHA)을 유발하는 가장 빈번한 것이다[참조: Zanella et al. 2007]. PKD의 발증 및 중증도는 매우 변동하고, 경도로부터 중도의 신생아 빈혈의 범위이며, 가장 심각한 증례에서는 소아기에 치명적으로 된다[참조: Pissard et al 2006]. 신생아 기간 동안 성장 지연, 태아 수포 및 사망은 또한 낮은 빈도로 보고되어 있다[참조: Gilsanz et al. 1993]. PKD의 유병률은 일반적인 백인 모집단에서 1:20,000으로 추정되고[참조: Beutler et al 2000], 이제까지 PKLR 유전자의 195종 이상의 돌연변이가 동정되어 있다[참조: http://www.lovd.nl/pklr]. 동종이계 골수 이식(BMT)은 중도의 PKD 환자를 치료하는데 성공적으로 사용되었지만[참조: Tanphaichitr et al 2000], 조직적합성 공여체의 이용률이 낮고, 이들 환자의 BMT와 연관된 중대한 합병증(즉, 이식편 대 숙주 질환, 기회 감염 등)은 정기적 수혈 및 비장 적출을 PKD의 대부분의 주요한 치료적 옵션으로 되게 하고[참조: Zanella et al 2005], 환자의 나환률 및 사망률을 현저히 증가시킨다[참조: Hilgard et al 2005]. 중도의 PKD 환자 및 이의 열성 유전 형질에 대해 치료 옵션의 한정된 유효성 및 부작용은 PKD를 유전자 치료에 의해 치료되는 적합한 질환으로 되게 한다.
PKD는, 모든 세포에서 해당 경로의 최후 ATP-생성 반응을 촉매하는 피루베이트 키나제(PK) 효소의 결손에 의해 유발된다[참조: Zanella 2005]. 성숙 적혈구에서 PK는, RBC가 PKLR 유전자좌의 적혈구 특이적 대체 프로모터의 조절에 기인하여[참조: Noguchi et al 1987] R-유형 특이적 이소형(RPK)을 유일하게 발현하기 때문에 필수적으로 된다[참조: Kanno et al 1992]. 따라서, RPK 활성의 임의의 소실은 RBC 대사 및 수명을 손상시켜[참조: Zanella 2005] CNSHA를 유도한다.
유전적 및 기타 질환 및 장애를 치료 및 예방하기 위한 유망한 접근법은 치료제를 유전자 치료 벡터로 전달하는 것이다. 현재, 바이러스 벡터는 유전자 전달에서 최대 유효성을 나타내고, 지속적 유전자 발현이 요구되도록 유전적 질환의 수정을 위해, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 AAV 기반 벡터는 바이러스 수명 사이클의 통합 성질에 기인하여 바람직하다.
단일유전자 질환, 특히 조혈계에 영향을 미치는 것들의 유전자 치료는, 자가유래 조혈 줄기 세포(HSC)의 유전자 수정이 이의 주요 합병증을 회피하여 동종이계 HSCT에 대한 대체 치료 옵션이라는 확실한 증거를 제공했다[참조: Cartier et al 2009; Cavazzana-Calvo et al 2010; Cartier et al 2012; Aiuti et al 2013; Biffi et al 2013]. β-지중해혈증 및 겸상 적혈구 질환 등의 적혈구에 영향을 미치는 질환의 유전자 수정은 동물 모델[참조: Pestina et al 2009l Breda et al 2012] 및 또한 인간[참조: Cavazzana-Calvo et al 2010]에서 해결되었다. 그러나, PKD 등의 유전성 적혈구 대사 결손증을 위한 유전자 치료 접근법은 여전히 제한된다. PKD에 대한 HSC 유전자 치료의 실현가능성은 마우스[참조: Tani et al 1994; Meza et al 2009] 및 개 RPK 결손 실험 모델[참조: Trobridge et al 2012]에서 입증되었고, 공여체 키메리즘 및 형질도입 수준은, 공여체 유전자-수정된 HSC의 선택적 이점을 고려하여 용혈성 표현형의 효율적 수정에 도달하는 주요 포인트임을 나타낸다[참조: Richard et al 2004]. PKD 마우스 모델을 사용한 이전 연구는, 레트로바이러스-유래의 인간 RPK 발현이, 25% 초과의 유전적으로 수정된 세포를 이식하는 경우, PKD 표현형을 완전히 수정할 수 있음을 입증했다[참조: Meza et al 2009]. 수정된 세포의 유사한 치료 역치는, 생체내 확장된 및 발포 벡터-수정된 HSC를 주입한 하나의 PKD 바센지(Basenji) 개에서 최근에 보고되었다[참조: Trobridge et al 2012].
유전자 치료에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터의 설계와 관련하여 다수의 과제가 잔존한다. 한 가지 중요한 과제는 표적 세포에서 도입유전자의 충분한 발현을 수득하는 것이다. 당해 기술분야에서 장기간 충족되지 않은 필요성은 유전자 전달 후의 도입유전자의 충분히 강력한 발현이었다. 일부 경우에, 보다 효율적 발현은 특정한 벡터, 예를 들면, 플라스미드 DNA 벡터의 유효성을 위해 필요하다. 다른 경우에, 보다 양호한 안전성 프로파일 또는 보다 적은 침습성의 투여 경로를 갖는 더욱 낮은 치료 용량을 가능하게 하기 위해서는 보다 효율적 유전자 발현 카세트가 바람직하다.
치료용 도입유전자 발현이 이들의 LTR 서열에 의해 조절된다는 사실에 기인하여, 감마-레트로바이러스(γ-RV) 벡터가 사용되는 경우, 고도의 도입유전자 발현이 달성될 수 있다. 그러나, 이러한 종류의 벡터에 기초하는 최초의 임상 시험은, 몇몇 환자가 예기치 않은 백혈병을 발증했기 때문에[참조: Hacein-Bey-Abina et al 2008], 안전성의 관심이 높아졌다. LTR 서열의 강력한 프로모터 활성은, 프로토-온코진 프로모터의 활성화에 의해 또는 종양 억제인자 유전자의 억제에 의해 주변 유전자의 조절에 영향을 미쳐, 삽입 돌연변이유발을 유도할 수 있다[참조: Ott et al 2006; Howe et al 2008; Stein et al 2010; Braun et al 2014].
이들 발견은, PKD 유전자 치료를 위한 감마 레트로바이러스 벡터보다도 안전하고 효율적인 벡터의 사용 필요성을 강조했다.
한 가지 실시형태에서, 본 발명은, a) 프로모터 서열; b) 유전자 생성물을 코딩하는 서열; 및 c) 리보핵산(RNA) 외수송 시그널(export signal)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)로서, 프로모터 서열이 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결되고, 임의로 a) 내지 c)가 5'에서 3'의 순서로 발현 카세트에 존재하는, 발현 카세트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 치료용 유전자 생성물이다. 일부 실시형태에서, 치료용 유전자 생성물은 피루베이트 키나제(PK) 폴리펩티드, 임의로 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 유전자 생성물을 코딩하는 서열은 코돈-최적화되어 있다. 특정 실시형태에서, RNA 외수송 시그널은 우드척형 간염 바이러스(Wpre)의 돌연변이된 전사후 조절 요소이다. 특정 실시형태에서, 돌연변이된 Wpre는 서열번호 1과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 키메라 Wpre이다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 하나 이상의 인핸서(enhancer) 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 폴리퓨린 관(PPT) 또는 폴리아데닐화(polyA) 시그널 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 하기 서열 중의 하나 이상을 추가로 포함한다: i) 팩킹(packing) 시그널 서열; ii) 절단된(truncated) Gag 서열; iii) Rev 반응성 요소(RRE); iv) 중앙 폴리퓨린 관(cPPT); v) 중앙 말단 서열(CTS); 및 vi) 임의로, 유인원 바이러스 40(SV40-USE)으로부터의 상류 서열 요소(USE). 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 5' 및 3' 긴 말단 반복 서열을 추가로 포함한다.
관련 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 유전자 전달 벡터를 제공한다. 특정 실시형태에서, 재조합 유전자 전달 벡터는 바이러스 또는 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 바이러스 또는 바이러스 벡터는 렌티바이러스(LV)이다.
또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 개시된 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 혈액 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 적혈구계 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 골수 세포, 예를 들면, 계통 고갈된 골수 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 위탁된 조혈 적혈구 전구 세포이다.
또 다른 관련 실시형태에서, 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 본원에 개시된 재조합 유전자 전달 벡터 또는 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 개시된 발현 카세트, 유전자 전달 벡터 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 한 가지 실시형태에서, 질환 또는 장애는 피루베이트 키나제 결손(PKD)이고, 유전자 생성물은 피루베이트 키나제(PK) 폴리펩티드, 임의로 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 재조합 유전자 전달 벡터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 세포를 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 세포는 대상체에 대해 자가유래이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다.
관련 실시형태에서, 본 발명은, 하나 이상의 적혈구계 세포를 유효량의 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 적혈구계 세포에서 도입유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 벡터가 인간 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 인간 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) cDNA 도입유전자의 코돈 최적화된 버전, 및 우드척형 간염 바이러스의 돌연변이된 전사후 조절 요소를 포함하고, 상기 접촉 후, PKLR이 하나 이상의 적혈구계 세포에서 검출가능한 수준으로 발현되는, 방법을 제공한다.
정의
본원에서 사용된 "벡터"는, 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이와 회합하고 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달을 매개하기 위해 사용될 수 있는 거대분자 또는 거대분자의 회합을 지칭한다. 예시적 벡터는, 예를 들면, 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 기타 유전자 전달 비히클을 포함한다.
용어 "LV"는 렌티바이러스의 약어이고, 바이러스 자체 또는 이의 유도체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이 용어는, 달리 필요한 경우를 제외하고, 모든 서브타입 및 천연 존재 및 재조합 형태 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자" 또는 "코딩 서열"은 유전자 생성물을 코딩하는 시험관내 또는 생체내 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 예에서, 유전자는 코딩 서열, 즉 유전자 생성물을 코딩하는 서열로 이루어지거나 실질적으로 이들로 이루어진다. 다른 예에서, 유전자는 추가의 비-코딩 서열을 포함한다. 예를 들면, 유전자는 코딩 영역 전후의 영역, 예를 들면, 개개 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론) 뿐만 아니라, 5' 비번역된(5' UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료용 유전자"는, 발현되는 경우, 각각이 존재하는 세포 또는 조직, 또는 유전자가 발현된 포유동물에게 유익한 효과를 부여하는 유전자를 지칭한다. 유익한 효과의 예는 상태 또는 질환의 징후 또는 증상의 개선, 상태 또는 질환의 예방 또는 억제, 또는 목적하는 특성의 부여를 포함한다. 치료용 유전자는 세포 또는 포유동물에서 유전자 결손을 수정하는 유전자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 도입유전자는 벡터에 의해 세포에 전달되는 유전자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 생성물"은, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA), miRNA 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함하는 간섭 RNA 등의 폴리뉴클레오티드 서열의 목적하는 발현 생성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭한다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 폴리머; 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 포스포릴화, 또는 표지 성분과의 접합을 포함한다.
"포함하는"이란, 열거된 요소가, 예를 들면, 조성물, 방법, 키트 등에 요구되지만, 다른 요소가 특허청구범위 내에서, 예를 들면, 조성물, 방법, 키트 등을 형성하기 위해 포함될 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 프로모터에 작동적으로 연결된 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 "포함하는" 발현 카세트(expression cassette)는 유전자 및 프로모터 이외의 다른 요소, 예를 들면, 폴리-아데닐화 서열, 인핸서 요소, 기타 유전자, 링커 도메인 등을 포함할 수 있는 발현 카세트이다.
"실질적으로 이루어진"이란, 예를 들면, 조성물, 방법, 키트 등의 기본적 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특정의 재료 또는 단계로 기재된, 예를 들면, 조성물, 방법, 키트 등의 범위의 한정을 의미한다. 예를 들면, 프로모터 및 폴리아데닐화 서열에 작동적으로 연결된 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 "실질적으로 이루어진" 발현 카세트는, 이들이 유전의 전사 또는 번역에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 추가 서열, 예를 들면, 링커 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 열거된 서열로 "실질적으로 이루어진" 변이체, 또는 돌연변이체, 폴리펩티드 단편은, 전체 길이 천연 폴리펩티드에 기초하여 서열의 경계에서 약 ±10개 아미노산 잔기의 인용된 서열의 아미노산 서열을 갖고, 이로부터, 예를 들면, 열거된 경계 아미노산 잔기보다 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 적은 잔기, 또는 열거된 경계 아미노산 잔기보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 많은 잔기를 유도한다.
"이루어진"이란, 특허청구범위에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분의 조성물, 방법 또는 키트로부터의 제외를 의미한다. 예를 들면, 프로모터에 작동적으로 연결된 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 전사후 조절 요소로 "이루어진" 발현 카세트는 프로모터, 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 전사후 조절 요소만으로 구성되어 있다. 또 다른 예로서, 열거된 서열로 "이루어진" 폴리펩티드는 열거된 서열만을 함유한다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는, 목적하는 유전자 생성물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 상기 기재된 또는 당해 기술분야에 공지된 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 미니서클, 바이러스 벡터, 리포좀 등을 포함하고, 의도된 표적 세포에서 유전자 생성물의 발현을 실시하기 위해 사용된다. 발현 벡터는 또한 표적에서 유전자 생성물의 발현을 촉진하기 위해 코딩 영역에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함한다. 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), UTR, miRNA 표적화 서열 등의 조절 요소, 및 이들이 발현을 위해 작동적으로 연결되는 유전자 또는 유전자들의 조합은 종종 "발현 카세트(expression cassette)"로서 지칭된다. 다수의 이러한 조절 요소는 당해 기술분야에 공지되어 있고 이용가능하거나, 당해 기술분야에서 이용가능한 성분으로부터 용이하게 구성할 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"는, RNA 폴리머라제의 결합을 지시하고 이에 의해 RNA 합성을 촉진하는 DNA 서열, 즉 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 포함한다. 프로모터 및 상응하는 단백질 또는 폴리펩티드 발현은 편재성일 수 있고, 이는 광범위한 세포, 조직 및 종에서 강력하게 활성적이거나, 세포-타입 특이적, 조직-특이적 또는 종 특이적임을 의미한다. 프로모터는, 지속적으로 활성적인 것을 의미하는 "구성적"일 수 있거나, 프로모터가 생물적 또는 비생물적 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성화되거나 불활성화될 수 있음을 의미하는 "유도성"일 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 작제물 또는 벡터에는, 프로모터 서열과 연속하거나 연속하지 않을 수 있는 인핸서 서열이 포함된다. 인핸서 서열은 프로모터-의존성 유전자 발현에 영향을 미치고, 천연 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치될 수 있다.
본원에 사용된 "인핸서(enhancer)"는 인접한 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 시스-작용 요소를 포함한다. 전사를 억제하는 인핸서는 또한 "사일런서"로서 불리운다. 인핸서는, 코딩 서열로부터 및 전사된 영역 하류의 위치로부터 수 킬로베이스 쌍(kb)까지의 거리에 걸쳐 어느 하나의 배향으로 기능할 수 있다(즉, 코딩 서열과 회합할 수 있다).
본원에 사용되는 "종결 시그널 서열"은, 예를 들면, 폴리아데닐화 시그널 서열 등과 같이 전사를 종결하기 위해 RNA 폴리머라제를 유발하는 임의의 유전적 요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 유전 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 종결 시그널 서열, 폴리아데닐화 서열 등의 병치를 지칭하고, 여기서 이러한 요소들은 이들을 예상된 방식으로 작동하게 하는 관계에 있다. 예를 들면, 프로모터는, 해당 프로모터가 코딩 서열의 전사를 개시하는 것을 보조하는 경우, 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한, 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성"은, 이들이 비교되는 실체의 나머지 것으로부터 유전적으로 상이한 실체로부터 유래하는 것을 의미한다. 예를 들면, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 종으로부터 유래된 플라스미드 또는 벡터에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종성 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 예로서, 이의 천연 코딩 서열로부터 제거되고 그것이 자연적으로 결합하지 않는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종성 프로모터이다. 따라서, 예를 들면, 이종성 유전자 생성물을 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 LV 벡터는, 천연에 존재하는 야생형 LV에 통상 포함되지 않는 핵산을 포함하는 LV 벡터이고, 코딩된 이종성 유전자 생성물은 천연에 존재하는 야생형 LV에 의 통상 코딩되지 않은 유전자 생성물이다.
뉴클레오티드 분자 또는 유전자 생성물과 관련하여 본원에 사용된 용어 "내인성"은 핵산 서열, 예를 들면, 유전자 또는 유전적 요소 또는 유전자 생성물, 예를 들면, RNA, 단백질을 지칭하고, 이는 숙주 바이러스 또는 세포에 천연적으로 존재하거나 이와 회합된다.
본원에 사용된 용어 "천연"은 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 유전자 또는 유전자 생성물, 예를 들면, RNA, 단백질을 지칭하고, 이는 야생형 바이러스 또는 세포에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "변이체"는, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열, 예를 들면, 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 돌연변이체, 즉 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 돌연변이체를 지칭한다. 달리 말하면, 변이체는, 참조 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 천연 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 차이(예를 들면, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 예를 들면, 변이체는 전장 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들면, 전장 천연 폴리뉴클레오티드 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예를 들면, 85%, 90% 또는 95% 이상, 예를 들면, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 예로서, 변이체는 전장 천연 폴리펩티드 서열과 70% 이상의 서열 동일성, 예를 들면, 전장 천연 폴리펩티드 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예를 들면, 85%, 90% 또는 95% 이상, 예를 들면, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 변이체는 또한 참조의 변이체 단편, 예를 들면, 참조 단편과 70% 이상의 서열 동일성을 공유하는 천연 서열, 예를 들면, 천연 서열과 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예를 들면, 85%, 90% 또는 95% 이상, 예를 들면, 98% 또는 99% 동일성을 공유하는 천연 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성"은 세포 중의 특정 생물학적 요소에 기인하는 활성을 지칭한다. 예를 들면, "면역글로불린", "항체" 또는 이의 단편 또는 변이체의 "생물학적 활성"은 항원 결정기에 결합하고 이에 의해 면역 기능을 촉진하는 능력을 지칭한다. 또 다른 예로서, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 생물학적 활성은, 예를 들면, 결합, 효소 활성 등의 이의 천연 기능을 실행하는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다. 제3 예로서, 유전자 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 코작 서열 등의 생물학적 활성은, 이것이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 조절, 즉 각각 촉진, 증강 또는 이의 번역을 활성화시키는 조절 요소 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체의 능력을 지칭한다.
용어 "투여하는" 또는 "도입하는"은, 본원에 사용된 바와 같이, 세포, 대상체의 세포 및/또는 기관, 또는 대상체에 재조합 단백질 발현을 위한 벡터의 전달을 지칭한다. 이러한 투여 또는 도입은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 실행할 수 있다. 유전자 생성물의 발현을 위한 벡터는, 전형적으로 물리적 수단(예를 들면, 인산칼슘 형질감염, 전기천공, 마이크로주입 또는 리포펙틴)에 의해 세포 내로 이종성 DNA의 삽입을 의미하는 형질감염에 의해; 전형적으로 감염제, 즉 바이러스에 의한 도입을 지칭하는 감염에 의해; 또는 전형적으로 바이러스를 사용한 세포의 안정한 감염 또는 바이러스제(예: 박테리오파지)에 의해 하나의 미생물로부터 또 다른 미생물로 유전자 물질의 전달을 의미하는 형질도입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
"형질전환"은 전형적으로, 암유전자를 발현하고 따라서 종양 유전자 등의 연속 성장 모드로 전환된 이종성 DNA 또는 세포를 포함하는 세균을 지칭하기 위해 사용된다. 세포를 "형질전환"하는데 사용된 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 비히클일 수 있다.
전형적으로, 세포는 "형질도입", "감염된"으로 지칭되고; 이종성 DNA(즉, 벡터)의 세포로의 투여, 도입 또는 삽입에 사용된 수단에 의존하여 "형질감염" 또는 "형질전환"으로 지칭된다. 용어 "형질도입된", "형질감염된" 및 "형질전환된"은 이종성 DNA의 도입 방법과 관계 없이 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는, 벡터로 형질도입, 감염, 형질감염 또는 형질전환된 세포를 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등일 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 이전에 사용된 것들이고, 당업자에게는 명백할 것이다. 용어 "숙주 세포"는 본래 형질도입된, 감염된, 형질감염된 또는 형질전환된 세포 또는 이의 자손을 지칭한다는 것이 이해된다.
용어 "치료", "치료하는" 등은, 일반적으로, 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 이 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것, 예를 들면, 그 질환 또는 증상이 대상체에서 발생할 가능성을 감소시키는 것의 점에서 예방적일 수 있고/있거나, 질환의 부분적 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, 하기를 포함한다: (a) 질환의 소인으로 될 수 있지만 이를 갖는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제, 즉 이의 발증을 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 경감, 즉 질환의 퇴행을 유발하는 것. 치료제는 질환 또는 상해의 발증 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상적 증상을 안정화 또는 감소시키는 진행중 질환의 치료는 특히 중요하다. 이러한 치료는 발병된 조직에서 기능의 완전한 소실 전에 수행하는 것이 바람직하다. 본 요법은 바람직하게는 질환의 증상 단계 동안, 및 일부 경우에 질환의 증상 단계 후에 투여된다.
용어 "개체", "숙주", "대상체" 및 "환자"는 본원에서 호환적으로 사용되고, 유인원 및 인간을 포함하는 인간 및 비-인간 영장류; 포유동물 스포츠 동물(예: 말); 포유동물 농장 동물(예: 양, 염소 등); 포유동물 펫(개, 고양이 등); 및 설치류(예: 마우스, 랫트 등)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 포유동물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어는 특정 실시형태만을 설명하는 목적을 위한 것이고, 본 발명을 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수 형태도 또한 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "갖다", "갖고" 또는 이의 변형이 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 측정되는 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위내를 의미하고, 이는 당해 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존한다. 예를 들면, "약"은 당해 기술분야의 관행에 따라 1 표준 편차 또는 1 표준 편차 초과를 의미할 수 있다. 달리는, "약"은 소정 값의 20%까지, 바람직하게는 10%까지, 보다 바람직하게는 5%까지 및 보다 바람직하게는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 달리는, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 이 용어는 소정 값의 1차수 이내, 바람직하게는 5배 이내, 및 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 특허청구범위에 기재되어 있는 경우, 특히 명기하지 않는 한, 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 상정되어야 한다.
달리 지시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는, 이들이 당업자에게 사용되고, 본 발명의 실시가 당업자의 지식 범위 내에 있는 종래 기술의 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 실시는, 달리 지시하지 않는 한, 세포 생물학, 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 사용하고, 이들은 당업자의 범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌[참조: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammanlian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); and "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]에 완전히 설명되어 있고, 이들 각각은 본원에서 참조에 의해 명확하게 도입된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에서 유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 카세트 및 발현 벡터를 제공한다. 또한, 예를 들면, 장애의 치료 또는 예방을 위해 세포, 예를 들면, 개체에서 유전자의 발현을 촉진시키는 임의의 조성물의 사용에 관한 약제학적 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 이들 및 기타 목적, 이점 및 특징은, 이하에 추가로 충분히 기재되어 있는 조성물 및 방법의 상세를 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 바이러스학의 분야에 관한 것이고, 특히 척추 동물의 선택된 세포 및 조직으로 선택된 치료용 작제물(예를 들면, 펩티드, 폴리펩티드, 리보자임 및 촉매적 RNA 분자)의 전달에 유용한 유전자 발현 카세트 및 이들을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특히, 이들 유전자 작제물은, 포유동물 및 특히 인간, 질환, 장애 및 기능부전의 치료를 위한, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 유전자 치료 벡터의 개발에 유용하다.
본 발명의 조성물은, 다양한 인간 질환의 예방 및 치료를 포함하는, 다양한 조사, 진단 및 치료 섭생에 이용될 수 있다. 본 발명의 다양한 조성물 및 방법은 하기에 기재되어 있다.
특정 조성물 및 방법이 본원에 예시되어 있지만, 임의의 다수의 대체 조성물 및 방법이 적용 가능하고 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 발현 작제물 및 방법의 평가는 당해 기술분야의 표준 절차를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 이해된다.
특정 실시형태에서, 방법 및 조성물은, 동물 및 특히 인간에서 질환, 장애 및 기능부전의 중심 및 표적화 유전자 치료에 유용한 의약의 제조에 사용하기 위한 이들 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 치료 벡터 조성물, 예를 들면, 바이러스 벡터를 제조하기 위해 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, PKLR cDNA의 발현을 유도하는 hPGK 진핵생물 프로모터를 보유하는 렌티바이러스 벡터에 기초하는 PKD를 위한 유전자 치료를 제공한다. 이러한 치료용 벡터는 마우스 PKD 조혈 줄기 세포(HSC)를 형질도입하기 위해 사용될 수 있고, 이어서 골수이식된 PKD 마우스로 이식될 수 있다. 이소성 RPK 발현은 조혈 표현형을 수정하고 기관 병상을 회복시키는 적혈구 구획을 정상화한다. 대사 연구는, 백혈구에서 대사 장해를 수반하지 않으면서, 유전적으로 수정된 PKD HSC로부터 유래된 RBC에서 해당 경로의 기능적 수정을 입증한다. 이식된 조혈 세포의 게놈에서 렌티바이러스 삽입 부위의 분석은 이식된 임의의 동물에서 유전독성의 증거를 나타내지 않는다. 전체적으로, 이 결과는 hPGK-coRPK 렌티바이러스 벡터의 치료 가능성을 강조하고, PKD 및 기타 적혈구 대사 유전적 장애의 유전자 치료에 대한 높은 기대를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PKD의 유전자 수정을 위한 RPK 렌티바이러스 벡터(LV)를 제공한다. 이 벡터를 사용한 뮤린 PKD-HSC의 유전자 변형은 이식된 PKD 마우스에서 용혈성 표현형 및 RBC 대사산물 프로파일을 효율적으로 수정할 수 있다. 놀랍게도, 벡터 통합으로부터 유래된 백혈구의 대사 장해 및 유전독성의 증거는 관찰되지 않고, 이는 PGK-coRPK LV 벡터의 치료 가능성을 뒷받침한다. 전체적으로, 이 결과는 임상 적용을 위해 설계된 LV를 갖는 PKD에 대한 유전자 치료의 실현가능성의 고무적 증거를 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태는 인간 PKLR 유전자의 코돈-최적화된 버전을 발현하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 이 발현 벡터는 프로모터 영역, 코딩 서열 및 전사후 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트의 특정 실시형태는 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 한 가지 실시형태에서, 프로모터는 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다.
본 발명의 일부 실시형태는 피루베이트 키나제의 증강된 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 전사시 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 인간 PKLR cDNA(coRPK)의 코돈-최적화된 버전을 포함한다. 최적화를 위해, GeneArt® 소프트웨어를 사용하여, GC 함량을 증가시키고, 전사 사일런싱을 회피하고 따라서 도입유전자 발현을 증가시키기 위해 불가해한 스플라이싱 부위를 제거할 수 있다. coRPK 최적화 서열은, 단백질의 아미노산 서열에서 변화 없이, 인간 PKLR 유전자와 80.4% 상동성을 나타냈다. 달리는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 최적화 방법을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 제2 인핸서의 하류의 RNA 외수송 시그널을 포함한다. RNA 외수송 시그널은 우드척형 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 잔존 개방 판독 프레임[참조: Schambach, Bohne et al. 2006]을 결여하는 우드척형 간염 바이러스(Wpre)의 돌연변이된 전사후 조절 요소는 치료용 유전자의 발현 및 안정성의 수준을 개선시키기 위해 또한 포함된다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 렌티바이러스이다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 및 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 유전자 전달 벡터 및 약제학적 부형제를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 포유동물 세포에서 도입유전자를 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 포유동물 세포를 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 유전자 전달 벡터와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 도입유전자는 하나 이상의 포유동물 세포에서 검출가능한 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 포유동물 세포를 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 또는 본 발명의 유전자 전달 벡터와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 도입유전자는 하나 이상의 포유동물 세포에서 치료 수준(therapeutic level)으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내이다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 생체내이다.
본 발명의 일부 양태에서, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에서 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 코딩 서열은 치료용 유전자 생성물을 코딩한다.
조성물
본 발명의 일부 양태에서, 진핵생물 세포(들)에서 도입유전자의 발현을 위한 조성물이 제공된다. 일부 양태에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 양태에서, 포유동물 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 골수 세포, 예를 들면, 계통 고갈된 골수 세포이다. 일부 양태에서, 포유동물 세포는 위탁된(committed) 조혈 적혈구 전구세포이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리뉴클레오티드 카세트이다. "폴리뉴클레오티드 카세트"란, 전형적으로 서로에 대해 작동가능한 연결로, 2개 이상의 기능적 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 조절 요소, 번역 개시 서열, 코딩 서열 및/또는 종결 서열 등을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 또한, "포유동물 세포에서 도입유전자의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 카세트"란, 세포에서 도입유전자의 발현을 촉진하는, 2개 이상의 기능적 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 5' UTR, 번역 개시 서열, 코딩 서열 및/또는 종결 서열의 조합을 의미한다.
예를 들면, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 카세트는 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 인간 PKLR cDNA의 코돈-최적화된 버전(coRPK), 및 우드척형 간염 바이러스(Wpre)의 돌연변이된 전사후 조절 요소를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, 인간 PKLR 프로모터는 하기 서열, 이의 기능적 단편, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
ATTATGGTAAATCCACTTACTGTCTGCCCTCGTAGCCATCGAGATAAACCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCC (서열번호 4).
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, 인간 PKLR 프로모터는 하기 서열, 이의 기능적 단편, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
TCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTCGTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGGCGCCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (서열번호 8).
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, RPE 서열은 하기 서열, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
TCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCT (서열번호 3).
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, psi 서열은 HIV-1 psi 서열이거나, psi 서열은 하기 서열, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
TCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAG (서열번호 5).
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, 5' LTR은 하기 서열, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT (서열번호 6).
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, 3' LTR은 하기 서열, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAG (서열번호 7).
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 포유동물 세포에서 도입유전자의 증강된 발현을 제공한다. 본 발명의 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 다수의 폴리뉴클레오티드 요소, 즉 당해 기술분야에 공지된 것들과 비교하여 개선된 요소를 발견했고, 이는 포유동물 세포에서 개별적으로 및 상승적으로 도입유전자의 증강된 발현을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 내의 2개 이상의 기능적 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬은 포유동물 세포에서 도입유전자의 증강된 발현을 제공한다. "증강된"이란, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 비교가능한 조절 요소에 작동적으로 연결된 도입유전자를 갖는 세포와 비교하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 갖는 세포에서 도입유전자의 발현이 증강, 증대 또는 강화되는 것을 의미한다. 또 다른 방식에서, 도입유전자의 발현은, 본 발명의 하나 이상의 최적화된 요소를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 카세트, 즉 참조 대조군의 발현과 비교하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트로부터 증가, 증대 또는 강화된다. 특정 실시형태에서, 증강된 발현은 하나 이상의 목적으로 세포 타입에 특이적이거나, 이들로 한정된다.
예를 들면, 도입유전자의 발현은, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 상이한 프로모터에 작동적으로 연결된 도입유전자를 포함하는 세포보다도 본원에 개시된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 세포에서 증강, 또는 증대, 또는 강화될 수 있다. 또 다른 예로서, 도입유전자의 발현은, 상이한 인핸서 서열에 작동적으로 연결된 도입유전자를 포함하는 세포보다도 본원에 개시된 인핸서 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 세포에서 증강, 또는 증가, 증대, 또는 강화될 수 있다.
프로모터 및 인핸서 요소는 조직 특이적 또는 단계 특이적일 수 있다. 예를 들면, 조직-특이적 프로모터 또는 인핸서는 하나 이상의 특정 세포 타입에서 발현(또는 보다 고도의 발현)을 우선적으로 유도한다. 세포 타입의 예는 조혈 줄기 세포, 장기간 조혈 줄기 세포, 단기간 조혈 줄기 세포, 다분화 전구세포, 조혈 CD34+ 세포 및 CD34+ 모집단 내의 임의의 클러스터 분화 아집단을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 단계-특이적 프로모터 또는 인핸서는 세포 사이클 또는 발달의 하나 이상의 특정 단계 동안 발현(또는 보다 고도의 발현)을 우선적으로 유도한다. 이들은 베터-글로빈 유전자좌 조절 영역, 아펙트린 프로모터 및 적혈구 특이적 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
이론에 구속되는 것은 아니지만, 세포에서 도입유전자의 증강된 발현은 세포에서 유전자 생성물의 보다 신속한 빌드-업 또는 세포에서 보다 안정한 유전자 생성물에 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트에 의한 도입유전자의 증강된 발현은 다수의 방식으로 관찰될 수 있다. 예를 들면, 증강된 발현은, 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 카세트의 접촉후 도입유전자의 발현을 보다 신속하게 검출함으로써 관찰될 수 있고, 예를 들면, 도입유전자가, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 비교가능한 조절 요소에 작동적으로 연결되었는지를 발현보다 2일 빠르게, 7일 빠르게, 2주 빠르게, 3주 빠르게, 4주 빠르게, 8주 빠르게, 12주 이상 빠르게 검출된다. 또한, 증강된 발현은 세포당 유전자 생성물의 양의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포당 유전자 생성물의 양태에서 2배 이상의 증가, 예를 들면, 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가 또는 10배 이상의 증가가 있을 수 있다. 증강된 발현은 또한, 폴리뉴클레오티드 카세트에 의해 보유된 도입유전자의 검출가능한 수준을 발현하는 포유동물 세포의 수의 증가로서 관찰될 수 있다. 예를 들면, 도입유전자의 검출가능한 수준을 발현하는 포유동물 세포의 수에서 2배 이상의 증가, 예를 들면, 3배 이상의 증가, 4배 이상의 증가, 5배 이상의 증가 또는 10배 이상의 증가가 있을 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상의 폴리뉴클레오티드 카세트와 비교하여 검출가능한 수준의 도입유전자를 세포의 보다 큰 퍼센트로 촉진시킬 수 있고; 예를 들면, 통상의 카세트가, 예를 들면, 특정 영역에서 검출가능한 수준의 도입유전자 발현을 세포의 5% 미만으로 촉진시킬 수 있는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당해 영역에서 검출가능한 수준의 발현을 세포의 5% 이상으로 촉진시키고; 예를 들면, 접촉되는 세포의 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 또는 45% 이상, 일부 경우에, 50% 이상, 55% 이상; 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상, 예를 들면, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상은 검출가능한 수준의 유전자 생성물을 발현할 것이다. 증강된 발현은 또한 세포의 생존능 및/또는 기능의 변화로서 관찰될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 전형적으로 프로모터 영역을 포함한다. 임의의 적합한 프로모터 영역 또는 그 중의 프로모터 서열은, 해당 프로모터 영역이 진핵생물 세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진하는 한, 본 폴리뉴클레오티드 카세트에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터 영역은 포유동물 세포에서 코딩 서열의 발현을 촉진시킨다. 일부 예에서, 프로모터는 편재성 프로모터이고, 즉 이는 광범위한 세포, 조직 및 종에서 활성적인 프로모터이다. 다른 예에서, 프로모터는 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 인핸서는 전사를 증강시키는 것으로 당해 기술분야에 공지된 핵산 요소이고, 예를 들면, 상류, 하류, 인트론내 등의 이들이 조절하는 유전자와 관련하여 어느 곳에도 위치할 수 있다. 임의의 인핸서 요소는, 프로모터와 조합하여 사용되는 경우, 유전자의 발현을 증강시키는 한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트 및 유전자 치료 벡터에 사용될 수 있다.
세포에서 발현되는 코딩 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 RNA-계 치료제(siRNA, 안티센스, 리보자임, shRNA 등)를 코딩하는 유전자 또는 cDNA일 수 있다. 코딩 서열은, 이것이 작동적으로 연결되는, 즉 이것과 자연적으로 작동적으로 연결되지 않는 프로모터 서열에 대하여 이종성일 수 있다. 또는, 코딩 서열은, 이것이 작동적으로 연결되는, 즉 해당 프로모터와 자연적으로 회합되는 프로모터 서열에 대하여 내인성일 수 있다. 유전자 생성물은 포유동물 세포 내에서 본질적으로 작용할 수 있거나, 외인적으로 작용할 수 있고, 예를 들면, 분비될 수 있다. 예를 들면, 도입유전자가 치료용 유전자인 경우, 코딩 서열은, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있는 목적하는 유전자 생성물 또는 기능적 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 임의의 유전자일 수 있다. 다양한 바람직한 실시형태에서, 도입유전자는 인간 PKLR을 코딩한다.
본 발명의 한 가지 실시형태에서, 도입유전자 코딩 서열은, 빈도가 낮게 발현되는 코돈을 보다 빈번하게 발현되는 코돈으로 치환함으로써 발현을 증강시키기 위해 변형되거나 "코돈 최적화"된다. 코딩 서열은 번역을 위해 아미노산을 코딩하는 mRNA 서열의 부분이다. 번역 동안, 각각의 61개 트리뉴클레오티드 코돈은 20개 아미노산 중의 하나로 번역되어, 유전자 코드에서 축퇴 또는 중복을 유도한다. 그러나, 상이한 세포 타입 및 상이한 동물 종은 상이한 빈도로 동일한 아미노산을 코딩하는 tRNA(각각 안티코돈을 갖는다)를 이용한다. 유전자 서열이 상응하는 tRNA에 의해 빈번하지 않게 발현되는 코돈을 함유하는 경우, 리보솜 번역 기구는 느려져서 효율적 번역을 방해할 가능성이 있다. 발현은, 코딩 서열이 동일한 단백질 서열을 코딩하도록 변경되지만 고도로 발현되는 코돈 및/또는 고도로 발현된 인간 단백질에 의해 이용되는 코돈을 이용하는 특정 종에 대한 "코돈 최적화"에 의해 개선될 수 있다[참조: Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928]. 본 발명의 한 가지 양태에서, 도입유전자의 코딩 서열은, 포유동물 또는 영장류에서 덜 빈번하게 발현되는 코돈을 영장류에서 빈번하게 발현되는 코돈으로 치환하도록 변형된다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 도입유전자에 의해 코딩된 코딩 서열은 상기 또는 본원에 개시된 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들면, 적어도 90% 서열 동일성, 예를 들면, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 여기서 코딩 서열의 적어도 하나의 코돈은 상기 또는 본원에 개시된 서열에서 상응하는 코돈보다 인간에서 보다 높은 tRNA 빈도를 갖는다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 도입유전자 코딩 서열은, 목적하는 도입유전자를 코딩하지 않는 개방 판독 프레임(ORF)의 종결 또는 제거에 의해 발현을 증강시키도록 변형된다. 개방 판독 프레임(ORF)는 개시 코돈에 후속하고 정지 코돈을 함유하지 않는 핵산 서열이다. ORF는 전 방향 또는 역 방향으로 존재할 수 있고, 목적하는 유전자와 비교하여 "프레임내" 또는 "프레임외"일 수 있다. 이러한 개방 판독 프레임은 목적하는 유전자와 병행하여 발현 카세트에서 발현될 가능성을 갖고, 바람직하지 않은 악영향을 유도할 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태에서, 도입유전자의 코딩 서열은 코돈 사용을 추가로 변경함으로써 개방 판독 프레임을 제거하도록 변형되어 있다. 이는, 개시 코돈(ATG)을 제거하고 정지 코돈(TAG, TAA 또는 TGA)을 역 방향 또는 프레임외 ORF에 도입하고, 아미노산 서열을 보존하고 목적하는 유전자에서 고도로 이용된 코돈을 유지함으로써 수행되었다(즉, 빈도 <20%의 코돈을 회피함). 본 발명에서, 도입유전자 코딩 서열은, 코돈 최적화 및 비-도입유전자 ORF의 제거 중의 어느 하나에 의해 최적화될 수 있거나 양 기술을 사용함으로써 최적화될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 코돈 최적화 동안 도입된 ORF를 제거하기 위해 코돈 최적화후 비-도입유전자 ORF를 제거 또는 최소화하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트는 RNA 외수송 시그널을 추가로 포함한다. 예시적 RNA 외수송 서열은 우드척형 간염 바이러스 전사후 요소(WPRE)의 서열을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 우드척형 간염 바이러스(WHV) 전사후 조절 요소(Wpre)는 RNA 안정성을 도입유전자, 프로모터 및 벡터-독립적 방식으로 증가시킴으로써 표적 세포에서 도입유전자 발현을 현저히 증가시킨다[참조: Zuffrey et al, 1999]. 그러나, 이는 간암에 관여하는 WHV X 유전자로부터 유래하는 절단된 60-아미노산 단백질을 발현할 수 있다[참조: Kingsman et al, 2005]. 따라서, 대부분의 임상전 프로토콜 및 임상 시험은 Wpre 요소의 돌연변이된 버전을 포함한다[참조: Zanta-Boussif et al, 2009]. 한편, SIN-LV 벡터에서 2개 SV40-USE 요소의 사용은 전사 판독의 억제에 있어서 WPRE 서열보다 더욱 효율적인 것으로 밝혀졌다[참조: Schambach et al, 2007]. 보다 상세하게는, 본원에 개시된 WPRE는, 악셀 샴바흐(Axel Schambach)에 의해 수행된 변형된 WPRE의 589개 뉴클레오티드(뉴클레오티드 1-589)(WO 2008136670 A2; [5]) 및 이전 WPRE로부터의 88개(뉴클레오티드 590-677)(Zuffrey et al, 1999)를 포함하는 키메라 WPRE이다. 본원에 개시된 데이터는 키메라 wpre가 이전 WPRE보다 더욱 양호하게 작용하는 것을 나타낸다. 키메라 WPRE 서열은 하기 표에 수록된 서열을 포함한다.
[표 1]
변형된 WPRE 서열
본 발명은 또한, 서열번호 1 또는 서열번호 9에 기재된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 9에 기재된 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, Wpre 서열은 서열번호 1의 서열, 또는 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, Wpre 서열은 하기 서열, 또는 하기 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다:
CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (서열번호 9).
특정 실시형태에서, 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스는 5'로부터 3' 순서로 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) PGK 프로모터 서열, 임의로 인간 PGK 프로모터 서열;
(b) 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 임의로 코돈 최적화된 RPK 코딩 또는 cDNA 서열; 및
(c) 서열번호 1의 서열을 임의로 포함하거나 이들로 이루어진 돌연변이체 Wpre 서열.
특정 실시형태에서, 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스는 5'로부터 3' 순서로 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) cPPT 서열;
(b) PGK 프로모터 서열, 임의로 인간 PGK 프로모터 서열;
(c) 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 임의로 코돈 최적화된 RPK 코딩 또는 cDNA 서열; 및
(d) 서열번호 1의 서열을 임의로 포함하거나 이들로 이루어지는 돌연변이체 Wpre 서열.
특정 실시형태에서, 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스는 5'로부터 3' 순서로 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) 5' LTR, 임의로 변형된 5' LTR;
(b) cPPT 서열;
(c) PGK 프로모터 서열, 임의로 인간 PGK 프로모터 서열;
(d) 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 임의로 코돈 최적화된 RPK 코딩 또는 cDNA 서열;
(e) 서열번호 1의 서열을 임의로 포함하거나 이들로 이루어진 돌연변이체 Wpre 서열; 및
(f) 3' LTR, 임의로 변형된 3' LTR.
특정 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 PGK-coRPK LV이거나, 도 21에 도시된 요소를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 발현 카세트 및 유전자 전달 벡터의 특정 실시형태에서, 코돈 최적화된 RPK cDNA 또는 코딩 서열은, 임의의 GenBank 수탁 번호 XP_016856982.1, XP_011507942.1, XP_006711449.1, NP_870986.1 또는 NP_000289.1에 개시된 서열, 또는 임의의 이들 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 PKLR 폴리펩티드를 코딩한다.
본원에 개시되거나 당해 기술분야에 공지된 요소 둘 다의 기타 조합은 당업자에 의해 용이하게 이해될 것이다.
추가로, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 카세트는, 클로닝을 용이하게 하기 위한 제한 부위 및 특정 유전자 발현 벡터를 위한 조절 요소를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 기타 요소를 임의로 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 해당 폴리뉴클레오티드 카세트는 유전자를 동물의 세포에 전달하기 위해, 예를 들면, 유전자가 세포 생존능 및/또는 기능에 대해 갖는 효과를 측정하기 위해, 세포 장애 등을 치료하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 포유동물 세포에서 도입유전자의 발현을 제공하는 조성물은 유전자 전달 벡터이고, 여기서 유전자 전달 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열을 포유동물 세포로 전달하는데 사용되는 임의의 편리한 유전자 치료 벡터는 본 발명의 유전자 전달 벡터에 포함된다. 예를 들면, 벡터는 단일 또는 이중 가닥 핵산, 예를 들면, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 유전자 전달 벡터는 DNA, 예를 들면, 네이키드 DNA, 예를 들면, 플라스미드, 미니서클 등일 수 있다. 벡터는, 변형된 형태의 RNA를 포함하는 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 유전자 전달 벡터는 RNA, 예를 들면, mRNA 또는 변형된 mRNA일 수 있다.
또 다른 예로서, 유전자 전달 벡터는 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 렌티바이러스(LV), 헤르페스 바이러스, 알파 바이러스 또는 레트로바이러스, 예를 들면, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 하베이 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유암 바이러스(MuMTV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 고양이 백혈병 바이러스(FLV), 스푸마바이러스, 프렌드 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)) 또는 렌티바이러스로부터 유래하는 바이러스 벡터일 수 있다. 렌티바이러스의 사용을 포함하는 실시형태가 하기에 보다 상세하게 기재되어 있지만, 당업자는 유사한 지식 및 기술이 비-LV 유전자 치료 벡터에도 또한 적용될 수 있음을 이해할 것으로 예상된다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 자가-제한 렌티바이러스이다.
이러한 실시형태에서, 대상 폴리뉴클레오티드 카세트는 기능적 긴 말단 반복(LTR) 서열에 의해 5' 및 3' 말단 상에서 인접된다. 한 가지 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터의 골격에 존재하는 상이한 요소의 위치는 도 1에 도시되어 있다. 양 LTR 서열은 자가-불활성화(SIN) LV 벡터를 생성하도록 변형되어 있다. SIN 벡터는 3'-LTR에서 결실에 의해 400bp 결실을 갖고, U3 영역으로부터의 프로모터/인핸서 요소를 덮는다. 이에 의해, 도입유전자의 발현은 내부 프로모터에 의존하여, RCL의 위험을 감소시키고 프로모터 간섭을 감소시킨다[참조: Ginn et al, 2003]. 이러한 3' LTR 결실은 TATA 박스를 제거하여 전사 개시를 방지하고[참조: Miyoshi et al. 1998; Zuffrey et al 1998]; 따라서 벡터를 불활성화시킨다. 5'-LTR의 U3 영역은 다른 이종성 촉진 서열(즉, CMV 또는 RSV)에 의해 치환되어, Tat-독립적 전사를 달성하고 게놈 RNA 합성을 증가시키고, 이는 바이러스 역가의 증가를 가져 온다. 5'-U3 영역은 일차 전사의 발현을 유도하기 때문에, 이의 변형은 형질도입된 세포에 존재하지 않는다[참조: Schambach et al. 2009]. 외인성 요소, 예를 들면, β-글로빈 또는 SV40 폴리아데닐화 시그널[참조: Iwakuma et al, 1999] 또는 유인원 바이러스 40으로부터의 상류 서열 요소(USE)(SV40-USE)[참조: Schambach et al. 2007]는, 내부 프로모터로부터[참조: Zaiss et al, 2002] 또는 하류 유전자의 잠재적 전사 활성화를 방지하는 SIN-LV 벡터의 결실된 U3 영역의 나머지[참조: Almarza et al. 2011]로부터 전사 판독을 감소시키기 위해 바이러스 3' LTR의 R 영역에 또한 포함되었다. 리더 영역은 팩킹(packing) 시그널(Ψ)을 함유하고, LV 벡터는 이 영역에서 대략 300bp의 Gag 유전자를 필요로 하는 것으로 생각된다. 현재, 이러한 Gag 서열은 40bp로 감소되었다(도 1). Rev 반응성 요소(RRE)는 또한, 이것이 주변 Env 잔기를 함유하지만, 유전자 전달의 효율을 개선시키기 위해 포함되어 있다. 역전사효소의 분리에 관여하는 중앙 말단 서열(CTS)과 함께, 통합전 복합체의 핵 전좌를 용이하게 하는 중앙 폴리퓨린 관(cPPT)는 바이러스 역가를 개선시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000]. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터에 존재하는 cPPT는 하기 서열: TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT (서열번호 2), 또는 서열번호 2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
dNEF/PPT 시그널은 역전사를 위해 불가결하고, 이의 도입은 LV 벡터 생성을 현저히 개선시킨다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 카세트를 캡슐화하는 유전자 치료 벡터는 표준 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들면, LV 비리온의 경우에, 본 발명에 따르는 LV 발현 벡터를 생산자 세포에 도입한 다음, LV 헬퍼 작제물을 도입할 수 있고, 여기서 헬퍼 작제물은 생산자 세포에서 발현될 수 있는 LV 코딩 영역을 포함하고 LV 벡터에 부재하는 LV 헬퍼 기능을 보완한다. 이어서, 헬퍼 바이러스 및/또는 추가의 벡터를 생산자 세포에 도입하고, 여기서 헬퍼 바이러스 및/또는 추가의 벡터는 효율적 LV 바이러스 생성을 뒷받침할 수 있는 보조 기능을 제공한다. 이어서, 생산자 세포를 배양하여 LV를 생성한다. 이들 단계는 표준 방법을 사용하여 수행한다.
대상 폴리뉴클레오티드 카세트의 전달을 위한 바이러스 입자를 생성하는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있고, 이는 하기하는 실시예에 기재된 것들을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 효율적으로 전환하는 포유동물 세포에 적합한 임의 농도의 바이러스 입자는 포유동물 세포를 시험관내 또는 생체내에서 접촉시키기 위해 제조할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 입자는 ml당 108 벡터 게놈의 농도, 예를 들면, mL당 5×108 벡터 게놈; mL당 109 벡터 게놈; mL당 5×109 벡터 게놈, mL당 1010 벡터 게놈, mL당 5×1010 벡터 게놈; mL당 1011 벡터 게놈; mL당 5×1011 벡터 게놈; mL당 1012 벡터 게놈; mL당 5×1012 벡터 게놈; mL당 1013 벡터 게놈; mL당 1.5×1013 벡터 게놈; mL당 3×1013 벡터 게놈; mL당 5×1013 벡터 게놈; mL당 7.5×1013 벡터 게놈; mL당 9×1013 벡터 게놈; mL당 1×1014 벡터 게놈, mL당 5×1014 벡터 게놈 이상, 그러나 전형적으로 mL당 1×1015 이하 벡터 게놈의 농도로 제형화될 수 있다.
대상 LV 조성물의 제조에서, LV 비리온을 생성하는 임의의 숙주 세포를 사용할 수 있고, 이는, 예를 들면, 포유동물 세포(예: 293 세포), 곤충 세포(예: SF9 세포), 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한 LV rep 및 cap 유전자가 생산자 세포에 안정하게 유지되는 팩키징 세포, 또는 LV 벡터 게놈이 안정하게 유지되어 팩키징되는 생산자 세포일 수 있다. 예시적 팩키징 및 생산자 세포는 SF-9, 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. LV 벡터는 당해 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제하고 제형화한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은, 본원에 개시된 발현 카세트 또는 유전자 전달 벡터를 포함하는 세포를 포함한다. 관련 실시형태에서, 세포는 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입되거나, 세포 게놈 내로 통합된 본원에 개시된 발현 카세트를 갖는다. 특정 실시형태에서, 세포는 바이러스 유전자 전달 벡터를 생성하기 위해 사용된 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 발현 카세트에 의해 코딩된 유전자 생성물을 대상체에 제공하기 위해 대상체로 전달되는 세포이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가유래이거나, 치료되는 대상체로부터 수득된 것이다. 다른 실시형태에서, 세포는 치료되는 대상체에 대해 동종이계이거나, 치료되는 대상체 이외의 공여체로부터 수득된 것이다. 특정 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 인간 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 혈액 세포, 적혈구, 조혈 전구 세포, 골수 세포, 예를 들면, 계대 고갈된 골수 세포, 조혈 줄기 세포(예: CD34+) 또는 위탁된 조혈 적혈구 전구 세포이다.
본 발명은, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 카세트, 유전자 발현 벡터 또는 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 유전자 전달 벡터 또는 세포는, 일반적으로 안전하고 무독성이고 바람직한 제형의 제조에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 시약과 조합될 수 있고, 영장류 사용를 위해 허용되는 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에 기체일 수 있다. 이러한 부형제, 담체 또는 희석제의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로즈 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 보조 활성 화합물도 또한 제형에 도입될 수 있다. 제형에 사용된 용액 또는 현탁액은 멸균 희석제, 예를 들면, 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균 화합물, 예를 들면, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트 화합물, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 응집을 방지하기 위해 세정제, 예를 들면, 트윈 20; 및 등장성 조정을 위한 화합물, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염, 예를 들면, 염산 또는 수산화나트륨으로 조정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 멸균이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은, 멸균 주사 용액 또는 분산액을 즉시 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 추가로 포함한다.
멸균 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 중에서 상기 열거된 성분 중의 하나 또는 이들의 조합에 도입한 다음, 필요한 경우, 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 화합물을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은, 활성 성분의 분말 + 사전 멸균-여과된 이의 이의 용액으로부터의 임의의 추가 목적하는 성분을 제공하는 진공 건조 및 동결-건조이다.
한 가지 실시형태에서, 조성물은, 신체로부터 신속한 제거로부터 유전자 카세트 또는 발현 벡터를 보호하는 담체, 예를 들면, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형으로 제조된다. 생체분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리산무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재료는 또한 상업적으로 수득할 수 있다.
투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 투약 단위 형태로 경구, 안내 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투약 단위 형태는 치료되는 대상체의 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태의 상세는 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 개인의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 당해 기술분야에 고유한 제한에 의해 결정되고 직접 의존한다.
약제학적 조성물은, 투여를 위한 지시서와 함께, 용기, 팩 또는 분배기, 예를 들면, 시린지, 예를 들면, 예비충전된 시린지에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 기타 화합물을 포함하고, 이는, 인간을 포함하는 동물에게 투여할 때, 생물학적 활성 대사산물 또는 이의 잔사를 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 약제학적으로 허용되는 염, 즉 모체 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 이에 대해 바람직하지 않은 독성 효과를 제공하지 않는 염을 지칭한다. 다양한 약제학적으로 허용되는 염은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (and more recent editions thereof), in the "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, and in J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)]에 기재되어 있다. 또한, 적합한 염의 고찰에 대해서는 문헌[참조: Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002]을 참조한다.
약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은 금속 또는 아민, 예를 들면, 알칼리 및 알칼리 토금속 또는 유기 아민으로 형성된다. 양이온으로 사용되는 금속은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등을 포함한다. 아민은 N,N'-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디사이클로헥실아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민 및 프로카인을 포함한다[참조: Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci., 1977, 66, 119]. 상기 산성 화합물의 염기 부가 염은 유리산 형태를 충분한 양의 목적하는 염기와 접촉시켜 통상적 방식으로 염을 형성함으로써 제조된다. 유리산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 유리산을 통상의 방식으로 분리하여 재생시킬 수 있다. 유리산 형태는 특정 물성, 예를 들면, 극성 용매 중의 용해도에서 이들의 각각의 염 형태와 다소 상이하지만, 염은 본 발명의 목적을 위해 각각의 유리산과 동등하다.
대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 재조합 바이러스(비리온) 또는 세포(예를 들면, 본원에 개시된 유전자 전달 벡터로 형질도입된)는 포유동물 환자, 특히 영장류 및 보다 특히는 인간에게 투여하기 위해 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 비리온, 또는 세포는 바람직하게는 3 내지 8 범위의 pH, 보다 바람직하게는 6 내지 8 범위의 pH에서 무독성, 불활성, 약제학적으로 허용되는 수성 담체에서 제형화될 수 있다. 이러한 멸균 조성물은 재구성시 허용되는 pH를 갖는 수성 완충제에 용해된 치료용 분자를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터 또는 비리온을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제, 예를 들면, 식염수, 인산염 완충된 식염수, 포스페이트 및 아미노산, 폴리머, 폴리올, 당, 완충제, 방부제 및 기타 단백질과 혼합하여 본원에 개시된 치료학적 유효량의 세포, 벡터 또는 비리온을 포함한다. 예시적 아미노산, 폴리머 및 당 등은 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 화합물, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르, 슈크로즈, 프럭토즈, 덱스트로즈, 말토즈, 글루코즈, 만니톨, 덱스트란, 솔비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 크실리톨, 락토즈, 트레할로즈, 소 또는 인간 혈청 알부민, 시트레이트, 아세테이트, 링거 및 행크 용액, 시스테인, 아르기닌, 카르니틴, 알라닌, 글리신, 리신, 발린, 류신, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 및 글리콜이다. 바람직하게는, 제형은 4℃에서 적어도 6개월 동안 안정하다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 완충제, 예를 들면, 인산염 완충된 식염수(PBS) 또는 인산나트륨/황산나트륨, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 멸균수 및 당업자에게 공지된 기타 완충제, 예를 들면, 문헌[참조: Good et al. (1966) Biochemistry 5:467]에 기재된 것들을 포함한다. 약제학적 조성물이 아데노바이러스 벡터 전달 시스템에 함유된 종양 억제인자 유전자를 포함하는 완충제의 pH는 6.5 내지 7.75 범위, 바람직하게는 7 내지 7.5 범위 및 가장 바람직하게는 7.2 내지 7.4 범위일 수 있다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는, 임의의 적합한 단위 용량으로 제형화될 수 있고, 1×108 이상의 벡터 게놈, 예를 들면, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012 또는 1×1013 이상의 벡터 게놈, 특정 예에서, 1×1014 벡터 게놈, 그러나 통상적으로 4×1015 이하의 벡터 게놈을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 일부 경우에, 단위 용량은 최대 약 5×1015 벡터 게놈, 예를 들면, 1×1014 이하의 벡터 게놈, 예를 들면, 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010 또는 1×109 이하의 벡터 게놈, 특정 예에서 1×108 이하의 벡터 게놈, 및 전형적으로 1×108 이상의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×101 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×109 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 단위 용량은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다. 한 가지 실시형태에서, 범위는 약 5×1010 내지 약 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 실시형태에서, 범위는 약 1×109 내지 약 1×1010 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 약제학적 조성물의 단위 용량은 감염 다중도(MOI)를 사용하여 측정할 수 있다. MOI란, 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율 또는 배수를 의미한다. 일부 경우에, MOI는 1×106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1××107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1××1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다. 일부 실시형태에서, 상기 범위는 약 20 내지 약 400 MOI이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 양은 약 1 × 108 내지 약 1 × 1015 재조합 바이러스, 약 1 × 109 내지 약 1 × 1014 재조합 바이러스, 약 1 × 1010 내지 약 1 × 1013 재조합 바이러스 또는 약 1 × 1011 내지 약 3 × 1012 재조합 바이러스를 포함한다.
방법
본원에 개시된 바와 같이, 본원에서 집합적으로 "대상 조성물"로서 지칭되는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트 및 유전자 전달 벡터는 동물의 세포에서 도입유전자의 발현에 사용된다. 예를 들면, 대상 조성물은, 예를 들면, 유전자가 세포 생존능 및/또는 기능에 대해 갖는 효과를 측정하는 연구에서 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 대상 조성물은, 예를 들면, 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 세포에서 유전자의 발현을 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 세포를 본 발명의 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 접촉은 시험관내 또는 생체외에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 접촉은 생체내에서 발생하고, 즉 대상 조성물은 대상체에게 투여된다.
포유동물 세포를 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 시험관내 또는 생체외에서 접촉시키는 예에 있어서, 세포는 임의의 포유동물 종, 예를 들면, 설치류(예: 마우스, 랫트, 저빌, 다람쥐), 래빗, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소, 영장류, 인간으로부터 기원할 수 있다. 세포는 확립된 세포주로부터 유래하거나 일차 세포일 수 있고, 여기서 "일차 세포", "일차 세포주" 및 "일차 배양물"은 본원에서 호환적으로 사용되어, 대상체로부터 유래되고 배양물의 제한된 수의 계대(분열)를 위해 시험관내에서 성장시키는 것을 가능하게 하는 세포 및 세포 배양물을 지칭한다. 예를 들면, 일차 배양물은 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회 또는 15회 계대될 수 있지만 위기 단계를 경과하는데 충분한 시간이 없는 배양물이다. 전형적으로, 본 발명의 일차 세포주는 시험관내에서 10대 계대 미만으로 유지된다.
본 발명의 실시형태는, 바이러스 전달 벡터, 예를 들면, 인간 간장 및 적혈구 피루베이트 키나제(PKLR) 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 포유동물 세포(예를 들면, CD34+ 세포)를 포함한다. 따라서, 본 발명은, 세포를, 본원에 기재된 발현 카세트를 포함하는 바이러스 전달 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포, 예를 들면, 본원에 기재된 인간 조혈 줄기 세포 또는 기타 세포를 형질도입시키는 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 치료되는 대상체로부터 또는 또 다른 공여체로부터 사전에 수득되었다. 특정 실시형태에서, 대상체는 PKD로 진단되었고, 세포는, 피루베이트 키나제를 코딩하는 발현 카세트, 예를 들면, 코돈-최적화된 RPK 코딩 영역 또는 cDNA를 포함하는 LV로 형질도입된다. 개시된 방법, 예를 들면, coPRK cDNA 서열을 사용하여 피루베이트 키나제 유전자 생성물을 대상체에게 전달하는데 사용된 방법은 또한 용혈성 빈혈을 치료하고/하거나 적혈구 분화를 정상화하고, 기능적 성숙 적혈구의 수를 증가시키고, 골수외 적혈구형성을 감소시키고, 용혈성 빈혈 또는 PKD의 비종 및 기타 이차 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
도입유전자의 발현을 촉진시키기 위해, 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 약 30분 내지 24시간 또는 그 이상, 예를 들면, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 24시간 등 동안 세포와 접촉된다.
대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터는 대상 세포에게 1회 이상, 예를 들면, 1회, 2회, 3회 또는 3회 이상 제공될 수 있고, 세포는 각 접촉 사상 후의 일정 시간, 예를 들면, 16 내지 24시간 동안 제제(들)과 함께 배양하고, 이후 배지를 신선한 배지로 교환하고, 세포를 추가로 배양한다. 세포의 접촉은, 세포의 생존을 촉진시키는 임의의 배양 배지에서 및 임의의 배양 조건하에 수행할 수 있다. 배양물은 세포가 반응하는 성장 인자를 함유할 수 있다. 본원에 정의된 성장 인자는, 막관통 수용체에 대한 특이적 효과를 통해, 배양물 또는 무손상 조직에서, 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 인자를 포함한다.
전형적으로, 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터의 유효량이 세포에서 도입유전자의 발현을 생성하기 위해 제공된다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 유효량은, 예를 들면, 유입유전자 유전자 생성물의 존재 또는 수준을 검출함으로써, 세포의 생존능 또는 기능에 대한 효과를 검출함으로써 경험적으로 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터의 유효량은 당해 기술분야에 공지된 동일한 양의 폴리뉴클레오티드 카세트보다 세포에서 도입유전자의 보다 큰 발현을 촉진시킨다. 전형적으로, 발현은, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 참조 또는 대조군의 발현과 비교하여 2배 이상, 예들 들면, 3배, 4배, 또는 5배 이상, 일부 경우에 10배, 20배 또는 50배 이상, 예를 들면, 100배 증강된다.
세포가 대상 폴리뉴클레오티드 카세트, 또는 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 유전자 전달 벡터와 생체내에서 접촉되는 예에 있어서, 대상체는 임의의 포유동물, 예를 들면, 설치류(예: 마우스, 랫트, 저빌), 래빗, 고양이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 소 또는 영장류일 수 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 영장류는 인간이다. 추가의 실시형태에서, 세포는 CD34+ 세포이다.
본 발명의 방법 및 조성물은, 예를 들면, 피루베이트 키나제 결손의 치료에 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 세포에서 치료용 유전자 생성물을 발현하는 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터로 형질도입된 유효량의 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 포함하여, 상기 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 대상체에 대하여 자가유래이다. 특정 실시형태에서, 세포는 적혈구계 세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포 또는 위탁된 조혈 적혈구 전구 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 골수 세포, 예를 들면, 계통 고갈된 골수 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 PKD를 치료하기 위해 사용되고, 바이러스 벡터는, 코돈 최적화된 인간 PKLR 유전자 cDNA 또는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 인간 PGK 프로모터, 및 본원에 개시된 돌연변이된 Wpre를 포함하는 본원에 개시된 발현 작제물을 포함하는 LV이다. 특정 실시형태에서, 세포는 대상체에게 비경구적으로, 예를 들면, 정맥내 주사를 통해 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 세포에서 코돈 최적화된 PKLR cDNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 유효량의 자가유래 C34+ 줄기 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 PKD를 치료하는 방법을 포함하고, 여기서 상기 렌티바이러스 벡터는 코돈 최적화된 인간 PKLR cDNA 또는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 인간 PGK 프로모터, 및 본원에 개시된 돌연변이된 Wpre 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 위탁된 조혈 전구 세포, 예를 들면, 골수 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 대상체에게 비경구적으로, 예를 들면, 정맥내 주사를 통해 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은, 대상체에서 치료용 유전자 생성물을 발현하는 유효량의 유전자 전달 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 PKD를 치료하기 위해 사용되고, 바이러스 벡터는, 코돈 최적화된 인간 PKLR 유전자 cDNA 또는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 인간 PGK 프로모터, 및 본원에 개시된 돌연변이된 Wpre을 포함하는 본원에 개시된 발현 작제물을 포함하는 LV이다. 특정 실시형태에서, 유전자 전달 벡터는 대상체에게 비경구적으로, 예를 들면, 정맥내 주사를 통해 제공된다.
특정 실시형태에서, 세포 또는 유전자 전달 벡터는 약제학적 조성물로 대상체에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 대상 방법은, 예를 들면, 장애의 발달을 예방하고, 장애의 진행을 정지시키고, 장애의 진행을 복귀시키는 등의 치료학적 이익을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상 방법은 치료적 이익이 달성되는 것을 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는 이러한 치료 유효성의 측정이 변형되는 특정 질환에 적용가능하고 적절한 검출 방법을 사용하여 치료 효력을 측정할 수 있음을 인지할 것이다.
대상 도입유전자를 사용하는 도입유전자의 발현은 강력할 것으로 예상된다. 따라서, 일부 예에서, 예를 들면, 유전자 생성물의 수준을 측정하고 치료적 효력을 측정하는 등에 의해 검출된 도입유전자의 발현은 투여후 2개월 이내, 예를 들면, 투여후 4, 3 또는 2주 이내, 예를 들면, 대상 조성물의 투여후 1주 이내에 관찰될 수 있다. 또한, 도입유전자의 발현은 시간의 경과와 함께 지속할 것으로 예상된다. 따라서, 일부 예에서, 예를 들면, 유전자 생성물의 수준을 측정하고 치료 효력을 측정하는 등에 의해 검출되는 도입유전자의 발현은 대상 조성물의 투여후 2개월 이상, 예를 들면, 4, 6, 8 또는 10개월 이상, 일부 예에서 1년 이상, 예를 들면, 2, 3, 4 또는 5년, 특정 예에서 5년 이상에서 관찰될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 세포 또는 대상체에서 도입유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서, 발현은 본 발명의 하나 이상의 개선된 요소를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 카세트의 발현과 비교하여 증강된다. 전형적으로, 발현은, 조기 검출, 유전자 생성물의 보다 높은 수준, 세포에 대한 보다 강력한 기능적 영향 등에 의해 입증된 바와 같이, 예를 들면, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 참조로부터 발현, 즉 대조군 폴리뉴클레오티드 카세트로부터의 발현에 대하여 2배 이상, 예를 들면, 3배, 4배 또는 5배 이상, 일부 경우에 10배, 20배 또는 50배 이상, 예를 들면, 100배 증강된다.
전형적으로, 대상 조성물이 본 발명의 대상 폴리뉴클레오티드 카세트를 포함하는 LV인 경우, 변화를 달성하는 유효량은 약 1×108 이상의 벡터 게놈, 이룹 경우에 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012 또는 1×1013 이상의 벡터 게놈, 일부 경우에, 1×1014 이상의 벡터 게놈, 및 통상적으로 1×1015 이하의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 최대 약 1×1015 벡터 게놈, 예를 들면, 1×1014 이하의 벡터 게놈, 예를 들면, 1×1013, 1×1012, 1×1011, 1×1010 또는 1×109 이하의 벡터 게놈, 특정 경우에 1×108 벡터 게놈, 및 전형적으로 1×108 이상의 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터의 양은 1×1010 내지 1×1011 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×1010 내지 3×1012 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×109 내지 3×1013 벡터 게놈이다. 일부 경우에, 전달되는 벡터 게놈의 양은 1×108 내지 3×1014 벡터 게놈이다.
일부 경우에, 투여되는 약제학적 조성물의 양은 감염 다중도(MOD)를 사용하여 측정할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 핵산이 전달될 수 있는 세포에 대한 벡터 또는 바이러스 게놈의 비율 또는 배수를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1××106일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×105 내지 1×107일 수 있다. 일부 경우에, MOI는 1×104 내지 1×108일 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 적어도 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 1×108 내지 3×1014 MOI이다. 일부 경우에, 본 발명의 재조합 바이러스는 최대 약 1×101, 1×102, 1×103, 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 1×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 및 1×1018 MOI이다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물의 양은 약 1 × 108 내지 약 1 × 1015 입자의 재조합 바이러스, 약 1 × 109 내지 약 1 × 1014 입자의 재조합 바이러스, 약 1 × 1010 내지 약 1 × 1013 입자의 재조합 바이러스, 또는 약 1 × 1011 내지 약 3 × 1012 입자의 재조합 바이러스이다.
목적하는 효과를 제공하거나 질환을 치료하기 위해 세포의 적절한 형질도입을 제공하기에 적합한 바이러스 입자의 임의의 총 수가 포유동물에게 투여될 수 있다. 다양한 바람직한 실시형태에서, 적어도 108; 5×108; 109; 5 × 109, 1010, 5×1010, 1011, 5×1011; 1012; 5×1012; 1013; 1014 이상의 바이러스 입자, 그러나 전형적으로 1×1015 이하의 바이러스 입자가 주사된다. 포유동물 또는 영장류에 대한 벡터 투여의 임의의 적합한 수가 수행될 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 상기 방법은 단일 투여를 포함하고, 다른 실시형태에서, 담당 주치의에 의해 적절한 것으로 간주되는 시간에 걸쳐 복수 투여가 수행된다. 일부 실시형태에서, 적어도 2×108 VG/ml의 5×105 세포/ml는 고도의 형질도입 효율을 제공하기 위해 단일 투여(24시간 형질도입)에서 요구된다.
개개 용량은 전형적으로 대상체에 대한 측정가능한 효과를 생성하는데 요구되는 양 이상이고, 대상 조성물 또는 이의 부산물의 흡수, 분포, 대사 및 배설("ADME")을 위한 약물동태 및 약력학에 기초하여 결정되며, 따라서 대상체 내의 조성물의 처분에 기초하여 결정될 수 있다. 이는 투여 경로 및 투여량의 고려를 포함한다. 용량 및/또는 용량 섭생의 유효량은, 임상전 검정, 안전성 및 점증 및 용량 범위 시험, 개개 임상의-환자 관계, 추가로 본원에 기재되고 실시예에 설명된 것들과 같은 시험관내 및 생체내 검정으로부터 경험적으로 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태는 설명을 위한 예시적 적용을 참조하여 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 상세, 관계 및 방법이 기재되어 있는 것을 이해해야 한다. 그러나, 당업자는, 본 발명이 하나 이상의 특정 상세 없이 또는 다른 방법으로 실시될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명은, 일부 동작이 상이한 순서 및/또는 다른 동작 또는 사상과 동시에 발생할 수 있기 때문에, 동작 또는 사상의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 추가로, 본 발명에 따르는 방법론을 실시하기 위해, 제시된 모든 동작 또는 사상이 필요한 것은 아니다.
추가로, 특허청구범위는 임의의 요소를 제외하도록 작성될 수 있음에 유의한다. 따라서, 이러한 기재는 청구항 요소의 열거 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "전적으로", "오직" 등의 배타적 용어를 사용하기 위한 전제로서 작용하는 것을 의도한다.
본원에 언급된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 이들의 개시만을 제공한다. 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 간행물에 선행하는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 공개일은 실제 공개일과는 상이할 수 있고, 이는 독립적으로 확인할 필요가 있을 수 있다.
본 명세서에 언급되고/되거나 특허 데이터 시트에 수록된 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물 모두는, 예를 들면, 해당 간행물이 인용하는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 기재하기 위해 이의 전체가 참조로서 본원에 도입된다. 본 개시는, 모순이 존재하지 않는 한, 도입된 간행물의 임의의 개시에 우선하는 것으로 이해된다.
본 발명은 피루베이트 키나제 결손에 대한 유전자 치료를 제공하기 위해 폴리뉴클레오티드 카세트, 발현 벡터 및 포유동물에서 유전자의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부의 특허청구범위의 상세로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점의 더욱 양호한 이해는, 본 발명의 원리가 이용되는 예시적 실시형태를 설명하는 이하의 상세한 설명 및 첨부의 도면을 참조함으로써 수득될 것이다.
도 1은 렌티바이러스 벡터의 골격에 존재하는 상이한 기재된 요소의 위치를 반영하는 도식을 나타낸다.
도 2a는 대조군 벡터(상부 도표)에서 EGFP 도입유전자의 발현 또는 치료용 벡터(하부 다이아그램)에서 PKLR 유전자 cDNA(coRPK)의 코돈-최적화된 서열의 발현을 조절하는 인간 PGK 프로모터를 보유하는 유전자 치료 실험을 통해 사용된 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.
도 2b는 개발된 PGK-coRPK 렌티바이러스 벡터의 기능성에 대처하기 위해 실시된 개략적 유전자 치료 프로토콜이다.
도 3a-d는 유전자 수정 후의 일차 수용체의 말초혈에서 PKD 표현형의 수정을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 3a RBC 및 도 3b는 건강한(흑색 바, n=5), 및 PKD 빈혈 마우스(회색 바, n=6), 및 EGFP(백색 바, n=9) 또는 coRPK 형질도입된 세포(스크래치 바, n=17)가 이식된 PKD 빈혈 마우스에서 망상적혈구 수준이다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 비-파라미터 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험으로 분석했다. 도 3c는 건강한(흑색 라인, n=2), 빈혈(회색 라인, n=2) 및 유전적으로 수정된 마우스(불연속 라인, n=4)에서 시간 전체에 걸친 비오틴 표지된 RBC 및 도 3d RBC 생존 동태를 검출하는데 사용된 유세포 분석 전략을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 단방향 ANOVA 시험으로 분석했다. 건강한, 비-이식된 대조군 마우스; PKD, 비-이식된 PKD 마우스; coRPK, 치료용 도입유전자를 발현하는 PKD 마우스.
도 4a-c는 이차 이식된 마우스에서 다계통 조혈 재구성을 나타낸다. 도 4a는, CD3-PE, B220-PE, B220-PECy5, Gr1-비오틴 및 Mac1-비오틴 + SAV-PE-Cy5로 표지함으로써 상이한 조혈 계통을 동정하는데 사용된 유세포 분석 전략의 도표이다. 도 4b는 대표적 도트-플롯을 나타내고, 도 4c는 이식후 140일에서 PB 중의 각 계통의 퍼센트를 나타낸다. 바는 건강한(n=2, 흑색 바) 및 PKD 마우스(n=2, 회색 바) 대조군 및 coRPK 치료용 도입유전자를 발현하는 이차 이식된 마우스(n=4, 스크래치 바)의 평균 퍼센트 ± SEM을 나타낸다.
도 5a-d는 이차 이식된 마우스에서 PKD 표현형 수정을 나타낸다. 도 5a는 망상적혈구 모집단(청색)을 동정하기 위해 비-이식된 마우스 및 이차 수용체로부터의 혈액 도말의 브릴리언트 크레실 블루 염색을 나타낸다. 도 5b는 말초혈에서 망상적혈구 수준의 유세포 분석이다. 도 5c는 RBC 퍼센트를 나타내고, 도 5d는 coRPK 도입유전자를 발현하는 이차 이식된 마우스(스크래치 바, n=4), 건강한 마우스(흑색 바, n=3) 및 빈혈 대조군 마우스(회색 바, n=3)에서 망상적혈구 퍼센트를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되고, 비-파라미터 양측 만-휘트니(Mann-Whitney) 시험으로 분석했다.
도 6a-c는 프로바이러스 통합의 정량화를 나타낸다. 도 6a는 이식후 120 내지 170일에서 개개 이식된 마우스로부터 BM CFU 중의 세포당 벡터 카피 수를 나타낸다. 형질도입 및 키메리즘 퍼센트가 또한 제시되어 있다. 도 6b는 상이한 조혈 구획으로부터의 세포에서 프로바이러스 카피 수를 나타낸다. 컬럼은 상이한 그룹의 이식된 마우스의 평균 ± SEM을 나타낸다. 도 6c는 개개 이식된 EGFP-발현 마우스(회색선) 및 coRPK 도입유전자를 갖는 마우스(흑색선)로부터의 BM 세포에서 프로바이러스 통합의 동력학을 나타낸다.
도 7a-c는 유전적으로 수정된 마우스에서 적혈구 분화 패턴의 정규화를 나타낸다. 도 7a는 이식후 140일에서 골수 및 비장 중의 상이한 적혈구 아집단의 퍼센트를 나타낸다. 도 7b는 사용된 유세포 분석 전략의 대표적 도트 플롯을 나타낸다. CD71 및 Ter119 마커의 발현 강도는 4개 적혈구 아집단의 동정을 가능하게 한다. 모집단 I: 초기 프로적아구(Ter119med CD71high), 모집단 II: 호염기성 적아구(Ter119high CD71high), 모집단 III: 후기 호염기성 및 다색성 적아구(Ter119high CD71med) 및 모집단 IV: 정염색 적아구, 망상적혈구 및 성숙 적혈구계 세포(Ter119high CD71low). 도 7c는 비-이식된 및 이식된 마우스에서 ELISA에 의해 측정한 혈장 Epo 수준을 나타낸다. 도트는 개개 마우스의 값을 나타낸다. 라인은 평균 ± SEM을 나타내고, 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험으로 분석했다. 건강한, 비-이식된 대조군 마우스; PKD, 비-이식된 PKD 마우스; EGFP, EGFP 도입유전자를 발현하는 PKD 마우스; coRPK, 치료용 도입유전자를 발현하는 PKD 마우스.
도 8a-b는 대조군 마우스 및 형질도입된 세포가 이식된 마우스에서 조혈 전구세포 검정을 나타낸다. 데이터는 이식후 140일에서 비장(도 8a) 및 골수(도 8b)로부터의 전체 CFU를 입증한다. 도트는 분석된 마우스당 콜로니의 수를 나타내고, 라인은 각 그룹에서 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험에 의해 통계적으로 분석했다.
도 9a-c는 이식후 140일에서 유전적으로 수정된 마우스에서 비종 및 기관 병상의 복귀를 나타낸다. 도 9a는 대표적 비장의 사진이고, 도 9b는 일차 및 이차 이식된 PKD 마우스로부터 비장 중량 대 전체 체중의 비율을 나타낸다. 도트는 개개 마우스의 값을 나타낸다. 라인은 그룹당 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험으로 분석했다. 도 9c는 일차 이식된 PKD 마우스로부터 비장 및 간장의 조직학적 연구를 나타낸다. 제1 및 제2 컬럼은 헤마톡실린-에오신으로 염색한 비장 및 간장의 대표적 조직 절편을 나타내고, 광학 현미경으로 각각 4배 및 10배 대물렌즈를 사용하여 촬영했다. 화살표는 골수외 적혈구형성을 나타내는 적혈구 세포 클러스터를 지칭한다. 제3 컬럼은 화살촉에 의해 나타낸 철 침착을 검출하는 간장 절편의 프러시안 블루 염색(Fe)을 나타낸다. 사진은 20배 대물렌즈를 사용하여 촬영했다. 도 7과 같이 그룹 전설. 제2 coRPK, 이차 수용자.
도 10a-g는 유전적으로 변형된 세포가 이식된 마우스로부터의 RBC 샘플에서 대사 프로파일링을 나타낸다. 2개의 독립적 실험에서 PKD 동물과의 비교에 의해 건강한 및 이식된 마우스에서 현저한 대사 프로파일 변화의 분석. 도 10a는 비표적화된 프로파일링에 의해 수득한 완전한 RBC 열 맵을 나타내고, 여기서 더욱 높거나 낮은 대사산물 수준은 각각 적색 및 청색으로 나타낸다. 수록된 대사산물은 하기 기준을 사용하여 유의한 적어도 하나의 비교를 갖는다: 절대 배율 변화 > 1.5; 최소 시그널 > 2000; 조정된 p-값 < 0.01. 흑색 박스는 그룹 중에서 상이한 프로파일을 갖는 대사산물 변화의 클러스터를 강조한다. 도 10b, 10c 및 10d는 각각, 이식후 140일에서 PKD 마우스와의 비교에 의한 비표적화된 프로파일링으로 측정한, ATP, ADP 및 피루베이트 수준을 나타낸다. 검정 1: 건강한 마우스(흑색 바) n=1, PKD(회색 바) n=1, hPGK-EGFP(백색 바) n=2, hPGK-coRPK(스크래치 바) n=3. 검정 2: 건강한 마우스 n=2, PKD n=2, hPGK-EGFP n=6, hPGK-coRPK n=10. 도 10e, 10f 및 10g는 이식후 280일에서 해당 경로(각각 PEP, 3-포스포글리세르산 및 D-락트산)에 관여하는 선택된 수의 대사산물의 RBC 표적화된 대사 프로파일링을 나타낸다. 도트는 개개 마우스의 값을 나타낸다. 라인은 평균 ± SEM을 나타내고, 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험에 의해 분석했다. 검정 2: 건강한 마우스 n=7, PKD n=5, hPGK-EGFP n=3, hPGK-coRPK n=5.
도 11a-c는 피루베이트 키나제 활성을 나타낸다. 도 11b 헥소키나제 활성 및 도 11c 대조군 마우스 및 형질도입된 세포가 이식된 마우스로부터의 RBC에서 피루베이트 키나제 및 헥소키나제 효소 활성의 비율. RBC는 백혈구 PK 활성 오염을 방지하기 위해 셀룰로즈 컬럼을 통해 혈액 샘플로부터 정제했고, 효소 활성 평가에 제공했다. 흑색 바, 건강한 마우스(n=2); 백색 바, EGFP 발현 벡터로 형질도입된 세포가 이식된 마우스(n=3); 스크래치 바, coRPK 발현 벡터로 형질도입된 세포가 이식된 마우스(n=3). 체크무늬 바는 건강한 지원자(n=1)로부터의 값을 나타낸다. 데이터는 각 그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 12a-d는 유전적으로 변형된 세포가 이식된 마우스로부터의 WBC 샘플에서 비표적화된 대사 프로파일링을 나타낸다. 도 12a는 대조군 및 이식된 마우스에서 RBC(적색 도트; 좌측 및 중앙) 및 WBC(청색 도트; 우상의 클러스터)에서 비표적화된 대사산물 프로파일의 주요 성분 분석을 나타낸다. 도 12b, 12c 및 12d는 PKD 마우스와의 비교에 의해 WBC에서 각각 ATP, ADP 및 피루베이트 수준을 나타낸다. 검정 1: 건강한 마우스(흑색 바) n=1, PKD(회색 바) n=1, hPGK-EGFP(백색 바) n=2, hPGK-coRPK(스크래치 바) n=3. 검정 2: 건강한 마우스 n=2, PKD n=2, hPGK-EGFP n=6, hPGK-coRPK n=10. 데이터는 그룹당 평균 ± SEM을 나타내고, 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험에 의해 분석했다.
도 13은 상이한 시점 및 조직에서 모든 마우스로부터 수거한 샘플에 대해 Tsp5091 효소로 생성한 LAM-PCR 생성물의 겔 이미지를 나타낸다. 벡터 통합 부위는 3' 벡터 LTR-게놈 접합부의 LAM-PCR 증폭에 의해 동정했다. 몇몇 밴드에 의해 특성화된 패턴을 생성하는 MultiNA 자동화 시스템을 사용했다. 벡터 골격 유래된 Tsp5091 내부 조절 밴드(IC)는 화살표로 표시되어 있다.
도 14는 상이한 시점 및 조직에서 모든 마우스로부터 수거한 샘플에 대해 HpyCH4IV5 효소로 생성한 LAM-PCR 생성물의 겔 이미지를 나타낸다. 벡터 통합 부위는 3' 벡터 LTR-게놈 접합부의 LAM-PCR 증폭에 의해 동정했다. 몇몇 밴드에 의해 특성화된 패턴을 생성하는 MultiNA 자동화 시스템을 사용했다. 벡터 골격 유래된 HpyCH4IV5 내부 조절 밴드(IC)는 화살표로 표시되어 있다.
도 15는 유전적으로 변형된 조혈 전구세포가 이식된 마우스에서 수행된 통합 부위 맵핑의 분석의 일반 도식을 나타낸다. 2개의 독립적 실험(표 3)에 속하고 이식후 상이한 시점에서 수거한 이식된 마우스로부터의 골수 및 백혈구 샘플을 제시된 파이프라인에 따르는 보충 방법에 기재된 바와 같이 분석했다.
도 16a-b는 이식된 마우스의 게놈을 따라 LV 통합의 분포를 나타낸다. 도 16a는, TSS의 상류 및 하류 500Kb에 걸쳐 있는 최근접 RefSeq 유전자의 전사 개시 부위(TSS) 부근의 통합 부위(IS) 주파수 분포를 나타낸다. 상부의 숫자는 모든 샘플 및 시점에 대해 검출된 IS의 수이다. 도 16b는 EGFP 도입유전자(흑색 바) 또는 coRPK 치료용 도입유전자(회색 바)를 발현하는 이식된 마우스에서 LV 통합 부위의 염색체 분포를 나타내고, 이는 특정 염색체를 향해 왜곡을 나타내지 않는다.
도 17a-c는 coRPK-LV 형질도입된 세포의 클론 풍부함(abundance) 분석을 입증한다. 도트 플롯은 검정 1(도 17a) 및 2(도 17b 및 17c)로부터의 각 마우스에서 풀링된 통합의 클론 풍부함을 나타낸다. 각 통합 부위의 상대적 퍼센트(y-축)는 각 데이터세트에서 수득한 서열 판독치의 총수에 대한 것이다. IS, 통합 부위; BM, 골수; PB, 말초혈; coRPK1-14, 치료용 벡터로 형질도입된 조혈 세포가 이식된 마우스.
도 18은, 치료용 PGK-coRPK LV 벡터를 보유하는 일차 및 이차 수용자 마우스 사이의 추적된 공유 통합을 나타낸다. 임의의 기관 및 임의의 시간에서 마우스 중의 어느 하나에서 검출된 통합은 풀링된다. 이차 수용자는 이식된 마우스 coRPK11 내지 14로부터 풀링된 BM을 제공받았다. 검출된 나머지 IS는 검출되거나 일차 또는 이차 수용자에서 검출되었다. 박스 내의 숫자는 참조된 마우스에서 상응하는 통합의 대표를 퍼센트로 나타낸다. 통합 분석에 적용된 ≥5% 필터에 추가하여, <3의 서열 계수를 갖는 모든 통합은 제외했다.
도 19는 EGFP-LV 형질도입된 세포의 클론 풍부함 분석을 입증한다. 도트 플롯은 골수에서 각 마우스의 풀링된 통합의 클론 풍부함을 나타낸다. 각 통합 부위에 대한 상대 퍼센트(y-축)는 각 데이터세트에서 수득한 서열 판독치의 총수에 대한 것이다. co-RPK 형질도입된 세포(도 17)와 유사하게, 그래프는 이식된 마우스의 대부분이 조혈 재모집단의 폴리클로날 패턴을 나타내는 것을 보여준다. IS, 통합 부위.
도 20은 LV 게놈 통합 프로파일을 나타낸다. 유전자 온톨로지(GO) 분석은 이식된 마우스로부터 샘플에 대해 GREAT 소프트웨어를 사용하여 수행했다. 이 연구(N=2220)로부터 검색된 모든 통합은 도면의 좌측 부분에 제시된 유전자 기능의 과도한 제시를 나타냈다. 가장 풍부한 통합이 특정 유전자 부류로 풍부화되는지를 조사하기 위해, 전체 데이터세트의 ＞5% 상대 서열 계수(도 17에 제시됨)를 갖는 모든 통합 부위를 선택하고, 이는 GO 유전자 부류가 과도하게 제시되지 않았음을 나타낸다.
도 21은 의약 생성물(PGK-coRPK LV)의 개략도를 나타낸다.
도 22a-b는 의약 생성물의 작용 메카니즘을 나타낸다. 도 22a는 PGK-coRPK LV 의약 생성물의 이소성 발현이 PKD 적혈구의 야생형 표현을 구제하고, 달리는 이들의 기능을 실시하기 위해 충분한 에너지를 생성하는 기능성 RPK 단백질을 생성할 수 없음을 나타낸다. 도 22b는 RPK 결손 CD34+ 조혈 전구세포의 의약 생성물에 의한 생체외 형질도입 및 이어서 환자로의 이식에 기초하여 PKD 환자에 대한 유전자 치료 전략을 나타낸다. 치료용 인간 PKLR 유전자 cDNA를 보유하는 개발된 의약 생성물은 생체외 형질도입시 환자 CD34+ 세포 게놈에 통합될 것이다. 이어서, 이들 유전적으로 수정된 세포는 환자에게 다시 주입되고, 여기서 이들은 치료용 도입유전자를 발현하는 RBC를 생성하고, PKD 병리학적 표현형을 수정하는 기능성 RPK 단백질을 생성한다. 보스턴 아동 병원(Boston Children's Hospital) 블로그로부터 변형된 도면.
상기로부터, 본 발명의 특정 실시형태가 설명을 목적으로 본원에 기재되어 있지만, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 일탈하지 않고서 이루어질 수 있음이 이해된다. 따라서, 본 발명은 첨부의 특허청구범위를 제외하고는 한정되지 않는다.
실시예
하기 실시예는, 본 발명을 수행하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 기재되어 있고, 본 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않고, 하기 실험이 수행된 실험의 전체 또는 실험만인 것을 나타내는 것을 의도하는 것도 아니다. 사용된 수치(예: 양, 온도 등)과 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 도이고, 압력은 대기압 또는 그 근방의 압력이다.
실험 방법
벡터 및 렌티바이러스 상청액 생성. LV는 본원에 기재된 바와 같이 생성했다. GeneArt® 소프트웨어를 사용하여 coRPK 서열을 설계하여, 서열의 GC 함량을 증가시키고 잠재적 스플라이싱 부위를 방지했다. 벡터는, 날디니 박사(Dr. Naldini)(HSR-TIGET, San Raffaele Telethon Institute, Milano, Italy)에 의해 관대하게 제공된 pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-Wpre* 작제물을 골격으로 사용하여 개발했다. VSVG 슈도타입 LV의 벡터 스톡은 문헌[참조: Follenzi A, et al. (2000). Nat Genet 25: 217-222]에 이미 기재된 바와 같이 293T 세포(ATCC: CRL-1573, Rockeville, MD, USA)에서 3-플라스미드 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 제조했다. 감염성 LV의 역가는 다른 곳[참조: Charrier S, et al. (2005). Gene Ther 12: 597-606]에 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 HT1080 세포(ATCC: CCL-121)에서 측정했다. 107-108 바이러스 역가(vp)/mL 역가의 렌티바이러스 스톡은 통상적으로 수득되었다.
정제 및 뮤린 HSC의 형질도입. 8-14주령 수컷 PKD 마우스의 BM을 다리 뼈로부터 수거하고, Lin- 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)를 사용하여 계통 음성 세포(Lin-)를 정제하여 70-90% 순도를 수득했다. Lin- 세포를, 20% FBS 및 0.5% 항생물질(50U/mL 페니실린 및 50㎍/mL 스트렙토마이신, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)이 보충된 IMDM-Glutamax 배지에서 100ng/mL의 재조합 인간 IL-11(Peprotech EC Ltd., London, UK) 및 100ng/mL의 재조합 뮤린 SCF(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)으로 24시간 동안 예비-자극시킨 다음, 1×10 vp/세포의 MOI에서 2사이클의 형질도입으로 VL를 갖는 EGFP 또는 coRPK로 형질도입했다. 각각의 형질도입은 24시간 동안 상기 사이토킨의 존재하에 CH-296 피브로넥틴 단편(2㎍/cm2; Retronectin, TakaraShuzo, Otsu, Japan)으로 사전 코팅된 플레이트 상에서 밤새 4℃에서 수행했다.
생체내 RBC 생존. coRPK 도입유전자를 갖는 이식된 마우스를 비오틴 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스테르 나트륨 염(50mg/kg)(Sigma Aldrich, Saint Louis, MO)의 3회 연속 정맥내 주사(12시간 간격)로 주사했다. 최후 주사로부터 12시간 후, 꼬리 정맥 혈액을 채취하고, 30분 동안 4℃에서 2㎍/mL의 항-마우스 Ter119-PE(BD Bioscience, San Jose, CA) 및 스트렙토아비딘-FITC(50㎍/mL, BD Biosciences, San Jose, CA)로 표지했다. 샘플은 주사후 40일 동안 2 내지 4일마다 EPICS XL 유세포 분석(Beckman Coulter, Brea, CA)으로 분석했다. RBC 생존 동태는 전체 RBC 모집단 내의 비오티닐화된 세포의 비율에 의해 측정했다.
CFC 검정. CFC 검장은 Methocult 배지 GF M3434(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)로부터 제조업자의 절차에 따라 대조군 및 이식된 마우스의 BM 및 비장에서 수행했다. BM 세포는 모든 그룹의 마우스로부터 이식후 상이한 시점에서 채취하고, Nikon Diaphot-TMD 현미경에서 파종 7일 후에 CFU(30 이상의 세포의 클러스터)를 채점했다.
조혈 계통의 동정. PBMC는 이식된 동물의 꼬리 정맥으로부터 수득하고, 상이한 조혈 세포를 검출하기 위해 항체의 패널로 표지했다. 항-GR-1 및 항-Mac-1 비오티닐화된 항체(BD Bioscience, San Jose, CA, 5㎍/mL)를 사용하여 골수 세포를 검출하고, T 세포에 대해 항-CD3-PE 항체, 및 SAV-TRC 이차 항체(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)와 함께, B-세포(BD Bioscience, San Jose, CA, 10㎍/mL)에 대해 항-B220-PE 및 항-B220-PECyS 항체를 사용하여 림프계 세포를 검출했다. 샘플은 사멸 세포를 배제하기 위해 DAPI(Boehringer, Ingelheim, Germany, 2㎍/mL)를 부가하는 BD LSR Fortessa 세포분석기(BD Bioscience, San Jose, CA,, USA)에서 분석했다.
구조 및 조직학적 연구. 비장을 채취하고, 사진 촬영하고, 정밀 저울로 칭량하여 비종의 존재를 측정했다. 조직학적 연구는 통상의 조직학적 방법에 따라 수득한 비장 및 간장 절편에 대해 수행하고, 헤마톡실린(Gill-2 Haematoxylin, Thermo, Pittsburgh, USA) 및 에오신(Eosin Alcoholic, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 염색했다. 또한, 철 침전물은 제조업자의 지시에 따라 프러시안 블루(Prussian Blue) 또는 펄(Perl) 염색(Sigma Aldrich, Saint Louis, MO)에 의해 비장에서 연구했다. 모든 절편은 올림푸스 BX40 광학 현미경을 사용하여 검사하고, 100× 또는 200×의 최종 배율로 올림푸스 DP21 카메라로 사진 촬영했다.
적혈구 분화. BM 및 비장에서 Ter119 및 CD71 마커 강도의 유세포 분석을 사용하여, 다른 곳[참조: Socolovsky M, et al. (2001). Blood 98: 3261-3273]에 기재된 바와 같이, 4㎍/mL의 항-마우스 Ten 19-PE 항체(BD Bioscience, San Jose, CA,), 10㎍/mL의 비오티닐화 항-CD71 항체(BD Bioscience, San Jose, CA,) 및 스트렙트아비딘-트리칼라(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 상이한 적혈구 아집단을 동정했다. 이어서, 세포는 프로피디움 요오다이드(IP, 2㎍/mL)를 사용하여 EPICS XL 유세포 분석(Beckman Coulter, Brea, CA)으로 분석하여 생존 세포를 검출했다.
프로바이러스 정량화. 세포당 통합된 프로바이러스의 검출 및 정량화는 팩키징 프로바이러스 서열(Ψ) 및 마우스 Titin 하우스키핑 유전자에 대한 상보성 프라이머를 사용하여 수행했다. 전체 BM 및 말초혈 샘플을 주기적으로 수집하고, 유핵 세포로부터의 게놈 DNA는 DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen, Venlo, Limburg, The Netherlands)를 사용하여 단리했다. 7500 Fast Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 및 이전에 기재된 프라이머 및 프로브[참조: Charrier S, et al. (2011). Gene Ther 18: 479-487]를 사용하여 20 내지 50ng의 게놈 DNA(gDNA)를 다중 qPCR에 의해 증폭시켰다.
키메리즘. 공여체 세포의 존재는 Y 염색체 SRY 유전자 및 마우스 β-액틴 하우스키핑 유전자를 검출하는 qPCR에 의해 정량했다. 이전에 기재된 프라이머 및 프로브[참조: Navarro S et al (2006). Mol Ther 14: 525-535]를 사용하고, 이식된 마우스의 PB로부터의 게놈 DNA는 7500 Fast Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 증폭시켰다. 표준 곡선은 수컷/암컷 마우스 혼합물로부터 0 내지 100% BM을 함유하는 샘플로부터의 gDNA 추출물을 사용하여 제조하고, 키메리즘은 다음과 같이 계산했다: 공여체 생착의 % = 100 × 2(CtßAct - CtSRY).
LAM-PCR 절차. 벡터 통합 부위를 동정하기 위해, 3' 벡터 LTR 게놈 접합부를 문헌[참조: Schmidt et al. 2007 [Nat Methods 4: 1051-1057]]에 의해 공개된 방법에 따라 LAM-PCR에 의해 증폭시켰다. 출발 선형 증폭(100 사이클)은 주형으로서 비오티닐화 LTR 특이적 프라이머 및 최대 100ng의 gDNA를 사용하여 수행했다. 선형 증폭 생성물은 스트렙트아비딘 자기 비드를 사용하여 정제하고, 이어서 상보성 쇄 합성, 2개의 상이한 제한 효소(Tsp509I 및 HpyCH4IV)에 의한 평행 소화, 및 효소 절단에 의해 잔류된 말단에 상보성인 링커 카세트를 사용한 2개 결찰 반응을 수행했다. 생성된 단편은 2개의 추가 기하급수적 PCR 단계에 의해 증폭시켰다. LAM-PCR 생성물을 분리하고, MultiNA 자동화 시스템(Shimadzu) 상에서 겔 전기영동에 의해 정량했다.
일루미나(Illumina) MiSeq 서열분석을 위한 LAM-PCR 생성물의 셋업. 파라진스키 등(Parazynski et al)[Paruzynski A, et al. (2010). Nat Protoc 5: 1379-1395]에 의해 간행된 방법에 따라, Tsp5091 및 HpyCH4IV 효소에 의해 생성된 40ng의 이차 기하급수적 PCR 생성물은, 일루미나 MiSeq 서열분석기 상에서 페어링된 말단 서열분석을 가능하게 하는 특이적 서열을 함유하는 융합 프라이머를 사용하여 재-증폭시켰다. LAM-PCR 샘플은 융합 PCR에 의해 454-피루시퀀싱에 적합시켜 로슈(Roche) 454 GS-FLX 어댑터를 부가했다: 어댑터 A + 8-뉴클레오티드 바코드는 LAM-PCR 앰플리콘의 LTR 말단에 부가하고; 어댑터 B는 링커 카세트 측에 부가했다. 5'-3' 배향에서, 최종 앰플리콘은 다음으로 구성되었다: 어댑터 A, 바코드, LTR 서열, 미지의 게놈 서열, 링커 카세트 서열 및 프라이머 B. 정제된 융합 프라이머 PCR 생성물을 실행시키고, MultiNA 자동화 전기영동 시스템로 정량하고, 함께 풀링하여 10nM의 최종 등몰량 라이브러리를 수득했다. 이어서, 최종 라이브러리는 Viia7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 상에서 일루미나 서열분석 플랫폼(Kapa Biosystems, Wilmington, MA)용의 KAPA 라이브러리 정량화 키트를 사용하여 재-정량하여, 16.35nM의 평가된 농도를 수득했다. 최종적으로, 라이브러리는 일루미나 MiSequ Reagent 키트를 사용하여 서열분석했다.
생물정보학 분석. 고처리량 서열분석 플랫폼, 로슈 454 및 일루미나 MiSeq/HiSeq 둘 다로부터 벡터 통합 부위(IS)를 추출하기 위해, 생 데이터(통상의 FastQ 화일 포맷)을 입역으로 취하는 파이프라인을 설계하여, 신뢰성의 IS 및 최근접 유전자의 목록을 제공했다. 클론 풍부함 정량 및 유전자 온톨로지 풍부함의 우수한 수준 분석은 Excel, GraphPad Prism(TM) 및 이용가능한 온라인 툴을 사용하여 수행했다.
NGS 데이터 처리 및 파이프라인 사용. NGS 데이터 처리의 단계는 일루미나 MiSeq 서열분석 플랫폼으로부터 고처리량 데이터의 관리를 다루고, 모든 유효한 서열 판독이 참조 게놈으로 정렬되는 IS를 동정하는 것을 목적으로 한다. 데이터 처리는, 2개 주요 활동을 포함한다. 1. 렌티바이러스 벡터 서열 및 기타 오염물이 트리밍되는 데이터 품질 검사 및 분석. 2. 모든 유효한 서열 판독이 참조 게놈으로 정렬되고 유효한 IS가 검색되는 통합 부위 동정.
데이터 품질 분석. 일루미나 MiSeq 생 데이터로부터 IS를 동정하기 위해, 생물정보학 파이프라인을 개발했다. 표준 LAM-PCR 생성물은 LTR 서열, 인접하는 인간 게놈 서열 및 링커 카세트(LC) 서열을 함유한다. 459 기술은 10bp 내지 900bp 범위의 길이를 갖는 LAM-PCR 서열의 검색을 가능하게 했다. 유사한 결과는 일루미나 MiSeq 페어링된- 말단 판독으로부터 취득했다. 이들 길이 경계는, 품질 분석 프로세스에서 고려하는 중요한 파라미터이고, 이는 후속의 정렬 절차 및 벡터 성분 동정의 알고리즘 둘 다에 영향을 미치기 때문이다. LC 서열의 일부 또는 전부를 결손하지 않도록 NSG 기술로 도달가능한 최대 크기를 초과하는 것들과 마찬가지로, 너무 짧아서 참조 유전자와 정확하게 정렬되지 않는 서열은 폐기했다. 파이프라인이 각 풀에 대해 종료하면, 모든 통합 부위를 파일(TIGET 네트워크 첨부 화일 저장 -NAS-) 및 내부 데이터베이스 둘 다에서 수집하고, 변경된 카피를 추적하는 저장 서버에서 관리했다.
통합 부위 동정. 유일한 통합 부위를 동정하고 모든 IS 열과 최근접 유전자 주석을 갖는 컬럼(IS 매트릭스)의 각 샘플을 사용하여 엑셀 화일을 추출하기 위해, 하기 단계를 실행했다: 1. create_matrix로 불리우는 프로그램을 사용하여 IS 매트릭스를 작성하여 프로젝트 사이의 충돌 검출을 가능하게 한다. 이 프로그램은 탭-분리된 화일(TSV)를 생성한다; 2. 프로그램 annotate_bed를 사용하여 IS 매트릭스 화일을 주석 달고, 이는 입력 TSV 화일을 사용하여 각 풀에 대해 다음과 불리운다: awk'{print "chr"$1"＼t"$2"＼t"$2}'TSV_FILE|tail-n+2>TSV_FILE.bed; annotate_bed-α/opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene.TIGET.gtf-b TSV_FILE.bed-o TSV_FILE.annotated.bed; 3. 주석 및 매트릭스 화일을 새로운 엑셀 워크시트로 수입한다, 여기서 XLS로 불리움.
충돌 검출. 각각의 이식된 마우스로부터 IS의 신뢰성 데이터세트를 수득하기 위해, 본 발명자들은 잠재적 오염/충돌 및 서열 카운트에 기초하여 펄스 양성으로부터 데이터를 필터링했다. 데이터 정규화의 추가 단계는 상이한 실험으로부터 수득되는 통합 부위를 조합하기 위해 요구되었다.
용어 "충돌"은 독립적 샘플에서 동일한 IS의 존재를 동정하기 위해 사용된다. 본 발명자들의 실험 세팅에서, 상이한 세포의 매우 동일한 게놈 위치에서 벡터의 통합은 매우 낮은 확률의 사상이다. 따라서, 독립적 샘플에서 동일한 IS의 검출은 오염으로부터 유래할 가능성이 높고, 이는 습식 실험 절차(샘플 정제, DNA 추출, LAM-PCR 및 서열분석)의 상이한 단계에서 발생할 수 있다. 본 발명자들의 작업 파이프라인은 샘플간 접촉의 발생을 최소화하도록 설계되어 있지만, IS의 고처리량 분석은 본질적으로 어느 정도의 배경 오염을 수반한다. 동일한 마우스로부터 수득한 상이한 샘플에서 동일한 IS의 회수가 후속 단계에서 사용되어 벡터-마킹된 조혈 세포의 생물학적 특성(즉, 다계통 잠재적 및 지속적 클론성 활성)에 대한 추론을 수행하기 때문에, 샘플 사이의 오염 정도의 동정도 또한 중요하다. 따라서, 본 발명자들은, 오염/충돌로부터 상이한 샘플(동일한 마우스로부터)에서 동일한 IS의 실제 발생을 구별할 수 있어야 한다. 이들 문제를 해소하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들의 분석에서 충돌 정도를 측정하는 방식으로서 상이한 시험 항목 및 마우스로부터 유래하는 샘플 중에서 공유된 IS의 정도를 평가하고, 이어서 각 마우스 데이터 세트로부터 이들 IS를 폐기하는 법칙을 설계하고, 이는 동일한 마우스로부터 샘플 사이의 공유된 IS를 탐색할 때에 충돌로 간주되고 펄스 양성으로 채점할 가능성을 최소화할 수 있다. 본 발명자들은, 각 통합 유전자좌의 검증을 가능하게 하는 충돌 검출 프로세스를 설계했다. 전체 결과는, 통합 유전자좌의 세트 I을 제공하면, 충돌로서 I 중의 통합 유전자좌 i의 분류하는 경우에, i가 I로부터 폐기하게 된다. 본 발명자들은, 3개의 독립적 이식 그룹 사이에서 충돌 검출 프로세스를 적용했다: 1. coPKR170: coRPK 발현 LV 벡터(coRPK 1-3)로 형질도입된 Lin- 세포에 이식후 170일에서 안락사시킨 검정 1로부터의 마우스. 2. EGFP: EGFP 발현 LV 벡터(EGFP 1-6)를 갖는 Lin- 세포로 이식된 검정 2로부터의 마우스. 3. coPKR-TC: coPKR 발현 LV 벡터(coRPK 1-14)로 형질도입된 Lin- 세포에 이식된 검정 2로부터의 마우스, 이의 혈액 및 BM은 일차 이식된 마우스(coRPK 11-14)의 아그룹으로부터 풀링된 BM에 이식된 이차 수용자를 포함하여 상이한 시점에서 분석했다.
각각의 동일한 IS는 상이한 마우스에서 상이한 서열 판독(서열 카운트)을 갖는다. 서열 카운트는, 어느 마우스로부터의 샘플이 풍부한 기준에 기초하여 다른 마우스의 샘플을 오염시켰는지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들의 이론적 근거에서, 2마리 마우스에서 발견된 통합은, 가장 풍부하게 존재하는 마우스에 할당되고, 다른 마우스에서는 오염물로서 고려된다. 따라서, 본 발명자들은, 소정 충돌을 마우스에게 할당하고 다른 것으로부터 제거하는 것을 가능하게 하는 상이한 서열 카운트의 역치를 동정할 수 있다. 본 발명자들은 10의 값을 수득하는 본 발명자 데이터로부터의 역치 값을 검색했고, 각 IS에 대해, 모든 TI 중에서, IS가 풍부함 값(퍼센트 서열 카운트 비율)을 다른 TI의 최고 풍부함 값(퍼센트 서열 카운트)보다 10배 더 낮은 것을 의미하고, 이어서 이는 현재의 TI로부터 폐기된다. 본 발명자들은 TI 및 선택된 그룹 둘 다에 이들 법칙을 적용했고, 엑셀 화일을 사용하여, 하기 법칙(본원에서 TI 필터링으로 상세하지만, 또한 그룹 필터링으로 연장됨)을 적용함으로써 충돌 검출을 계산했다: 1. 각 TI의 단리, 서열 카운트를 합계함으로써 함께 동일한 TI의 모든 샘플을 그룹화한다. 2. 수득된 3개 TI에 있어서, 각각의 IS에 대해, IS 서열 카운트 대 TI의 판독의 전체 합계의 퍼센트 비율을 계산한다. 3. 이어서, 하기 법칙을 적용하여, 각각의 IS를 신뢰성 TI로 할당하는 것을 가능하게 하는 10의 역치를 갖는 결정 단계를 계산한다.
IS를 검출하여 제거하면, 이것이 더이상 해당 그룹에 할당되지 않도록, IS의 판독을 그룹으로부터 제거했다. 상기 기재된 필터는, 상이한 생체외 형질도입된 세포 모집단으로 이식된 마우스(검정 2의 EGFP 발현 마우스의 1 코호트, 및 2개 독립적 이식 실험에 속하는 coPKR 마우스의 2 코호트) 사이에 적용했다. 더욱이, coPKR-TC 그룹(검정 2)와 관련하여, 상기 언급된 필터 방법은 2개 방식으로 변형시켰다: a) 클론 풍부함 분석의 문맥에서 시점 사이의 통합의 공유를 보다 잘 강조하기 위해, 본 발명자들은 하기 법칙을 부가했다: 하나의 통합이 하나 이상의 마우스 사이에서 공유되는 경우, 통합은 이들의 서열 카운트가 마우스 중에서 최대 서열 카운트의 10% 미만인 경우에도 모든 시점에 대해 유지하고; b) 계통 추적 관계에 있어서, 본 발명자들은 3 미만의 서열 카운트를 갖는 IS 및 시점 사이의 공유를 위해 10% 서열 카운트 필터를 제거함으로써 보다 엄격한 필터를 적용했다. 2개 시점 사이에 공유된 통합은, 각각 다른 것보다 많거나 적은 경우만을 유지하거나 폐기하는 것을 의미한다.
유전자 온톨로지 분석. 모든 유전자 온톨로지 분석은 GREAT 온라인 소프트웨어(http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/)를 사용하여 수행했다. 웹 페이지는, 각 데이터세트의 통합의 게놈 배좌를 업로드하는 것을 가능하게 하고, 위치 정보(p-값 계산을 위한 2항 분포 분석에 기초함) 및 통합 부위에 가장 근접한 유전자의 주석 함수(p-값 계산을 위한 초기하 분포 분석에 기초함)를 상관시킴으로써 시험된 데이터세트에서 풍부함 수준을 계산한다[참조: Groeschel S, et al. (2011). J Inherit Metab Dis 34: 1095-1102]. 유전자 온톨로지 데이터베이스의 생물학적 프로세스 및 분자 기능은 풍부함 분석을 위해 선택했다. 양 통계학적 분석에 대해 펄스 발견률 <0.05를 갖는 유전자 부류만을 고려했다(도 20).
데이터 저장. 모든 데이터, 행 데이터 및 결과 둘 다는 루트 폴더 중의 TIGET 네트워크 첨부 화일 저장(NAS)에 저장하고, 풍부함 매트릭스 및 플롯 뿐만 아니라 파이프라인으로부터의 모든 정렬이 이용가능하다. NAS 저장은 인증 및 인가 정책에 의해 보호되고, 디스크 RAID 5의 중복 어레이를 사용하여 신뢰성 및 확장성 하부구조로 구축되었고, TIGET에 등록된 CrashPlan 소프트웨어에서 백업되어 있다.
실시예 1: PGK-coRPK 치료용 렌티바이러스 벡터는 유전적으로 수정된 PKD 마우스에서 빈혈 표현형의 안정한 및 장기간 수정을 유도함
PGK-coRPK LV의 생체내 효력(도 2a)는 PKD 마우스로부터 계통 고갈된 BM 세포(Lin- 세포)의 형질도입 및 이식에 의해 검정했다(도 2b). 도 2a는, 대조군 벡터에서 EGFP 도입유전자의 발현(상부 다이아그램) 또는 치료용 벡터에서 PKLR 유전자 cDNA(coRPK)의 코돈-최적화된 서열의 발현(하부 다이아그램)을 조절하는 인간 PGK 프로모터를 포함하는 유전자 치료 실험을 통해 사용된 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터의 개략도이다. coRPK 서열은 인간 PKLR cDNA와 80.4% 상동성을 나타냈고, 아미노산 서열의 변화 없이, 마우스 Pklr cDNA와 76.5% 상동성을 나타냈다. 도 2b는 개발된 PGK-coRPK 렌티바이러스 벡터의 기능성에 대처하기 위해 수행된 유전자 치료 프로토콜의 개략도이다. PKD 표현형의 수정은 조혈학적 분석 및 대사 프로파일링을 통해 PB 및 BM에서 이식후 4 내지 9개월 동안 연구되었다. 통합 분석은 LV 벡터 안전성에 대처하기 위해 모든 마우스로부터 상이한 조직 및 시점에서 수행되었다. 이식후 280일에서, coRPK 도입유전자를 갖는 일차 이식된 마우스의 전체 BM을 다시 치사적으로 조사된 암컷 PKD 마우스(이차 수용자)에 이식시켜 이식물의 안정성 및 안전성을 시험했다. coRPK LV에 형질도입된 결손 세포가 이식된 치사적으로 조사된 PKD 마우스는, 비-이식된 PKD 동배체 또는 EGFP LV로 형질도입된 세포가 이식된 마우스와 비교하는 경우, 모든 시험된 적혈구 파라미터에서 현저한 개선을 나타냈다(도 3 및 표 2).
[표 2]
혈액학적 변수는 말초혈에서 이식후 140일을 기록했다.
데이터는 평균 ± SEM을 나타내고, 크루스칼-왈리스 비-파라미터 시험을 사용하여 EGFP-발현 마우스와의 비교에 의해 통계학적으로 분석했다. *p<0.05; **p<0.01.
RBC 카운트는 이식후 40일과 같이 빠르게 증가했고(도 3a), PKD의 가장 통상적 징후 중의 하나인 구성 망상적혈구증은 PGK-coRPK 도입 유전자를 갖는 마우스에서 현저히 복귀되어, 이식후 적어도 9개월 동안 건강한 대조군에서 관찰된 것에 근접한 수준에 도달했다(도 3b). 대조적으로, EGFP LV-형질도입된 세포가 이식된 PKD 동물은 분석된 모든 시점에서 PKD 마우스와 병행하여 빈혈 및 현저한 망상적혈구증을 나타냈다. 헤모글로빈 수준(HGB), 헤마토크릿 지수(HTC), 평균 적혈구 용적(MCV) 및 평균 적혈구 헤모글로빈(MCH) 값은 또한, 비-이식된 PKD 동배체와 비교하는 경우, 치사적으로 수정된 세포가 이식된 마우스에서 수정되었다(표 2). 이러한 혈액학적 수정은 63.66 ± 4.45%의 공여체 키메리즘 및 60% 내지 90% 범위의 형질도입 효율로 달성되었다(표 3).
[표 3]
유전적으로 변형된 세포가 이식된 마우스에서 관련 분자 파라미터.
데이터는 평균 ± SEM을 나타내고, n.d는 측정하지 않음을 나타내고, a 평가된 형질도입 퍼센트는 실험 1로부터 작성된 선형 회귀에서 외삽에 의해 수득했다(X 축: VCN/WBC, Y 축: % 프로바이러스+ CFUs).
형질도입된 세포는 세포당 평균 1.65 ± 0.08 통합된 벡터 카피를 나타냈고, 이는 PGK-coRPK LV-벡터가 충분한 인간 RPK 도입유전자 발현을 제공하여 용혈성 빈혈을 복귀시키는 것을 나타낸다. 놀랍게도, coRPK 유입유전자의 발현은, 비-이식된 PKD 마우스와 비교하는 경우, 적혈구 세포 반감기의 연장을 유도했다(도 3c,d). 평균하여, PKD 마우스는 19일의 RBC 반감기를 나타낸 반면, 유전적으로 수정된 마우스에서는 이것이 25일까지 연장되어(6일 연장) 야생형 RBC 반감기에 근접하는 값에 도달했다(도 3d). 따라서, coRPK-발현 마우스의 RBC는 건강한 및 결손 대조군 마우스 사이에서 중간 생존 동태를 나타냈고(도 3c), 이는 완전한 키메리즘이 이들 동물에서 달성되지 않았기 때문일 가능성이 높다(표 3).
이식후 9개월에서, 일차 수용자로부터의 조혈 전구세포는 생착 수준(62.89 ± 5.61%) 및 VCN(1.44 ± 0.08 카피)을 유지한 이차 수용자에 이식했다(표 3). 이차 이식된 수용자는 이식후 최대 5개월까지 다계통 조혈 재구성(도 4) 및 모든 PB 적혈구 파라미터에서 현저한 개선(도 5 및 표 2)을 나타냈다. 도 4a는, CD3-PE, B220-PE, B220-PECyS, Grl-비오틴 및 Macl-비오틴 항체 + SAV-PE-CyS로 표지함으로써 상이한 조혈 계통을 동정하는데 사용된 유세포 분석 전략의 다이아그램이다. 도 4b는 이식후 140일에서 PB 중의 각 계통의 대표적 도트-플롯 및 퍼센트(도 4c)를 도시한다. 바는 건강한(n=2, 흑색 바) 및 PKD 마우스(n=2, 회색 바) 대조군 및 coRPK 치료용 도입유전자를 발현하는 이차 이식된 마우스(n=4, 스크래치 바)의 평균 퍼센트 ± SEM을 나타낸다. 또한, 프로바이러스 통합은 상이하게 위탁된 조혈 전구세포에서 검출되었고(도 6a, b), 이의 수는 시간 경과에 따라 일정하였으며(도 6c), 이는 유전자 수정의 안정성을 입증하고 PGK-coRPK LV의 안전성을 강조한다. 도 6a는 이식후 120 내지 170일에서 개개 이식된 마우스로부터의 BM CFU에서 세포당 벡터 카피 수를 나타낸다. 형질도입 및 키메리즘 퍼센트가 또한 제시되어 있다. 도 6b는 상이한 조혈 구획으로부터의 세포에서 프로바이러스 카피 수를 나타낸다. 컬럼은 이식된 마우스의 상이한 그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다. 도 6c는 개개 이식된 EGFP-발현 마우스(회색선) 및 coRPK 도입유전자를 갖는 마우스(흑색선)으로부터의 BM 세포에서 프로바이러스 통합의 동력학을 나타낸다.
실시예 2: 렌티바이러스-유래된 RPK 발현은 적혈구 분화를 정상화하고 기능적 성숙 적혈구의 생성을 가능하게 함
PKD 마우스는 대상 적혈구형성 메카니즘에 의해 유발된 적혈구 구획의 특징적 확장을 나타낸다[참조: Min-oo et al 2004]. 이식된 마우스에서 적혈구 분화 패턴의 연구는 이소성 RPK 발현이 이러한 메카니즘을 복귀시켰음을 나타냈다(도 7a, b). PKD 및 EGFP-발현 마우스는 BM 및 비장에서 미성숙 적혈구 전구체(아집단 I: 프로적아구 및 아집단 II: 호염기성 적아구)의 우성 및 후기 적혈구계 세포(모집단 IV: 망상적혈구 및 성숙 적혈구)에서 현저한 저하를 나타낸 반면, coRPK LV로 형질도입된 세포가 이식된 마우스는 BM 및 비장에서 미성숙 적혈구 전구체의 현저한 감소(아집단 I 및 II), 및 건강한 마우스에 상당하는 최후 적혈구 구획(아집단 IV)의 현저한 증가를 나타냈다(도 7a, b). 또한, PKD 및 EGFP-발현 마우스와 달리, coRPK 도입유전자를 갖는 것들은 혈장에서 에리트로포이에틴(Epo) 수준의 현저한 감소를 나타냈다(도 7c). 도 8a는 비장으로부터의 전체 CFU를 나타내고, 도 8b는 이식후 140일에서 골수를 나타낸다. 도트는 분석된 마우스당 콜로니의 수를 나타내고, 라인은 각 그룹에서 평균 ± SEM을 나타낸다. 데이터는 비-파라미터 크루스칼-왈리스 시험에 의해 통계학적으로 분석했다. 치료용 벡터로 처리한 PKD 마우스에서 적혈구형성의 정규화는, BM CFU 함량의 변화가 주목되지 않지만(도 8b), 정상 수준까지 전구세포 함량의 비장 수의 감소를 수반했다(도 8a).
실시예 3: coRPK 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 세포의 이식은 골수외 적혈구형성 및 기관 병상을 복귀시킴
RPK 결손 적혈구의 활성적 파괴에 기인하여, PKD 및 EGFP-발현 마우스는, 건강한 대조군과 비교하는 경우, 200% 이상의 비장 중량 및 크기의 증가를 수반하는 급성 비종을 나타냈다(도 9a, b). 비장 구조의 해체 구조 및 비장 적색 펄프의 확장이 또한 이들 동물에서 관찰되었고, 이는 PKD 및 EGFP-발현 간 절편에서 적혈구 세포 클러스터의 존재에 의해 또한 뒷받침되는 강력한 골수외 적혈구형성을 나타낸다(도 9c). 놀랍게도, coRPK 도입유전자의 이소성 발현은 유전적으로 수정된 마우스에서 비장 및 간장 병리를 완전히 복귀시켜, RBC 축적을 감소시키고 비장 조직학적 구조 및 크기를 정상화했다(도 9). 추가로, 조직학적 연구는 유전적으로 수정된 마우스의 간장에서 철 침작의 완전한 결여를 나타낸 반면, 비-이식된 그룹 또는 EGFP-담지 벡터로 형질도입된 HSC가 이식된 그룹의 PKD 마우스는 연속 용혈성 프로세스에 기인하여 강력한 철 과부하를 나타냈다(도 9c). 전체적으로, PKD 마우스에서 유전적으로 수정된 HSC의 이식은 적혈구형성의 정상 상태 및 용혈성 빈혈에 의해 유발된 모든 이차 효과를 회복시켰다.
실시예 4: PGK-coRPK LV-유래된 발현은 WBC 대사 밸런스의 변형 없이 해당 경로를 회복시킴
이어서, 본 발명자들은, RPK 효소적 활성의 기능적 수정을 연구하기 위해 모든 이식된 및 대조군 마우스의 광범위한 대사 분석을 수행했다. 비표적화된 프로파일링 전략에 계속하여, 본 발명자들은 상이한 그룹 중에서 RBC 중의 해당 중간체의 현저한 변화를 관찰하고, 명확한 경향을 갖는 대사산물 패턴의 3개 광범위한 클러스터를 동정했다(도 10a). coRPK-발현 마우스의 RBC는, 건강한 대조군과 유사하지만 EGFP 도입유전자를 갖는 이식된 마우스와는 상이한 클러스터 1로부터의 대사산물의 증가를 나타냈다. 마찬가지로, 클러스터 3은, 야생형 마우스와 유사하지만 EGFP-발현 마우스와는 상이한 유전적으로 수정된 마우스에서 감소된 대사산물 경향을 반영했다. 그럼에도 불구하고, 검정 1로부터의 클러스터 2는 이식된 마우스 그룹(EGFP 및 coRPK 발현 마우스) 사이에서 대사산물 프로파일의 차이를 나타내지 않았다(도 10a). 또한, 비표적화된 대사 프로파일링은 유전적 변형이 일부 중요한 해당 중간체를 변형시킬 수 있고, PGK-coRPK LV-형질도입된 HSC가 이식된 마우스로부터 단리된 적혈구에서 ATP(도 10b), ADP(도 10c) 및 피루베이트(도 10d) 수준의 증가를 달성할 수 있음을 나타냈다. 이들 대사 경향을 고려하여, 본 발명자들은 표적화된 프로파일링 접근법을 사용하여 PK-촉매된 반응에 근접하여 위치된 다른 대사산물을 분석했다. PK-촉매된 반응의 상류에 위치된, 직접 PK 기질 포스포에놀피루베이트(PEP)(도 10e) 및 3-포스포글리세레이트(3-PG)(도 10f)의 수준은 건강한 대조군 마우스의 것에 접근했다. coRPK 도입유전자를 발현하는 결손 적혈구는 또한, PKD 및 EGFP 발현 마우스와 비교하는 경우, D-락테이트(도 10g), 혐기성 해당의 최종 생성물의 증가를 생성했다. 해당 대사산물의 보상이 성숙 적혈구에서 PK 활성의 정규화의 결과인지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 이러한 효소의 활성을 측정하고 이를 헥소키나제 활성과 관련하여 정규화하여 결핍 동물에서 높은 양의 망상적혈구의 영향을 회피했다. RBC는 셀룰로즈 컬럼을 통해 정제하여 백혈구 PK 활성 오염을 방지했다. PK 활성의 완전한 보상은, 야생형 건강한 동물 및 정상의 건강한 혈액 공여체 지원자로부터 수득한 것들과 유사한 비율에 도달하는 coRPK를 발현하는 동물에서 관찰되었다(도 11). 도 11a는 피루베이트 키나제 활성을 나타내고, 도 11b는 헥소키나제 활성을 나타내고, 도 11e는 대조군 마우스 및 형질도입된 세포가 이식된 마우스로부터의 RBC에서 피루베이트 키나제 및 헥소키나제 효소적 활성의 비율을 나타낸다. RBC는 셀룰로즈 컬럼을 통해 혈액 샘플로부터 정제하여 백혈구 PK 활성 오염을 회피하고, 효소 활성 평가에 제공했다. 흑색 바, 건강한 마우스(n=2); 백색 바, EGFP 발현 벡터로 형질도입된 세포가 이식된 마우스(n=3); 스크래치 바, coRPK 발현 벡터로 형질도입된 세포가 이식된 마우스(n=3). 체크무늬 바는 건강한 지원자(n=1)로부터의 값을 나타낸다. 데이터는 각 그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다.
주성분 분석은 RBC의 대사산물 패턴이 그룹에 의존하여 상이하고 WBC 프로파일에 대해 현저히 상이함을 나타냈다(도 12a). 대조적으로, WBC 아그룹은 그룹 사이에서 매우 작은 차이와 함께 군집하였고, 이는, 이소성 coRPK를 발현하는 경우, 백혈구의 대사 밸런스에서 변화가 없음을 나타낸다(도 12a). 추가로, RBC 비표적화된 프로파일링에서 관찰된 특정의 대사산물 변화는 WBC에 존재하지 않았다(도 12b-d).
실시예 5: PGK-coRPK LV 형질도입된 세포는 벡터 유전독성 없이 폴리클로날 조혈 재구성을 유도함
coRPK 또는 EGFP 도입유전자를 갖는 LV의 통합 프로파일을 이식된 마우스에서 분석했다. LV의 게놈-전체의 통합 프로파일의 결과, 각 삽입은, 개개 형질도입된 세포에서 클론 거동을 추적하는데 사용될 수 있는 고유한 유전자 마커를 생성한다. 게놈 DNA(gDNA)는 WBC 및 BM 세포로부터 및 일차 및 이차 이식된 마우스로부터, 또한 이식전 형질도입된 세포 풀(Lin- 세포)로부터 수득했다. 선형 증폭 매개된 PCR(LAM-PCR)(도 13 및 14)을 사용하여 벡터/게놈 접합부를 증폭시키고 벡터 삽입 부위(IS)를 동정했다. 도 13은 벡터 통합 부위가 3' 벡터 LTR-게놈 접합부의 LAM-PCR 증폭에 의해 동정되었음을 입증한다. MultiNA 자동화 시스템을 사용하여, 몇몇 밴드에 의해 특정화된 패턴을 생성한다. 벡터 골격 유래된 Tsp5091 내부 대조군 밴드(IC)는 화살표에 의해 지시되어 있다. 도 14는 벡터 통합 부위가 3' 벡터 LTR-게놈 접합부의 LAM-PCR 증폭에 의해 동정되었음을 입증한다. MultiNA 자동화 시스템을 사용하여, 몇몇 밴드에 의해 특성화된 패턴을 생성했다. 벡터 골격 유래된 HpyCH4IV5 내부 대조군 밴드(IC)는 화살표로 지시되어 있다.
PCR 생성물은 MiSeq 일루미나 플랫폼에 의해 서열분석하고, 수득된 서열은 생물정보학 파이프라인에 의해 마우스 게놈에 맵핑하고, 상기 방법 부분에 기재된 바와 같이 충돌을 위해 필터링했다(도 15). 도 15는, 유전적으로 변형된 조혈 전구세포가 이식된 마우스에서 수행된 통합 부위 맵핑의 분석의 일반적 도식이다. 2개 독립적 실험(표 3)에 속하고 이식후 상이한 시점에서 채취한 이식된 마우스로부터의 골수 및 백혈구 샘플은 제시된 파이프라인에 계속하여 보충 방법에 기재된 바와 같이 분석했다.
전체적으로, 본 발명자들은 이식된 마우스 게놈에 대해 5,173,892 서열분석 판독을 맵핑하여, 2,220개 독특한 벡터 통합 부위를 수득했다. 2개 독립적 실험으로부터 IS의 게놈 분포는 전사 단위 내(특히 전사 개시 부위 -TSS- 하류의 최초 50kb 내)의 통합을 위해 이전에 보고된 LV 선호와 일치했고(도 16a), 이는 마우스 게놈에서 임의의 특정 염색체에 대한 왜곡을 나타내지 않는다(도 16b). 도 16a는 최근접 RefSeq 유전자의 전사 개시 부위(TSS) 주변의 통합 부위(IS) 빈도 분포를 나타내고, 이는 TSS의 상류 및 하류의 500bp에 걸쳐 있다. 상부의 숫자는 모든 샘플 및 시점에 대해 검출된 IS의 수이다. 도 16b는 EGFP 도입유전자(흑색 바) 또는 coRPK 치료용 도입유전자(회색 바)를 발현하는 이식된 마우스에서 LV 통합 부위의 염색체 분포를 나타내고, 이는 임의의 특정 염색체에 대해 왜곡을 나타내지 않는다.
PGK-coRPK LV-기반 유전자 치료의 안전성은 클론 풍부 추정에 의해 연구했고, 이는 데이터세트의 전체 서열 수에 대하여 각 IS(클론 마크)에 대한 서열 카운트의 퍼센트를 계산한다. 각 IS의 상대적 풍부함의 도트 플롯 및 열 맵 대표(도 17, 18 및 19)는 상이한 마우스 및 시험관내 배양된 Lin- 세포의 클론 조성의 강력한 변동을 나타냈다. 도 17은 치료용 PGK-coRPK LV 벡터를 갖는 일차 및 이차 수용자 마우스 사이의 추적된 공유 통합의 챠트이다. 임의의 기관 및 임의의 시간에서 어느 하나의 마우스에서 검출된 통합을 풀링했다. 이차 수용자는 이식된 마우스 coRPK11 내지 14로부터 풀링된 BM을 제공받았다. 검출된 나머지 IS는 검출되거나 일차 및 이차 수용자에서 검출되었다. 박스 내의 숫자는 참조된 마우스에서 상응하는 통합의 퍼센트에서 대표성을 나타낸다. 통합 분석에 적용된 ≥5% 필터에 추가하여, 서열 카운트 <3을 갖는 모든 통합을 제거했다. 도 19는 골수에서 각 마우스에서 풀링된 통합의 클론 풍부함을 나타내는 도트 플롯을 나타낸다. 각각의 통합 부위에 대한 상대적 퍼센트(y-축)는 각 데이터세트에서 수득된 서열 판독의 총 수에 대한 것이다. co-RPK 형질도입된 세포(도 17)와 유사하게, 그래프는 이식된 마우스의 대부분이 조혈 재모집단의 폴리클로날 패턴을 나타낸다.
또한, 몇몇 샘플에 대하여, 소수의 통합이 대량의 서열 판독에 기여했음을 이해할 수 있고(도 17 및 18), 이는 형질도입된 HSC의 재모집단의 폴리클로날 패턴을 나타낸다. 또한, 치료용 PGK-coRPK LV를 갖는 일차 마우스와 후속의 이식된 이차 마우스 사이의 추전된 공유 통합은 그룹 사이에 통합의 강력한 공유를 나타내지 않았고, 이는 클론 우성의 결여를 확인시켜 준다(도 18).
삽입 돌연변이유발의 홀마크가 이식된 마우스에 존재했는지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 현재 진행중의 LV 매개된 임상 시험과 유사한 공통 삽입 부위(CIS)의 발생을 평가했다. CIS는 형질도입의 시점에서 통합 바이어스로부터 또는 성장 이점을 제공하는 벡터 통합을 갖는 클론의 생체내 선택으로부터 발생할 수 있는 삽입 핫스팟이다. CIS는 아벨 및 콜스(Abel and cols)에 기초한 알고리즘을 사용하여 동정했고, 그루브(Grubbs)는 CIS, 따라서 이러한 판독에 의해 유전독성의 놀라운 징후를 발견하지 못한 이상치를 시험한다. 더욱이, 유전자 온톨로지(GO) 분석은 조직-분포, 시점, 또는 재충전 조혈 세포 클론의 풍부함에 의해 분류된 임의의 통합 데이터세트에서 암, 세포 증식 또는 아폽토시스의 조절에 관여하는 유전자 부류에 대한 왜곡이 없음을 밝혀냈다(도 20). 도 20은 LV 게놈 통합 프로파일을 나타낸다. 유전자 온톨로지(GO) 분석은 이식된 마우스로부터의 샘플에 대해 GREAT 소프트웨어를 사용하여 수행했다. 이 연구(N=2220)로부터 검색된 모든 통합은 도면의 좌측 부분에 나타낸 유전자 기능의 과도한 제시를 나타냈다. 가장 풍부한 통합이 특정 유전자 부류에 풍부한지를 조사하기 위해, 전체 데이터세트의 상대 서열 카운트 >5%를 갖는 모든 통합 부위를 선택했고(도 17에 제시됨), 이는 GO 유전자 부류는 과도하게 제시되지 않았음을 보여준다.
이들 결과는 벡터 통합의 중립성을 시사하고, 임상전 세팅에서 PGK-coRPK LV의 안전성을 입증한다.
실시예 6: 인간 임상 시험
임상 시험은, EU/3/14/1130 의약 생성물(RPK 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 자가유래 CD34+ 조혈 줄기 세포)을 사용하여 안전성 및 자가유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)의 일차 효력을 평가하기 위해, 비장적출 불응성의 중증 및 수혈 의존성 빈혈의 병력을 갖는 피루베이트 키나제 결손증 환자에서 수행한다.
ODD EU/3/14/1130은 치료용 인간 PKLR 유전자의 코돈-최적화된 버전을 발현하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함한다(도 21).
자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(SIN-LV)는 보다 강력한 발현을 제공하고(Ellis 2005), 감마-레트로바이러스 벡터보다 전사 사일런싱에 덜 감수성이다(Pfeifer, Ikawa et al. 2002). 또한, 이들은 보다 안전한 통합 프로파일을 나타내고(Schroder, Shinn et al. 2002) (Mitchell, Beitzel et al. 2004) (Wu, Li et al. 2003), 이들이 3' LTR 서열에 포함하는 400bp 결실 때문에(Miyoshi, Blomer et al. 1998) (Zufferey, Dull et al. 1998), 도입유전자 발현은 내부 프로모터에 의해 조절되어 LV-기초 유전자 변형의 안전성을 증가시킨다.
또한, 수용된 렌티바이러스 벡터의 벡터 서열은 몇몇 변형을 포함하여 표적 세포에서 도입유전자 발현 및 안전성을 개선시킨다.
한 가지 변형은, 생체내 활성에서의 이의 안정성 및 유전자 치료에 사용된 다른 프로모터와 비교하여 개선된 안전성 특성을 이미 특징으로 하는 인간 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터의 사용이다(Montini, Cesana et al. 2006, Modlich, Navarro et al. 2009, Montini, Cesana et al. 2009, Biffi, Montini et al. 2013). PGK는 도입유전자의 보다 많은 생리학적 발현 및 전사 사일런싱에 대한 보다 낮은 감수성을 유도한다[참조: Gerolami, Uch et al. 2000, Zychlinski, Schambach et al. 2008].
또 다른 변형은 전사시 mRNA 안정성을 증가시키기 위한 인간 PKLR cDNA(coRPK)의 코돈-최적화된 버전이다. 최적화를 위해, GeneArt® 소프트웨어를 사용하여, GC 함량을 증가시키고 잠재적 스플라이싱 부위를 제거하여 전사 사일런싱을 회피하고, 따라서 도입유전자 발현을 증가시킨다. coRPK 최적화된 서열은, 단백질의 아미노산 서열에서의 변화 없이, 인간 PKLR 유전자와 80.4% 상동성을 나타냈다.
또 다른 변형은 우드척형 간염 바이러스(Wpre)의 돌연변이된 전사후 조절 요소이고, 임의의 잔류 개방 판독 프레임의 결여[참조: Schambach, Bohne et al. 2006]를 또한 포함시켜 치료용 유전자의 발현 수준 및 안정성을 개선시킨다. 이러한 렌티바이러스 벡터(PGK-coRPK LV)의 골격, 프로모터 및 Wpre* 서열은, 이색성 백혈병증(MLD)의 현재 진행중의 임상 시험에 사용된 벡터 골격[참조: Biffi, Montini et al. 2013] 뿐만 아니라, 의약 생성물 "판코니 빈혈 타입 A 환자의 치료를 위한 판코니 빈혈 A(FANCA) 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터"(Ref 141/2000)에 상응하는 것과 동일하다
작동 방식
PKD 환자로부터 CD34+ 전구세포 세포를 수확한 후, 골수(BM) 또는 고정된 말초혈 세포로부터, 이들을 의약 생성물로 생체외 형질도입하고, 치료용 벡터를 세포의 게놈에 통합한다. 통합되면, 치료용 인간 유전자(coRPK)는 결손 세포 내에서 전사 및 번역되어, PKD 성숙 적혈구를 결실하거나 감소된 치료용 RPK 단백질을 생성한다. 이어서, 형질도입된 PKD 조혈 전구세포를 유전적으로 수정하고, 따라서 이들의 기능을 달성하기에 충분한 양의 ATP를 갖는 RBC를 생성한다(도 22). 이어서, 이들 유전적으로 수정된 조혈 전구세포(이는 의약 생성물을 구성한다)를 다시 환자에게 이식하고, 일단 이식되면, 질환을 일생 치유하는 정상 적혈구를 생성한다.
활성 원리는, 피루베이트 키나제 결손의 치료를 위한 유럽 위원회(ODD EU/3/14/1130)에 의한 오르판 약물로서 설계된 치료용 렌티바이러스 벡터 PGK.coRPK.wpre를 갖는 수정된 조혈 줄기 세포(CD34+) 세포의 세포 현탁액에서 구성할 수 있다. 따라서, 이러한 신규 의약은 유전자 치료 아부류 내의 진보된 치료법 개발의 그룹에 포함되어야 한다.
활성 원리는, 세포당 적어도 0.1 카피의 치료용 벡터를 갖는 적어도 2×106 CD34+ 세포/체중 kg의 유전적으로 변형된 세포 현탁액에 의해 구성된다. 세포는 2% HSA로 식염수 완충액에 현탁된다.
최종 치료 생성물은 GMP 규칙에 따라 제조되고, 따라서 환자에서 이의 해방 및 이의 주입을 위한 생성물 요건은 생성물의 품질과 연관된다. 이와 관련하여, 이들 명세는 세포 생존능 ≥30%, 멸균성(그램 시험 및 약초학에 의한 무균성), 마이코플라즈마의 부재, 복제 경쟁 렌티바이러스 입자의 부재, 및 정량적 PCR에 의해 세포당 적어도 0.1 벡터 카피의 존재의 검출에 의한 치료 가능성의 효력의 입증일 것이다. 추가로, 이들 중에서 조혈 전구세포의 내용 및 벡터 카피 수의 조사 및 연구가 수행될 것이다. 3개의 독립적 검증이 건강한 대조군 세포를 사용해 수행되어, 해당 절차가 상기한 요건에 도달하도록 보장할 것이다.
최종 생성물은 열에 의해 밀봉되는 전달 백에 팩키징하고, 특히 환자에게 주입 때까지 동결 및 보존하기 위해 완성하고; 이전에, 샘플은 정확한 상응하는 품질 관리를 위해 수집된다.
동원
2명의 최초 환자가 병원 델 니이오 제우스(Hospital del Niiio Jesus, Madrid (Spain))에서 동원될 수 있지만, 환자는 이들의 각각의 병원에서 동원된다. 동원 프로세스는 12mg/kg의 용량으로 생후 최대 8일 동안 1일 2회 재조합 자극 인자 과립구 콜로니(G-CSF, Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA), 4일 연속일 동안 피하 용량으로 240mg/kg/d에서 4일차에 플레릭사(Plerixa)(Mozobil®, Genzyme Europe BV, Naarden, Netherlands)의 투여로 이루어진다. 말초혈로부터의 조혈 전구세포 세포는, 동원 5일차로부터 세포 분리기를 통해 및 마드리드의 병원 니이오 제우스에서 표준 프로토콜에 따라 백혈구반출에 의해 대량으로 수집한다. 모든 장치 및 용액은 CE 표지되고, 의료 기기의 법률의 사양을 만족시킨다.
CD34 + 세포 정제
동원 프로세스와 일치하여, 환자가 동원되는 병원에서 분리반출법이 수행된다. 분리반출물은, 강자성 매트릭스를 사용하여 강력한 영구 자석 및 분리 컬럼을 통해 높은 자장 구배에 의해 세포의 분리를 가능하게 하는 MACS "자기 세포 선별" 기술(Miltenyi Biotec, Germany)을 통해 조혈 전구세포(CD34+ 세포)를 선택하기 위해 즉시 처리된다. C1iniMACS(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 시스템은 컴퓨터(C1iniMACS®plus Instrument), 특정의 CD34+ 선택 소프트웨어, 멸균 튜브 세트(C1iniMACS Tubing Sets), 자기-조절된 반응성 멸균 기수(C1iniMACS CD34 Reagent) 및 멸균 완충제(C1iniMACS PBS/EDTA Buffer)로 이루어진다. 사용된 장치 및 시약은 CE 표지되고, 의료 기기의 법률의 사양을 만족시킨다. 이러한 단계 및 그 후의 세척 동안, 비특이적 면역글로불린(정맥내 Flebogamma 5% 0.5 gr, Grifols) 및 인간 알부민(인간 알부민 Grifols® 20%, Grifols)이 사용되고, 이는 이후에 원심분리후 세척에 의해 제거된다. 이어서, CD34+ 세포를 정량한다. 수득된 생성물에 대한 미생물학적 조절은 특정 프로토콜에 따라 배양을 위한 표준 진균, 호기성 세균 및 혐기성 세균 샘플을 채취함으로써 수행한다.
CD34 + 형질도입
ODD EU/3/14/1130를 갖는 정제된 CD34+ 세포의 형질도입은, 환자(분리반출법)로부터 세포의 추출 이래 48시간 이내의 시간 윈도우에서 GMP 조건하에 수행한다. 세포의 생체외 배양은 48시간 미만으로 지속하고, 적절한 제형화된 배지 X-vivo-20(Lonza)의 사용, 조혈 성장 인자(100ng/ml hrSCF, 100ng/ml hrFlt-3, 100ng/ml TPO 및 20ng/mL IL-3)(모두 Prepotech), 풀모자임(Pulmozyme) 및 조절된 5% O2 농도를 포함하는 확립된 표준에 따라 배양한다. 형질도입은, VIVEbiotech (San Sebastian, Spain)에 의해 생성된 ODD EU/3/14/1130의 GMP 렌티바이러스 배치로 수행한다. 형질도입 후, 세포를 X-vivo-20(Lonza)로 세척하여 최종적으로 동결보존에 적합한 전달 백에 팩키징한다. 특정 샘플을 수집하여, 최종 생성물이 이의 최종 해방을 위해 이미 언급된 모든 사양을 만족하는지를 판단한다. 3개의 독립적 검증을 수행하여 생성물의 안정성을 평가할 수 있다. 벡터를 포함하는 모든 생성물 및 용액은 의료 기기 및 이상 용도를 위한 법률의 사양을 만족한다. 생성 전에, 모든 원재료(소모품, 생물학적 시약 및 화학적 분말을 포함)는 표준 조작 절차(SOP)에 따라 CliniStem의 품질 관리(QC) 유닛에 의해 검사된다.
컨디셔닝
환자는 시험을 위해 고려되는 표준화된 특정 프로토콜에 따라 컨디셔닝된다. 환자가 선택지를 컨디셔닝하는 것을 고려하기 위해, 2×106 미처리 CD34+ 세포/kg의 백업은, 제조된 생성물이 치료되는 환자의 조혈을 완전히 재구성하지 않는 경우에 사용되도록 동결 상태로 유지된다.
주입
주입 전에, 환자 적격성은 이들이 연구 요건을 만족하는 것을 보장하기 위해 검사된다. 주입 일자, 전투약 및 사용된 예방 의약이 기록된다.
실시예 7: 비-임상 개발
이전 연구는, 25% 이상의 유전적으로 수정된 세포가 이식되는 경우, 마우스에서 PKD를 위한 HSC 유전자 치료의 실현가능성을 입증했다. 이들 결과는, PKD에서 치료 효과를 달성하기 위해, 유의한 수의 공여체 유전자-수정된 HSC(Zaucha, Yu et al. 2001) 및 고도의 도입유전자 발현이 필요하다는 것을 시사한다. 본 발명자들은, 2014년 8월(EU/3/14/1130)에 오르판 약물로서 명명된 PKLR cDNA의 발현을 유도하는 hPGK 진핵생물 프로모터를 보유하는, 이러한 임상 시험을 위해 제안된 신규한 치료용 렌티바이러스 벡터를 개발했다. 이 벡터를 사용하여, 본 발명자들은 질환의 마우스 모델에서 PKD의 임상전 유전자 치료 프로토콜을 수행했다. 임상 기준에 기초하는 렌티바이러스 용량을 사용하여, 이소성 RPK 발현은 적혈구 구획을 정상화하고 혈액학적 표현형을 수정하고 기관 병상을 복귀시킬 수 있었다. 대사 연구는, 백혈구에서 관찰된 대사 장애 없이, 유전적으로 수정된 RBC에서 해당 경로의 기능적 수정을 입증하였다. 놀랍게도, 병행하여 분석된 WBC는, RPK가 PGK 등의 편재성 프로모터의 활성하에 이소성으로 발현되는 경우에 대사 밸런스의 변화를 전혀 나타내지 않았고, 이는 가능한 안전성 관념으로서 백혈구 대사 이점을 배제하고 EU/3/14/1130 벡터의 치료 가능성을 강화한다.
BM 재-이식에 의해 유도된 증식 스트레스 후에 이차 수용자에서 임의의 백혈구 사상 또는 클론 확장의 다계통 재구성 및 부재는 PGK-coRPK LV 벡터-기반 프로토콜의 장기간 안정성 및 안전성을 입증한다. i) RPK 도입유전자의 보다 많은 생리학적 발현을 유도하고 ii) 약한 트랜스활성화 인자인 것으로 증명되고 iii) 이색성 백혈병증(MLD)의 임상 시험에서 현재 사용되고 있는 인간 PGK 진핵생물 프로모터의 사용은 또한 전체 절차의 안전성을 설명할 수 있다.
벡터 통합 부위의 분석을 통해 HSC 유전자 치료의 장기간 안전성을 평가하기 위해, 차세대 서열분석을 사용하여 HSC에서 삽입 발암성의 위험을 예측했다. 5,173,892개 이상의 서열 판독은 마우스 게놈 상에서 전체 2220개 독특한 벡터 IS로 맵핑되었고, 생체내 확장 또는 IS를 보유하는 클론의 선택의 증거는 발견되지 않았다. 오히려, 본 발명자들의 데이터는 마우스에서 형질도입된 HSC의 이식후 조혈의 클론 조성 및 동태를 나타내고, 이는 시간 경과에 따라 HSC의 진정한 및 안정한 유전자 생체내 변형을 시사한다. 전체적으로, 벡터 통합 패턴의 분석은, 유전독성의 증거 없이 PKD 유전자 수정을 제공하는 PGK-coRPK LV 벡터의 안전성 특성을 강조한다.
실시예 8: 임상 개발
지금까지, 임상 연구는 의약품으로 수행되지 않았다. 프로토콜 지원이 규제 당국에 요구되는 것은 이것이 최초이다. 본 발명자들의 목적은, 유럽 위원회가 주최하는 임상 시험을 실시하는 것이다. 유럽에서 상이한 임상의 및 연구자에 의해 구성된 ForGeTPKD 컨소시엄은 신규한 치료 전략의 PKD 연구 및 개발에 주력하기 위해 설립되었다. ForGeTPKD 임상 시험은 인간에서 이러한 의약 제품의 최초의 투여일 것이다. 이는, 중증 피루베이트 키나제 결손을 갖는 환자에서 적혈구 타입 피루베이트 키나제(RPK) 유전자(EU/3/14/1130)를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 생체외에서 형질도입된 자가유래 CD34+ 세포의 이식의 안전성 및 효력을 평가하기 위해 국제, 다중센터, 상 I/II 오픈 라벨 연구로서 설계된다.
규제 상황
의약 생성물은 현 시점에서 판매 인가를 받지 못했다. PKD 컨소시움의 목적은 최종적으로 판매 허가를 수득하기 위해 의약 생성물의 임상 개발로 전진하고 있다.
상술한 최종 생성물은 다음과 관련된 오르판 약물 지정을 받은 렌티바이러스 벡터로 생성된다:
적응증: 피루베이트 키나제 결손의 치료
기준: PKD를 위한 유일한 치유적 처치는 동종이계 BMT이고, 이는 다른 수단에 불응성인 수열-의존성 중증 빈혈을 갖는 환자에서 사용되어 왔다. 그러나, 동종이계 BMT는 PKD(문헌[참조: Tanphaichitr, Suvatte et al. 2000]에 보고된 유일한 1명 환자)를 위한 광범위하게 허용된 처치는 아니고, 이는 화학요법 또는 화학-방사선요법에 의한 집중적 프리-알로-BMT 컨디셔닝과 관련된 중증 합병증, 뿐만 아니라 급성 및 만성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)과 관련되기 때문이다. 본 발명자들의 가설은, ODD EU/3/14/1130에 의해 제공된 유전자의 야생형 버전을 함유하는 바이러스 벡터가 형질도입된 자가유래 조혈 줄기 세포를 사용한 유전자 치료가 이들 환자의 잠재적 치유 기회를 나타내고, 조혈 전구세포 이식의 실패의 주요 원인인 GVHD의 위험을 회피할 수 있다는 것이다.
활성 물질: 단백질의 야생형 버전을 발현하는, 적혈구 타입 피루베이트 키나제(RPK) 유전자(ODD EU/3/14/1130)를 함유하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된, 자가유래 CD34+ 조혈 줄기 세포.
완성 생성물: 2% HAS를 갖는 식염수 완충제에 현탁시킨, 적어도 2×106 활성 물질/체중 kg을 함유하는 동결 백.
실시예 9: 약리학
완성 연구: 개발된 의약 생성물은 PKD에 대한 유전자 치료를 위한 몇몇 이점을 제공하는 이의 서열에서 몇몇 변형을 포함한다: 1) SIN-LV 벡터 설계의 사용은 바이러스 스톡의 비교적 용이한 및 안전한 생성을 가능하게 하여, HSC를 효율적으로 형질도입시킬 수 있고; 2) 메틸화에 의한 사일런싱에 대해 덜 감수성(Gerolami, Uch et al. 2000)인 hPGK 등의 약한 및 진핵생물 프로모터의 사용은 도입유전자의 덜 감수성의 생리학적 발현을 유도하여, 임상 기준 내의 바이러스 용량(1.65 VCN)으로 치료 수준을 달성하고(Matrai, Chuah et al. 2010); 3) 코돈 최적화된 도입유전자 서열 및 돌연변이된 Wpre 서열의 존재는 도입유전자 mRNA 안정성을 증가시키고; 치료용 벡터 서열에 리포터 유전자를 포함하지 않아 가능한 면역원성 문제를 회피할 수 있었다(Morris, Conerly et al. 2004); (Stripecke, Carmen Villacres et al. 1999).
개발된 hPGK-coRPK LV 의약 생성물은, ODD EU/3/14/1130로 형질도입되고 수정된 전구세포가 이식된 일차 및 이차 결손 마우스 둘 다에서 PKD 병리를 효율적으로 복귀했다. 수정은 치료용 도입유전자의 세포당 평균 1.65 카피를 갖는 세포로 달성되었다.
인간 PGK 프로모터는 coRPK 단백질의 임상적 관련 수준을 발현시키기에 충분히 강력하여, 이식된 마우스에서 용혈성 표현형을 회복시킨다.
유전자 수정은 하기를 가능하게 했다: RBC 반감기를 연장시키고; 혈액학적 변수 및 망상적혈구 수준을 정상화하고; PKD 마우스에서 구성적으로 활성화된 보상 적혈구형성을 복귀시키고; 비장 및 간장에서 병리를 구조하여, PKD의 삶-위협 합병증 중의 하나인 철 과부하를 현저히 감소시킨다. 또한, 인간 RPK의 이소성 발현은 WBC에서 대사 밸런스를 변화사키지 않고서 RBC에서 에너지 결함을 수정하여, 의약 생성물의 유효성 및 안전성을 강조한다.
실시예 10: 진행 중의 연구
하기 연구를 위한 건강한 공여체 및 PKD 환자로부터의 인간 조혈 전구세포의 형질도입: 1) 인간 세포에서 ODD EU/3/14/1130의 효율; 2) RPK 치료용 단백질의 효율적 및 치료적 발현을 수득하기 위한 최적 벡터 카피 수/세포의 정의; 및 3) 조혈 줄기 세포 능력을 소실하지 않고서 치료적 형질도입을 수득하기 위한 최적 조건의 정의.
계획된 연구는, 최종 치료 생성물에 대해 정의된 요구된 사양에 도달하는 최적 조건을 설정하기 위해 GMP 시설에서의 대규모 형질도입 및 사전 검증 및 3회 검증 연구를 위한 조건의 설정을 포함한다.
독물학
완성 연구는 하기를 포함한다: 1) 인간 RPK의 이소성 발현은 WBC에서 대사 밸런스를 변화시키지 않고서 RBC에서 에너지 결함을 수정했고; 2) 벡터의 게놈 통합 분석은, (i) 특정 세포 클론의 상대적 풍부함의 분석이 일부 마우스의 올리고클론 조혈 재구성을 나타내어, 임의의 일차 및 이차 이식된 마우스의 클론 우성을 나타내지 않았고; (ii) 삽입 돌연변이유발의 홀마크로 간주되는 공통 통합 부위(CIS, 규정된 게놈 간격에서 벡터 통합의 고밀도 클러스터)가 유전독성의 어떠한 징후도 나타내지 않았고, 마우스에서 수행된 2개 독립적 유전자 치료 실험으로부터 시간 경과에 따른 CIS의 이상 풍부화 및 검출된 CIS가 고도 서열 카운트에 의해 나타나지 않았고, 암유전자를 우선적으로 표적화하지 않았고; (iii) 렌티바이러스 통합 및 게놈의 특정 영약에서 벡터 통합의 위치의 연구에 의해 표적화된 유전자의 유전자 온톨로지(GO) 분석은, 암, 세포 증식 또는 아폽토시스의 조절에 관여하는 유전자 부류에 대하여 왜곡 없음을 입증하고; (iv) 종합적으로, 의약 생성물 통합 분석은 유전독성의 임의의 증거를 나타내지 않았음을 입증한다.
계획된 연구는 하기를 포함한다: 1) 재조합 경쟁 렌티바이러스(RCL) 생성의 분석: 건강한 공여체 및 PKD 환자로부터의 인간 T 림프구를 ODD EU/3/14/1130로 형질도입하고 연장된 시간 동안 시험관내에서 배양한다. 바이러스 p24 단백질의 존재는 잠재적 발생 또는 RCL을 평가하기 위해 ELISA에 의해 상청액에서 분석한다; 2) 의약 생성물의 생물분포: 마우스 조혈 전구세포를 ODD EU/3/14/1130로 형질도입하고, 치사적으로 조사된 수용자에 이식한다. 이식후 1개월에서, 동물의 희생시키고, 상이한 기관(생식선, 간장, 신장, 뇌, 골수, 비장 및 말초혈)을 벡터 DNA의 존재에 대해 분석한다; 3) 인간 세포에서 벡터 통합: 건강한 공여체 및 PKD 환자로부터의 조혈 전구세포를 ODD EU/3/14/1130으로 형질도입하고, 인간 조혈 세포의 생착 및 증식을 가능하게 하기 위해 중증 면역결핍 마우스에 이식한다. 상이한 시점(이식후 1, 2 및 3개월)에서, 혈액 및 BM 이식물을 채취하고, 인간 세포에 대해 선별하고, 마우스 세포로 이미 수행된 바와 같이 벡터 통합 분석에 제공했다.
실시예 11: 인간 임상 시험
임상적 효력을 시험하기 위해, ForgetPKD 시험을 수행한다. 제안된 임상 시험은, 비장적출술에 불응성인 중증의 수혈 의존성 빈혈의 병력을 갖는 피루베이트 키나제 결손증 환자에서 EU/3/14/1130(적혈구 타입 피루베이트 키나제(RPK) 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 자가유래 CD34+ 조혈 줄기 세포)를 사용하여 자가유래 조혈 줄기 세포 이식(HSCT)의 안전성 및 예비적 유효성을 평가하는 것을 목적으로 한다.
제1 목적은 치료 안전성 및 인용성/실행가능성을 평가하는 것이다. 하기 종점은, 1) 형질도입된 세포의 주입과 관련된 AE, 세포 주입 전에 컨디셔닝으로부터 유래된 AE, 및 형질도입된 세포와 관련된 클론 진화로부터 유래된 AE를 포함하는 유해 사상(AE)의 빈도 및 특성화; 및 2) 이식후 30일에서 줄기 세포 생착을 갖는 환자의 수에 따라 측정한다.
제2 목적은, 예비적 치료 유효성을 평가하는 것이다. 하기 종점은 연구 말기에 "수혈 독립적"으로 되는 환자의 수; 치료후 수혈을 여전히 필요로 하는 환자에서, 기준선 평가 전에 과거 1.5년간 평균 수혈 수에 대하여 연구 기간(1년) 이내에 필요한 평균 수혈 수 사이의 비율; 연구 종료시에 기준선으로부터 2gr/dL의 헤모글로빈 수준의 수준의 상승을 갖는 환자의 수로서 정의되는 빈혈의 임상적으로 유의한 감소; 연구 종료시에 기준선 평가로부터 50%의 감소를 갖는 환자의 수로서 정의되는 망상적혈구증의 임상적으로 유의한 감소; 및 1% 형질도입된 세포가 세포 주입후 6 및 12개월에서 및 연구 종료시에 검출될 수 있는 줄기 세포 생착을 갖는 환자의 수에 따라 측정할 수 있다.
탐색적 목적은 환자의 생활의 질에 대하여 치료 영향을 평가하는 것이다. 하기 종점은, 생활의 질에 관한 설문지(성인의 경우에 SF-36 또는 어린이의 경우에 PEDSQL) 및 참가국 언어(이탈리아어, 독일어 및 스페인어)로 이의 번역된 유효 버전을 사용하여 연구 종료시에 기준선으로부터 삶의 질의 개선에 따라 측정할 수 있다.
ForGetPKD 시험은, 3개 EU 가맹국: 스페인, 이탈리아 및 네델란드에서 수행되는 다중센터, 국제 시험이다. 참가하는 센터는 PKD 진단 및 치료를 위한 참조 국립 조사기관 및 시설을 포함한다.
시험은, 기재된 생성물의 인간에 대한 최초 투여를 나타낸다. 이는, 비-경쟁적, 개방 표지, 단일-용량, 상 I/II 연구로서 설계된다.
전세계 연구 기간은 최초의 환자의 최초 방문으로부터 최후 방문 환자까지의 2년으로 된다. 이는 1년간의 모집 기간 및 1년간의 치료 기간 및 조기(즉시) 추적조사를 포함한다. 시험 종료 후, 포함된 대상체는 이식후 최대 5년 동안 안전성 및 유효성을 모니터링하는 후석의 연구에 참가할 것이 요구된다.
질환 빈도 및 연구 설계에 따라, 본 발명자들은 1년에 6인의 환자를 포함하도록 계획하고 있다. 이러한 견적은, 3명의 잠재적 참가자가 이미 동정되어 있는 것을 고려하여 결정되었다.
연구 절차는 스크리닝 기간, 치료 기간 및 추적 기간을 포함한다. 각 상에 대한 방문의 상세 및 관련된 연구 절차는 하기 상세되어 있고 표 4에 요약되어 있다.
[표 4]
스크리닝 기간
방문 -1: 사전-스크리닝 방문
잠재적 후보자는, 시험의 목적 및 특징을 통지받고, 서면에 의한 통지된 동의서는 이중으로 작성하고 이행하고 환자(또는 미성년의 경우에 법정 대리인)에 의해 서명된다. 연구 대상으로 되기 위해, 환자는 모든 포괄적 기준을 만족해야 하고, 검사되는 제외 기준도 만족하지 않으면 안된다. 이는 생존가능한 CD34+ 세포를 동원하고 수득하기 위한 전처리 절차를 포함하여, A. 비-생착의 경우에 백업으로 기능하기 위해 2×106 CD34+ 세포/체중 kg을 저장하고, B. 적어도 6×106 CD34+ 세포/체중 kg을 EU/3/14/1130 벡터로 형질도입하여 의약 생성물을 생성하고 의약 생성물의 유리에 필요한 모든 품질 관리를 수행한다. 의약 생성물(2×106 형질도입된 CD34+ 세포/체중 kg)의 유리 후에 이용가능한 충분히 형질도입된 세포를 갖는 환자만이 연구에 포함된다.
하기 절차는 또한 금회의 방문에서 수행된다:
· 관련 의학적 수술 병력의 등록.
· 인구통계 데이터 및 임상적 관련 신체 검사 결과의 등록.
· 관련 병용 의약의 등록.
· 통상의 세포 혈액 카운트(CBC)에 대한 말초혈 시험, 생화학, 응고 측정 및 혈청학
· 심초음파검사, 폐 기능 검사 및 흉부 X-선
· 삶의 질 설문지(SF-36 또는 PEDSQL)
· PKD의 유전적 진단
이 연구에 적격이기 위해, 환자는 이하의 포함 기준 및 제외 기준 모두를 만족해야 한다.
포함 기준은 남성 또는 여성 환자이고, 모집 시점에서 2세 초과이며, 서명 통지된 동의서(18세 이하의 어린의 경우에 양친 또는 법적 대리인에 의해 서명된다)를 받아 유전자 검사에 의해 확인된 PKD의 사전 진단, 비장적출술에 반응하지 않는 중증의 수혈-의존성 빈혈의 병력, 자가유래 조혈 줄기 세포 이식의 후보자, ≥ 2×106 형질도입된 CD34+ 세포/체중 kg을 이용가능하고, 수혈 병력을 포함하는 상세한 의료 기록을 유지한 전문 센터에서 적어도 과거 2년 동안 치료되었다.
제외 기준은, 인간 면역결손 바이러스 타입 1 또는 2(HIV 1 및 HIV 2)의 존재, 미수정된 출혈 장애, 기타 용혈 원인의 존재, 이전 또는 현재의 악성종양 또는 골수증식성 또는 면역결핍 질환, 공지된 또는 의심되는 가족 암 증후군(이들로 한정되지 않지만, 유전성 유방암 및 난소암 증후군, 유전성 비-폴리포시스 결장직장암 증후군 및 가족성 선종 폴리포시스를 포함함)을 갖는 직계 가족, 이전 동종이계 이식을 갖는 환자, 공여체 기원의 잔존 세포의 존재, 의학적 평가후 등급 III/IV 심장, 폐, 간장 또는 신장 기능 이상을 앓는 것으로 간주되는 중증 합병증을 갖는 환자, 제어불능의 발작 장애, <50%의 예측된 (헤모글로빈에 대해 수정됨) 일산화탄소의 확산 능력(DLco), 검사관의 의견에서 제외를 보증하는 중증 철 과부하의 임의의 기타 증거, 스크리닝의 30일 이내에 조사 약물을 사용한 별개의 임상 시험에의 참가, 동종이계 골수 이식을 위한 HLA-동일 계열 공여체의 이용가능성, 임신중 또는 수유 여성, 연구자의 기준에 따라, 연구의 목적, 이점 및 위험을 이해할 수 없고/없거나 연구 절차에 부합할 수 없는 환자, 성인에서 카모프스키 지수 ≤80 또는 어린이에서 란스키 ≤80에 의해 입증되는 불량한 기능 상태에 대해 양성이다.
연구의 통계학적 분석은 기술적이다. 정성적 종점은 빈도 및 퍼센트에 의해 기재된다. 정성적 종점은 유해 사상, 줄기 세포 생착을 갖는 환자의 수, "수혈 독립적"으로 되는 환자의 수, 임상적으로 유의한 빈혈의 감소를 갖는 환자의 수, 임상적으로 유의한 망상적혈구증의 감소를 갖는 환자의 수, 형질도입된 세포의 존재가 검출될 수 있는 줄기 세포 생착을 갖는 환자의 수, 및 SF-36 또는 PEDSQL 설문지에 의해 측정된 기준선으로부터 삶의 질의 개선을 포함한다. 정량적 종점은 평균 및 표준 편차에 의해 또는 중앙치 및 4분위점에 의해 기재된다. 정량적 종점은 기준선으로부터 빈혈 및 망상적혈구증의 감소, 기준선 평가 전의 과거 1년간 수혈 수에 대한 연구 기간 내에 필요한 수혈 수, 및 말초혈 및 골수에서 벡터 카피 수를 포함한다. 모든 종점은 연구 종료시에 기재된다.
이전 연구는, 25% 이상의 유전적으로 수정된 세포가 이식된 마우스에서 PKD에 대한 HSC 유전자 치료의 실현가능성을 입증했다. 이들 결과는, PKD에서 치료 효과를 달성하기 위해, 현저한 수의 공여체 유전자-수정된 HSC(Zaucha, Yu et al. 2001) 및 고도의 도입유전자 발현이 필요하다는 것을 시사한다. 본 발명자들은, 2014년 8월에 오르판 약물(EU/3/14/1130)로서 명명된 PKLR cDNA의 발현을 유도하는 hPGK 진핵생물 프로모터를 보유하는, 이러한 임상 시험을 위해 제안된 새로운 치료용 렌티바이러스 벡터를 개발했다. 이러한 벡터를 사용하여, 본 발명자들은 질환의 마우스 모델에서 PKD에 대한 임상전 유전자 치료 프로토콜을 수행했다. 임상 기준에 기초한 렌티바이러스 용량을 사용하여, 이소성 RPK 발현은 적혈구 구획을 정상화하고 혈액학적 표현형을 수정하고 기관 병상을 복귀시킬 수 있었다. 대사 연구는, 백혈구에서 관찰된 대사 장애 없이, 유전적으로 수정된 RBC에서 해당 경로의 기능적 수정을 입증했다. 놀랍게도, 병행하여 분석된 WBC는, RPK가 PGK 등의 편재성 프로모터의 활성하에 이소성으로 발현되는 경우, 백혈구에서 대사 밸런스의 변화를 나타내지 않았고, 이는 가능한 안전성 관념으로서 백혈구 대사 이점을 배제하고 EU/3/14/1130 벡터의 치료 가능성을 강화시킨다.
BM 재-이식에 의해 유도된 증식 스트레스 후에 이차 수용자에서 임의의 백혈구 사상 또는 클론 확장의 다계통 재구성 및 부재는 PGK-coRPK LV 벡터-기반 프로토콜의 장기간 안정성 및 안전성을 입증한다. RPK 도입유전자의 보다 많은 생리학적 발현을 유도할 가능성이 높고 약한 트랜스활성화 인자인 것으로 판명되고 이색성 백혈병증(MLD)에 현재 사용되고 있는 인간 PGK 진핵생물 프로모터의 사용은 또한 전체 절차의 안전성을 설명할 수 있다.
벡터 통합 부위의 분석을 통해 HSC 유전자 치료의 장기간 안전성을 평가하기 위해, 차세대 서열분석을 사용하여 HSC에서 삽입 발암성의 위험을 예측할 수 있었다. 5,173,892개 이상의 서열 판독은 마우스 게놈 상에서 전체 2220개 독특한 벡터 IS로 맵핑되었고, 생체내 확장 또는 IS를 보유하는 클론의 선택의 증거는 발견되지 않았다. 오히려, 본 발명자들의 데이터는 마우스에서 형질도입된 HSC의 이식후 조혈의 클론 조성 및 동태를 나타내고, 이는 시간 경과에 따라 HSC의 진정한 및 안정한 유전자 생체내 변형을 시사한다. 전체적으로, 벡터 통합 패턴의 분석은, 유전독성의 증거 없이 PKD 유전자 수정을 제공하는 PGK-coRPK LV 벡터의 안전성 특성을 강조한다.
<110> CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGETICAS MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLOGICAS (C.I.E.M.A.T.) FUNDACION INSTITUTO DE INVESTIGACION SANITARIA FUNDACION JIMENEZ DIAZ CENTRO DE INVESTIGACION BIOMEDICA EN RED <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED GENE EXPRESSION OF PKLR <130> IPA181231-US <140> PCT/US2017/028695 <141> 2017-04-20 <150> US 62/325,397 <151> 2016-04-20 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 677 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric modified Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (Wpre) <400> 1 cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60 tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120 tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180 ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240 taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300 tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360 ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420 cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480 tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540 aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600 ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660 ggccgcctcc ccgcctg 677 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 2 tttaaaagaa aaggggggat tggggggt 28 <210> 3 <211> 205 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 3 tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 60 tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 120 ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 180 gaatcctggc tgtggaaaga tacct 205 <210> 4 <211> 566 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 attatggtaa atccacttac tgtctgccct cgtagccatc gagataaacc ctaccgggta 60 ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact 120 tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg taggcgccaa 180 ccggctccgt tctttggtgg ccccttcgcg ccaccttcta ctcctcccct agtcaggaag 240 ttcccccccg ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaagt agcacgtctc 300 actagtctcg tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc 360 agcggccaat agcagctttg ctccttcgct ttctgggctc agaggctggg aaggggtggg 420 tccgggggcg ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga 480 ggcccggcat tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttctc ctcttcctca 540 tctccgggcc tttcgacctg cagccc 566 <210> 5 <211> 138 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 5 tcgacgcagg actcggcttg ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt 60 gagtacgcca aaaattttga ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt 120 cagtattaag cgggggag 138 <210> 6 <211> 236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified LTR nucleic acid sequence <400> 6 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagt 236 <210> 7 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified LTR nucleic acid sequence <400> 7 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcag 235 <210> 8 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized codon optimized human PKLR promoter sequence <400> 8 tccacggggt tggggttgcg ccttttccaa ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc 60 tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc ggcgccgacc ctgggtctcg cacattcttc 120 acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg 180 cttcctcgtc cgcccctaag tcgggaaggt tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga 240 caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg 300 gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc aatagcggct gctcagcagg ggcgcccgag 360 agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg 420 ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc 480 tccctcgttg accgaatcac cgacctctct ccccag 516 <210> 9 <211> 677 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 9 cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca 60 tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat 120 tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg 180 ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct 240 taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc 300 tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct 360 ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga 420 cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc 480 tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac 540 aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc 600 ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 660 ggccgcctcc ccgcctg 677

Claims (25)

  1. a) 프로모터 서열;
    b) 치료적 유전자 생성물을 코딩하는 서열; 및
    c) 리보핵산(RNA) 외수송 시그널
    을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)로서,
    상기 치료적 유전자 생성물이 인간 피루베이트 키나제 폴리펩티드이고,
    상기 프로모터 서열이 상기 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동적으로 연결되고,
    상기 RNA 외수송 시그널이 서열번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 돌연변이된 우드척형 간염 바이러스의 전사후 조절 요소(WPRE)인, 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 WPRE가 서열번호 1의 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터인, 발현 카세트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 키나제 폴리펩티드가 피루베이트 키나제, R 이소형(RPK) 폴리펩티드인, 발현 카세트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 키나제 폴리펩티드가 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드인, 발현 카세트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 키나제 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 코돈-최적화되어 있는, 발현 카세트.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 인핸서(enhancer) 서열을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
  8. 제1항에 있어서, 폴리퓨린 관(PPT) 또는 폴리아데닐화(polyA) 시그널 서열을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
  9. 제1항에 있어서, 하기 서열 중 하나 이상을 추가로 포함하는 발현 카세트:
    i) 팩킹(packing) 시그널 서열;
    ii) 절단된(truncated) Gag 서열;
    iii) Rev 반응성 요소(RRE);
    iv) 중앙 폴리퓨린 관(cPPT);
    v) 중앙 말단 서열(CTS); 및
    vi) 임의로, 유인원 바이러스 40로부터의 상류 서열 요소(SV40-USE)인, 상류 서열 요소(USE).
  10. 제1항에 있어서, 5' 및 3' 긴 말단 반복 서열을 추가로 포함하는, 발현 카세트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 유전자 전달 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 재조합 유전자 전달 벡터가 바이러스 또는 바이러스 벡터인, 재조합 유전자 전달 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 또는 바이러스 벡터가 렌티바이러스(LV)인, 재조합 유전자 전달 벡터.
  14. 제12항에 있어서, 피루베이트 키나제 폴리펩티드가 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드인, 재조합 유전자 전달 벡터.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는, 단리된 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포인, 단리된 세포.
  17. 제15항에 있어서, 상기 세포가 위탁된(committed) 조혈 적혈구 전구 세포인, 단리된 세포.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포 또는 위탁된 조혈 적혈구 전구 세포이고, 상기 피루베이트 키나제 폴리펩티드가 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드인, 단리된 세포.
  19. 약제학적으로 허용되는 부형제 및 제15항의 세포를 포함하는, 피루베이트 키나제 결손(PKD)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 피루베이트 키나제 결손(PKD)을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 유전자 생성물이 피루베이트 키나제, 간장 및 적혈구(PKLR) 폴리펩티드인, 약제학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 세포가 대상체에 대해 자가유래인, 약제학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 세포가 대상체에 대해 동종이계인, 약제학적 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
KR1020227030357A 2016-04-20 2017-04-20 Pklr의 유전자 발현 증강을 위한 조성물 및 방법 KR102673203B1 (ko)

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Biochemistry, April 28, 1998, 95 (9) 4864-4869
https://www.ema.europa.eu/en/documents/orphan-designation/eu/3/14/1330-public-summary-opinion-orphan-designation-lentiviral-vector-containing-human-liver-erythroid_en.pdf
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