JP7158427B2 - ヘモグロビン異常症を処置するためのグロビン遺伝子療法 - Google Patents
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Description
本願は、2014年9月4日に出願された米国仮出願第62/045,997号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
本発明は、国立心肺血液研究所からの補助金番号第HL053750号のもとの政府支援で行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
配列番号18に示されるCTCF結合部位配列を含む、インシュレーター。
(項目2)
配列番号24または配列番号25を含む、項目1に記載のインシュレーター。
(項目3)
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する、項目2に記載のインシュレーター。
(項目4)
項目1から3のいずれかに記載のインシュレーター、およびβ-グロビン遺伝子座制御領域(LCR)領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む、発現カセット。
(項目5)
前記β-グロビンLCR領域が、Dnase I高感受性部位-2(HS2)領域を含まない、項目4に記載の発現カセット。
(項目6)
前記β-グロビンLCR領域が、HS2のコア配列を含まない、項目5に記載の発現カセット。
(項目7)
HS2の前記コア配列が、配列番号20に示されるヌクレオチド配列を有する、項目6に記載の発現カセット。
(項目8)
HS2の前記コア配列が、配列番号21に示されるヌクレオチド配列を有する、項目6に記載の発現カセット。
(項目9)
前記β-グロビンLCR領域が、HS2のエンハンサー活性を維持するHS2領域を含まない、項目4に記載の発現カセット。
(項目10)
前記β-グロビンLCR領域が、Dnase I高感受性部位-1(HS1)領域、Dnase I高感受性部位-3(HS3)領域およびDnase I高感受性部位-4(HS4)領域を含む、項目4から9のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目11)
前記HS3領域が、前記HS1領域と前記HS4領域との間に置かれる、項目10に記載の発現カセット。
(項目12)
前記HS1領域が約1.1kbの長さである、項目10または11に記載の発現カセット。
(項目13)
前記HS1領域が、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する、項目12に記載の発現カセット。
(項目14)
前記HS1領域が約600bpの長さである、項目10または11に記載の発現カセット。
(項目15)
前記HS1領域が602bpの長さである、項目14に記載の発現カセット。
(項目16)
前記HS1領域が、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有する、項目15に記載の発現カセット。
(項目17)
前記HS1領域が約490bpの長さである、項目10または11に記載の発現カセット。
(項目18)
前記HS1領域が489bpの長さである、項目17に記載の発現カセット。
(項目19)
前記HS1領域が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する、項目18に記載の発現カセット。
(項目20)
前記β-グロビンLCR領域が、HS1領域を含まない、項目4または5に記載の発現カセット。
(項目21)
前記β-グロビンLCR領域が、HS1のコア配列を含まない、項目20に記載の発現カセット。
(項目22)
HS1の前記コア配列が、配列番号22に示されるヌクレオチド配列を有する、項目21に記載の発現カセット。
(項目23)
HS1の前記コア配列が、配列番号23に示されるヌクレオチド配列を有する、項目21に記載の発現カセット。
(項目24)
前記β-グロビンLCR領域が、HS1の機能を維持するHS1領域を含まない、項目20に記載の発現カセット。
(項目25)
前記β-グロビンLCR領域が、HS3領域およびHS4領域を含む、項目20から24のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目26)
前記HS3領域が、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分と前記HS4領域との間に置かれる、項目25に記載の発現カセット。
(項目27)
前記HS3領域が約1300bpの長さである、項目10から26のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目28)
前記HS3領域が1301bpの長さである、項目27に記載の発現カセット。
(項目29)
前記HS3領域が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する、項目28に記載の発現カセット。
(項目30)
前記HS4領域が約1.1kbの長さである、項目10から29のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目31)
前記HS4領域が1065bpの長さである、項目30に記載の発現カセット。
(項目32)
前記HS4領域が、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有する、項目31に記載の発現カセット。
(項目33)
前記HS4領域が、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する、項目31に記載の発現カセット。
(項目34)
前記HS4領域が約450bpの長さである、項目10から29のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目35)
前記HS4領域が446bpの長さである、項目34に記載の発現カセット。
(項目36)
前記HS4領域が、配列番号8に示されるヌクレオチド配列を有する、項目35に記載の発現カセット。
(項目37)
前記β-グロビンLCR領域が、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有するHS1領域、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含み、該β-グロビンLCR領域が、HS2領域を含まない、項目5から11のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目38)
前記β-グロビンLCR領域が、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を有するHS1領域、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号8に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含み、該β-グロビンLCR領域が、HS2領域を含まない、項目5から11のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目39)
前記β-グロビンLCR領域が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有するHS1領域、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号8に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含み、該β-グロビンLCR領域が、HS2領域を含まない、項目5から11のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目40)
前記β-グロビンLCR領域が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号6に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含み、該β-グロビンLCR領域が、HS1領域もHS2領域も含まない、項目20から25のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目41)
前記β-グロビンLCR領域が、HS2領域、HS3領域およびHS4領域を含む、項目4に記載の発現カセット。
(項目42)
前記HS2領域が860bpの長さである、項目41に記載の発現カセット。
(項目43)
前記HS2領域が、配列番号9に示されるヌクレオチド配列を有する、項目42に記載の発現カセット。
(項目44)
前記HS3領域が約1300bpの長さである、項目41から42のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目45)
前記HS3領域が1301bpの長さである、項目44に記載の発現カセット。
(項目46)
前記HS3領域が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する、項目45に記載の発現カセット。
(項目47)
前記HS4領域が約1.1kbの長さである、項目41から46のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目48)
前記HS4領域が1065bpの長さである、項目47に記載の発現カセット。
(項目49)
前記HS4領域が、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する、項目49に記載の発現カセット。
(項目50)
前記β-グロビンLCR領域が、配列番号9に示されるヌクレオチド配列を有するHS2領域、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含む、項目41に記載の発現カセット。
(項目51)
前記β-グロビンLCR領域が、HS1領域をさらに含む、項目41から50のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目52)
前記グロビン遺伝子が、β-グロビン遺伝子、γ-グロビン遺伝子およびδ-グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目4から51のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目53)
前記グロビン遺伝子が、ヒトβ-グロビン遺伝子である、項目52に記載の発現カセット。
(項目54)
前記ヒトβ-グロビン遺伝子が、野生型ヒトβ-グロビン遺伝子、イントロン配列の1つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ-グロビン遺伝子、および少なくとも1つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ-グロビン遺伝子からなる群から選択される、項目53に記載の発現カセット。
(項目55)
前記ヒトβ-グロビン遺伝子が、コドン87におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβA-グロビン遺伝子(βA-T87Q)である、項目54に記載の発現カセット。
(項目56)
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを1つ含む、項目4から55のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目57)
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを2つ含む、項目4から55のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目58)
β-グロビンプロモーターをさらに含む、項目4から57のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目59)
前記β-グロビンプロモーターが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分と前記β-グロビンLCR領域との間に置かれる、項目58に記載の発現カセット。
(項目60)
前記β-グロビンプロモーターが、約613bpの長さであるヒトβ-グロビンプロモーターである、項目58または59に記載の発現カセット。
(項目61)
前記ヒトβ-グロビンプロモーターが、配列番号10に示されるヌクレオチド配列を有する、項目60に記載の発現カセット。
(項目62)
前記β-グロビンプロモーターが、約265bpの長さであるヒトβ-グロビンプロモーターである、項目58または59に記載の発現カセット。
(項目63)
前記ヒトβ-グロビンプロモーターが、配列番号11に示されるヌクレオチド配列を有する、項目62に記載の発現カセット。
(項目64)
ヒトβ-グロビン3’エンハンサーをさらに含む、項目4から63のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目65)
前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の上流に置かれる、項目64に記載の発現カセット。
(項目66)
前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが約879bpの長さである、項目64または65に記載の発現カセット。
(項目67)
前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが、配列番号12に示されるヌクレオチド配列を有する、項目66に記載の発現カセット。
(項目68)
少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーをさらに含む、項目5から67のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目69)
前記少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーが、前記グロビン遺伝子またはその機能的部分とβ-グロビンLCR領域との間に置かれる、項目68に記載の発現カセット。
(項目70)
前記少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーが、配列番号13、14、15、16および17からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、項目68または69に記載の発現カセット。
(項目71)
1、2または3つの赤血球系特異的エンハンサーを含む、項目68から70のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目72)
哺乳動物における前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の発現を可能にする、項目4から71のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目73)
ヒトβ-グロビン遺伝子の発現を可能にする、項目72に記載の発現カセット。
(項目74)
前記グロビン遺伝子またはその機能的部分の発現が、赤血球系組織に限定される、項目71または72に記載の発現カセット。
(項目75)
項目4から74のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、組換えベクター。
(項目76)
レトロウイルスベクターである、項目75に記載の組換えベクター。
(項目77)
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目76に記載の組換えベクター。
(項目78)
前記発現カセットが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを1つ含む、項目75から77のいずれか一項に記載の組換えベクター。
(項目79)
前記ベクターの3’長末端反復(LTR)中にウッドチャック肝炎ポスト調節エレメント(WPRE)をさらに含む、項目75から77のいずれか一項に記載の組換えベクター。
(項目80)
前記ベクターの3’長末端反復(LTR)中にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目79に記載の組換えベクター。
(項目81)
項目4から74のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼ。
(項目82)
天然に存在しないまたは操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、天然に存在しないまたは操作されたメガヌクレアーゼ、および天然に存在しないまたは操作された転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される、項目81に記載のヌクレアーゼ。
(項目83)
DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含む、項目81または82に記載のヌクレアーゼ。
(項目84)
ゲノムセーフハーバー部位に結合する、項目81から83のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
(項目85)
前記ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断(DSB)を引き起こす、項目84に記載のヌクレアーゼ。
(項目86)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である、項目84または85に記載のヌクレアーゼ。
(項目87)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、第1染色体上に位置する、項目84から86のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
(項目88)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、以下の5つの判定基準:(1)任意の遺伝子の5’末端から(例えば、該遺伝子の5’末端から)少なくとも50kbの距離、(ii)任意のがん関連遺伝子から少なくとも300kbの距離、(iii)開いた/アクセス可能なクロマチン構造内(天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるDNA切断によって測定される)、(iv)遺伝子転写単位の外側の位置、および(v)ヒトゲノムの超保存領域(UCR)、microRNAまたは長い非コードRNAの外側の位置のうち全てを満たす、項目84から86のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
(項目89)
前記発現カセットが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを2つ含む、項目81から88のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
(項目90)
前記発現カセットの標的化された送達を可能にする、項目81から89のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ。
(項目91)
項目81から90のいずれか一項に記載のヌクレアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。
(項目92)
項目91に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目93)
レンチウイルスベクターである、項目92に記載のベクター。
(項目94)
項目4から74のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、天然に存在しないまたは操作されたCRISPR-Cas系。
(項目95)
前記CRISPR-Cas系が、CRISPR-CasヌクレアーゼおよびシングルガイドRNAを含む、項目94に記載の系。
(項目96)
前記CRISPR-Cas系が、ゲノムセーフハーバー部位に結合する、項目94または95に記載の系。
(項目97)
前記CRISPR-Cas系が、前記ゲノムセーフハーバー部位において二本鎖切断(DSB)を引き起こす、項目96に記載の系。
(項目98)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、遺伝子外のゲノムセーフハーバー部位である、項目96または97に記載の系。
(項目99)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、第1染色体上に位置する、項目96から98のいずれか一項に記載の系。
(項目100)
前記ゲノムセーフハーバー部位が、以下の5つの判定基準:(1)任意の遺伝子の5’末端から(例えば、該遺伝子の5’末端から)少なくとも50kbの距離、(ii)任意のがん関連遺伝子から少なくとも300kbの距離、(iii)開いた/アクセス可能なクロマチン構造内(天然のまたは操作されたヌクレアーゼによるDNA切断によって測定される)、(iv)遺伝子転写単位の外側の位置、および(v)ヒトゲノムの超保存領域(UCR)、microRNAまたは長い非コードRNAの外側の位置のうち全てを満たす、項目96から99のいずれか一項に記載の系。
(項目101)
前記発現カセットが、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する前記インシュレーターを2つ含む、項目94から100のいずれか一項に記載の系。
(項目102)
前記発現カセットの標的化された送達を可能にする、項目94から101のいずれか一項に記載の系。
(項目103)
項目94から102のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系をコードする、ポリヌクレオチド。
(項目104)
項目103に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
(項目105)
レンチウイルスベクターである、項目104に記載のベクター。
(項目106)
項目4から74のいずれか一項に記載の発現カセットで形質導入された、細胞。
(項目107)
項目75から80のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質導入された、細胞。
(項目108)
項目81から90のいずれか一項に記載のヌクレアーゼで形質導入された、細胞。
(項目109)
項目94から102のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系で形質導入された、細胞。
(項目110)
項目92、93、104および105のいずれか一項に記載のベクターで形質導入された、細胞。
(項目111)
造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される、項目106から110のいずれか一項に記載の細胞。
(項目112)
前記造血幹細胞がCD34+造血幹細胞である、項目111に記載の細胞。
(項目113)
ex vivoで形質導入される、項目106から112のいずれか一項に記載の細胞。
(項目114)
項目106から113のいずれか一項に記載の細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
(項目115)
項目106から113のいずれか一項に記載の細胞の有効量、および薬学的に許容されるキャリアを含む、ヘモグロビン異常症を処置するための医薬組成物。
(項目116)
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンC病、ヘモグロビン鎌状赤血球症(SCD)、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α-サラセミアおよびヘモグロビンH病からなる群から選択される、項目115に記載の医薬組成物。
(項目117)
前記ヘモグロビン異常症がβ-サラセミアである、項目116に記載の医薬組成物。
(項目118)
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目116に記載の医薬組成物。
(項目119)
項目106から113のいずれか一項に記載の細胞を含む、ヘモグロビン異常症を処置するためのキット。
(項目120)
ヘモグロビン異常症を有する被験体を処置するために前記細胞を使用するための書面の指示をさらに含む、項目119に記載のキット。
(項目121)
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンC病、ヘモグロビン鎌状赤血球症(SCD)、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α-サラセミアおよびヘモグロビンH病からなる群から選択される、項目119または120に記載のキット。
(項目122)
前記ヘモグロビン異常症がβ-サラセミアである、項目121に記載のキット。
(項目123)
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目121に記載のキット。
(項目124)
被験体においてヘモグロビン異常症を処置する方法であって、項目106から113のいずれか一項に記載の細胞の有効量を該被験体に投与するステップ、それによって、正常ヘモグロビンを含む赤血球を生成する該被験体の能力を回復させるステップを含む、方法。
(項目125)
前記細胞を前記被験体に投与するステップの後に、治療的に適切なレベルのヘモグロビンが該被験体において産生される、項目124に記載の方法。
(項目126)
項目75から80のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質導入された細胞の有効量を投与するステップを含む、方法。
(項目127)
前記被験体において治療的に適切なレベルのヘモグロビンを提供する、前記細胞中の前記組換えベクターのベクターコピー数が、細胞1個当たり約0.5~2ベクターコピー数である、項目126に記載の方法。
(項目128)
前記被験体において効果のない赤血球生成を修正する、項目124から127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記被験体に対する移植片対宿主病のリスクをきたさない、項目124から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
免疫抑制剤を投与するステップを含まない、項目124から129のいずれか一項に記載の方法。
(項目131)
前記ヘモグロビン異常症が、ヘモグロビンC病、ヘモグロビン鎌状赤血球症(SCD)、鎌状赤血球貧血、遺伝性貧血、サラセミア、β-サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α-サラセミアおよびヘモグロビンH病からなる群から選択される、項目124から130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記ヘモグロビン異常症がβ-サラセミアである、項目131に記載の方法。
(項目133)
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球貧血である、項目131に記載の方法。
(項目134)
前記細胞が、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞からなる群から選択される、項目124から133のいずれか一項に記載の方法。
(項目135)
前記被験体がヒトである、項目124から134のいずれか一項に記載の方法。
(項目136)
前記細胞が前記被験体由来である、項目124から135のいずれか一項に記載の方法。
(項目137)
前記細胞が、前記被験体の骨髄由来である、項目136に記載の方法。
別段定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する:Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版、1994年);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編、1988年);The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら(編)、Springer Verlag(1991年);ならびにHaleおよびMarham、The Harper Collins Dictionary of Biology(1991年)。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段特記しない限り、以下のそれらに帰せられる意味を有する。
ベクター関連悪性形質転換のいくつかの例が、ベクターにコードされたエンハンサーによる細胞癌遺伝子の活性化と関連して、臨床状況において報告されており(Baumら(2006年)、Nienhuisら(2006年)、Ramezaniら(2006年))、種々のベクター改変が、ベクター遺伝子毒性を低減させるために実施または提唱されてきた(Baumら(2006年)、Nienhuisら(2006年)、Ramezaniら(2006年))。クロマチンインシュレーターとして公知のDNAエレメントのクラスは、ベクターの安全性および性能を改善するための1つのアプローチとして認識されている(Emery(2011年))。
本明細書で開示される主題は、1つまたは複数の上に開示したインシュレーター(例えば、インシュレーターA1)を含む発現カセットを提供する。ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを少なくとも1つ、およびβ-グロビンLCR領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。
ヒトβ-グロビン遺伝子クラスターは、多くの嗅覚受容体遺伝子アレイのうち1つの内に埋め込まれた5つの遺伝子からなる(Bulgerら、PNAS(1999年);96巻:5129~5134頁)。このクラスターは、染色体11p15.4上の80kbに及び、5つの発現されるβ様遺伝子、および個体発生の間のそれらの段階特異的発現を指示するシス作用性調節エレメントを含む(Forget(2001年)、Molecular Mechanism of Beta Thalassemia. Steinberg MHら編、Disorders of Hemoglobin. Genetics、Pathophysiology and Clinical Management、Cambridge University Press、Cambridge)。これらの遺伝子は、それらの発生上の発現の順序、5’-ε-Gγ-Aγ-ψη-δ-β-3’で配置されている(Stamatoyannopoulosら(2001年)Hemoglobin Switching.、Stamatoyannopoulos Gら編、Molecular Basis of Blood Disorders、W.B. Saunders、Philadelphia、PA)。α様グロビン遺伝子クラスター(5’-ξ2-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-3’)は、第16染色体の短腕のテロメアに非常に近い位置にあり、約40kbに及ぶ。これら2つの独立したクラスター内にコードされる遺伝子の発現は、赤血球系細胞に限定され、β-グロビン様鎖のアウトプットがα鎖のものと一致するように、バランスがとられる。この微調整されたバランスは、転写レベル、転写後レベルおよび翻訳後レベルで調節される。
本明細書で開示される主題によれば、発現カセットは、グロビン遺伝子またはその機能的部分を含む。このグロビン遺伝子は、β-グロビン遺伝子、γ-グロビン遺伝子またはδ-グロビン遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、この発現カセットは、ヒトβ-グロビン遺伝子を含む。本明細書で開示される主題によれば、このヒトβ-グロビン遺伝子は、野生型ヒトβ-グロビン遺伝子、イントロン配列の1つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ-グロビン遺伝子、または少なくとも1つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ-グロビン遺伝子であり得る。非限定的な一実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、野生型ヒトβ-グロビン遺伝子を含む。別の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、コドン87におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβA-グロビン遺伝子(βA-T87Q)を含む。ガンマ-グロビン鎖中の87位のグルタミン残基は、成人のベータ鎖の酸素結合特徴を保ちつつ、ベータ鎖と比較してガンマ鎖の抗鎌状化活性を増進する(Nagelら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1979年);76巻:670~672頁)。ある特定の実施形態では、グロビン遺伝子の機能的部分は、対応する野生型参照ポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%の同一性を有する。
本明細書で開示される主題によれば、この発現カセットは、β-グロビンプロモーターをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、このβ-グロビンプロモーターは、グロビン遺伝子またはその機能的部分とβ-グロビンLCR領域との間に置かれるる。このβ-グロビンプロモーターの長さおよび配列は、変動し得る。ある特定の実施形態では、このβ-グロビンプロモーターは、約100bp~約1600bpの長さ、例えば、約200bp~約700bp、約100bp~約200bp、約200bp~約300bp、約300bp~約400bp、約400bp~約500bp、約500bp~約600bp、約600bp~約700bp、約700bp~約800bp、約800bp~約900bp、約900bp~約1000bp、約1000bp~約1100bp、約1100bp~約1200bp、約1200bp~約1300bp、約1300bp~約1400bp、約1400bp~約1500bp、または約1500bp~約1600bpの長さである。ある特定の実施形態では、このβ-グロビンプロモーターは、約130bp、約613bp、約265bpまたは約1555bpの長さであるヒトβ-グロビンプロモーターである。一実施形態では、このβ-グロビンプロモーターは、約613bpの長さであるヒトβ-グロビンプロモーターである。非限定的な一例では、このヒトβ-グロビンプロモーターは、以下に提供される配列番号10に示されるヌクレオチド配列を有する:
本明細書で開示される主題によれば、上記発現カセットは、上記インシュレーターのうち少なくとも1つを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される発現カセットは、配列番号18に示されるCTCF結合部位配列を含むインシュレーター、例えば、それらに限定されないが、配列番号24または配列番号25を含むインシュレーター、例えば、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーター(即ち、インシュレーターA1)を少なくとも1つ含む。種々の非限定的な実施形態では、このインシュレーターは、一方もしくは両方のLTR中に、または細胞ゲノム中に組み込まれる本明細書で開示される発現カセットの領域中の他の場所に、取り込まれ得るまたは挿入され得る。一実施形態では、このインシュレーターは、発現カセットの3’末端に置かれる。一実施形態では、このインシュレーターは、発現カセットの5’末端に置かれる。一実施形態では、この発現カセットは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有するインシュレーターを2つ含み、一方のインシュレーターは、発現カセットの3’末端に置かれ、他方のインシュレーターは、発現カセットの5’末端に置かれる。
本明細書で開示される主題は、上記発現カセットを含むベクターおよび送達系(例えば、天然に存在しないまたは操作されたヌクレアーゼまたはCRISPR-Cas系)を提供する。これらのベクターおよび送達系は、細胞においてグロビンタンパク質(ヒトβ-グロビンタンパク質)の発現を増加させるための、広範囲の標的細胞のゲノム中へのグロビン遺伝子(例えば、ヒトβ-グロビン)の安定な導入に適切な送達ビヒクルである。
細胞(例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞および造血内皮細胞)の遺伝子改変は、実質的に均質な細胞組成物を、組換えDNAまたはRNA構築物(例えば、上記発現カセットを含むベクターまたは送達系)で形質導入することによって、達成され得る。本明細書で開示される主題は、「形質導入された細胞」と総称される、上記発現カセットで形質導入された細胞、上記ベクターで形質導入された細胞、および上記ヌクレアーゼで、またはこれらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質導入された細胞、および上記CARISPR-Cas系で、またはこのCARISPR-Cas系をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質導入された細胞、を提供する。上記のように、ベクター、ヌクレアーゼおよびCRISPR-Cas系は、グロビン遺伝子(例えば、ヒトβ-グロビン遺伝子)を発現させるための、細胞への発現カセットの形質導入のために使用される。ある特定の実施形態では、これらの形質導入された細胞は、造血の疾患、障害または状態を処置および/または予防するために、被験体に投与される。本明細書で開示されるインシュレーターは、細胞への発現カセットの形質導入の効率を増強し得る。
本明細書で開示される主題は、上述された本明細書で開示される形質導入された細胞および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」には、薬学的に許容される細胞培養培地を含む、生理学的に適合性である、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容されるキャリアは、非経口(例えば、静脈内、筋内、皮下または腹腔内)、脊髄または表皮投与(例えば、注射、注入またはインプランテーションによる)に適切であり得る。投与の経路に依存して、活性化合物、例えば形質導入された細胞は、その化合物を不活性化し得る酸および他の天然の条件の作用からその化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
本明細書で開示される発現カセットを含むベクターおよび他の送達系(ヌクレアーゼおよびCRISPR-Cas系)は、遺伝子治療の改善された方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子治療」とは、遺伝子および/または遺伝子の発現を回復、修正または改変する、細胞のゲノム中へのポリヌクレオチドの導入を指す。種々の非限定的な実施形態では、本明細書で開示されるベクターまたは他の送達系(例えば、ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cas系)は、造血系の疾患、障害もしくは状態を有すると診断された被験体またはそれを有する疑いがある被験体に、治癒的、予防的または軽減的利益を提供する、グロビンタンパク質(例えば、ヒトβグロビンタンパク質)をコードするグロビン遺伝子またはその機能的部分を含む発現カセットを含む。このベクターまたは他の送達系(例えば、ヌクレアーゼおよびCRISPR-Cas系)は、細胞を、in vivo、ex vivoまたはin vitroで感染および形質導入することができる。ex vivoおよびin vitroの実施形態では、形質導入された細胞は、次いで、治療を必要とする被験体に投与され得る。本明細書で開示される主題は、本明細書で開示される主題のベクターおよび他の送達系(例えば、ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cas系)、ウイルス粒子、ならびに形質導入された細胞が、被験体における造血系の疾患、障害または状態、例えばヘモグロビン異常症を処置、予防および/または軽減させるために使用されることを企図する。
本明細書で開示される主題は、ヘモグロビン異常症の処置または予防のためのキットを提供する。一実施形態では、このキットは、単位剤形中に、本明細書で開示される発現カセットで形質導入された細胞の有効量を含む、治療的または予防的組成物を含む。非限定的な一実施形態では、このキットは、本明細書に開示される1つまたは複数の発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、このキットは、本明細書に開示される発現カセットを含む1種または複数種のベクターを含む。一部の実施形態では、このキットは、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の適切な容器形態であり得る、無菌容器を含む。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬を保持するのに適切な他の材料で作製され得る。
新規インシュレーターの発見
遺伝子毒性のリスクが、クロマチンインシュレーターの使用によって低減され得ることから明らかなように(Arumugamら(2007年)、Emery(2011年)、Evans-Galeaら(2007年)、Rivellaら(2000年)、Emeryら(2000年)、Emeryら(2002年)、Yannakiら(2002年)、Hinoら(2004年)、Ramezaniら(2003年)、Ramezaniら(2008年))、ウイルスベクターの挿入性変異誘発によって生じる問題は、広く知られている(Nienhuis(2013年)、Baumら(2006年)、Nienhuisら(2006年))。ヒトゲノムにおけるエンハンサー遮断性インシュレーターの効率的同定を可能にするアプローチが開発されている。これらの新たなインシュレーターは、平均150bpで短く、ウイルスベクターの力価に悪影響を与えず、インシュレーターcHS4よりも数倍強力である。ゲノムアプローチを使用して、ヒトゲノムの最も強力なエンハンサー遮断因子およびバリアインシュレーターを発見した。ヘモグロビン異常症の遺伝子治療のために、強力なエンハンサーが、治療レベルのグロビン遺伝子発現を達成するために必要である。したがって、強力なインシュレーターは、組込みベクターの強力なエンハンサーからゲノム環境を保護するための1つの手段を提供し得る。
少なくとも1つのインシュレーターを含むグロビンベクターの特徴付け。
インシュレーターA1、ならびに配列番号9に示されるヌクレオチド配列を有するHS2領域、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有するHS3領域および配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有するHS4領域を含むβ-グロビンLCR領域に作動可能に連結したコドン87におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβA-グロビン遺伝子(βA-T87Q)を含む、本明細書で開示される発現カセット(「発現カセット1」と称される;図1に示される)を、生成した。バリアントβ鎖(βA)を使用するための理論的根拠は、ベクターにコードされるβ-グロビン遺伝子の検出を促進して、内因性のまたは注入されたベータ鎖からそれを識別することである。γ-グロビン鎖中の87位のグルタミン(GLN)残基は、成人のβ鎖の酸素結合特徴を保ちつつ、β鎖と比較してガンマ鎖の抗鎌状化活性を増進する(Nagelら(1979年))。ベクター1では、コドン87を変更する点変異(βA-T87Q即ちβ87)は、正常スレオニンをグルタミンで置き換え、ベクターがコードするβ鎖の抗鎌状化活性を増進する。このβ87鎖は、HbE-サラセミアを有する患者において安全に使用されてきた(Cavazzana-Calvoら(2010年))。
非赤血球系K562細胞におけるエンハンサー活性の評価
HS2のエンハンサー活性を、非赤血球系K562細胞において評価した。図7に示すように、エンハンサーなし(「空」)、HS2、HS3-4、HS2-3-4または陽性対照として使用したrunx1エンハンサー(「RUNX1」)と連結したミニマルプロモーターによって駆動されるベクターで形質導入されたK562細胞におけるGFP発現。バックグラウンドの発現は、およそ(on the order or)0.01%(「空」)であったが、HS2-3-4では10倍超増加した(「Lcr9」、0.17%)。この増強は、大部分はHS2に起因し(0.15%)、HS3-4には起因しなかった(0.05%)。全ての細胞株を、同等に形質導入した(平均ベクターコピー数2.5)。これらの結果は、HS3-HS4ではなくHS2が、非赤血球系造血幹細胞および前駆体細胞において発癌のリスクを有し得ることを支持している。
新規赤血球系特異的エンハンサー
図8および9に示すように、5つの赤血球系特異的エンハンサーがHS2を置換した:ALASイントロン1、ALASイントロン8、BLVRB、PPOXおよびスペクトリン-アルファ。本発明者らは、これら5つ全てのエンハンサーが、強力なエンハンサーであり、非赤血球系組織においてエンハンサー活性を欠き、ベクター力価を低減させないことを示した。
3’LTR改変を介してグロビンレンチウイルスベクター産生を増加させる
治療的グロビンベクターの本質的な特性は、患者細胞の有効な形質導入に十分な高い力価を達成することである。遺伝子、プロモーター、エンハンサーおよび/またはLCRエレメントを含むそれらの大きいカーゴのおかげで、グロビンレンチウイルスベクターは、それらの製造を困難にし、それらの臨床的使用を制限する、低い力価を固有に有する。この問題は、ベクターのサイズをさらに増加させるインシュレーターなどのさらなるゲノムエレメントの組み入れによって、さらに複雑にする。
Claims (43)
- 配列番号1または配列番号25に示されるヌクレオチド配列を含むインシュレーターと、β-グロビン遺伝子座制御領域(LCR)領域に作動可能に連結したグロビン遺伝子とを含む発現カセット、および、リポソームを含む、脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記送達系がカチオン性脂質媒介性非ウイルス送達系である、請求項1に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、Dnase I高感受性部位-2(HS2)領域を含まない、請求項1または2に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS2のコア配列を含まない、請求項1または2に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- HS2の前記コア配列が、配列番号20または配列番号21に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項4に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS2のエンハンサー活性を維持するHS2領域を含まない、請求項1または2に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、Dnase I高感受性部位-1(HS1)領域、Dnase I高感受性部位-3(HS3)領域およびDnase I高感受性部位-4(HS4)領域を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS3領域が、前記HS1領域と前記HS4領域との間に置かれる、請求項7に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS1領域が1.1kbの長さ、600bpの長さまたは490bpの長さである、請求項7または8に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS1領域が、配列番号2、配列番号3または配列番号4に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項9に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS1領域を含まない、請求項1~10のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS1のコア配列を含まない、請求項1~10のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- HS1の前記コア配列が、配列番号22または配列番号23に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項12に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS1の機能を維持するHS1領域を含まない、請求項11に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS3領域およびHS4領域を含む、請求項11~14のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS3領域が、前記グロビン遺伝子と前記HS4領域との間に置かれる、請求項15に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS3領域が1300bpの長さである、請求項7~16のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS3領域が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項17に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS4領域が1.1kbの長さまたは450bpの長さである、請求項7~16のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS4領域が、配列番号6、配列番号7または配列番号8に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項19に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- a.前記β-グロビンLCR領域が、HS1領域、HS3領域およびHS4領域を含み、HS2領域を含まず、ここで、
i.前記HS1領域が配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含み、前記HS3領域が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ前記HS4領域が配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含むか、
ii.前記HS1領域が配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含み、前記HS3領域が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ前記HS4領域が配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含むか、または
iii.前記HS1領域が配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含み、前記HS3領域が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ前記HS4領域が配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは
b.前記β-グロビンLCR領域が、HS3領域およびHS4領域を含み、HS1領域もHS2領域も含まず、ここで、前記HS3領域が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ、前記HS4領域が配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含む、
請求項3~20のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。 - 前記β-グロビンLCR領域が、HS2領域、HS3領域およびHS4領域を含む、請求項1または2に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS2領域が860bpの長さであり、および/または、前記HS3領域が1300bpの長さであり、および/または、前記HS4領域が1.1kbの長さである、請求項22に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記HS2領域が配列番号9に示されるヌクレオチド配列を含み、および/または、前記HS3領域が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、および/または、前記HS4領域が配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項22または23に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンLCR領域が、HS1領域をさらに含む、請求項22~24のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記グロビン遺伝子が、β-グロビン遺伝子、γ-グロビン遺伝子およびδ-グロビン遺伝子からなる群から選択される、請求項1~25のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記グロビン遺伝子が、ヒトβ-グロビン遺伝子である、請求項26に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビン遺伝子が、野生型ヒトβ-グロビン遺伝子、イントロン配列の1つまたは複数の欠失を含む、欠失したヒトβ-グロビン遺伝子、および少なくとも1つの抗鎌状化アミノ酸残基をコードする、変異したヒトβ-グロビン遺伝子からなる群から選択される、請求項27に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビン遺伝子が、コドン87におけるスレオニンからグルタミンへの変異をコードするヒトβA-グロビン遺伝子(βA-T87Q)である、請求項27または28に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 1つの前記インシュレーター、または2つの前記インシュレーターを含む、請求項1~29のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- β-グロビンプロモーターをさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンプロモーターが、前記グロビン遺伝子と前記β-グロビンLCR領域との間に置かれる、請求項31に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記β-グロビンプロモーターが、610bpまたは265bpの長さのヒトβ-グロビンプロモーターである、請求項31または32に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビンプロモーターが、配列番号10または配列番号11に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項33に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- ヒトβ-グロビン3’エンハンサーをさらに含む、請求項1~34のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが、前記グロビン遺伝子の上流に置かれる、請求項35に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが880bpの長さである、請求項35または36に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記ヒトβ-グロビン3’エンハンサーが、配列番号12に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項37に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーをさらに含む、請求項1~38のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーが、前記グロビン遺伝子とβ-グロビンLCR領域との間に置かれる、請求項39に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記少なくとも1つの赤血球系特異的エンハンサーが、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16または配列番号17に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項39または40に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記発現カセットが、哺乳動物における前記グロビン遺伝子の発現を可能にする、請求項1~41のいずれか一項に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
- 前記発現が、赤血球系組織に限定される、請求項42に記載の脂質媒介性非ウイルス送達系。
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