KR20170044752A - 헤모글로빈병증 치료용 글로빈 유전자 치료법 - Google Patents

헤모글로빈병증 치료용 글로빈 유전자 치료법 Download PDF

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Abstract

본 개시된 보호대상은 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 발현을 가능하게 하는 발현 카세트, 이를 포함하는 벡터, 및 이러한 발현 카세트 및 벡터로 형질도입된 세포를 제공한다. 본 개시된 보호대상은 이러한 형질도입된 세포를 대상체에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 헤모글로빈병증을 치료하는 방법도 제공한다.

Description

헤모글로빈병증 치료용 글로빈 유전자 치료법{GLOBIN GENE THERAPY FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHIES}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2014년 9월 4일자로 출원되고 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 가출원 제62/045,997호에 대한 우선권을 주장한다.
교부금 정보
본 발명은 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소로부터 교부금 번호 HL053750 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
서론
본 개시된 보호대상은 글로빈 단백질, 예컨대 인간 β-글로빈 단백질을 발현하는 발현 카세트 및 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시된 보호대상은 추가로 복수의 Dnase I 과민감성 부위를 포함하는 β-글로빈 좌위(locus) 조절 영역(locus control region, LCR)과 작동가능하게 연결된 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 본 개시된 보호대상의 발현 카세트는 인핸서(enhancer) 구성요소의 효과에 대응하는 하나 이상의 인슐레이터(insulator)를 포함한다. 본 명세서에 개시된 인슐레이터는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터의 역가(titer)에 실질적으로 부정적인 영향을 미치지 않는다. 상기 발현 카세트 및 벡터는 헤모글로빈병증(hemoglobinopathy), 예컨대 β-지중해빈혈(thalassemia) 및 겸상 세포 빈혈의 치료용으로 사용될 수 있다.
β-지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈은 결함이 있는 헤모글로빈의 β 쇄의 생성에 의해 유발되는 중증 선천성 빈혈이다. β-지중해빈혈에서, β 쇄의 결손은 세포내 침전을 과량의 α-글로빈 쇄의 침전을 유도하여, 비효과적인 적혈구생성 및 용혈성 빈혈을 유발한다(Weatherall and Clegg (1981), Stamatoyannopoulos et al., (1994), Weatherall (2001), Steinberg (2001)). 동형접합체 또는 복잡한 이형접합체에서 발견되는 가장 심각한 형태에 있어서, 빈혈은 어떠한 치료도 없으면 일생의 첫 번째 해 이내에 치명적이다(Cooley and Lee (1925)). 빈혈을 보정하고, 비효과적인 적혈구생성을 저해하며, 위장의 철 흡수를 억제하기 위하여 일생동안 수혈 치료법이 필요하다(Weatherall and Clegg (1981), Stamatoyannopoulos et al. (1994), Weatherall (2001), Steinberg (2001)). 그러나, 수혈 치료법 자체는 철 과부하를 유도하는데, 이는 치료되지 않으면 치명적이다. 철 과부하의 방지 및 치료는 현재 환자 관리의 주요 목표이다(Giardina (2001)). β-지중해빈혈을 치유하기 위한 현재의 유일한 치유적 치료는 동종이계 골수 이식(bone marrow transplantation, BMT)을 통해 정상 글로빈 유전자를 갖고 있는 적혈구 전구체를 제공하는 것이다(Giardini and Lucarelli (1994), Boulad et al. (1998), Lucarelli et al. (1999), Tisdale and Sadelain (2001)).
겸상 세포 빈혈에서, 헤모글로빈 β 쇄는 아미노산 위치 6에서 돌연변이(Glu → Val)되어, 정상적인 βA 쇄 대신에 βS의 합성을 유도한다(Steinberg (2001), Pauling et al. (1949)). 결과물인 헤모글로빈 HbS는 가속화된 적혈구 파괴, 적혈구 과다형성 및 고통적인 혈관-막힘 '위기'를 초래한다(Steinberg (2001)). 혈관-막힘은 기관에 손상을 주고, 결국 장기간의 장애(예컨대, 후속 뇌졸중 또는 뼈 괴사)와 때때로 돌연사를 초래한다. 매우 심각한 장애이지만, 겸상 세포 질환의 과정은 전형적으로 예측불가하다(Steinberg (2001)). 태아 헤모글로빈의 생산을 증가시키고(Swank and Stamatoyannopoulos (1998)) 조혈작용을 저해함으로써, 수산화요소는 측정가능한 임상적 이점을 생성할 수 있다(Platt et al. (1984)), Charache et al. (1992), Atweh and Loukopoulos (2001)). 수산화요소는 세포독성제이므로, γ-글로빈 유전자 발현을 유도하기 위하여 대체적인 독성이 덜한 약물에 대한 강한 필요성이 있다(Perrine et al. (2005), Stamatoyannopoulos (2005)). β-지중해빈혈에 대하여, 동종이계 골수 이식(BMT)은 현재 겸상 세포 질환에 대한 유일한 치유적 치료법이다(Tisdale and Sadelain (2001), Vermylen et al. (1998), Luzzatto and Goodfellow (1989)).
그러나, BMT는 대부분의 개체에 대해 HLA-일치된 골수 공여자의 부재로 인해 β-지중해빈혈 또는 겸상 세포 질환을 앓고 있는 대부분의 환자에게 치료적 옵션으로 이용불가이다. 또한, 잠재적으로 치유적이기는 하지만, 동종이계 BMT는 합병증이 없지 않다. 안전한 이식은 이식 거부 및 이식편-대-숙주 질환의 위험을 최소화하기 위하여 조직-적합성 공여자의 확인을 필요로 한다(Tisdale and Sadelain (2001), Vermylen et al. (1998), Luzzatto and Goodfellow (1989)). 일치된-비연관성 또는 불일치된 이식과 연관된 위험성이 더 커지기 때문에, 대부분의 환자는 평생 수혈 치료법에 적응해야 하는데, 이것은 비효과적인 적혈구생성을 보정하지 않고 전신성 철 축적을 악화시킨다. 또한, 지난 수십년 내에 기대 수명이 상당히 개선되었지만(Borgna-Pignatti et al. (2004), Telfer et al. (2009), Ladis et al. (2011)), 바이러스 감염, 철 독성 및 간 경화로부터 유래되는 장기간에 걸쳐 일어나는 일부 심각한 합병증의 위험성이 남아 있다(Mancuso et al. (2006)). 상기 의학적 위험성은 만성 β-지중해빈혈의 사회경제학적 비용과 함께 안전하교 효과적이며 치유적인 치료법에 대한 필요성을 강조한다.
중증 β-지중해빈혈을 치료보다는 치유하기 위한 유일한 방법은 환자에게 건강한 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)를 제공하는 것이다. HSC는 보통 성인에서 하루에 200억 RBC를 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 발생시킨다. HSC는 야생형 β-글로빈 유전자를 갖는 공여자로부터 수확하여 헤모글로빈 함량이 정상인 오래 생존하는 적혈구 세포(RBC)를 생성할 수 있다. 다른 한편으로, 환자 자신의 HSC를 유전적으로 보정할 수 있으며, 이것은 공여자에 대한 검색을 즉시 해결하고 동종이계 BMT와 연관된 이식편-대-숙주 질환 및 이식 거부의 위험성을 제거한다(Sadelain (1997), Sadelain et al. (2007)). 글로빈 유전자 전달은 β-지중해빈혈 개체 자신의 혈액-형성 줄기 세포의 능력을 회복하여 충분한 헤모글로빈 함량을 갖는 RBC를 생성하는 것을 목표로 한다(Sadelain et al. (2007), Persons and Tisdale (2004), Sadelain (2006)). 겸상 세포 빈혈을 갖는 환자에서의 목표는 겸상화를 방지하는 것이며, 이것은 벡터-암호화된 글로빈 쇄를 포함하는 비-겸상화 Hb로 내인성 HbS를 희석함으로써 달성될 수 있다. 환자 자신의 HSC는 오래 지속하는 치료적 이점을 보장하고 치유적 줄기 세포-기반의 치료법을 달성하도록 유전적으로 변형되어야 하는 세포이다.
중증 β-지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈의 치료를 위한 글로빈 유전자 전달의 실행은 HSC에서 조절된 인간 β- 또는 β-유사 글로빈 유전자의 효과적인 도입을 필요로 한다. β-글로빈 유전자(또는 β-유사 변이체)는 특히 수혈-의존적 베타-제로 지중해빈혈의 치료를 위해서는 적혈구-특이적인 방식으로 높은 레벨로 발현되어야 한다.
지금까지 개발된 글로빈 벡터는 지중해빈혈 및 겸상 세포 환자에서의 안전한 사용을 제한하거나 심지어 배제할 수 있는 결점을 갖고 있다. 상기 벡터들 내에 함유되는 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR) 구성성분의 일부, 특히 Dnase I 과민감성 부위-2(HS2)는 비-적혈구 활성을 가질 수 있고, 환자를 비-특이적 발현 벡터에서 보여지는 것과 같은 삽입적 종양형성의 위험성에 노출시킨다. 또한, 큰 LCR 분절(segment)의 사용은 높은 역가의 벡터의 생산 및 환자 HSC의 효과적인 형질도입에 해로울 수 있다. 따라서, 삽입적 종양형성의 위험성을 최소화하고, 적혈구-특이적이고 분화 단계-특이적인 방식으로 글로빈 유전자(예컨대, 인간 β-글로빈 유전자)의 치료적 발현을 허용하며, 높은 레벨의 형질도입을 가능하게 하여, 지중해빈혈 및 겸상 세포 환자의 치료에 사용될 때 그 안전성을 개선하는 신규한 글로빈 발현 카세트에 대한 필요성이 있다.
본 개시된 보호대상은 일반적으로 인핸서 차단 인슐레이터를 제공하며, 어떤 인슐레이터는 부가적으로 장벽(barrier) 인슐레이터 활성을 갖고 있다. 본 개시된 보호대상은 또한 하나 이상의 인슐레이터를 포함하는 발현 카세트를 제공하고, 글로빈 유전자(예컨대, 인간 β 글로빈 유전자)의 발현을 허용한다. 또한, 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터, 이러한 발현 카세트 또는 이러한 벡터로 형질도입된 세포, 및 헤모글로빈병증(예컨대, β-지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈)의 치료를 위한 이러한 발현 카세트의 용도가 제공된다.
어떤 비제한적 구현예에서, 본 개시된 보호대상은 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 인슐레이터, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터와 같이 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터를 제공한다(하기 참조). 본 개시된 보호대상은 또한 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 적어도 하나의 인슐레이터, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터와 같이 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 비제한적 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 적어도 하나의 인슐레이터, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터와 같이 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터, 및 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR)에 작동가능하게 연결된 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 Dnase I 과민감성 부위-2(HS2) 영역을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 코어(core) 서열을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS2의 코어 서열은 서열번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS2의 코어 서열은 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 HS2의 인핸서 활성을 유지하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 Dnase I 과민감성 부위-1(HS1) 영역, Dnase I 과민감성 부위-3(HS3) 영역 및 Dnase I 과민감성 부위-4(HS4) 영역을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 HS3 영역은 HS1 및 HS4 영역 사이에 위치한다.
어떤 구현예에서, 상기 HS1 영역은 약 1.1 kb bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 약 500 bp 및 약 1,000 bp 사이의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS1 영역은 약 600 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 602 bp의 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS1 영역은 약 500 내지 약 600 bp 사이의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS1 영역은 약 490 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 489 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1 영역은 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR은 HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR은 HS2 영역을 포함하지 않는다.
어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역을 포함하지 않거나 및/또는 HS2 영역을 포함하지 않고, 상기 β-글로빈 LCR은 HS2의 코어 서열을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 HS1의 코어 서열을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1의 코어 서열은 서열번호 22에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS1의 코어 서열은 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 HS1의 기능을 유지하는 HS1 영역을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR은 HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하고, HS1의 코어 서열을 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS3 영역은 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 상기 HS4 영역 사이에 위치한다. 어떤 구현예에서, 상기 HS3 영역은 약 200 내지 약 1,400 bp 사이, 예컨대 길이가 약 1,300 및 1,400 bp 사이의 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS3 영역은 약 1,300 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS3 영역은 1,301 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS3 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS4 영역은 약 200 및 약 1,200 bp 사이, 예컨대 길이가 약 400 및 1,100 bp 사이의 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS4 영역은 약 1.1 kb의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 1,065 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS4 영역은 약 450 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 446 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는다.
다른 한편으로, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 HS2 영역은 약 400 및 약 1,000 bp 사이, 예컨대 길이가 약 800 및 900 bp 사이의 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS2 영역은 약 860 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS2 영역은 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS3 영역은 약 1,300 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS3 영역은 1,301 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS3 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 HS4 영역은 약 1.1 kb의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 1,065 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 HS4 영역은 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함한다. 부가적으로, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역을 추가로 포함할 수 있다.
어떤 구현예에서, 상기 글로빈 유전자는 β-글로빈 유전자, γ-글로빈 유전자 및 δ-글로빈 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 글로빈 유전자는 인간 β-글로빈 유전자이다. 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 야생형 β-글로빈 유전자, 하나 이상의 인트론 서열의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자 및 적어도 하나의 항-겸상화 아미노산 잔기를 암호화하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 유전자는 코돈 87에서 트레오닌의 글루타민으로의 돌연변이(βA - T87Q)를 암호화하는 인간 βA 글로빈 유전자이다.
어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 1개의 인슐레이터, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터와 같이 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 2개의 인슐레이터를 포함하고, 각각은 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하고, 예를 들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 1개 또는 2개의 모든 인슐레이터는 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하거나 및/또는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 β-글로빈 프로모터를 추가로 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 프로모터는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분 및 β-글로빈 LCR 영역 사이에 위치한다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 프로모터는 약 200 및 약 700 bp 사이의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 프로모터는 약 613 bp의 길이를 갖는 인간 β-글로빈 프로모터이다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 프로모터는 서열번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 비제한적 구현예에서, 상기 β-글로빈 프로모터는 약 265 bp의 길이를 갖는 인간 β-글로빈 프로모터이다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 프로모터는 서열번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인간 β-글로빈 3' 인핸서를 추가로 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 상류에 위치한다. 어떤 구현예에서, 상기 β-글로빈 3' 인핸서는 약 700 및 약 900 bp 사이의 길이, 예컨대 약 800 및 900 bp 사이의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 약 879 bp의 길이를 갖는다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 서열번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 적어도 하나의 적혈구-특이적 인핸서를 추가로 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 적혈구-특이적 인핸서는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 상기 β-글로빈 LCR 영역 사이에 위치한다. 어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 적혈구-특이적 인핸서는 서열번호 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 적어도 하나의 적혈구-특이적 인핸서는 약 100 및 약 200 bp 사이의 길이를 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 1개, 2개 또는 3개의 적혈구-특이적 인핸서를 포함한다.
어떤 구현예에서, 상기 발현 카세트는 포유류에서 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 발현을 허용한다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 발현 카세트는 인간 β-글로빈 유전자의 발현을 허용한다. 어떤 구현예에서, 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 발현은 적혈구 조직에 한정된다.
본 개시된 보호대상은 또한 전술한 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 어떤 구현예에서, 상기 재조합 벡터 내에 포함되는 발현 카세트는 1개의 인슐레이터를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 벡터의 3' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR) 내의 우드척 간염 후-조절 요소(Woodchuck hepatitis post-regulatory element, WPRE)를 추가로 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR) 내의 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
또한, 본 개시된 보호대상은 전술한 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생형 또는 조작된 뉴클레아제를 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 비-자연 발생형 또는 조작된 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 비-자연 발생형 또는 조작된 메가뉴클레아제 및 비-자연 발생형 또는 조작된 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 게놈 세이프 하버 부위(genomic safe harbor site)에 결합한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 상기 게놈 세이프 하버 부위에 결합한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 상기 게놈 세이프 하버 부위에서 이중 가닥 절단(double strand break, DSB)을 생성한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제 내에 포함되는 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터를 2개 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 상기 발현 카세트의 표적화된 운반을 허용한다. 본 개시된 보호대상은 또한 전술한 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
또한, 본 개시된 보호대상은 전술한 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생형 또는 조작된 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR-Cas 뉴클레아제 및 단일-가이드(guide) RNA를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 게놈 세이프 하버 부위에 결합한다. 어떤 구현예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템은 상기 게놈 세이프 하버 부위에 이중 가닥 절단(DSB)을 생성한다. 어떤 구현예에서, 상기 CRISPR-Cas 시스템 내에 포함되는 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터 2개를 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 CRISPR-Cas는 상기 발현 벡터의 표적화된 운반을 허용한다. 본 개시된 보호대상은 또한 전술한 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 상기 게놈 세이프 하버 부위는 유전자외적(extragenic) 게놈 세이프 하버 부위이다. 어떤 구현예에서, 상기 게놈 세이프 하버 부위는 1번 염색체 상에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 게놈 세이프 하버는 다음의 5가지 기준을 모두 충족한다: (ⅰ) 임의의 유전자의 5' 말단(예컨대, 상기 유전자의 5' 말단)으로부터 적어도 50 kb의 거리, (ⅱ) 임의의 암 관련 유전자로부터 적어도 300 kb의 거리, (ⅲ) 개방된/접근가능한 염색질 구조 내(천연 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 DNA 절단에 의해 측정됨), (ⅳ) 유전자 전사 유닛 외부에 위치, 및 (ⅴ) 인간 게놈의 초보존된 영역(ultraconserved region, UCR), microRNA 또는 긴 비-코딩 RNA 외부에 위치.
부가적으로, 본 개시된 보호대상은 전술한 발현 카세트로 형질도입된 세포, 전술한 재조합 벡터로 형질도입된 세포, 전술한 뉴클레아제로 형질도입된 세포, 전술한 CRISPR-Cas 시스템으로 형질도입된 세포를 제공한다. 또한, 본 개시된 보호대상은 전술한 벡터로 형질도입된 세포를 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포 및 조혈발생(hemogenic) 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 조혈 줄기 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. 어떤 구현예에서, 상기 세포는 생체외에서(ex vivo) 형질도입된다.
또한, 유효량의 전술한 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 본 개시된 보호대상은 또한 유효량의 전술한 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 헤모글로빈병증의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 개시된 보호대상은 전술한 세포를 포함하는 헤모글로빈병증의 치료용 키트를 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 키트는 헤모글로빈병증을 갖는 대상체의 치료용 세포를 사용하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함한다.
또한, 본 개시된 보호대상은 대상체에서 유효량의 전술한 세포를 대상체에 투여하고, 이로 인해 정상 헤모글로빈을 함유하는 적혈구를 생산하기 위한 대상체의 능력을 회복하는 단계를 포함하는 헤모글로빈병증의 치료 방법을 제공한다. 어떤 구현예에서, 치료적으로 연관있는 레벨의 헤모글로빈은 상기 세포를 대상체에 투여한 후 상기 대상체에서 생성된다. 어떤 구현예에서, 상기 방법은 전술한 재조합 벡터로 형질도입된 유효량의 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체에서 치료적으로 연관있는 레벨의 헤모글로빈을 제공하기 위한 세포 내의 상기 재조합 벡터의 벡터 카피 수(copy number)는 세포 당 약 0.5-2 벡터 카피 수이다. 어떤 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에서 비효과적인 적혈구생성을 보정한다. 어떤 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에서 이식편-대-숙주 질환의 위험성을 초래하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 방법은 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하지 않는다. 어떤 구현예에서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포 및 조혈발생 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 어떤 구현예에서, 상기 세포는 상기 대상체로부터 유래된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 세포는 상기 대상체의 골수로부터 유래된다.
본 개시된 보호대상에 따르면, 상기 헤모글로빈병증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(sickle cell disease, SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 지중해빈혈 메이저(major), 지중해빈혈 인터메디아(intermedia), α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈이다. 다른 비제한적 구현예에서, 상기 헤모글로빈병증은 겸상 세포 빈혈이다.
본 발명을 기재된 특정 구현예들로 한정하기 위한 것이 아니라 예로써 제공된 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있다.
도 1은 본 개시된 보호대상의 한 비제한적 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 2는 본 개시된 보호대상의 한 비제한적 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 3은 본 개시된 보호대상의 한 비제한적 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 4는 본 개시된 보호대상의 한 비제한적 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 5의 a 내지 c는 인슐레이터 A1의 유전독성을 나타낸다. (a) 이용된 감마레트로바이러스 벡터 유전독성 분석을 보여준다. (b) 인슐레이팅된 감마레트로바이러스 벡터로 형질도입된 32D 세포를 제공받은 마우스들의 증가된 생존을 주목한다. cHS4 및 인슐레이팅되지 않은 대조군을 사용하여 수득한 결과도 주목한다. (c) 인슐레이터 A1이 유전독성의 위험을 감소시켰다는 것을 보여준다.
도 6은 치료 후 8주 및 44주에서 지중해빈혈 Hbbth3 /+ 마우스들에서의 표준화된 β 쇄 발현을 나타낸다.
도 7은 비-적혈구 K562 세포에서의 인핸서 활성의 평가를 나타낸다.
도 8은 본 개시된 보호대상의 일부 구현예들에 따른 적혈구-특이적 인핸서를 나타낸다.
도 9은 본 개시된 보호대상의 일부 구현예들에 따른 적혈구-특이적 인핸서를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 다양한 재조합 벡터들을 보여준다.
도 11은 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터의 역가를 나타낸다.
도 12는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터의 역가를 나타낸다.
본 개시된 보호대상은 일반적으로 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 발현을 가능하게 하는 발현 카세트를 제공한다. 한 비제한적 예에서, 발현 카세트는 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 하나 이상의 인슐레이터, 예를 들면, 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터, 예컨대, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 인슐레이터(그러나, 이들로 한정되지 않음), 및 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR)에 작동가능하게 연결된 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 본 개시된 발현 카세트에 의해 유도된 글로빈 유전자의 발현은 적혈구-특이적이고 분화 단계-특이적이고 고수준이고 지속된다. 본 개시된 보호대상은 재조합 벡터, 비-천연 생성 또는 조작된 뉴클레아제, 및 이러한 발현 카세트를 포함하는 비-천연 생성 또는 조작된 CRISPR-Cas 시스템, 및 이러한 발현 카세트, 재조합 벡터, 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템으로 형질도입된 세포도 제공한다. 본 개시된 발현 카세트 및 이를 포함하는 벡터는 치료 전이유전자(transgene) 발현이 세포당 낮은 벡터 카피 수(예를 들면, 0.5-2, 1-2, 또는 심지어 0.5-1)로 달성되기(예를 들면, 치료적으로 적절한 수준의 헤모글로빈이 생성되기) 때문에 안전한 유전자 전달 요법을 제공한다. 또한, 본 개시된 보호대상은 헤모글로빈병증(예를 들면, β-지중해빈혈 및 겸상 세포 빈혈)을 치료하기 위해 이러한 형질도입된 세포를 사용하는 방법을 제공한다.
Ⅰ. 정의
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 하기 참고문헌들은 본 발명에서 사용된 용어들 중 대부분의 용어들의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 특정되어 있지 않은 한, 하기 용어들은 이하에서 그들에게 부여된 의미를 가진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소들을 가진, 재조합 또는 합성에 의해 생성된 핵산 구축물을 지칭한다. 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 영역 내로 도입될 수 있다. 발현 카세트 부분은 전사될 유전자, 및 이 유전자의 발현을 조절하는 요소(예를 들면, 프로모터)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR)"은 HS1 영역, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 하나 이상의 Dnase I 과민감성 부위(HS) 영역으로 구성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. β-글로빈 유전자들의 많은 LCR들의 구조는 예를 들면, 인간의 경우 문헌[Li et al., J. Biol. Chem. (1985); 260:14,901; Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87:8207]; 마우스의 경우 문헌[Shehee et al., J. Mol. Biol. (1989);205:41]; 토끼의 경우 문헌[Margot et al., J. Mol. Biol. (1989);205:15]; 및 염소의 경우 문헌[Li, Q., et al., Genomics (1991);9:488]에 공개되었고, 이들 문헌들 각각은 본원에 참고로 도입된다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함한다(예를 들면, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역; 및 HS1 영역, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역). 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다(예를 들면, HS1 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역). 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역 또는 HS1 영역을 포함하지 않는다(예를 들면, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 이종 핵산의 도입에 의해 변경된 세포 또는 벡터, 또는 이처럼 변경된 세포로부터 유래된 세포의 지칭을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 재조합 세포는 천연(비-재조합) 형태의 세포 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 의도적인 인간 개입의 결과로서 다른 방식으로 비정상적으로 발현되거나, 과소발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현하거나, 천연 유전자의 감소된 또는 제거된 발현을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "글로빈"은 산소의 결합 및 수송에 관여하는 헴(heme) 함유 단백질의 패밀리를 지칭한다. 척추동물 및 무척추동물 헤모글로빈, 척추동물 및 무척추동물 미요글로빈 또는 이들의 돌연변이체의 서브유닛들이 용어 글로빈에 의해 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형"은 임의의 돌연변이 또는 변경을 갖지 않는 천연 상태로 발견된 정상 유전자, 바이러스 또는 유기체를 지칭한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오티드들의 중합체 형태 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원적 구조를 가질 수 있고, 공지되어 있거나 공지되어 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예들은 다음과 같다: 유전자 또는 유전자 영역의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 좌위들(좌위), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보좀 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변경된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시된 보호대상은 하나 이상의 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변경은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 단절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 중합 후에 더 변경될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 내생성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내생성 서열에 대한 "실질적인 동일성"을 가진 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중 가닥 핵산 분자의 하나 이상의 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화한다"는 다양한 엄격성 조건들 하에서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열들(예를 들면, 본원에 기재된 유전자) 또는 이들의 부분들 사이에 쌍을 이루어 이중 가닥 분자를 형성한다는 것을 의미한다(예를 들면, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참조).
예를 들면, 엄격한 염 농도는 통상적으로 약 750 mM NaCl 및 75 mM 삼나트륨 시트레이트 미만, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 삼나트륨 시트레이트 미만, 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 삼나트륨 시트레이트 미만일 것이다. 낮은 엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드의 부재 하에서 수득될 수 있는 반면, 높은 엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 포름아미드, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재 하에서 수득될 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃, 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가 파라미터들, 예컨대, 혼성화 시간 및 세제, 예를 들면, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 농도의 변경, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제는 본 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다. 필요에 따라 이들 다양한 조건들을 조합하여 다양한 엄격성 수준을 달성한다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 30℃의 750 mM NaCl, 75 mM 삼나트륨 시트레이트 및 1% SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 혼성화는 37℃의 500 mM NaCl, 50 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 ㎍/㎖ 변성된 연어 정자 DNA(ssDNA)에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 42℃의 250 mM NaCl, 25 mM 삼나트륨 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 ㎍/㎖ ssDNA에서 일어날 것이다. 이들 조건들에 대한 유용한 변경은 본 기술분야에서 숙련된 자에게 용이하게 자명할 것이다.
대부분의 적용들의 경우, 혼성화 후 수행되는 세척 단계도 엄격성 면에서 달라질 것이다. 세척 엄격성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 전술된 바와 같이, 세척 엄격성은 염 농도의 감소 또는 온도의 증가에 의해 증가될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계를 위한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 삼나트륨 시트레이트 미만, 가장 바람직하게는 약 15 mM NaCl 및 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 미만일 것이다. 세척 단계를 위한 엄격한 온도 조건은 통상적으로 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 25℃의 30 mM NaCl, 3 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 42℃의 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 68℃의 15 mM NaCl, 1.5 mM 삼나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS에서 일어날 것이다. 이들 조건들에 대한 추가 변경은 본 기술분야에서 숙련된 자에게 용이하게 자명할 것이다. 혼성화 기법은 본 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Benton and Davis (Science 196:180, 1977)]; 문헌[Grunstein and Rogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)]; 문헌[Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)]; 문헌[Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)]; 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체, 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비-천연 생성 아미노산, 예컨대, 상응하는 천연 생성 아미노산의 화학적 유사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 생성 아미노산 중합체에도 적용된다. 본 개시된 보호대상의 특정 구현예는 폴리펩티드 "변이체"도 포함한다. 폴리펩티드 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가, 결실, 절두 및/또는 치환에 의해 기준 폴리펩티드로부터 식별되고 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 폴리펩티드 변이체는 본 기술분야에서 공지되어 있는 바와 같이 보존적 또는 비-보존적일 수 있는 하나 이상의 치환에 의해 기준 폴리펩티드로부터 식별된다. 일부 구현예들에서, 변이체 폴리펩티드는 기준 폴리펩티드의 상응하는 서열에 대한 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 아미노산 추가 또는 결실은 기준 폴리펩티드의 C-말단 및/또는 N-말단에서 일어난다. 일부 구현예들에서, 아미노산 결실은 모든 개재 수, 예를 들면, 25개, 26개, 27개, 29개, 30개 ... 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개 ... 170개, 171개, 172개, 173개, 174개 등의 아미노산들을 포함하는, 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 15개, 약 20개, 약 25개, 약 30개, 약 35개, 약 40개, 약 45개, 50개, 약 55개, 약 60개, 약 65개, 약 70개, 약 75개, 약 80개, 약 85개, 약 90개, 약 95개, 약 100개, 약 105개, 약 110개, 약 115개, 약 120개, 약 125개, 약 130개, 약 135개, 약 140개, 약 145개, 약 150개, 약 155개, 약 160개, 약 165개, 약 170개 또는 약 175개 이상의 아미노산들의 C-말단 절두를 포함한다.
상기 인지된 바와 같이, 본 개시된 보호대상의 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절두 및 삽입을 포함하는 다양한 방식들로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법들은 본 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경을 위한 방법들은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492)], 문헌[Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌[Watson, J. D. et al., Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, 1987)] 및 이들에서 인용된 참고문헌들을 참조한다. 관심있는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 문헌[Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 기준 아미노산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 아미노산 서열들 중 어느 하나) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본원에 기재된 핵산 서열들 중 어느 하나)에 대한 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 비교를 위해 사용된 서열과 아미노산 수준 또는 핵산 수준에서 적어도 60%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성 또는 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, 미국 위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 위스콘신 대학 생물공학 센터에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 팩키지, LAST, BESTFIT, GAP 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 이용함으로써 측정된다. 이러한 소프트웨어는 상동성 정도를 다양한 치환들, 결실들 및/또는 다른 변경들에 배정함으로써 동일한 또는 유사한 서열들을 맞춘다. 동일성 또는 상동성 정도를 측정하는 예시적 방법에서, 밀접하게 관련된 서열을 표시하는 e-3 내지 e-100의 확률 점수와 함께 BLAST 프로그램이 이용될 수 있다. 2개의 서열들 사이의 동일성의 백분율도 프로그램, 예컨대, DNAMAN(Lynnon Biosoft, version 3.2)에 의해 측정될 수 있다. 이 프로그램을 이용할 때, 최적 정렬 알고리즘을 이용하여 2개의 서열들을 정렬할 수 있다(Smith and Waterman, 1981). 2개의 서열들의 정렬 후, 2개의 서열들 사이에 동일한 뉴클레오티드의 수를, 모든 갭들의 길이를 차감한 정렬된 서열의 길이로 나눔으로써 백분율 동일성을 계산할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 배향을 기술하는 용어들은 5'(통상적으로 자유 포스페이트 기를 가진 폴리뉴클레오티드의 말단) 및 3'(통상적으로 자유 하이드록실(OH) 기를 가진 폴리뉴클레오티드의 말단)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 5'부터 3'으로의 배향 또는 3'부터 5'으로의 배향으로 해독될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단일 가이드 RNA" 또는 "합성 가이드 RNA"는 가이드 서열, tracr 서열 및 tracr 메이트(mate) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 부위를 특정하는, 가이드 RNA 내의 약 20 bp 서열을 지칭하고, 용어 "가이드" 또는 "스페이서"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "tracr 메이트 서열"은 용어 "직접적 반복부(들)"와 상호교환적으로 사용될 수도 있다.
용어 "비-천연 생성" 또는 "조작된"은 상호교환적으로 사용되고, 인간의 손의 개입을 표시한다. 상기 용어들은 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭하는 경우 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 천연 상태에서 발견될 때 천연 상태에서 이들과 천연적으로 회합되어 있는 하나 이상의 다른 성분을 적어도 실질적으로 갖지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 "유전자 생성물"로서 총칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 발현은 진핵세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 질환 경과를 변경시키기 위한 시도에서의 임상 중재를 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 치료는 질환 또는 장애의 진행을 예방함으로써 영향을 받거나 진단된 대상체 또는 장애를 가진 것으로 의심되는 대상체에서 장애로 인한 악화를 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 치료는 장애에 대한 위험에 있거나 장애를 가진 것으로 의심되는 대상체에서 장애 또는 장애의 증상의 발병을 예방할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 (예를 들면, 특정 치료의 수용자이거나 채취되는 세포의 기원인) 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 동물(예를 들면, 포유동물)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 세포를 천연적으로 동반하는 분자 및/또는 세포 성분으로부터 분리되어 있는 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 물질이 그의 천연 상태에서 발견될 때 통상적으로 그와 동반되는 성분을 다양한 정도까지 갖지 않거나, 실질적으로 갖지 않거나 본질적으로 갖지 않는 물질을 지칭한다. "단리된"은 원래의 공급원 또는 환경으로부터의 분리 정도를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포 집단"은 유사한 또는 상이한 표현형들을 발현하는 적어도 2종의 세포들의 군을 지칭한다. 비제한적 예에서, 세포 집단은 유사한 또는 상이한 표현형들을 발현하는 적어도 약 10종의 세포들, 적어도 약 100종의 세포들, 적어도 약 200종의 세포들, 적어도 약 300종의 세포들, 적어도 약 400종의 세포들, 적어도 약 500종의 세포들, 적어도 약 600종의 세포들, 적어도 약 700종의 세포들, 적어도 약 800종의 세포들, 적어도 약 900종의 세포들, 적어도 약 103종의 세포들, 적어도 약 104종의 세포들, 적어도 약 105종의 세포들, 적어도 약 106종의 세포들, 적어도 약 107종의 세포들 또는 적어도 약 108종의 세포들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "절단"은 DNA 분자의 공유 골격의 파괴를 지칭한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법들에 의해 시작될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 둘 다가 가능하고, 이중 가닥 절단은 2개의 상이한 단일 가닥 절단 사건들의 결과로서 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트(blunt) 말단 또는 스태거드(staggered) 말단의 생성을 야기할 수 있다. 일부 구현예들에서, 융합 폴리펩티드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "절단 절반-도메인"은 (동일한 또는 상이한) 제2 폴리펩티드와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중 가닥 절단 활성)을 가진 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 용어 "제1 절단 절반-도메인 및 제2 절단 절반-도메인", "+ 절단 절반-도메인 및 - 절단 절반-도메인" 및 "우측 절단 절반-도메인 및 좌측 절단 절반-도메인"은 이량체화하는 절단 절반-도메인들의 쌍을 지칭하는 데 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "염색체"는 세포의 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체를 지칭한다. 종종 세포의 게놈은 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체들의 집합체인 그의 핵형(karyotype)을 특징으로 한다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사되는 서열에 인접하는지 여부와 관계없이 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역들도 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터(terminators), 번역 조절 서열, 예컨대, 리보좀 결합 부위 및 내부 리보좀 도입 부위, 인핸서, 사일런서(silencers), 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 좌위 조절 영역을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "사용가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분들(예컨대, 서열 요소들)의 병치에 대하여 상호교환적으로 사용되고, 이때 상기 성분들은 성분들 둘 다가 정상적으로 작용하고 성분들 중 하나 이상이 나머지 성분들 중 하나 이상에 대해 발휘하는 기능을 매개할 수 있을 가능성을 허용하도록 정렬된다. 예를 들면, 전사 조절 서열, 예컨대, 프로모터는 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 조절하는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스(cis)로 작동가능하게 연결되어 있으나, 상기 코딩 서열에 바로 인접할 필요는 없다. 예를 들면, 비록 인핸서와 코딩 서열이 인접하지 않을지라도, 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 전사 조절 서열이다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능성 영역" 또는 "기능성 부분"은 전체 길이 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지 않은 서열을 갖지만 여전히 전체 길이 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능성 영역은 상응하는 천연 분자보다 더 많은 또는 더 적은 수의 잔기, 또는 상응하는 천연 분자와 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들면, 코딩 기능, 또 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 확인하는 방법들은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 기능을 확인하는 방법들은 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 DNA 결합 기능은 예를 들면, 필터 결합, 전기영동적 이동-변동 또는 면역침전 분석에 의해 확인될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있다. 또 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예를 들면, 동시-면역침전, 투-하이브리드 분석, 또는 유전적 상보성 및 생화학적 상보성 둘 다에 의해 확인될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 결합하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. 용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하고 일부 경우 또 다른 조절 서열에 대한 그의 배향과 관계없이 작용할 수 있는 DNA 분절을 지칭한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력적으로 또는 상가적으로 작용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 적절한 조절 요소와 연결될 때 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포 내로 전달할 수 있는 임의의 유전적 요소, 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 등을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절한다"는 긍정적으로 또는 부정적으로 변경시키는 것을 지칭한다. 예시적 조절은 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75% 또는 약 100% 변화를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가시킨다"는 약 5%까지, 약 10%까지, 약 25%까지, 약 30%까지, 약 50%까지, 약 75%까지 또는 약 100%까지 긍정적으로 변경시키는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 적어도 약 5%까지 긍정적으로 변경시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "감소시킨다"는 약 5%까지, 약 10%까지, 약 25%까지, 약 30%까지, 약 50%까지, 약 75%까지 또는 약 100%까지 부정적으로 변경시키는 것을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 적어도 약 5%까지 부정적으로 변경시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 측정될 때 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있다는 것을 의미하고, 이 오차 범위는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 의해 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들면, "약"은 본 기술분야의 관행에 따라 3 이내의 또는 3 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내에 있다는 것을 의미할 수 있다.
Ⅱ. 인슐레이터
벡터 관련 악성 형질전환의 여러 사례들이 벡터에 의해 코딩된 인핸서에 의한 세포 종양유전자의 활성화와 관련된 임상 환경에서 보고되었고(Baum et al. (2006), Nienhuis et al. (2006), Ramezani et al. (2006)), 다양한 벡터 변경들이 벡터 유전독성을 감소시키기 위해 수행되었거나 제안되었다(Baum et al. (2006), Nienhuis et al. (2006), Ramezani et al. (2006)). 염색질 인슐레이터로서 공지된 DNA 요소들의 한 클래스는 벡터 안전성 및 성능을 개선하는 한 수단으로서 인식되었다(Emery (2011)).
인슐레이터는 인접 염색질 도메인들 사이의 기능성 경계로부터 돕는 천연 생성 DNA 요소이다. 인슐레이터는 염색질을 변형시키고 국부적 유전자 발현을 변경시키는 단백질에 결합한다. 본원에 기재된 벡터에서 인슐레이터의 배치는 1) 플랭킹 염색체에 의한 발현의 위치적 효과 다변화로부터 벡터를 차폐한다는 점(즉, 위치 효과 및 벡터 침묵을 감소시킬 수 있는 장벽 활성); 및 2) 벡터에 의한 내생성 유전자 발현의 삽입적 트랜스-활성화로부터 플랭킹 염색체를 차폐한다는 점(인핸서 차단)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 잠재적 이점들을 제공한다. 염색질 인슐레이터들의 두 기본 클래스들이 존재한다: (a) 침묵 이종염색질이 전사적으로 허용되는 개방 염색질의 인접 영역들 내로 침입하는 것을 차단하는 장벽 인슐레이터, 및 (b) 인접 영역들의 인핸서-매개된 전사 활성화를 방해하는 인핸서 차단 인슐레이터. 이들 활성들을 매개하는 서열들은 물리적으로 분리될 수 있고 기작적으로 상이하다(Recillas-Targa et al. (2002)). 염색질 인슐레이터들은 혼자 스스로 고유의 전사 향상 또는 억제 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 이들은 유전자 전달 벡터와 표적 세포 게놈 사이의 상호작용을 감소시키기 위한 이상적인 요소를 만든다. 인슐레이터들은 게놈 또는 유전적 환경에 포함된 유전자들 또는 전사 유닛들의 독립적인 기능을 보존하는 것을 도울 수 있고, 이때 상기 유전자들 또는 전사 유닛들의 발현은 게놈 또는 유전적 환경 내의 조절 신호에 의해 다른 방식으로 영향을 받을 수 있다(예를 들면, 문헌[Burgess-Beusse et al. (2002) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 99: 16433; and Zhan et al. (2001) Hum. Genet., 109: 471] 참조).
유전독성의 위험이 염색질 인슐레이터의 사용에 의해 감소될 수 있다는 것이 입증된 것과 마찬가지로(Arumugam et al. (2007), Emery (2011), Evans-Galea et al. (2007), Rivella et al. (2000), Emery et al. (2000), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2003), Ramezani et al. (2008)), 바이러스 벡터의 삽입적 돌연변이유발에 의해 발생된 문제점들은 널리 공지되어 있다(Nienhuis (2013), Baum et al. (2006), Nienhuis et al. (2006)). 본 개시된 보호대상은 강력한 인핸서 차단 인슐레이터인 신규 인슐레이터를 제공하고, 일부 인슐레이터들은 장벽 인슐레이터 활성을 추가로 가진다. 척추동물에서, 인핸서 차단 인슐레이터의 기능은 징크-핑거 DNA 결합 인자 CTCF를 통해 매개된다(Gaszner and Felsenfeld (2006), Wallace and Felsenfeld (2007)). 일반적으로, 이들 요소들은 인접 인슐레이터 요소들 사이의 CTCF-매개된 상호작용에 의해 확립되거나 핵 내의 구조적 요소에의 염색질 섬유의 CTCF-매개된 고착을 통해 확립되는 물리적 루프 구조를 통해 작용하는 것으로 생각된다. 가장 먼저 특징규명된 척추동물 염색질 인슐레이터는 닭 β-글로빈 좌위 조절 영역 내에 위치한다. DNase-I 과민감성 부위-4(cHS4)를 함유하는 이 요소는 닭 β-글로빈 좌위의 5' 경계를 구성하는 듯하다(Prioleau et al. (1999) EMBO J. 18: 4035-4048). 상기 cHS4 요소를 함유하는 1.2-kb 영역은 세포주에서 글로빈 유전자 프로모터와 인핸서의 상호작용을 차단하는 능력(Chung et al. (1993) Cell, 74: 505-514), 및 초파리(상기 문헌), 형질전환된 세포주(Pikaart et al. (1998) Genes Dev. 12: 2852-2862) 및 형질전환 포유동물(Wang et al. (1997) Nat. Biotechnol., 15: 239-243; Taboit-Dameron et al. (1999) Transgenic Res., 8: 223-235)에서 발현 카세트를 위치 효과로부터 보호하는 능력을 포함하는 고전적인 인슐레이터 활성을 나타낸다. 이 활성의 대부분은 250-bp 영역에 함유되어 있다. 이 스트레치(stretch) 내에 인핸서 차단 분석(Bell et al. (1999) Cell, 98: 387-396)에 관여하는 징크 핑거 DNA 결합 단백질 CTCF와 상호작용하는 49-bp cHS4 요소(Chung et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 575-580)가 존재한다.
인슐레이터, 예컨대, cHS4는 인핸서와 프로모터 사이에 배치될 때 이들 요소들 사이의 상호작용을 차단할 수 있다(Evans-Galea et al. (2007), Chung et al. (1997), Bell et al. (1999), Ryu et al. (2007), Ryu et al. (2008)). 여러 연구들은 감마레트로바이러스 벡터(Evans-Galea et al. (2007), Rivella et al. (2000), Emery et al. (2000), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2006), Yao et al. (2003), Nishino et al. (2006), Aker et al. (2007), Li and Emery (2008)) 및 렌티바이러스 벡터(Bank et al. (2005), Arumugam et al. (2007), Puthenveetil et al. (2004), Evans-Galea et al. (2007), Ramezani et al. (2003), Aker et al. (2007), Ma et al. (2003), Chang et al. (2005), Pluta et al. (2005))의 위치 효과 침묵을 감소시키는 cHS4 인슐레이터의 능력을 입증하였다. 이러한 적절하게 설계된 연구들은 cHS4 인슐레이터의 1.2 kb 버전의 포함이 적어도 일부 환경들에서 벡터 전이유전자 발현의 확률 및/일관성을 증가시킨다는 것을 입증하였다(Arumugam et al. (2007), Emery (2011), Evans-Galea et al. (2007), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2006), Aker et al. (2007), Li and Emery (2008), Pluta et al. (2005). Jakobsson et al. (2004)). 그럼에도 불구하고, cHS4 인슐레이터에 의해 부여된 보호 정도는 결코 완전하지 않다. 또한, 1.2 kb cHS4의 포함은 벡터 역가에 불리하게 영향을 미칠 수 있는 반면, 가장 작은 cHS4 코어는 비효과적인 것으로 입증되었다(Aker et al. (2007), Jakobsson et al. (2004)). 대조적으로, 본 개시된 보호대상의 인슐레이터는 바이러스 벡터의 역가에 불리하게 영향을 미치지 않고, cHS4 인슐레이터보다 더 강력하고 효과적이다.
본 개시된 인슐레이터는 게놈 접근법, 예를 들면, 강력한 인핸서 차단제일뿐만 아니라 인간 게놈의 장벽 인슐레이터인 인슐레이터를 확인하는 게놈 접근법의 이용을 통해 확인된다. 본 개시된 인슐레이터는 유전자 요법(예를 들면, 줄기 세포 유전자 요법, 글로빈 유전자 요법)의 안전성을 향상시킨다. 헤모글로빈병증의 유전자 요법의 경우, 강력한 인핸서가 치료적 수준의 글로빈 유전자 발현을 달성하기 위해 요구된다. 따라서, 강력한 인슐레이터는 삽입 벡터의 강력한 인핸서로부터 게놈 환경을 보호하는 한 수단을 대표한다.
본 개시된 인슐레이터는 강력한 인핸서 차단 활성을 가진다. 한정하기 위한 것이 아닌 예로써, 본 개시의 인슐레이터는 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%까지 인핸서 요소의 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예들에서, 인슐레이터는 인핸서 차단 활성 이외에 장벽 활성을 가진다. 본 개시된 인슐레이터는 삽입적 돌연변이유발의 위험 및 바이러스 벡터와 관련된 유전독성을 실질적으로 감소시킨다. 나아가, 본 개시된 인슐레이터가 벡터 내로 도입될 때, 상기 인슐레이터는 벡터의 벡터 역가에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예들에서, 인슐레이터(예를 들면, 인슐레이터 A1)는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 생체내 발현을 증가시킨다.
일부 구현예들에서, 인슐레이터는 이하에 제공된 서열번호 18에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 전사 억제제 CTCF 결합 부위를 포함한다:
Figure pct00001
한 비제한적 구현예에서, 인슐레이터는 이하에 제공된 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1과 적어도 약 95% 상동하거나 적어도 약 98% 동일한(상동성) 서열을 가진다. 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 이 인슐레이터는 인슐레이터 A1로서 표기된다.
Figure pct00002
일부 구현예들에서, 인슐레이터는 서열번호 24에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 24와 적어도 약 95% 동일하거나 적어도 약 98% 동일한 서열을 포함한다.
Figure pct00003
일부 구현예들에서, 인슐레이터는 (서열번호 1의 역 상보체인) 서열번호 25에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 25와 적어도 약 95% 동일하거나 적어도 약 98% 동일한 서열을 포함한다.
Figure pct00004
일부 구현예들에서, 인슐레이터는 염색체 1의 hg18 좌표 76229933 내지 76230115에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 인슐레이터는 호모 사피엔스 염색체 1 클론 RP11-550H2(진뱅크 접근번호 AC092813.2)의 잔기 68041과 68160 사이, 잔기 68041과 68210 사이, 잔기 68041과 68280 사이, 또는 잔기 68005와 68305 사이의 뉴클레오티드 서열, 또는 이 서열과 적어도 95% 또는 98% 동일한 서열을 포함한다.
Ⅲ. 발현 카세트
본 개시된 보호대상은 하나 이상의 상기 개시된 인슐레이터(예를 들면, 인슐레이터 A1)를 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 일부 구현예들에서, 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 하나 이상의 인슐레이터, 및 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함한다.
β-글로빈 LCR 영역
인간 β-글로빈 유전자 클러스터는 많은 후각 수용체 유전자 어레이들 중 한 어레이 내에 내장된 5종의 유전자들로 구성된다(Bulger et al., PNAS (1999);96:5129-5134). 상기 클러스터는 염색체 11p15.4 상에서 80 kb에 걸쳐 있고, 5종의 발현되는 β-유사 유전자들, 및 개체발생 동안 이들의 단계-특이적 발현을 지시하는 시스-작용 조절 요소를 포함한다(Forget (2001), Molecular Mechanism of Beta Thalassemia. Steinberg MH et al., Eds. Disorders of Hemoglobin. Genetics, Pathophysiology and Clinical Management, Cambridge University Press, Cambridge). 상기 유전자들은 그들의 발생학적 발현의 순서로 정렬되어 있다(Stamatoyannopoulos et al., (2001) Hemoglobin Switching. In: Stamatoyannopoulos G, et al., Eds. Molecular Basis of Blood Disorders, W.B. Saunders, Philadelphia, PA), 5'-ε-Gγ-Aγ-ψη-δ-β-3'. α-유사 글로빈 유전자 클러스터(5'-ξ2-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-3')는 염색체 16의 짧은 아암(arm)의 텔로미어(telomere)에 매우 가까이 위치하고 약 40 kb에 걸쳐 있다. 이들 2종의 독립적인 클러스터들 내에 코딩된 유전자들의 발현은 적혈구 세포로 한정되고, β-글로빈-유사 쇄들의 결과물이 α-쇄들의 결과물과 일치하도록 균형 잡힌다. 이 정밀하게 조정된 균형은 전사 수준, 전사 후 수준 및 번역 후 수준에서 조절된다.
발생학적 단계-특이적 발현은 다수의 근위 또는 원위 시스-작용 요소들, 및 이들에 결합하는 전사 인자들에 의해 조절된다. β-글로빈 유전자(HBB)의 경우, 근위 조절 요소는 β-글로빈 프로모터 및 2개의 다운스트림 인핸서들을 포함하는데, 상기 인핸서들 중 하나는 β-글로빈의 제2 인트론에 위치하고 나머지 하나는 상기 유전자로부터 대략 800 bp 다운스트림에 위치한다(Antoniou et al., EMBO J. (1988);7:377-384; Trudel et al., Genes Dev. (1987);1:954-961; Trudel et al., Mol. Cell. Biol. (1987);7:4024-4029). 가장 두드러진 원위 조절 요소는 HBB의 50 내지 60 kb 업스트림에 위치하고 적혈구 세포에서 DNaseI에 대한 강화된 민감성을 가진 여러 하위-영역들로 구성된 β-글로빈 LCR이다(Forget (2001); Grosveld et al., Cell (1987);51:975-985; Talbot et al., Nature (1989);338:352). LCR의 가장 두드러진 성질은 그의 강한 전사 향상 활성이다. 염색체 11 상의 인간 β-글로빈 영역의 예시적 뉴클레오티드 서열은 이하에 제공된 서열번호 19(진뱅크 접근번호 NG_000007.3)에 기재되어 있다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
5개의 5' 과민감성 부위(HS)들(HS1-HS5) 및 1개의 3' HS 부위가 인간 β-글로빈 LCR에서 확인되었다(Stamatoyannopoulos et al., (2001)). 5' HS1 내지 HS4는 Dnase I 과민감성 부위들이다. HS2 및 HS3 요소들은 많은 연구진들에 의해 확인된 바와 같이 LCR 내에서 가장 강력한 단일 요소들이다(Ellis et al., EMBO J. (1996), 15:562-568; Collis et al., EMBO J. (1990) 9:233-240). 형질전환 마우스들에서 βYAC의 환경 하에서 HS2의 결실은 HS 부위 형성에 심각하게 영향을 미칠뿐만 아니라 모든 발생학적 단계에서 모든 인간 β-글로빈 유전자들의 발현에도 심각하게 영향을 미친다(Bungert et al., Mol. Cell Biol. (1999);19:3062-3072). HS2의 결실은 난황으로부터 유래된 적혈구에서 배아 εy 및 βhi 글로빈 유전자의 발현을 최소한으로 감소시켰다고 보고되었다(Ley et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1998);850:45-53; Hug et al., Mol. Cell Biol. (1996);26:2906-2912). HS2는 일차적으로 인핸서로서 작용한다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함한다. 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함한다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역 내의 HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역은 인접한다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 본질적으로 HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역과 HS4 영역 사이의 연접부에서 2개의 도입된 GATA-1 결합 부위들을 포함한다. HS3 영역은 HS2 영역과 HS4 영역 사이에 놓일 수 있다. HS2 영역의 길이 및 서열은 달라질 수 있다. HS2 영역은 약 400 bp 내지 약 1000 bp, 예를 들면, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 또는 약 900 bp 내지 약 1000 bp의 길이를 가질 수 있다. 한 비제한적 구현예에서, HS2 영역은 860 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS2 영역은 이하에 제공된 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00023
일부 구현예들에서, HS2 영역은 약 840 bp의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS2 영역은 약 650 bp(예를 들면, 646 bp)의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS2 영역은 약 420 bp(예를 들면, 423 bp)의 길이를 가진다.
HS3 영역의 길이 및 서열은 달라질 수 있다. HS3 영역은 약 200 bp 내지 약 1400 bp, 예를 들면, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 약 900 bp 내지 약 1000 bp, 약 1000 bp 내지 약 1100 bp, 약 1100 bp 내지 약 1200 bp, 약 1200 bp 내지 약 1300 bp, 또는 약 1300 bp 내지 약 1400 bp의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, HS3 영역은 약 1300 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS3 영역은 1308 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS3 영역은 1301 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS3 영역은 이하에 제공된 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00024
일부 구현예들에서, HS3 영역은 약 850 bp(예를 들면, 845 bp)의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS3 영역은 약 280 bp 내지 약 290 bp(예를 들면, 280 bp 내지 287 bp)의 길이를 가진다.
유사하게, HS4 영역의 길이 및 서열은 달라질 수 있다. HS4 영역은 약 200 bp 내지 약 1200 bp, 예를 들면, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 약 900 bp 내지 약 1000 bp, 약 1000 bp 내지 약 1100 bp, 또는 약 1100 bp 내지 약 1200 bp의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 1.0 kb 이상의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 1.1 kb의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 1150 bp(예를 들면, 1153 bp)의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS4 영역은 1065 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS4 영역은 이하에 제공된 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00025
한 비제한적 예에서, HS4 영역은 이하에 제공된 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00026
일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 1.0 kb 미만, 예를 들면, 약 900 bp 미만, 약 700 bp 미만, 약 600 bp 미만 또는 약 500 bp 미만의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 500 bp 미만의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 450 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS4 영역은 약 446 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS4 영역은 이하에 제공된 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00027
일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 280 bp(예를 들면, 283 bp)의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS4 영역은 약 240 bp(예를 들면, 243 bp)의 길이를 가진다.
일부 비제한적 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 9, 서열번호 20 또는 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함한다.
한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 도 1에 표시된 바와 같이 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함한다.
또 다른 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역을 추가로 포함한다. 즉, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함한다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역 내의 HS1 영역, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역은 인접한다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 본질적으로 HS1 영역, HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역과 HS4 영역 사이의 연접부에서 2개의 도입된 GATA-1 결합 부위들을 포함한다.
HS1 영역의 길이 및 서열은 달라질 수 있다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 300 bp 내지 약 1500 bp의 길이, 예를 들면, 약 300 bp 내지 약 1100 bp의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 1.0 kb 이상, 예를 들면, 약 1.1 kb, 약 1.2 kb, 약 1.3 kb, 약 1.4 kb 또는 약 1.5 kb의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 1.1 kb의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS1 영역은 1074 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS1 영역은 이하에 제공된 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00028
일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 1.0 kb 미만, 예를 들면, 약 400 bp 내지 약 700 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 또는 약 900 bp 내지 약 1.0 kb의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 700 bp 미만의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 600 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS1 영역은 602 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS1 영역은 이하에 제공된 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00029
일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 500 bp 미만의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, HS1 영역은 약 490 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, HS1 영역은 489 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 예에서, HS1 영역은 이하에 제공된 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00030
최근의 연구는 HS2가 적혈구-특이적인 것이 아니라, 다른 세포주들 및 계통들에서 발현되고(실시예 3 및 도 4 참조) 미분화된 인간 배아 줄기 세포에도 존재한다는 것(Chang et al., Stem cell reviews (2013);9:397-407)을 보여주었다. HS2의 비-적혈구 활성으로 인해, HS2 함유 글로빈 벡터들은 예를 들면, 지중해빈혈 및 겸상 세포 환자들을 치료하기 위한 임상 치료에서 그들의 안전한 사용에 대한 위험을 제기하였다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 코어 서열을 포함하지 않는다. HS2의 코어 서열은 위치 독립적인 고수준 발현을 제공한다. 또한, HS2의 코어 서열은 HS2의 인핸서 활성을 유지한다. 예를 들면, HS2의 코어 서열은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 전사를 향상시킨다. 추가로, HS2의 코어 서열은 AP1 패밀리 단백질들의 구성원(예를 들면, NF-E2), GATA-1("NF-E1" 또는 "NFE1"로서도 공지되어 있음), 크루펠(Kruppel)-유사 Zn 핑거 단백질(예를 들면, 편재하는 단백질들 Sp1 및 YY1, 및 적혈구-제한된 인자 적혈구 크루펠-유사 인자(EKLF)), 및 기본 나선-루프-나선(bHLH) 단백질(E 박스)(예를 들면, USF 및 TAL1)을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 편재하는 단백질들 및 조직-특이적(예를 들면, 적혈구-특이적) 단백질들(예를 들면, 전사 인자)에 대한 하나 이상의 결합 부위 또는 결합 모티프를 포함한다. AP1 결합 부위는 향상 및 유도를 위해 요구된다(Moi and Kan (1990); Ney et al., (1990); Talbot and Grosveld (1991)). 나아가, NF-E2의 결합은 HS2에서 시험관내 재구성된 염색질의 파괴를 야기할 수 있다(Armstrong and Emerson (1996)). GATA-1 결합 부위에서의 돌연변이는 형질전환 마우스들에서 HS2의 인핸서 활성의 감소를 야기할 수 있다(Caterina et al., (1994)). AP1(예를 들면, AP1/NF-E2) 및 GATA1 결합 부위들 둘 다가 코어 기능에 중요하지만, 이들 인자들을 결여하는 마우스들은 손상된 글로빈 유전자 발현을 보이지 않는다(Weiss et al., 1994).
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 코어 서열의 전체 길이를 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, HS2 영역의 코어 서열은 인간 HS2의 코어 서열이다. 한 비제한적 구현예에서, 인간 HS2의 코어 서열은 AP1 패밀리 단백질들의 구성원들(예를 들면, NF-E2)에 대한 한 직렬 쌍의 결합 부위들("AP1/NF-E2" 결합 부위들로서 지칭됨)(예를 들면, GCTGAGTCA 및 GATGAGTCA), 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위(예를 들면, AGGGTGTGT), 1개의 GATA-1 결합 부위(예를 들면, CTATCT) 및 3개의 E 박스들(CANNTG, 예를 들면, CAGATG 및 CACCTG)을 포함한다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 이하에 제공된 서열번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진, 인간 HS2의 388 bp 코어 서열의 전체 길이를 포함하지 않는다:
Figure pct00031
서열번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 뉴클레오티드 위치 16671 내지 위치 17058에 상응한다(진뱅크 접근번호 NG_000007.3). 서열번호 20에서, GCTGAGTCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위는 위치 175 내지 위치 183에 위치하고, GATGAGTCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위는 위치 185 내지 위치 193에 위치하고, AGGGTGTGT의 뉴클레오티드 서열을 가진 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위는 위치 205 내지 위치 213에 위치하고, CAGATG의 뉴클레오티드 서열을 각각 가진 2개의 E 박스들은 위치 217 내지 위치 222 및 위치 278 내지 위치 283에 위치하고, CTATCT의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 246 내지 위치 251에 위치하고, CACCTG의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 E 박스는 위치 306 내지 위치 311에 위치한다.
한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 이하에 제공된 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진, 인간 HS2의 387 bp 코어 서열의 전체 길이를 포함하지 않는다:
Figure pct00032
서열번호 21에서, GCTGAGTCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위는 위치 175 내지 위치 183에 위치하고, GATGAGTCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위는 위치 185 내지 위치 193에 위치하고, AGGGTGTGT의 뉴클레오티드 서열을 가진 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위는 위치 204 내지 위치 212에 위치하고, CAGATG의 뉴클레오티드 서열을 각각 가진 2개의 E 박스들은 위치 216 내지 위치 221, 및 위치 277 내지 위치 282에 위치하고, CTATCT의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 245 내지 위치 250에 위치하고, CACCTG의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 E 박스는 위치 305 내지 위치 310에 위치한다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 코어 서열을 포함하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. HS2의 코어 서열을 포함하는 HS2 영역은 길이 및 서열 면에서 달라질 수 있다. 비제한적 예에서, HS2의 코어 서열을 포함하는 HS2 영역은 약 400 bp 내지 약 1000 bp, 예를 들면, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 또는 약 900 bp 내지 약 1000 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 840 bp HS2 영역(예를 들면, 미국 특허 제7,541,179호에 개시된 글로빈 벡터 TNS9에 포함된 HS2 영역)을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 860 bp HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 약 650 bp HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 646 bp HS2 영역(예를 들면, "β87"로서도 공지되어 있는 글로빈 벡터 LentiGlobin™에 포함된 HS2 영역)을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 약 420 bp HS2 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 423 bp HS2 영역(예를 들면, 문헌[Sadelain et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) (1995);92:6728-6732]에 개시된 글로빈 벡터에 포함된 HS2 영역)을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 인핸서 활성을 유지하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 전사를 향상시킬 수 있는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 전사를 향상시키는 능력이 천연 HS2 영역에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 HS2 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 하기 결합 부위들 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 결합 부위들을 포함하는 HS2 영역을 포함하지 않는다: 2개(한 직렬 쌍)의 AP1/NF-E2 결합 부위들(예를 들면, GCTGAGTCA 및 GATGAGTCA), 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위(예를 들면, AGGGTGTGT), 1개의 GATA-1 결합 부위(예를 들면, CTATCT), 및 3개의 E 박스들(CANNTG, 예를 들면, CAGATG 및 CACCTG). 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 전술된 결합 부위들 중 6개의 결합 부위들을 포함하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 예를 들면, 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개의 AP1/NF-E2 결합 부위들, 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위, 1개의 GATA-1 결합 부위, 및 3개가 아니라 2개의 E 박스들을 포함하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개가 아니라 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위, 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위, 1개의 GATA-1 결합 부위 및 3개의 E 박스들을 포함하는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개의 AP1/NF-E2 결합 부위들, 1개의 GATA-1 결합 부위 및 3개의 E 박스들을 포함하고 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위를 포함하지 않는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개의 AP1/NF-E2 결합 부위들, 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질에 대한 1개의 결합 부위 및 3개의 E 박스들을 포함하고 1개의 GATA-1 결합 부위를 포함하지 않는 HS2 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하고, HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역 내의 HS1 영역, HS3 영역 및 HS4 영역은 인접한다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 본질적으로 HS1 영역, HS3 영역 및 HS4 영역으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역과 HS4 영역 사이의 연접부에서 2개의 도입된 GATA-1 결합 부위들을 포함한다. HS3 영역은 HS1 영역과 HS4 영역 사이에 놓일 수 있다.
일부 비제한적 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 22 또는 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다.
한 비제한적 구현예에서, 도 2에 표시된 바와 같이, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다.
한 비제한적 구현예에서, 도 3에 표시된 바와 같이, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다.
한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 코어 서열을 포함하지 않는다. HS1의 코어 서열은 HS1의 활성, 예를 들면, 인핸서 활성, 또는 다른 HS 영역, 예를 들면, HS2 내지 HS4의 인핸서 활성을 조절하기 위한 촉진제 또는 조절 요소로서의 기능을 유지한다. 추가로, HS1의 코어 서열은 GATA-1 및 크루펠-유사 Zn 핑거 단백질(예를 들면, 적혈구-제한된 인자 EKLF)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 편재하는 단백질 및 조직-특이적(예를 들면, 적혈구-특이적) 단백질(예를 들면, 전사 인자)에 대한 하나 이상의 결합 부위 또는 결합 모티프를 포함한다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 코어 서열의 전체 길이를 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, HS1 영역의 코어 서열은 인간 HS1의 코어 서열이다. 한 비제한적 구현예에서, 인간 HS1의 코어 서열은 2개의 GATA-1 결합 부위들(예를 들면, TTATCT 및 CTATCA), 및 EKLF에 대한 1개의 결합 부위(예를 들면, CCACACACA)를 포함한다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 인간 HS1의 286 bp 코어 서열의 전체 길이를 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, 인간 HS1의 286 bp 코어 서열은 이하에 제공된 서열번호 22에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00033
서열번호 22에서, TTATCT의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 173 내지 위치 178에 위치하고, CTATCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 210 내지 위치 215에 위치하고, CCACACACA의 뉴클레오티드 서열을 가진, EKLF에 대한 1개의 결합 부위는 위치 183 내지 위치 191에 위치한다.
또 다른 비제한적 구현예에서, 인간 HS1의 286 bp 코어 서열은 이하에 제공된 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00034
서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 19(진뱅크 접근번호 NG_000007.3)의 뉴클레오티드 위치 21481 내지 위치 21766에 상응한다. 서열번호 23에서, TTATCT의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 173 내지 위치 178에 위치하고, CTATCA의 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 GATA-1 결합 부위는 위치 210 내지 위치 215에 위치하고, CCACACACA의 뉴클레오티드 서열을 가진, EKLF에 대한 1개의 결합 부위는 위치 183 내지 위치 191에 위치한다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 코어 서열을 포함하는 HS1 영역을 포함하지 않는다. HS1의 코어 서열을 포함하는 HS1 영역은 길이 및 서열 면에서 달라질 수 있다. 비제한적 예에서, HS1의 코어 서열을 포함하는 HS1 영역은 약 300 bp 내지 약 1200 bp, 예를 들면, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 약 900 bp 내지 약 1000 bp, 약 1000 bp 내지 약 1100 bp, 또는 약 1100 bp 내지 약 1200 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 약 1.0 kb bp HS1 영역을 포함하지 않는다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 약 1.1 kb HS1 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 활성, 예를 들면, 인핸서 활성, 또는 다른 HS 영역, 예를 들면, HS2 내지 HS4의 인핸서 활성을 조절하기 위한 촉진제 또는 조절 요소로서의 기능을 유지하는 HS1 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 전사를 향상시킬 수 있는 HS1 영역을 포함하지 않는다. 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 전사를 향상시키는 능력이 천연 HS1 영역에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 HS1 영역을 포함하지 않는다. 비제한적 예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS2 내지 HS4 중 하나 이상의 인핸서 활성을 조절하는 능력이 천연 HS1 영역에 비해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 HS1 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 하기 결합 부위들 중 1개, 2개 또는 3개의 결합 부위들을 포함하는 HS1 영역을 포함하지 않는다: 2개의 GATA-1 결합 부위들(예를 들면, TTATCT 및 CTATCA), 및 EKLF에 대한 1개의 결합 부위(예를 들면, CCACACACA). 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 상기 결합 부위들 중 2개의 결합 부위들을 포함하는 HS1 영역을 포함하지 않는다. 예를 들면, 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개의 GATA-1 결합 부위들을 포함하고 EKLF에 대한 1개의 결합 부위를 포함하지 않는 HS1 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 2개가 아니라 1개의 AP1/NF-E2 결합 부위 및 EKLF에 대한 1개의 결합 부위를 포함하는 HS1 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역 내의 HS3 영역 및 HS4 영역은 인접한다. 한 비제한적 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 본질적으로 HS3 영역 및 HS4 영역으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역과 HS4 영역 사이의 연접부에서 2개의 도입된 GATA-1 결합 부위들을 포함한다. HS3 영역은 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 HS4 영역 사이에 놓일 수 있다.
일부 구현예들에서, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는다.
한 비제한적 구현예에서, 도 4에 표시된 바와 같이, β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역, 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하고, β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는다.
글로빈 유전자
본 개시된 보호대상에 따라, 발현 카세트는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 글로빈 유전자는 β-글로빈 유전자, γ-글로빈 유전자 또는 δ-글로빈 유전자일 수 있다. 일부 구현예들에서, 발현 카세트는 인간 β-글로빈 유전자를 포함한다. 본 개시된 보호대상에 따라, 인간 β-글로빈 유전자는 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 또는 하나 이상의 항-겸상화(anti-sickling) 아미노산 잔기를 암호화하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자일 수 있다. 한 비제한적 구현예에서, 본 개시된 발현 카세트는 야생형 인간 β-글로빈 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 개시된 발현 카세트는 코돈 87에서 글루타민으로의 쓰레오닌의 돌연변이(βA-T87Q)를 암호화하는 인간 βA-글로빈 유전자를 포함한다. 감마-글로빈 쇄에서 위치 87에 있는 글루타민 잔기는 베타 쇄의 산소 결합 특성을 보존하면서 베타 쇄에 비해 감마 쇄의 항-겸상화 활성을 증강시킨다(Nagel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1979);76:670-672). 일부 구현예들에서, 글로빈 유전자의 기능성 부분은 상응하는 야생형 기준 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 가진다.
프로모터 및 인핸서
본 개시된 보호대상에 따라, 발현 카세트는 β-글로빈 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 프로모터는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 β-글로빈 LCR 영역 사이에 위치한다. β-글로빈 프로모터의 길이 및 서열은 달라질 수 있다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 프로모터는 약 100 bp 내지 약 1600 bp의 길이, 예를 들면, 약 200 bp 내지 약 700 bp, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 200 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 400 bp, 약 400 bp 내지 약 500 bp, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 약 800 bp 내지 약 900 bp, 약 900 bp 내지 약 1000 bp, 약 1000 bp 내지 약 1100 bp, 약 1100 bp 내지 약 1200 bp, 약 1200 bp 내지 약 1300 bp, 약 1300 bp 내지 약 1400 bp, 약 1400 bp 내지 약 1500 bp, 또는 약 1500 bp 내지 약 1600 bp의 길이를 가진다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 프로모터는 약 130 bp, 약 613 bp, 약 265 bp 또는 약 1555 bp의 길이를 가진 인간 β-글로빈 프로모터이다. 한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 약 613 bp의 길이를 가진 인간 β-글로빈 프로모터이다. 한 비제한적 예에서, 인간 β-글로빈 프로모터는 이하에 제공된 서열번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다:
Figure pct00035
한 구현예에서, β-글로빈 프로모터는 약 265 bp의 길이를 가진 인간 β-글로빈 프로모터이다. 한 비제한적 예에서, 인간 β-글로빈 프로모터는 서열번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다.
Figure pct00036
추가로 또는 대안적으로, 본 개시된 발현 카세트는 인간 β-글로빈 3' 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 업스트림에 위치한다. 일부 구현예들에서, β-글로빈 3' 인핸서는 약 500 bp 내지 약 1000 bp의 길이, 예를 들면, 약 500 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 700 bp, 약 700 bp 내지 약 800 bp, 또는 약 800 bp 내지 약 900 bp의 길이를 가진다. 한 구현예에서, 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 약 879 bp의 길이를 가진다. 일례에서, 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 서열번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진다.
Figure pct00037
나아가, 본 개시된 발현 카세트는 하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시된 발현 카세트는 적혈구-특이적 방식으로 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)의 발현을 가능하게 한다. 적혈구-특이적 인핸서는 적혈구-특이적 방식으로 글로빈 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 적혈구-특이적 인핸서는 비-적혈구 조직에서 인핸서 활성을 결여한다. 구체적으로, 일차적으로 발현 인핸서로서 작용하는 HS2 영역을 결여하는 β-글로빈 LCR 영역의 경우, 하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서의 추가는 HS2 영역의 향상 활성을 보완할 수 있다. 더욱이, 본 개시된 적혈구-특이적 인핸서는 발현 카세트를 포함하는 벡터의 역가를 감소시키거나 경감시키지 않는다. 적혈구-특이적 인핸서의 길이는 달라질 수 있고, 예를 들면, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 100 bp 내지 약 120 bp, 약 120 bp 내지 약 140 bp, 약 140 bp 내지 약 200 bp(예를 들면, 약 140 bp 내지 약 150 bp, 약 150 bp 내지 약 160 bp, 약 160 bp 내지 약 170 bp, 약 170 bp 내지 약 180 bp, 약 180 bp 내지 약 190 bp, 또는 약 190 bp 내지 약 200 bp)일 수 있다. 일부 구현예들에서, 적혈구-특이적 인핸서는 약 140 bp 내지 약 200 bp의 길이를 가진다. 한 비제한적 구현예에서, 적혈구-특이적 인핸서는 이하에 제공된 서열번호 13에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 152 bp의 길이를 가진다:
Figure pct00038
한 비제한적 구현예에서, 적혈구-특이적 인핸서는 이하에 제공된 서열번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 157 bp의 길이를 가진다:
Figure pct00039
한 비제한적 구현예에서, 적혈구-특이적 인핸서는 이하에 제공된 서열번호 15에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 141 bp의 길이를 가진다:
Figure pct00040
한 비제한적 구현예에서, 적혈구-특이적 인핸서는 이하에 제공된 서열번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 171 bp의 길이를 가진다:
Figure pct00041
한 비제한적 구현예에서, 적혈구-특이적 인핸서는 이하에 제공된 서열번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 195 bp의 길이를 가진다:
Figure pct00042
적혈구-특이적 인핸서는 본 기술분야에서 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 확인될 수 있고 결정될 수 있다. 적혈구-특이적 인핸서는 β-글로빈 LCR 영역의 3' LTR(다운스트림) 또는 5' LTR(다운스트림)에 위치할 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서는 β-글로빈 LCR 영역의 5' LTR, 예를 들면, HS3 영역의 업스트림에 위치한다. 발현 카세트는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 적혈구-특이적 인핸서들을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 발현 카세트는 1개의 적혈구-특이적 인핸서를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 2개의 적혈구-특이적 인핸서들을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트는 3개의 적혈구-특이적 인핸서들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 발현 카세트는 4개의 적혈구-특이적 인핸서들을 포함한다. 비제한적 구현예에서, 발현 카세트는 5개의 적혈구-특이적 인핸서들을 포함한다.
인슐레이터
본 개시된 보호대상에 따라, 발현 카세트는 전술된 인슐레이터들 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예들에서, 본 개시된 발현 카세트는 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 하나 이상의 인슐레이터, 예를 들면, 서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터, 예컨대, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 인슐레이터(즉, 인슐레이터 A1)(그러나, 이들로 한정되지 않음)를 포함한다. 다양한 비제한적 구현예들에서, 인슐레이터는 세포 게놈 내로 삽입되는 본 개시된 발현 카세트의 영역 내의 LTR들 중 하나 또는 둘 다 또는 다른 부위 내로 도입될 수 있거나 삽입될 수 있다. 한 구현예에서, 인슐레이터는 발현 카세트의 3' 말단에 위치한다. 한 구현예에서, 인슐레이터는 발현 카세트의 5' 말단에 위치한다. 한 구현예에서, 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 2개의 인슐레이터들을 포함하고, 이때 한 인슐레이터는 3' 말단에 위치하고 나머지 인슐레이터는 발현 카세트의 5' 말단에 위치한다.
본 개시된 인슐레이터는 강력한 인핸서 차단 활성을 가진다. 일부 구현예들에서, 인슐레이터는 인핸서 차단 활성 이외에 장벽 활성도 가진다. 본 개시된 인슐레이터는 삽입적 돌연변이유발의 위험 및 바이러스 벡터와 관련된 유전독성을 실질적으로 감소시킨다. 나아가, 본 개시된 인슐레이터가 벡터 내로 도입될 때, 상기 인슐레이터는 벡터의 바이러스 역가에 불리하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예들에서, 인슐레이터(예를 들면, 인슐레이터 A1)는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 생체내 발현을 증가시킨다.
한정이 아니라 예시를 목적으로, 도 1 내지 4는 본 개시된 보호대상의 일부 구현예들에 따른 예시적 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다. 도 1은 860 bp HS2 영역(예를 들면, 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역), 1301 bp HS3 영역(예를 들면, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역), 및 1065 bp HS4 영역(예를 들면, 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역)을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 인간 βA-T87Q 글로빈 유전자를 포함하는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 2는 본 개시된 보호대상의 한 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 한 예시적 재조합 벡터를 보여준다. 도 2는 1.1 kb HS1 영역(예를 들면, 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역), 1301 bp HS3 영역(예를 들면, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역), 및 1065 bp HS4 영역(예를 들면, 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역)을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 인간 βA-T87Q 글로빈 유전자를 포함하는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 3은 본 개시된 보호대상의 한 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 한 예시적 재조합 벡터를 보여준다. 도 3은 602 bp HS1 영역(예를 들면, 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS1 영역), 1301 bp HS3 영역(예를 들면, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역), 및 446 bp HS4 영역(예를 들면, 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역)을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 인간 βA-T87Q 글로빈 유전자를 포함하는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다.
도 4는 본 개시된 보호대상의 한 구현예에 따른 발현 카세트를 포함하는 한 예시적 재조합 벡터를 보여준다. 도 4는 1301 bp HS3 영역(예를 들면, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역), 및 1065 bp HS4 영역(예를 들면, 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역)을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 인간 βA-T87Q 글로빈 유전자를 포함하는 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 보여준다. 도 4에 표시된 발현 카세트는 하기 5개의 적혈구-특이적 인핸서들(도 4에서 "EE5"로서 표시됨)도 포함한다: 서열번호 13에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 적혈구-특이적 인핸서, 서열번호 14에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 적혈구-특이적 인핸서, 서열번호 15에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 적혈구-특이적 인핸서, 서열번호 16에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 적혈구-특이적 인핸서, 및 서열번호 17에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 1개의 적혈구-특이적 인핸서.
도 1 내지 4에 표시된 바와 같이, 발현 카세트들 각각은 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 인슐레이터(즉, 인슐레이터 A1)를 포함한다. 추가로, 도 1 내지 4에 표시된 바와 같이, 발현 카세트들 각각은 인간 β-글로빈 유전자의 업스트림에 위치하는 879 bp 인간 β-글로빈 3' 인핸서를 포함한다. 나아가, 도 1 내지 4에 표시된 바와 같이, 발현 벡터들 각각은 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)(예를 들면, 3' LTR 내의 R 영역에 대해 3')에서 우드척 간염 후-조절 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
III. 벡터, 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템
본 개시된 보호대상은 전술된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 전달 시스템(예를 들면, 비-천연 생성 또는 조작된 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템)을 제공한다. 상기 벡터 및 전달 시스템은 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈)를 광범위한 표적 세포들의 게놈 내로 안정하게 도입하여 상기 세포에서 글로빈 단백질(인간 β-글로빈 단백질)의 발현을 증가시키는 데 적합한 전달 비히클이다.
일부 구현예들에서, 벡터는 전술된 발현 카세트를 숙주 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포 또는 조혈발생 내피 세포)의 게놈 내로 도입하거나 형질도입하는 데 사용되는 레트로바이러스(예를 들면, 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스) 벡터이다. 일부 구현예들에서, 레트로바이러스 벡터는 전술된 인슐레이터들 중 하나, 예를 들면, 인슐레이터 A1을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 인슐레이터는 발현 카세트의 3' 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 한 구현예에서, 인슐레이터는 발현 카세트의 3' 말단에 위치한다. 역전사 및 벡터 삽입 동안, 3' 말단에 위치하는 인슐레이터는 발현 카세트의 5' 말단 내로 카피된다. 생성된 위상기하학(topology)은 삽입된 바이러스의 5' LTR 및 3' LTR에 위치한 게놈 영역들 사이에 인슐레이터의 카피를 배치하고 5' LTR 및 내부 팩키지 프로모터로부터의 인핸서 활성을 함유하지만, 3' LTR에서 인핸서를 함유하지 않는다. 이 위상기하학은 유전독성을 감소시킴으로써, 종양 형성을 감소시킬 수 있고 동물 생존을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 재조합 벡터는 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)(예를 들면, 벡터의 3' LTR 내의 R 영역에 대해 3')에서 우드척 간염 후-조절 요소(WPRE)를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 재조합 벡터는 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)(예를 들면, 벡터의 3' LTR 내의 R 영역에 대해 3')에서 WPRE 이외에 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호도 포함한다. 치료 글로빈 벡터의 본질적인 특징은 환자 세포의 효과적인 형질도입에 충분한 높은 역가를 달성하는 것이다. 글로빈 렌티바이러스 벡터들은 유전자, 프로모터, 인핸서 및/또는 LCR 요소를 포함하는 그들의 큰 적하물 때문에, 그들의 제조를 복잡하게 하고 그들의 임상 용도를 한정하는 낮은 역가라는 문제점을 본질적으로 가진다. 이 문제점은 벡터의 크기를 더 증가시키는, 추가 유전적 요소, 예컨대, 인슐레이터의 도입에 의해 더 악화된다. WPRE는 재조합 벡터의 역가를 증가시킬 수 있다. WPRE에의 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호의 추가는 재조합 벡터의 역가를 더 증가시킬 수 있다. 일부 구현예들에서, WPRE 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호는 발현 카세트 내에 포함되지 않으므로, 재조합 벡터로 형질도입된 세포에게 전달되지 않는다. 글로빈 렌티바이러스 벡터의 생성을 향상시키기 위한 이들 요소들의 도입은 보다 높은 역가의 제공 및 이로써 본원에 기재된 벡터의 임상 유용성에 필수적이다.
한 비제한적 예에서, 본 개시된 발현 카세트는 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현은 그의 내생성 프로모터, 레트로바이러스 긴 말단 반복부 또는 대안적 내부 프로모터로부터 유도될 수 있다. 레트로바이러스 벡터와 적절한 팩키징 라인의 조합물도 적합하고, 이때 캡시드 단백질은 인간 세포를 감염시키는 데 작용할 것이다. PA12(Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317(Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); 및 CRIP(Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 암포트로픽(amphotropic) 바이러스 생성 세포주들이 공지되어 있다. 비-암포트로픽 입자, 예를 들면, VSVG, RD114 또는 GALV 외피로 슈도타이핑된 입자 및 본 기술분야에서 공지된 임의의 다른 입자도 적합하다.
적합한 형질도입 방법은 예를 들면, 문헌(Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422)의 방법에 의한 세포와 생산자 세포의 직접적인 공-배양, 또는 예를 들면, 문헌(Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; and Hughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817)의 방법으로 적절한 성장 인자 및 다가양이온을 갖거나 갖지 않는 바이러스 상청액 단독 또는 농축된 벡터 스톡(stocks)을 사용하는 배양도 포함한다.
형질도입 바이러스 벡터는 숙주 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도된 다분화능 줄기 세포)에서 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)를 발현하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 벡터는 고효율의 감염 및 안정한 삽입 및 발현을 나타낸다(예를 들면, 문헌[Cayouette et al., Human Gene Therapy (1997);8:423-430]; 문헌[Kido et al., Current Eye Research (1996);15:833-844]; 문헌[Bloomer et al., Journal of Virology (1997);71:6641-6649]; 문헌[Naldini et al., Science (1996);272:263-267]; 및 문헌[Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997] 참조). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 예를 들면, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스, 소 파필로마 바이러스 또는 헤르페스 바이러스, 예컨대, 엡스테인-바 바이러스를 포함한다(예를 들면, 문헌[Miller, Human Gene Therapy (1990);15-14]; 문헌[Friedman, Science (1989);244:1275-1281]; 문헌[Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988]; 문헌[Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology (1990);1:55-61]; 문헌[Sharp, The Lancet (1991);337:1277-1278]; 문헌[Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology (1987)36:311-322]; 문헌[Anderson, Science (1984);226:401-409]; 문헌[Moen, Blood Cells (1991);17:407-416]; 문헌[Miller et al., Biotechnology (1989);7:980-990]; 문헌[Le Gal La Salle et al., Science (1993);259:988-990]; 및 문헌[Johnson, Chest (1995);107:77S-83S]의 벡터들도 참조). 레트로바이러스 벡터가 특히 잘 개발되어 있고 임상 환경에서 사용되고 있다(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med (1990);323:370; Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호).
효율적인 전달 및 삽입을 위한 요건은 레트로바이러스 벡터가 본 개시된 발현 카세트를 형질도입하는 데 적합하게 만든다. 레트로바이러스 벡터는 레트로비리대(retroviridae)의 3개 속들로부터 유도될 수 있다: γ-레트로바이러스(C-형 뮤린 레트로바이러스 또는 온코레트로바이러스로서도 공지되어 있음), 렌티바이러스 및 스푸마바이러스(포말 바이러스로서도 공지되어 있음). 복제-결함 레트로바이러스 입자의 생성을 위한 분자적 방법을 상세히 설명하는 여러 문헌들이 입수가능하다(Cornetta et al. (2005); Cockrell & Kafri (2007)). 치료 전이유전자 또는 cDNA를 암호화하는 벡터 그 자체는 팩키징 세포주에서의 바이러스 입자의 팩키징, 역전사 및 삽입을 가능하게 하는 데 필요한 최소한의 바이러스 서열을 보유한다. 팩키징 세포는 벡터 서열, 및 형질도입된 세포에서 그의 역전사 및 삽입에 필요한 기구를 함유하는 감염성 재조합 입자를 조립하는 데 요구되는 필수적인 구조 단백질들 및 효소들을 발현한다.
모든 레트로바이러스 벡터 유형들의 제조 양태가 동일한 일반적 원리를 따르지만, γ-레트로바이러스, 렌티바이러스 및 스푸마바이러스 벡터는 그들의 고유한 생물학적 성질들 중 일부에서 상이하다. 원형 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)를 포함하는 감마-레트로바이러스는 많은 세포 유형들을 효과적으로 감염시키지만, 감염 후 즉시 S 기로 진행하지 않는 세포에서 삽입될 수 없다. 대조적으로, 렌티바이러스들 및 이들의 벡터 유도체들은 핵으로 전위하고 세포 분열의 부재 시 삽입되는 그들의 능력 때문에(Lewis & Emerman, 1994; Goff, 2001) 비-분열 세포를 형질도입할 수 있다(Follenzi & Naldini, 2002; Salmon & Trono, 2002). 렌티바이러스 벡터들의 또 다른 근본적인 특성은 글로빈 렌티바이러스 벡터에 대해 확립된 바와 같이(May et al., 2000) 그들의 상대적인 게놈 안정성이고, 이것은 MLV-기반 글로빈 벡터의 게놈 불안정성과 대비된다(Leboulch et al., 1994; Sadelain et al., 1995). 렌티바이러스 및 포말 벡터는 보다 더 우수한 팩키징 성능도 제공한다(Kumar et al., 2001; Rethwilm, 2007). 모든 3종의 벡터 유형들이 사이토카인에 의해 활성화된 HSC들의 형질도입을 위해 성공적으로 사용되고 있다(Miyoshi et al., 1999; Josephson et al., 2002; Leurs et al., 2003).
이들 3종의 벡터 시스템들은 그들의 삽입 패턴들에서 상이하다. 레트로바이러스의 삽입 패턴은 준무작위적(semi-random)이고 모든 삽입 사건들의 대략 3분의 2에서 유전자들 및 이들의 주변을 향해 편향되어 있다(Schroder et al., 2002; Wu et al., 2003; Mitchell et al., 2004; De Palma et al., 2005; Trobridge et al., 2006). 그러나, 이들의 정확한 분포에서 미묘한 및 가능하게는 유의한 차이가 있다. 감마-레트로바이러스는 전사된 유전자의 업스트림에서 삽입되는 경향을 가진 반면, 렌티바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 전체 전사된 유전자 서열을 표적화한다. 포말 벡터는 유전자내 삽입의 경향이 더 낮은 듯하다(Trobridge et al., 2006). 한 구현예에서, 발현 카세트를 포함하는 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 상기 벡터는 인간 면역결핍-1(HIV-1), 인간 면역결핍-2(HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 젬브라나(Jembrana) 질환 바이러스(JDV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV) 등으로부터 유래될 수 있다. 한 비제한적 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV 벡터이다. HIV-기반 구축물은 인간 세포의 형질도입 시 가장 효율적이다.
벡터 삽입의 준무작위적 패턴은 벡터가 인접 종양유전자를 트랜스-활성화시킬 때 환자를 삽입적 종양형성의 위험에 노출시킨다. 이것은 클론 증폭(Ott et al., 2006; Cavazzana-Calvo et al., 2010), 골수이형성증(Stein et al., 2010) 또는 백혈병(Hacein-Bey-Abina et al., 2003, 2008; Howe et al., 2008)을 초래할 수 있다. 비-천연 생성 또는 조작된 뉴클레아제(징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)를 포함하나 이들로 한정되지 않음) 또는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하는 표적화된 유전자 전달 방법은 레트로바이러스 벡터의 사용에 본질적인 삽입적 종양형성이라는 우려를 감소시킬 수 있거나 심지어 제거할 수 있다.
진핵 세포는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)에 반응하여 2종의 상이한 DNA 복구 기작들을 이용한다: 상동성 재조합(HR) 및 비-상동성 말단-연결(NHEJ). HR 복구 기구의 활성화는 세포 주기 상태에 의해 좌우되고, S 및 G2 기로 제한되고; 대조적으로, NHEJ 경로는 세포 주기 전체에서 활성 상태이다. 기작적으로, HR은 손상된 DNA 가닥을 복구하기 위해 상동성 주형을 요구하기 때문에 오류-부재 DNA 복구 기작이다. 다른 한편으로, NHEJ는 DNA 절단 부위에서 삽입 또는 결실을 유발하는 복구 동안의 DNA 말단 프로세싱으로 인해 부정확한 주형 독립적 복구 기작이다(Moynahan & Jasin, 2010). HR은 그의 상동성-기반 기작 때문에 상이한 종들의 게놈을 부위-특이적으로 조작하기 위한 수단으로서 사용되고 있다. 치료적 관점에서 볼 때, HR은 돌연변이된 유전자를 복구하는 데 성공적으로 사용되고 있으므로, 단일유전자성(monogenic) 질환의 세포-매개된 치료를 위한 기대되는 방법을 제공한다(Porteus et al., 2006).
HR에 의한 유전자 표적화는 관심있는 전이유전자/표적 부위를 플랭킹하는 2개의 상동성 아암들의 사용을 요구한다. 일반적으로, 표준 플라스미드 DNA들은 양성 선택 및 음성 선택을 위해 전이유전자와 함께 5 내지 10 kb의 상동성 아암을 전달하는 데 사용되고 있다. 이 방법은 마우스 배아 줄기(mES) 세포에서 유전자의 넉-아웃(knock-out)/넉-인(knock-in)에 통상적으로 사용된다(Capecchi, 2005; 도 2B). 인간 세포에서, 이 방법의 이용은 mES 세포에서의 효율보다 더 낮고 치료적으로 실용적이지 않은 대략 10-6의 효율로 유전자 표적화를 허용하였다. 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 사용하여 표적 부위에서 DNA-이중 가닥 절단(DSB)을 도입하여 HR 효율을 증가시킴으로써, 정확한 유전자 표적화를 1,000배 이상 증가시킬 수 있다(Jasin, 1996). 이 현상의 발견은 상이한 종들의 게놈에서 부위-특이적 DSB를 생성하는 방법의 개발을 촉진하였다. 지난 십년에 걸쳐 이 목적을 위해 다양한 키메라 효소들, 즉 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가뉴클레아제 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)가 설계되었다.
ZFN은 ZF-기반 DNA 결합 도메인(DBD) 및 FokI 뉴클레아제 도메인을 함유하는 모듈식 키메라 단백질이다(Porteus & Carroll, 2005). DBD는 통상적으로 3-염기쌍 특이성을 각각 가진 3개의 ZF 도메인들로 구성되고; FokI 뉴클레아제 도메인은 2개의 플랭킹 ZFN들에 의해 표적화되는 DNA 닉킹(nicking) 활성을 제공한다. DBD의 모듈식 성질 때문에, 원칙적으로 게놈 내의 임의의 부위가 표적화될 수 있다. 그러나, 단일 ZFN이 DNA에 결합할 수 있고 DNA를 닉킹할 수 있기 때문에, 삽입/결실을 도입할 수 있거나 비-특이적 방식으로 표적화 벡터를 삽입할 수 있는 NHEJ 경로의 활성화를 야기하는, 다수의 탈-표적(off-target) 효과에 대한 잠재력이 있다. 이종이량체를 형성할 때에만 그들 각각의 DNA 가닥을 닉킹할 수 있는 필수적인 FokI 도메인들은 최근에 보고되었다(Doyon et al., 2011). 이러한 필수적인 ZFN들의 사용은 이 방법의 유전독성 효과를 감소시킬 수 있다.
메가뉴클레아제(MN)/귀소 엔도뉴클레아제(HE)는 진핵 게놈에서 낮은 절단 빈도로 큰 DNA 부위(14-40 bp)를 인식하고 절단하는 dsDNA 뉴클레아제이다(Paques & Duchateau, 2007). 이것은 잠재적인 표적 부위를 한정하지만, MN-DNA 구조물은 MN 특이성을 바꾸기 위해 DNA-상호작용 잔기를 특이적으로 변경시키기 위한 가이드로서 사용되고 있다(Marcaida et al., 2010). I-CreI는 인간 XPC 및 RAG1 유전자를 표적화하는 키메라 메가뉴클레아제를 생성하도록 성공적으로 조작되었고, 분명한 유전독성 없이 포유동물 세포에서 HR 활성을 자극하는 것으로 밝혀졌다(Redondo et al., 2008; Grizot et al., 2009). 이 방법의 유전독성은 ZFN 및 TALE 뉴클레아제의 유전독성과 비교될 필요가 있을 것이다.
TALEN은 DBD가 식물병원성 세균에 의해 사용되는 병독성 인자인 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE)로부터 유래된다는 점을 제외하고 ZFN과 유사하다(Herbers, 1992). TALE DBD는 모듈식이고 34-잔기 반복부로 구성되고, 그의 DNA 특이성은 반복부의 수 및 순서에 의해 결정된다(Herbers, 1992). 각각의 반복부는 2개의 잔기만을 통해 표적 서열에서 단일 뉴클레오티드에 결합한다(Boch, 2011). ZFN 기술에 비해 장점은 DBD의 빠른 구축이다.
다수의 연구들이 이들 키메라 효소들을 사용하여 그들의 표적 부위에서 유전자 추가 또는 유전자 복구를 위한 HR을 자극하였다(Paques & Duchateau, 2007; Urnov et al., 2010). 포르테우스(Porteus)는 겸상 세포 돌연변이 뉴클레오티드를 둘러싸는 인간 HBB로부터 절반 부위 서열에 대한 ZFN을 디자인하였다(Porteus, 2006). 이 ZFN은 상기 서열을 표적화하고 Zif268 결합 부위를 표적화하는 ZFN과 조합될 때 키메라 DNA 표적에서 HR을 자극한다. 제대혈 CD34+ 세포에서 유전자를 표적화하는 데 있어서 최근에 진보가 있었다. CCR5 유전자를 표적화하기 위해 이들 세포들에서 ZFN 및 공여자 DNA를 전달하기 위한 비-삽입 렌티바이러스의 사용은 문헌(Lombardo et al., 2007)에 보고되었다. 문헌(Lombardo et al., 2007)은 양성적으로 선택된 세포의 80%에서 정확한 표적화와 함께 이 좌위에서의 유전자 추가를 보여주었다.
최근에 개시된 보호대상은 전술된 바와 같이 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 비-천연 생성 또는 조작된 뉴클레아제를 제공한다. 적합한 뉴클레아제는 ZFN, 메가뉴클레아제 및 TALEN을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 개시된 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인을 포함한다. 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 선택된 서열, 예를 들면, 소정의 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA 결합 도메인은 천연 생성 뉴클레아제에 비해 상이한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적인 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 임의의 적합한 절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 작동가능하게 연결되어 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 예를 들면, 징크-핑거 단백질(ZFP) DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 절단 도메인에 융합되어, 그의 조작된 ZFP DNA 결합 도메인을 통해 그의 의도된 핵산 표적을 인식할 수 있고 DNA가 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위 근처에서 절단되게 할 수 있는 ZFNs-a 기능성 물질을 생성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kim et al. Proc Nat'l Acad Sci USA (1996);93(3):1156-1160]을 참조한다. 마찬가지로, TALE DNA 결합 도메인은 뉴클레아제 절단 도메인에 융합되어 TALEN을 생성할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공보 제20110301073호를 참조한다.
절단 도메인은 DNA 결합 도메인에 대한 이종성을 가질 수 있다(예를 들면, 메가뉴클레아제 DNA 결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인). 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인의 기원이 될 수 있는 예시적 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 문헌[2002-2003 Catalog, New England Biolabs, Beverly, Mass.]; 및 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가 효소는 공지되어 있다(예를 들면, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 또한 참조). 이들 효소들(또는 이들의 기능성 영역들) 중 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 요구하는 상기 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우 2개의 융합 단백질들이 절단을 위해 요구된다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인들을 포함하는 단일 도메인이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인들은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 부분)로부터 유래될 수 있거나, 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 부분)로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예들에서, 뉴클레아제는 전술된 인슐레이터들 중 2개의 인슐레이터들, 예를 들면, 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 2개의 인슐레이터들을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 상기 2개의 인슐레이터들 중 하나는 발현 카세트의 3' 말단에 위치하고, 나머지 인슐레이터는 발현 카세트의 5' 말단에 위치한다.
본 개시된 보호대상은 상기 발현 카세트를 포함하는 비-천연 생성 또는 조작된 CRISPR-Cas 시스템도 제공한다. CRISPR(밀집된 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))-Cas (CRISPR 관련) 시스템은 게놈 조작을 위해 사용될 수 있는 세균 시스템을 기반으로 하는 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이것은 많은 세균들 및 고세균들의 후천성 면역 반응의 부분을 기반으로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 세균을 침입할 때, 침입자의 DNA의 분절은 "면역" 반응에 의해 CRISPR RNA(crRNA)로 전환된다. 그 다음, crRNA는 부분적 상보성의 영역을 통해 tracrRNA로서 지칭되는 또 다른 유형의 RNA와 회합하여, CRISPR-Cas 뉴클레아제를 "프로토 스페이서"로서 지칭되는 표적 DNA에서 crRNA와 상동한 영역으로 안내한다. CRISPR-Cas 뉴클레아제는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위에서 DSB에서 블런트 말단을 생성하도록 DNA를 절단한다. CRISPR-Cas 뉴클레아제는 부위-특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 요구한다. 이 시스템은 crRNA 및 tracrRNA가 한 분자("단일 가이드 RNA")로 조합될 수 있도록 조작되어 있고; 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가 부분은 CRISPR-Cas 뉴클레아제를 안내하여 임의의 원하는 서열을 표적하도록 조작될 수 있다(문헌[Jinek et al., Science (2012);337:816-821] 참조). 따라서, CRISPR-Cas 시스템은 게놈 내의 원하는 표적에서 DSB를 생성하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예들에서, CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR-Cas 뉴클레아제 및 단일 가이드 RNA를 포함한다. CRISPR-Cas 뉴클레아제의 적합한 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로서도 공지되어 있음), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변경된 버전들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이들 CRISPR-Cas 뉴클레아제들은 공지되어 있고; 예를 들면, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 접근번호 Q99ZW2 하에 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 일부 구현예들에서, CRISPR-Cas 뉴클레아제는 DNA 절단 활성, 예를 들면, Cas9를 가진다. 일부 구현예들에서, CRISPR-Cas 뉴클레아제는 Cas9이다. CRISPR-Cas 뉴클레아제는 표적 서열의 위치(예를 들면, 게놈 세이프 하버 부위)에서 가닥들 중 하나 또는 둘 다를 직접적으로 절단할 수 있다. 추가로, CRISPR-Cas 뉴클레아제는 표적 서열의 첫 번째 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 50개, 100개, 200개 또는 500개 이상의 염기쌍들 내에서 가닥들 중 하나 또는 둘 다를 직접적으로 절단할 수 있다.
본 개시된 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템은 발현 카세트의 표적화된 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예들에서, 본 개시된 CRISPR-Cas 시스템 또는 본 개시된 뉴클레아제의 DNA 결합 도메인은 게놈 세이프 하버 부위에 결합한다. 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템은 게놈 세이프 하버 부위에서 이중 가닥 절단을 생성한다. 게놈 세이프 하버 부위는 숙주 세포 또는 유기체에 불리한 영향을 미치지 않으면서 새로 삽입된 DNA의 예측가능한 발현을 수용할 수 있는 인간 게놈의 유전자내 또는 유전자외적 영역이다. 유용한 세이프 하버는 원하는 수준의 벡터-코딩된 단백질 또는 비-코딩 RNA를 제공하기에 충분한 전이유전자 발현을 허용해야 한다. 게놈 세이프 하버 부위는 세포가 악성 형질전환에 취약하지 않게 해야 하고 세포 기능도 변경시키지 않아야 한다. 게놈 세이프 하버 부위를 확인하는 방법은 전체로서 참고로 도입되는 문헌[Sadelain et al., "Safe Harbours for the integration of new DNA in the human genome," Nature Reviews (2012);12:51-58; Papapetrou et al., "Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells" Nat Biotechnol. (2011) Jan;29(1):73-8]에 기재되어 있다. 본 개시된 게놈 세이프 하버 부위는 하기 5개의 기준들 중 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)을 충족시킨다: (ⅰ) 임의의 유전자의 5' 말단(예를 들면, 유전자의 5' 말단)으로부터 적어도 50 kb의 거리, (ⅱ) 임의의 암 관련 유전자로부터 적어도 300 kb의 거리, (ⅲ) (천연 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 DNA 절단에 의해 측정된) 개방된/접근가능한 염색질 구조 내부에 위치, (ⅳ) 유전자 전사 유닛 외부에 위치, 및 (ⅴ) 인간 게놈의 초보존된 영역(UCR), microRNA 또는 긴 비-코딩 RNA 외부에 위치. 가장 흔한 삽입적 종양형성 사건은 인접 종양-촉진 유전자들의 트랜스활성화이기 때문에, 처음 2개 기준들은 유전자, 특히 인간 암에 기능적으로 관여된 유전자 또는 모델 유기체에서 암에 관여된 유전자의 인간 상동체인 암 관련 유전자의 프로모터 근처에 위치한 인간 게놈의 부분을 배제한다. miRNA 유전자에의 인접성은 miRNA가 세포 증식 및 분화를 포함하는 많은 세포 과정들의 조절에 관여하기 때문에 한 배제 기준이다. 전사 유닛 내의 벡터 삽입은 종양 억제제 유전자의 기능 상실 또는 비정상적으로 스플라이싱된 유전자 생성물의 생성을 통해 유전자 기능을 파괴할 수 있기 때문에, 네 번째 (ⅳ) 기준은 전사된 유전자 내부에 위치하는 모든 부위들을 배제한다. 다수의 척추동물들에 걸쳐 고도로 보존되어 있고 인핸서 및 엑손이 풍부한 것으로 공지되어 있는 영역인 UCR, 및 긴 비-코딩 RNA도 배제된다. 일부 구현예들에서, 게놈 세이프 하버 부위는 유전자외적 게놈 세이프 하버 부위이다. 일부 구현예들에서, 게놈 세이프 하버 부위는 염색체 1 상에 위치한다.
본 개시된 보호대상은 전술된 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 전술된 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 전술된 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 전술된 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 제공한다.
뉴클레아제 및 이 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 CRISPR-Cas 시스템 및 이 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 수단에 의해 생체내 또는 생체외 전달될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템은 상기 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포, 또는 조혈발생 내피 세포)에게 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터(예를 들면, γ-레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 포말 바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 아데나 관련 바이러스 벡터 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 전술된 뉴클레아제 또는 전술된 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 특정 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 비-삽입 렌티바이러스 벡터이다. 비-삽입 렌티바이러스 벡터의 예는 문헌[Ory et al. (1996) Proc. Natl. A cad. Sci. USA 93:11382-11388]; 문헌[Dull et al., (1998) J. Viral.72:8463-8471]; 문헌[Zuffery et al. (1998) J. Viral. 72:9873-9880]; 문헌[Follenzi et al., (2000) Nature Genetics 25:217-222]; 및 미국 특허출원 공보 제2009/054985호에 기재되어 있다.
추가로, 비-바이러스 방법도 세포에서 글로빈 유전자를 발현시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 리포펙션의 존재 하에서 핵산의 투여 (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리라이신(asialoorosomucoid-polylysine) 접합(Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989), 또는 수술적 조건 하에서의 마이크로-주입(Wolff et al., Science 247:1465, 1990)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원생동물 융합을 이용한 시험관내 형질감염을 포함한다. 리포좀도 DNA를 세포 내로 전달하는 데 잠재적으로 유리할 수 있다. 대상체의 영향받은 조직 내로의 정상 유전자의 이식도 정상 핵산을 생체외에서 배양가능한 세포 유형(예를 들면, 자가 또는 이종 일차 세포 또는 이의 자손) 내로 전달함으로써 달성될 수 있고, 그 후 상기 세포(또는 그의 자손)는 표적화된 조직 내로 주입되거나 전신적으로 주입된다. 트랜스포자제(transposases)를 사용하여 재조합 수용체도 유도할 수 있거나 수득할 수 있다. 일시적 발현은 RNA 전기천공에 의해 수득될 수 있다.
Ⅳ. 세포
세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포, 및 조혈발생 내피 세포)의 유전적 변경은 실질적으로 균질한 세포 조성물을 재조합 DNA 또는 RNA 구축물(예를 들면, 전술된 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 전달 시스템)로 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 본 개시된 보호대상은 전술된 발현 카세트로 형질도입된 세포, 전술된 벡터로 형질도입된 세포, 전술된 뉴클레아제 또는 이 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질도입된 세포, 및 전술된 CARISPR-Cas 시스템 또는 이 CARISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질도입된 세포(이들은 "형질도입된 세포"로서 총칭됨)를 제공한다. 전술된 바와 같이, 상기 벡터, 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템은 발현 카세트를 세포 내로 형질도입하여 글로빈 유전자(예를 들면, 인간 β-글로빈 유전자)를 발현시키는 데 사용된다. 일부 구현예들에서, 형질도입된 세포는 조혈 질환, 장애 또는 상태를 치료하고/하거나 예방하기 위해 대상체에게 투여된다. 본 개시된 인슐레이터는 세포 내로의 발현 카세트의 형질도입의 효율을 향상시킬 수 있다.
적합한 형질도입된 세포는 줄기 세포, 조상 세포 및 분화된 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조상" 또는 "조상 세포"는 자가-재생하고 더 성숙한 세포로 분화하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 조상 세포는 다분화능 줄기 세포 및 분화다능성 줄기 세포에 비해 감소된 효능을 가진다. 많은 조상 세포들이 단일 계통을 따라 분화하지만, 꽤 광범위한 증식 능력도 가질 수 있다.
일부 구현예들에서, 형질도입된 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 생체내 특정 생물학적 적소에 투여될 때 적절한 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진다. 줄기 세포는 (1) 장기간 자가-재생할 수 있거나 원래의 세포의 하나 이상의 동일한 카피를 생성할 수 있고, (2) 단일 세포 수준에서 다수의 전문화된 세포 유형 및 일부 경우 단지 하나의 전문화된 세포 유형으로 분화할 수 있고, (3) 생체내에서 조직을 기능적으로 재생시킬 수 있는 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 그들의 발달 잠재력에 따라 분화전능성, 다분화능, 분화다능성 및 올리고/단분화능으로서 하위-분류된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다분화능"은 신체 또는 체세포(즉, 적절한 배아)의 모든 계통들을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들면, 배아 줄기 세포는 3종의 배엽들, 즉 외배엽, 중배엽 및 내배엽 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 다분화능 줄기 세포의 일종이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화다능성"은 한 계통의 다수의 세포 유형들을 형성하는 성체 줄기 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포는 혈액 세포 계통의 모든 세포들, 예를 들면, 림프 및 골수 세포들을 형성할 수 있다.
일부 구현예들에서, 형질도입된 세포는 배아 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 제대 줄기 세포, 태반 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 심장 줄기 세포, 신장 줄기 세포 및/또는 조혈 줄기 세포이다. 한 구현예에서, 형질도입된 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. HSC는 유기체의 수명에 걸쳐 성숙 혈액 세포의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 수임(committed) 조혈 조상 세포(HPC)를 발생시킨다. 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 골수(예를 들면, 단핵세포 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포) 및 림프 계통(예를 들면, T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함하는, 유기체의 모든 혈액 세포 유형들을 발생시키는 분화다능성 줄기 세포를 지칭한다. 조혈 줄기 세포 및 조상 세포는 치사량의 방사선을 조사받은 동물 또는 인간 내로 이식될 때 적혈구, 호중구-대식세포, 거핵세포 및 림프 조혈 세포 풀을 재증식시킬 수 있다.
HSC는 골수, 제대혈 또는 말초혈로부터 단리될 수 있거나 채취될 수 있다. HSC는 특정 표현형적 또는 유전형적 마커들에 따라 확인될 수 있다. 예를 들면, HSC들은 그들의 작은 크기, 계통(lin) 마커의 결여, 생염료(vital dye), 예컨대, 로다민 123(롤로(rholo)로서도 지칭되는 로다민DULL) 또는 헥스트(Hoechst) 33342를 사용한 낮은 염색(부집단), 및 그들의 표면 상의 다양한 항원성 마커들(이들 중 대다수는 분화 시리즈(예를 들면, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, Terl 19, 및 c-kit, 줄기 세포 인자에 대한 수용체)의 클러스터에 속함)의 존재에 의해 확인될 수 있다. 한 구현예에서, 형질도입된 세포는 CD34+ HSC이다.
한 구현예에서, 형질도입된 세포는 배아 줄기 세포이다. 또 다른 구현예에서, 형질도입된 세포는 유도된 다분화능 줄기 세포이다. 또 다른 구현예에서, 형질도입된 세포는 조혈발생 내피 세포이다.
HSC들은 장기간 조혈을 회복시키기 위한 천연 비히클이지만, 이들의 사용은 일부 중요한 한계들을 가진다. 첫 번째는 채취된 세포 생성물이 너무 작을 때 궁극적으로 자가 HSC 요법을 불가능하게 할 수 있는 그들의 상대적인 부족이다. 두 번째는 성체 HSC들이 시험관내에서 복제될 수 없기 때문에 생물안전성 검사, 예컨대, 삽입 부위 분석을 수행하기 어렵고 결과적으로 선택된 삽입 부위를 가진 세포를 선택하기 어렵다는 것이다. 세 번째 한계는 현재의 기술을 이용한 상동성 재조합이 사실상 불가능하여, 유전자 보정의 출현을 위태롭게 한다는 점이다. 모든 이들 한계점들은 궁극적으로 성체 HSC들이 그들의 줄기 세포 능력을 상실하지 않으면서 시험관내에서 증폭될 수 없다는 사실에 기인한다. 이들 한계점들은 안정한 유전자 전달을 달성하는 데 있어서 현저히 신속하고 효율적인 바이러스 벡터, 예컨대, 감마-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 엄청난 중요성을 설명한다. 이것은 한정된 양으로만 사용될 수 있는 HSC들을 다룰 때 필수적이다.
글로빈 유전자 요법을 위한 ES 및 유도된 다분화능 줄기(iPS) 세포의 용도는 문헌[Moi et al., Haematol March 1, 2008;93(3):325-330]에 개시되어 있다. 배아 줄기(ES) 세포는 유전자 표적화 및 보정을 받을 수 있고, 이것은 분화다능성을 상실하지 않으면서 한정되지 않은 시험관내 세포 분열을 요구한다. 문헌[Chang et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:1036-40]은 겸상 세포 빈혈을 가진 마우스에서 상동성 재조합 방법의 실행가능성의 원리 증거를 제공하였다. 문헌[Takahashi et al. Cell 2006;126:663-76]은 배아 줄기-유사 상태로의 섬유모세포의 성공적인 재프로그래밍을 보고하였다. 이 역-분화 과정에 의해 수득된 세포(유도된 다분화능 줄기(iPS) 세포로서 지칭됨)는 배아 또는 어린 성체 대용량 섬유모세포 배양물을, 배아 줄기 세포에서 생리학적으로 활성을 나타내지만 분화가 진행될 때 일반적으로 꺼져 있는 4종의 전사 인자들을 암호화하는 감마-레트로바이러스 벡터에 노출시킴으로써 생성되었다. 배양된 세포는 ES 세포 콜로니와 유사한 콜로니를 형성하였다. 이들 발견들은 다른 연구진들에 의해 확인되었고 마우스 섬유모세포 및 인간 섬유모세포 둘 다로 확장되었다(Meissner et al., Nat Biotechnol 2007;25:1177-81; Nakagawa et al., Nat Biotechnol 2007;26:101-6; Okita et al., Nature 2007; 448:313-7; Park et al., Nature 2007;451:141-6; Takahashi et al., Nat Protoc 2007;2:3081-9; Takahashi K et al., Cell 2007;131:861-72; Wernig et al., Nature 2007;448:318-24; Yu J et al., Science 2007;318: 1917-20). 루돌프 예니쉬(Rudolf Jaenisch)와 그의 동료들은 ES-유사 iPS 세포에서 상동성 재조합을 이용하여 겸상 세포 질환의 마우스 모델에서 성공적인 유전자 요법을 달성하였다(Hanna et al., Science 2007;318:1920-3). 상기 과정은 지금까지 피부 생검으로부터 채취된 섬유모세포에 주로 적용되어 왔고, 그 후 상기 섬유모세포는 4종의 줄기 세포 전사 인자들을 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 iPS가 되도록 유도된다. iPS는 표준 상동성 재조합 기법에 의한 SC 돌연변이의 보정을 받을 수 있고, 그 후 시험관내에서 한정되지 않은 양의 조혈 줄기 세포로 분화될 수 있다. 전체 과정은 그의 SC 질환을 치유받을 원래의 마우스 공여자 내로의 보정된 HSC의 자가 이식으로 종결된다. 이 기법은 상동성 재조합에 유용할 뿐만 아니라, 세포를 수용자 내로 주입하기 전에 상세한 삽입 부위 분석 및 적절한 시험관내 세포 증폭을 수행하기 위한 수단을 제공함으로써 β-지중해빈혈의 치료를 위한 렌티바이러스-매개된 글로빈 유전자 전달도 향상시킬 수 있다.
본 개시된 보호대상의 세포는 자가("자신") 또는 비-자가("비-자신", 예를 들면, 동종이계, 동계 또는 이종) 세포일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "자가"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "동종이계"는 비교되는 세포와 유전적으로 상이한 동일한 종의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "동계"는 비교되는 세포와 유전적으로 동일한 상이한 대상체의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이종"은 비교되는 세포와 상이한 종의 세포를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 세포는 자가 세포이고, 예를 들면, 본 개시된 발현 카세트로 형질도입된 세포는 그 세포가 채취된 대상체에게 투여되고, 예를 들면, 상기 세포는 상기 대상체의 골수, 제대혈, 말초혈 및/또는 지방 조직으로부터 채취된다. 일부 구현예들에서, 세포는 대상체의 골수로부터 수득되거나 채취된다.
일부 구현예들에서, 발현 카세트를 사용한 형질도입 전, 세포는 예를 들면, 하나 이상의 사이토카인(예를 들면, IL-3, IL-1α, IL-6, Kit 리간드("줄기 세포 인자(SCF)"로서도 공지되어 있음), 및 Flt-3 리간드), 및/또는 하나 이상의 당단백질(예를 들면, 쓰롬보포이에틴 및 피브로넥틴)의 존재 하에서 미리 자극된다. 한 비제한적 예에서, 세포는 Flt-3 리간드, SCF, 쓰롬보포이에틴, 인터류킨-3 및 피브로넥틴의 존재 하에서 미리 자극된다. 세포는 약 24시간 이상, 예를 들면, 약 48시간 또는 약 36시간 동안 미리 자극될 수 있다. 그 후, 세포는 본 개시된 발현 카세트, 또는 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 또 다른 전달 시스템으로 형질도입된다. 형질도입은 새로 채취된 세포 또는 동결된 세포에 대해 수행될 수 있다. 예를 들면, 서던 블롯 분석 및/또는 정량 PCR로 벡터 카피 수를 측정하고 삽입 부위 또는 삽입된 벡터 구조를 분석하기 위해 세포의 게놈 DNA를 단리한다. 글로빈 mRNA의 정량(예를 들면, 인간 β-글로빈 전이유전자 분석)을 위해, 세포로부터 총 RNA를 추출한다. 글로빈 mRNA의 정량을 위해 정량적 프라이머 연장 분석을 이용할 수 있다.
Ⅴ. 조성물 및 제제
본 개시된 보호대상은 전술된 바와 같은 본 개시된 형질도입된 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적으로 허용가능한 세포 배양 배지를 포함하는, 생리학적으로 상용가능한 임의의 모든 용매들, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 비경구(예를 들면, 정맥내, 근육내, 피하 또는 복강내), 척추 또는 표피 투여(예를 들면, 주사, 주입 또는 이식에 의한 투여)에 적합할 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 예를 들면, 형질도입된 세포는 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 천연 조건으로부터 상기 화합물을 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 형질도입된 세포와 상용불가능한 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 개시된 보호대상의 약학 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방법과 함께 세포 또는 동물에게 투여하기 위해 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 용액에서 제제화된, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 형질도입된 세포 등을 추가로 포함할 수 있다. 원하는 경우, 본 개시된 보호대상의 약학 조성물은 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 작은 분자 또는 다양한 약학적 활성 물질들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 물질과 함께 투여될 수 있다. 의도된 유전자 요법을 전달하는 조성물의 능력에 불리하게 영향을 미치지 않는 임의의 추가 물질이 조성물에 포함될 수 있다.
본 개시된 보호대상의 약학 조성물에서, 예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 코내 및 근육내 투여 및 제제화를 포함하는 다양한 치료 섭생법들로 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 치료 섭생법이 개발되어 있는 것과 마찬가지로, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제제화는 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있다.
본 개시된 보호대상의 약학 조성물은 예를 들면, 미국 특허 제5,543,158호, 제5,641,515호 및 제5,399,363호에 기재된 바와 같이 비경구(예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 복강내)로 전달될 수 있다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대, 하이드록시프로필셀룰로스와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액도 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제들은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 사용은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 화합물과 상용불가능한 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 조성물 내로 도입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되어야 하고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀전, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정돈된 구조물로서 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 상기 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
본 개시된 보호대상의 약학 조성물은 선택된 pH까지 완충될 수 있는 멸균 액체 제제, 예를 들면, 등장성 수성 용액, 현탁액, 에멀전, 분산액 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있다. 액체 제제는 통상적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 더 용이하다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기에 다소 더 편리하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과 보다 더 긴 접촉 기간을 제공하기 위해 적절한 점성 범위 내에서 제제화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들면, 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 원하는 경우 다양한 양의 다른 성분들을 가진 요구된 양의 적절한 용매에 본 개시된 보호대상의 조성물을 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대, 멸균수, 생리학적 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 상태로 존재할 수 있다. 조성물은 동결건조될 수도 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제제에 따라 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 분산제 또는 에멀전화제(예를 들면, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화 또는 점성 향상 첨가제, 보존제, 풍미제, 안료 등을 함유할 수 있다. 과도한 실험 없이 적합한 제제를 제조하기 위해 표준 교재, 예컨대, 본원에 참고로 도입되는 문헌["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]을 참조할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 포함하는, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제들이 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제들 및 항진균제들, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사가능한 약학 제형의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 달성될 수 있다.
조성물은 등장성을 나타낼 수 있다. 즉, 조성물은 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 본 개시된 보호대상의 조성물의 원하는 등장성은 염화나트륨, 또는 다른 약학적으로 허용가능한 물질, 예컨대, 덱스트로스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜 또는 다른 무기 또는 유기 용질의 사용을 통해 달성될 수 있다. 염화나트륨은 특히 나트륨 이온을 함유하는 완충제를 위해 바람직하다.
수성 용액에서의 비경구 투여를 위해, 예를 들면, 상기 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성을 갖게 되어야 한다. 멸균 주사가능한 용액은 요구된 경우 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 상기 성분들의 조합물을 가진 적절한 용매 내로 요구된 양의 활성 화합물을 도입한 후 마이크로여과로 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 나열된 성분들 중 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 분말을 그의 미리 멸균-여과된 용액으로부터 제공하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
일부 구현예들에서, 조성물은 코내 분무, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 코 에어로졸 분무를 통해 유전자, 폴리뉴클레오티드 및 펩티드 조성물을 폐에 직접적으로 전달하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호에 기재되어 있다. 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물을 사용하여 약물을 전달하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,725,871호에 기재되어 있다. 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태의 경점막 약물 전달은 예를 들면, 미국 특허 제5,780,045호에 기재되어 있다. 본 개시된 보호대상의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노스피어, 나노입자 등으로 캡슐화된 상태로 전달되도록 제제화될 수 있다. 이러한 전달 비히클의 제제화 및 사용은 공지되어 있는 통상적인 기법의 이용을 통해 수행될 수 있다. 본 개시된 보호대상의 제제 및 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 방법과 함께 세포 또는 동물에게 투여되기 위해 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 용액(예를 들면, 배양 배지)에서 제제화된, 본원에 기재된 임의의 수의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 소분자의 조합물을 포함하는 하나 이상의 억제제 및/또는 활성화제를 포함할 수 있다.
일부 양태들에서, 본 개시된 보호대상은 레트로바이러스(예를 들면, 렌티바이러스) 벡터들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 바이러스 벡터 시스템의 전달(즉, 바이러스-매개된 형질도입)에 적합한 제제 또는 조성물을 제공한다. 생체외 전달을 위한 예시적 제제는 본 기술분야에서 공지되어 있는 다양한 형질감염제들, 예컨대, 인산칼슘, 전기천공, 열충격 및 다양한 리포좀 제제들(즉, 지질-매개된 형질감염)의 사용도 포함할 수 있다. 리포좀은 수성 유체의 극히 일부를 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 (그의 전하를 통해) 양이온성 리포좀들의 외부 표면에 자발적으로 연결되고, 이들 리포좀들은 세포 막과 상호작용할 것이다.
당업자는 조성물 중의 세포 및 임의적 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양 및 본 개시된 보호대상의 방법에서 투여될 이들의 양을 용이하게 결정할 수 있다. 전형적으로, (형질도입된 세포(들) 및/또는 물질(들) 이외에) 임의의 첨가제가 포스페이트 완충 식염수 용액에 약 0.001 중량% 내지 약 50 중량%의 양으로 존재하고, 활성 성분은 대략 마이크로그램 내지 밀리그램, 예컨대, 약 0.0001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.0001 중량% 내지 약 1 중량%, 약 0.0001 중량% 내지 약 0.05 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 20 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 10 중량%, 또는 약 0.05 중량% 내지 약 5 중량%의 양으로 존재한다. 동물 또는 인간에게 투여될 임의의 조성물 및 임의의 특정 투여 방법에 대한 독성은 예컨대, 적합한 동물 모델, 예를 들면, 설치류, 예컨대, 마우스에서의 치사량(LD) 및 LD50; 및 적합한 반응을 이끌어낼 조성물(들)의 복용량, 조성물에 존재하는 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 시기를 결정함으로써 측정되어야 한다. 이러한 결정은 당업자의 지식, 본 개시 및 본원에서 인용된 문헌들의 지식을 벗어나는 과도한 실험을 요구하지 않는다. 그리고, 순차적 투여를 위한 시간은 과도한 실험 없이 확인될 수 있다.
Ⅵ. 용도 및 방법
본 개시된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 다른 전달 시스템(뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템)은 개선된 유전자 요법 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 요법"은 유전자 및/또는 유전자의 발현을 회복시키거나, 보정하거나 변경시키는 폴리뉴클레오티드를 세포의 게놈 내로 도입하는 것을 지칭한다. 다양한 비제한적 구현예들에서, 본 개시된 벡터 또는 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템)은 조혈 시스템의 질환, 장애 또는 질병으로 진단된 대상체 또는 이러한 질환, 장애 또는 질병을 가진 것으로 의심되는 대상체에게 치유적, 예방적 또는 완화적 이익을 제공하는 글로빈 단백질(예를 들면, 인간 β 글로빈 단백질)을 암호화하는 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 벡터 또는 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템)은 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내에서 세포를 감염시킬 수 있고 형질도입할 수 있다. 그 후, 생체외 및 시험관내 구현예에서, 형질도입된 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시된 보호대상은 본 개시된 보호대상의 벡터 및 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템), 바이러스 입자 및 형질도입된 세포가 대상체에서 조혈 시스템의 질환, 장애 또는 질병, 예를 들면, 헤모글로빈병증을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나 완화하는 데 사용된다는 것을 예상한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤모글로빈병증" 또는 "헤모글로빈병증성 질환"은 혈액에서의 비정상적인 헤모글로빈 분자의 존재를 수반하는 임의의 장애를 포함한다. 헤모글로빈병증의 예는 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈 및 지중해빈혈을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비정상적인 헤모글로빈들의 조합물이 혈액에 존재하는 헤모글로빈병증(예를 들면, 겸상 세포/Hb-C 질환)도 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "지중해빈혈"은 헤모글로빈의 불완전한 생성을 특징으로 하는 유전성 장애를 지칭한다. 지중해빈혈의 예는 α-지중해빈혈 및 β-지중해빈혈을 포함한다. β-지중해빈혈은 베타 글로빈 쇄에서의 돌연변이에 의해 야기되고, 메이저(major) 형태 또는 마이너(minor) 형태로 발생할 수 있다. 메이저 형태의 β-지중해빈혈에서, 어린이는 출생 시 정상이지만, 태어난 첫 해 동안 빈혈을 발생시킨다. 경미한 형태의 β-지중해빈혈은 작은 적혈구 세포를 생성하고, 상기 지중해빈혈은 글로빈 쇄로부터의 유전자 또는 유전자들의 결실에 의해 야기된다. α-지중해빈혈은 전형적으로 HBA1 및 HBA2 유전자들을 수반하는 결실로부터 발생된다. 이들 유전자들 둘 다가 헤모글로빈의 성분(서브유닛)인 α-글로빈을 코딩한다. 각각의 세포 게놈에는 HBA1 유전자의 2개 카피 및 HBA2 유전자의 2개 카피가 존재한다. 결과적으로, α-글로빈을 생성하는 4개의 대립형질들이 존재한다. 상이한 유형의 지중해빈혈은 이들 대립형질들의 일부 또는 전부의 상실로부터 발생된다. 지중해빈혈의 가장 심각한 형태인 Hb Bart 증후군은 모든 4개의 α-글로빈 대립형질들의 상실로부터 발생된다. HbH 질환은 4개의 [알파]-글로빈 대립형질들 중 3개의 대립형질들의 상실에 의해 야기된다. 이들 두 질환들에서, [알파]-글로빈의 부족은 세포가 정상 헤모글로빈을 만들지 못하게 한다. 그 대신에, 세포는 헤모글로빈 Bart(Hb Bart) 또는 헤모글로빈 H(HbH)로서 지칭되는 비정상적인 형태의 헤모글로빈을 생성한다. 이들 비정상적인 헤모글로빈 분자는 산소를 신체의 조직에 효과적으로 운반할 수 없다. 정상 헤모글로빈 대신에 Hb Bart 또는 HbH의 치환은 지중해빈혈과 관련된 빈혈 및 다른 심각한 건강 문제를 야기한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "겸상 세포 질환"은 글로빈 유전자의 돌연변이로부터 발생되고 비정상적인 강성 겸상 형태를 취하는 적혈구 세포를 특징으로 하는 상염색체 열성 유전적 혈액 장애의 일군을 지칭한다. 이들은 글루탐산이 펩티드의 아미노산 위치 6에서 발린으로 치환되어 있는 β-글로빈 쇄 변이체를 암호화하는 βS-유전자, 및 임상 표현형을 유발하는 HbS의 결정화를 가능하게 하는 돌연변이를 가진 제2 β-유전자의 존재에 의해 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "겸상 세포 빈혈"은 HbS를 야기하는 돌연변이에 대한 동형접합성을 나타내는 환자들에서 겸상 세포 질환의 특정 형태를 지칭한다. 겸상 세포 질환의 다른 흔한 형태는 HbS/β-지중해빈혈, HbS/HbC 및 HbS/HbD를 포함한다.
일부 구현예들에서, 본 개시된 보호대상의 유전자 요법 방법은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 지중해빈혈 메이저, 지중해빈혈 인터메디아, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤모글로빈병증을 치료하거나, 예방하거나 완화하는 데 이용된다. 한 비제한적 구현예에서, 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈이다. 또 다른 비제한적 구현예에서, 헤모글로빈병증은 겸상 세포 빈혈이다.
다양한 비제한적 구현예들에서, 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템)은 생체내에서 유전자 요법을 필요로 하는 대상체의 세포, 조직 또는 장기에 직접 주사함으로써 투여된다. 다양한 다른 구현예들에서, 세포는 본 개시된 보호대상의 벡터 또는 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템)으로 시험관내에서 또는 생체외에서 형질도입되고, 임의적으로 생체외에서 증폭된다. 그 다음, 예를 들면, 본원에 개시된 약학 제제 내의 형질도입된 세포는 유전자 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본 개시된 보호대상은 형질도입된 세포를 대상체에게 제공하는 방법을 제공한다. 다양한 비제한적 구현예들에서, 상기 방법은 본 개시된 발현 카세트, 또는 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 또 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 시스템)으로 형질도입된 하나 이상의 세포(세포 집단)를 대상체에게 (예를 들면, 비경구로) 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시된 보호대상은 대상체에서 헤모글로빈병증을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 비제한적 구현예들에서, 상기 방법은 유효량의 본 개시된 형질도입된 세포 또는 본 개시된 형질도입된 세포들의 집단(예를 들면, HSC들, 배아 줄기 세포들, 또는 iPSC들)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료를 위해, 투여되는 양은 원하는 효과를 생성하는 데 효과적인 양이다. 유효량은 1회 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스로 제공될 수 있거나 연속 관주에 의해 제공될 수 있다. "유효량"(또는 "치료 유효량")은 치료 시 유리한 또는 원하는 임상 결과를 달성하는 데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 복용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 유효량은 질환의 진행을 경감시키거나, 완화하거나, 안정화시키거나, 역전시키거나 늦추거나, 질환의 병리학적 결과를 다른 방식으로 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량은 일반적으로 사례별로 의사에 의해 결정되고 당업자의 기술 내에 있다. 유효량을 달성하기 적절한 복용량을 결정할 때 전형적으로 여러 요인들이 고려된다. 이들 요인들은 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 질환, 질환의 중증도, 및 투여되는 면역반응 세포의 형태 및 유효 농도를 포함한다.
한 비제한적 예에서, 하나 이상의 본 개시된 형질도입된 세포의 투여 후, 대상체의 말초혈을 채취하고 헤모글로빈 수준을 측정한다. 하나 이상의 본 개시된 형질도입된 세포의 투여 후, 치료적으로 적절한 수준의 헤모글로빈이 생성된다. 치료적으로 적절한 수준의 헤모글로빈은 (1) 빈혈을 개선하거나 보정하고/하거나, (2) 정상 헤모글로빈을 함유하는 적혈구 세포를 생성하는 대상체의 능력을 회복시키고/시키거나, (3) 대상체에서 비효과적인 적혈구생성을 보정하고/하거나, (4) 수질외 조혈(예를 들면, 비장 및 간 수질외 조혈)을 보정하고/하거나, (5) 예를 들면, 말초 조직 및 장기에서 철 축적을 감소시키기에 충분한 헤모글로빈의 수준이다. 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 적어도 약 7 g/dL Hb, 적어도 약 7.5 g/dL Hb, 적어도 약 8 g/dL Hb, 적어도 약 8.5 g/dL Hb, 적어도 약 9 g/dL Hb, 적어도 약 9.5 g/dL Hb, 적어도 약 10 g/dL Hb, 적어도 약 10.5 g/dL Hb, 적어도 약 11 g/dL Hb, 적어도 약 11.5 g/dL Hb, 적어도 약 12 g/dL Hb, 적어도 약 12.5 g/dL Hb, 적어도 약 13 g/dL Hb, 적어도 약 13.5 g/dL Hb, 적어도 약 14 g/dL Hb, 적어도 약 14.5 g/dL Hb 또는 적어도 약 15 g/dL Hb일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 약 7 g/dL Hb 내지 약 7.5 g/dL Hb, 약 7.5 g/dL Hb 내지 약 8 g/dL Hb, 약 8 g/dL Hb 내지 약 8.5 g/dL Hb, 약 8.5 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 9.5 g/dL Hb, 약 9.5 g/dL Hb 내지 약 10 g/dL Hb, 약 10 g/dL Hb 내지 약 10.5 g/dL Hb, 약 10.5 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 11.5 g/dL Hb, 약 11.5 g/dL Hb 내지 약 12 g/dL Hb, 약 12 g/dL Hb 내지 약 12.5 g/dL Hb, 약 12.5 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 약 13 g/dL Hb 내지 약 13.5 g/dL Hb, 약 13.5 g/dL Hb 내지 약 14 g/dL Hb, 약 14 g/dL Hb 내지 약 14.5 g/dL Hb, 약 14.5 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb, 약 7 g/dL Hb 내지 약 8 g/dL Hb, 약 8 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 10 g/dL Hb, 약 10 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 12 g/dL Hb, 약 12 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 약 13 g/dL Hb 내지 약 14 g/dL Hb, 약 14 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb, 약 7 g/dL Hb 내지 약 9 g/dL Hb, 약 9 g/dL Hb 내지 약 11 g/dL Hb, 약 11 g/dL Hb 내지 약 13 g/dL Hb, 또는 약 13 g/dL Hb 내지 약 15 g/dL Hb일 수 있다. 일부 구현예들에서, 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 적어도 약 6개월 동안, 적어도 약 12개월(또는 1년) 동안 또는 적어도 약 24개월(또는 2년) 동안 대상체에서 유지된다. 일부 구현예들에서, 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 최대 약 6개월 동안, 최대 약 12개월(또는 1년) 동안 또는 최대 약 24개월(또는 2년) 동안 대상체에서 유지된다. 일부 구현예들에서, 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 약 6개월, 약 12개월(또는 1년) 동안 또는 약 24개월(또는 2년) 동안 대상체에서 유지된다. 일부 구현예들에서, 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준은 약 6개월 내지 약 12개월(예를 들면, 약 6개월 내지 약 8개월, 약 8개월 내지 약 10개월, 약 10개월 내지 약 12개월), 약 12개월 내지 약 18개월(예를 들면, 약 12개월 내지 약 14개월, 약 14개월 내지 약 16개월, 또는 약 16개월 내지 약 18개월), 또는 약 18개월 내지 약 24개월(예를 들면, 약 18개월 내지 약 20개월, 약 20개월 내지 약 22개월, 또는 약 22개월 내지 약 24개월) 동안 대상체에서 유지된다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은 전술된 본 개시된 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터로 형질도입된 하나 이상의 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 대상체에서 헤모글로빈의 치료적으로 적절한 수준(예를 들면, 9-10 g/dL)을 제공하는, 세포 내의 재조합 벡터의 벡터 카피 수는 세포당 약 0.5 내지 약 2, 약 0.5 내지 약 1, 또는 약 1 내지 약 2 벡터 카피 수이다. 일부 구현예들에서, 본 개시된 벡터의 벡터 카피 수는 세포당 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9 또는 약 2.0 벡터 카피 수이다.
일부 구현예들에서, 대상체는 인간 백혈구 항원(HLA)-일치된 공여자를 결여한다. 일부 구현예들에서, 형질도입된 세포는 동일한 대상체로부터 유래된다. 한 구현예에서, 형질도입된 세포는 동일한 대상체의 골수로부터 유래된다. 따라서, 형질도입된 세포의 투여는 대상체에서 이식편-대-숙주 질환의 위험을 발생시키지 않는다. 상기 방법은 이식편 거부를 예방하기 위해 면역 억제를 요구하지 않는다. 예를 들면, 상기 방법은 면역억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하지 않는다.
본 개시된 보호대상은 대상체에서 백혈 세포 또는 백혈구에 비해 적혈구 세포 또는 적혈구의 비율을 증가시키는 방법도 제공한다. 다양한 비제한적 구현예들에서, 상기 방법은 유효량의 본 개시된 형질도입된 세포 또는 본 개시된 형질도입된 세포들의 집단(예를 들면, HSC들, 배아 줄기 세포들 또는 iPSC들)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 조혈 줄기 세포의 적혈구 세포 자손 세포의 비율은 대상체에서 조혈 줄기 세포의 백혈 세포 자손 세포에 비해 증가된다.
임의의 특정 이론에 구속받고자 하지 않지만, 본 개시된 보호대상의 발현 카세트, 벡터 및 다른 전달 시스템(예를 들면, 뉴클레아제 및 CRISPR-Cas시스템), 조성물 및 방법에 의해 제공된 중요한 장점은 기존 방법에 비해 더 낮은 백분율의 형질도입된 세포를 포함하는 세포 집단의 투여에 의해 달성될 수 있는 글로빈 유전자 요법의 고효율이다. 이것은 형질도입된 세포에서 세포 유전자의 유해한 돌연변이, 형질전환 또는 종양유전자 활성화의 감소된 가능성과 관련된 중요한 안전성 장점을 제공한다. 형질도입된 세포는 골수 제거 요법을 받았거나 받지 않은 개체에서 골수 또는 제대혈 이식물의 일부로서 투여될 수 있다.
본원에 기재된 발현 카세트로 형질도입된 본 개시된 세포의 치료적 용도에 관한 한 고려사항은 최적 효과를 달성하는 데 필요한 세포의 양이다. 투여될 형질도입된 세포의 양은 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 한 구현예에서, 약 1 x 104개 내지 약 1 x 105개 세포/kg, 약 1 x 105개 내지 약 1 x 106개 세포/kg, 약 1 x 106개 내지 약 1 x 107개 세포/kg, 약 1 x 107개 내지 약 1 x 108개 세포/kg, 약 1 x 108개 내지 약 1 x 109개 세포/kg, 또는 약 1 x 109개 내지 약 1 x 1010개 세포/kg의 본 개시된 형질도입된 세포가 대상체에게 투여된다. 훨씬 더 작은 수의 보다 효과적인 세포가 투여될 수 있다. 일부 구현예들에서, 적어도 약 1 x 108개 세포/kg, 적어도 약 2 x 108개 세포/kg, 적어도 약 3 x 108개 세포/kg, 적어도 약 4 x 108개 세포/kg, 또는 적어도 약 5 x 108개 세포/kg의 본 개시된 형질도입된 세포가 대상체에게 투여된다. 유효 복용량으로서 간주되는 복용량의 정확한 결정은 구체적인 대상체의 크기, 연령, 성별, 체중 및 상태를 포함하는, 각각의 대상체에게 개별적인 요인에 근거할 수 있다. 복용량은 본 개시 및 본 기술분야의 지식으로부터 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
다양한 구현예들에서, 본 개시된 보호대상의 발현 카세트, 벡터 및 다른 전달 시스템(뉴클레아제 및 CRISPR-Cas 시스템), 조성물 및 방법은 생체외 유전자 요법 및 자가 이식을 이용하는 개선된 유전자 요법 방법을 제공한다. 발현 카세트로 형질도입된 세포를, 헤모글로빈병증을 가진 대상체 내로 이식하는 것은 질환의 장기간 보정을 일으킨다.
하나 이상의 본 개시된 형질도입된 세포는 비경구 투여(예를 들면, 근육내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여 또는 복강내 투여), 척추 투여 및 표피 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 본 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 한 비제한적 구현예에서, 하나 이상의 형질도입된 세포는 정맥내로 대상체에게 전달된다. 하나 이상의 본 개시된 형질도입된 세포는 주사, 주입 또는 이식에 의해 투여될 수 있다. 한 비제한적 구현예에서, 하나 이상의 형질도입된 세포는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 비제한적 구현예에서, 하나 이상의 형질도입된 세포는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
대상체는 진행된 형태의 질환을 가질 수 있고, 이 경우 치료 목적은 질환 진행의 경감 또는 역전, 및/또는 부작용의 완화를 포함할 수 있다. 대상체는 이미 치료받은 병력을 가질 수 있고, 이 경우 치료 목적은 전형적으로 재발 위험의 감소 또는 지연을 포함할 것이다.
Ⅶ. 키트
본 개시된 보호대상은 헤모글로빈병증의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 본 개시된 발현 카세트로 형질도입된 유효량의 세포를 유닛 제형으로 함유하는 치료 또는 예방 조성물을 포함한다. 한 비제한적 구현예에서, 상기 키트는 본원에 개시된 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 키트는 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 키트는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩 또는 본 기술분야에서 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있는 멸균 용기를 포함한다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층된 종이, 금속 포일, 또는 약제를 지탱하기에 적합한 다른 재료로 만들어질 수 있다.
원하는 경우, 형질도입된 세포는 헤모글로빈병증을 갖거나 발생시킬 위험에 있는 대상체에게 상기 세포를 투여하는 것에 대한 설명서와 함께 제공된다. 상기 설명서는 일반적으로 헤모글로빈병증의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 사용에 대한 정보를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 상기 설명서는 하기 정보들 중 하나 이상을 포함한다: 치료제의 설명; 헤모글로빈병증 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 위한 복용 일정 및 투여; 주의; 경고; 적응증; 역-적응증; 과다복용 정보; 불리한 반응; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고자료. 대안적으로 또는 추가로, 키트는 하나 이상의 발현 카세트 및/또는 이러한 발현 카세트를 포함하는 벡터로 세포를 형질도입하는 것에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 (존재할 때) 용기 상에 직접 인쇄될 수 있거나, 용기에 적용된 표지로서 인쇄될 수 있거나, 용기 내에 또는 용기와 함께 공급된 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 인쇄될 수 있다.
실시예
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 개시된 보호대상의 실시는 당업자의 이해범위 내에 있는 분자생물학(재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법들을 이용한다. 이러한 기법들은 문헌, 예컨대, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)]; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)]; 문헌["Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)]; 문헌["Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)]; 문헌["Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)]; 문헌["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)]; 및 문헌["Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이들 기법들은 본 개시된 보호대상의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용될 수 있으므로, 본 개시된 보호대상의 제조 및 실시에서 고려될 수 있다. 특정 구현예를 위한 특히 유용한 기법은 하기 단락에서 논의될 것이다.
하기 실시예들은 본 개시된 보호대상의 발현 카세트, 벡터, 전달 시스템 및 치료 방법을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 제공하도록 기재되어 있고, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1: 신규 인슐레이터의 발견
유전독성의 위험이 염색질 인슐레이터의 사용에 의해 감소될 수 있다는 것이 입증된 것과 마찬가지로(Arumugam et al. (2007), Emery (2011), Evans-Galea et al. (2007), Rivella et al. (2000), Emery et al. (2000), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2003), Ramezani et al. (2008)), 바이러스 벡터의 삽입적 돌연변이유발에 의해 발생된 문제점은 널리 공지되어 있다(Nienhuis (2013), Baum et al. (2006), Nienhuis et al. (2006)). 인간 게놈에서 인핸서 차단 인슐레이터를 효율적으로 확인할 수 있게 하는 방법이 개발되어 있다. 이들 신규 인슐레이터들은 평균 150 bp의 짧은 길이를 갖고, 바이러스 벡터의 역가에 불리하게 영향을 미치지 않고, 인슐레이터 cHS4보다 몇 배 더 강력하다. 게놈 접근법은 인간 게놈의 가장 강력한 인핸서 차단제 및 장벽 인슐레이터를 발견하는 데 이용되었다. 헤모글로빈병증의 유전자 요법의 경우, 치료적 수준의 글로빈 유전자 발현을 달성하기 위해 강력한 인핸서가 요구된다. 따라서, 강력한 인슐레이터는 삽입 벡터의 강력한 인핸서로부터 게놈 환경을 보호하기 위한 한 수단을 제공할 수 있다.
여러 연구들은 감마레트로바이러스 벡터[Evans-Galea et al. (2007), Rivella et al. (2000), Emery et al. (2000), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2006), Yao et al. (2003), Nishino et al. (2006), Aker et al. (2007), Li and Emery (2008)], 및 렌티바이러스 벡터[Evans-Galea et al. (2007), Ramezani et al. (2003), Puthenveetil et al. (2004), Arumugam et al. (2007), Bank et al. (2005), Aker et al. (2007), Ma et al. (2003), Chang et al. (2005), Pluta et al. (2005)]의 위치-효과 침묵을 감소시키는 cHS4 인슐레이터의 능력을 입증하였다. 적절하게 설계된 연구들은 cHS4 인슐레이터의 1.2 kb 버전의 포함이 적어도 일부 환경에서 벡터 전이유전자 발현의 확률 및/또는 일관성을 증가시켰다는 것을 입증하였다(Arumugam et al. (2007), Evans-Galea et al. (2007), Emery et al. (2002), Yannaki et al. (2002), Hino et al. (2004), Ramezani et al. (2006), Aker et al. (2007), Li and Emery (2008), Pluta et al. (2005), Jakobsson et al. (2004)). 그럼에도 불구하고, cHS4 인슐레이터에 의해 부여된 보호의 정도는 결코 완전하지 않다. 추가로, 1.2 Kb cHS4의 포함은 벡터 역가에 불리하게 영향을 미칠 수 있는 반면, 가장 작은 cHS4 코어는 비효과적인 것으로 입증되었다(Aker et al. (2007), Jakobsson et al. (2004)).
마우스에서의 종양 형성의 정량을 기반으로 하는 생체내 분석을 이용하여 유전독성에 대한 효과를 시험하였다. 인슐레이터 A1에 의해 인슐레이팅된 벡터는 인슐레이팅되지 않은 대조군 또는 cHS4로 인슐레이팅된 대조군을 제공받은 마우스들에 비해 조혈 키메라에서 무작위적 벡터 삽입에 의해 유도된 종양 형성을 감소시켰다.
벡터 역가에 대한 효과를 평가하기 위해, 항시성 팩키지 프로모터로부터 GFP를 발현하는 제3세대 렌티바이러스 벡터의 이중-카피 영역 내로 인슐레이터 A1을 도입하였고, 바이러스 역가 및 GFP 발현을 측정하였다. 인슐레이터 A1은 벡터 GFP 발현에 불리하게 영향을 미치지 않았다.
생체내 유전독성 분석에서, 감마레트로바이러스 벡터로 형질도입된 세포주는 마우스들 내로의 이식 후 종양을 생성하였고 종양 부재 생존율의 측정에 의한 유전독성 효과의 정량을 가능하게 하였다. 유전독성에 대한 인슐레이터의 효과는 마우스들에서 형성된 종양의 수 및 종양 부재 생존율에 의해 정량되었다. 인슐레이터 A1은 3' LTR의 근위 부분에 삽입되었고, 역전사 및 벡터 삽입 동안 이러한 부분으로부터 5' LTR 내로 카피된다. 생성된 위상기하학은 삽입된 프로바이러스의 5' 및 3'에 위치하는 게놈 영역들 사이에 인슐레이터의 카피들을 배치하고 5' 바이러스 LTR 및 내부 Pgk 프로모터로부터의 인핸서 활성을 함유하지만, 3' LTR에서 인핸서를 함유하지 않는다. 이것은 유전독성을 감소시킴으로써, 종양 형성을 감소시킬 수 있고 동물의 생존을 증가시킬 수 있다. 인슐레이터 A1 또는 대조군 영역으로 플랭킹된 감마-레트로바이러스 레포터 벡터를 사용하여 성장 인자 의존성 세포주 32D를 형질도입하였고, 각각의 벡터에 대한 10개의 독립적인 서브-풀들(sub-pools)을 동계 C3H/HeJ 마우스들 내로 이식하였다. 모의물(mock)로 형질도입된 세포를 이식받은 10마리의 마우스들 전부가 32D 세포 유래의 종양을 갖지 않는 상태로 유지된 반면, 삽입물을 함유하지 않거나 790 bp 중성 스페이서를 함유하는 벡터로 형질도입된 32D 세포를 이식받은 거의 모든 마우스들은 평균 16주 이내에 종양을 발생시켰다(도 5b). cHS4 인슐레이터에 의한 이 벡터의 플랭킹은 종양 형성의 시작을 수주까지 지연시켰고, 종양을 발생시킨 동물의 빈도를 10분의 6까지 감소시켰다. 대조적으로, 10마리의 동물들 중 2마리의 동물들만이 인슐레이터 A1로 플랭킹된 벡터로 형질도입된 32D 세포를 사용한 이식 후 종양을 발생시켰다(도 5b). 원래의 서브-풀에서 종양을 가진 동물의 빈도 및 벡터 형질도입 사건의 수는 인슐레이터 A1에 의한 벡터의 플랭킹이 전체 종양 형성률을 105 프로바이러스당 46.9개의 종양부터 105 프로바이러스당 3.9개 종양까지 12배 감소시켰다는 것을 암시하였다(도 5c). 대조적으로, cHS4 인슐레이터는 전체 종양 형성률을 2.8배(105 프로바이러스당 16.9개 종양)까지 감소시킨 반면, 중성 스페이서는 종양 형성률에 대한 통계적으로 유의한 효과를 갖지 않았다. 이들 결과들은 발견된 인핸서 차단 인슐레이터가 삽입적 돌연변이유발의 위험 및 유전독성을 실질적으로 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다.경숙
실시예 2: 하나 이상의 인슐레이터를 포함하는 글로빈 벡터의 특징규명
인슐레이터 A1; 및 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된, 코돈 87에서 글루타민으로의 쓰레오닌의 돌연변이(βA - T87Q)를 암호화하는 인간 βA-글로빈 유전자를 포함하는 본 개시된 발현 카세트(도 1에 표시된 바와 같이 "발현 카세트 1"로서 표기됨)를 생성하였다. 변이체 β 쇄(βA)를 사용하는 이유는 내생성 또는 주입된 베타 쇄로부터 이것을 식별하는, 벡터-코딩된 β-글로빈 유전자의 검출을 용이하게 한다는 것이다. γ-글로빈 쇄 내의 위치 87에 있는 글루타민(GLN) 잔기는 β 쇄의 성체 산소 결합 특성을 보존하면서 β 쇄에 비해 감마 쇄의 항-겸상화 활성을 증강시킨다(Nagel et al. (1979)). 벡터 1에서, 코돈 87을 변경시키는 점 돌연변이(βA - T87Q, 또는 β87)는 정상 쓰레오닌을 글루타민으로 대체하고 벡터-코딩된 β 쇄의 항-겸상화 활성을 증강시킨다. 이 β87 쇄는 HbE-지중해빈혈을 가진 환자에서 안전하게 사용되고 있다(Cavazzana-Calvo et al. (2010)).
발현 카세트 1을 렌티바이러스 벡터("벡터 1"로서 표기됨)에 삽입하였거나 도입하였다. 종래 기재된 바와 같이(May et al. (2000), May et al. (2002), Lisowski et al. (2007)), 벡터 1을 C57BL/6-Hbb th3/+ 마우스의 골수 세포에 도입하였고 치사량의 방사선을 조사받은 동계 수용자에게 이식하였다. V1의 벡터 역가는 인슐레이터 A1을 결여하는 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 역가에 필적할만하였다. 벡터 1의 β-글로빈 발현은 인슐레이터를 결여하고 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 야생형 인간 β-글로빈 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 벡터("벡터 2"로서 표기됨)의 β-글로빈 발현에 비교되었다. 도 6에 표시된 바와 같이, 벡터 2와 비교될 때, 벡터 카피로 표준화된 벡터 1의 β-글로빈 발현은 동등하였거나 약간 증가되었는데, 이것은 플랭킹 장벽 요소에 의해 제공된, 생체내 발현을 위한 추가된 이익을 암시한다.
실시예 3: 비-적혈구 K562 세포에서 인핸서 활성의 평가
HS2의 인핸서 활성을 비-적혈구 K562 세포에서 평가하였다. 도 7에 표시된 바와 같이, 벡터로 형질도입된 K562 세포에서의 GFP 발현은 인핸서에 연결되어 있지 않거나("Empty"), HS2, HS3-4, HS2-3-4, 또는 양성 대조군으로서 사용된 runx1 인핸서("RUNX1")에 연결된 최소 프로모터에 의해 유도되었다. 배경 발현은 대략 0.01%("Empty")이었지만, HS2-3-4의 사용 시 10배 이상 증가되었다("Lcr9", 0.17%). 이 향상은 HS3-4(0.05%)에 기인한 것이 아니라 주로 HS2(0.15%)에 기인하였다. 모든 세포주들이 비교가능하게 형질도입되었다(평균 벡터 카피 수 2.5). 결과는 HS3-HS4가 아니라 HS2가 비-적혈구 조혈 줄기 및 조상 세포에서 종양형성 위험을 초래할 수 있다는 것을 뒷받침한다.
실시예 4: 신규 적혈구-특이적 인핸서
도 8 및 9에 표시된 바와 같이, 5종의 적혈구-특이적 인핸서들이 HS2 대신에 사용되었다: ALAS 인트론 1, ALAS 인트론 8, BLVRB, PPOX 및 스펙트린(Spectrin)-알파. 본 발명자들은 모든 이들 5종의 인핸서들이 강력한 인핸서이고 비-적혈구 조직에서 인핸서 활성을 결여하고 벡터 역가를 감소시키지 않는다는 것을 보여주었다.
실시예 5: 3' LTR 변경을 통한 글로빈 렌티바이러스 벡터 생성의 증가
치료 글로빈 벡터의 본질적인 특징은 환자 세포의 효과적인 형질도입에 충분한 높은 역가를 달성하는 것이다. 글로빈 렌티바이러스 벡터들은 유전자, 프로모터, 인핸서 및/또는 LCR 요소를 포함하는 그들의 큰 적하물 때문에 본질적으로 낮은 역가를 갖고, 이 문제점은 그들의 제조를 복잡하게 하고 그들의 임상 사용을 한정한다. 이 문제점은 벡터의 크기를 더 증가시키는, 추가 유전적 요소, 예컨대, 인슐레이터의 도입에 의해 더 악화된다.
본 발명자들은 글로빈 벡터의 역가를 증가시키기 위해 글로빈 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)의 상이한 변경을 활용하였다. 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역에 작동가능하게 연결된 인간 β-글로빈 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터에 대해 모델링된 62종의 변이들(1부터 62까지 넘버링됨)에 대해 평가하였다. 다시 말해, 벡터 #1부터 벡터 #62까지 전부가 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS3 영역 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가진 HS4 영역을 포함하는 β-글로빈 LCR 영역을 포함한다. 벡터 #18은 3' LTR에서 표준 U3 결실을 포함하는 기준으로서 사용되었다. 벡터 #1(표시되어 있지 않음)은 임상적으로 사용될 수 없는 전체, 즉 야생형 LTR을 포함하였다. 3' LTR에 대한 변경은 도 10a 및 10b에 표시되어 있고, 그들의 역가는 도 11 및 12에 표시되어 있다(Y 축은 엄격히 동일한 조건 하에서 제조되고 시험된 벡터 스톡의 벡터 카피 수를 보여준다). 적정은 2명의 작업자들에 의해 동시에 수행된 삼중 레플리카(triple replicas)에서 측정되었고 다회 실험들에서 반복되었다.
도 11 및 12에 표시된 바와 같이, 벡터 #55는 반복적으로 보다 더 높은 역가를 보였다. 이 벡터는 3' LTR 내의 R 영역에 대해 3' 방향에서 우드척 간염 후-조절 요소(WPRE) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 따라서, WPRE 요소는 형질도입된 세포에게 전달되지 않는다.
글로빈 렌티바이러스 벡터의 생성을 향상시키기 위한 이들 요소들의 도입은 보다 더 높은 역가의 제공 및 이로써 본원에 기재된 벡터의 임상 유용성을 위해 필수적이다.
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상기 설명으로부터, 본원에 기재된 본 개시된 보호대상을 다양한 용도들 및 조건에 맞추기 위해 변경 및 변형시킬 수 있다는 것은 자명할 것이다. 이러한 구현예들도 하기 청구범위 내에 있다.
본 명세서에서 언급된 접근번호 또는 참조번호에 의해 지칭된 모든 특허들 및 공개문헌들 및 서열들은 마치 각각의 독립적인 특허 및 공개문헌 및 서열이 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER UNIVERSITY OF WASHINGTON <120> GLOBIN GENE THERAPY FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHIES <130> 2017-FPA-7991 <150> 62/045,997 <151> 2014-09-04 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 305 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tccttccttt ctaaatgacg agagagacag aagaattctt caaggttagt gtgtccagca 60 tgcaaccttt ccttcctgga tgagcatccc tggagtagga gagccagcct gcctcctgcg 120 ctggcacaga gcccggttcc ctagacaact gcctctccaa atctgatgtc cagcgccacc 180 tggtgtccac atcaagcaga cacaattaat agtcaacctg ttcaggaaaa ctgtgagggg 240 gaaaaaaaag aaagaggatt tatgaaggga aaagaaagtt tagaggatat gccacgattg 300 gctag 305 <210> 2 <211> 1074 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aagtaaactt ccacaaccgc aagcttattg aggctaaggc atctgtgaag gaaagaaaca 60 tctcctctaa accactatgc tgctagagcc tcttttctgt actcaagcct cattcagaca 120 ctagtgtcac cagtctcctc atatacctat tgtattttct tcttcttgct ggtttagtca 180 tgttttctgg gagcttaggg gcttatttta ttttgttttg ttttctaatc aacagagatg 240 ggcaaaccca ttattttttt ctttagactt gggatggtga tagctgggca gcgtcagaaa 300 ctgtgtgtgg atatagataa gagctcggac tatgctgagc tgtgatgagg gagggaccta 360 gccaaaggca gtgagagtca gaatgctcct gctattgcct tctcagtccc cacgcttggt 420 ttctacacaa gtagatacat agaaaaggct ataggttagt gtttgagagt cctgcatgag 480 ttagttgctc agaaatgccc gataaatatg ttatgtgtgt ttatgtatat atatgtttta 540 tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgttgtgt ttacaaatat gtgattatca 600 tcaaaacgtg agggctaaag tgaccagata acttgcaggt cctaggatac caggaaaata 660 aattacattc caaaaattta actgagactt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac 720 cagtgatcca tggacacagg gaggggaaca tcacacactg gggcctgttg ggggtggggg 780 gctaggggaa ggatagcatt aggagaaata cctaatgtag atgacgggtt gatgggtgca 840 gcaaaccacc atggcacatg taccccagaa cttaaagcat attaaaaaaa cagtgatcat 900 aaaagaagct caaatttaac tataagagac ggaatggctc ccacaattct taactataat 960 cttacagaat attctcattg aatagaagta tgcttatcat tagagatttg gacagccagg 1020 aaagcacaga aaaaaaaaaa aggagctctg ttgccttata gcctagaggt gttt 1074 <210> 3 <211> 602 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcatctgtg aaggaaagaa acatctcctc taaaccacta tgctgctaga gcctcttttc 60 tgtactcaag cctcattcag acactagtgt caccagtctc ctcatatacc tattgtattt 120 tcttcttctt gctggtttag tcatgttttc tgggagctta ggggcttatt ttattttgtt 180 ttgttttcta atcaacagag atgggcaaac ccattatttt tttctttaga cttgggatgg 240 tgatagctgg gcagcgtcag aaactgtgtg tggatataga taagagctcg gactatgctg 300 agctgtgatg agggagggac ctagccaaag gcagtgagag tcagaatgct cctgctattg 360 ccttctcagt ccccacgctt ggtttctaca caagtagata catagaaaag gctataggtt 420 agtgtttgag agtcctgcat gagttagttg ctcagaaatg cccgataaat atgttatgtg 480 tgtttatgta tatatatgtt ttatatatat atatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg 540 tgtttacaaa tatgtgatta tcatcaaaac gtgagggcta aagtgaccag ataacttgca 600 gg 602 <210> 4 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggcatctgtg aaggaaagaa acatctcctc taaaccacta tgctgctaga gcctcttttc 60 tgtactcaag cctcattcag acactagtgt caccagtctc ctcatatacc tattgtattt 120 tcttcttctt gctggtttag tcatgttttc tgggagctta ggggcttatt ttattttgtt 180 ttgttttcta atcaacagag atgggcaaac ccattatttt tttctttaga cttgggatgg 240 tgatagctgg gcagcgtcag aaactgtgtg tggatataga taagagctcg gactatgctg 300 agctgtgatg agggagggac ctagccaaag gcagtgagag tcagaatgct cctgctattg 360 ccttctcagt ccccacgctt ggtttctaca caagtagata catagaaaag gctataggtt 420 agtgtttgag agtcctgcat gagttagttg ctcagaaatg cccgataaat atgttatgtg 480 tgtttatgt 489 <210> 5 <211> 1301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aagctttcat taaaaaaagt ctaaccagct gcattcgact ttgactgcag cagctggtta 60 gaaggttcta ctggaggagg gtcccagccc attgctaaat taacatcagg ctctgagact 120 ggcagtatat ctctaacagt ggttgatgct atcttctgga acttgcctgc tacattgaga 180 ccactgaccc atacatagga agcccatagc tctgtcctga actgttaggc cactggtcca 240 gagagtgtgc atctcctttg atcctcataa taaccctatg agatagacac aattattact 300 cttactttat agatgatgat cctgaaaaca taggagtcaa ggcacttgcc cctagctggg 360 ggtatagggg agcagtccca tgtagtagta gaatgaaaaa tgctgctatg ctgtgcctcc 420 cccacctttc ccatgtctgc cctctactca tggtctatct ctcctggctc ctgggagtca 480 tggactccac ccagcaccac caacctgacc taaccaccta tctgagcctg ccagcctata 540 acccatctgg gccctgatag ctggtggcca gccctgaccc caccccaccc tccctggaac 600 ctctgataga cacatctggc acaccagctc gcaaagtcac cgtgagggtc ttgtgtttgc 660 tgagtcaaaa ttccttgaaa tccaagtcct tagagactcc tgctcccaaa tttacagtca 720 tagacttctt catggctgtc tcctttatcc acagaatgat tcctttgctt cattgcccca 780 tccatctgat cctcctcatc agtgcagcac agggcccatg agcagtagct gcagagtctc 840 acataggtct ggcactgcct ctgacatgtc cgaccttagg caaatgcttg actcttctga 900 gctcagtctt gtcatggcaa aataaagata ataatagtgt ttttttatgg agttagcgtg 960 aggatggaaa acaatagcaa aattgattag actataaaag gtctcaacaa atagtagtag 1020 attttatcat ccattaatcc ttccctctcc tctcttactc atcccatcac gtatgcctct 1080 taattttccc ttacctataa taagagttat tcctcttatt atattcttct tatagtgatt 1140 ctggatatta aagtgggaat gaggggcagg ccactaacga agaagatgtt tctcaaagaa 1200 gccattctcc ccacatagat catctcagca gggttcagga agataaagga ggatcaaggt 1260 cgaaggtagg aactaaggaa gaacactggg caagtggatc c 1301 <210> 6 <211> 1065 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgagcccctt ttcctctaac 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attatgaaca gcaatgagat 900 aatatgtaca aagtacccag acctatgtgg tagagcatca aggaagcgca ttgcggagca 960 gttttttgtt tgtttgtttt tgtattctgt ttcgtgaggc aaggtttcac tctgctgtcc 1020 aggctggagt gcagtggcaa gatcatgtct cactgcagcc ttgac 1065 <210> 7 <211> 1065 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgagcccctt ttcctctaac tgaaagaagg aaaaaaaaaa tggaacccaa aatattctac 60 atagtttcca tgtcacagcc agggctgggc agtctcctgt tatttctttt aaaataaata 120 tatcattaaa tgcataaata agcaaaccct gctcgggaat gggagggaga gtctctggag 180 tccacccctt ctcggccctg gctctgcaga tagtgctatc aaagccctga cagagccctg 240 cccattgctg ggccttggag tgagtcagcc tagtagagag gcagggcaag ccatctcata 300 gctgctgagt gggagagaga aaagggctca ttgtctataa actcaggtca tggctattct 360 tattctcaca ctaagaaaaa gaatgagatg tctacatata ccctgcgtcc cctcttgtgt 420 actggggccc ccaagagctc tctaaaagtg atggcaaagt cattgcgcta gatgccatcc 480 catctattat aaacctgcat ttgtctccac acaccagtca tggacaataa ccctcctccc 540 aggtccacgt gcttgtcttt gtataatact caagtaattt cggaaaatgt attctttcaa 600 tcttgttctg ttattcctgt ttcaatggct tagtagaaaa agtacatact tgttttccca 660 taaattgaca atagacaatt tcacatcaat gtctatatgg gtcgttgtgt ttgctgtgtt 720 tgcaaaaact cacaataact ttatattgtt actactctaa gaaagttaca acatggtgaa 780 tacaagagaa agctattaca agtccagaaa ataaaagtta tcatcttgag gcctcagctt 840 tctaggaata atatcaatat tacaaaatta atctaacaat tatgaacagc aatgagataa 900 tatgtacaaa gtacccagac ctatgtggta gagcatcaag gaagcgcatt gcggagcagt 960 tttttgtttg tttgtttttg tattctgttt cgtgaggcaa ggtttcactc tgctgtccag 1020 gctggagtgc agtggcaaga tcatgtctca ctgcagcctt gacac 1065 <210> 8 <211> 446 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tggaacccaa aatattctac atagtttcca tgtcacagcc agggctgggc agtctcctgt 60 tatttctttt aaaataaata tatcatttaa atgcataaat aagcaaaccc tgctcgggaa 120 tgggagggag agtctctgga gtccacccct tctcggccct ggctctgcag atagtgctat 180 caaagccctg acagagccct gcccattgct gggccttgga gtgagtcagc ctagtagaga 240 ggcagggcaa gccatctcat agctgctgag tgggagagag aaaagggctc attgtctata 300 aactcaggtc atggctattc ttattctcac actaagaaaa agaatgagat gtctacatat 360 accctgcgtc ccctcttgtg tactggggtc cccaagagct ctctaaaagt gatggcaaag 420 tcattgcgct agatgccatc ccatct 446 <210> 9 <211> 860 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gtatatgtgt atatatatat atatatattc aggaaataat atattctaga atatgtcaca 60 ttctgtctca ggcatccatt ttctttatga tgccgtttga ggtggagttt tagtcaggtg 120 gtcagcttct cctttttttt gccatctgcc ctgtaagcat cctgctgggg acccagatag 180 gagtcatcac tctaggctga gaacatctgg gcacacaccc taagcctcag catgactcat 240 catgactcag cattgctgtg cttgagccag aaggtttgct tagaaggtta cacagaacca 300 gaaggcgggg gtggggcact gaccccgaca ggggcctggc cagaactgct catgcttgga 360 ctatgggagg tcactaatgg agacacacag aaatgtaaca ggaactaagg aaaaactgaa 420 gcttatttaa tcagagatga gatgctggaa gggatagagg gagctgagct tgtaaaaagt 480 atagtaatca ttcagcaaat ggttttgaag cacctgctgg atgctaaaca ctattttcag 540 tgcttgaatc ataaataaga ataaaacatg tatcttattc cccacaagag tccaagtaaa 600 aaataacagt taattataat gtgctctgtc ccccaggctg gagtgcagtg gcacgatctc 660 agctcactgc aacctccgcc tcccgggttc aagcaattct cctgcctcag ccaccctaat 720 agctgggatt acaggtgcac accaccatgc caggctaatt tttgtacttt ttgtagaggc 780 agggtatcac catgttgtcc aagatggtct tgaactcctg agctccaagc agtccaccca 840 cctcagcctc ccaaagtgct 860 <210> 10 <211> 613 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 aagcaataga tggctctgcc ctgactttta tgcccagccc tggctcctgc cctccctgct 60 cctgggagta gattggccaa ccctagggtg tggctccaca gggtgaggtc taagtgatga 120 cagccgtacc tgtccttggc tcttctggca ctggcttagg agttggactt caaaccctca 180 gccctccctc taagatatat ctcttggccc cataccatca gtacaaattg ctactaaaaa 240 catcctcctt tgcaagtgta tttacgtaat atttggaatc acagcttggt aagcatattg 300 aagatcgttt tcccaatttt cttattacac aaataagaaa ttgatgcact aaaagtggaa 360 gagttttgtc taccataatt cagctttggg atatgtagat ggatctcttc ctgcgtctcc 420 agaatatgca aaatacttac aggacagaat ggatgaaaac tctacctcag ttctaagcat 480 atcttctcct tatttggatt aaaaccttct ggtaagaaaa gaaaaaaaat atatatatat 540 atgtgtatat atacacacat acatatacat atatatgcat tcatttgttg ttgtttttct 600 taatttgctc atg 613 <210> 11 <211> 265 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aagcaataga tggctctgcc ctgactttta tgcccagccc tggctcctgc cctccctgct 60 cctgggagta gattggccaa ccctagggtg tggctccaca gggtgaggtc taagtgatga 120 cagccgtacc tgtccttggc tcttctggca ctggcttagg agttggactt caaaccctca 180 gccctccctc taagatatat ctcttggccc cataccatca gtacaaattg ctactaaaaa 240 catcctcctt tgcaagtgta tttac 265 <210> 12 <211> 879 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 taggtattga ataagaaaaa tgaagttaag gtggttgatg gtaacactat gctaataact 60 gcagagccag aagcaccata agggacatga taagggagcc agcagacctc tgatctcttc 120 ctgaatgcta atcttaaaca tcctgaggaa gaatgggact tccatttggg gtgggcctat 180 gatagggtaa taagacagta gtgaatatca agctacaaaa agcccccttt caaattcttc 240 tcagtcctaa cttttcatac taagcccagt ccttccaaag cagactgtga aagagtgata 300 gttccgggag actagcactg cagattccgg gtcactgtga gtgggggagg cagggaagaa 360 gggctcacag gacagtcaaa ccatgccccc tgtttttcct tcttcaagta gacctctata 420 agacaacaga gacaactaag gctgagtggc caggcgagga gaaaccatct cgccgtaaaa 480 catggaagga acacttcagg ggaaaggtgg tatctctaag caagagaact gagtggagtc 540 aaggctgaga gatgcaggat aagcaaatgg gtagtgaaaa gacattcatg aggacagcta 600 aaacaataag taatgtaaaa tacagcatag caaaacttta acctccaaat caagcctcta 660 cttgaatcct tttctgaggg atgaataagg cataggcatc aggggctgtt gccaatgtgc 720 attagctgtt tgcagcctca ccttctttca tggagtttaa gatatagtgt attttcccaa 780 ggtttgaact agctcttcat ttctttatgt tttaaatgca ctgacctccc acattccctt 840 tttagtaaaa tattcagaaa taatttaaat acatcattg 879 <210> 13 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 tctcccacgc cctggtctca gcttggggag tggtcagacc ccaatggcga taaactctgg 60 caactttatc tgtgcactgc aggctcagcc ccaacagctt tagctttcac aagcaggcag 120 gggaagggaa acacatatct ccagatatga gg 152 <210> 14 <211> 157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 ctaaacccct cccccaccct agccccaagc ttcatcttag ctccactcct gaccctatcc 60 agctaaaggt ccccacccag ctcctgccta tctagtcatt gcatatggca agacttgaaa 120 gtcctatctc 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ctctctctct ctctctgaca 180 cattttatct tgcca 195 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 caccaggtgg cgct 14 <210> 19 <211> 81706 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggatcctcac atgagttcag tatataattg taacagaata aaaaatcaat tatgtattca 60 agttgctagt gtcttaagag gttcacattt ttatctaact gattatcaca aaaatacttc 120 gagttacttt tcattataat tcctgactac acatgaagag actgacacgt aggtgcctta 180 cttaggtagg ttaagtaatt tatccaaaac cacacaatgt agaacctaag ctgattcggc 240 catagaaaca caatatgtgg tataaatgag acagagggat ttctctcctt cctatgctgt 300 cagatgaata ctgagataga atatttagtt catctatcac acattaaacg ggactttaca 360 tttctgtctg ttgaagattt gggtgtgggg ataactcaag gtatcatatc caagggatgg 420 atgaaggcag gtgactctaa cagaaaggga aaggatgttg gcaaggctat gttcatgaaa 480 gtatatgtaa aatccacatt aagcttcttt ctgcatgcat tggcaatgtt tatgaataat 540 gtgtatgtaa aagtgtgctg tatattcaaa agtgtttcat gtgcctaggg gtgtcaaata 600 ctttgagttt gtaagtatat acttctctgt aatgtgtctg aatatctcta tttacttgat 660 tctcaataag taggtatcat agtgaacatc tgacaaatgt 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<213> Homo sapiens <400> 21 taagcttcag tttttcctta gttcctgtta catttctgtg tgtctccatt agtgacctcc 60 catagtccaa gcatgagcag ttctggccag gcccctgtcg gggtcagtgc cccacccccg 120 ccttctggtt ctgtgtaacc ttctaagcaa accttctggc tcaagcacag caatgctgag 180 tcatgatgag tcatgctgag gctagggtgt gtgcccagat gttctcagcc tagagtgatg 240 actcctatct gggtccccag caggatgctt acagggcaga tggcaaaaaa aaggagaagc 300 tgaccacctg actaaaactc cacctcaaac ggcatcataa agaaaatgga tgcctgagac 360 agaatgtgac atattctaga atatatt 387 <210> 22 <211> 286 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ctgagcaact aactcatgca ggactctcaa acactaacct atagcctttt ctatgtatct 60 acttgtgtag aaaccaagcg tggggactga gaaggcaata gcaggagcat tctgactctc 120 actgcctttg gctaggtccc tccctcatca cagctcagca tagtccgagc tcttatctat 180 atccacacac agtttctgac gctgcccagc tatcaccatc ccaagtctaa agaaaaaaat 240 aatgggtttg cccatctctg ttgattagaa aacaaaacaa aataaa 286 <210> 23 <211> 286 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ctgagcaact aatcatgcag gactctcaaa cactaaccta tagccttttc tatgtatcta 60 cttgtgtaga aaccaagcgt ggggactgag aaggcaatag caggagcatt ctgactctca 120 ctgcctttag ctaggcccct ccctcatcac agctcagcat agtcctgagc tcttatctat 180 atccacacac agtttctgac gctgcccagc tatcaccatc ccaagtctaa agaaaaaaat 240 aatgggtttg cccatctctg ttgattagaa aacaaaacaa aataaa 286 <210> 24 <211> 301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ccaatcgtgg catatcctct aaactttctt ttcccttcat aaatcctctt tctttttttt 60 ccccctcaca gttttcctga acaggttgac tattaattgt gtctgcttga tgtggacacc 120 aggtggcgct ggacatcaga tttggagagg cagttgtcta gggaaccggg ctctgtgcca 180 gcgcaggagg caggctggct ctcctattcc agggatgctc atccaggaag gaaaggttgc 240 atgctggaca cactaacctt gaagaattct tctgtctctc tcgtcattta gaaaggaagg 300 a 301 <210> 25 <211> 305 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ctagccaatc gtggcatatc ctctaaactt tcttttccct tcataaatcc tctttctttt 60 ttttccccct cacagttttc ctgaacaggt tgactattaa ttgtgtctgc ttgatgtgga 120 caccaggtgg cgctggacat cagatttgga gaggcagttg tctagggaac cgggctctgt 180 gccagcgcag gaggcaggct ggctctccta ctccagggat gctcatccag gaaggaaagg 240 ttgcatgctg gacacactaa ccttgaagaa ttcttctgtc tctctcgtca tttagaaagg 300 aagga 305 <210> 26 <211> 896 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 ctcgagttaa ttaatctccc acgccctggt ctcagcttgg ggagtggtca gaccccaatg 60 gcgataaact ctggcaactt tatctgtgca ctgcaggctc agccccaaca gctttagctt 120 tcacaagcag gcaggggaag ggaaacacat atctccagat atgaggttaa ttaacctgca 180 ggctaaaccc ctcccccacc ctagccccaa gcttcatctt agctccactc ctgaccctat 240 ccagctaaag gtccccaccc agctcctgcc tatctagtca ttgcatatgg caagacttga 300 aagtcctatc tcaaagcagc agaattatca gctacgactc ctgcaggtta taaccatccc 360 ccagcactcc ctgcccccac agcccagact tgaccaactc ccagctccgc ctgggacttc 420 cagatatggg gccccaccct tgcaggcctt ggggacgctg aagatattga ctatctgcgt 480 gccggaaaag ggtgttataa accggtaaag gctgggggtg ggagtagcgg atttgaagca 540 cttgttggcc tacagaggtg tggcaagcag agcacctcag aactcaggcg tactgcccgc 600 cgcccgagcc ctgcgagggc cgatagcgag ggtgtggccc ttatctgcac ccagcagagc 660 gccggcgggg tacggtcacc ggtcccgggc agttgcctca gctgagtatg tcttctaaag 720 ataatgtcga ttgtgtatgg ctgatgggat tctaggacca agcaagaggt tttttttttt 780 cccccacata cttaacgttt ctatatttct atttgaattc gactggacag ttccatttga 840 attatttctc tctctctctc tctctgacac attttatctt gccacccggg ctcgag 896

Claims (137)

  1. 서열번호 18에 기재된 CTCF 결합 부위 서열을 포함하는 인슐레이터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    서열번호 24 또는 서열번호 25를 포함하는 인슐레이터.
  3. 청구항 2에 있어서,
    서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 인슐레이터.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 인슐레이터, 및 β-글로빈 좌위 조절 영역(LCR)의 영역에 작동가능하게 연결된 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분을 포함하는 발현 카세트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 Dnase I 과민감성 부위-2(HS2) 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 코어 서열을 포함하지 않는 발현 카세트.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 HS2의 코어 서열은 서열번호 20에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 HS2의 코어 서열은 서열번호 21에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  9. 청구항 4에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2의 인핸서 활성을 유지하는 HS2 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  10. 청구항 4 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 Dnase I 과민감성 부위-1(HS1) 영역, Dnase I 과민감성 부위-3(HS3) 영역 및 Dnase I 과민감성 부위-4(HS4) 영역을 포함하는 발현 카세트.
  11. 청구항 10항에 있어서,
    상기 HS3 영역은 상기 HS1 영역과 HS4 영역 사이에 위치하는 발현 카세트.
  12. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 HS1 영역은 약 1.1 kb의 길이를 갖는 발현 카세트.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 HS1 영역은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  14. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 HS1 영역은 약 600 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 HS1 영역은 602 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 HS1 영역은 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  17. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 HS1 영역은 약 490 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 HS1 영역은 489 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 HS1 영역은 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  20. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 코어 서열을 포함하지 않는 발현 카세트.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 HS1의 코어 서열은 서열번호 22에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 HS1의 코어 서열은 서열번호 23에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  24. 청구항 20에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1의 기능을 유지하는 HS1 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  25. 청구항 20 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 발현 카세트.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 HS3 영역은 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 HS4 영역 사이에 위치하는 발현 카세트.
  27. 청구항 10 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HS3 영역은 약 1300 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 HS3 영역은 1301 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 HS3 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  30. 청구항 10 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HS4 영역은 약 1.1 kb의 길이를 갖는 발현 카세트.
  31. 청구항 30에 있어서,
    상기 HS4 영역은 1065 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  32. 청구항 31에 있어서,
    상기 HS4 영역은 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  33. 청구항 31에 있어서,
    상기 HS4 영역은 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  34. 청구항 10 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HS4 영역은 약 450 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 HS4 영역은 446 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 HS4 영역은 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  37. 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역, 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  38. 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역, 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  39. 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS1 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역, 및 서열번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  40. 청구항 20 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역 및 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하고, 상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역 또는 HS2 영역을 포함하지 않는 발현 카세트.
  41. 청구항 4에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS2 영역, HS3 영역 및 HS4 영역을 포함하는 발현 카세트.
  42. 청구항 41에 있어서,
    상기 HS2 영역은 860 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 HS2 영역은 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  44. 청구항 41 또는 청구항 42에 있어서,
    상기 HS3 영역은 약 1300 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  45. 청구항 44에 있어서,
    상기 HS3 영역은 1301 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 HS3 영역은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  47. 청구항 41 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 HS4 영역은 약 1.1 kb의 길이를 갖는 발현 카세트.
  48. 청구항 47에 있어서,
    상기 HS4 영역은 1065 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  49. 청구항 49에 있어서,
    상기 HS4 영역은 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  50. 청구항 41에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 서열번호 9에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS2 영역, 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS3 영역, 및 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 HS4 영역을 포함하는 발현 카세트.
  51. 청구항 41 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 β-글로빈 LCR 영역은 HS1 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트.
  52. 청구항 4 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 글로빈 유전자는 β-글로빈 유전자, γ-글로빈 유전자 및 δ-글로빈 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 발현 카세트.
  53. 청구항 52에 있어서,
    상기 글로빈 유전자는 인간 β-글로빈 유전자인 발현 카세트.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 유전자는 야생형 인간 β-글로빈 유전자, 인트론 서열의 하나 이상의 결실을 포함하는 결실된 인간 β-글로빈 유전자, 및 하나 이상의 항-겸상화 아미노산 잔기를 암호화하는 돌연변이된 인간 β-글로빈 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 발현 카세트.
  55. 청구항 54에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 유전자는 코돈 87에서 글루타민으로의 쓰레오닌의 돌연변이를 암호화하는 인간 βA-글로빈 유전자(βA-T87Q)인 발현 카세트.
  56. 청구항 4 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 1개의 인슐레이터를 포함하는 발현 카세트.
  57. 청구항 4 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 2개의 인슐레이터를 포함하는 발현 카세트.
  58. 청구항 4 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
    β-글로빈 프로모터를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 β-글로빈 프로모터는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 β-글로빈 LCR 영역 사이에 위치하는 발현 카세트.
  60. 청구항 58 또는 청구항 59에 있어서,
    상기 β-글로빈 프로모터는 약 613 bp의 길이를 갖는 인간 β-글로빈 프로모터인 발현 카세트.
  61. 청구항 60에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 프로모터는 서열번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  62. 청구항 58 또는 청구항 59에 있어서,
    상기 β-글로빈 프로모터는 약 265 bp의 길이를 갖는 인간 β-글로빈 프로모터인 발현 카세트.
  63. 청구항 62에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 프로모터는 서열번호 11에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  64. 청구항 4 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 β-글로빈 3' 인핸서를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  65. 청구항 64에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 업스트림에 위치하는 발현 카세트.
  66. 청구항 64 또는 청구항 65에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 약 879 bp의 길이를 갖는 발현 카세트.
  67. 청구항 66에 있어서,
    상기 인간 β-글로빈 3' 인핸서는 서열번호 12에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  68. 청구항 5 내지 청구항 67 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  69. 청구항 68에 있어서,
    상기 하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서는 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분과 β-글로빈 LCR 영역 사이에 위치하는 발현 카세트.
  70. 청구항 68 또는 청구항 69에 있어서,
    상기 하나 이상의 적혈구-특이적 인핸서는 서열번호 13, 14, 15, 16 및 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 카세트.
  71. 청구항 68 내지 청구항 70 중 어느 한 항에 있어서,
    1개, 2개 또는 3개의 적혈구-특이적 인핸서를 포함하는 발현 카세트.
  72. 청구항 4 내지 청구항 71 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 포유동물에서 상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 발현을 가능하게 하는 발현 카세트.
  73. 청구항 72에 있어서,
    상기 발현 카세트는 인간 β-글로빈 유전자의 발현을 가능하게 하는 발현 카세트.
  74. 청구항 71 또는 청구항 72에 있어서,
    상기 글로빈 유전자 또는 이의 기능성 부분의 발현은 적혈구 조직으로 제한되는 발현 카세트.
  75. 청구항 4 내지 청구항 74 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
  76. 청구항 75에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 레트로바이러스 벡터인 재조합 벡터.
  77. 청구항 76에 있어서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 재조합 벡터.
  78. 청구항 75 내지 청구항 77 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 1개의 인슐레이터를 포함하는 재조합 벡터.
  79. 청구항 75 내지 청구항 77 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)에서 우드척 간염 후-조절 요소(WPRE)를 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  80. 청구항 79에 있어서,
    상기 벡터의 3' 긴 말단 반복부(LTR)에서 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  81. 청구항 4 내지 청구항 74 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 비-천연 생성 또는 조작된 뉴클레아제.
  82. 청구항 81에 있어서,
    상기 뉴클레아제는 비-천연 생성 또는 조작된 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 비-천연 생성 또는 조작된 메가뉴클레아제, 및 비-천연 생성 또는 조작된 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레아제.
  83. 청구항 81 또는 청구항 82에 있어서,
    상기 뉴클레아제는 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 뉴클레아제.
  84. 청구항 81 내지 청구항 83 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레아제는 게놈 세이프 하버 부위에 결합하는 뉴클레아제.
  85. 청구항 84에 있어서,
    상기 뉴클레아제는 상기 게놈 세이프 하버 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 발생시키는 뉴클레아제.
  86. 청구항 84 또는 청구항 85에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 유전자외적 게놈 세이프 하버 부위인 뉴클레아제.
  87. 청구항 84 내지 청구항 86 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 염색체 1 상에 위치하는 뉴클레아제.
  88. 청구항 84 내지 청구항 86 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 하기 5개의 기준들 전부를 충족시키는 뉴클레아제: (ⅰ) 임의의 유전자의 5' 말단(예를 들면, 상기 유전자의 5' 말단)으로부터 적어도 50 kb의 거리, (ⅱ) 임의의 암 관련 유전자로부터 적어도 300 kb의 거리, (ⅲ) (천연 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 DNA 절단에 의해 측정된) 개방된/접근가능한 염색질 구조 내부에 위치, (ⅳ) 유전자 전사 유닛 외부에 위치, 및 (ⅴ) 인간 게놈의 초보존된 영역(UCR), microRNA 또는 긴 비-코딩 RNA 외부에 위치.
  89. 청구항 81 내지 청구항 88 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 2개의 인슐레이터를 포함하는 뉴클레아제.
  90. 청구항 81 내지 청구항 89 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트의 표적화된 전달을 가능하게 하는 뉴클레아제.
  91. 청구항 81 내지 청구항 90 중 어느 한 항의 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  92. 청구항 91의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  93. 청구항 92에 있어서,
    상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  94. 청구항 4 내지 청구항 74 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 비-천연 생성 또는 조작된 CRISPR-Cas 시스템.
  95. 청구항 94에 있어서,
    상기 CRISPR-Cas 시스템은 상기 CRISPR-Cas 뉴클레아제 및 단일-가이드 RNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템.
  96. 청구항 94 또는 청구항 95에 있어서,
    상기 CRISPR-Cas 시스템은 게놈 세이프 하버 부위에 결합하는 CRISPR-Cas 시스템.
  97. 청구항 96에 있어서,
    상기 CRISPR-Cas 시스템은 상기 게놈 세이프 하버 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 발생시키는 CRISPR-Cas 시스템.
  98. 청구항 96 또는 청구항 97에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 유전자외적 게놈 세이프 하버 부위인 CRISPR-Cas 시스템.
  99. 청구항 96 내지 청구항 98 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 염색체 1 상에 위치하는 CRISPR-Cas 시스템.
  100. 청구항 96 내지 청구항 99 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 게놈 세이프 하버 부위는 하기 5개의 기준들 전부를 충족시키는 CRISPR-Cas 시스템: (ⅰ) 임의의 유전자의 5' 말단(예를 들면, 상기 유전자의 5' 말단)으로부터 적어도 50 kb의 거리, (ⅱ) 임의의 암 관련 유전자로부터 적어도 300 kb의 거리, (ⅲ) (천연 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 DNA 절단에 의해 측정된) 개방된/접근가능한 염색질 구조 내부에 위치, (ⅳ) 유전자 전사 유닛 외부에 위치, 및 (ⅴ) 인간 게놈의 초보존된 영역(UCR), microRNA 또는 긴 비-코딩 RNA 외부에 위치.
  101. 청구항 94 내지 청구항 100 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 1에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 2개의 인슐레이터를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템.
  102. 청구항 94 내지 청구항 101 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 발현 카세트의 표적화된 전달을 가능하게 하는 CRISPR-Cas 시스템.
  103. 청구항 94 내지 청구항 102 중 어느 한 항의 CRISPR-Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  104. 청구항 103의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  105. 청구항 104에 있어서,
    상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  106. 청구항 4 내지 청구항 74 중 어느 한 항의 발현 카세트로 형질도입된 세포.
  107. 청구항 75 내지 청구항 80 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질도입된 세포.
  108. 청구항 81 내지 청구항 90 중 어느 한 항의 뉴클레아제로 형질도입된 세포.
  109. 청구항 94 내지 청구항 102 중 어느 한 항의 CRISPR-Cas 시스템으로 형질도입된 세포.
  110. 청구항 92, 청구항 93, 청구항 104 및 청구항 105 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입된 세포.
  111. 청구항 106 내지 청구항 110 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포 및 조혈발생 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포.
  112. 청구항 111에 있어서,
    상기 조혈 줄기 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포인 세포.
  113. 청구항 106 내지 청구항 112 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 생체외에서 형질도입되는 세포.
  114. 유효량의 청구항 106 내지 청구항 113 중 어느 한 항의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  115. 유효량의 청구항 106 내지 청구항 113 중 어느 한 항의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 헤모글로빈병증 치료용 약학 조성물.
  116. 청구항 115에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 지중해빈혈 메이저, 지중해빈혈 인터메디아, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  117. 청구항 116에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈인 약학 조성물.
  118. 청구항 116에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 겸상 세포 빈혈인 약학 조성물.
  119. 청구항 106 내지 청구항 113 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 헤모글로빈병증 치료용 키트.
  120. 청구항 119에 있어서,
    상기 키트는 헤모글로빈병증을 갖는 대상체를 치료하기 위해 상기 세포를 사용하기 위한 기록된 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  121. 청구항 119 또는 청구항 120에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 지중해빈혈 메이저, 지중해빈혈 인터메디아, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  122. 청구항 121에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈인 키트.
  123. 청구항 121에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 겸상 세포 빈혈인 키트.
  124. 청구항 106 내지 청구항 113 중 어느 한 항의 세포를 대상체에게 유효량 투여함으로써, 정상 헤모글로빈을 함유하는 적혈구 세포를 생성하는 대상체의 능력을 회복시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 헤모글로빈병증을 치료하는 방법.
  125. 청구항 124에 있어서,
    치료적으로 적절한 수준의 헤모글로빈이 상기 세포를 대상체에게 투여한 후 상기 대상체에서 생성되는 방법.
  126. 청구항 75 내지 청구항 80 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질도입된 세포를 유효량 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  127. 청구항 126에 있어서,
    상기 대상체에서 치료적으로 적절한 수준의 헤모글로빈을 제공하는 상기 세포 내의 재조합 벡터의 벡터 카피 수는 세포당 약 0.5 내지 2 벡터 카피 수인 방법.
  128. 청구항 124 내지 청구항 127 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 대상체에서 비효과적인 적혈구생성을 보정하는 방법.
  129. 청구항 124 내지 청구항 128 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 대상체에게 이식편-대-숙주 질환의 위험을 발생시키지 않는 방법.
  130. 청구항 124 내지 청구항 129 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 면역억제제를 투여하는 단계를 포함하지 않는 방법.
  131. 청구항 124 내지 청구항 130 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상 세포 질환(SCD), 겸상 세포 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해빈혈, β-지중해빈혈, 지중해빈혈 메이저, 지중해빈혈 인터메디아, α-지중해빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  132. 청구항 131에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 β-지중해빈혈인 방법.
  133. 청구항 131에 있어서,
    상기 헤모글로빈병증은 겸상 세포 빈혈인 방법.
  134. 청구항 124 내지 청구항 133 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기 세포 및 조혈발생 내피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  135. 청구항 124 내지 청구항 134 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체는 인간인 방법.
  136. 청구항 124 내지 청구항 135 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 상기 대상체로부터 유래되는 방법.
  137. 청구항 136에 있어서,
    상기 세포는 상기 대상체의 골수로부터 유래되는 방법.
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