CN113564248A - 同时检测hba1/2、hbb和hbd基因位点多种突变的方法和试剂盒 - Google Patents

同时检测hba1/2、hbb和hbd基因位点多种突变的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变的引物组、试剂盒和方法。其中所述试剂盒包括以下试剂：（1）用于多重PCR扩增的试剂；和（2）用于构建三代测序文库的试剂。其中所述方法包括以下步骤：（1）制备受试者样本；（2）多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2、HBB和HBD基因片段；（3）构建三代测序文库；（4）测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型。

Description

同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种利用三代长读长测序平台同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因多种突变的引物组合和方法，以及适用于此方法的试剂盒。
背景技术
α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足会导致珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血（简称地贫）。地贫主要分为α-地贫和β-地贫，是世界上最常见的单基因遗传病，属常染色体隐性遗传，高发地区包括中国南方、东南亚、地中海地区、印度、中东和非洲等地区1,2,3。
人源α-珠蛋白基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’-HBZ-HBZps-HBM-HBA1ps-HBA2(α1)-HBA1(α1)-HBQ-3’。其中只有HBA1和 HBA2两个基因在胚胎和成年人中都具有编码珠蛋白的能力。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型突变和非缺失型突变。我国最常见的缺失型HBA1和HBA2基因的突变为-α3.7，-α4.2，和--SEA，非缺失型突变为HBA2:c.369C>G，HBA2: c.377T>C，HBA2: c.427T>C。这六种基因突变占中国人群α-地贫总数的98%，因此现有的临床常规分子诊断主要针对上述突变3,4,5。随着α-地贫致病机制的不断阐明，越来越多的突变类型被发现。综合Ithanet，HbVar，LOVD和LOVD-China地贫数据库，目前在世界范围已经发现约50种α-珠蛋白基因簇区域的缺失，和超过900种HBA1和HBA2基因的非缺失型突变可导致α-珠蛋白表达的减低或缺失。除此之外还有些罕见的结构变异，如αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα和antiHKαα等。传统的Gap-PCR方法难以检测罕见的结构变异，且无法区分HKαα和-α3.7，也无法区分antiHKαα和-α4.2，在筛选时会导致误诊6。而准确区分这些基因型需要借助不同的PCR体系，无法在同一体系内实现同时检测。这些说明α-地贫有较广的基因突变谱，增加目前α-地贫基因缺陷的筛查范围，将会有效避免异常基因型的漏检。
人源β-珠蛋白基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5’-HBE-HBG2-HBG1-HBD(δ)-HBB(β)-3’。其中HBB基因在成年人中编码珠蛋白，其他四个基因均在胚胎发育过程中表达，或者在成年人中表达量非常低。绝大多数导致β地贫的突变是非缺失的，少数为大片段缺失7,8。综合Ithanet，HbVar，LOVD和LOVD-China地贫数据库，目前在世界范围已经发现超过1000种HBB基因的非缺失型突变。迄今为止在中国人群中发现了129种β-珠蛋白基因非缺失型突变，但目前主要检测的主要是已知常见的17个位点19种突变，包括c.-82C>A、c.52A>T、c.94delC、c.126_129delCTTT、c.216_217insA、c.216_217insT等9。这19种突变约占我国南方β-地中海贫血突变构成比的99%，根据这19种变异已建立了针对性的检测系统，但目前缺乏可行的方法实现一次性检测所有的HBB基因缺失型与非缺失型突变。
HBD基因在胚胎发育中编码珠蛋白，迄今为止已报道了 50 多个缺失的 HPFH/δβ-地贫和 130 个δ-珠蛋白基因突变10。δ-地贫是一种没有临床后果的地贫，是由 δ-珠蛋白基因突变导致 HbA2水平降低引起的，虽然 δ-地贫没有临床意义，但δ-珠蛋白的功能破坏可能导致HbA2的测量异常，并且在依赖患者的HbA2测量值时可能使β-地贫的诊断复杂化11。在地贫流行地区，因HPFH或δ地贫与α或β地贫共存会导致地贫误诊漏诊，检测缺失的HPFH/δβ地贫和δ-珠蛋白基因突变很重要。除此之外还有些罕见的结构变异，如anti-Lepore等。增加HBD基因诊断会有效的减少地贫误诊漏诊的情况。
目前检测地贫基因缺失型和非缺失型突变的试剂盒大多基于多重Gap-PCR和PCR-RDB等方法，主要检测常见的3个HBA2和17个HBB基因突变位点。这些检测试剂盒主要有以下几个方面局限：
1、无法实现在同一体系内同时检测缺失型和非缺失型α-、β-和δ-地中海贫血相关突变检测；
2、只检测常见的地贫突变，覆盖范围有限，容易造成漏检，比如罕见的HBA1/2、HBB 和HBD基因点突变，以及anti-Lepore、αααanti3.7和αααanti4.2等结构变异；
3、常规的Gap-PCR无法区分α-地贫的-α3.7缺失和HKαα结构变异，也无法区分-α4.2缺失和antiHKαα结构变异，会造成一定程度的误检；
4、当HBA1/2、HBB和HBD基因位点上同时存在两个或多个突变时，现有的方法无法区分顺式还是反式突变。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种基于多重PCR扩增和三代测序的方法来同时检测HBA1/ 2、HBB和HBD基因区域多种突变。多重PCR扩增可在单反应管中实现同时扩增HBA1/2、HBB和 HBD基因缺失型和非缺失型突变，而三代测序平台具有读长测长、校准精确度高和高通量等特点，可以实现准确、快速并高通量地检测HBA1/2、HBB和HBD基因突变。本发明涉及的方法操作简便，多重PCR和三代文库质量可靠且重复性强，有利于三代测序技术在临床检测上的应用。
本发明的目的在于解决现阶段HBA1/2、HBB和HBD基因突变检测存在精确度低和不能同时检测多种缺失和非缺失突变，无法确定突变是否连锁，无法检测非常见突变，临床上存在漏检和误检等问题。通过多重PCR同时扩增HBA1/2、HBB和HBD基因突变片段及制备三代测序文库，实现精确和快速检测多个样品HBA1/2、HBB和HBD基因多种突变的目标。
本发明第一方面提供了一种引物组，其可以同时扩增HBA1/2、HBB和HBD基因的多种突变，例如可以同时检测：HBA1/2基因位点上引物范围内所有点突变，30种大片段缺失（包括--SEA，-α3.7，-α4.2，--THAI和--FIL等，如表1所示）和6种结构变异（αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα，antiHKαα；ααααanti3.7，和ααααanti4.2）；HBB和HBD基因位点上引物范围内所有点突变，28种大片段缺失（包括ChineseGγ(Aγδβ)0-Thal和SEA-HPFH等，如表2所示）和2种结构变异（Hb Anti-Lepore和Hb Miyada）。
表1：可检测的HBA1/2基因上30种大片段缺失
Figure 750195DEST_PATH_IMAGE001
表2：可检测的HBB和HBD基因上28种大片段缺失
Figure 401756DEST_PATH_IMAGE002
本发明的引物组合可以同时检测并区分-α3.7、αααanti4.2和HKαα三种突变类型，还可以同时检测并区分-α4.2、αααanti3.7和antiHKαα三种突变类型。
根据本发明的一个实施方案，所述引物组包括：
1）HBA正向引物，选自以下的一个或多个：HBA-F1、HBA-F2、HBA-F3、HBA-F4、HBA-F5；
2）HBA反向引物，选自以下的一个或多个：HBA-R1、HBA-R2；
3）HBBD正向引物，选自以下的一个或多个：HBBD-F1、HBBD-F2、HBBD-F3、HBBD-F4、HBBD-F5、HBBD-F6、HBBD-F7、HBBD-F8、HBBD-F9；和
4）HBBD反向引物，选自以下的一个或多个：HBBD-R1、HBBD-R2、HBBD-R3。
其中，所述引物设计示意图如图1A至图1B所示，引物基因组坐标位置范围如表3所示。所述引物可以扩增HBA1/2、HBB和HBD基因的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物小于25Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
表3：引物位置信息
Figure 243810DEST_PATH_IMAGE003
根据一个优选的实施方案，所述引物组中包含上述的19条引物。更优选地，其中所述引物序列如表4中SEQ ID NO: 1-19所示。
表4：引物信息
Figure 435757DEST_PATH_IMAGE004
在一个实施方案中，在所述引物5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），即条形码，可用于区分不同的样本。
在一个实施方案中，F和R引物的5’端Barcode可以相同或者不相同，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实验方案，其中所述引物组用于多重PCR扩增HBA1/2、HBB和HBD基因片段。再结合后续的PacBio测序平台，可以检测引物范围内所有的HBA1/2、HBB和HBD基因片段的突变类型。
本发明第二方面提供了一种可以同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因多种突变的试剂盒，包括以下试剂：
（1）用于多重PCR扩增HBA1/2、HBB和HBD基因片段的试剂；和
（2）用于构建三代测序文库的试剂。
根据本发明的一个实施方案，其中所述用于多重PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物组。
根据本发明的一个实施方案，其中所述引物组选自本文上述的引物组。
根据本发明的一个实施方案，所述引物族中，包括上文所述的19条引物，引物设计示意图如图1A至图1B所示，引物基因组坐标位置范围如表3所示。所述引物可以扩增HBA1/ 2、HBB和HBD基因的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物小于25Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
根据一个优选的实施方案，其中所述19条引物序列分别如表4中SEQ ID NO: 1-19所示。
在一个实施方案中，在所述引物5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），可用于区分不同的样本。
在一个实施方案中，F和R引物的5’端Barcode可以一样或者不一样，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，PCR扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，其中所述试剂盒可以同时检测：HBA1/2基因位点上引物范围内所有的点突变，30种大片段缺失（包括--SEA，-α3.7，-α4.2，--THAI和--FIL等，如表1所示）和6种结构变异（αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα，antiHKαα；ααααanti3.7，和ααααanti4.2）；HBB和HBD基因位点上引物范围内所有的点突变，28种大片段缺失（包括ChineseGγ(Aγδβ)0-Thal和SEA-HPFH等，如表2所示）和2种结构变异（Hb Anti-Lepore和HbMiyada）。
根据一个优选的实施方案，其中所述试剂盒可以同时检测并区分-α3.7、αααanti4.2和HKαα三种突变类型，还可以同时检测并区分-α4.2、αααanti3.7和antiHKαα三种突变类型。
根据一个优选的实施方案，其中所述试剂盒用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
根据一个优选的实施方案，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一个实施方案中，三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。
根据一个优选的实施方案，其中所述用于构建三代PacBio文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇、DNA修复混合液、反应缓冲液和外切酶。
在一个实施方案中，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，PacBio通用平末端接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’，通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’，通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，所述PacBio文库与Pacific Biosciences公司测序平台匹配。
根据一个优选的实施方案，其中所述用于构建三代Nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。
在一个实施方案中，Nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，Nanopore接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，所述Nanopore文库与ONT公司测序平台匹配。
本发明第三方面提供了一种检测受试者HBA1/2、HBB和HBD基因突变的方法，包括以下步骤：
（1）制备受试者样本；
（2）多重PCR扩增样本中HBA1/2、HBB和HBD基因突变片段；
（3）构建三代测序文库；
（4）测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型。其中，所述多重PCR扩增使用本发明上文所述的引物组。
本发明所述方法可以同时检测受试者HBA1/2、HBB和HBD基因多突变。
根据本发明的一个实施方案，所述多重PCR扩增引物有19条，引物设计示意图如图1A至图1B所示，引物基因组坐标位置范围如表3所示。所述引物可以扩增HBA1/2、HBB和HBD基因的完整全部序列，包括引物范围内任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物小于25Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
根据一个优选的实施方案，其中所述引物序列如表4中SEQ ID NO: 1-19所示。
在一个实施方案中，可以在所述引物5’端加入5-50nt不同序列的DNA（Barcode），用于区分不同的样本。
在一个实施方案中，F和R引物的5’端Barcode可以一样或者不一样，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，PCR扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，其中所述方法可以同时检测：HBA1/2基因位点上引物范围内所有点突变，30种大片段缺失（包括--SEA，-α3.7，-α4.2，--THAI和--FIL等，表1）和6种结构变异（αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα，antiHKαα；ααααanti3.7，和ααααanti4.2）；HBB和HBD基因位点上引物范围内所有点突变，28种大片段缺失（包括ChineseGγ(Aγδβ)0-Thal和SEA-HPFH等，表2）和2种结构变异（Hb Anti-Lepore和Hb Miyada）。
根据一个优选的实施方案，其中所述方法可以同时检测并区分-α3.7、αααanti4.2和HKαα三种突变类型，还可以同时检测并区分-α4.2、αααanti3.7和antiHKαα三种突变类型。
根据一个优选的实施方案，其中所述方法用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
根据一个优选的实施方案，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一个实施方案中，其中所述样本选自生物样本或样本提取的gDNA。其中生物样本选自培养的细胞系、血液、羊水、绒毛、配子、囊胚细胞、关节液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液等。
在一个实施方案中，三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或ONT公司的Nanopore测序。
在一个实施方案中，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，PacBio通用平末端接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’，通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案中，PacBio通用TA接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATT-3’，通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上5-50nt不同序列的DNA（Barcode）形成不同带Barcode的接头适
在一个实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，所述PacBio文库与Pacific Biosciences公司测序平台匹配。
根据一个优选的实施方案，其中所述用于构建三代Nanopore文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、80%乙醇和反应缓冲液。
在一个实施方案中，Nanopore文库接头连接可以使用平末端连接或TA连接的方式。
在一个实施方案中，Nanopore接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，Nanopore接头带ONT公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，所述Nanopore文库与ONT公司测序平台匹配。
本发明的另一方面，还涉及一种检测基因位点突变的系统，其可同时检测受试者HBA1/2、HBB和HBD基因位点的多种突变，所述系统包括以下模块：
（1）采集模块：获得受试者样本；
（2）扩增模块：多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2、HBB和HBD基因片段；
（3）文库构建模块：构建三代测序文库；
（4）测序模块：测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型。其中，所述扩增模块中，采用本发明上文所述的引物组。
在一个实施方案中，本发明所述系统用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
在优选的实施方案中，本发明所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
在一个实施方案中，本发明所述的三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。
基于PCR扩增和第三代高通量测序特定组合的本发明所述的方法可高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个样品HBA1/2、HBB和HBD基因多种突变。
本发明所述方法和试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面：
（1）检测范围广。本发明可以同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点引物范围内所有缺失型和非缺失型突变（表1和表2）。
（2）多种突变类型单管检测。传统的方法针对每种突变类型都需要设置一种检测体系，而本发明在一个反应引物体系里同时检测多种缺失型和非缺失型地贫突变，包括罕见的结构变异，如HKαα，antiHKαα，αααanti3.7，αααanti4.2，ααααanti3.7，ααααanti4.2等。
（3）检测准确性高。常规的GAP-PCR无法区分α-地贫的-α3.7缺失和HKαα结构变异，也无法区分-α4.2缺失和antiHKαα结构变异，会造成一定程度的误检。而本发明可以很好区分这些缺失突变和罕见结构变异。
（4）样本多样化。用于PCR的模板可以是经提取的基因组DNA，也可以是人源细胞系或特定的组织。
（5）高通量检测。三代测序可实现384种Barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种Barcode接头。或者利用引物带Barcode和接头带Barcode的双Barcode系统实现更多种Barcode组合。三代测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测。
（6）精确度高。PacBio的哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，矫正后测序结果碱基精确度大于99%。而且PacBio测序错误是随机的，再通过测序深度矫正碱基精确度大于99.9%。因此可以精确解读引物检测范围内的缺失型和非缺失型HBA1/2、HBB和HBD基因突变。同时，由于PacBio读长测长的特性，本发明的方法还可以检测不同突变是否连锁。
（7）检测时间灵活。Nanopore平台可在数分钟内产生数据，可根据实际数据量需求在数分钟或数小时内开启数据分析。当对检测时效要求比较高时，Nanopore平台具有时间优势。
附图说明
图1A至图1B：多重PCR引物设计示意图，其中图1A表示HBA1/2基因突变，和图1B表示HBB-HBD基因突变。
图2：根据实施例1中的多重PCR方法扩增不同缺失突变样本的DNA凝胶图。
图3：代表性的HBA1/2、HBB和HBD基因突变样本PacBio测序结果图。其中A是-α3.7/HKαα样本，B是αααanti3.7/αααanti4.2样本，C是--THAI/+样本，D是HBB: c.126_129delCTTT/c.-11_-8delAAA反式突变样本，E是HBD: c.-127T>C/+样本，F是Chinese G(γAγδβ)0-Thal/+样本。
具体实施方式
实施例1：利用本发明的多重PCR方法扩增不同HBA1/2、HBB和HBD基因突变
按照以下制备反应体系，扩增不同类型HBA1/2、HBB和HBD基因突变的外周血样本：
Figure 810981DEST_PATH_IMAGE005
在PCR仪上，按如下条件进行预扩增：
Figure 492498DEST_PATH_IMAGE006
扩增完成后，每个样本取20ul，在1%的DNA凝胶上检测，结果如图2所示，HBA1/2基因和HBB-HBD基因的不同缺失型突变和HBB基因均能有效扩增。
实施例2：利用本发明涉及的多重PCR方法构建PacBio测序文库
步骤1：多重PCR扩增
按照以下制备反应体系，扩增不同类型HBA1/2、HBB和HBD基因突变的外周血样本：
Figure 556269DEST_PATH_IMAGE005
在PCR仪上，按如下条件进行预扩增：
Figure 489590DEST_PATH_IMAGE006
扩增完成后，将扩增产物放入离心机中，10000rpm，离心20min。离心结束后水平静置放置，取4μL上清加入新的管内。
步骤2：构建PacBio测序文库
按照下示制备反应体系：
Figure 751944DEST_PATH_IMAGE007
在PCR仪上，按如下条件进行反应：37ºC 20 min; 25ºC 15 min; 65ºC 10 min。反应完成后，加入0.5 uL Exonuclease III(NEB, Cat#M0206L)和0.5 uL Exonuclease VII(NEB, Cat#M0379L)，继续在37ºC反应1小时。用0.6x Ampure PB磁珠（PacBio, Cat#100-265-900）依照制造商的说明书纯化两次，最后用10uL Elution Buffer洗脱DNA。所得DNA洗脱液即是目标DNAPacBio测序文库。用Qubit dsDNA HS试剂(ThermoFisher, Cat# Q32851)在Qubit 3 Fluoromter (ThermoFisher, Cat#Q33216)上测定DNA浓度。当有多个样本PacBio测序文库时，可以取等量的文库混合在一起，制备成混合文库。
步骤3：PacBio上机测序和分析
根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂(PacBio，Cat#101-820-200)和引物（PacBio, Cat#100-970-100）反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如图3所示，其中图3A是-α3.7/HKαα样本，图3B是αααanti3.7/αααanti4.2样本，图3C是--THAI/+样本，图3D是HBB: c.126_129delCTTT/c.-11_-8delAAA反式突变样本，图3E是HBD:c.-127T>C/+样本，图3F是Chinese G(γAγδβ)0-Thal/+样本。这些结果表明该方法可以同时准确检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变。
需要说明的是，多重PCR反应和PacBio测序文库构建中所涉及的反应试剂、反应条件等等均可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献
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Claims (20)

1.一种用于同时扩增HBA1/2、HBB和HBD基因突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
1）HBA正向引物，选自以下的一个或多个：HBA-F1、HBA-F2、HBA-F3、HBA-F4、HBA-F5；
2）HBA反向引物，选自以下的一个或多个：HBA-R1、HBA-R2；
3）HBBD正向引物，选自以下的一个或多个：HBBD-F1、HBBD-F2、HBBD-F3、HBBD-F4、HBBD-F5、HBBD-F6、HBBD-F7、HBBD-F8、HBBD-F9；和
4）HBBD反向引物，选自以下的一个或多个：HBBD-R1、HBBD-R2、HBBD-R3；
其中所述引物在基因组上的位置如下表所示：
Figure 478935DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组包括权利要求1中所述的19条引物。
3.根据权利要求2所述的引物组，其中所述引物组中引物序列如下所示：
Figure 967686DEST_PATH_IMAGE002
。
4.根据权利要求2所述的引物组，其中所述引物在5’端加上5-50nt不同序列的DNA，即Barcode，用于区分不同样本。
5.一种试剂盒，其能够同时检测HBA1/2、HBB和HBD基因位点多种突变，所述试剂盒包括以下试剂：
（1）用于多重PCR扩增HBA1/2、HBB和HBD基因片段的试剂；和
（2）用于构建三代测序文库的试剂；
其中，所述用于多重PCR扩增的试剂包括权利要求1-4任一项所述的引物组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述的突变至少包括以下的一种或多种：
HBA1/2基因位点上引物范围内所有点突变；
表示所示的30种大片段缺失；
选自αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα，antiHKαα；ααααanti3.7和ααααanti4.2的6种结构变异；
HBB和HBD基因位点上引物范围内所有点突变；
表2所示的28种大片段缺失；和
选自Hb Anti-Lepore和Hb Miyada的2种结构变异。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述用于多重PCR扩增的试剂还包括DNA聚合酶、反应缓冲液。
10.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。
11.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述用于构建三代测序文库的试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。
12.一种检测受试者HBA1/2、HBB和HBD基因位点突变的方法，包括以下步骤：
（1）制备受试者样本；
（2）多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2、HBB和HBD基因片段；
（3）构建三代测序文库；
（4）测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型；
其中，所述多重PCR步骤采用权利要求1-4任一项所述的引物组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的突变至少包括以下的一种或多种：
HBA1/2基因位点上引物范围内所有点突变；
表示所示的30种大片段缺失；
选自αααanti3.7，αααanti4.2，HKαα，antiHKαα；ααααanti3.7和ααααanti4.2的6种结构变异；
HBB和HBD基因位点上引物范围内所有点突变；
表2所示的28种大片段缺失；和
选自Hb Anti-Lepore和Hb Miyada的2种结构变异。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。
17.一种检测基因位点突变的系统，其可同时检测受试者HBA1/2、HBB和HBD基因位点的多种突变，所述系统包括以下模块：
（1）采集模块：获得受试者样本；
（2）扩增模块：多重PCR同时扩增所述样本中HBA1/2、HBB和HBD基因片段；
（3）文库构建模块：构建三代测序文库；
（4）测序模块：测序并分析HBA1/2、HBB和HBD基因突变类型；
其中，所述扩增模块中，采用权利要求1-4任一项所述的引物组。
18.根据权利要求17所述的系统，其中所述系统用于检测HBA1/2、HBB和HBD基因的不同突变是否连锁。
19.根据权利要求17所述的系统，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
20.根据权利要求17所述的系统，其中所述三代测序选自Pacific Biosciences公司的PacBio测序或Oxford Nanopore Technologies（ONT）的Nanopore测序。
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