CN112080558B - 同时检测hba1/2和hbb基因突变的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒和方法，其中所述试剂盒包括以下试剂：(1)用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段的试剂；和(2)用于构建PacBio文库的试剂。

Description

同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及一种利用PacBio长读长测序平台同时检测HBA1/2和HBB基因突变的方法，以及适用于此方法的试剂盒。
背景技术
血红蛋白(Hemoglobin，简称Hb)是红细胞内运输氧的特殊蛋白质。成年人血红蛋白(Adult Hemoglobin，简称HbA)是由两对α-珠蛋白和两对β-珠蛋白组成的四聚体。α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足会导致珠蛋白生成障碍性贫血，又称地中海贫血。由α-珠蛋白基因突变引起的α珠蛋白缺失或不足称为α-地中海贫血(简称α-地贫)；由β-珠蛋白基因突变引起的β珠蛋白缺失或不足称为β-地中海贫血(简称β-地贫)。地贫是世界上最常见的单基因遗传病，属常染色体隐性遗传，主要分布在地中海沿岸和东南亚国家等。
人源α-珠蛋白(alpha-globin)基因簇位于16号染色体，共包含7个基因位点：5’-zeta-pseudozeta-mu-psedudoalpha-1-alpha-2-alpha-1-theta-3’。其中只有HBA1(alpha-1)和HBA2(alpha-2)两个基因在胚胎和成年人中具有编码珠蛋白的能力，其他均为假基因或预测基因，或只在胚胎发育早期翻译表达珠蛋白。HBA1和HBA2基因的编码区域完全相同，在5’非编码区(UTR)和内含子区域有少量碱基的不同，主要的差别集中在3’UTR。HBA1和HBA2基因的突变包括缺失型和非缺失型突变。目前已经发现约50种α-珠蛋白基因簇区域的缺失可导致α-珠蛋白表达的减低或缺失，其中最常见的三种缺失型是-α3.7、-α4.2和--SEA。如图1所示，HBA1和HBA2基因区域和附近有两个约4Kb的进化上高度同源区域，按照序列可分为X/Y/Z和X2/Y2/Z2。Z和Z2区域相隔3.7Kb，两个区域之间的重组会导致α-珠蛋白基因缺失1个拷贝，产生-α3.7缺失型突变。X和X2区域相隔4.2Kb，两个区域之间的重组也会导致α-珠蛋白基因缺失1个拷贝，产生-α4.2缺失型突变。而--SEA缺失区域超过19Kb，包含α-珠蛋白基因簇中HBA1和HBA2在内的多个基因。目前全球已报道至少70种导致点α-珠蛋白表达降低或缺失的点突变，其中在中国最常见的三种点突变类型是位于HBA2基因上的QS、CS和WS。
人源β-珠蛋白(beta-globin)基因簇位于11号染色体，共包含5个基因位点：5’-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta-3’。其中只有HBB(beta)基因在成年人中编码珠蛋白，其他四个基因均在胚胎发育过程中表达，或者在成年人中表达量非常低。HBB基因的突变主要是非缺失型突变，包括单点突变，小的插入和缺失等。目前全球已经有超过300种HBB基因的突变被报道，但是其中会引起90％人群的β-珠蛋白表达缺失或减少的常见突变为40种左右。引起β-珠蛋白表达减少的突变主要集中在HBB基因区域，通过影响转录、RNA加工、mRNA剪接和翻译等来降低β-珠蛋白的表达。在中国，最主要的17种突变占HBB基因致病性突变的95％以上，包括-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、-28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Iht(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。
采用分子诊断方法可以有效地检测HBA1/2和HBB基因区域的突变。跨越断裂点PCR(Gap-PCR)法可以检测HBA1/2基因缺失型突变，但是无法检测非缺失型突变。PCR反向点杂交(PCR-RDB)方法可以检测HBA1/2和HBB基因区域的非缺失型突变，但是无法检测缺失型突变。PCR-寡核苷酸探针法(PCR-ASO)可用于检测单个点突变，但是对于多个突变位点的检测操作繁琐。PCR-限制性酶谱分析法(PCR-RFLP)法依赖于限制性酶切位点，无法同时检测多种缺失和突变。近年来发展的单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、Taqman探针荧光PCR法、高分辨溶解曲线检测技术(HRM)等均难以同时实现同时检测中国人群常见HBA1/2和HBB基因突变，更无法检测其中的所有突变类型特别是非常见突变。基于PCR-芯片杂交的方法可用于同时检测缺失型和非缺失型HBA1/2和HBB基因突变，但是数据的解读会受到杂交背景的干扰，灵敏度仍有待提高。而且，有些病人会同时出现两种HBA1/2或HBB基因突变，这些传统的检测手段均无法检测出两种突变是否连锁。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种基于多重PCR扩增和PacBio测序的方法来同时检测HBA1/2和HBB基因区域突变，特别是常见的区域突变。多重PCR扩增可在单反应管中实现同时扩增HBA1/2和HBB基因缺失型和非缺失型突变，而PacBio测序平台具有读长测长、校准精确度高和高通量等特点，可以实现准确、快速并高通量地检测HBA1/2和HBB基因突变。本发明涉及的方法操作简便，多重PCR和PacBio文库质量可靠且重复性强，有利于PacBio测序技术在临床检测上的应用。
本发明的目的在于解决现阶段HBA1/2和HBB基因突变检测存在精确度低和不能同时检测多种缺失和非缺失突变，无法确定突变是否连锁，无法检测非常见突变等问题。通过多重PCR同时扩增HBA1/2和HBB基因突变片段及制备PacBio文库，实现精确和快速检测多个样品HBA1/2和HBB基因突变的目标。
本发明第一方面提供了一种同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒，包括以下试剂：
(1)用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段的试剂；和
(2)用于构建PacBio文库的试剂。
根据本发明的一个的实施方式，其中所述用于多重PCR扩增的试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液和引物。
根据本发明的一个实施方案，其中所述引物包括用于扩增HBA1/2和HBB基因的引物组，所述引物组包括如下引物对：
(1)SEA引物对；
(2)4.2引物对；
(3)WT引物对；
(4)3.7引物对；和
(5)HBB引物对；
其中所述SEA引物对分别位于基因组hg19 chr16：215396-234699上下游；所述4.2引物对分别位于基因组hg19 chr16∶219568-224747上下游；所述WT引物对分别位于基因组hg19 chr16：222951-223597上下游；所述3.7引物对分别位于基因组hg19 chr16：222188-227321上下游；和所述HBB引物对分别位于基因组hg19 chr11：5246715-5248391上下游。所述引物组的构建如图1所示。所述引物可以扩增HBA1/2和HBB基因的完整全部序列，包括任何类型的突变序列。优选地，每个引物的扩增产物小于5Kb。优选地，如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
根据一个优选的实施方案，其中所述引物序列如表1中SEQ ID NO.1-1O所示。
表1.本发明方法中检测HBA1/2和HBB基因突变的PCR引物。
引物序列号 引物名称 引物序列(5’-3’)
SEQ ID NO.1 WT-F TCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCA
SEQ ID NO.2 WT-R GCAGGAGGAACGGCTACCGAG
SEQ ID No.3 3.7-F TCCTCACCCCACATCCCCTCACCTACATTCTGCA
SEQ ID No.4 3.7-R TGGACTTCGCGGTGGCTCCACTTTCCCTC
SEQ ID NO.5 4.2-F AAGCTAGAGCATTGGTGGTCAT
SEQ ID No.6 4.2-R TGAGGCGGAGTTTCGCTG
SEQ ID No.7 SEA-F AATGGATGAGGACGGAGCGA
SEQ ID No.8 SEA-R ACGTTGTGTTCATGGCTGTG
SEQ ID No.9 HBB-F GAGGGAGGGCTGAGGGTYTG
SEQ ID No.10 HBB-R GGGTGGGCCTATGAYAGGGT
在一个实施方案中，PCR扩增产物在进行下一步反应前，可以纯化或者不纯化，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，其中所述试剂盒用于同时检测HBA1/2和HBB基因的缺失型和非缺失型突变。
根据一个优选的实施方案，其中所述试剂盒用于检测常见HBA1/2和HBB基因的不同突变是否连锁。
根据一个优选的实施方案，其中所述HBA1/2和HBB基因突变为常见HBA1/2和HBB基因突变，包括由HBA1/2基因缺失引起的--SEA、-α3.7与-α4.2三种缺失型突变；位于HBA2基因的QS、CS、WS三种点突变；以及位于HBB基因的突变，包括以下17种常见的突变型：-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、-28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。
根据一个优选的实施方案，其中所述HBA1/2和HBB基因突变包括由HBA1/2基因缺失引起的--SEA、-α3.7与-α4.2三种缺失型突变；如表2所示的位于HBA2基因的点突变；以及如表3所示的位于HBB基因的突变。
表2.本发明非缺失型HBA2基因突变检测范围
编号 HGVs命名 碱基改变
1 HBA2：c.40G>T CD13(G-T)
2 HBA2：c.91_93de1GAG CD30(-GAG)
3 HBA2：c.95G>A CD31(G-A)
4 HBA2：c.133delC CD43/44(-C)
5 HBA2：c.149_150delGC CD49(-GC)
6 HBA2：c.179G>A CD59(G-A)
7 HBA2：c.369C>G WS(CD122(C-G))
8 HBA2：c.377T>C QS(CD125(T-C))
9 HBA2：c.427T>C CS(CD142(T-C))
表3.本发明HBB基因突变检测范围
根据一个优选的实施方案，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
根据一个优选的实施方案，其中所述用于构建PacBio文库的试剂包括接头、测序引物、连接酶、DNA纯化磁珠、80％乙醇、DNA修复混合液、反应缓冲液和外切酶。
在一个实施方案中，PacBio通用接头序列为5’-pATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGAT-3’，通过退火形成平末端茎环状结构接头适配子。可以在茎部加上16bp不同序列的DNA(Barcode)形成不同barcoded的接头适配子。带有不同Barcode的PacBio文库可以混合在一起测序。
在一个实施方案种，PacBio接头可以带或者不带Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
在一个实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
根据一个优选的实施方案，所述PacBio文库与PacBio公司测序平台匹配。
根据本方面的第二个方面，本发明提供了一种同时检测受试者HBA1/2和HBB基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)制备受试者DNA样品；
(2)多重PCR同时扩增所述DNA样品中HBA1/2和HBB基因突变片段；
(3)构建PacBio测序文库；
(4)PacBio测序并分析HBA1/2和HBB基因突变类型。
在一个实施方案中，其中所述多重PCR的引物其中所述引物包括用于扩增HBA1/2和HBB基因的引物组，所述引物组包括如下引物对：
(1)SEA引物对；
(2)4.2引物对；
(3)WT引物对；
(4)3.7引物对；和
(5)HBB引物对；
所述引物组的构建如图1所示。
在一个实施方案中，其中所述多重PCR的引物序列如SEQ ID NO.1-10所示。
在一个实施方案中，其中所述样品选自基因组DNA、血液、羊水、绒毛、胚胎的遗传物质、关节液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁或胰腺液。
在一个实施方案中，其中所述胚胎的遗传物质选自配子或囊胚细胞。
在一个实施方案中，其中所述的HBA1/2和HBB基因突变为常见的，所述常见的HBA1/2和HBB基因突变包括由HBA1/2基因缺失引起的--SEA、-α3.7与-α4.2三种缺失型突变；位于HBA2基因的QS、CS、WS三种点突变；以及位于HBB基因的突变，包括以下17种常见的突变型：-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、-28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。
在一个实施方案中，其中所述多重PCR在单反应管中完成HBA1/2和HBB基因突变片段的扩增。
在一个实施方案中，其中所述方法用于同时检测HBA1/2和HBB基因的缺失型和非缺失型突变。
在一个实施方案中，其中所述方法用于检测常见HBA1/2和HBB基因的不同突变是否连锁。本在一个实施方案中，PacBio接头带PacBio公司设计的Barcode或者自行设计的Barcode，本领域技术人员可以根据需要选择。
基于PCR扩增和第三代高通量测序PacBio平台的特定组合的本发明所述的方法可高特异性地、准确和快速地实现同时检测多个样品HBA1/2和HBB基因突变。
(1)根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种用于同时扩增HBA1/2和HBB基因片段的引物组，所述引物组包括如下引物对：SEA引物对；
(2)4.2引物对；
(3)WT引物对；
(4)3.7引物对；和
(5)HBB引物对；
所述引物组的构建如图1所示。其中SEA引物对分别位于基因组hg19 chr16：215396-234699上下游；4.2引物对分别位于基因组hg19 chr16：219568-224747上下游；WT引物对分别位于基因组hg19 chr16：222951-223597上下游；3.7引物对分别位于基因组hg19 chr16：222188-227321上下游；HBB引物对分别位于基因组hg19 chr11：5246715-5248391上下游。每个引物对的扩增产物小于5Kb；如果引物位置有SNP，则使用简并碱基引物。
根据一个实施方案，其中所述引物组的序列如SEQ ID NO 1-10所示。
本发明的引物组可以用于多重引物PCR扩增包括所有突变类型的HBA1/2和HBB基因片段。再结合后续的PacBio测序平台，可以检测所有类型的HBA1/2和HBB基因片段的突变类型。
本发明所述方法和试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面：
(1)样品多样化。用于PCR的模板可以是经提取的基因组DNA，也可以是人源细胞系或特定的组织。
(2)高效的PCR系统。多重PCR实现单反应管同时扩增多个基因片段。
(3)高通量检测。PacBio公司目前有384种barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种barcode接头。PacBio测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测。
(4)精确度高。PacBio的哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，对于5Kb或小于5Kb的文库单个碱基精确度大于99.9％，因此可以精确解读所有类型的缺失型和非缺失型HBA1/2和HBB基因突变。同时，由于PacBio读长测长的特性，本发明的方法还可以检测不同突变是否连锁。
附图说明
图1是多重PCR引物设计示意图，其中图1A表示HBA1/2基因突变，和图1B表示HBB基因突变。
图2是根据实施例1中的多重PCR方法扩增不同HBA1/2基因突变样本的DNA凝胶图。
图3是根据实施例2中的方法构建PacBio文库的Bioanalyzer分析结果。
图4是HBB基因杂合突变CD17(A-T)样品的PacBio测序结果图。该样品测序得到1096条测序分子覆盖HBB基因区域，其中500条测序分子无CD17位置突变(箭头区域)，另外596条测序分子在CD17位置由A突变成T，说明该样品为CD17(A-T)杂合突变样品。
具体实施方式
实施例1：利用本发明的多重PCR方法扩增不同HBA1/2和HBB基因突变
按照下表制备反应体系，扩增不同类型HBA1/2和HBB基因突变样本的基因组DNA：
在PCR仪上，按如下条件进行预扩增：
扩增完成后，每个样本取20ul，在1％的DNA凝胶上检测，结果如图2所示，HBA1/2基因的不同缺失型突变和HBB基因均能有效扩增。
实施例2：利用本发明涉及的多重PCR方法构建PacBio测序文库
步骤1：提取基因组DNA
取200uL人外周血，利用DNA提取试剂盒(Qiagen，Cat#51106)，按照试剂盒的说明书提取基因组DNA。提取后的基因组DNA用Qubit dsDNA BRreagent(ThermoFisher，Cat#Q32850)在Qubit 3Fluoromter(ThermoFisher，Cat#Q33216)上测定DNA浓度，并用ddH2O将基因组DNA稀释到10ng/u1。
步骤2：多重PCR扩增
按照下表制备反应体系：
在PCR仪上，按如下条件进行预扩增：
扩增完成后，用80uL Agencourt Ampure XP磁珠(Beckman Coulter，Cat#A63880)依照制造商的说明书纯化预扩增产物。将纯化产物溶于10uL Elution buffer。用QubitdsDNA HS reagent(ThermoFisher，Cat#Q32850)在Qubit 3Fluoromter(ThermoFisher，Cat#Q33216)上测定DNA浓度，并用ddH2O将扩增产物稀释到20ng/μl。
步骤3：构建PacBio测序文库
按照下表制备反应体系(如果有多个样品，每个样品使用不同的PB barcoded适配子)：
在PCR仪上，按如下条件进行反应：37℃ 20min；25℃ 15min；65℃ 10min。反应完成后，将多个样品混合到一起，用0.6x Ampure PB磁珠(PacBio，Cat#100-265-900)依照制造商的说明书纯化，并用43uL Elution buffer洗脱。然后加入1.0uL Exonuclease III(NEB，Cat#M0206L)和Exonuclease VII(NEB，Cat#M0379L)，继续在37℃反应1小时。用0.6xAmpure PB磁珠(PacBio，Cat#100-265-900)依照制造商的说明书纯化两次，最后用10uLElution Buffer洗脱DNA。所得DNA洗脱液即是目标DNAPacBio测序文库。用Qubit dsDNA HS试剂(ThermoFisher，Cat#Q32851)在Qubit 3Fluoromter(ThermoFisher，Cat#Q33216)上测定DNA浓度，同时用水稀释10倍后通过毛细管电泳检测DNA大小分布和摩尔纯度(Agilent2100Bioanalyzer Instrument，Cat#G2939BA)。如图3所示，Bioanalyzer分析PacBio测序文库主峰在1.5-3Kb，与PCR产物加上PB barcoded适配子大小预测一致。
步骤4：PacBio上机测序和分析
根据文库的总浓度与摩尔浓度，将适当体积的文库与结合试剂(PacBio，Cat#101-626-600)和引物(PacBio，Cat#100-970-100)反应，制备成最终可上机文库。代表性测序结果如图3所示，该样品经本发明方法检测结果为HBB基因CD17(A-T)杂合突变，与Sanger测序结果一致。
实施例3常见HBA1/2和HBB基因突变的检测和验证
从福建省妇幼保健医院收集68个受试者的外周血作为验证样品68例，参照实施例1，利用本发明方法(和试剂盒)同时检测HBA1/2和HBB基因突变，同时用深圳益生堂生物企业有限公司的试剂盒Gap-PCR方法检测HBA1/2基因缺失型突变，用试剂盒PCR-探针法检测HBA1/2基因非缺失型突变和HBB基因突变，结果如下表4所示。数据表明，利用本发明得到的基因型，研究结果与试剂盒检测结果完全吻合，阳性和阴性符合率都达到100％。而且其中33号和40号两例样品均有两个HBB基因杂合点突变，利用传统的PCR-探针法无法判定这两个点突变是否连锁，利用本发明涉及的方法可以明确判定两例样品中的两个点突变均不连锁。因此，本发明利用多重PCR方法结合PacBio测序，能够准确高效地同时检测HBA1/2和HBB基因突变。
表4.利用实施例2中的方法以及深圳益生堂生物企业有限公司试剂盒检测68例样品中HBA1/2和HBB基因突变样品的结果
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需要说明的是，虽然已通过以上实施例阐明了本发明的一些特征，但不能用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。多重PCR反应和PacBio测序文库构建中所涉及的反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于同时扩增HBA1/2和HBB基因片段的引物组，所述引物组包括如下引物对：
(1)SEA引物对；
(2)4.2引物对；
(3)WT引物对；
(4)3.7引物对；和
(5)HBB引物对；
其中所述引物组的序列如SEQ ID NO.1-10所示。
2.一种同时检测HBA1/2和HBB基因突变的试剂盒，包括以下试剂：
(1)用于多重PCR扩增HBA1/2和HBB基因片段的试剂；和
(2)用于构建PacBio文库的试剂；
其中所述用于多重PCR扩增的试剂包括权利要求1所述引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述用于多重PCR扩增的试剂还包括DNA聚合酶、反应缓冲液。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述HBA1/2和HBB基因突变为常见HBA1/2和HBB基因突变，包括由HBA1/2基因缺失引起的--SEA、-α3.7与-α4.2三种缺失型突变；位于HBA2基因的QS、CS、WS三种点突变；以及位于HBB基因的突变，包括以下17种常见的突变型：-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、-28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T,G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述多重PCR扩增在单反应管中完成。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述用于构建PacBio文库的试剂包括接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。
7.根据权利要求1所述的引物组在制备同时检测HBA1/2和HBB基因的缺失型和非缺失型突变的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求1所述的引物组在制备检测常见HBA1/2和HBB基因的不同突变是否连锁的试剂盒中的应用。
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