CN114561460A - 一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因检测领域，具体涉及一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库。本申请通过在β‑珠蛋白基因簇上下游区域设计一对相距很远的互补引物以及在HBB基因区域设计一对距离适中的正常内对照互补引物，长片段PCR扩增以及第三代测序文库构建与测序，实现断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异的精准快速检测。此外，本申请还可在设计的引物的5’端加入5‑50nt不同序列的DNA，即DNA条形码(Barcode)，用于区分不同的样本，实现多个样本同时检测。本申请涉及的方法操作简便，结果可靠且重复性强，具有很强的临床适用性及可推广性。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测领域，具体涉及一种检测断裂位点未明的罕 见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia)是由珠蛋白基因缺陷引起珠蛋白合成 障碍所致的遗传性溶血性疾病，分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两 种类型。地中海贫血是全世界分布最广、累及人群最多的一种单基因 遗传病。全球至少有3.45亿人携带地中海贫血基因变异，不同国家和 地区的地中海贫血基因变异携带率约1-5％，尤以东南亚、中国南方地 区、地中海地区、印度、中东、北非等地区高发。当亲本为同类型α 或β地中海贫血基因变异携带者时，其后代有25％的机率患重型α或β 地中海贫血，重型α和β地中海贫血均为致死性疾病，严重影响儿童健 康和出生人口素质。在地中海贫血高发区域开展婚前、孕前以及产前地中海贫血基因检测，预防重型地中海贫血患儿出生具有重要意义。
β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因簇变异导致的，该基因簇变异具 有高度的异质性。全世界已报道的β-珠蛋白基因簇变异有1000多种， 变异类型包括点突变、不同片段长度的缺失等。目前我国临床上广泛 使用的商品化β-地中海贫血基因检测试剂盒仅覆盖了中国人群常见 的CD41-42(-CTTT)、CD17(AAG>TAG)、IVS-II-654(C>T)、-28(A>G)、 CD71/72(+A)和CD26(GAG>AAG)等17种点突变。对罕见变异和大片 段缺失等复杂结构变异覆盖不全，存在较高漏诊率和误诊率。在临床 工作中如果患者常规地中海贫血基因检测结果与血液学表型和临床 表型不符，且高度怀疑为β-地中海贫血时应进一步做罕见β-地中海贫 血基因检测以避免漏诊或误诊。
针对地中海贫血基因罕见变异，可进一步采用Sanger测序联合多 重连接探针扩增(MLPA)等技术检测，但这些技术所覆盖变异仍十 分有限，且通量低、成本高、操作繁琐。针对断裂位点范围已知的大 片段缺失等地中海贫血基因簇复杂结构变异，可采用跨越断裂点PCR (Gap-PCR)联合多重连接探针扩增(MLPA)技术进行检测，但仍 无法精准检测断裂位点的具体位置，更无法检出断裂位点范围未明的 地中海贫血基因簇复杂结构变异。
应用第二代高通量测序(next-generation sequencing，NGS)进行 地中海贫血基因检测可显著提高基因变异的检测时效、检测准确度和 检出率，但NGS测序读长(reads)短，仅能检测点突变、小片段插入 /缺失、拷贝数变异，仍不能检测大片段杂合缺失等地中海贫血基因 簇复杂结构变异。因此，寻找一种可有效覆盖大片段缺失等地中海贫 血基因簇复杂结构变异，能精确定位复杂结构变异断裂点的具体位 置，实现地中海贫血基因变异的精准检测的方法是当务之急。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本申请提供一种检测 断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒 及测序文库，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引 物组，包含如下的引物：
βdel-F：位于β-珠蛋白基因簇上游区域的正向引物，其序列为： 5’-GACTTAATGGGAGACTTTCCCCTAGCT-3’；
βdel-R：位于β-珠蛋白基因簇下游区域的反向引物，其序列为： 5’-GGTGGGGACTTAGGTGAAGGAAATGAG-3’；
HBB-F：位于HBB基因区域的正常内对照正向引物，其序列为： 5’-GTTTCCTGATTCTCCCACCCCCAACC-3’；
HBB-R：位于HBB基因区域的正常内对照反向引物，其序列为： 5’-CCATATTTCTCTGACCCTAGAGTCCTT-3’。
进一步的，所述βdel-F和所述βdel-R用于扩增断裂位点未明的罕 见β地中海贫血基因大片段缺失后断裂拼接的截短目的片段，所述 HBB-F和所述HBB-R用于扩增HBB基因区域的正常内对照片段。
所述引物组可以扩增断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片 段缺失后断裂拼接的截短目的片段和位于HBB基因区域的正常内对 照片段。通过三代高通量测序检测后，如仅检测到正常内对照片段序 列，则该样本未携带β地中海贫血基因缺失变异；如检测到β地中海贫 血基因大片段缺失后断裂拼接的截短目的片段和正常内对照片段序 列，则该样本为β地中海贫血缺失变异杂合子，可通过截短目的片段 序列确定断裂位点；如仅检测到β地中海贫血基因大片段缺失后断裂 拼接的截短目的片段序列，未检测到正常内对照片段序列，则该样本 为β地中海贫血缺失变异纯合子，可通过截短目的片段序列确定断裂位点。
一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的试 剂盒，包括以下试剂：
(1)前文所述的引物组的长片段PCR扩增试剂：包括DNA聚合 酶及反应缓冲液等，用于扩增断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因 大片段缺失后断裂拼接的截短目的片段和位于HBB基因区域的正常 内对照片段。试剂包括DNA聚合酶、反应缓冲液以及上述引物组。在 使用时可以在上述引物组的5’端加入5-50nt不同序列的DNA (Barcode)，用于区分不同的样本，F和R引物的5’端Barcode可以相 同或者不相同，可以根据具体需要进行选择。利用长片段PCR扩增试 剂扩增得到的长片段PCR扩增产物在进行下一步反应前可以纯化或者不纯化，也可以根据具体需要进行选择。
(2)第三代测序文库构建试剂：用于构建第三代测序文库，所 用试剂包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液 和外切酶。上述长片段PCR扩增产物通过末端修复酶完成末端补齐后 进行接头连接、文库纯化及测序。第三代测序选用PacificBiosciences 公司的Pacific测序平台，PacBio文库接头连接可以使用平末端连接或 TA连接。
所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的 引物组在构建用于检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段 缺失的测序文库中的应用。
一种用于检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失 的测序文库的构建方法，包括如下步骤：采用前文所述的引物组对待 检测DNA样本进行长片段PCR扩增。
进一步的，还包括对长片段PCR扩增的产物连接测序接头的步 骤。
本申请选用Pacific Biosciences公司的Pacific测序平台对使用如上 所述试剂盒构建的第三代测序文库进行测序的方法，最终所得测序数 据采用inhouse分析流程可准确定位罕见β地中海贫血基因大片段缺失 变异，确定其断裂位点，实现高特异性、准确快速地同时检测多个样 本的断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异。
应用第二代高通量测序(next-generation sequencing，NGS)进行 地中海贫血基因检测可显著提高基因变异的检测时效、检测准确度和 检出率，但NGS测序读长(reads)短，仅能检测点突变、小片段插入 /缺失、拷贝数变异，仍不能检测大片段杂合缺失等地中海贫血基因 簇复杂结构变异。
以单分子实时测序(single molecule real-time sequencing,SMRT) 为代表的第三代高通量测序技术平台可实现对每一条DNA分子的单 独测序，具有超长读长(读长可达30kb-100kb)、高准确度(QV30 ＞99.8％)、无GC偏好性和单分子分辨率的特点。应用第三代高通量 测序技术平台进行地中海贫血基因检测可有效覆盖大片段缺失等地 中海贫血基因簇复杂结构变异，能精确定位复杂结构变异断裂点的具 体位置，实现地中海贫血基因变异的精准检测。
本申请是一种基于长片段PCR扩增和三代高通量测序技术平台 检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组，试 剂盒及测序文库构建方法。可以解决目前实验室常规采用的Gap-PCR 联合MLPA技术只可针对断裂位点范围已知的大片段缺失等地中海 贫血基因簇复杂结构变异进行检测，无法精准检测断裂位点具体位 置，更无法检出断裂位点范围未明的地中海贫血基因簇复杂结构变 异，以及NGS测序读长短，仅能检测点突变、小片段插入/缺失、拷 贝数变异，而不能检测大片段杂合缺失等地中海贫血基因簇复杂结构 变异的问题。本申请通过在β-珠蛋白基因簇上下游区域设计一对相距 很远的互补引物以及在HBB基因区域设计一对距离适中的正常内对 照互补引物，长片段PCR扩增以及第三代测序文库构建与测序，实现 断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异的精准快速检 测。此外，本申请还可在设计的引物的5’端加入5-50nt不同序列的DNA，即DNA条形码(Barcode)，用于区分不同的样本，实现多个 样本同时检测。本申请涉及的方法操作简便，结果可靠且重复性强， 具有很强的临床适用性及可推广性。
与现有技术相比，本申请创造的技术效果体现在：
(1)本申请能够精准检测断裂位点。常规Gap-PCR联合MLPA 技术无法精准检测断裂位点具体位置，本申请基于长片段PCR扩增和 第三代测序技术，可以直接测序缺失区域断裂拼接的截短目的片段， 实现断裂位点的精准检测。
(2)本申请能够精准检测地中海贫血基因簇复杂结构变异。NGS 因测序读长短，仅能检测点突变、小片段插入/缺失、拷贝数变异， 而不能检测大片段杂合缺失等地中海贫血基因簇复杂结构变异。本申 请使用的第三代测序技术具有超长读长(读长可达30kb-100kb)、 高准确度(QV30＞99.8％)、单分子分辨率等特点，可精准检测地中 海贫血基因簇复杂结构变异。
(3)本申请能够实现高通量检测。本申请可通过在设计的引物5’ 端或文库接头茎部加入5-50nt不同序列的Barcode用于区分不同的样 本，或者利用引物带Barcode和接头带Barcode的双Barcode系统实现更 多种Barcode组合，实现高通量样本检测。
(4)本申请的检测时间灵活。第三代测序平台可快速产生数据， 并根据实际数据量需求快速开启数据分析，可显著提高检测时效。
附图说明
图1为检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失 变异的长片段PCR引物设计示意图，βdel-F和βdel-R引物分别位于 β-珠蛋白基因簇上下游区域，HBB-F和HBB-R引物分别位于HBB 基因上下游区域。βdel-F和βdel-R引物对扩增的片段为发生缺失的 截短目的片段；HBB-F与HBB-R引物对扩增的片段为正常内对照片 段。
图2为断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异 杂合子个体的第三代测序结果图，上方模块展示βdel-F和βdel-R引 物对扩增的片段，该片段内发生22.62kb的缺失(缺失区域为 chr11:5220827-5243447)；下方模块展示HBB-F与HBB-R引物对 扩增的正常内对照片段。
图3为正常个体的第三代测序结果图，上方模块及下方模块均 展示HBB-F与HBB-R引物对扩增的正常内对照片段，无βdel-F和 βdel-R引物对扩增的缺失截短目的片段。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本申请的技术方案做进一步的限 定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
(1)引物设计与长片段PCR扩增
查阅UCSC数据库，确定β-珠蛋白基因簇和HBB基因序列，利用 Primer 5软件在β-珠蛋白基因簇上下游区域设计一对相距很远的互补 引物以及在HBB基因区域设计一对距离适中的正常内对照互补引物。 引物序列见表1。
表1：检测引物序列
以高度怀疑存在断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺 失变异个体的基因组DNA为模板，使用表1中的引物组，按照表2制备 反应体系，按照表3扩增条件进行长片段PCR扩增。
表2：PCR反应体系
表3：PCR扩增条件
(2)PacBio测序文库构建
长片段PCR扩增产物以10000rpm转速离心20min，离心结束后取 4L上清液到新的PCR管中，按照表4制备反应体系，构建PacBio测序 文库。
表4：测序文库构建反应体系
制备好的反应体系置于PCR仪中，按如下条件进行反应：37℃20 min；25℃15min；65℃10min。反应结束后，向反应体系中加入0.5L Exonuclease III(NEB,Cat#M0206L)和0.5L Exonuclease VII(NEB, Cat#M0379L)，37℃继续反应1小时得到终反应产物。
按照制造商说明书，使用0.6x Ampure PB磁珠(PacBio, Cat#100-265-900)对终反应产物进行两次纯化，最后用10uL Elution Buffer进行洗脱，得到的DNA洗脱液即为目标DNAPacBio测序文库。 用Qubit dsDNA HS试剂(ThermoFisher,Cat#Q32851)在Qubit 3Fluoromter(ThermoFisher,Cat#Q33216)上对PacBio测序文库浓度进 行测定。当存在多个样本的PacBio测序文库时，可以取等量文库进行 混合，制备成混合文库。
(3)PacBio上机测序和分析
根据文库总浓度与摩尔浓度，将适当体积的混合文库与结合试剂 (PacBio，Cat#101-820-200)和测序引物(PacBio,Cat#100-970-100) 反应，制备成最终上机文库。利用PacBio Sequel II平台，选择CCS模 式对最终上机文库进行测序。本发明的高度怀疑存在断裂位点未明的 罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异个体的测序结果如图2所示，该 个体为缺失变异杂合子个体，β-珠蛋白基因簇内发生22.62kb的缺失 (缺失区域为chr11:5220827-5243447)。本发明实现了断裂位点未明 的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异及其断裂位点的精准检测。
实施例1
1、样本提取
采用凯杰(Qiagen)公司的DNeasyBlood&Tissue Kits提取试剂盒 进行DNA提取，按照试剂盒操作说明进行操作。提取后采用Qubit荧 光定量仪测定DNA浓度，质控标准为DNA浓度大于10ng/L。
2、PCR扩增
以高度怀疑存在断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺 失变异个体的基因组DNA为模板，使用表1中的引物组，按照表2制备 反应体系，按照表3扩增条件进行长片段PCR扩增。
3、文库构建
长片段PCR扩增产物以10000rpm转速离心20min，离心结束后取 4L上清液到新的PCR管中，按照表4制备反应体系，构建PacBio测序 文库。
制备好的反应体系置于PCR仪中，按如下条件进行反应：37℃20 min；25℃15min；65℃10min。反应结束后，向反应体系中加入0.5L Exonuclease III(NEB,Cat#M0206L)和0.5L Exonuclease VII(NEB, Cat#M0379L)，37℃继续反应1小时得到终反应产物。
按照制造商说明书，使用0.6x Ampure PB磁珠(PacBio, Cat#100-265-900)对终反应产物进行两次纯化，最后用10uL Elution Buffer进行洗脱，得到的DNA洗脱液即为目标DNAPacBio测序文库。 用Qubit dsDNA HS试剂(ThermoFisher,Cat#Q32851)在Qubit 3Fluoromter(ThermoFisher,Cat#Q33216)上对PacBio测序文库浓度进 行测定。当存在多个样本的PacBio测序文库时，可以取等量文库进行 混合，制备成混合文库。
4、测序
根据文库总浓度与摩尔浓度，将适当体积的混合文库与结合试剂 (PacBio，Cat#101-820-200)和测序引物(PacBio,Cat#100-970-100) 反应，制备成最终上机文库。利用PacBio Sequel II平台，选择CCS模 式对最终上机文库进行测序。
5、结果分析
本发明的高度怀疑存在断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大 片段缺失变异个体的测序结果如图2所示，上方模块展示βdel-F与 βdel-R引物对扩增的片段，该片段内发生22.62kb的缺失(缺失区域为 chr11:5220827-5243447)；下方模块展示HBB-F与HBB-R引物对扩增 的正常内对照片段。根据图2所示测序结果，该个体为罕见β地中海贫 血基因大片段缺失杂合子个体。同等条件下，正常个体的测序结果如 图3所示，上方模块及下方模块均展示HBB-F与HBB-R引物对扩增的 正常内对照片段，无βdel-F与βdel-R引物对扩增的缺失截短目的片段。 可见，本发明实现了断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失变异及其断裂位点的精准检测。
最后，应当指出，以上实施例仅是本申请较有代表性的例子。显 然，本申请的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本 领域的普通技术人员能从本申请公开的内容直接导出或联想到的所 有变形，均应认为是本申请的保护范围。
序列表
<110> 广西医科大学第二附属医院（广西医科大学第二临床医学院）
<120> 一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库
<141> 2021-12-30
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 位于β-珠蛋白基因簇上游区域的正向引物(Artificial Sequence)
<400> 1
gacttaatgg gagactttcc cctagct 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 位于β-珠蛋白基因簇下游区域的反向引物(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggggact taggtgaagg aaatgag 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 位于HBB基因区域的正常内对照正向引物(Artificial Sequence)
<400> 3
gtttcctgat tctcccaccc ccaacc 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 位于HBB基因区域的正常内对照反向引物(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatatttct ctgaccctag agtcctt 27
Claims (9)
1.一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组，其特征在于，包含如下的引物：
βdel-F：位于β-珠蛋白基因簇上游区域的正向引物，其序列为：5’-GACTTAATGGGAGACTTTCCCCTAGCT-3’；
βdel-R：位于β-珠蛋白基因簇下游区域的反向引物，其序列为：5’-GGTGGGGACTTAGGTGAAGGAAATGAG-3’；
HBB-F：位于HBB基因区域的正常内对照正向引物，其序列为：5’-GTTTCCTGATTCTCCCACCCCCAACC-3’；
HBB-R：位于HBB基因区域的正常内对照反向引物，其序列为：5’-CCATATTTCTCTGACCCTAGAGTCCTT-3’。
2.根据权利要求1所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组，其特征在于，所述βdel-F和所述βdel-R用于扩增断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失后断裂拼接的截短目的片段，所述HBB-F和所述HBB-R用于扩增HBB基因区域的正常内对照片段。
3.一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
(1)权利要求1-2中任一项所述的引物组的长片段PCR扩增试剂；
(2)第三代测序文库构建试剂。
4.根据权利要求3所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的试剂盒，其特征在于，所述引物组的长片段PCR扩增的试剂，包括DNA聚合酶及反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的试剂盒，其特征在于，所述第三代测序文库构建试剂，包括末端修复酶、接头、连接酶、DNA纯化磁珠、反应缓冲液和外切酶。
6.根据权利要求3所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的试剂盒，其特征在于，所述第三代测序，是Pacific Biosciences公司的PacBio测序。
7.权利要求1所述的检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组在构建用于检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的测序文库中的应用。
8.一种用于检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求1所述的引物组对待检测DNA样本进行长片段PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的用于检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的测序文库的构建方法，其特征在于，还包括对长片段PCR扩增的产物连接测序接头的步骤。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111659854.7A CN114561460A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202111659854.7A CN114561460A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114561460A true CN114561460A (zh) | 2022-05-31 |
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ID=81711562
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202111659854.7A Pending CN114561460A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种检测断裂位点未明的罕见β地中海贫血基因大片段缺失的引物组、试剂盒及测序文库 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN112080558A (zh) * | 2019-06-13 | 2020-12-15 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 同时检测hba1/2和hbb基因突变的试剂盒和方法 |
| CN112342289A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-09 | 广州精科医学检验所有限公司 | 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用 |
-
2021
- 2021-12-30 CN CN202111659854.7A patent/CN114561460A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN112342289A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-09 | 广州精科医学检验所有限公司 | 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| QIAOWEI LIANG等, THE JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS, vol. 23, no. 9, pages 1195 - 1204 * |
| 中国食品药品检定研究院组织编写: "《体外诊断试剂检验技术》", vol. 2019, 31 August 2019, 北京：中国医药科技出版社, pages: 579 * |
| 武艳林: "重型α-地中海贫血胎儿产前超声及基因诊断分析", 广东医学院学报, vol. 27, no. 5, pages 1 * |
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