CN112342289A - 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用 - Google Patents

用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。发明人通过自有技术，优化得到的了用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组实验数据表明该引物具有很好的扩增效果，可以高效地扩增得到需要的长片段基因，大大简化了地中海贫血的检测。

Description

用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因扩增领域，具体涉及用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia，简称地贫)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传性血液病，常见的类型为alpha地贫(α-地贫)和beta地贫(β-地贫)。在我国，该病主要在长江以南大部分省区，特别是广西、广东和海南等省区。α-地贫发生率约为4-15％，β-地贫发生率约为1-6％。目前地贫检测主要通过大规模的人群筛查，以及出于医疗目的的在医疗机构设立的个体检查。这两种检查手段为传统方法，如PCR电泳检法、反向点杂交、荧光定量PCR、sanger测序等。传统方法一般针对高发的已知突变位点，后来为了扩大地贫突变检测位点，研究机构不限于高校、医院等均开始借助高通量测序平台进行更多位点、更高通量的检测，比如芯片捕获方法、多重PCR方法。
目前用于地贫检测的传统方法，仅能检测已知的突变位点，且同时可检测的位点数量少，检测通量低。而高通量检测方法比如芯片捕获方法、多重PCR方法等使用的测序平台存在弊端：测序读长短，且地贫基因区域序列复杂，存在高重复高GC区，而短片段测序无法跨越重复区域，即在高重复区域短片段测序结果并不能拼接完整的单体型，且NGS测序在高GC区域表现较差，存在测序错误率高或者无法读取碱基序列的缺陷。因此使用短读长对地贫基因序列测序存在显而易见的缺点。
长片段PCR中用两种DNA聚合酶进行反应，一种是用常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(常用Taq酶)，它具有很强的延伸能力，依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有3′→5核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶(常用Pfu酶)，它具有较好的校读功能，可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点，充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能，使两种酶在反应中相辅相成，完成长片段DNA的扩增。使用长片段PCR可以直接扩增得到片段长度在5kb以上的序列，直接覆盖部分基因缺失，可以克服传统地贫检测的一些不足。然而地贫基因组所在的区域存在重复性序列、高GC含量、复杂空间结构等特性，尤其是HBA基因存在几kb的重复性序列且部分区域GC含量高达60％。普通长片段PCR(Long-PCR)体系难以扩增大于55％GC含量序列，尤其是难以扩增5kb以上高GC含量序列。这限制了地中海贫血的检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
用于检测地中海贫血基因的长片段PCR引物组，所述引物组的序列包括如下引物对中的至少一对，优选包括HBA的4对引物、HBB的4对引物，或全部8对引物：
编号 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’)
HBA NO:1 GGGCTTCCAACCATACTGTTCGC ACCCAGTACAGCGAGTCCTTGG
HBA NO:2 CAATTCAATAGGGGCTCTACTTTCACC CCCTGTATACCTGAAATGTAGTGCTC
HBA NO:3 ACCACTCCCTCCTAGAAGACGAAG AGCCTCCTCCATTCCTAGCATCTG
HBA NO:4 GAATCCAAGTGATGAAATCTGCGTAT GCATGGATTTAGGAGAATGTACCT
HBB NO:1 CAGCCTGACTCAGACATATCGTC TTCATTTTCCCCTTCCCAATCT
HBB NO:2 CCACCTGTGAGTATTAGGATTTCC GCAACTTTGGCAAGGAATTCAC
HBB NO:3 GCTGAGGCAGGAGATTTGCT TGAGAAGGCCACCTGGATTC
HBB NO:4 TGGTGTCAATTTATGGAGAGCAG CTATTACTGCGCTGAAACTGTGG
。
表中，引物组的SEQ ID NO.由左到右，由上自下依次为1～16。
本发明的第二个方面，提供：
一种检测地中海贫血基因的试剂盒，所述试剂盒使用的PCR扩增引物包括本发明第一个方面所述的长片段PCR引物组。
在一些实例中，所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂，片段修复和连接试剂，阴性对照以及阳性对照。
在一些实例中，所述试剂盒的PCR扩增体系的配比为：
Figure BDA0002759811340000021
本发明的第三个方面，提供：
一种检测地中海贫血基因的系统，包括：
DNA提取装置：用于提取受试者的基因组DNA；
DNA扩增装置：以提取的基因组DNA为模板，本发明第一个方面所述的长片段PCR引物组进行长片段PCR扩增；
文库构建装置：使用扩增产物构建测序文库；
测序装置：对测序文库进行长片段测序；
结果判定装置：基于测序结果，确定受试者地中海贫血基因及判断受试者的地中海贫血基因是否携带突变。
在一些实例中，所述长片段PCR扩增的体系配比为：
Figure BDA0002759811340000031
在一些实例中，所述长片段PCR扩增的程序为：
Figure BDA0002759811340000032
在一些实例中，结果判定时，将测序结果比对回参考基因，确定受试者的基因序列，并与地中海贫血疾病数据库比对，判断受试者地中海贫血基因是否携带突变。
本发明的第四个方面，提供：
长片段PCR引物组在制备地中海贫血基因检测试剂中的应用，所述长片段PCR引物组如本发明的第一个方面所述。
本发明的第五个方面，提供：
试剂盒在在制备地中海贫血基因检测试剂中的应用，所述试剂盒如本发明的第二个方面所述。
本发明的有益效果是：
发明人通过自有技术，设计得到了用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组，实验数据表明该引物具有很好的扩增效果，可以高效地扩增得到需要的长片段基因，大大简化了地中海贫血的检测。
附图说明
图1是不同引物组组合长片段PCR产物的电泳图；
图2是引物组组合2优化后的长片段PCR产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。本发明如无特别说明，均以Nanopore平台进行实验，同时长片段测序可以使用Pacbio或其他可进行长读长测序平台。
引物设计
根据alpha地中海贫血的相关靶基因16号染色体60001到434700区域及beta地中海贫血的相关靶基因11号染色体5043000到5453000区域进行设计引物组及探针。使用自有方法对设计得到的引物组进行筛选，得到如下2组引物组组合。
引物组组合1
引物名称 正向引物 反向引物
HBA-01 CGGCCTCCCAAGACGCTTTC ATGTTTCCCACCTCTCAGTTCGTT
HBA-02 CTCAGGCTGTTTTCTCCTCAGTACCATC CTCAAGCAGTCCTCTCGAATCAGT
HBA-03 CCAACCACTCCCTCCTAGAAGACGAA AGCAAATGGGTTCTAAGACTTTACGC
HBA-04 CGTCCAACCTTCCTTCTTAGCATTCCGTA AATCCCTAATCACCCATCGCTAGTATGACC
HBB-01 GTCAAGGATCTGGGATTGATCAC CTGGGTTCAAGCAAATCTCCTG
HBB-02 AATTGCTCTAGGCAGTATGGACAT AAGAATGTTCAGCTCAACTTCCTG
HBB-03 ACTGTCTGTTTCCATGAGAGTGACT TGCTACACTGAGTGACCTGCAC
HBB-04 GGAGAGCAGAGGTACAGTCTTCAG ACTGAGCATAGAAGAGCTACGCC
引物组的SEQ ID NO.由左到右，由上自下依次为17～32。
引物组组合2
Figure BDA0002759811340000041
Figure BDA0002759811340000051
每种引物组合分成HBA组及HBB组分别进行PCR反应，使用的PCR体系如下：
组份 体积/μL
H<sub>2</sub>O(HPLC级) 22
KOD PCR Mix 25
PCR引物F(10μM) 1
PCR引物R(10μM) 1
模版DNA(100-200ng/ul) 1
总体积 50
PCR条件如下：
Figure BDA0002759811340000052
PCR结束后，配制1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，取2ulPCR产物加入1ul 5X溴酚黄染料，充分混匀后点样，使用λHind III Marker作为参考，点样后，150V，30分钟，取出琼脂糖凝胶拍照，结果如图1所示。图中，M孔道是λHind III Marker，1号孔道是引物组合1HBA引物集PCR产物，2号孔道是引物组合1HBB引物集PCR产物，3号孔道是引物组合2HBA引物集PCR产物，2号孔道是引物组合2HBB引物集PCR产物。
电泳结果显示，引物组合1HBA和HBB引物集均没有产物，引物组合2HBA和HBB引物集均有目的条带及存在少许小片短非特异扩增。由此可见，引物组合2结果均优于引物组合1，因此选择引物组合2继续进行PCR体系及PCR条件优化。
PCR条件优化
根据已有结果进行PCR体系及PCR反应条件优化，PCR体系如下：
组份 体积/μL
H<sub>2</sub>O(HPLC级) 21
KOD PCR Mix 25
PCR引物F(10μM) 1
PCR引物R(10μM) 1
甜菜碱 1
模版DNA(100～200ng/ul) 1
总体积 50
PCR条件1，如下：
Figure BDA0002759811340000061
PCR条件2，如下：
Figure BDA0002759811340000062
PCR结束后，配制1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，取2ulPCR产物加入1ul 5X溴酚黄染料，充分混匀后点样，使用λHind III Marker作为参考，点样后，150V，30分钟，取出琼脂糖凝胶拍照，结果如图2所示。图中，M孔道是λHind III Marker，5号孔道是PCR条件1HBA引物集PCR产物，6号孔道是PCR条件1HBB引物集PCR产物，7号孔道是PCR条件2HBA引物集PCR产物，8号孔道是PCR条件2HBB引物集PCR产物。
由图2可知，PCR条件1HBA和HBB引物集产物条带亮度高且单一，PCR条件2HBA和HBB引物集产物有目的条带，但存在较多小片段拖尾，因此该PCR体系及PCR条件1为优选条件。
引物组合及PCR条件确定
发明人通过自有技术，高利得到了扩增地中海贫血基因序列灵敏度高和特异性强的引物组，本发明使用的引物组合可以将HBA(包含HBA1及HBA2基因)及HBB完整基因分别以整条单一扩增子方式扩增出来。市面上销售的试剂盒一般只能扩增出突变缺失的基因型，而不能将没有发生缺失突变的基因序列完整扩增出来。本发明使用的引物组合核苷酸序列如上的引物组组合2所示。
本发明使用的PCR体系如下：
组份 体积/μL
H<sub>2</sub>O(HPLC级) 21
KOD PCR Mix 25
PCR引物F(10μM) 1
PCR引物R(10μM) 1
甜菜碱 1
模版DNA(100～200ng/ul) 1
总体积 50
本发明使用的PCR条件如下
Figure BDA0002759811340000071
实施例1：
一、样本基因组DNA提取
使用Qiagen 51106全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)对受检者全血进行基因组DNA提取，提取过程按照试剂盒说明书进行，并进行质控检测。
二、长片段PCR及目的片段回收
1、PCR扩增目的区域
取合格的受试者全血基因组DNA样本，每份样本重量为300ng-400ng，按照表1和表2，使用8对引物分别进行长片段PCR扩增反应。不同对引物的核苷酸如下：
表1长片段PCR扩增体系
Figure BDA0002759811340000072
充分混匀后瞬时离心，再进行长片段PCR反应，扩增程序如下：
表2长片段PCR扩增反应
Figure BDA0002759811340000081
PCR反应结束后瞬时离心，置于冰上待用。
2、磁珠纯化
1)将PCR扩增产物(50μL)加入提前准备好的含有40μL(0.8×)翊圣XP磁珠的离心管中，使磁珠和PCR产物充分混合，室温静置15min，置于磁力架上至溶液澄清，弃上清液；
2)加入200μL 75％乙醇，静置30s，置于磁力架至溶液澄清，弃上清液；
3)重复步骤2)彻底移除残留乙醇，置于磁力架室温静置2-4min，晾干；
4)加入32μL无核酸酶水，充分混匀，室温静置5min，置于磁力架至溶液澄清，取30μL上清液于新的离心管；
5)将同一全血样本基因组DNA的8个PCR产物等质量混合，另取适量使用QubitdsDNA HS Assay Kit进行浓度测定。
3、目的片段回收
使用Bluepipin自动切胶仪进行目的片段回收，并去除小片段使不影响Nanopore测序结果。
三、Nanopore文库构建
1、FFPE修复DNA和末端修复加dA尾
将纯化回收后的PCR产物(DNA)取1ug转移到新PCR管中，加无核酸酶水补足至48uL。按表3配制并轻弹混匀，轻微离心，进行DNA修复。
表3 FFPE修复酶修复DNA
Figure BDA0002759811340000082
Figure BDA0002759811340000091
反应条件：20℃，5min；65℃，5min。
2、纯化回收末端修复产物
1)将上述步骤得到的修复产物转移至新管中，将Agencourt AMPure XP beads涡旋振荡混匀并从中取60uL加到修复产物中，轻弹混匀，室温静置10min；
2)轻微离心，置于磁力架静置5min，弃去上清后，加入200uL新鲜配置的70％乙醇，静置30s后小心弃上清；重复步骤共清洗磁珠2次；
3)晾干至磁珠开始出现哑光现象，立即将样本从磁力架取下，加入25uL无核酸酶水，轻弹混匀以重悬磁珠，置于37℃反应10min；置于磁力架5min后，小心转移上清至新管中，得纯化后的修复产物。
3、文库标签Barcode标记
取22.5uL上述步骤获得的修复产物，按表4进行配置，轻微离心后，转移新管进行反应。
表4 Barcode连接
组份 体积
末端修复DNA 22.5uL
Native Barcode 2.5uL
Blunt/TA连接酶混合物 25uL
总体系 50uL
反应条件：20℃反应10min。
4、纯化回收产物
1)涡旋振荡混匀Agencourt AMPure XP beads并从中取50uL加至上述步骤Barcode连接产物中，轻弹混匀，放于旋转仪，室温静置10min；
2)轻微离心置于磁力架静置5min，小心弃上清后，加入200uL新鲜配置的70％乙醇，放置30s后小心移除上清；重复上述步骤共清洗磁珠2次；
3)晾干至磁珠刚刚开始出现哑光现象，立即将样本从磁力架取下，加入26uL无核酸酶水，轻弹混匀以重悬磁珠，置于37℃反应10min；置磁力架5min后，小心转移上清至新LB管中，得纯化后的Barcode标签产物。
5、不同Barcode标签样本混合
将上述步骤的标签产物等量地混合在新管。混池后总体积为51uL，总量>700ng。从中取1uL样本进行Qubit检测。
6、测序接头的连接
ABB buffer，ELB buffer平衡至室温；Barcode Adapter Mix(BAM)，NEBNextQuick Ligation Reaction Buffer(5×)冰上放置。按表5混合，轻弹混匀，轻微离心，进行反应。
表5 DNA测序接头的连接
Figure BDA0002759811340000101
反应条件：20℃(室温),20min。
7、纯化回收产物
1)将上述步骤得到的连接产物转移至新管中，将Agencourt AMPure XP beads涡旋振荡混匀并从中取40uL加到修复产物中，轻弹混匀，旋转仪室温旋转10min；
2)轻微离心，置于磁力架静置5min，弃去上清后，加入140uL ABB buffer洗涤磁珠，轻弹混匀，置于磁力架静置，小心移除上清；重复上述步骤，共清洗磁珠2次；
3)从磁力架取下，加入15uL ELB buffer，轻弹混匀以重悬磁珠，置于37℃反应10min；放置磁力架静置5min，小心转移上清至新的LB离心管中。
4)Nanopore文库构建完成，上机进行Nanopore测序。
四、结果分析
将每一份全血样本的3组PCR产物，通过PCR产物间的overlap进行连接，形成完整的地贫全基因片段，分析受试者地中海贫血基因突变情况和突变类型。
其中，将受试者的地中海贫血基因比对至参考基因，确定受试者的地中海贫血基因序列，然后将该序列与地中海贫血疾病数据库进行序列比对分析，判断受试者是否携带中海贫血基因突变及其突变类型。通过本发明的检测，本发明的引物特异性好，解决了测序读长短，地贫基因区域序列复杂，存在高重复高GC区的困难，建立了准确、重复性好的检测，能够一次性对已知的突变进行检测，且能够发现未知的突变类型。
五、二代文库构建及测序
1.PCR长片段扩增产物片段化
取400ng纯化后长片段扩增产物，用EB补至体积100μL，混匀离心，利用BioruptorPlus超声打断，打断程序为Time on:30s Time off:30s Cycles:8，完成后，振荡混匀1分钟，共打断1轮。
2.文库构建
使用YEASEN提供的Hieff
Figure BDA0002759811340000111
UltimaTM DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002759811340000112
全能型DNA建库试剂盒，不同样本使用不同的barcode进行唯一标签标记，具体实施步骤如下：
1)根据如下配制末端修复反应体系：取50μL打断后产物加入到含分装10μL的EndPrep MixPCR管中，用移液管吹打混匀，短暂离心；
2)置于PCR仪，设置热盖105℃，程序：30℃，20min；72℃，20min；4∞；
3)接头连接，确认接头已稀释至10μM工作浓度，并按表6配制接头连接反应体系；
表6接头连接反应体系
Figure BDA0002759811340000113
4)配制好反应体系后，震荡混匀，短暂离心，分装至含有上部End Preparation产物的PCR管中，再单加接头5μL，震荡混匀后短暂离心；
5)放入PCR中，设置热盖105℃，反应程序：20℃，15min，4∞；
6)反应结束后，使用磁珠进行纯化，回融得到25μL无磁珠洗脱产物用于下步PCR扩增；
7)PCR反应体系配置表如表7所示：
表7 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002759811340000114
Figure BDA0002759811340000121
8)配制好反应体系后震荡混匀，短暂离心，分装反应体系至上步纯化筛选的反应液中，震荡混匀，短暂离心；
9)放入PCR仪中，设置反应条件如下：
Figure BDA0002759811340000122
10)反应结束后，使用反应液体积0.8倍磁珠进行纯化，回溶于25μL NF水进行洗脱，使用
Figure BDA0002759811340000123
dsDNA HS Assay Kit对产物进行定量；
11)二代文库于illumina二代测序平台进行测序，得到的结果用于校正4代数据。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州精科医学检验所有限公司
深圳精科基因科技有限公司
<120> 用于长片段PCR富集地中海贫血基因的引物组及其应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cggcctccca agacgctttc 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgtttccca cctctcagtt cgtt 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctcaggctgt tttctcctca gtaccatc 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ctcaagcagt cctctcgaat cagt 24
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ccaaccactc cctcctagaa gacgaa 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
agcaaatggg ttctaagact ttacgc 26
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cgtccaacct tccttcttag cattccgta 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aatccctaat cacccatcgc tagtatgacc 30
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gtcaaggatc tgggattgat cac 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ctgggttcaa gcaaatctcc tg 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
aattgctcta ggcagtatgg acat 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
aagaatgttc agctcaactt cctg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
actgtctgtt tccatgagag tgact 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tgctacactg agtgacctgc ac 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
ggagagcaga ggtacagtct tcag 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
actgagcata gaagagctac gcc 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gggcttccaa ccatactgtt cgc 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
acccagtaca gcgagtcctt gg 22
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
caattcaata ggggctctac tttcacc 27
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
ccctgtatac ctgaaatgta gtgctc 26
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
accactccct cctagaagac gaag 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
agcctcctcc attcctagca tctg 24
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
gaatccaagt gatgaaatct gcgtat 26
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
gcatggattt aggagaatgt acct 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
cagcctgact cagacatatc gtc 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ttcattttcc ccttcccaat ct 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccacctgtga gtattaggat ttcc 24
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaactttgg caaggaattc ac 22
<210> 29
<211> 20
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gctgaggcag gagatttgct 20
<210> 30
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tgagaaggcc acctggattc 20
<210> 31
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<212> DNA
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tggtgtcaat ttatggagag cag 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ctattactgc gctgaaactg tgg 23

Claims (10)

1.用于检测地中海贫血基因的长片段PCR引物组，所述引物组的序列包括如下引物对中的至少一对，优选包括HBA的4对引物、HBB的4对引物，或全部8对引物：
编号 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) HBA NO:1 GGGCTTCCAACCATACTGTTCGC ACCCAGTACAGCGAGTCCTTGG HBA NO:2 CAATTCAATAGGGGCTCTACTTTCACC CCCTGTATACCTGAAATGTAGTGCTC HBA NO:3 ACCACTCCCTCCTAGAAGACGAAG AGCCTCCTCCATTCCTAGCATCTG HBA NO:4 GAATCCAAGTGATGAAATCTGCGTAT GCATGGATTTAGGAGAATGTACCT HBB NO:1 CAGCCTGACTCAGACATATCGTC TTCATTTTCCCCTTCCCAATCT HBB NO:2 CCACCTGTGAGTATTAGGATTTCC GCAACTTTGGCAAGGAATTCAC HBB NO:3 GCTGAGGCAGGAGATTTGCT TGAGAAGGCCACCTGGATTC HBB NO:4 TGGTGTCAATTTATGGAGAGCAG CTATTACTGCGCTGAAACTGTGG
。
2.一种检测地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒使用的PCR扩增引物包括权利要求1所述的长片段PCR引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂，片段修复和连接试剂，阴性对照以及阳性对照。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR扩增体系的配比为：
Figure FDA0002759811330000011
5.一种检测地中海贫血基因的系统，包括：
DNA提取装置：用于提取受试者的基因组DNA；
DNA扩增装置：以提取的基因组DNA为模板，权利要求1所述的长片段PCR引物组进行长片段PCR扩增；
文库构建装置：使用扩增产物构建测序文库；
测序装置：对测序文库进行长片段测序；
结果判定装置：基于测序结果，确定受试者地中海贫血基因及判断受试者的地中海贫血基因是否携带突变。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述长片段PCR扩增的体系配比为：
Figure FDA0002759811330000021
7.根据权利要求5或6所述的系统，其特征在于：所述长片段PCR扩增的程序为：
Figure FDA0002759811330000022
8.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：结果判定时，将测序结果比对回参考基因，确定受试者的基因序列，并与地中海贫血疾病数据库比对，判断受试者地中海贫血基因是否携带突变。
9.长片段PCR引物组在制备地中海贫血基因检测试剂中的应用，其特征在于：所述长片段PCR引物组如权利要求1所述。
10.试剂盒在在制备地中海贫血基因检测试剂中的应用，其特征在于：所述试剂盒如权利要求2～4任一项所述。
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