CN113981109A - 用于猪亲缘关系鉴定的snp分子标记组合、应用及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种用于猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合、应用及方法，SNP分子标记组合包括在猪的18条常染色体上的200个SNP标记，该SNP分子标记组合能够应用在杜洛克猪、长白猪和大白猪的亲缘关系鉴定中，鉴定方法包括制备上述200个SNP标记的液相芯片；利用待测猪基因组DNA构建高通量测序文库；将液相芯片与高通量测序文库混合，捕获猪DNA高通量测序文库中包含目标SNP位点的DNA片段并进行扩增和纯化，获得待测猪个体的基因分型，根据基因分型进行亲子鉴定推断。本发明提供了鉴定SNP位点信息的探针及试剂盒。本发明通过靶向捕获测序检测SNP多态性，经高深度测序，分型结果准确可靠，保证了亲子关系的精准性。
Description
技术领域
本申请涉及分子遗传学技术领域，尤其涉及一种用于猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合、应用及方法。
背景技术
系谱信息在育种中有着非常重要的作用，系谱错误会大大降低遗传评估的准确性，影响选中选配的效果，降低群体遗传进展，给企业带来巨大的经济影响。然而，在实际的生产中，系谱错误是难免的，它受多种因素的影响，比如配种记录、产仔记录、系谱录入及整理过程中的人为错误等等。目前针对猪亲缘关系鉴定的方法基本都是基于微卫星方法建立的，如专利CN102154280A中公开了一种猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物、专利CN106244717A中公开了12个常染色体STR基因座和1个性别决定基因gSTRAM在内的13个基因座的亲权鉴定的方法。
SNP是继RFLP和STR两种遗传标记之后的第三代分子标记，在生物基因组中分布最广泛，占所有已知多态性的90％以上，具有数量多、分布广、稳定性高等优点，而且由于SNP属于二态的遗传标记，更适合快速、规模化筛查。
目前尚无利用SNP标记进行杜、长、大商业化品种猪亲缘关系鉴定的报道。
发明内容
鉴于上述内容，第一方面，本申请提供了一种用于猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合，其特征在于，包括：在猪的18条常染色体上的200个SNP标记，所述SNP标记的SNP位点信息如下：
编号1的SNP位点位于2号染色体上第9987664位；
编号2的SNP位点位于14号染色体上第418001位；
编号3的SNP位点位于15号染色体上第2977317位；
编号4的SNP位点位于7号染色体上第7738134位；
编号5的SNP位点位于10号染色体上第2775295位；
编号6的SNP位点位于3号染色体上第11913946位；
编号7的SNP位点位于9号染色体上第7629826位；
编号8的SNP位点位于4号染色体上第7720753位；
编号9的SNP位点位于16号染色体上第2857298位；
编号10的SNP位点位于8号染色体上第1653890位；
编号11的SNP位点位于5号染色体上第5646887位；
编号12的SNP位点位于6号染色体上第2308923位；
编号13的SNP位点位于17号染色体上第2842639位；
编号14的SNP位点位于12号染色体上第1779292位；
编号15的SNP位点位于11号染色体上第4655543位；
编号16的SNP位点位于13号染色体上第7406226位；
编号17的SNP位点位于18号染色体上第23529836位；
编号18的SNP位点位于1号染色体上第1166570位；
编号19的SNP位点位于8号染色体上第1735070位；
编号20的SNP位点位于15号染色体上第126780202位；
编号21的SNP位点位于13号染色体上第9797897位；
编号22的SNP位点位于1号染色体上第277024546位；
编号23的SNP位点位于12号染色体上第9778935位；
编号24的SNP位点位于6号染色体上第10774932位；
编号25的SNP位点位于9号染色体上第60564642位；
编号26的SNP位点位于6号染色体上第11560736位；
编号27的SNP位点位于17号染色体上第13605151位；
编号28的SNP位点位于2号染色体上第10411684位；
编号29的SNP位点位于6号染色体上第11229072位；
编号30的SNP位点位于4号染色体上第15870194位；
编号31的SNP位点位于17号染色体上第13261924位；
编号32的SNP位点位于12号染色体上第9585887位；
编号33的SNP位点位于8号染色体上第11917230位；
编号34的SNP位点位于1号染色体上第3659113位；
编号35的SNP位点位于1号染色体上第13677911位；
编号36的SNP位点位于2号染色体上第45279469位；
编号37的SNP位点位于16号染色体上第75677205位；
编号38的SNP位点位于14号染色体上第1472814位；
编号39的SNP位点位于17号染色体上第35417485位；
编号40的SNP位点位于5号染色体上第89085559位；
编号41的SNP位点位于6号染色体上第110566592位；
编号42的SNP位点位于5号染色体上第26784434位；
编号43的SNP位点位于6号染色体上第12847266位；
编号44的SNP位点位于8号染色体上第93655842位；
编号45的SNP位点位于14号染色体上第44862892位；
编号46的SNP位点位于18号染色体上第24878198位；
编号47的SNP位点位于18号染色体上第33999857位；
编号48的SNP位点位于14号染色体上第2935893位；
编号49的SNP位点位于10号染色体上第15659641位；
编号50的SNP位点位于2号染色体上第126441545位；
编号51的SNP位点位于1号染色体上第13005755位；
编号52的SNP位点位于4号染色体上第15411794位；
编号53的SNP位点位于1号染色体上第3067609位；
编号54的SNP位点位于9号染色体上第151103363位；
编号55的SNP位点位于2号染色体上第93254715位；
编号56的SNP位点位于8号染色体上第14014245位；
编号57的SNP位点位于7号染色体上第9853317位；
编号58的SNP位点位于13号染色体上第16580025位；
编号59的SNP位点位于2号染色体上第17899277位；
编号60的SNP位点位于13号染色体上第9626564位；
编号61的SNP位点位于1号染色体上第71814074位；
编号62的SNP位点位于1号染色体上第195015097位；
编号63的SNP位点位于15号染色体上第25870115位；
编号64的SNP位点位于2号染色体上第12825813位；
编号65的SNP位点位于14号染色体上第98924773位；
编号66的SNP位点位于2号染色体上第120196914位；
编号67的SNP位点位于6号染色体上第15404754位；
编号68的SNP位点位于16号染色体上第78321074位；
编号69的SNP位点位于15号染色体上第50703395位；
编号70的SNP位点位于17号染色体上第5602353位；
编号71的SNP位点位于2号染色体上第15690950位；
编号72的SNP位点位于1号染色体上第280005928位；
编号73的SNP位点位于6号染色体上第113590851位；
编号74的SNP位点位于14号染色体上第16009816位；
编号75的SNP位点位于14号染色体上第153484247位；
编号76的SNP位点位于14号染色体上第47976495位；
编号77的SNP位点位于12号染色体上第12928807位；
编号78的SNP位点位于12号染色体上第31110698位；
编号79的SNP位点位于5号染色体上第8872919位；
编号80的SNP位点位于1号染色体上第155807226位；
编号81的SNP位点位于6号染色体上第46463711位；
编号82的SNP位点位于9号染色体上第11099863位；
编号83的SNP位点位于1号染色体上第283667735位；
编号84的SNP位点位于1号染色体上第17357393位；
编号85的SNP位点位于13号染色体上第183593435位；
编号86的SNP位点位于3号染色体上第115303312位；
编号87的SNP位点位于14号染色体上第43524188位；
编号88的SNP位点位于8号染色体上第87954260位；
编号89的SNP位点位于8号染色体上第92363697位；
编号90的SNP位点位于1号染色体上第69552307位；
编号91的SNP位点位于14号染色体上第7471774位；
编号92的SNP位点位于6号染色体上第19952359位；
编号93的SNP位点位于13号染色体上第21156860位；
编号94的SNP位点位于13号染色体上第188175696位；
编号95的SNP位点位于2号染色体上第124815814位；
编号96的SNP位点位于13号染色体上第14426507位；
编号97的SNP位点位于11号染色体上第23153305位；
编号98的SNP位点位于6号染色体上第43151417位；
编号99的SNP位点位于2号染色体上第98301703位；
编号100的SNP位点位于9号染色体上第60295990位；
编号101的SNP位点位于2号染色体上第50604042位；
编号102的SNP位点位于2号染色体上第152297331位；
编号103的SNP位点位于14号染色体上第12929923位；
编号104的SNP位点位于5号染色体上第14421184位；
编号105的SNP位点位于12号染色体上第36700556位；
编号106的SNP位点位于6号染色体上第127776310位；
编号107的SNP位点位于4号染色体上第13581647位；
编号108的SNP位点位于15号染色体上第31743469位；
编号109的SNP位点位于8号染色体上第106292625位；
编号110的SNP位点位于1号染色体上第65086280位；
编号111的SNP位点位于8号染色体上第100178608位；
编号112的SNP位点位于6号染色体上第52993684位；
编号113的SNP位点位于1号染色体上第152542119位；
编号114的SNP位点位于16号染色体上第74982838位；
编号115的SNP位点位于6号染色体上第59962724位；
编号116的SNP位点位于17号染色体上第12798122位；
编号117的SNP位点位于12号染色体上第9053303位；
编号118的SNP位点位于6号染色体上第157089555位；
编号119的SNP位点位于3号染色体上第136625273位；
编号120的SNP位点位于6号染色体上第38167864位；
编号121的SNP位点位于15号染色体上第47966193位；
编号122的SNP位点位于1号染色体上第11314997位；
编号123的SNP位点位于18号染色体上第32645081位；
编号124的SNP位点位于11号染色体上第30968353位；
编号125的SNP位点位于3号染色体上第34875870位；
编号126的SNP位点位于6号染色体上第10527048位；
编号127的SNP位点位于1号染色体上第137394988位；
编号128的SNP位点位于6号染色体上第121919072位；
编号129的SNP位点位于15号染色体上第40337548位；
编号130的SNP位点位于13号染色体上第58558625位；
编号131的SNP位点位于8号染色体上第140609282位；
编号132的SNP位点位于3号染色体上第79053118位；
编号133的SNP位点位于1号染色体上第292925911位；
编号134的SNP位点位于14号染色体上第68031660位；
编号135的SNP位点位于1号染色体上第112021945位；
编号136的SNP位点位于8号染色体上第11343109位；
编号137的SNP位点位于15号染色体上第23522601位；
编号138的SNP位点位于12号染色体上第47262225位；
编号139的SNP位点位于6号染色体上第30555475位；
编号140的SNP位点位于14号染色体上第58652121位；
编号141的SNP位点位于15号染色体上第13833343位；
编号142的SNP位点位于4号染色体上第105640665位；
编号143的SNP位点位于5号染色体上第25590839位；
编号144的SNP位点位于1号染色体上第28713935位；
编号145的SNP位点位于7号染色体上第82090814位；
编号146的SNP位点位于10号染色体上第14181887位；
编号147的SNP位点位于13号染色体上第199677045位；
编号148的SNP位点位于1号染色体上第102484718位；
编号149的SNP位点位于3号染色体上第91245946位；
编号150的SNP位点位于11号染色体上第77165356位；
编号151的SNP位点位于12号染色体上第59746957位；
编号152的SNP位点位于9号染色体上第73545907位；
编号153的SNP位点位于10号染色体上第77737314位；
编号154的SNP位点位于11号染色体上第18300706位；
编号155的SNP位点位于3号染色体上第129063083位；
编号156的SNP位点位于1号染色体上第42744126位；
编号157的SNP位点位于12号染色体上第27939849位；
编号158的SNP位点位于3号染色体上第27041626位；
编号159的SNP位点位于1号染色体上第58600437位；
编号160的SNP位点位于1号染色体上第129136174位；
编号161的SNP位点位于7号染色体上第27082548位；
编号162的SNP位点位于1号染色体上第173619066位；
编号163的SNP位点位于1号染色体上第90430196位；
编号164的SNP位点位于1号染色体上第192669302位；
编号165的SNP位点位于4号染色体上第124706188位；
编号166的SNP位点位于13号染色体上第179766527位；
编号167的SNP位点位于2号染色体上第117677874位；
编号168的SNP位点位于4号染色体上第36028125位；
编号169的SNP位点位于3号染色体上第111456973位；
编号170的SNP位点位于2号染色体上第146937374位；
编号171的SNP位点位于17号染色体上第34347823位；
编号172的SNP位点位于6号染色体上第149727715位；
编号173的SNP位点位于15号染色体上第73085857位；
编号174的SNP位点位于14号染色体上第39399052位；
编号175的SNP位点位于8号染色体上第131690844位；
编号176的SNP位点位于4号染色体上第62131813位；
编号177的SNP位点位于17号染色体上第62012280位；
编号178的SNP位点位于2号染色体上第44590539位；
编号179的SNP位点位于14号染色体上第96480217位；
编号180的SNP位点位于13号染色体上第49676934位；
编号181的SNP位点位于9号染色体上第149185476位；
编号182的SNP位点位于1号染色体上第226497707位；
编号183的SNP位点位于4号染色体上第94775080位；
编号184的SNP位点位于11号染色体上第64739915位；
编号185的SNP位点位于3号染色体上第70024499位；
编号186的SNP位点位于7号染色体上第122018904位；
编号187的SNP位点位于2号染色体上第91335279位；
编号188的SNP位点位于7号染色体上第70704925位；
编号189的SNP位点位于9号染色体上第55233498位；
编号190的SNP位点位于9号染色体上第120274182位；
编号191的SNP位点位于10号染色体上第64259339位；
编号192的SNP位点位于6号染色体上第109405647位；
编号193的SNP位点位于1号染色体上第276846341位；
编号194的SNP位点位于14号染色体上第150391777位；
编号195的SNP位点位于15号染色体上第126613417位；
编号196的SNP位点位于5号染色体上第87950981位；
编号197的SNP位点位于16号染色体上第68067084位；
编号198的SNP位点位于8号染色体上第83640594位；
编号199的SNP位点位于13号染色体上第160581841位；
编号200的SNP位点位于1号染色体上第1614730位。
第二方面，本申请还提供一种用于鉴定如第一方面技术方案中所述SNP分子标记组合的探针。
第三方面，本申请还提供一种如第二方面技术方案中所述探针的试剂盒。
第四方面，本申请还提供一种如第一方面技术方案中所述的SNP分子标记组合在猪的亲缘关系鉴定中的应用，所述猪的品种包括杜洛克猪、长白猪和大白猪。
第五方面，本申请还提供一种对猪群进行SNP多态性分析及亲子鉴定推断的方法包括以下步骤：
步骤S1，制备基于靶向捕获测序的如第一方面技术方案中所述的SNP分子标记组合的液相芯片；
步骤S2，利用待测猪基因组DNA构建高通量测序文库；
步骤S3，将步骤S1制备的猪200SNP标记的液相芯片与步骤S2构建的高通量测序文库混合，捕获猪DNA高通量测序文库中包含目标SNP位点的DNA片段；
步骤S4，对步骤S3捕获的DNA片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后对测序结果进行参考基因组比对，获得待测猪个体的基因分型；
步骤S5，亲子鉴定推断：根据相反纯合子、似然比(与无关个体相比)进行过滤，排除掉大多数不可能的亲子对。
优选的，所述猪200SNP标记的液相芯片由独立包装的探针和杂交捕获试剂构成；所述探针为单链RNA探针，所述杂交捕获试剂为建库试剂盒，包括
LibraryPrep Kit、
Buffer、BindingBuffer、Wash Buffer、Post PCR Kit。
本发明的有益效果：本申请通过提供一种用于猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合，并建立靶向捕获测序方法进行检测，来保证育种中系谱的完整和准确，进而推动猪产业的遗传育种改良的发展，经过靶向捕获测序检测SNP多态性，经高深度测序，分型结果准确可靠，保证了亲子关系的精准性。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为靶向捕获测序技术的原理示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明通过对3923个杜洛克个体、4440个长白个体和8620个大白个体的中芯一号芯片数据分析，筛选出18条常染色体上的200个SNP位点(参考基因组Sscrofa10.1)，可用于杜、长、大商业化品种猪亲缘关系鉴定的SNP标记组合，其包含200个SNP标记的分型及物理位置。
参见表1，本发明提供的用于杜、长、大商业化品种猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合由以下200个SNP标记组成。
表1
上述200个SNP标记在杜洛克、长白和大白群体中的基因频率与基因型频率如下表2所示：
表2
表2中，P、H、R分别代表纯合子AA基因型频率、杂合子AB基因型频率和纯合子BB基因型频率、MAF代表最小等位基因频率。
上述200个SNP标记在靶向捕获测序流程中的探针序列如下表3所示：
表3
本发明经过靶向捕获测序检测SNP多态性以及亲子推断试验验证，上述200个SNP标记的按照相对严格的质控参数即call rate(>0.95)、哈温平衡(p>10-6)、MAF>0.3、LD过滤(r2>0.5)筛选出，用于确定亲子关系的置信度极高。并且实例验证用该发明的200个SNP标记推断的亲子关系与实际亲本关系完全一致(实际亲本已经过猪群企业的相关记录验证是正确的)。
本发明经过靶向捕获测序检测SNP多态性(靶向捕获测序技术的原理图参见图1，包括WGS文库变性、加入捕获探针、探针与目标片段杂交、链霉亲和素磁珠结合、磁力架吸附、PCR富集目标片段以及上机测序)，经高深度测序，分型结果准确可靠，保证了亲子关系的精准性。
靶向捕获测序技术的原理
下面结对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
实施例1：SNP标记组合的选择；
本发明对用于杜、长、大商业化品种猪群进行亲子鉴定体系的SNP标记选择经过了3个过程，具体如下：
(1)群体划分
将杜、长、大商业化品种猪群体划分为标记筛点群体和标记验证群体，筛点群体用于筛点和验证，标记验证群体只用于标记验证。
(2)标记筛选
对不同群体中芯一号的基因型数据，首先按照callrate(>0.95)，哈温平衡(p>10-6)进行过滤，剔除不符合要求的SNP标记，然后筛选出MAF>0.3的SNP标记。最终找出所有群体符合要求的SNP标记的交集。最后对这些标记进行LD过滤(r2>0.5，剔除物理位置极近的SNP标记)。具体如下：
第一步，按照callrate>0.95，哈温平衡(p>10-6)，maf>0.3这三个条件，对1419个杜洛克个体、1472个长白个体和1052个大白个体的基因型数据进行过滤，保留了1012个三个群体的共同SNP标记集合。
第二步，采用2504个杜洛克个体、2968个长白个体和7568个大白个体的中芯一号的基因型数据，计算这1012个SNP标记的哈温平衡的p值和maf，剔除哈温平衡p值<10-6，maf<0.3的位点，保留327个SNP标记。
第三步，采用2504个杜洛克个体、2968个长白个体和7568个大白个体的中芯一号的基因型数据对这327个位点进行LD过滤(r2<0.5)，剩下202个位点。
第四步，根据位点的物理位置，剔除了2个相距极近的标记，最终筛选出200个SNP标记。
(3)标记验证
采用筛选出来的200个SNP标记，利用3923个杜洛克个体、4440个长白个体和8620个大白个体的基因型数据，利用sequoia软件进行系谱重建，与中芯一号芯片数据的亲子鉴定结果(真值)比对，计算错误率(eror rate)，计算公式为：
error rate＝分配了错误亲本的个体数/总的个体数；
计算结果参见表4。
由表4可以看出，200个SNP标记在杜、长、大商业化品种猪群体中进行亲子鉴定的准确率达到99.999％以上。
实施例2：采样靶向捕获测序的技术对猪群进行SNP多态性分析及亲子鉴定推断；具体包括以下爱步骤：
步骤S1，制备基于靶向捕获测序的猪200SNP标记的液相芯片；
在此步骤中，所述猪200SNP标记的液相芯片由独立包装的探针和杂交捕获试剂构成。所述猪200SNP标记探针为单链RNA探针，是根据筛选到的SNP位点设计并合成的核苷酸序列。探针的设计原则为探针长度120bp,探针GC含量25％-75％之间、同源性比对个数≤10。根据筛选获得的SNP位点设计2条覆盖所述SNP位点的寡核苷酸序列，核苷酸序列5’短带有生物素基团修饰，即所述的液相芯片的探针。将合成的2条RNA探针进行等摩尔质量混合，利用EDTA和Tris-HCl混合液定容为3pmol/mL的探针混合液。
本实施例中，所述杂交捕获试剂为康普森自主研发的建库试剂盒，包括
Library Prep Kit、
Buffer、Binding Buffer、Wash Buffer、Post PCR Kit。
步骤S2，利用待测猪基因组DNA构建高通量测序文库；步骤S2具体包括以下步骤：
步骤S2.1，提取待测猪只的基因组DNA：
本实施例选取包含父母代和子代的杜洛克、长白、大白三个猪品种群体进行检测，其中杜洛克194个个体，长白161个个体、大白220个个体，共计575个血液样本进行基因组DNA的提取，具体方法如下：
(1)向1.5ml的离心管中加入20ul蛋白酶K，之后加入200ul的血液。
注意：
1)冷冻抗凝血液需提前在室温(15～30℃)下放置，融化混匀。
2)如血液体积大于或小于200ul，蛋白酶K、Buffer ML和异丙醇与磁珠混合物的用量需按比例调整。
(2)向离心管中加入200ul Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次。
(3)将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟。加入彻底混匀的320ul异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀
仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。
(4)将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
(5)将离心管从磁力架上取下，加入750ul Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
(6)重复步骤5。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入750ul Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
(8)重复步骤7。
(9)保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750ul无水乙醇。盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
(10)将离心管从磁力架上取下，加入50-200ul Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
(11)将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
步骤S2.2，构建猪DNA高通量测序文库：
(1)基因组DNA片段化、末端修复、3’加A，具体包括：
在PCR管中配置总体积为30ul的反应体系，取步骤S2.1获得的猪DNA50-200 ng、Enzyme Fragmentation Mix 5ul、余量为Nuclease-free water。将反应体系轻柔混匀后短暂离心将反应液收集至管底，置于PCR仪中，进行如表5所示的反应，85℃热盖。
表5
(2)接头连接
将上述反应管置于冰盒上，加入Adapter for MGI 5ul、5×Ligation Buffer20ul、Ligase 10ul、Nuclease-free water 15ul，轻轻吹吸混匀并短暂离心将反应液收集至管底，置于PCR仪中，进行如表6所示的反应，取消热盖。
表6
| 温度(℃) | 时间(min) |
| 20℃ | 15min |
| 4℃ | 保持 |
(3)连接体系纯化
1)在上述反应体系中加入80ul的AgencourtAMPure XP磁珠，轻柔吹打混匀，室温静置5-10min；
2)将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清，移除上清；
3)PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200ul80％乙醇溶液，静置30s；
4)移除上清，再向PCR管内加入200ul80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
5)室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
6)加入22ul的Nuclease-free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
7)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，用移液器吸取20ul上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)。
(4)杂交前PCR反应：
将上述得到的纯化产物中加入Enzyme HiFi PCR Mix 25ul、Barcode-1(20μM)2.5ul、Barcode-2(20μM)2.5ul，涡旋或吹吸混匀并短暂离心将反应液收集至管底，置于PCR仪中，进行如表7所示的反应，热盖温度105℃。
表7
(5)PCR产物纯化：
1)在上述反应体系中加入50ul的AgencourtAMPure XP磁珠，轻柔吹打混匀，室温静置5-10min；
2)将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清，移除上清；
3)PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200ul80％乙醇溶液，静置30s；
4)移除上清，再向PCR管内加入200ul80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
5)室温静置3min-5min，使残留乙醇彻底挥发；
6)加入30ul的Nuclease-free water，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
7)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，用移液器吸取28ul上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)。
(6)文库质检
取1ul样品使用
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度，如下游进行液相捕获，则需文库浓度>25ng/ul；取3ul样品进行琼脂糖凝胶电泳检测片段长度，文库长度约在300bp-500bp间，合格后进行后续实验步骤，或将文库置于-20℃冰箱中保存。
步骤S3，将步骤S1制备的猪200SNP标记液相芯片与步骤S2构建的高通量测序文库混合，捕获猪DNA高通量测序文库中包含目标SNP位点的DNA片段。
(1)文库制备和浓缩
1)预先从﹣20℃保存的捕获试剂盒中，取出下表所示Block试剂，放置于冰盒上溶解，溶解混匀后置于冰上或4℃待用；
2)将样品文库与相对应的Block按照下表中相对应的反应体系配制，混匀后标记为B管。(“对应”指文库index类型与Block类型的对应，eg：使用了单端8bp的index类型，则参照表8所示的体系进行配制)。
表8
| 组分 | 体积 |
| 样品文库 | 750ng |
| Hyb Block | 5μl |
| Adapter-Block | 6μl |
3)将B管放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩(浓缩之前可以先用相同体积的水进行浓缩时间测试，计算样品单位体积减少的时间，确认浓缩速率，避免因浓缩时间过长导致过度干燥，造成样品损耗)；
4)将B管浓缩至体积小于10ul，之后用Nuclease-free water补足至10ul，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用。
(2)探针杂交
1)将
Buffer置于室温融化，混匀后置于50℃恒温混匀仪内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)每个反应取20ul
Buffer置于新的200ul PCR管内，盖好管盖，置于50℃恒温混匀仪孵育待用，标记为A管；
2)取5ul RNase Block与2ul Probe置于200ulPCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上或4℃待用，标记为C管；
3)从A管吸取13ul与B管10ul加入C管中震荡混匀，短暂离心后置于冰上待用；
4)将PCR管C置于PCR仪上，运行如表9所示的程序，热盖85℃：
表9
| 温度(℃) | 时间(min) |
| 80℃ | 5min |
| 50℃ | hold |
(3)捕获磁珠平衡
1)捕获磁珠(Cap beads)从4℃取出，涡旋震荡重悬；
2)取50ul磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清；
3)从磁力架上取下PCR管，加入200ulBinding Buffer轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠；
4)置磁力架上1min，移除上清；
5)重复步骤3以及步骤4两次，共清洗磁珠3次；
6)从磁力架上取下PCR管，加入180ulBinding Buffer轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
(4)捕获目标区域DNA文库
1)保持杂交产物在PCR仪上，将上述步骤重悬后180μl Cap beads加入到杂交产物中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；
2)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；
3)向杂交产物内加入200ul的Wash Buffer 1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，使溶液澄清，移除上清；
4)加入200ul的50℃预热的
Wash Buffer 2，轻轻吸打6次混匀，置于恒温振荡混匀仪上50℃孵育10min；
5)短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用
Buffer 2清洗2次，共计3次。最后一次彻底移除
Buffer 2(可用10ul移液器移除残留)；
6)保持样品在磁力架上，向PCR管内加入200ul80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10ul移液器移除残留)，室温晾干；
7)向PCR管加入30ul Nuclease-free water，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
步骤S4，对步骤S3捕获的DNA片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后对测序结果进行参考基因组比对，获得待测猪个体的基因分型。
(1)杂交后PCR反应
1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出Post PCR Buffer、Post PCR Primer(25μM)试剂，放置冰上溶解，溶解混匀后置于冰上待用；取出Post PCR Polymerase简短离心后立即使用。
2)捕获后需要对DNA文库进行富集，根据下表配制如表10所述的反应体系：
表10
| 组分 | 体积 |
| 来自步骤S3反应结束的样品 | 30μl |
| Post PCR Buffer | 18μl |
| Post PCR Primer(25μM) | 1μl |
| Post PCR Polymerase | 1μl |
| Total volume | 50μl |
3)将移液器调至40ul，轻轻吸打混匀6次，然后立即置于PCR仪上，运行如表11所示的程序，热盖105℃。
表11
(2)文库纯化
1)PCR结束后向样品加入55ulAgencourtAMPure XP磁珠，用移液器轻轻吸打6次混匀；
2)室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；
3)移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200ul的80％乙醇，静置30s；
4)移除上清，再向PCR管内加入200ul的80％乙醇，静30s后彻底移除上清(可用10ul移液器移除底部残留酒精)；
5)室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发；
6)加入25ul Nuclease-free water，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min；
7)将PCR管置于磁力架上2min；
8)用移液器吸23ul上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息；
9)取1ul文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1ng/ul-20ng/ul；
10)取1ul样品使用Agilent 2100Bioanalyzer system(Agilent DNA1000Kit)进行片段长度测定，文库长度约在300bp-500bp间；
11)利用高通量测序平台进行测序，并进行参考基因组比对，获得待测猪个体的基因分型。
步骤S5，亲子鉴定推断
第一步：根据相反纯合子、似然比(与无关个体相比)进行过滤，排除掉大多数不可能的亲子对；
第二步：对于每个个体(按照最早出生-最晚出生-出生日期未知的顺序)，所有前面满足过滤步骤并且出生年份更早或者未知的个体视为候选亲本，然后计算该个体与候选亲本亲子关系和全同胞关系的似然值。如果亲子关系的似然值更高，且亲子关系与全同胞关系的似然比大于给定阈值，就实现了一个亲子分配。如果存在多个符合条件的候选亲本，则分配似然比最高的候选亲本。
该实施案例的亲子鉴定的结果文件如下：
194个杜洛克个体的亲子关系鉴定结果参见表12，161个长白个体亲子关系鉴定结果参见表13，220个大白个体亲子关系鉴定结果参见表14。
表12
表13
表14
以上鉴定结果与系谱关系一致率100％，说明该发明专利的200个SNP标记能够准确的进行杜、长、大商业化品种猪亲缘关系鉴定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于猪亲缘关系鉴定的SNP分子标记组合，其特征在于，包括：在猪的18条常染色体上的200个SNP标记，所述SNP标记的SNP位点信息如下：
编号1的SNP位点位于2号染色体上第9987664位；
编号2的SNP位点位于14号染色体上第418001位；
编号3的SNP位点位于15号染色体上第2977317位；
编号4的SNP位点位于7号染色体上第7738134位；
编号5的SNP位点位于10号染色体上第2775295位；
编号6的SNP位点位于3号染色体上第11913946位；
编号7的SNP位点位于9号染色体上第7629826位；
编号8的SNP位点位于4号染色体上第7720753位；
编号9的SNP位点位于16号染色体上第2857298位；
编号10的SNP位点位于8号染色体上第1653890位；
编号11的SNP位点位于5号染色体上第5646887位；
编号12的SNP位点位于6号染色体上第2308923位；
编号13的SNP位点位于17号染色体上第2842639位；
编号14的SNP位点位于12号染色体上第1779292位；
编号15的SNP位点位于11号染色体上第4655543位；
编号16的SNP位点位于13号染色体上第7406226位；
编号17的SNP位点位于18号染色体上第23529836位；
编号18的SNP位点位于1号染色体上第1166570位；
编号19的SNP位点位于8号染色体上第1735070位；
编号20的SNP位点位于15号染色体上第126780202位；
编号21的SNP位点位于13号染色体上第9797897位；
编号22的SNP位点位于1号染色体上第277024546位；
编号23的SNP位点位于12号染色体上第9778935位；
编号24的SNP位点位于6号染色体上第10774932位；
编号25的SNP位点位于9号染色体上第60564642位；
编号26的SNP位点位于6号染色体上第11560736位；
编号27的SNP位点位于17号染色体上第13605151位；
编号28的SNP位点位于2号染色体上第10411684位；
编号29的SNP位点位于6号染色体上第11229072位；
编号30的SNP位点位于4号染色体上第15870194位；
编号31的SNP位点位于17号染色体上第13261924位；
编号32的SNP位点位于12号染色体上第9585887位；
编号33的SNP位点位于8号染色体上第11917230位；
编号34的SNP位点位于1号染色体上第3659113位；
编号35的SNP位点位于1号染色体上第13677911位；
编号36的SNP位点位于2号染色体上第45279469位；
编号37的SNP位点位于16号染色体上第75677205位；
编号38的SNP位点位于14号染色体上第1472814位；
编号39的SNP位点位于17号染色体上第35417485位；
编号40的SNP位点位于5号染色体上第89085559位；
编号41的SNP位点位于6号染色体上第110566592位；
编号42的SNP位点位于5号染色体上第26784434位；
编号43的SNP位点位于6号染色体上第12847266位；
编号44的SNP位点位于8号染色体上第93655842位；
编号45的SNP位点位于14号染色体上第44862892位；
编号46的SNP位点位于18号染色体上第24878198位；
编号47的SNP位点位于18号染色体上第33999857位；
编号48的SNP位点位于14号染色体上第2935893位；
编号49的SNP位点位于10号染色体上第15659641位；
编号50的SNP位点位于2号染色体上第126441545位；
编号51的SNP位点位于1号染色体上第13005755位；
编号52的SNP位点位于4号染色体上第15411794位；
编号53的SNP位点位于1号染色体上第3067609位；
编号54的SNP位点位于9号染色体上第151103363位；
编号55的SNP位点位于2号染色体上第93254715位；
编号56的SNP位点位于8号染色体上第14014245位；
编号57的SNP位点位于7号染色体上第9853317位；
编号58的SNP位点位于13号染色体上第16580025位；
编号59的SNP位点位于2号染色体上第17899277位；
编号60的SNP位点位于13号染色体上第9626564位；
编号61的SNP位点位于1号染色体上第71814074位；
编号62的SNP位点位于1号染色体上第195015097位；
编号63的SNP位点位于15号染色体上第25870115位；
编号64的SNP位点位于2号染色体上第12825813位；
编号65的SNP位点位于14号染色体上第98924773位；
编号66的SNP位点位于2号染色体上第120196914位；
编号67的SNP位点位于6号染色体上第15404754位；
编号68的SNP位点位于16号染色体上第78321074位；
编号69的SNP位点位于15号染色体上第50703395位；
编号70的SNP位点位于17号染色体上第5602353位；
编号71的SNP位点位于2号染色体上第15690950位；
编号72的SNP位点位于1号染色体上第280005928位；
编号73的SNP位点位于6号染色体上第113590851位；
编号74的SNP位点位于14号染色体上第16009816位；
编号75的SNP位点位于14号染色体上第153484247位；
编号76的SNP位点位于14号染色体上第47976495位；
编号77的SNP位点位于12号染色体上第12928807位；
编号78的SNP位点位于12号染色体上第31110698位；
编号79的SNP位点位于5号染色体上第8872919位；
编号80的SNP位点位于1号染色体上第155807226位；
编号81的SNP位点位于6号染色体上第46463711位；
编号82的SNP位点位于9号染色体上第11099863位；
编号83的SNP位点位于1号染色体上第283667735位；
编号84的SNP位点位于1号染色体上第17357393位；
编号85的SNP位点位于13号染色体上第183593435位；
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编号88的SNP位点位于8号染色体上第87954260位；
编号89的SNP位点位于8号染色体上第92363697位；
编号90的SNP位点位于1号染色体上第69552307位；
编号91的SNP位点位于14号染色体上第7471774位；
编号92的SNP位点位于6号染色体上第19952359位；
编号93的SNP位点位于13号染色体上第21156860位；
编号94的SNP位点位于13号染色体上第188175696位；
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编号102的SNP位点位于2号染色体上第152297331位；
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编号116的SNP位点位于17号染色体上第12798122位；
编号117的SNP位点位于12号染色体上第9053303位；
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编号119的SNP位点位于3号染色体上第136625273位；
编号120的SNP位点位于6号染色体上第38167864位；
编号121的SNP位点位于15号染色体上第47966193位；
编号122的SNP位点位于1号染色体上第11314997位；
编号123的SNP位点位于18号染色体上第32645081位；
编号124的SNP位点位于11号染色体上第30968353位；
编号125的SNP位点位于3号染色体上第34875870位；
编号126的SNP位点位于6号染色体上第10527048位；
编号127的SNP位点位于1号染色体上第137394988位；
编号128的SNP位点位于6号染色体上第121919072位；
编号129的SNP位点位于15号染色体上第40337548位；
编号130的SNP位点位于13号染色体上第58558625位；
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编号132的SNP位点位于3号染色体上第79053118位；
编号133的SNP位点位于1号染色体上第292925911位；
编号134的SNP位点位于14号染色体上第68031660位；
编号135的SNP位点位于1号染色体上第112021945位；
编号136的SNP位点位于8号染色体上第11343109位；
编号137的SNP位点位于15号染色体上第23522601位；
编号138的SNP位点位于12号染色体上第47262225位；
编号139的SNP位点位于6号染色体上第30555475位；
编号140的SNP位点位于14号染色体上第58652121位；
编号141的SNP位点位于15号染色体上第13833343位；
编号142的SNP位点位于4号染色体上第105640665位；
编号143的SNP位点位于5号染色体上第25590839位；
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编号146的SNP位点位于10号染色体上第14181887位；
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编号154的SNP位点位于11号染色体上第18300706位；
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编号163的SNP位点位于1号染色体上第90430196位；
编号164的SNP位点位于1号染色体上第192669302位；
编号165的SNP位点位于4号染色体上第124706188位；
编号166的SNP位点位于13号染色体上第179766527位；
编号167的SNP位点位于2号染色体上第117677874位；
编号168的SNP位点位于4号染色体上第36028125位；
编号169的SNP位点位于3号染色体上第111456973位；
编号170的SNP位点位于2号染色体上第146937374位；
编号171的SNP位点位于17号染色体上第34347823位；
编号172的SNP位点位于6号染色体上第149727715位；
编号173的SNP位点位于15号染色体上第73085857位；
编号174的SNP位点位于14号染色体上第39399052位；
编号175的SNP位点位于8号染色体上第131690844位；
编号176的SNP位点位于4号染色体上第62131813位；
编号177的SNP位点位于17号染色体上第62012280位；
编号178的SNP位点位于2号染色体上第44590539位；
编号179的SNP位点位于14号染色体上第96480217位；
编号180的SNP位点位于13号染色体上第49676934位；
编号181的SNP位点位于9号染色体上第149185476位；
编号182的SNP位点位于1号染色体上第226497707位；
编号183的SNP位点位于4号染色体上第94775080位；
编号184的SNP位点位于11号染色体上第64739915位；
编号185的SNP位点位于3号染色体上第70024499位；
编号186的SNP位点位于7号染色体上第122018904位；
编号187的SNP位点位于2号染色体上第91335279位；
编号188的SNP位点位于7号染色体上第70704925位；
编号189的SNP位点位于9号染色体上第55233498位；
编号190的SNP位点位于9号染色体上第120274182位；
编号191的SNP位点位于10号染色体上第64259339位；
编号192的SNP位点位于6号染色体上第109405647位；
编号193的SNP位点位于1号染色体上第276846341位；
编号194的SNP位点位于14号染色体上第150391777位；
编号195的SNP位点位于15号染色体上第126613417位；
编号196的SNP位点位于5号染色体上第87950981位；
编号197的SNP位点位于16号染色体上第68067084位；
编号198的SNP位点位于8号染色体上第83640594位；
编号199的SNP位点位于13号染色体上第160581841位；
编号200的SNP位点位于1号染色体上第1614730位。
2.用于鉴定权利要求1所述SNP分子标记组合的探针。
3.含有权利要求2所述探针的试剂盒。
4.权利要求1所述的SNP分子标记组合在猪的亲缘关系鉴定中的应用，所述猪的品种包括杜洛克猪、长白猪和大白猪。
5.一种对猪群进行SNP多态性分析及亲子鉴定推断的方法包括以下步骤：
步骤S1，制备基于靶向捕获测序的如权利要求1所述的猪200SNP标记的液相芯片；
步骤S2，利用待测猪基因组DNA构建高通量测序文库；
步骤S3，将步骤S1制备的猪200SNP标记的液相芯片与步骤S2构建的高通量测序文库混合，捕获猪DNA高通量测序文库中包含目标SNP位点的DNA片段；
步骤S4，对步骤S3捕获的DNA片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后对测序结果进行参考基因组比对，获得待测猪个体的基因分型；
步骤S5，亲子鉴定推断：根据相反纯合子、似然比进行过滤；
将满足过滤步骤的个体视为候选亲本，计算每个个体与候选亲本亲子关系和全同胞关系的似然值，确定亲子关系的似然值更高，且亲子关系与全同胞关系的似然比大于给定阈值，则实现亲子分配。
6.根据权利要求5所述的对猪群进行SNP多态性分析及亲子鉴定推断的方法，其特征在于，所述猪200SNP标记的液相芯片由独立包装的探针和杂交捕获试剂构成；所述探针为单链RNA探针，所述杂交捕获试剂为建库试剂盒，包括
Fast Library Prep Kit、
HybBlockI、
HybBlockII、
Hyb Buffer、Binding Buffer、WashBuffer、Post PCR Kit。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023201950A1 (zh) * | 2022-04-22 | 2023-10-26 | 中国农业大学 | 一种用于北京黑猪基因分型的snp分子标记组合、芯片及其制备方法与应用 |
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2021
- 2021-12-03 CN CN202111467074.2A patent/CN113981109A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| WO2023201950A1 (zh) * | 2022-04-22 | 2023-10-26 | 中国农业大学 | 一种用于北京黑猪基因分型的snp分子标记组合、芯片及其制备方法与应用 |
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