CN116287168B - 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 - Google Patents
一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116287168B CN116287168B CN202310552851.6A CN202310552851A CN116287168B CN 116287168 B CN116287168 B CN 116287168B CN 202310552851 A CN202310552851 A CN 202310552851A CN 116287168 B CN116287168 B CN 116287168B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- snp
- msnp
- probe
- pig
- target site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因分子育种领域,具体涉及基于多聚单核苷酸多态性的猪50K液相芯片及其应用。本发明芯片的探针设计考虑了捕获的SNP位点在全基因组的分布情况、位点多态性、mSNP标记质量等问题,有效避免了标记密度不均匀和多态性较差等问题。还考虑了mSNP标记质量及mSNP标记间连锁不平衡问题,在保持液相芯片设计基本原则下,挑选标记间连锁不平衡程度中等的基因组区域,产生更多分型质量高、在探针区域内与靶位点连锁不平衡中等的SNP标记。本发明的mSNP液相芯片使可检测的SNP数目扩大到靶位点数的1.5‑2倍以上,解决了传统液相芯片高质量mSNP标记较少的问题,且成本没有增加。
Description
技术领域
本发明涉及基因分子育种领域,具体涉及基于多聚单核苷酸多态性的猪50K液相芯片及其应用,更具体是猪50K mSNP液相芯片。
背景技术
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)具有数量庞大,在基因组范围分布广泛、易于大规模快速筛查以及基因分型等特点,被认为是目前最佳的分子标记。分子检测技术发展极为迅速,能够进行高通量基因分型的SNP芯片应运而生。目前,市场主流的SNP芯片主要基于固相技术开发,检测准确率较高。如图1所示,固相芯片主要对目标位点多次检测,保证基因分型的准确性。但固相芯片存在灵活性差、样本量要求严格(需是12或24的倍数)、定制成本高等缺点,限制了其在实际育种中的大规模使用。
与固相芯片不同,基于靶向测序基因型检测(genotyping by targetsequencing,GBTS)技术的液相芯片,具有标记增减方便、无样本量要求等优点。图1显示了GBTS技术主要对靶位点及其上下游进行多重测序,保证靶位点基因型分型质量。与固相芯片不同,液相芯片在对靶位点基因型检测同时,靶位点上下游的多态位点也能够得到基因型分型,称之为多聚单核苷酸多态性(multiple singlenucleotide-polymorphismcluster,mSNP或multiple dispersed nucleotide polymorphism,MNP)。以靶位点为核心的mSNP由于紧密连锁,处于高度连锁不平衡状态。在很多物种中,靶位点上下游mSNP基因型被认为与靶位点一致,提供不了额外的信息。如图2所示,水稻多个品种200bp片段内的标记间连锁不平衡(r2)为1,表明这些片段内的SNP基因型连锁相一样,即使有多个mSNP,提供的信息与单个靶位点是一样的。因此液相芯片纵使能够检测出超过靶位点数量的mSNP,也很少利用靶位点上下游的mSNP信息,仍以靶位点进行遗传分析和分子育种为主。
虽然动物基因组也存在近距离标记连锁不平衡程度高的现象,但是由于动物基因组多样性高和标记平均杂合度高,存在很多基因组区域,标记间的连锁不平衡程度处于中等水平。对于液相芯片,靶位点上下游的标记可以提供额外的信息。因此,多聚单核苷酸多态性技术,在不增加靶位点标记的前提下,显然可以增加更多有效mSNP标记,提高液相芯片的信息含量,充分利用GBTS技术特点,这是固相芯片技术做不到的。
多聚单核苷酸多态性技术虽然增加了mSNP标记,但是如何利用这些标记信息也存在诸多挑战,直接将mSNP作为单标记利用,标记间较高的连锁不平衡往往会带来噪音,降低遗传分析的效果。单倍型分析能够同时利用多个SNP标记信息,提高遗传分析效力。但是很多研究表明,如果标记间距过大,造成标记间的低连锁不平衡会产生很多单倍型,不仅不能增加遗传分析效力,还增加了分析复杂度和计算时间。目前猪上主流的50K SNP芯片,如美国纽勤公司设计的SNP chip Porcine GGP 50 K (包含 50,697 SNP标记),相邻标记平均间距40kb, 平均连锁不平衡为0.2。理论研究和育种实践表明,固定片段长度或固定SNP数目的单倍型分析不能够提高基因组选择的准确性。而液相芯片,虽然靶位点平均间距及连锁不平衡水平与SNP chip Porcine GGP 50 K接近,但以靶位点为核心的上下游mSNP标记,由于间距小,标记间连锁不平衡程度大大提升,将其作为一个区块进行单倍型分析,基因组选择准确性及遗传分析效力会大幅度提升。
发明内容
本发明开发了猪50K液相芯片,同时提供了芯片靶位点开发方法和分析方法,利用本发明设计的芯片和分析策略能够最大限度地利用靶位点上下游mSNP标记信息,提高猪遗传分析和分子育种效率。
本发明第一方面提供一种用于多聚单核苷酸多态性的50K mSNP液相芯片的SNP标记筛选和探针制备的方法,其以猪品种全基因组测序数据,挖掘并筛选靶位点SNP,再针对靶位点SNP设计探针并优化,最终得到确定的探针,所述方法包括以下步骤:
步骤一、确定靶位点SNP:基于杜洛克、大白、长白三个猪品种全基因组测序数据,比对至猪品种全基因组测序数据,挑选标记间连锁不平衡程度中等的基因组区域,筛选靶向捕获位点,即靶位点SNP;
步骤二、根据确定的靶位点SNP,设计探针:利用多聚单核苷酸多态性检测技术,以每个靶位点SNP为核心,设计1-4个110bp长度探针,每个探针覆盖靶位点,以靶位点为核心的探针总覆盖165bp长度区间;而探针设计的原则是:1)选取探针含量在30%-80%之间的;2)选取同源性区域个数≤5的;3)选取探针区域不包含SSR、N区域的;
步骤三、挑选含高质量mSNP的探针并优化探针:对探针进行杂交和测序,检测靶位点在内的mSNP基因型分型质量,设定缺失率NA<0.1,最小等位基因频率MAF>=0.05,杂合度Het<0.5,作为标准筛选mSNP,去掉不符合要求的mSNP,若探针没有符合标准要求的mSNP,删去该探针和靶位点,重新按步骤一和二设计新的探针,继续按本步骤检测和优化探针;符合质检要求的mSNP,最终作为50K mSNP液相芯片的靶位点。
具体地,所述猪品种全基因组测序数据是11.1参考基因组;所述靶位点SNP筛选的原则是:①各染色体上分布均匀、各染色体两端分布较密;②多态性考虑杜洛克、长白猪、大白猪中MAF>0.35;③与上下游SNP标记平均连锁不平衡程度r2低于0.85;④与QTLdb数据库比对,SNP标记尽量落在经济性状QTL区域;⑤与已知的猪50K芯片的部分位点重叠。
更具体地,所述已知的猪50K芯片是50KSNP液相芯片、美国纽勤公司GGP50K或中芯一号。
本发明第二方面提供一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50KmSNP液相芯片,其是基于所述方法得到的探针制备而成。
其制备步骤是,合成所述探针后进行等摩尔质量混合,缓冲液中定容1-5 pmol/mL,然后配制探针杂交液即得。
具体地,所述缓冲液是EDTA和Tris-HCl混合液。
更具体地,进一步包括采用Pooled,barcoded library,GenoBaits Block I,GenoBaits Block II for ILM/MGI配制探针杂交液,其组成如下:
优选地,利用真空浓缩仪在≤60℃的温度下对探针杂交液浓缩至全干。
本发明第三方面提供所述猪50KmSNP液相芯片的应用,具体是用于检测猪只个体基因型的方法,所述方法包括以下步骤:受检猪样本获得与基因组DNA提取;猪cDNA文库构建;用所述猪50KmSNP液相芯片与所构建的文库进行杂交、测序;按测序数据操作流程,对mSNP基因型分型,完成个体所有液相芯片标记位点的基因型判定。
优选地,所述mSNP基因型分析方法如下:
步骤一:完成个体液相芯片所有mSNP标记基因型判定后,对mSNP基因型进行质量控制;质控时按如下次序进行:
1)过滤复等位基因;
2)去除性染色体和位置未知的位点;
3)去除检出率(call rate)低于90%的SNP;
4)去除SNP位点的最小等位基因频率(MAF)低于0.05的SNP;
5)去除检出率低于90%的个体
步骤二:以靶位点SNP为核心,将其上下游200bp作为一个单倍型区块,将基因组划分为52000个单倍型区块,单倍型区块内mSNP标记数不少于1,数量不等;
步骤三:以单个单倍型区块为单位,推断单倍型,判定单倍型等位基因,构建受检样本该单倍型区块的单倍型基因型或双倍型,进而构建受检样本所有单倍型区块的双倍型向量,类似所有mSNP标记的基因型向量;
步骤四:根据所有样本双倍型向量,采用遗传分析或分子育种方法,以单倍型区块作为一个标记,区块内单倍型作为等位基因,双倍型为基因型。
与现有技术相比,本发明提供的基于猪50KmSNP液相芯片的开发方法具备以下有益效果:
本发明提供了基于靶向捕获测序进行基因分型的猪高通量SNP50K探针,探针设计考虑了捕获的SNP位点在全基因组的分布情况、位点多态性、mSNP标记质量等问题。在杜洛克、长白猪、大白猪群体中靶位点MAF要求大于0.35,有效避免了标记密度不均匀和多态性较差等问题。
相较于已有液相芯片,本发明考虑了mSNP标记质量及mSNP标记间连锁不平衡问题,在保持液相芯片设计基本原则下,挑选标记间连锁不平衡程度中等的基因组区域,产生更多分型质量高、在探针区域内与靶位点连锁不平衡中等的SNP标记,与靶位点统称为mSNP。mSNP液相芯片在单个扩增位点(靶位点)可以产生多个SNP标记,使可检测的SNP数目扩大到位点数的1.5-2倍以上。解决了传统液相芯片高质量mSNP标记较少的问题,且成本没有增加。
此外,本发明提供了有效利用mSNP标记的分析方法。相比传统的单标记分析及单倍型分析方法,本发明提供了以靶位点为核心涵盖其上下游mSNP的单倍型区块方法,充分利用了探针内SNP标记的连锁不平衡信息,提高了遗传分析及分子育种的效率。避免了传统单标记分析探针内mSNP带来的噪声,造成偏差过大;以及固定SNP数或片段长度的单倍型分析方法效力不高的问题。
因此,本发明在已开发的猪50K液相芯片基础上,结合猪基因组特点,利用多聚单核苷酸多态性技术,开发了猪50KmSNP液相芯片。相比已有的液相芯片,本发明在不增加成本的前提下,增加了有效的mSNP标记,信息量更大。同时,可以利用mSNP, 结合单倍型等分析方法,提高遗传分析和分子育种的效力。此外,本发明液相芯片可实现DNA杂交捕获时间为1个小时,相对于16小时以上的过夜杂交捕获流程,可大大缩短基因型获取时间,建库和捕获全流程可在一天内完成。
附图说明
图1、固相芯片和液相芯片技术示意图。
图2、5个水稻亚种的连锁不平衡衰减(Yan等,2020),5个亚种分别为澳大利亚水稻(Aus)/芳香族水稻(Aro)/热带/粳稻(TrJ)/温带粳稻(TeJ)/野生稻亚种(Oru)/籼稻(Ind)五个水稻亚种的标记间连锁不平衡说明数百bp间距的R2为1,处于完全连锁不平衡。
图3、本发明各染色体靶位点SNP数量(A)和密度分布(B)。
图4、猪场1的50KmSNP液相芯片靶位点和mSNP各染色体数量分布。
图5、猪场1的50K mSNP液相芯片靶位点(A)以及所有mSNP(B)的染色体密度分布。
图6、质控后50K mSNP液相芯片所有位点的分布(A)以及连锁不平衡衰减情况(B)。
图7、单倍型矩阵构建流程图。
图8 、50K mSNP液相芯片每个探针mSNP数量分布(A)和单标记及不同单倍型区块划分下相邻标记的单倍型平均连锁不平衡水平(B)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1:本发明所需的SNP标记筛选方法和探针制备
步骤一:靶位点SNP标记筛选
结合申请人已发明的50K液相芯片,基于杜洛克、大白、长白三个猪品种全基因组测序数据,比对至猪11.1参考基因组,挑选标记间连锁不平衡程度中等的基因组区域,筛选靶向捕获位点,即靶位点SNP。靶位点SNP筛选的原则是:①各染色体上分布均匀、各染色体两端分布较密;②多态性主要考虑杜洛克、长白猪、大白猪中MAF>0.35;③与上下游SNP标记平均连锁不平衡程度(r2)低于0.85;④QTLdb数据库比对,SNP标记尽量落在经济性状QTL区域;⑤与当前市场上50K芯片的部分位点重叠(50KSNP液相芯片、美国纽勤公司GGP50K和中芯一号),尤其包括本申请人此前研制的50KSNP液相芯片已含有的生长、繁殖、饲料报酬、体尺性状重要候选位点(CN202110359470.7-一种基于靶向捕获测序的猪50K液相芯片及其应用),保证芯片兼容性。
步骤二:根据靶位点SNP,设计探针
利用多聚单核苷酸多态性检测技术优化和设计探针,以每个靶位点SNP为核心,设计1-4个110bp长度探针,每个探针覆盖靶位点,以靶位点为核心的探针总覆盖165bp长度区间。探针设计的原则是:1)选取探针含量在30%-80%之间的;2)选取同源性区域个数≤5的;3)选取探针区域不包含SSR、N区域的。
步骤三:通过对探针多重测序和杂交,挑选含高质量mSNP的探针,并进行探针优化
对探针进行测序和杂交,检测靶位点和mSNP基因型分型质量,设定缺失率NA<0.1,最小等位基因频率MAF>=0.05, 杂合度Het <0.5 作为标准筛选mSNP,去掉不符合要求的mSNP, 若探针没有符合基因型质控要求的mSNP, 删去该探针和相应的靶位点,重新按步骤一和二设计新探针,继续按本步骤检测和优化探针。符合质检要求的mSNP,最终作为50KmSNP液相芯片位点。
其中,所述方法中步骤三设计的探针有助于保证同一靶位点SNP下,实现mSNP标记(含靶位点)检测数量和质量最优。本发明包含52000个靶位点,最终80631个高质量探针,与已开发的猪50K液相芯片相比,增加了3385个含5-7个mSNP的探针,主要集中在intergenic和intronic区域,含5-7个mSNP的探针平均间隔550Kb,表1以18号染色体为例,列出了部分含5-7个mSNP的探针信息。
表1:部分含有5-7个mSNP标记的探针信息(18号染色体)
与市场上50K SNP固相芯片相比,本发明提供的靶位点SNP数量为52000个(图3),针对靶位点设计80631个探针,检测到的SNP标记数(mSNP,含靶位点),大幅增加至8-10万个,提供了更多基因组信息。
实施例2: 50KmSNP液相芯片的制备
本实施例用来展示本发明的50KmSNP液相芯片的制备流程。具体如下:
步骤一:探针准备
将合成后的猪50K探针进行等摩尔质量混合,利用EDTA和Tris-HCl(TE缓冲液)混合液定容,配制成3pmol/mL的猪50K探针混合液,用于后期测序和杂交。
1、TE缓冲液的配制
1×TEBuffer
组成浓度:10mMTris-HCl1mM EDTA,PH=8.0
配制量:500ml
配制方法:量取下列溶液于500ml烧杯中
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0,5ml;0.5M EDTA PH=8.0,1ml
向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌;室温保存。
2、利用配制好的TE缓冲对猪50K探针定容,配制成3 pmol/mL的猪50K探针混合液,用于后期测序和杂交。
步骤二:探针杂交液配制
1、根据文库类型,将下述试剂混合于1.5mL的PCR管中
2、利用真空浓缩仪在≤60℃的温度下浓缩至全干;
3、浓缩完成后需将进行12000rpm离心1min,所制备探针可在在室温(15-25℃)下过夜储存用于后续DNA文库杂交捕获。
实施例3:50K液相芯片的使用和检测方法
本实施例用来展示本发明的50K液相芯片进行基因型检测的操作流程。具体如下:
步骤一:猪样本获得与基因组DNA提取
选取杜洛克、大白、长白三个常见的商业化猪种,每个猪种20个样本,共计60个样本,对耳组织进行基因组DNA的提取。具体方法如下:
1. 将适量乙醇脱水的猪耳组织剪碎放到96深孔板中(量小的话可以使用2.0mL离心管),加1个5mm钢珠,液氮冷冻后,利用研磨仪研磨1-2min。
2. 加入 500 uL Buffer PL2 、5 uL蛋白酶 K(目前实验室使用的已稀释的蛋白酶 K)到上述深孔板中。盖紧胶盖,利用振荡器振荡混匀。
3. 放入 65℃水浴 30min,水浴中间取出颠倒混匀。
4. 加入 500 uL酚氯仿异戊醇到深孔板中,用振荡器或移液器上下吹打充分混匀,静置 5min。
5. 4000 转离心 10 min,转移 400uL 上清液到新的 96 孔深孔板中。(注意一定不要吸到中间沉淀)。
6. 加入 800uL PW 溶液,充分混匀。
7. 将步骤 6 中的上清液分两次转移至 96 孔离心柱中,真空抽滤。
8. 向 96 孔离心柱中加入 600uL WB I,室温放置 2min,真空抽滤。(确认在 WBI 中已按瓶上指定的体积加入无水乙醇)。
9. 向 96 孔离心柱中加入 600uL WB II,真空抽滤。(确认在 WB II 中已按瓶上指定的体积加入无水乙醇)。
10. 向 96 孔离心柱中加入 600uL WB II,真空抽滤。
11. 将 96 孔离心柱放入一个空的收集板中,4000 转离心 5 min。将 96 孔离心柱放置于新96 孔 PCR 板上,室温晾干。
12. 96 孔离心柱中加 60~100uL 65℃预热 TE,室温放置 2 min,4000rpm 离心5 min(将TE 预热到 65℃有利于提高 DNA 的洗脱效率糖凝胶电泳检测目的片段长度)。
步骤二:猪cDNA文库构建
具体步骤包含:
1. 探针混合液
a) 在 PCR 管中采用本发明的试剂配制如下反应:
b) 将反应体系轻轻混匀后,短暂离心将反应液收集至管底;
c) 将反应管置于 PCR 仪中,进行以下反应,82℃热盖:
。
2. 接头连接
a) 在步骤1的反应体系中直接加入以下组分:
b) 将反应体系轻轻混匀后,短暂离心将反应液收集至管底。
注:体系一定要充分混匀,否则可能导致建库失败。
c) 将反应管置于 PCR 仪中,进行以下反应,取消热盖:于22℃ 60min后置于4℃保存备用。
3. DNA纯化
a) 将GenoPrep DNA CLean Beads提前取出,室温平衡30min以上,使用前振荡混匀。
b) 在步骤2的连接体系加入48 μLGenoPrep DNA CLean Beads,震荡混匀,尽量不要产生气泡,静置5min后,短暂离心将液体收集至管底。
c) 置于磁力架上至少3min,直至溶液澄清,移除上清。
d) 保持 PCR 管处于磁力架中,加入 100μL 80%乙醇。室温孵育 30秒,移除上清。
e)保持 PCR 管处于磁力架中,开盖晾 5分钟,直至乙醇挥发干。
f)PCR 管从磁力架中取出,用步骤四的 PCR 体系重悬磁珠。
4. 文库扩增
起始量与推荐扩增循环数
a)在新管中配制以下反应:
;
b) 将上述体系加入到步骤三晾干的磁珠中,将磁珠重悬后,短暂离心将反应液收集至管底;
c) 将反应管置于PCR 仪中,进行以下反应:
。
5.纯化
a) 在步骤4的体系加入20μL GenoPrep DNA CLean Beads,震荡混匀,尽量不要产生气泡,静置5min后,短暂离心将液体收集至管底。
b) 置于磁力架上至少3min,直至溶液澄清,移除上清。
c) 保持 PCR 管处于磁力架中,加入 100μL 80%乙醇。室温孵育 30秒,移除上清。
d) 保持 PCR 管处于磁力架中,开盖晾 10 分钟。
e) 将 PCR 管从磁力架中取出,加入 35μL Tris-HcL,震荡混匀,静置5min后,短暂离心将液体收集至管底。
f) 磁力架上,待溶液澄清(约 3 分钟),将上清移至新管,-20 度保存。
g) 文库需进行进一步的文库质量检测(如浓度测定与分布测定),以应用于上机或下一步的实验。
步骤三:猪基因组片段与本发明探针杂交,样品PCR与纯化,进行测序
步骤包含如下:
1.利用混合好的本发明探针,在室温(15-25℃)下融化,混合均匀并短暂离心。
2.GenoBaitsBLock II、GenoBaitsBLock
a)根据文库类型,将下述试剂混合于1.5 mL的PCR 管中
b) 利用真空浓缩仪在≤60℃的温度下浓缩至全干;
c) 浓缩完成后需将进行12000rpm离心1min再进行后续操作。
3. DNA文库杂交捕获
a)在室温下溶解所有的GenoBaits杂交试剂;
b) 将试剂加入试管;
c) 吸打或涡旋混匀,12000rpm离心1min,室温放置5min,再次吸打或涡旋混匀,轻微离心,将混合 mix全部转移至0.2mLEP管中;
d) 热循环孵化条件95℃ 10min (热盖温度105℃);
e) 待 PCR 扩增仪降温至 65°C时,转移至另一热盖温度为 75°C PCR 仪中。备注:若实验需要可进行65℃过夜杂交,(14-16h) *65℃杂交温度有助于提高捕获率
4. 准备洗脱液(Wash Buffer)
单一捕获体系,稀释GenoBaits buffers到1× 的体系。
5. 准备GenoBaits DNA Probe Beads
a)GenoBaits Probe Beads使用前室温放置10 min;
b)涡旋振荡15s混匀;
c)一个反应准备50 μL的GenoBaits Probe Beads 放入0.2mL的EP管中;
d)试管放在磁力架上,让磁珠与溶液彻底分离;
e)去除上清,保留磁珠
f)洗脱,每个反应加150 μL的GenoBaits 1X Bead Wash Buffer ,涡旋振荡10s,试管转移至磁力架上,磁珠与溶液完全分离,去上清;
g)重复上述第6步两次,共洗3次。
6.杂交片段与GenoBaits DNA Probe Beads结合
a)将杂交液16 μL(全部)转移至准备好的Beads中
b)涡旋震荡10s充分混匀,离心5s;
c)EP管放入PCR仪中,65℃,45min,热盖温度75℃(DNA与磁珠结合);
d)每12min,震荡5s 。
7.洗脱去除未结合的DNA(用步骤4中的1× Wash Buffer)
a)准备65℃洗脱液(在PCR仪上完成);
b)准备室温洗脱液;
c)重悬磁珠,悬液用于步骤8,剩余10μL留作备份。
8.PCR富集
a)据文库类型,在0.2mL的PCR管中配备PCR试剂;
b)简短涡旋,离心,保证磁珠仍在溶液中;
c)将PCR管放入PCR仪中,热盖温度105℃,进行PCR扩增。
9. PCR产物纯化
a) 每个 PCR 反应中加入 45μL(1.5X voLume)
GenoPrep DNA CLean Beads,震荡混匀,尽量不要产生气泡,静置5min后,短暂离心将液体收集至管底;
b) 置于磁力架上至少3min,直至溶液澄清,移除上清;
c) 保持 PCR 管处于磁力架中,加入 100μL 80% 乙醇。室温孵育 30秒,移除上清;
d) 保持 PCR 管处于磁力架中,开盖晾 10 分钟;
e) 将 PCR 管从磁力架中取出,加入 35μL Tris-HcL,震荡混匀,静置5min后,短暂离心将液体收集至管底;
f) 磁力架上,待溶液澄清(约 3 分钟),将上清移至新管,-20 度保存;
g) 文库需进行进一步的文库质量检测(如浓度测定与分布测定),以应用于上机或下一步的实验。
10. 文库检测
a) 用Qubits FLuorometer和Qubit dsDNA HS Assay Kit测量文库;
b)测量数字电泳系统上捕获DNA文库片段的平均长度;
c)用KAPA Library Quantification Kit测量文库浓度。
11. 测序
按测序仪要求操作。对靶位点SNP的平均测序深度为105.88X。
步骤四:mSNP基因型分型
按测序数据处理流程获得所有mSNP位点基因型。具体步骤如下:
1、利用Trimmomatic软件去除接头和低质量reads。
2、使用BWA软件将每个个体的reads比对到猪参考基因组Sscrofa11.1 (GCA_000003025.6);
3、使用SAMtools生成BAM和排序后的BAM文件;
4、使用GATK pipeline生成含有所有mSNP(含靶位点SNP)的VCF文件。
实施例3展示了本发明液相芯片使用操作流程,实施例4则对多个猪场的样本评测液相芯片基因型检测质量。
实施例4:猪50KmSNP液相芯片基因型分型质量评测
采集来自多个猪场杜洛克、长白和大白血样,按实施例3采用本发明进行基因型检测,对本发明检测稳定性、mSNP标记质量进行评测。
1、稳定性
芯片检测稳定性一般用重复样本两次基因型检测结果的一致性及相关系数来衡量。猪50KmSNP液相芯片60个重复样的两次基因型检测结果的基因型一致性(0.992(0.001))及相关系数均大于99%(0.996(0.001)),表明基因型检测的稳定性很好。
2、不同猪群体mSNP数量和质量
本发明开发的猪50K mSNP液相芯片靶位点数为52000个,测序数据经初步过滤后,由于标记如表2所示,靶位点均能检测出来,但其上下游的mSNP由于群体差异(有的群体部分mSNP位点没有多态),检测出来的数量有所不同,如表2所示,三个猪场检测出的靶位点数均为52000,总mSNP数108559-108585,虽略有差异,但变化不大。表明本发明设计的SNP位点在不同场具有普适性,能够广泛应用于实际群体。另外,如图4所示,各条染色体mSNP数显著增加。
两者的染色体密度分布相似,mSNP提高了SNP的密度,没有改变SNP分布的大致情况(图5),其他猪场也表现同样。表明在实际应用中,mSNP的检出符合多聚单核苷酸多态性理论检测技术特征,反映了本发明mSNP检测技术能够有效扩增SNP的标记数,从而提高片段捕获的效率。
另外,mSNP液相芯片中mSNP(含靶位点)与靶位点的缺失率和MAF几乎没有差异,表明mSNP液相芯片对SNP数目的扩增不会降低芯片数据的质量。
表2 三个种猪场50KmSNP液相芯片质控前后的靶位点及mSNP数
。
3、不同群体基因型质控后情况
基因型质量控制(简称‘质控’)是芯片检测完成后,为了保证下游分析质量,所进行的常规操作,主要受群体影响较大。本实施例对本发明多个猪群体采用如下质控步骤:
去除位置未知的位点;去除检出率(call rate)低于 90%的 SNP;去除 SNP 位点最小等位基因频率(MAF)低于 0.05 的 SNP;去除严重偏离哈代-温伯格平衡(P<10-6)的SNP。
如表2所示,三个猪场50KmSNP液相芯片质控后均删除掉小部分SNP,质控后mSNP标记共有81461~89851个,其中包含43136~43998靶位点,靶位点不满足质控的,其探针内的mSNP也同样不符合质控条件。质控后,mSNP标记数并没有大量减少,大约为靶位点的2倍,说明本发明挑选出了靶位点上下游高质量的SNP,增加了基因组信息。
以猪场1为例,如图6所示,mSNP液相芯片质控后数据分布没有太大变化,LD衰减趋势正常,但平均连锁不平衡程度(r2为0.45)与基于靶位点相比提升了(r2为0.2),有助于提高遗传分析和基因组选择效力。表明质控后mSNP在不降低数据质量的情况下可以大大提高SNP的检测数量,这有助于保留更多的有效变异,从而提高变异的检测效率。
本实施例4评测了本发明稳定性高,基因型质量好,液相芯片可用于全基因组关联分析和基因组选择等。实施例5以基因组选择为例,展示本发明的应用效果。
实施例5:50KmSNP液相芯片基因组选择应用
本发明对800头具有生长和繁殖数据大白猪个体采样后,利用本发明进行基因型检测,用于基因组选择。这些个体同时有固相芯片SNP chip Porcine GGP 50K(简称GGP50K,纽勤公司,美国)基因型数据。
1、基因型检测和质量控制
基因型质量控制是所有芯片(包括本发明)完成基因型检测后对标记基因型的必需手段,用以保证后续遗传分析及分子育种的结果合理。本实施例依次按如下步骤质控:
1)过滤复等位基因;2)去除性染色体和位置未知的位点;3)去除检出率(callrate)低于90%的SNP;4)去除SNP位点的最小等位基因频率(MAF)低于0.05的SNP;5)去除检出率低于90%的个体。
质控后,全部个体保留,本发明88105个mSNP位点保留,其中包含42302个靶位点SNP。GGP50K 芯片保留41296个SNP。GGP50K质控后SNP标记数与本发明靶位点SNP数接近。
2、本发明与GGP50K基因组选择准确性比较
表3展示了本发明和主流芯片GGP50K基因组选择效果比较,两款芯片标记数相近。基因型质控后,50K 液相芯片有88105个mSNP标记,其中包含42302个靶位点SNP,与GGP50K芯片质控后41296SNP数量接近。但GGP50K三个性状的基因组选择准确性低于本发明,比利用所有mSNP标记(88105个)的基因组选择准确性低1%~4%,比仅利用靶位点(42302个)的准确性低1.8%~5.4%。结果说明了本发明靶位点的选取能够保证基因组选择效果优于基于固相芯片技术的GGP50K。另一方面,与固相芯片不同,通过多聚单核苷酸多态性技术,mSNP液相芯片增加了标记,但传统的单标记分析方法没有显示出标记增加的优势,基因组选择准确性略低于仅利用42302靶位点。
需要说明的是,基因组选择是当前主要的分子育种方式,其应用效果主要通过基因组选择准确性来衡量。大多数性状的基因组选择准确性主要通过扩大参考群体(同时具有表型和基因型)和评估方法来改善,参考群体扩大1倍,意味着育种成本增加了1倍,准确性也仅是5-9%左右的提升,有的性状提升难度更大。而本发明同等群体规模下,液相芯片比GGP50K准确性在某些性状的提升达到了群体扩大1倍的效果。
表3本发明与固相芯片基因组选择准确性比较
实施例5虽然表明本发明可用于基因组选择,且与固相芯片相比具有优势。但按传统分析方法利用的mSNP标记没有显示标记数量增多优势。本发明提出了mSNP的改进分析方法,实施例6展示了应用于基因组选择的效果。同样,新方法也可用于全基因组关联分析等遗传分析。
实施例6:本发明mSNP分析方法应用于基因组选择
实施例5表明mSNP液相芯片虽然增加了mSNP标记数,且基因组选择准确性高于美国纽勤公司设计的GGP50K,但与仅使用靶位点SNP的基因组选择效果相比,没有显示标记数量优势,主要是由于传统分析方法的限制。因此本发明提出了基于单倍型分析的mSNP利用策略。本实施例即为说明本发明新分析方法的优势。
1、猪群体、表型数据与基因型数据同实施例5。
2、基因型质量控制标准及质控后个体数和标记数同实施例5。
3、单倍型区块划分:本发明提出了以靶位点SNP为核心的单倍型区块划分策略。以本发明制备的50K液相芯片靶位点为核心,将靶位点及其上下游200bp的mSNP作为一个单倍型区块,构建单倍型(以靶向block命名),靶向block数量与质控后靶位点数量相同。
4、单倍型等位基因(haplotype allele)及基因型矩阵构建
在每个靶向block内,构建所有受测样本的单倍型矩阵。如图7所示,在每个单倍型区块内(即靶向block),对个体单倍型进行重新编码。图7中A表示4个个体6个SNP标记的基因型矩阵,0,1,2分别表示纯合子,杂合子和另外一种纯合子基因型。图7中B方框所示的四个SNP为一个靶向block,首先根据SNP基因型进行单倍型推断,获得每个单倍型区块内每个个体父源和母源单倍型,对所有单倍型归类后作为等位基因编码,然后,针对单倍型区块中的每个单倍型等位基因,将个体双倍型编码为0、1、2,表示该个体携带某种单倍型等位基因的个数,如图7中C所示,4个SNP经单倍型推断后,有6种单倍型作为等位基因。最终产生一个N-H矩阵,其中N是个体数,H是单倍型等位基因总数,如图7中D所示,4个个体单倍型根据单倍型基因重新编码后,生成一个4*6单倍型矩阵,4为个体数,6为单倍型等位基因数。
5、本发明mSNP分析新方法的基因组选择准确性
表4展示了本发明mSNP分析新方法用于猪生长和繁殖性状的基因组选择效果。我们同时比较了靶向block与另外三种单倍型区块划分方法的效果,2 SNPs/block和5 SNPs/block是设置2个和5个SNP作为单倍型区块大小,不重叠,进行单倍型构建。400bp/block则是固定400bp物理间距划分区块,不重叠,进行单倍型构建。在四种单倍型区块划分方法中,本发明提出的靶向block基因组选择准确性最高,即使400bp/block效果与本发明提出的接近,但是其划分需要遍历整个基因组,计算时间过长,而靶向block只针对性地选取靶位点附近的mSNP,计算时间大大缩短。
表4 本发明提出的mSNP新分析方法基因组选择优势
经质控后,mSNP芯片有88105个mSNP标记,包含42302,一共形成42302个靶向单倍型区块,如图8中A所示,有50%的区块包含2个以上的mSNP (含靶位点),额外增加了45803个标记,标记数增加。如图8中B所示,这些mSNP与靶位点处于高连锁不平衡状态(r2=0.75),但不是完全连锁不平衡, 因此拥有单倍型多态,可以比单个SNP提供更高的信息(相邻靶位点的连锁不平衡平均为0.3),比仅利用靶位点产生了更高的基因组选择准确性。这些应用与本发明的设计吻合,筛选连锁不平衡程度中高的mSNP。因此,mSNP液相芯片可以在不增加应用成本的情况下,通过本发明提出的单倍型分析策略,提高基因组选择准确性,即本发明提出的mSNP分析新方法基因组选择效果最好。这同样可推广到全基因组关联分析等遗传分析中。
Claims (9)
1.一种用于多聚单核苷酸多态性的50K液相芯片的SNP标记筛选和探针制备的方法,其以猪品种全基因组测序数据,挖掘并筛选靶位点SNP,再针对靶位点SNP设计探针并优化,最终得到确定的探针,所述方法包括以下步骤:
步骤一、确定靶位点SNP:基于杜洛克、大白、长白三个猪品种全基因组测序数据,比对至猪品种全基因组测序数据,挑选标记间连锁不平衡程度中等的基因组区域,筛选靶向捕获位点,即靶位点SNP;
步骤二、根据确定的靶位点SNP,设计探针:利用多聚单核苷酸多态性检测技术,以每个靶位点SNP为核心,设计1-4个110bp长度探针,每个探针覆盖靶位点,以靶位点为核心的探针总覆盖165bp长度区间;而探针设计的原则是:1)选取探针含量在30%-80%之间的;2)选取同源性区域个数≤5的;3)选取探针区域不包含SSR、N区域的;
步骤三、挑选含高质量mSNP的探针并优化探针:对探针进行杂交和测序,检测靶位点在内的mSNP基因型分型质量,设定缺失率NA<0.1,最小等位基因频率MAF>=0.05,杂合度Het<0.5,作为标准筛选mSNP,去掉不符合要求的mSNP,若探针没有符合标准要求的mSNP,删去该探针和靶位点,重新按步骤一和二设计新的探针,继续按本步骤检测和优化探针;符合质检要求的mSNP,最终作为50K mSNP液相芯片的靶位点;
所述猪品种全基因组测序数据是11.1参考基因组;所述靶位点SNP筛选的原则是:①各染色体上分布均匀、各染色体两端分布较密;②多态性考虑杜洛克、长白猪、大白猪中MAF>0.35;③与上下游SNP标记平均连锁不平衡程度r2低于0.85;④与QTLdb数据库比对,SNP标记尽量落在经济性状QTL区域;⑤与已知的猪50K芯片的部分位点重叠。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述已知的猪50K芯片是50K mSNP液相芯片、美国纽勤公司GGP50K或中芯一号。
3.一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50K mSNP液相芯片,其特征在于,其是基于如权利要求1或2所述方法得到的探针制备而成。
4.如权利要求3所述的猪50K mSNP液相芯片,其特征在于,合成所述探针后进行等摩尔质量混合,缓冲液中定容1-5 pmol/mL,然后配制探针杂交液即得。
5.如权利要求4所述的猪50K mSNP液相芯片,其特征在于,所述缓冲液是EDTA和Tris-HCl混合液。
6.如权利要求4所述的猪50K mSNP液相芯片,其特征在于,进一步包括采用Pooled,barcoded library,GenoBaits Block I,GenoBaits Block II for ILM/MGI配制探针杂交液,其组成如下:
Pooled,barcoded library 0.6 μL,GenoBaits Block I 5 μL,GenoBaits Block IIforILM/MGI 2μL,所述探针300ng。
7.如权利要求6所述的猪50K mSNP液相芯片,其特征在于,利用真空浓缩仪在≤60℃的温度下对探针杂交液浓缩至全干。
8.一种利用如权利要求3至7任一项所述猪50K mSNP液相芯片检测猪只个体基因型的方法,所述方法包括以下步骤:受检猪样本获得与基因组DNA提取;猪cDNA文库构建;用所述猪50KmSNP液相芯片与所构建的文库进行杂交、测序;按测序数据操作流程,对mSNP基因型分型,完成个体所有液相芯片标记位点的基因型判定。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述mSNP基因型分析方法如下:
步骤一:完成个体液相芯片所有mSNP标记基因型判定后,对mSNP基因型进行质量控制;质控时按如下次序进行:
1)过滤复等位基因;
2)去除性染色体和位置未知的位点;
3)去除检出率低于90%的SNP;
4)去除SNP位点的最小等位基因频率低于0.05的SNP;
5)去除检出率低于90%的个体;
步骤二:以靶位点SNP为核心,将其上下游200bp作为一个单倍型区块,从而将基因组划分为52000个单倍型区块,单倍型区块内mSNP标记数不少于1,数量不等;
步骤三:以单个单倍型区块为单位,推断单倍型,判定单倍型等位基因,构建受检样本该单倍型区块的双倍型,进而构建受检样本所有单倍型区块的双倍型向量,类似所有mSNP标记的基因型向量;
步骤四:根据所有样本双倍型向量,以单倍型区块作为一个标记,进行遗传分析或分子育种分析。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310552851.6A CN116287168B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310552851.6A CN116287168B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116287168A CN116287168A (zh) | 2023-06-23 |
CN116287168B true CN116287168B (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=86783690
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310552851.6A Active CN116287168B (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116287168B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112921076A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-08 | 中国农业大学 | 一种基于靶向捕获测序的猪50k液相芯片及其应用 |
CN115232881A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-10-25 | 厦门大学 | 一种鲍基因组育种芯片及其应用 |
-
2023
- 2023-05-17 CN CN202310552851.6A patent/CN116287168B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112921076A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-08 | 中国农业大学 | 一种基于靶向捕获测序的猪50k液相芯片及其应用 |
CN115232881A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-10-25 | 厦门大学 | 一种鲍基因组育种芯片及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Zifeng Guo等.Development of high-resolution multiple-SNP arrays for genetic analyses and molecular breeding through genotyping by target sequencing and liquid chip.《Plant Communications》.2021,第2卷(第6期),第1-15页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116287168A (zh) | 2023-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112921076B (zh) | 一种基于靶向捕获测序的猪50k液相芯片的制备方法及其应用 | |
US20100016653A1 (en) | Quantitative Trait Loci and Somatostatin | |
CN113308562B (zh) | 棉花全基因组40k单核苷酸位点及其在棉花基因分型中的应用 | |
CN110029178A (zh) | 与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测引物组、检测试剂盒和应用 | |
CN107090495B (zh) | 与谷子脖长性状相关的分子标记及其检测引物和应用 | |
CN106498078B (zh) | 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
Salisu et al. | Molecular markers and their Potentials in Animal Breeding and Genetics | |
CN106755371B (zh) | 利用pcr-rflp检测绵羊pcnp基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
CN106967722A (zh) | 与水牛泌乳相关基因srebp1及其作为分子标记的应用 | |
CN101899526B (zh) | 一种山羊产羔性状的分子标记选择方法 | |
KR102235340B1 (ko) | 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도 | |
CN117363750A (zh) | 一种可用于民猪选育的15k液相芯片制备方法及基因分型方法 | |
CN105543403B (zh) | 水牛泌乳相关基因Leptin作为分子标记的方法及其应用 | |
CN116287168B (zh) | 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪50k液相芯片及其应用 | |
KR102064559B1 (ko) | 모돈의 생애총생산성 형질 예측용 snp 마커 및 이의 용도 | |
CN106701930B (zh) | 利用pcr-sscp检测绵羊fth-1基因插入缺失多态性的方法及其应用 | |
CN110564867A (zh) | 一种秦川牛cfl1基因的snp分子标记及其检测方法 | |
CN116377082A (zh) | 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用 | |
CN116004898A (zh) | 一种花生40K液相SNP芯片PeanutGBTS40K及其应用 | |
CN115612746A (zh) | 一种用于肉鸡亲缘关系鉴定的靶向捕获测序芯片 | |
CN108315435A (zh) | 与绵羊产羔数性状相关的snp分子标记及应用 | |
CN116445584B (zh) | 一种基于多聚单核苷酸多态性的猪10k液相芯片及其应用 | |
CN101845507B (zh) | 检测山羊促性腺激素释放激素和生长分化因子9的碱基突变多态性的方法 | |
CN113981109A (zh) | 用于猪亲缘关系鉴定的snp分子标记组合、应用及方法 | |
CN107287301B (zh) | 利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |