CN112458198B - 抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记及其应用。本发明公开了与水稻抗褐飞虱基因Bph27共分离及扩增效果良好的SNP标记K040534，该标记检测水稻第4号染色体20308270位碱基(MSU7.0)，多态性为G/C，基于KASP技术开发的标记K040534的引物序列如SEQ ID No：1‑3所示。本发明的SNP分子标记可用于检测Bph27基因位点为高特异性的位点，可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有Bph27基因。本发明提供的SNP分子标记的应用方法准确可靠，操作简便，适用于Bph27基因的鉴定及辅助选择育种。

Description

抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，尤其涉及抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记及其应用。

背景技术

水稻是我国的重要粮食作物。褐飞虱是一种水稻单食性害虫，通过口针吸食韧皮部汁液为害稻株，造成水稻生长缓慢、分蘖延迟、空瘪粒增加。褐飞虱还是草状丛矮病毒和齿叶矮缩病毒等一些水稻病毒的传播媒介，严重影响水稻的生产和安全。目前，对褐飞虱的防治主要依赖于化学防治，不但增加了生产成本和害虫的耐药性，而且污染环境，因此，利用寄主抗性培育抗褐飞虱品种被认为是防治其危害的有效途径。

到目前为止，已经鉴定和导报了至少34个抗褐飞虱基因位点，其中显性基因19个，隐性基因15个，已经定位的主效抗褐飞虱基因达28个，有4个抗性基因被克隆，分别是Bph3(Liu et al.2014)、Bph14(Du et al.2009)、Bph9(Zhao et al.2016)和Bph26(Ji etal.2016)。He等从普通水稻品种Balamawee鉴定出抗虫基因Bph27，并将其定位在第4号染色体的分子标记Q52和Q4之间。

由于抗虫表型鉴定过程繁琐复杂，限制了水稻抗褐飞虱品种的育种效率，且利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。开发与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记，利用分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)技术聚合一个或多个目的基因或QTL，从而选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。

传统的水稻抗虫育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助选择育种简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期，亦可进行有目的的多基因聚合，提高育种效率，带来巨大的社会经济效益。文献报道中主要利用的标记类型为SSR和InDel标记，在育种中存在多态率较低，差异较小的缺点。检测过程中使用的EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。开发与抗褐飞虱基因Bph27共分离的特异性分子标记及建立高效、环境友好的相关检测体系，则对促进Bph27基因在商业化育种中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是开发出高抗、广谱、持久的抗褐飞虱基因Bph27的分子标记，其能用于Bph27基因的鉴定及辅助选择育种。

本发明抗褐飞虱基因Bph27辅助育种分子标记的开发流程见图1。前期研究表明抗褐飞虱基因Bph27来源于籼稻品种Kaharamana，定位于水稻第4号染色体的分子标记Q52和Q4之间(国家水稻数据中心)。

利用前期文献公布的Bph27基因序列确定对应参考基因组日本晴(MSU7.0)上物理位置，对此基因区间及其附近两侧的SNP位点进行挖掘。挑选出的SNP位点，提取侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3对其进行引物设计。

针对这些候选SNP标记，对抗虫基因Bph27供体材料3份、其他抗虫基因供体2份、感虫对照4份和常见水稻材料7份进行KASP初筛反应验证，挑选出与Bph27供体材料共分离及扩增效果好的的SNP标记K040534。

随后利用约95份材料对所挑选的抗性基因连锁SNP标记进行自然群体验证，证明本发明检测的Bph27基因位点为高特异性的抗性位点，可以用于Bph27的筛选和检测。

为了实现本发明目的，本发明提供抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记，所述分子标记是与水稻抗褐飞虱基因Bph27共分离的SNP标记K040534，该SNP标记检测水稻第4号染色体20308270位碱基。

本发明还提供基于KASP技术开发的用于鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph27的引物，包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph27中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在抗褐飞虱基因Bph27辅助育种中的应用。

本发明还提供所述分子标记、引物、检测试剂或试剂盒在选育具有褐飞虱抗性的水稻资源中的应用。

所述应用包括以下步骤：

1)提取待测水稻样品的DNA；

2)取20ng干燥的模板DNA，100μM特异引物X 0.005μL，100μM特异引物Y 0.005μL，100μM通用引物C 0.0125μL，2×KASP Master Mix 1.4792μL，H ₂O 1.4983μL，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

进一步地，步骤2)中的PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

进一步地，步骤3)具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，如果样品的PCR产物只检测到特异引物X对应的荧光信号，则检测位点为碱基G，判定测试的水稻样品为纯合的不抗虫Bph27基因型；若只检测到特异引物Y对应的荧光信号，则检测位点为碱基C，判定测试的水稻样品为纯合的抗虫的Bph27基因型；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为G:C，判断待测水稻为杂合的抗Bph27基因型。等位位点K040534-C为具有褐飞虱抗性优异等位类型的水稻植株。

利用本发明提供的SNP标记K040534，通过检测某水稻品种的“Bph27基因位点”，最终确认在被测定水稻品种中Bph27基因的等位类型。

本发明具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，而且该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可在早代选择，缩短育种年限，提高育种效率，适于推广应用。本发明对水稻抗褐飞虱品种的改良具有重要意义，适用于Bph27基因的辅助选择育种。

基于KASP的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致性高；检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记的开发流程图。

图2为本发明实施例2中SNP标记K040534检测自然群体分型图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1水稻抗褐飞虱基因Bph27辅助育种分子标记的获得

本实施例用于说明本发明提供的分子标记在检测抗褐飞虱基因Bph27中的应用，具体步骤如下：

1、引物设计

根据相关文献将抗褐飞虱基因Bph27的位置确定在日本晴(MSU7.0)的第4号染色体21271158-21334358区间，提该区间的Bph27基因特异的SNP位点和侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。

表1：分子标记及引物信息

基于KASP反应原理及抗感材料的单碱基差异设计的标记能高通量地对水稻材料进行Bph27抗性基因检测，如果样品中只检测到FAM荧光，则该样品的碱基为Allele X；如果只检测到HEX荧光，则该样品的碱基为Allele Y；如果同时检测到两种荧光，则该位点碱基为杂合状态。

2、采用简化CTAB法，从水稻叶片中提取基因组DNA

①取样放入2.0mLTube中，预先加入两粒钢珠和750μL CTAB溶液，震荡匀浆样品1.5min；

②65℃震荡加热0.5-1h；

③冷却至室温，在通风橱中加入750mL氯仿︰异戊醇(24︰1)溶液混匀；

④12000rmp离心10min，取上清约500mL转移至新的1.5mL离心管中；

⑤加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，去上清；

⑥加入1000mL70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，去上清；

⑦加300μL H₂O过夜溶解备用。

3、KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ngDNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。

表2：KASP检测的反应体系

PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

4、标记分型数据

用标记K040534对抗虫基因Bph27供体材料3份、其他抗虫基因供体2份、感虫对照4份和常见水稻材料7份进行KASP初筛反应验证，结果如表3。Bph27基因的供体品种在K040534测试位点检测出抗虫的基因型C，其他13份材料全部为不抗虫的基因型G。

表3：标记K040534初筛分型数据

编号	材料名称	材料说明	检测结果
				1	Balamawee	Bph27	C
2	991-2	Bph27	C
				3	抗991	Bph27	C
4	IR56	Bph3	G
				5	华2211	Bph14，Bph15	G
6	02428	感性材料	G
				7	TN1	感病材料	G
8	9311	感虫材料	G
				9	Nipponbare	感虫材料	G
10	黄华占	轮回亲本	G
				11	华占	轮回亲本	G
12	南粳5055	轮回亲本	G
				13	天丰B	轮回亲本	G
14	岳4B	轮回亲本	G
				15	Y58S	轮回亲本	G
16	C815S	轮回亲本	G

实施例2水稻抗褐飞虱基因Bph27的SNP标记K040534的应用

为检测本发明中标记的特异性和实用性，利用95份材料对SNP标记K040534进行自然群体验证。95份材料中包括感虫对照材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料。标记在自然群体分型结果如图2所示，除了供体Balamawee检测出纯合Bph27基因型外，其他感虫对照材料、常见杂交稻和核心水稻育种材料均检测为无褐飞虱抗性纯合bph27基因型。可见，SNP标记K040534检测Bph27基因位点为高特异性的抗性位点，可便捷高效的用于鉴定水稻品种中是否含有Bph27基因。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 华智水稻生物技术有限公司

<120> 抗褐飞虱基因Bph27的辅助育种分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttttacagaa ttagcaggtg cc 42

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tttacagaat tagcaggtgc g 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaacaaaa acatgaatgc 20

Claims (6)

1.一种引物或检测试剂或试剂盒在鉴定水稻抗褐飞虱基因Bph27中的应用；

所述引物包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；

所述检测试剂或试剂盒含有所述引物。

2.一种引物或检测试剂或试剂盒在水稻抗褐飞虱基因Bph27辅助育种中的应用；

所述引物包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；

所述检测试剂或试剂盒含有所述引物。

3.一种引物或检测试剂或试剂盒在选育具有褐飞虱抗性的水稻资源中的应用；

所述引物包括特异引物X、特异引物Y和通用引物C，引物序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；

所述检测试剂或试剂盒含有所述引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1）提取待测水稻样品的DNA； 2）取20ng干燥的模板DNA，100µM特异引物X 0.005μL，100µM特异引物Y 0.005μL，100µM通用引物C 0.0125μL，2×KASP Master Mix1.4792μL，H₂O 1.4983μL，进行PCR扩增； 3）采用荧光检测仪分析PCR扩增产物基因型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2）PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤3）具体为：利用生物学软件对PCR扩增产物进行分型，如果样品的PCR产物只检测到特异引物X对应的荧光信号，判定测试的水稻样品为纯合的不抗虫Bph27基因型；若只检测到特异引物Y对应的荧光信号，判定测试的水稻样品为纯合的抗虫的Bph27基因型；若同时检测到两种荧光信号，判断待测水稻为杂合的抗Bph27基因型。

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