CN102344925A - 一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8，其序列如SEQIDNO：1所示。检测试剂盒，含有可识别上述基因试剂。本发明首次在人类基因组中分离并鉴定得到的α-地贫基因。该致病基因缺失了整个α2基因，可导致α-珠蛋白表达产物量降低。本发明的新基因为更为全面的进行地贫筛选创造了条件。使用本发明的检测试剂盒，可以检测出这一新型基因缺陷。

Description

一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种新的致病基因及其检测试剂盒，特别涉及一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒。

背景技术

地中海贫血（“地贫”）是一常见的常染色体隐性遗传病，是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病之一，被世界卫生组织列为危害人类健康的6种常见病之一。该疾病是由于珠蛋白基因或其相关调控序列的缺失或点突变，导致珠蛋白肽链合成障碍，使得组成珠蛋白的α链和β链合成失去平衡而导致的溶血性贫血病。根据受累珠蛋白链的不同，分为α地中海贫血与β地中海贫血。

人的α类珠蛋白基因位于16p13.3，长约40kb，整个α类珠蛋白基因簇共由7个基因组成，包括4个可编码基因和3个假基因：端粒-ξ-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-着丝粒。珠蛋白族基因表达受着严格的时空调控，其中ξ-珠蛋白基因在胚胎期表达，α2、α1和θ珠蛋白基因在胎儿和成人期表达。

在我国大于80%的α地中海贫血是由于编码α-珠蛋白的α基因（α2和/或α1）的大片段缺失引起，而这其中最为常见的又为--^SEA，-α^3.7与-α^4.2 3种类型，但却不仅限于此，一些新的缺失如：--^11.1、--^HW、-α^2.7、-α^2.4、-α^27.6也相继被发现。这些发现我国的α-地中海贫血基因谱特别广。这也提醒我们在地贫的基因筛查时需特别谨慎。

目前对于α-地贫的诊断主要依靠基因检测，即检测到α-地贫基因而确诊。检测方法有多重Gap-PCR、多重连接酶依赖的探针扩增技术（MLPA）、实时荧光定量PCR、斑点杂交、直接基因测序等方法。

要进行地贫的全面基因筛查，需要找到尽可能多的致病基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的α-地中海贫血2基因。

本发明所采取的技术方案是：

缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8，其序列如SEQ ID NO：1所示。

一种检测试剂盒，含有可识别上述基因的试剂。

优选的，检测试剂盒含有可特异性识别上述基因或其产物的试剂。

缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8的检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待测患者外周血的基因组DNA；

（2）以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；

（3）对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出扩增产物；

（4）对检测出阳性PCR产物进行直接基因测序，对测序结果与参考序列NG_000006.1进行比对，确定断裂位点（NG_000006.1: g.32486-35380 del 2895）。

优选的，PCR反应中的引物序列为：Primer F: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT （SEQ ID NO：2）；Primer R：CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT （SEQ ID NO：3），PCR产物直接测序的引物序列为：SEQ_2R: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT（SEQ ID NO：4）。

本发明的有益效果是：

本发明首次在人类基因组中分离并鉴定得到的α-地贫基因。该致病基因缺失了整个α2基因，可导致α-珠蛋白表达产物量降低。本发明的新基因为更为全面的进行地贫筛选创造了条件。

使用本发明的检测试剂盒，可以检测出这一新型基因缺陷。

附图说明

图1泳道2是样本患者的多重Gap-PCR 检测中国人常见的3种缺失型α-地中海贫血基因结果，其中长度为1800bp的条带是α-珠蛋白正常基因的扩增产物，长度为2000bp、1600bp、1300bp的条带分别是-α^3.7、-α^4.2、--^SEA缺失型扩增产物；

图2是样本患者的MLPA检测结果，其中a ：图中蓝色示正常α珠蛋白基因MLPA检测原始结果，红色示患者α珠蛋白基因MLPA检测原始结果。b :示将a中的患者MLPA结果量化后的结果，其中比值0.73-1.3则无相应基因序列缺失，比值0.4-0.7则存在相应序列的杂合缺失。比值为0.0则存在相应序列的纯合缺失（其中探针9所检测序列即a中箭头所示片段缺失乃是由于在连接位点的SNP导致的假阳性）。c : 示各探针在α珠蛋白基因上的相对位置（其中探针13,16同时可检测α2与α1基因序列）图中红色粗线条示新缺失片段的区域；

图3是样本患者的Gap-PCR产物测序结果图， a：示断裂位点附近序列；b：示正常α-珠蛋白基因（αα）与新缺失型α-地贫基因-α^2.8。

具体实施方式

样本来源：

29岁疑似地贫女性患者外周血，患者既往无输血史，发育正常，无黄疸及肝脾肿大。贫血筛查示：RBC（红细胞计数）5.55×10¹²/l，Hb（血红蛋白）92g/l，MCV（红细胞平均体积）54fl，MCH（平均血红蛋白含量）16.5pg。血红蛋白电泳结果示：HbA含量96.96%，HbA2含量1.89%，HbH含量1.15%。符合轻型HbH病表现。

多重Gap-PCR 检测

采用亚能生物技术有限公司生产的α-地中海贫血基因诊断试剂盒进行多重Gap-PCR检测，该诊断试剂盒可同时检测中国人群中常见的--^SEA，-α^3.7与-α^4.2三种α-地贫基因。按照说明书进行检测，其检测结果如图1所示，图中，其中长度为1800bp的条带是α-珠蛋白正常基因的扩增产物，长度为2000bp、1600bp、1300bp的条带分别是-α^3.7、-α^4.2、--^SEA缺失型扩增产物。

结果显示该个体基因型为--^SEA纯合子（--^SEA/--^SEA），即缺失了4个α基因，与患者表型不符。提示该个体可能携带本试剂盒不能检测到的α-地贫基因。

MLPA检测

用荷兰MRC-Holland公司的Salsa MLPA P140-B3 HBA试剂盒进行检测。该试剂盒中含有针对α-珠蛋白基因簇的HS 40、α2、α1基因序列以及ξ、ψξ1、ψα2、ψα1、HS 40、α2、α1基因间DNA序列的多对探针。可同时专一检测α1与α2第1及第3外显子、α2第2内含子及第3外显子DNA序列，以及上游调控序列HS 40和α-珠蛋白基因簇上的ξ、ψξ1、ψα2、ψα1序列。因此该试剂盒能筛查α-珠蛋白基因簇上的各相应DNA序列的缺失情况。按照试剂盒说明书对该个体DNA进行检测。结果显示（见图2）：除外一常见--^SEA 缺失（SALSA probe HBA2P/HBA1P-04637-L04018 到probe HBQ1 3.7kb dw’ HBA1 06707-L06294*，图2c中探针8-25），还存在另一缺失，范围从探针04628-L04008（NG_000006.1: 33103-33102，图2c中探针12）到探针04626-L04740（NG_000006.1: 34974-34975，图2c中探针18）。

根据MLPA结果，锁定上游断裂位点位于探针08492-L08415（NG_000006.1：31233-31232，图2c中探针11）与04628-L04008（NG_000006.1: 33103-33102，图2c中探针12）之间的区域内，下游断裂位点位于探针04626-L04740（NG_000006.1: 34974-34975，图2c中探针18）与探针08493-L08416 (NG_000006.1: 35557-35558，图2c中探针19)之间的区域内。因此，基于此结果设计引物：

Primer F: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT （SEQ ID NO：2）；

Primer R：CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT （SEQ ID NO：3）进行跨越断裂点扩增。扩增体系可以为：

PCR扩增试剂盒可以为购自宝生物公司的Primer STAR^TM HS DNA Polymerase 试剂。

扩增程序可以为：98℃， 5 min； (98℃ 10 S；72℃^{-0.2℃/循环} ，2.5min)^{20 次循环}； 98℃ 10 S； 68℃， 2.5min)^15次循环s； 72℃，7min； 4℃ 保存。PCR扩增在ABI公司的9700 PCR仪上运行。扩增完成后取5ul PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察扩增是否成功。若扩增成功应显示一约2~3kb的产物条带。

扩增成功后，产物直接测序，测序仪为ABI公司的3130XL遗传分析仪，所用试剂为ABI公司的Bigdye v3.1。测序引物第一轮直接采用上述扩增引物，可得到一段可读长度约400bp的DNA序列，然后再利用这段序列设计引物，继续下轮测序，引物序列为：

SEQ_2R: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT（SEQ ID NO：4）。将测序结果与参考序列NG_000006.1比对。获得具体断裂位点。结果为：断裂位点5‘端位于32486位置，3‘端位于35380位置，因此缺失片段为：NG_000006.1: g.32486-35380 del 2895（断裂位点附近序列见图3），该缺失片段包含了整个α2基因片段（NG_000006.1: g.33710-34573），命名为-α^2.8。

本发明首次在人类基因组中分离并鉴定得到的α-地贫基因。因该致病基因缺失了整个α2基因，可导致α-珠蛋白表达产物量降低。该基因的分离个体同时携带一--^SEA地贫基因，因此该个体缺失了3个α基因，仅剩下1个α1-珠蛋白基因，基因型符合缺失型HbH病的基因型（--/-α）。经过血红蛋白与红细胞相关参数测定以及对该个体的临床表现调查发现其临床表现及实验室检测结果与缺失型HbH病吻合，表现为轻型HbH病。预测该致病基因（/-α^2.8）为α-地贫2基因。

检测试剂盒，含有可识别缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8的试剂，其特征在于：包括如下步骤：（1）提取待测患者外周血的基因组DNA；（2）以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；（3）对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出扩增产物；（4）对检测出阳性PCR产物进行直接基因测序，对测序结果与参考序列NG_000006.1进行比对，确定断裂位点（NG_000006.1: g.32486-35380 del 2895），PCR反应中的引物序列为：Primer F: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT （SEQ ID NO：2）；Primer R：CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT （SEQ ID NO：3），PCR产物直接测序的引物序列为：SEQ_2R: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT（SEQ ID NO：4）。

<110>  昆明金域医学检验所有限公司

<120>  一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒和检测方法

<130>

<160>  1   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  40163

<212>  DNA

<213>  human

<400>  1

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gtggctttat aagaagagag acctggccgg gcacggtggc tgacacctgt aatcccagca     7080

ctttgtgagg ccgagatggg cggatcacaa ggtcagggga tcgagaccat cctggctaac     7140

acagtgaaac cctgtctcta ctaaaaaaaa aatgcaaaaa aattagccgg gcgtggtggc     7200

gggcacctgt agtcccagct actaggaagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacctggga     7260

ggcggagctt gcagtgagcc gagatcgcgc cactgccctc cagcctgggc gacagagcaa     7320

gactctgtct caaaaaaaaa aagaagagag atctgaggtg gcacacaagc atgctcagcc     7380

cacacgacct gcgattaata ctctgtgcca ctttgggact ctgcacgagt ccccactggg     7440

ctcgaaactt ctcagcctcc gtaactatag gaaataaatt ccttttaaaa taaattccac     7500

agtctcaggt attctattat aagcaacaga aaatggagta ctacaccgat catatcaaat     7560

gtttagaagg atttggagca aggagaatgc tcgcacacca ctagggaaaa cataagttgg     7620

ttaaccactg tgaaaaagtt tggcattctt tactaaagtt gaaaatctat atgccctatg     7680

acccagcaac tttactccta ggtatgtatg tacaaaatag aatttcaggc atgtgggtac     7740

caggtgacat gtaaaggaat gtttattgca gcattattca taatagccaa gaactaaaca     7800

acacaaagtt ccagccccag tacaatgaat aaactgtggt atattcctac aaggaaatat     7860

taatagatac agcaatgaaa atgaacacat ataacatggc tggtaaatct gacatgagag     7920

agtgaaagaa gatggacatt cagtgtgcag acagttggat taaaaatatt tttttaaagg     7980

ccaggcttgg tggctcacat ctataatcct agcacttaca gaggccaagg cgggcagatc     8040

acctgaggtc aggagttcag gaccagcctg gctaacacag tgaaacccca tctctactag     8100

aaaatacaaa aattagccag gtgtggtggt gcatgcctgt agtcccaact actcgggagg     8160

ctgaggcagg agaatcactt gaacctagga ggcggaggtt gcagtgagcc aagatcgcat     8220

cactgtactc catcctgggt gacagagcaa gactgcgtct cgaaaataaa tagataaata     8280

aataaataac caacaggccg ggagcagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag     8340

gctgaggtgg gcagatcacg aggtcaggag atcaagacca tcctggctaa cacagtgaaa     8400

ccctgtctct actgaaaata caaaaaaatt agccgggcat ggtggcgggc gcctgtagtc     8460

ccagctactc aggaggctga ggcaggagaa tggcatgaac ccgggaggtg gagcttgcag     8520

tgagccgaga tcatgccact gcactccagc ctgagcgaca gagcgagact ccatctcaaa     8580

aaaataataa ttaaaaataa ataaattaaa taaataaata acagattgca taaagtggct     8640

catgcctgta atccaagcac tttgggaggc caaggcagaa ggatcacttg agcccaggag     8700

ttcaggacaa gcctgagcaa catggtgaaa ccccacctct acaaaaaaaa aaaaaaaatt     8760

agctgggcat ggtggcatgt gcctgtgatc ccagctactt gggaggctga ggcaggagga     8820

tcacttaagc ctgggaggtc gaggctgcaa tgagctatga tcgtaccact gcactccagc     8880

ctgggcaata gagcaagacc ctgtctcaaa acaaataaac aaaagccaga cagacacaaa     8940

tgagagcatt ctgtatcgtt tcatttctat gaaggtgaaa agcaggcaaa aacaaccaaa     9000

gtgcttgcag atgcatatct gagtagttaa aaacttactg aaaagcaggc ctggctcacg     9060

cctttaatcc cagcactttg ggaagcgggc ggatcacgag gtcaggagat cgagaccatc     9120

ctggctaaca cggtgaaacc ccgtctctac taaaaatata aaaaattagc caggtatggt     9180

ggctagtgcc tgtggtccca gctactcgag aggctgaggc aggagaatgg catgaatccg     9240

ggaggtggag cttgcagtga gctaagatcg tgcaactgca ctccagcctg ggcagcagag     9300

cgagactccc tctcaaaaaa aaaaaaactt actgaaaagc aagaagtcag gtggaggtta     9360

cctttgggga ggattggggt gctgtccgct ttctaataat tcgttaaact atagtctaca     9420

tcttgtgcta tatttcacaa tggaaaaaca gaaaagagct cctgcccata acgctgcttt     9480

gcaggtttgg aaatttcaga ttcaattcct ctccttgcgg gggccaagga tgggaagagc     9540

aggtggttcc agtagggaaa gaggaggccc tggggcctca aaatggctaa ggaccattcc     9600

tcagcgtggg tggcacctac cctggaaaca ggactctact tcctcctctg ttagggggca     9660

gagcagccct gcagtgcctt ctgggcacag gtcctcactc tgcagctgga ggaattctcc     9720

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tccctgctct gtatatctcc ctccgcctga ccctcagcct cctccatcac tcactgtctt     9840

ctctgccagt ctattcatct gtctctgtcc ctctctctgc caccttctct cctattgaga     9900

agccgaaacc tcaggcacag acccacatcc cctcctcatg ggcccatgtg cccaaggtgc     9960

ccctaggtgc caggctgaga tgaaccagga gtgtccttct gaacccagca acagcgaagg    10020

gtgaccaggg agggccagtt catctcggtc tgaaagaagc cccagatgag caaaggatac    10080

actggcctcc tgcggtcagc agcacttccc aggacagtga gcaagacagg ggtaaggcca    10140

gagtgggtgg gcacacccat gggagagagg agccgctgtg aaatgtgcac gaggaacaga    10200

ccagcaagga ggatccacgc agtgctagaa gggagttcct ggaagcctgg tggagagccc    10260

ctcccatctg ctaagcccgg agggcatcaa aggctgctgc tgccctcaac ccctgacaat    10320

ctcatcatct catatctcag gcatggaaga atgagggcca ttacacgagt aaaacatcaa    10380

gtacactcca gcctggatga cagggccagg ctccatctca aaaaaaaatg cctgtggtca    10440

aagctctcct gacaggggaa aacaaaacaa aacaaacttc tccttaaaga aaacatttgc    10500

ctttgactgc atcataattc cagcaggatt ttgtgcagat aactctttgg ctaactctaa    10560

aattaataca gaaaggtaaa gaaattagaa tagccaaaga aattttgaaa aggaagaata    10620

aagcgagagg aatcacattc ctcaattttt aacagctcta ttgagataaa attcacatac    10680

catacggttc acccatttaa agtgtataat tcaggccggg cgcggtggct cacgcctgta    10740

atcccagcac tttgggaggc tgaagcgggc agatcacctg aggtcgggaa ttcgagacca    10800

gtctgaccaa catggagaaa ccccgtctct actaaaaata caaaattagc caggcgtggt    10860

ggctcatgcc tgtactccca gctactcgga agactgaggc aagagaattg cttgaacccg    10920

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tgattacttg tctatttatt actgagttgt aagatatttt gggccaagca cggtggctaa    11040

cgcctgtaat cccagcactt taggaggcta tggtgggcaa atcacttgag gtcaggagtt    11100

cgagaccagg ctggccaaca tggcaaaaca ccatctctac taaaaataca aaaaaattag    11160

ccaggtgtgg ccaggcgtgg tgactcacgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccaagg    11220

cgggtggatc acctgaggtc gggggctcaa gaccagcctg accaacatgg agaaaccccg    11280

actccgctaa aaatacaaaa ttagccgggt gtggtggtgc atgcctgtaa tcccagctac    11340

tcacgaagct gaggcaggag aatggcttga gcccaggagg cagaggttgt ggtgagctga    11400

gatcatgcca ttgtactcca gcctgggcga caagagcgaa attctgtcac aaaaaaaaaa    11460

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tatgagaatt gcttgaaccc aggaggcaga ggttgcagcg agccaggatt acgccgctgc    11580

actccagtct gggtgacaga gcaagactct gtctaaaaaa aaaacaaaaa caaaaaagat    11640

attttgtatg tgtttggata acttccctat cagatatatg atttgcaaat atgtttctct    11700

cattctgtga gacatcattc aattttaaga catcacagag ctatgttaat caaggcactg    11760

tggctgtggt aaaggataga cacacagaac agaacagaga gcccagaaat ggacccgcaa    11820

acctatgccc cattcatttt ttacaaataa gtgcgagaag ccaactgaat agaaagcgta    11880

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ttgtagatct caatataaac ataaactata caactttaga agaaaatata ggtgaaactc    12060

tttgtgttct gtggttaggc agacagttcc taggcatggc actaagtaag attcatttaa    12120

aattttttga caaattggac tttattaaaa cttttgctct acaaaagaca atattaagag    12180

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atttttaaat gggcaaaaca ggccaggcgt ggtggtgcac gcctgtaatc ctagcacttt    12360

gggaggccga ggcaggcgga tcacaaggtc aggagattga gaccatccta gctaacacgg    12420

tgaaaccctg tctctactaa aaatacaaaa aattagccag gcatggtggc aggtgcctgt    12480

agtcccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatggcgt gaacctggga ggcggagctt    12540

gcagtgagtg gagatcgcac cactgcgctc cagcctgggc aacagagcga gactccgtct    12600

caaaaaaaag acaaaatact tgaaaagata ttggctaggc gcgctggctc atgcctgtaa    12660

tcccagcact ttgggaggcc aaggcgggtg gatcacaagg tcaggagttc aagcagcctg    12720

gccaagatgg tgaaaccccg tctctactaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaattgg    12780

ccgggcacag tggctcatgc ctgtaatccc agcactttgg gaggctgagg caggtggatc    12840

aggagtcagg agatcgagac catcctggcc aacatggtga aaccccatct ctatgaaaat    12900

acaaaaatta gccagagatg atgccgggtg cctgtaatcc cagctactca tgaggctgag    12960

gcagaagaat cacttgaacc agggagtcag aggttgcagt gagctgagat cgcaccactg    13020

cactccaccc tgggcgacaa atcgagattc catctcaaaa aaagaaaaaa aaattaaaag    13080

gaatatttgc ctcattatgt tacaataact aatatggaaa gcaatattgc aatgcctatt    13140

agcacatgac attaggtgaa ttctcctttg tccccggacc tgctgcctcc tcctgcttgt    13200

caggggacag atccagtaca tctcccctca gcgctgggtg gacctaaccc ttgctttctt    13260

ggaggaaacc caggaatcca gagacaaagt ggaagggtac tggcatgtgg ttgggcaggg    13320

ctgcctgagg tcggtgtcag ccgaccgtgg ggcttggtcc caggaggctg cttactgggc    13380

cctgctcctc tggtttcccc caagtcgtga ttctgaaatg aataaggacg gtgcagaact    13440

ggactacaaa tgcaggagtg acttcctggg agggtggggc ccctatctct cctagactct    13500

gtggtcagac tctggccaac accccctgta aggccacagg agaggaacag gagtgatagc    13560

ccccaaaccc cagtcccacc aggccctgag ggcccctttg tcactggatc tgataagaaa    13620

caccacccct gcagccccct cccctcacct gaccaatggc cacagcctgg ctgggcccag    13680

ctccctgtat ataaggggac cctgggggct gagcactacc aaggccagtc ctgagcaggc    13740

ccaactccag tgcagctgcc caccctgccg ccatgtctct gaccaagact gagaggacca    13800

tcattgtgtc catgtgggcc aagatctcca cgcaggccga caccatcggc accgagactc    13860

tggagaggtg agtgtcagac gggactgcca gagggactgg gtgggaggcc aggtatgtga    13920

gtggggacag tggggagggg gcggtgggga ggggacagtg gggaggggac catggagagg    13980

agacagtggg gagggcactg tggggagagg acagtgagga ggggaccttg gggaggggac    14040

agtgaggagg gaaccgtgga gaggggacag tgaggaaggg acagtgagga cagatagcgt    14100

tccctctcag tgaggagagc agggtaagga gggaacgatt aggagttgca caaccatctg    14160

ggctcgctga gacctgggca ggcacaggcc caggttctga caagcagagg gtgaaaggtt    14220

tcgttctagg cctgaagggc cttacagggc agccagggca ctacagcctc taaagtccca    14280

gcatctggga tcagggcact gtcccagctt caaattccca gcatctgatc ccctgggagg    14340

ggccagggag cttttccttc cctggaacgc tgctgggagg tcatgagcct gcagaagggg    14400

tggcgggcaa cccagtctgg ggctgggagg gaggtcctgt ggccagagga gacggtggag    14460

gggctggggg caccaggcgt gctggaggcg gagggcggga gatttgggga ccaggctgca    14520

cagaacccgt cggaagcagg gcgatcagcc gggagctgca gaggcctggg gggcctctag    14580

cccagggcag cctgggaggg gcagctgcct gggcacccgg gccccgcgag gaggggctgg    14640

ggcctgctgc ggggtcgcag atgtgtcccg gtgctcggag agggccgcag ggcgcgtggg    14700

ccgtggcggg aggccgcgct gctgggagct cacggccccc gccccccgtc ccaggctctt    14760

cctcagccac ccgcagacca agacctactt cccgcacttc gacctgcacc cggggtccgc    14820

gcagttgcgc gcgcacggct ccaaggtggt ggccgccgtg ggcgacgcgg tgaagagcat    14880

cgacgacatc ggcggcgccc tgtccaagct gagcgagctg cacgcctaca tcctgcgcgt    14940

ggacccggtc aacttcaagg tgcgcggggc gcggtgcggg cggggcggga cggggcgggg    15000

cgcggtgcgg gcggggcggg gcggggcggg gcggggaggg gcggggaggg gcggggtcgc    15060

ggggcggatg cgggggtcgc cgggcggggc ccgggctagg ccccgccccc tcactgagcc    15120

gcccccgccc ccagctcctg tcccactgcc tgctggtcac cctggccgcg cgcttccccg    15180

ccgacttcac ggccgaggcc cacgccgcct gggacaagtt cctatcggtc gtatcctctg    15240

tcctgaccga gaagtaccgc tgagcgccgc ctccgggacc cccaggacag gctgcggccc    15300

ctcccccgtc ctggaggttc cccagcccca cttaccgcgt aatgcgccaa taaaccaatg    15360

aacgaagcag cgtccacctg gtctctgttg tccgtgggcg gcgggcgctt ggggaggcgg    15420

agcgggagga gggcgccccg gctgtctcgg ggccactgct gggccgcagg gatccttgca    15480

ccgaccccag ggtctctaag aggcagaggg atgtgcagct cccggggcgg gagcgggggt    15540

cactcgggac ccaggcgtgg tggagaaggg gtgcagttag gcctttgcgg aggggggagc    15600

agtgctggcg cccacccgcc gcggctctcc ctgggacctc cgtggtcttc cttctttatt    15660

tctcccgaat gtgtactatt tcctgatttc agaacgatca ggacgaagag gggagggatg    15720

ggcgtctgcg ctcactcatt ccttcttcca ttcctcaatg aaacatttac tgggcataag    15780

acagcctagg catgtttcta ggctatggat accgcagctg aaataaagaa agccctctgc    15840

cccgtggggc tgacaatcta gtgggggata cagacgtgat gaagacagtc agatcacagt    15900

tcacagaaat gagacaggaa aagaggctga gcctcactca taagagaaac gcaagttaaa    15960

ctacacaaaa ataaaaaacc tcactgagat ccatgtctca cctccctgat aggcaaaaat    16020

ccaagagttt gatcagactg caggcgcccc tcctccactg ggcacccctc atccagggca    16080

gagggaacca gcccggggcg caagtccacc ggggcatctc atttgctaaa gacctgaaaa    16140

cccaggtgtc catcatcagg actaactgga aaaaccaagg gtatccgcac catggagagc    16200

tcgactgaaa aaaaaaaatg aggataattg gataatttct tttttttttt tttttttttt    16260

cagacggagt ctcgctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggtgcgatcc cggctcactg    16320

caagctccgc ctcctggttt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggtc    16380

tacaggcgcc cgccaccacg gctggctaat tttttgtatt tttagtagag acggggtttc    16440

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caaagtgctg ggattacagg tgtgagccac cgcgcccgac ctaaaatgag gataatttct    16560

aataatgaaa ataaagaggt tagaatggtg tgtatacaat ggtggaacag aggagaaaca    16620

cgaatatgtg tgtgcacata tatgtgagct tatgcataac tatgtatgag gctgcgtgtg    16680

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taaatatttt acattatcaa aaataaattc aggctgggca tggtggctca tacctgtagt    16920

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ctggccaaca tagagagacc ctgtctttaa aaaaaattac aaaattaagg ccgggcgcgg    17040

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ctttataccc acttttcatt atatgcaaat taagggaaag ttatgcacaa atttctagga    17760

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gcaggagaat tgcttgaacc caggagacag aggttgcagt gagccgagat tgtgccactg    19080

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gtacacatta agtgggtgaa ttttatctca ataaaactgt taaataaaat aacaagaata    19200

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aatatccgta ctctaaatat cctccatata ctgtgtattt cctaaaatca acaaggacat    19380

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atcaacagaa gcaacatcaa gttcaagacc cttttgaaag caatgatacc agccatttac    19500

tccatcccta aaggactgag ggtgctgcga atttaaccgt atcaatgcag tctttttgat    19560

gttatttact gaaggaaatg gatgttcttt aaaatatgta tttatttatt tttctttttt    19620

gagacggaat cttgttctgt cgcccaggct ggagggcagt gggacaatct tggttcactg    19680

caacctctgc ctcctgggtt caagaggttc tcctgcctca gcctcccgag tagctgggat    19740

tacaggcgcg aaccaccacg cccggttaat tttggtattt ttagtagagg cggggtttta    19800

ccatgttggc caggctggtc tcaaactcct gacatggtag cctgtaatcc cagctactcg    19860

ggaggctgag gcaggagaat cgcttgaacc caggaggtgg ggttgcagtg agccaagatc    19920

gtgccattgc actccagcct gggagacaga gcgagactcc atcaaaaaaa aaaaaaaaaa    19980

aaattcctga agctcctctt gagcttacat tctagtggac tgtaaacaga aacatttttt    20040

tttcctgtgg ataaagaaaa gcagggcaag taggggctta gacagaggag gggaggattc    20100

agattttaaa tgggttggcc actgtaggtc tattaacgtg gtgacatttg agggagtggc    20160

aatactaggg aaggggcttc aggggagtgg ccaggagcta gggatagagg gagggaggac    20220

aggaggcctt gtctgtcttt tcctccatat gtaagtttca ggagtgagtg gggggtgtcg    20280

agggtgctgt gctctccggc ctgagcctca ggaaggaagg gcagtagtca gggatgccag    20340

ggaaggacag tggagtaggc tttgtgggga acttcacggt tccattgttg agatgatttg    20400

ctggagacac acagatgagg acatcaaata catccctgga tcaggccctg gggcctgagt    20460

ccggaagaga ggtctgtatg gacacaccca tcaatgggag caccaggaca cagatggagg    20520

ctaatgtcat gttgtagaca ggatgggtgc tgagctgcca cacccacatt attagaaaat    20580

aacagcacag gcttggggtg gaggcgggac acaagactag ccagaaggag aaagaaaggt    20640

gaaaagctgt tggtgcaagg aagctcttgg tatttccaat ggcttgggca caggctgtga    20700

gggtgcctgg gacggcttgt ggggcacagg ctgcaagagg tgcccaggac ggcttgtggg    20760

gcacaggttg tgagaggtgc cctggacggc ttgtggggca caggctgtga gaggtgccca    20820

ggacggcttg tggggcacag gctgtgaggg tgcccgggac ggcttgtggg gcacaggttg    20880

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ggggcacagg ttgtgagagg tgcccgggac ggcttgtggg acacaggttg tgagaggtgc    21000

ctgggacggc ttgtggggca caggctgtga gggtgcctgg gacggcttgt ggggcacagg    21060

ttgtgagagg tgcccgggtc ggcttgtggg gcacaggttg tgagaggtgc ccgggacggc    21120

ttgtggggca caggttgtga gacgtgcccg ggacggcttg tggggcacag gctgtgaggg    21180

tgcccgggtc ggcttgtggg gcacaggctg caagaggtgc ccgggacggc ttgtggggca    21240

caggctgtga gggtgcccgg gacggcttgt ggggcacagg ctgtgagggt gcccgggaca    21300

gctcgtgggg cacaggttgt gagaggtgcc cgggacggct tgtggggcac aggctgtgag    21360

ggtgcctggg acggcttgtg gggcacaggt tgtgagaggt gcccgggacg gcttgtgggg    21420

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acggcttgtg gggcacaggc tgtgagggtg cccgggacgg cttgtggggc acaggctgtg    21540

agaggtgcct gggacggctt gtggggcaca ggctgtgagg atgcccggga cggcttgtgg    21600

ggcacaggtt gtgaggggtg cccaggacgg cttgtggggc acaggctgca agaggtgccc    21660

aggacggctt gtggggcaca ggttgtgaga ggtgcccggg acggcttgtg gggcacaggc    21720

tgtgagggag cccggcacgg cttgcagcta cagggagaaa agacttggtg ctgtgggcct    21780

gccttggggc tggtggtaca gcccttatct gctgccctca ggatctcccg gcccctctcg    21840

tccaggcccc tgcaacccca tgccccagcc tctgaggacc aaaggcgccc ctgcttggga    21900

agagggggct caggggagtc gcctgacccg gttccaagcc aggctgattt accgttgcta    21960

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cctgtgggat tccctcacct ctgcagcctg cggtctgaaa gctgccccat ggtgtgtagt    22200

gctaaacttc caacttactc caggccagcg gtgacagccc gagggcagga agggcaccca    22260

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tgtcagcggg gatgggggca cgcttgctga cgcagcaacg gaaaagcatc agtgtgtgaa    22560

gatgcatttt ctctctttct attattatta tttttatttt tattttttct gaggcagaac    22620

ctcgctctgt cacccaggct ggagtgcagt gatgcgacct catcacaacc acgagccacc    22680

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cctctattta aaaaagatgt gcatgggccg ggcacggtgg ttcacgctca taatcccagc    22800

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tgcctgtaat cccagctact caggagactg aagcaggaga atcacttgaa cccaggaggc    22980

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attcagcaca tagaaatggt tgtctaacgg aggagggggg agttaataaa cagagaggat    23220

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ggggacaatg gagaggggac agtgaggagg ggactgtggg gagaggacag tgaggagggg    24600

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tggggagggg acagtggaga cagatagcct tccctctcag tgaggagggc agggtaagga    24720

gggaacgatt aggagttgca caaccatctg ggctcgctga gacctgggca ggcacaggcc    24780

caggttctga caagcagagg gtgaaaggtt tcgttctagg cctgaagggc cttacagggc    24840

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caaattccca gcatctgatc ccctgggagg ggccagggag cttttccttc cctggaacgc    24960

tgctgggagg tcatgagcct gcagaagggg tggcgggcaa cccagtctgg ggctgggagg    25020

gaggtcctgt ggccagagga gacggtggag gggctggggg caccaggcgt gctggaggcg    25080

gagggcggga gatttgggga ccaggctgca cagaacccgt cggaagcagg gcgatcagcc    25140

gggagctgca gaggcctggg gggcctctag cccagggcag cctgggaggg gcagctgcct    25200

gggcacccgg gccccgcgag gaggggctgg ggcctgctgc ggggtcgcag atgtgtcccg    25260

gtgctcggag agggccgcag ggcgcgtggg ccgtggcggg aggccgcgct gctgggagct    25320

cacggccccc gccccccgtc ccaggctctt cctcagccac ccgcagacca agacctactt    25380

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ggccgccgtg ggcgacgcgg tgaagagcat cgacgacatc ggcggcgccc tgtccaagct    25500

gagcgagctg cacgcctaca tcctgcgcgt ggacccggtc aacttcaagg tgcgcggggc    25560

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cggggcgcgg ggcggggcgg ggcggggtgg ggtcgcgggg cggggcccgg gctaggcccc    25860

gcccccgcac tgagccgccc ccgcccccag ctcctgtccc actgcctgct ggtcaccctg    25920

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tcggtcgtat cctctgtcct gaccgagaag taccgctgag cgccgcctcc gggaccccca    26040

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taaatggatg aggacggagc gatctgggct ctgtgttctc agtattggag ggaaggaggg    26160

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cggcctgggg ttcacttggg gggcgccttg gggaggttct agcccctgag caccggagct    26280

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gtcggacggg cgtttgtgcg tctcccggct tcccatatcg cacaaagatt gtcacttcac    26400

taagcgtatt ggaagcgtgt cggggctcag ggaacttttc cacaaagcct gacgtccgaa    26460

tcccgggact ctggcagcta cgggggtccc tgaggccggt ccctccccga ctcctaagag    26520

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agagcagtaa ctttacccga ggggagtaaa cagatgcccc taaagtctgc agtaaaggtg    26640

cccacgcgca acggcgtggg tcaatgccag aaaccctggg atcccggagg tcgaggcctc    26700

cacacagacg ggaacccggg ctggttacgt tccccggcgc aggccgaggg tccccgcgtt    26760

cccgccgcgc tcgggccgat aaggacgggc ggggtgcccg gaggctctat aaggaggcca    26820

gggcggcggg cgcggccccc agagcacgtc aggcggcgcc atgctcagcg cccaggagcg    26880

cgcccaaatc gcgcaggtct gggacctgat tgcgggccac gaggcgcaat tcggggcgga    26940

gctgctgctc aggtcggtag aggcggggtc tccgggagct cagggaggtg gagatgaggg    27000

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ggtcctgcag gctcttcacg gtgtacccca gcaccaaggt ctacttcccg cacctgagcg    27180

cctgccagga cgcgacgcag ctgctgagcc acgggcagcg catgctggcg gctgtgggcg    27240

cggcggtgca gcacgtggac aacctgcgcg ccgcgctgag cccgctggcg gacctgcacg    27300

cgctcgtgct gcgcgtggac ccagccaact ttccggtgag gcctttccgg ccggggcaat    27360

ggtgcagcgc gcagccgggg tgggggggct ctgggggtcc ctagcggggc agaccccgtc    27420

tcaccggccc cttctcctgc agctgctaat ccagtgtttc cacgtcgtgc tggcctccca    27480

cctgcaggac gagttcaccg tgcaaatgca agcggcgtgg gacaagttcc tgactggtgt    27540

ggccgtggtg ctgaccgaaa aataccgctg agccctgtgc tgcgcaggcc ttggtctgtg    27600

cctgtcaata aacagaggcc cgaaccatct gcccctgcct gtgtggtctt tggggagcta    27660

gcaaagcgag gtcactattg ttggccagtg aagctcaggg acctaaaagg agcctcctag    27720

aactctcaaa tgcgccccac ccccggaggt ttgtcctccc atggcgagga gtgcgatggg    27780

gcagagggag cactgtgatg tggcgggggt agggagggtg gccttcgact tcaacccttg    27840

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cagagagatg cagaaactga ggtcccagag ccaaatgtgc aacctaattc gttggcccag    28020

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tcgggaggaa gtcctcagtg gccacaattt ggcagacaga gcaggtttag tcttccagcc    28200

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gtctcaatct ctgcaggtgc ccaggccaag gcactccctt ccccaggttc cctcttctcc    28440

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ttttgggggt tttttttttt tttgctttgt ttttgttttt gagataggcc cttgctctga    28860

caccccggct ggagtgcagt ggcacagttt tggctcactg cagcctcaac ctcctgggtt    28920

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gcaacaagag caaaactccg tctcaaaaaa taaataaata aataaataaa taaactaaaa    31680

tctatccatg ctttcacaca cacacacaca cacacacaca cacacccttt tttgtgttac    31740

ttaaagtagg agagtgtctc tctttcctgt ctcctcacac ccacccccag aagagaccaa    31800

aatgaagggt ttggaactca gcccatgggc cccatcccat gctgagggaa cacagctaca    31860

tctacaacta ctgccacagg ctctcttttt ggacaaaaat accatcatac tgtagatacc    31920

tgtgtacaac ttcctattct cagtgaagtg tctcccctgc atccctttca gccagttcat    31980

tcagctctgc gccattccac agtctcactg attattacta tgtttccatc atgatccccc    32040

caaaaaatca tgactttatt tttttatttt tattattatt attttttttt ttttttttgt    32100

gacggagtct cgctctgtca cccaggctgg agtgcagtgg cacaatctcg gctcactgca    32160

agctccacct cgcaggttca cgccattctc ctccctcagc ctcccgagta gctgagtagc    32220

tgggactaca ggcgcccccc actacgcctg gctaattttt tctattttta atagagacag    32280

agtttcactg cattagcgag gatggtctcg atctcctgac ctcgcatctg cccgcctcag    32340

cctcccaatg tgctgggatt acaggcgtga gccaccgcgc ccggccttat gtatttattt    32400

ttttgagaca gagtctcgct gtgtcgtcag gctagagtgc tgtggcacga tctcggctca    32460

ctgcaacctc caactccctg gttcatgagc agcacttcca acccagtccc tgccccacag    32520

caagcctccc cctccacact cacagtactg gattgagctt tggggagggt ggagaggacc    32580

ctgtcactgc tttccttctg gacatggacc tctctgaatt gttggggagt tccctcccct    32640

ctccaccacc cgctcttcct gcgcctcaca gcccagagca ttgttatttc agcagaaaca    32700

ctttaaaaaa taaactaaaa tccgacaggc acggtggctc acgcctgtaa tcccagcact    32760

ttgggaggcc gaggtgggag gatcacctga ggtcgggagt ttgagaccac cctgatcaac    32820

atgtagaaac cccatctata ctaaaaatac aaaatcagcc gggcatggtg gcccatgcct    32880

gtaaacccac ctactccgga ggctgaggca ggagaatcat tttaaccaag gaggcagagg    32940

ttgcagtgag ctaagatcac accattgcac tccagcctgg aaaacaacag cgaaactccg    33000

cctcaaaaaa aaaaaagccc ccacatctta tctttttttt ttccttcagg ctgtgggcag    33060

agtcagaaga gggtggcaga cagggagggg aaatgagaag atccaacggg ggaagcattg    33120

ctaagctggt cggagctact tccttctctg cccaaggcag cttaccctgg cttgctcctg    33180

gacacccagg gcagggcctg agtaagggcc tggggagaca gggcagggag caggctgaag    33240

ggtgctgacc tgatgcactc ctcaaagcaa gatcttctgc cagaccccca ggaaatgact    33300

tatcagtgat ttctcaggct gttttctcct cagtaccatc cccccaaaaa acatcacttt    33360

tcatgcacag ggatgcaccc actggcactc ctgcacctcc cacccttccc cagaagtcca    33420

ccccttcctt cctcaccctg caggagctgg ccagcctcat caccccaaca tctccccacc    33480

tccattctcc aaccacaggg cccttgtctc ctctgtcctt tcccctcccc gagccaagcc    33540

tcctccctcc tccacctcct ccacctaata catatcctta agtctcacct cctccaggaa    33600

gccctcagac taaccctggt caccttgaat gcctcgtcca cacctccaga cttcctcagg    33660

gcctgtgatg aggtctgcac ctctgtgtgt acttgtgtga tggttagagg actgcctacc    33720

tcccagagga ggttgaatgc tccagccggt tccagctatt gctttgttta cctgtttaac    33780

cagtatttac ctagcaagtc ttccatcaga tagcatttgg agagctgggg gtgtcacagt    33840

gaaccacgac ctctaggcca gtgggagagt cagtcacaca aactgtgagt ccatgacttg    33900

gggcttagcc agcacccacc accccacgcg ccaccccaca accccgggta gaggagtctg    33960

aatctggagc cgcccccagc ccagccccgt gctttttgcg tcctggtgtt tattccttcc    34020

cggtgcctgt cactcaagca cactagtgac tatcgccaga gggaaaggga gctgcaggaa    34080

gcgaggctgg agagcaggag gggctctgcg cagaaattct tttgagttcc tatgggccag    34140

ggcgtccggg tgcgcgcatt cctctccgcc ccaggattgg gcgaagcctc ccggctcgca    34200

ctcgctcgcc cgtgtgttcc ccgatcccgc tggagtcgat gcgcgtccag cgcgtgccag    34260

gccggggcgg gggtgcgggc tgactttctc cctcgctagg gacgctccgg cgcccgaaag    34320

gaaagggtgg cgctgcgctc cggggtgcac gagccgacag cgcccgaccc caacgggccg    34380

gccccgccag cgccgctacc gccctgcccc cgggcgagcg ggatgggcgg gagtggagtg    34440

gcgggtggag ggtggagacg tcctggcccc cgccccgcgt gcacccccag gggaggccga    34500

gcccgccgcc cggccccgcg caggccccgc ccgggactcc cctgcggtcc aggccgcgcc    34560

ccgggctccg cgccagccaa tgagcgccgc ccggccgggc gtgcccccgc gccccaagca    34620

taaaccctgg cgcgctcgcg gcccggcact cttctggtcc ccacagactc agagagaacc    34680

caccatggtg ctgtctcctg ccgacaagac caacgtcaag gccgcctggg gtaaggtcgg    34740

cgcgcacgct ggcgagtatg gtgcggaggc cctggagagg tgaggctccc tcccctgctc    34800

cgacccgggc tcctcgcccg cccggaccca caggccaccc tcaaccgtcc tggccccgga    34860

cccaaacccc acccctcact ctgcttctcc ccgcaggatg ttcctgtcct tccccaccac    34920

caagacctac ttcccgcact tcgacctgag ccacggctct gcccaggtta agggccacgg    34980

caagaaggtg gccgacgcgc tgaccaacgc cgtggcgcac gtggacgaca tgcccaacgc    35040

gctgtccgcc ctgagcgacc tgcacgcgca caagcttcgg gtggacccgg tcaacttcaa    35100

ggtgagcggc gggccgggag cgatctgggt cgaggggcga gatggcgcct tcctcgcagg    35160

gcagaggatc acgcgggttg cgggaggtgt agcgcaggcg gcggctgcgg gcctgggccc    35220

tcggccccac tgaccctctt ctctgcacag ctcctaagcc actgcctgct ggtgaccctg    35280

gccgcccacc tccccgccga gttcacccct gcggtgcacg cctccctgga caagttcctg    35340

gcttctgtga gcaccgtgct gacctccaaa taccgttaag ctggagcctc ggtggccatg    35400

cttcttgccc cttgggcctc cccccagccc ctcctcccct tcctgcaccc gtacccccgt    35460

ggtctttgaa taaagtctga gtgggcggca gcctgtgtgt gcctgagttt tttccctcag    35520

caaacgtgcc aggcatgggc gtggacagca gctgggacac acatggctag aacctctctg    35580

cagctggata gggtaggaaa aggcaggggc gggaggaggg gatggaggag ggaaagtgga    35640

gccaccgcga agtccagctg gaaaaacgct ggaccctaga gtgctttgag gatgcatttg    35700

ctctttcccg agttttattc ccagactttt cagattcaat gcaggtttgc tgaaataatg    35760

aatttatcca tctttacgtt tctgggcact cttgtgccaa gaactggctg gctttctgcc    35820

tgggacgtca ctggtttccc agaggtcctc ccacatatgg gtggtgggta ggtcagagaa    35880

gtcccactcc agcatggctg cattgatccc ccatcgttcc cactagtctc cgtaaaacct    35940

cccagataca ggcacagtct agatgaaatc aggggtgcgg ggtgcaactg caggccccag    36000

gcaattcaat aggggctcta ctttcacccc caggtcaccc cagaatgctc acacaccaga    36060

cactgacgcc ctggggctgt caagatcagg cgtttgtctc tgggcccagc tcagggccca    36120

gctcagcacc cactcagctc ccctgaggct ggggagcctg tcccattgcg actggagagg    36180

agagcggggc cacagaggcc tggctagaag gtcccttctc cctggtgtgt gttttctctc    36240

tgctgagcag gcttgcagtg cctggggtat cagagggagg gttcccggag ctggtagcca    36300

taaagccctg gccctcaact gataggaata tcttttattc cctgagccca tgaatcaccc    36360

ttggtaaaca cctatggcag gccctctgcc tgcgtttgtg atgtccttcc cgcagcctgt    36420

gggtacagta tcaactgtca ggaagacggt gtcttcgtta tttcatcagg aagaatggag    36480

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ctttttacaa ttaattgatc agaaccagtt ataaatttat catttccttc tccactcctg    36600

ctgcttcagt tgactaagcc taagaaaaaa ttataaaaat tggccgggcg cggtggctca    36660

cacctgtaat tgcagcactt tgccaggctt aggcaggtgg atcacctgaa gtcaggggtt    36720

cgagaccagc ctagccaaca tagtgaaacc ctgtctctac taaaaagaca aaaattgtcc    36780

aggtgtgatg actcatgcct gtaaacctgg cactttggga ggcggaggtt gtagtgagtc    36840

aagatcgcgc catcgcactc cagcttgggc aacaagagcg aaactctgtc tcaaaaaaaa    36900

atttaatcta atttaattta atttaaaaat tagcacggtg gttgggcaca gtggctcacg    36960

cctgtaatcc cagcactttg ggaagccaag gtgggcagat cacaaggtca ggaattcgag    37020

accagcctgg ccaatatggg gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa attagccggg    37080

tgtggtggcg cacgcctgta atcccagcta ctcgggaggt tgaggtagga gaatcacttg    37140

aacccaggag gcagaggttg cagtgacccg agatcacacc attgcactct agcctgggca    37200

acaagagcaa aactccatct caaaaaaaat tataaaaatt atacatcagt agatgaatgg    37260

gtaaacaaaa tgtggtggtc tatacacaca atggaatatt atttggccac aaaaagaaat    37320

gaagcactga taggatgtag ctgcaccctg aaaatatttg acaagtaaaa gaagccggac    37380

accaaaggtc acaaactgca tgaccccatc tatatgcaat atccgctaca gccaaatcca    37440

tagggaccaa aagcggatta gtggctgccg gggccagagt tactgttaat gagtaccgag    37500

gtggcgtttg ggatgatgaa aaagttctga cctagatagt ggtgatggct gcataacact    37560

aagtgttctt aatatcacca aattttatac ctgaaaaatg gctacaatgg taatttatgt    37620

ctattttatc acctttttta aaacaaaaaa gatataaggg gtacagcaga gtgagtgctg    37680

catatgcatt tactattatt cttgggttac atcccaggta ctcaataaat gttcactgcc    37740

ctgaagaaac acctgctacg agtcaggcac ctcacagttg ttatccgttt aattctcaca    37800

atctgagaag aaactgtcac cctcatttta tataataaat gagaaaacag actcgggcaa    37860

gtgtcacaat agaatcaaga ggcagaataa actgacttcc aatgccaaat ccatgccgaa    37920

attcagtgct ataataatgt acatggccgg gcgcggtggt tcacgcctgt aatcccagaa    37980

ctttgggagg ctgaggcggg aggatcacct gaggtcggga gtttgagatc agcctaacac    38040

ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aattggcatg gtggcatgca cctgtgatcc    38100

cagttactcg ggaggctgag gcaggagaat cgtttgaacc cgggaggcgg aggttgcagt    38160

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ggcgtctaca cgacagaggc cctggaaagg tgcggcaggc tgggcgcccc cgcccccagg    38580

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ctggctttcc ccgccacgaa gacctacttc tcccacctgg acctgagccc cggctcctca    38700

caagtcagag cccacggcca gaaggtggcg gacgcgctga gcctcgccgt ggagcgcctg    38760

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gacccggcca gcttccaggt gagcggctgc cgtgctgggc ccctgtcccc gggagggccc    38880

cggcggggtg ggtgcggggg gcgtgcgggg cgggtgcagg cgagtgagcc ttgagcgctc    38940

gccgcagctc ctgggccact gcctgctggt aaccctcgcc cggcactacc ccggagactt    39000

cagccccgcg ctgcaggcgt cgctggacaa gttcctgagc cacgttatct cggcgctggt    39060

ttccgagtac cgctgaactg tgggtgggtg gccgcgggat ccccaggcga ccttccccgt    39120

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cccagatcca ggcgcgcctc tttccacctc cagcaggttt ggggcctcgg ccatgggggc    39300

accgaactgc gtgcagcctg accctcccga atggggtggt aggtgagggc cgcgggacgc    39360

cccgggcggc gggctgcgag gacggccgac tctgcccatc ccgagggcgg ctggcttcgc    39420

cctccccact ctgcgccgag cacgcggccc ggacccaccg cgagaactcc gcacctgcag    39480

cgtgaacgca cgcgggcggc gttaagggcc cggggctgac tcggagcagg ttagggaaca    39540

gcgccccctc ccggcgcgag ccggtacctg cgcagcaccc agccgccgcg gctgtggcct    39600

ggaatcgggg acctggggtg ccggggggtt gtggtgaagg aggtgggacc agccccagca    39660

cctagccacg tagctggcga ggtggaccag gaaccgaccc agacccctgc cgtcacccga    39720

catcactacg gagagtgaag cttttttata tttgtccaca taaaaccaat catggtcatt    39780

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gtgcagcaca tccttcagct gccgcttgac acgcggcaaa ctgtgtcatg tgtaaacaag    39900

aacaggacat ggctgtcata tccaagagca catgtgtaac acagacatgc cacacacaca    39960

cacacacaca cacggggtag aggcaggcct catccacacc cctaacattt gatgcgtagc    40020

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gacactgagg aaaagtggac aggccgggcg cggtggctca cgcctgtaat cccagcactc    40140

cgggaggccg aggcgggcgg atc                                            40163

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  2

ggacctcctg gtgcttctgc ttcct                                             25

 

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  3

ctccctgtct gccaccctct tct                                               23

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  4

gggccaccat gcccggctga tt                                                22

Claims (5)

1.缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种检测试剂盒，含有可识别权利要求1所述基因的试剂。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒含有可特异性识别权利要求1所述基因或其产物的试剂。

4.权利要求1缺失型α地中海贫血-2基因-α^2.8的检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待测患者外周血的基因组DNA；

（2）以基因组DNA为模板进行PCR，得到PCR产物；

（3）对PCR产物作琼脂糖凝胶电泳分析检测出扩增产物；

（4）对检测出阳性PCR产物进行直接基因测序，对测序结果与参考序列NG_000006.1进行比对，确定断裂位点（NG_000006.1: g.32486-35380 del 2895）。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：PCR反应中的引物序列为：Primer F: GGACCTCCTGGTGCTTCTGCTTCCT （SEQ ID NO：2）；Primer R：CTCCCTGTCTGCCACCCTCTTCT （SEQ ID NO：3），PCR产物直接测序的引物序列为：SEQ_2R: GGGCCACCATGCCCGGCTGATT（SEQ ID NO：4）。

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