CN113846150A

CN113846150A - 核酸分子及其应用

Info

Publication number: CN113846150A
Application number: CN202010598916.7A
Authority: CN
Inventors: 尹珍珍; 魏凤香; 郭健; 张通达; 詹念吉; 杨颖�; 王琳
Original assignee: Shenzhen Longgang District Materuity & Child Healthcare Hospital; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Longgang District Materuity & Child Healthcare Hospital; BGI Shenzhen Co Ltd; Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2021-12-28

Abstract

本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子与SEQ ID NO:1相比，具有c.349G>T突变，所述突变与地中海贫血密切相关。

Description

核酸分子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种核酸分子及其应用，更具体地，涉及一种检测所述核酸分子的试剂在制备试剂盒中的用途，一种用于核酸分型的非诊断方法，一种基因分型方法，一种基因分型系统，一种探针，一种分离的多肽。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia)，以下简称“地贫”，是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺失，从而导致的一种遗传性溶血性疾病。地贫是世界上发病率最高的单基因隐性遗传病之一，是全球性的公共卫生问题，主要发生在中东，地中海国家，北非，印度次大陆和东南亚等地区。据估计全球约有3.5亿人携带地贫基因，每年约有30万-50万地贫儿出生。在我国，地贫人群主要分布在长江以南的广东、广西、海南、云南、贵州、四川、福建、江西、湖南等地区，其中两广、云贵以及海南是高发区。据2016年《中国地中海贫血蓝皮书》数据显示，我国南方地区地贫基因缺陷携带率为2.5％-20％，地贫基因携带者达3000万人，其中重型和中间型地贫患者约30万人。

地中海贫血以α和β地贫最为常见。其中α地贫在中国南方地区的发生率为4％-15％，在广东地区的发生率约为13％，在云南傣族地区的发生率约为12.0％，在湖南郴州发生率约为6％。到目前为止，全球已报道了300多种α地贫，大多数是由于HBA1和HBA2基因重要功能区域的缺失突变造成的，小部分为基因点突变。

因此，完善地中海贫血新基因型对于地中海贫血基因检测新技术的开发和完善至关重要。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识所作出的：

人类单基因遗传病往往与人类族群、地域等因素有关，随着“人类基因组计划”与“走出非洲”等计划的展开，对人类不同族群的迁徙、溯源与追踪的研究开始从不同的单基因遗传病作为切入点展开，而对于不同的单基因遗传病型别的扩展与发现，是上述研究的基础。

同时近年来，随着我国南方地区人群的地贫防控如火如荼的进行，发明人发现现有的地贫基因型别并不够全面，基于现有的地贫基因检测技术，很多地贫基因突变患者的型别不能准确检出甚至不能检出，从而造成地贫防控的疏漏，同时也造成地贫的基因治疗研究缺乏完善的信息支持，进而对针对地贫生物治疗新方法的研究产生误导。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子与SEQ ID NO:1相比，具有c.349G>T突变。根据本发明实施例的核酸分子，所述SEQ ID NO:1核苷酸序列与野生型HBA1基因编码区的核苷酸序列相同，所述SEQ ID NO:1核苷酸序列的第349位的碱基为鸟嘌呤，所述核酸分子的第349位的碱基为胸腺嘧啶，即所述核酸分子的第349位的碱基从鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。发明人发现所述突变与地中海贫血密切相关，形成了地中海贫血的新基因型。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测上述核酸分子的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断地中海贫血。根据本发明实施例，所述试剂盒可以通过所述试剂判断上述核酸分子是否存在，进而判断所检测的生物样品是否属于地中海贫血新基因型。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于核酸分型的非诊断方法。根据本发明的实施例，所述方法包括，获取受试者的基因组序列信息的至少一部分；将所述基因组序列信息的至少一部分与参考序列相比，以便确定所述基因组序列是否存在c.349G>T突变，所述参考序列至少包括SEQ ID NO：1中第349位的位点信息。根据本发明实施例的核酸分型的非诊断方法可有效确定受试者基因组中是否含有上述位点突变，进而进行后续相关科学研究。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种基因分型方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)提取生物样品的核酸样本，以便进行所述核酸样本的序列确定；(2)确定所述核酸样本的序列，以便进行所述核酸样本的序列比对；(3)将所述核酸样本的序列与所述SEQ ID NO：1进行比对，判断所述核酸样本序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型。根据本发明实施例的方法基于测序手段，可以简单快速地判断生物样品的基因组中在HBA1基因的第349位的碱基是否由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种基因分型系统。根据本发明的实施例，所述系统包括核酸样本提取装置，所述核酸样本提取装置用于从生物样品中提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的所述核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，基于所述核酸样本的所述核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对，以便判断所述核酸序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型。根据本发明实施例的系统可以执行前述基因分型的方法，进而快速有效地判断所述生物样品的基因组中在HBA1基因的第349位的碱基是否由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种探针。根据本发明的实施例，所述探针特异性识别靶序列，所述靶序列包括SQ ID NO：1中的第349位碱基。根据本发明实施例的探针可以特异性识别并标记待检测样品的靶序列，进而判断待检测样本中靶位点的碱基与野生型HBA1基因的核苷酸序列，即SQ ID NO：1相比，是否由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述分离的多肽具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述分离的多肽与SEQ ID NO：15相比，C端截短了26个氨基酸。根据本发明实施例的多肽，上述具有c.349G>T突变的核酸分子所编码的多肽与SEQ ID NO：15相比，C端截短了26个氨基酸，所述c.349G>T为无义突变，使所述核酸分子所对应的mRNA在突变处的密码子变为终止密码子，造成翻译过程在此位点提前终止，最终导致所述多肽片段的截短。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的用于核酸分型的非诊断方法的流程示意图；

图2是根据本发明实施例的基因分型方法的流程示意图；

图3是根据本发明实施例的确定所述核酸样本的序列的流程示意图；

图4是根据本发明实施例的基因分型系统的框图；

图5是根据本发明实施例的核酸序列确定装置的框图；

图6是根据本发明实施例的受检者HBA1编码区349位前后序列反向互补链sanger峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子与SEQ ID NO:1相比，具有c.349G>T突变。根据本发明实施例的核酸分子，所述SEQID NO:1核苷酸序列与野生型HBA1基因编码区的核苷酸序列相同，所述SEQ ID NO:1核苷酸序列的第349位的碱基为鸟嘌呤，所述核酸分子的第349位的碱基为胸腺嘧啶，即所述核酸分子的第349位的碱基从鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。所述核酸分子的类型不受特别限制，可以为DNA、cDNA或者RNA的任一种或是其融合体。根据本发明的一个具体实施例，所述核酸分子为DNA，并且发明人确认了HBA1基因编码区第349位的碱基由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶与地中海贫血有密切关联，因而可以通过检测生物样品中是否具有所述位点的突变来推断所述生物样品是否具有较高概率的地中海贫血表型。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测上述核酸分子的试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断地中海贫血。根据本发明实施例的用途，所述试剂可以特异性检测上述核酸分子：通过特异性与上述核酸分子互补配对来特异性标记上述核酸分子；通过检测上述核酸分子的次级产物，如肽链、蛋白质，来辅助检测上述核酸分子。需要说明的是，发明人发现HBA1基因编码区的c.349G>T突变为无义突变，导致HBA1基因所编码蛋白的提前终止，并不能形成完整的HBA1基因所编码的蛋白，因此任何检测与所述HBA1基因突变后所对应的蛋白质、多肽、氨基酸残基的试剂均可间接确认HBA1基因编码区所述突变位点的异常。因此，本发明试剂盒中的试剂可以测定待测生物样品的HBA1基因编码区的第349位碱基是否从G突变为T，进而判断所述生物样品是否为HBA1基因的新型突变，从而推断所述生物样品是否为地中海贫血表型的高发样品。

此外所述试剂适于识别SEQ ID NO：1中第349位碱基的探针，适于扩增含有第349位碱基的引物。探针用于直接定位识别并标记所述位点，通过探针是否能与所述位点发生碱基互补配对，从而判断所述位点是否发生所述突变。此外所述试剂还可以包括引物序列，所述引物序列用于扩增靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO：1中第349位碱基。所述扩增是利用所述引物及已经获得的核酸分子，基于碱基互补配对原则对已经获得的核酸分子进行数量上的扩增及片段的提取。通过对所述引物加入接头、荧光基团、生物素基团、标签等标记可以为后续核酸分子的测序或定位等其他技术手段进行准备。

所述引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具体如下：

5’-GCACAGCTCCTAAGCCACT-3’

所述引物具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列具体如下：

5’-CACCTCCATTGTTGGCACAT-3’

所述引物具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列具体如下：

5’-CAAGCATAAACCCTGGCGCGC-3’

所述引物具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列具体如下：

5’-GGCCCCGGACCCAAAC-3’

所述引物具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列具体如下：

5’-CCTGGCACGTTTGCTGAG-3’

所述引物具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列具体如下：

5’-CAAGCATAAACCCTGGCGCGC-3’

所述引物具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列具体如下：

5’-GGCCCCGGACCCAAAC3’

所述引物具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列具体如下：

5’-ATTGTTGGCACATTCCGGGA3’

所述引物具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列具体如下：

5’-TAAGCCAGTGCCAGAAGAGCC3’

所述引物具有SEQ ID NO：11的核苷酸序列具体如下：

5’-CAАТCAТТСGТСТGТТТСCСАТTC3’

所述引物具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列具体如下：

5’-TTTCAGGGCAATAATGATACAATG3’

所述引物具有SEQ ID NO：13的核苷酸序列具体如下：

5’-GCACTGACCTCCCACATTCC3’

所述HBA1基因编码区核苷酸序列具体如下：

ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA(SEQ ID NO:1)。

具有c.349G>T突变的核酸分子的具体核苷酸序列如下：

ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCTAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA(SEQ ID NO:14)。

所述HBA1基因编码区所编码的氨基酸序列如下：

MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR*(SEQ ID NO:15)。

所述分离的多肽的氨基酸序列如下：

MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPA*

*(SEQ ID NO:16)。

上述序列中“*”代表终止，“*

*”代表所述分离的多肽与SEQ ID NO：15相比，C端所截短的26个氨基酸。

对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员可以理解，实际包括任意一条链或者互补的双链，为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提到SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员可以理解，已知一条链的情况下可以根据碱基互补配对原则推断出另外一条链，已知一条链的情况下，也可以根据碱基互补配对原则检测另一条链。

目前已报道地中海贫血大多数是由于HBA1和HBA2基因重要功能区域的缺失突变造成的，小部分为基因点突变，但目前仍未有报道称发现HBA1基因编码区第349位碱基由G突变为T与地中海贫血有关联。本发明中编码HBA1突变体的核酸，是本申请的发明人通过测序联合候选基因突变验证的方法确定的，该突变位点在现有技术中并未提到。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种用于核酸分型的非诊断方法。根据本发明的实施例，参考图1，本方法包括：

S100，获取受试者的基因组序列信息的至少一部分。根据本发明的实施例，可以通过测序的方式获得受试者的基因组序列的至少一部分，可以针对受试者全部基因组进行测序，也可以针对HBA1基因进行测序，还可以针对地贫相关基因(HBA1、HBA2、HBB)进行测序。测序可以为一代测序、二代测序、三代测序、单细胞测序及更先进的测序技术等可以获得核酸序列信息的测序方式。

S200，将所述基因组序列信息的至少一部分与参考序列相比，以便确定所述基因组序列是否存在c.349G>T突变，所述参考序列至少包括SEQ ID NO：1中第349位的位点信息。将所获得的受试者的序列信息与野生型HBA1基因编码区序列信息进行比对，以便确定所获得的受试者的HBA1基因编码区的第349位碱基由G突变为T。

本发明的用于核酸分型的非诊断方法可以用于人群中特定种群的溯源及追踪，例如在中国，云南傣族地区为地中海贫血的高发地，利用地中海贫血基因的突变型可以对傣族氏族的发源、迁徙及民族融合等进行追踪及溯源，本发明的核酸分型的非诊断方法不仅提供了地中海贫血的新基因型，也为上述科学研究提供了新的信息及研究方向。此外，地中海贫血的发病存在明显的地域性，在世界范围内，地贫主要发生在中东，地中海国家，北非，印度次大陆和东南亚等地区，在中国，地贫人群主要分布在长江以南的广东、广西、海南、云南、贵州、四川、福建、江西、湖南等地区，其中两广、云贵以及海南是高发区。本发明的用于核酸分型的非诊断方法可以为地中海贫血与环境之间的关联研究提供新的方法、研究思路与新的地贫型别信息，为地中海贫血遗传病的病因溯源以及防控研究提供一种新方法。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种基因分型方法。根据本发明的实施例，参考图2和图3，所述方法包括以下步骤：

S1000，提取生物样品的核酸样本，以便进行所述核酸样本的序列确定。根据本发明的实施例，生物样品可以选自人或者动物的细胞、组织、器官、血液、皮肤、皮下组织的至少一种，“生物样品”不受特别限制，只要能够提取到受试者的核酸样本即可。根据本发明的一个实施例，生物样品为人的外周血，取外周血方便快捷，不会对受试者造成巨大创伤。所述核酸样本应做广义理解，可以是任何能够反映生物样品中HBA1基因编码区是否具有c.349G>T突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含HBA1基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高检测效率。另外，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品中提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品中提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA，以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所获得的cDNA样本构成核酸样本，由此可以进一步提高利用RNA作为核酸样本检测的效率。本领域技术人员可以理解，随着测序技术的发展，测序之前可以不进行核酸的提取步骤，如单细胞测序不需要对细胞样本进行核酸提取即可对细胞样本内的核酸进行高通量测序，因此本步骤的目的在于为了获得生物样品的核酸序列的前期处理。

S2000，确定所述核酸样本的序列，以便进行所述核酸样本的序列比对。

S2100，首先利用HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物分别独立地扩增HBA1、HBA2和HBB基因至少之一，以便获得HBA1、HBA2和HBB基因的扩增产物至少之一，HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物并不受特别限制，根据本发明的实施例，HBA1特异性引物具有如下核苷酸序列：

5’-CAAGCATAAACCCTGGCGCGC-3’(SEQ ID NO：4)

5’-GGCCCCGGACCCAAAC-3’(SEQ ID NO：5)

5’-CCTGGCACGTTTGCTGAG-3’(SEQ ID NO：6)

HBA2特异性引物为：

5’-CAAGCATAAACCCTGGCGCGC-3’(SEQ ID NO：7)

5’-GGCCCCGGACCCAAAC3’(SEQ ID NO：8)

5’-ATTGTTGGCACATTCCGGGA3’(SEQ ID NO：9)

HBB特异性引物具有如下核苷酸序列：

5’-TAAGCCAGTGCCAGAAGAGCC3’(SEQ ID NO：10)

5’-CAАТCAТТСGТСТGТТТСCСАТTC3’(SEQ ID NO：11)

HBB特异性引物还具有如下核苷酸序列：

5’-TTTCAGGGCAATAATGATACAATG3’(SEQ ID NO：12)

5’-GCACTGACCTCCCACATTCC3’(SEQ ID NO：13)

根据本发明的实施例，通过上述对HBA1基因、HBA2基因以及HBB基因编码区的提取、扩增及富集，可以进一步提高检测效率。

S2200,随后将所述扩增产物加入接头，以便获得测序文库，根据测序技术选择所需接头，进而构建测序文库。

S2300,对测序文库进行测序，以便确定所述核酸样本的序列。利用测序文库得到核酸样本的序列信息，确定所述核酸样本的序列可以通过测序的方式，测序技术可以为一代测序、二代测序、三代测序、单分子测序、单细胞测序等可以高通量、高深度测序的技术，也可以是上述技术的联用，用以达到快速、高效、准确的测序效果。

S3000,最终将所述核酸样本的序列与所述SEQ ID NO：1进行比对，判断所述核酸样本序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型，即所述核酸分子与野生型HBA1基因编码序列进行比对，若核酸分子在与野生型HBA1基因编码序列对应的第349位碱基发生了突变，并且由G突变为T，则生物样品为突变型。

根据本发明的具体实施例，提取受试者外周血样本中的基因组，利用HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物分别独立地扩增HBA1、HBA2和HBB基因至少之一，以便获得HBA1、HBA2和HBB基因的扩增产物至少之一。扩增产物再经过打断、末端修复、加A加接头、扩增纯化等步骤，最后形成二代测序文库。文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照MGISeq2000标准的测序说明进行上机测序，测序平台为MGISeq2000，测序策略为PE100，样本的平均测序深度为50×。随后进行变异检测及注释，将上述测序产出数据依次进行初步统计分析，SNP、indel、CNV检测和注释，主要步骤如下：(1)基本数据分析统计：将测序产出数据进行基本数据分析统计：测得的序列reads长度分析、统计reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、统计目标区域比对到所要参考的基因组reads的覆盖度(Coverage)与测序深度(Depth)等。然后，根据以上基本数据的统计结果，得到通过PCR扩增获得样本目标区域基本信息，并判断目标区域的数据是否符合要求；(2)SNP和INDEL检测：将各样本的高质量的原始reads通过bwa比对软件比对到参考基因组(hg19)上。然后，使用GATK检测SNP和Indel，将所获得的SNP和Indel与HbVar数据库进行比较注释。最后，将所述核酸样本的序列与所述SEQ ID NO：1进行比对，判断所述核酸样本序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种基因分型系统。根据本发明的实施例，参考图4，本系统包括：核酸样本提取装置100，所述核酸样本提取装置用于从生物样品中提取核酸样本；核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的所述核酸序列；判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，基于所述核酸样本的所述核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对，以便判断所述核酸序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型，即所述核酸分子与野生型HBA1基因编码序列进行比对，若核酸分子在与野生型HBA1基因编码序列对应的第349位碱基发生了突变，并且由G突变为T，则生物样品为突变型。

根据本发明的实施例，核酸样本提取装置100用于提取生物样品的核酸样本，以便进行所述核酸样本的序列确定。根据本发明的实施例，生物样品可以为人或者动物的细胞、组织、器官、血液等，“生物样品”不受特别限制，只要能够提取到受试者的核酸样本即可。根据本发明的一个实施例，生物样品为人的外周血，取外周血方便快捷，不会对受试者造成巨大创伤。所述核酸样本为DNA、RNA、cDNA或者聚合体，核酸样本中含有与所述SEQ ID NO：1相匹配的信息即可。本领域技术人员可以理解，随着测序技术的发展，测序之前可以不进行核酸的提取步骤，如单细胞测序不需要对细胞样本进行核酸提取即可对细胞样本内的核酸进行高通量测序，因此本步骤的目的在于为了获得生物样品的核酸序列的前期处理。

核酸序列确定装置200用于确定所述核酸样本的序列，以便进行所述核酸样本的序列比对。根据本发明的实施例，参考图5，核酸序列确定装置200进一步包括目标基因扩增单元210，利用HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物分别独立地扩增HBA1、HBA2和HBB基因至少之一，以便获得HBA1、HBA2和HBB基因的扩增产物至少之一；测序文库构建单元220，所述测序文库构建单元220与所述目标基因扩增单元210相连，将所述扩增产物加入接头，以便获得测序文库；测序单元230，所述测序单元230与所述测序文库构建单元220相连，将所述测序文库作为输入进行测序，以便获得所述核酸样本的测序数据。如前所述，HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物并不受特别限制，并且，确定所述核酸样本的序列可以通过测序的方式，测序技术可以为一代测序、二代测序、三代测序、单分子测序、单细胞测序等可以高通量、高深度测序的技术，也可以是上述技术的联用，用以达到快速、高效、准确的测序效果。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种探针。根据本发明的实施例，所述探针特异性识别靶序列，所述靶序列包括SQ ID NO：1中的第349位碱基。根据本发明实施例的探针可以特异性识别并标记待检测样品的靶序列，进而判断待检测样本中靶位点的碱基与野生型HBA1基因的核苷酸序列，即SQ ID NO：1相比，是否由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。所述探针具有荧光基团、生物素和标签等标记，以便对所述靶序列进行定位。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例

1.1样本收集

使用EDTA抗凝采血管采集受检者外周血1mL，进行血常规和血红蛋白电泳检测，再将剩余血液样品保存于-20℃备用。

1.2地贫基因检测

对受检者进行高通量测序地贫基因测序，并对受检者潜在致病的地贫基因突变位点区域序列两端设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，Sanger测序的方法获得受检者地贫基因序列信息，根据序列测定结果验证受检者是否为该地贫基因突变新基因型。具体方法步骤如下：

1.2.1DNA提取

取受检者外周静脉血200μL，采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒提取外周血样品DNA，提取步骤如下：

(1)取200μL全血样本，加入150μL OB蛋白酶，2.1mL缓冲液BL和20μL核糖核酸酶A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。

(2)65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。

(3)加入2.2mL无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。

(4)将3.5mL裂解液移入带过滤柱的15mL离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15mL离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

加入3mL HB缓冲液，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

加入3mL DNA冲洗缓冲液，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(8)再次加入3mL DNA冲洗缓冲液，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。4000转离心15分钟，甩干过滤柱。

(9)将过滤柱移至新的15mL离心管，加入500μL 70摄氏度的洗脱缓冲液，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(11)再次将过滤柱移至新的15mL离心管，加入500μL 70摄氏度的洗脱缓冲液，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(12)提取所得样本基因组DNA，利用Qubit Fluorometer3.0、NanoDrop及凝胶电泳法测量DNA的浓度、纯度和完整性，所得的样本DNA的OD260/OD280位于1.8-2.0之间，电泳条带清晰，完整性较好，总量不低于500ng，样品存-20℃备用。

1.2.2建库

(1)目的基因扩增：

通过设计的特异性引物对，将样本DNA的HBA1、HBA2和HBB基因片段区域分别扩增出来。HBA1和HBA2基因的特异性引物各为2对(3条)，HBB基因则是采用2对(4条)引物，具体引物序列如下表1所示：

表1：PCR反应对应引物序列

PCR反应体系均为25μL，具体如表2所示：

表2：PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		gDNA	100ng
2x GC缓冲液I	12.5
		TaKaRaTaq HS	0.13
引物混合物	2(50ng)
		2.5mM dNTP	3
水	补齐
		总计	25

将各反应样品置入PCR仪中反应，反应条件分别如下：

1)PCR反应1和PCR反应2：

2)PCR反应3：

(2)PCR产物混合纯化

上一步骤所得3个PCR产物中各取等量产物混合到一个5mL EP管中进行混合，振荡混匀，从中取200μL混合产物经“AxyPrep Mag PCR Clean-up kit”试剂盒纯化(具体纯化步骤详见说明书)，纯化所得的80μL产物，经Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司)进行测定、浓度不低于50ng/μL。

(3)打断、末端修复，加A尾，加接头

1)打断：将上一步骤纯化所得的80μL产物用Covaris E220打断仪做打断，打断条件如表3所示：

表3：打断条件

工作因子	峰值入射功率(W)	循环/Burst	时长(秒)
				21％	500	500	20s×8个循环

打断完成后,产物经“AxyPrep Mag PCR Clean-up kit”试剂盒纯化，纯化后溶于38μL TE buffer。

2)末端修复

a.提前5分钟左右准备末端修复混合液，混匀后备用，如表4所示:

表4：末端修复混合液配方

试剂	体积(μL)
		10xT4 PNK反应缓冲液	5
dNTP溶液(10mM)	2
		T4 DNA聚合酶	2.5
Klenow片段	0.5
		T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)	2.5
总计	12.5

b.将已经打断后的38L DNA混匀离心；往样本管中加入12.5L配置好的末端修复混合液，混匀离心。

c.将样品置入PCR仪中反应，反应条件：20℃30min；4℃保持：反应完成后，产物经AxyPrep Mag PCR Clean-up kit纯化，纯化后溶于32.5μL TE缓冲液备用。

3)加"A"尾

a.提前5分钟左右准备加"A"混合液，混匀后备用，如表5所示:

表5：加"A"混合液配方

b.在2)中得到的32.5μL产物中加入18μL配置好的加"A"混合液，混匀离心。

c.将样品置入PCR仪中反应，反应条件：37℃30min:4℃保持。反应完成后，产物经AxyPrep MagPCR Clean-up kit纯化，纯化后溶于38μL TE缓冲液·，备用。

4)加接头

a.提前5分钟左右准备连接酶混合液，涡旋混匀后备用，如表6所示：

表6：连接酶混合液配方

试剂	体积(μL)
		10xT4 DNA连接缓冲液	5
T4 DNA连接酶(快速)	5
		总计	10

b.在3)中得到的38μL产物中加入8bp Adapter(50uM)2μL，混匀离心。

c.再往样本管中加入10μL连接酶混合液，混匀离心

d.将样品置入PCR仪中反应，反应条件:16℃过夜(大于16h)；4℃保持。

5)纯化回收

加接头样品片段筛选将已完成AdA接头连接反应的样品转移至新1.5mL不粘管中,用AyPrep Mag Fragment Select-I purification kit做片段筛选(具体步骤详见说明书)，纯化后回收DNA片段范围180-600bp，溶于30μL TE。

(4)测序

按照MGISeq-2000测序仪的标准操作流程，进行样本单链环化等操作后进行上机测序。

(5)结果分析

步骤(4)所得测序下机数据按照上述2.2.2中分析流程和变异注释方法进行地贫基因突变型别的分析，检测所得结果为HBA1:c.349G>T，与预期结果相符。

1.3引物设计及sanger验证

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer6.0设计该地贫新基因型验证的特异性引物，具体见表7：

表7：地贫新基因型验证的特异性引物

接着，分别按照以下配比配制样本的PCR反应体系以及进行PCR反应，参照表8

反应体系：25μl

表8:PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		KAPA HiFi HotStart Readymix(2x)	12.5
上游引物(20uM)	0.25
		下游引物(20uM)	0.25
DNA	30ng
		水	补齐
总计	25μL

PCR反应条件：

最后，将PCR产物进行sanger测序，测序所得结果通过BioEdit SequenceAlignment Editor软件进行比对分析，附图6，显示了受检者突变位点sanger验证峰图，从峰图可以看出，该受检者在HBA1基因编码区的第349位处G碱基确实存在突变，突变为T碱基。

1.4血液学检查

对受检者样本及健康对照样本进行血常规和血红蛋白电泳，具体操作步骤如下：

(1)血常规：将采集的外周血与质控品取出，两者均充分混匀后，置于迈瑞BC-2600全自动血球仪上进行自动检测，检测内容包括血常规19项：白细胞计数(WBC)，中性粒细胞数(NEUT)，淋巴细胞数(LYM)，中间细胞计数(MID)，中性粒细胞比率(NEUT％)，淋巴细胞比率(LYM％)，中间细胞比率(MID％)，红细胞计数(RBC)，血红蛋白浓度(Hb)，红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积(MCV)，平均血红蛋白量(MCH)，平均血红蛋白浓度(MCHC)，红细胞体积分布宽度(RDW-CV)，红细胞体积分布宽度标准差(RDW-SD)，血小板计数(PLT)，平均血小板体积(MPV)，血小板体积分布宽度(PDW)，血小板压积(PCT)。

(2)血红蛋白电泳：采用法国SEBIA血红蛋白电泳自动分析仪进行分析检测。

a.洗涤红细胞。取400pL血细胞加4mL生理盐水，上下颠倒5次或吹打混匀；

b.用3000转速的离心机离心全血5分钟并弃去浮在表面上的悬浮液；

c.重复a和b步骤，尽量吸走红细胞表面多余的生理盐水；

d.取40ul RBC于试管中，加150ul裂解液，充分混匀，放置15-20分钟。

e.打开电脑及电泳仪，电泳仪试剂检查及准备好后，放置海绵条在电泳槽两侧电极中，轻轻压平；

f.载样盘每孔加入30ul裂解液，装好胶片；

g.运行自动分析仪，自动完成点样、电泳、凝胶变性、染色、脱色、烘干及自动判读全过程。

(3)检查结果：

携带HBA1:c.349G>T(Glu>Stop)突变的受检者的血常规3个指标值均出现异常：血红蛋白浓度(Hb)，红细胞平均体积(MCV)和平均血红蛋白量(MCH)值均低于正常参考值。在临床上的地贫筛查流程中，通常以血常规中的红细胞平均体积(MCV)和平均血红蛋白量(MCH)指标值作为评估是否地贫的两个主要参数。杂合携带该地贫基因新型突变的受检者的血液学相关指标均出现异常，说明了该地贫基因突变位点影响了人体珠蛋白肽链的合成，导致Hb合成减少，MCV和MCH值降低，呈现出轻型地贫血液学特征，这些现象也进一步证实了该位点具有生理学功能，见表9。

表9：血液学检查结果

参考范围：Hb(g/L):130-175,MCV(fL):81-100,MCH(pg):27-34,HbA(％):96.5-97.3,HbA2(％):2.5-3.5。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院；深圳市龙岗区妇幼保健院

<120> 核酸分子及其应用

<130> PIDC3203637

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 429

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBA1基因编码区核苷酸序列

<400> 1

atggtgctgt ctcctgccga caagaccaac gtcaaggccg cctggggtaa ggtcggcgcg 60

cacgctggcg agtatggtgc ggaggccctg gagaggatgt tcctgtcctt ccccaccacc 120

aagacctact tcccgcactt cgacctgagc cacggctctg cccaggttaa gggccacggc 180

aagaaggtgg ccgacgcgct gaccaacgcc gtggcgcacg tggacgacat gcccaacgcg 240

ctgtccgccc tgagcgacct gcacgcgcac aagcttcggg tggacccggt caacttcaag 300

ctcctaagcc actgcctgct ggtgaccctg gccgcccacc tccccgccga gttcacccct 360

gcggtgcacg cctccctgga caagttcctg gcttctgtga gcaccgtgct gacctccaaa 420

taccgttaa 429

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

gcacagctcc taagccact 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

cacctccatt gttggcacat 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

caagcataaa ccctggcgcg c 21

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggccccggac ccaaac 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

cctggcacgt ttgctgag 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

caagcataaa ccctggcgcg c 21

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggccccggac ccaaac 16

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

attgttggca cattccggga 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

taagccagtg ccagaagagc c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

CAАТCAТТСGТСТGТТТСССАТTC 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

tttcagggca ataatgatac aatg 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

gcactgacct cccacattcc 20

<210> 14

<211> 429

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 具有c.349G>T突变的核酸分子

<400> 14

atggtgctgt ctcctgccga caagaccaac gtcaaggccg cctggggtaa ggtcggcgcg 60

cacgctggcg agtatggtgc ggaggccctg gagaggatgt tcctgtcctt ccccaccacc 120

aagacctact tcccgcactt cgacctgagc cacggctctg cccaggttaa gggccacggc 180

aagaaggtgg ccgacgcgct gaccaacgcc gtggcgcacg tggacgacat gcccaacgcg 240

ctgtccgccc tgagcgacct gcacgcgcac aagcttcggg tggacccggt caacttcaag 300

ctcctaagcc actgcctgct ggtgaccctg gccgcccacc tccccgccta gttcacccct 360

gcggtgcacg cctccctgga caagttcctg gcttctgtga gcaccgtgct gacctccaaa 420

taccgttaa 429

<210> 15

<211> 142

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HBA1基因编码区所编码的氨基酸

<400> 15

Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg

20 25 30

Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp

35 40 45

Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala

65 70 75 80

Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro

85 90 95

Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala

100 105 110

His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys

115 120 125

Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

<210> 16

<211> 141

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 分离的多肽的氨基酸序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (117)..(141)

<223> 被截去

<400> 16

Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg

20 25 30

Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp

35 40 45

Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala

65 70 75 80

Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro

85 90 95

Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala

100 105 110

His Leu Pro Ala Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

Claims

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子与SEQ ID NO:1相比，具有c.349G>T突变。

2.检测权利要求1所述核酸分子的试剂在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于诊断地中海贫血。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂适于识别SEQ ID NO：1中第349位碱基的探针，适于扩增含有第349位碱基的引物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的序列至少之一。

5.一种用于核酸分型的非诊断方法，其特征在于，包括：

获取受试者的基因组序列信息的至少一部分；

将所述基因组序列信息的至少一部分与参考序列相比，以便确定所述基因组序列是否存在c.349G>T突变，所述参考序列至少包括SEQ ID NO：1中第349位的位点信息。

6.一种基因分型方法，其特征在于，包括：

(1)提取生物样品的核酸样本，以便进行所述核酸样本的序列确定；

(2)确定所述核酸样本的序列，以便进行所述核酸样本的序列比对；

(3)将所述核酸样本的序列与所述SEQ ID NO：1进行比对，判断所述核酸样本序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型；

任选的，所述基因为HBA1、HBA2和HBB至少之一。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)进一步包括：

利用HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物分别独立地扩增HBA1、HBA2和HBB基因至少之一，以便获得HBA1、HBA2和HBB基因的扩增产物至少之一；

将所述扩增产物加入接头，以便获得测序文库；

对测序文库进行测序，以便确定所述核酸样本的序列；

任选的，所述HBA1特异性引物具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述HBA2特异性引物具有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，所述HBB特异性引物具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13所示的核苷酸序列。

8.一种基因分型系统，其特征在于，包括：

核酸样本提取装置，所述核酸样本提取装置用于从生物样品中提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的所述核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，基于所述核酸样本的所述核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对，以便判断所述核酸序列是否具有c.349G>T突变，进而判断所述核酸分子是否为突变型；

任选的，所述基因为HBA1、HBA2和HBB至少之一；

任选的，所述核酸序列确定装置进一步包括：

目标基因扩增单元，利用HBA1特异性引物、HBA2特异性引物和HBB特异性引物分别独立地扩增HBA1、HBA2和HBB基因至少之一，以便获得HBA1、HBA2和HBB基因的扩增产物至少之一；

测序文库构建单元，所述测序文库构建单元与所述目标基因扩增单元相连，将所述扩增产物加入接头，以便获得测序文库；

测序单元，所述测序单元与所述测序文库构建单元相连，将所述测序文库作为输入进行测序，以便获得所述核酸样本的测序数据；

9.一种探针，其特征在于，所述探针特异性识别靶序列，所述靶序列包括SQ ID NO：1中的第349位碱基。

10.一种分离的多肽，其特征在于，所述分离的多肽具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述分离的多肽与SEQ ID NO：15相比，C端截短了26个氨基酸。